WO2000049155A1 - Genes codant des proteines ayant une activite de transfert de sucre sur l'aurone - Google Patents

Genes codant des proteines ayant une activite de transfert de sucre sur l'aurone Download PDF

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WO2000049155A1
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protein
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plant
auron
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PCT/JP2000/000876
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Keiko Sakakibara
Yuko Fukui
Yoshikazu Tanaka
Takaaki Kusumi
Takafumi Yoshikawa
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Suntory Limited
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    • C12P19/44—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides
    • C12P19/60—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides having an oxygen of the saccharide radical directly bound to a non-saccharide heterocyclic ring or a condensed ring system containing a non-saccharide heterocyclic ring, e.g. coumermycin, novobiocin

Definitions

  • the present invention relates to a gene encoding a protein having an activity of transferring sugar to auron.
  • the present invention relates to a gene encoding a protein having an activity of transferring sugar to auron, a protein, and a method of using the same.
  • Flower color is mainly based on three types of colorants: flavonoids, carotenoids and betalains.
  • the yellow color is mainly derived from carotenoids and betalains, but the yellow color of some plants is derived from flavonoids.
  • the main pigments that are thought to be involved in the development of yellow flowers can be divided into three groups: chalcones, aurons, and yellow flavonols (Saito, Bioholty 1, p49 -57, 1 990) o
  • Auron is a substance in which two phenyl groups are bonded via three carbon atoms of dihydrofuran, and as auron, 4, 6, 4'-trih Droxylone, auredin, sunolefretin, black teatin and the like are known.
  • auron 4, 6, 4'-trih Droxylone, auredin, sunolefretin, black teatin and the like are known.
  • goldfish plants have aureidin and black teatin
  • statices have aureticin
  • morning glory have aureticin
  • dalian have sulfretin
  • wheat wheat has black teatin.
  • Jerusalem artichoke contains sulfretin.
  • flavonoids are modified by acylation, glycosylation, methylation, etc., and carotenoids and betalains are often glycosylated. Glycosylation among various modifications is due to the following: 1) Dye stability and solubility 2) Presence of acylation, which has a significant effect on color tone, 3) Glossation of flavonoids, such as the co-pigmentation effect of flower colors. Plays an important role.
  • one of the flavonoids is glycosylated at position 6 corresponding to position 7 in flavonoids. Glycosylation occurs in plants containing other aurons, because aurons exist as glycosides, and glycosylation occurs because of the stable presence of aurons. Deemed necessary.
  • UDP-glucose flavonoid 3
  • darcosyltransferase (3GT) which transfers sugars to position 3 of flavonoids
  • UDP-glucose flavonoid 5 — glucosyltransferase (5GT), which transfers sugars to the 5th position of flavonoids, are perilla, trennia and verpena. (International Publication Number; W099 / 05287).
  • PS.b UFGTl a glycosyltransferase gene that has the activity to transfer glucose to position 7 of baicalein, one of the flavones, was isolated from hairy roots of the Labiatae plant Scutellaria.
  • this gene product can also transfer sugars to position 7 of anthocyanidins and flavonols (presented at the 15th Annual Meeting of the Japanese Society for Plant Cell and Molecular Biology).
  • This gene product can also transfer sugars to position 7 of anthocyanidins and flavonols (presented at the 15th Annual Meeting of the Japanese Society for Plant Cell and Molecular Biology). Has not been reported.
  • glycosyltransferases using flavonoids as substrates have large differences in substrate specificity between flavonoids.
  • the flavonoid 3 -glycosyltransferase gene derived from gentian was cloned and expressed in Escherichia coli, and the activity was measured. The activity is 61% for, and 38% for pelargonidin, showing good activity for anthocyanidins. On the other hand, it shows only 7.0%, 6.5% and 4.4% activity against the flavonols, camprol, quercetin and myricetin, respectively. Furthermore, it does not transfer sugar at all to dihydroflavonol (Tanaka et al. Plant Cell Physiol.
  • glycosyltransferases can recognize the type of flavonoids, and that the glycosyltransferase activity of one flavonoid cannot be easily inferred from the glycosyltransferase activity of another flavonoid. ing.
  • glycosyltransferases that use flavonoids as substrates have large differences in substrate specificity, and predict the activity of glycosyltransferases from known glycosyltransferases to specific flavonoids. It was difficult.
  • the inventors of the present invention completed the present invention with an object of obtaining a gene encoding a protein having an activity of transferring sugar to aurone among flavonoid dyes.
  • the present inventors have clarified that the pS.b UFGT1 gene product derived from Scutellaria has a transglycosylation activity to auron, and further used this gene as a probe.
  • a gene encoding a protein having an activity to transfer sugar to gold was obtained from goldfish (Antirrrhinum majus).
  • the present invention provides a gene encoding a protein having an activity to transfer sugar to auron. Further, the present invention provides a gene encoding a protein having an activity of transferring a sugar to an aurone having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, 8, or 10. The present invention further relates to the addition or deletion of one or more amino acids to the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2, 8, or 10, and Z or other amino acids. It is intended to provide a gene encoding a protein having an amino acid sequence which has been modified by the substitution of a sugar chain and having an activity of transferring sugar to sugar.
  • the present invention further relates to a nucleic acid having a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 2, 8 and 10, or a nucleic acid having a portion thereof, under stringent conditions. It is intended to provide a gene encoding a protein which hybridizes and has an activity to transfer sugars to itself.
  • the present invention also provides a vector comprising the above gene.
  • the present invention further provides a host transformed with the above vector. This host may be a cell such as a microorganism, a plant cell, or an animal cell, or may be a plant.
  • the present invention can also provide a method for producing a protein having an activity of transferring sugar to auron by culturing, cultivating, or breeding the host.
  • the present invention also relates to a plant having auron, wherein the above gene is introduced into a plant, the gene is expressed, and sugar is transferred to auron in the plant by the produced protein, whereby the plant is transformed into a plant.
  • FIG. 1 is a diagram showing a method for producing plasmid pESBGT-1.
  • FIG. 2 shows a method for preparing plasmid pETAmGTl.
  • cDNA library for the yellow goldfish petals.
  • the obtained cDNA library is screened using pS.b UFGTl, a flavonoid 7-glycosyltransferase gene derived from Scutellaria, to obtain clones. Then, the plasmid obtained from this clone is separated and its nucleotide sequence is determined.
  • a protein having an enzymatic activity has a region essential for the enzyme activity and a region not essential for the enzyme activity, and the non-essential region has one or more amino acid deletions, additions and / or deletions. It is known that the enzyme activity is maintained even when modified by substitution with another amino acid. Therefore, the present invention provides not only the protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, 8 or 10, but also the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, 8 or 10, Has an amino acid sequence modified by deletion, addition, and / or substitution with another amino acid sequence of the amino acid sequence, and has an activity of transferring a sugar to aurone.
  • the present invention also includes a protein and a gene encoding the protein.
  • the number of amino acids to be modified is, for example, 50 or less, preferably 30 or less, for example, 20 or 10 or less.
  • the gene encoding the protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, 8 or 10 of the present invention can be obtained from goldfish or petunia as cDNA or genomic DNA. Methods for cloning cDNA are specifically described in Examples 2-3 and 6. Genomic DNA can be obtained by preparing a genomic library from goldfish or petunia according to a conventional method and screening it with the cDNA or a fragment thereof according to a conventional method.
  • the gene encoding a protein having an amino acid sequence modified with respect to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, 8 or 10 of the present invention is a system number: 2, 8 or 10
  • DNA encoding a protein having an amino acid sequence shown in (1) for example, a cDNA by modifying a nucleotide sequence according to a conventional method for manipulating a gene, such as site-directed mutagenesis or PCR. Can be.
  • a nucleic acid that hybridizes to the gene or a portion thereof encodes a similar enzymatic activity and is similar to the original protein. It often encodes the acid sequence. Therefore, the present invention hybridizes under stringent conditions to a nucleic acid having a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence described in any of SEQ ID NOs: 2, 8 or 10, or a nucleic acid having a portion thereof, And a gene encoding a protein having an activity to transfer sugar to aurone.
  • washing conditions are preferably 5X SSC, 0.1% SDS, 50 ° C, and more preferably 2X SSC, 0.1% SDS. , 50 ° C, more preferably 0.1 x SSC, 0.1% SDS, 50 ° C.
  • nucleic acid having a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2, 8, or 10 is used in the above hybridization
  • the length of the nucleic acid It has a length of at least 17 base pairs and preferably has a length of at least 100 base pairs.
  • Nucleic acids to be subjected to high-purification are, for example, nucleic acids prepared from Scutellaria, goldfish, petunia, statice, morning glory, dahlias, barley chrysanthemum, jerusalem artichoke, and preferably genomic.
  • a DNA library or cDNA library is used.
  • the present invention also relates to the above protein having glycosyltransferase activity to aurone.
  • a manufacturing method is provided. This method comprises introducing a vector comprising the DNA encoding the protein into a host, culturing or growing the host, and collecting the protein as desired. And features.
  • the host may be a host cell or an organism such as a plant.
  • prokaryotic cells especially bacterial cells, such as Escherichia coli and Bacillus bacteria, such as Bacillus subtilis ⁇ Bacillus brevis, are used.
  • Lower eukaryotes for example, fungi, for example, yeasts, for example, yeasts of the genus Saccharomyces, for example, Saccharomyces' Saccharomyces cerev is iae, or thread;
  • filamentous fungi belonging to the genus Aspergillus such as Aspergillus oryzae, Aspergillus oryzae, and Aspergilulus nicer, Aspergi 1 lus niger, can be mentioned.
  • higher eukaryotic cell hosts include insect cells, such as silkworm cells, animal cells, such as CH0 cells, human cultured cells, such as HeLa cells, and the like.
  • the gene of the present invention can also be expressed in organisms such as plants.
  • a vector comprising the DNA of the present invention, particularly an expression vector contains an expression control region, and the expression control region depends on the host cell.
  • trc promoter, tac promoter, lac promoter, T7 promoter, etc. can be used as the promoter of the bacterial expression vector.
  • the promoter of the yeast expression vector include, for example, A glycolytic enzyme gene promoter, for example, glyceroaldehyde 3-phosphate dehydrogenase-promoter, galactokinase promoter, etc. can be used, and an animal cell expression vector promoter can be used.
  • the virus promoter can be used as the heater.
  • isolation and purification of the protein such as liquid chromatography, affinity chromatography, etc. The common means used in the above can be used.
  • this cDNA can also be linked under the control of a constitutive or inductive micromotor to produce a system using an aggressive vehicle or a particle gun, an electroporator.
  • Plants such as petunias, roses, and powers — such as petunia, chrysanthemum, trennia, verbena, gerbera, tobacco, strawberry, eustoma, gentian, gladiolus, and chew.
  • a gene encoding an auron synthase gene is introduced and expressed, and at the same time, a gene encoding a protein having the activity of transferring sugar to auron of the present invention is also introduced. By expressing it, it is possible to stably express auron and provide a new plant having a yellow color tone. Examples of the plant that does not have auron include petunia, trennia, and tobacco. Example
  • Example 1 Translocation of p S .b UFGT1 gene product from Aspergillus oryzae to orange Measurement of glycosyl transfer activity
  • the transglycosylation activity of the pS.b UFGTl gene derived from Aspergillus oryzae was measured using the expression vector pE SiGT-1 in Escherichia coli prepared by the method described below.
  • the pS.b UFGTl gene was subjected to a PCR reaction using the following two types of primers, and Ndel and BamHI sites were introduced.
  • the PCR reaction solution consists of 300 ng of pSBGT-1, lx Native Pfu DNA polymerase reaction buffer (Stratagene), 0.2 mM dNTPs, 4 pg / ⁇ 1 each of primers, and 2.5 U of Native Pfu DNA polymerase. The volume was adjusted to 50 ⁇ 1. The reaction was carried out at 95 ° C for 3 minutes, then 95 ° C for 1 minute, 50 ° C for 2 minutes, and 72 ° C for 2 minutes as one cycle, and then 30 cycles, and finally Treated at 72 ° C for 7 minutes.
  • the obtained PCR product was digested with Ndel and BamHI, and ligated with a pET-3a vector (Stratagene) also digested with Ndel and BamHI to construct pESBGT-1 (FIG. 1).
  • pESBGT-1 and pET-3a vectors were used to transform Epicurian Coli (Epicurian Coli) BL2KDE3) (Stratagene), respectively.
  • the transformant was cultured with shaking at 37 ° C. overnight in 3 ml of LB medium containing 50 g / ml of ampicillin.
  • IPTG isopropyl-/ 3 thiogalacto virano
  • the pellet was suspended in 5 ml of a buffer (lOmM sodium phosphate, pH 6.5, ImM / 3-mercaptoethanol (2-ME)), and E. coli was disrupted with an ultrasonic disrupter. After that, centrifugation (15,000 rpm, 5 minutes, 4 ° C) The supernatant was used as a crude enzyme solution and used in the following enzyme reaction.
  • a buffer LOmM sodium phosphate, pH 6.5, ImM / 3-mercaptoethanol (2-ME)
  • Enzyme activity was measured using naringenin or luteolin as a substrate in addition to aureungin.
  • enzymatic activity was measured as follows. 0.1M Tris-HCl, pH 8.0, 0.05% 2-ME 150 ⁇ 1 was added to the crude enzyme solution and incubated at 30 ° C for 10 minutes. Then, 4.66 mM auredin 5-1 and 5 mM UDP-glucose 50-1 were added and reacted at 30 ° C. for 1 hour. The reaction was stopped by adding 200% acetonitrile 200 ⁇ 1 containing 5% TFA (trifluoroacetic acid), followed by centrifugation at 15,000 rpm for 3 minutes at 4 ° C. The supernatant was filtered to remove insolubles using a filter (pore size: 0.45 ex1, 4 mm Mi11ex-LH, Millipore). This was analyzed by liquid high-speed chromatography.
  • TFA trifluoroacetic acid
  • Crude enzyme solution 201 0.1 M citrate-phosphate buffer, pH 6.5, 25 ⁇ 1 5 ⁇ M of each substrate 5 ⁇ 1, containing 5 mM UDP-glucose 25 ⁇ 1 in a total volume of 250 // 1
  • the reaction was performed at 30 ° C for 30 minutes. After stopping the reaction by adding 90% acetonitrile 200 1 containing 5% TFA, the mixture was centrifuged at 15,000 rpm for 3 minutes at 4 ° C, and the resulting supernatant was filtered. (Pore size 0.45 ⁇ m, 4 mm Millex-LH, Millipore) to remove insolubles. This was analyzed by high performance liquid chromatography.
  • the analysis conditions for naringenin are as follows. Column using YMC J 'sp here ODS-M80 (4.6mm0 xl50mm, YM C) and the mobile phase was a H 2 0, B solution containing TFA 0.1% in the A dissolved solution TFA0.13 ⁇ 4 the B80% after B80% of Riniagura Gen bets 10 minutes B20% with 90% CH 3 CN containing and held for 5 minutes. The flow rate was 0.6 ml / min. Detection was performed using A290nm and Shimadzu PDA detector SPD-M6A to measure the absorption spectrum at 250 to 400nm.
  • the analysis conditions for luteolin are as follows. YMC J 'sphere 0DS-M 80 using (4. G ⁇ xl50mm), 90 the mobile phase containing TFA 0.1% in the H 2 0, B solution containing TFA 0.1% in the solution A A linear gradient from B20% to B80% was used for 10 minutes using% CH 3 CN, and then B80% was held for 5 minutes. The flow rate was 0.6 ml / min. Detection was performed using A330nm and Shimadzu PDA detector SPD-M6A to measure the absorption spectrum at 250-400nm.
  • baicalein can be glycosylated at the 7-position.
  • baicalein almost 100% was detected as 7-glycoside after the reaction, but almost no reaction for naringenin, and S. serrata pS.b UFG Tl gene expression The product was also found to have high substrate specificity.
  • the petal cDNA library was prepared by the following method. 5 g of fresh petals of yellow goldfish (Ero Butterfly) from guanidine thiocyanoate / cesium chloride as detailed in R. McGookin et al., Method in Molecular Biology vol. 2 (Humana Press Inc. 1984) RNA was obtained in the same manner as described above, and polyA + RNA was purified using Origotex dT30 (Nippon Roche). From this polyA + RNA, a cDNA library was constructed using a cDNA synthesis kit, an XR vector kit (Stratagene). Library one obtained had summer 1.6 10 5 plaque forming Interview two Tsu preparative (pfu).
  • the goldfish grass cDNA library obtained in Example 2 was Screening was performed using the full length of pS.b UFGT1, a flavonoid 7-glycosyltransferase gene derived from hairy roots. Screening of the library was performed using a non-radiosystem DNA detection kit (Boehringer). Neubridization is 37. C. The final letter was washed with 5 ⁇ SSC, 0.1% SDS at 50 ° C. for 30 minutes. About 200,000 plaques were screened and finally two clones were obtained. METHODS: The Molecular Cloning was by (Sambrook e t. Al. Cold Spring Harbour L aboratory Press, 1989) c
  • the nucleotide sequence was determined by synthesizing an oligonucleotide primer and using a DNA Sequencer model 310 (Applied Biosystems). The nucleotide sequence and the deduced amino acid sequence are shown in Sequence Listing and SEQ ID NO: 1.
  • pAmGTl contained the 1751 bp gene AmGTl which encodes a protein consisting of 481 amino acids and having a molecular weight of 53.9 kDa.
  • AmGTl gene expression was performed using the pET System (Stratagene).
  • PETAmGT5 ' 5'-ATA ACT ACA TAT GGG AAA ACT TCA C_3' (Sequence number: 5)
  • pETAmGT3 ' 5'-GAA CAG GAT CCA CAC ACT AGA AGT CA-3' (SEQ ID NO: 6)
  • the PCR reaction solution was pAmGTl lOOng, lx cloned Pfu DNA polymerase reaction buffer (Stratagene), 0.2 mM dNTPs, and the primer—0.5 pmo each.
  • the total volume was adjusted to 100 ⁇ 1 comprising M 1 and cloned Pfu DNA polymerase 5.0.
  • the reaction is performed at 95 ° C for 45 seconds, followed by 25 cycles of 95 ° C for 45 seconds, 50 ° C for 45 seconds and 72 ° C for 2 minutes, and finally for 10 minutes at 72 ° C. Processed.
  • the obtained PCR product was subcloned into pCR2.1 T0P0 vector (IN VITR0GEN).
  • Example 4 The transformant obtained in Example 4 was cultured and extracted as in Example 1, and the enzyme activity was measured.
  • the retention time of the aleicidin 6-glycoside for the substance evolving at 10.98 minutes was the same as the retention time of the aleicidin 4-glycoside for the substance evolving at 11.85 minutes. From the above results, it was revealed that AmGTl can glycosylate the 6th and 4th positions of auredin. The absorption spectrum of the substance detected at 11.27 minutes is presumed to be aurethidine glycoside.
  • Example 6 Acquisition of auronic glycosyltransferase gene derived from petunia
  • a cDNA library derived from petals of a petunia cultivar Alldgrilli blue was obtained in Example 3 using cDNA library (Nature366, 276-279, 1993). Screening was performed using the full length of the gene AmGTl. Screening of the library was performed using a non-radiosystem DNA detection kit (Belinger). Hybridization was performed at 37 ° C., and filter washing was performed using 5 ⁇ SSC, 0.1% SDS at 50 ° C. for 30 minutes. Approximately 200,000 plaques were screened, and finally two types of clones were obtained. The method was based on Molecular Cloning (Sambrook et. Al. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).
  • the two clones were named pPh7GTa and pPh7GTb, respectively, and their base sequences were determined.
  • the nucleotide sequence was determined by synthesizing the oligonucleotide primer and using DNA Sequencer model 310 (Applied Biosystems).
  • P The nucleotide sequence and predicted amino acid sequence at the insertion site in Ph7GTa are shown in SEQ ID NOs: 7 and 8, respectively, and the nucleotide sequence and predicted amino acid sequence at the insertion site in pPh7GTb are sequenced, respectively. No .: Shown in 9 and 10.
  • pPh7GTa contained a 1750 bp gene Ph7GTa encoding a protein consisting of 488 amino acids
  • pPh7GTb contained a 1669 bp gene Ph7GTb encoding a protein consisting of 476 amino acids.
  • AmGTl derived from goldfish and pS.b UFGT1 derived from Scutellaria obtained in Example 3 were compared with PhGTGT, and AmGTl and pS.b UFGT1 were identified as Ph7GTa. Indicate 50% and 51% homology, respectively. Was.
  • Ph7GTa gene expression was performed using the pET System (Stratagene). To introduce the Ndel and BamHI sites first, the following two primers were used: pETPh7GTa5 '[5'-ATA ACT ACA TAT GGC TAT TCC CAC A-3' (SEQ ID NO: 11)] and pETPh7GTa3 '[ 5'-GAA CAG GAT CCT AAA AGG ACC T-3 '(SEQ ID NO: 12)]
  • the PCR reaction solution was pAmGTl lOOng, lx cloned Pfu DNA polymerase reaction buffer (Stratagene), 0.2 mM dNTPs, each primer 0.5 pmo 1/1, cloned Pfu DNA polymerase. 5. Adjusted to a total volume of 100 1 consisting of OUn it. The reaction is performed at 95 ° C for 45 seconds, followed by 25 cycles of 95 ° C for 45 seconds, 50 ° C for 45 seconds, and 72 ° C for 2 minutes, and finally for 10 minutes at 72 ° C. Processed. The obtained PCR product was subcloned into pCR2.1 T0P0 vector (INVI TR0GEN).
  • pETPhGTa was used to transform Epicurian Co1i BL21 (DE3) (Stratagene).
  • pETPh7GTb5 ′ [5′-ATA ACT ACA TAT GGG TCA GCT CCA-3 ′ (SEQ ID NO: 13)] and pETPh7GTb3
  • plasmid pETPhGTb was similarly obtained.
  • Example 8 The transformant obtained in Example 8 was cultured and extracted as in Example 1, and the enzyme activity was measured. Enzyme activity was measured using auredin as a substrate. The enzyme activity was measured in the same manner as described in Example 1.
  • Ph7GTa and Ph7GTb peaks having the same retention time and spectrum as those of auredin 6-glycoside were detected as reaction products.
  • Ph7GTa one kind of peak expected to be an aurone glycoside from the absorption spectrum was obtained
  • Ph7GTb two kinds of peaks were obtained.
  • Ph7GTa and Ph7GTb encode an enzyme having an activity of glycosylating aurethidine.
  • aurone could be glycosided. This enabled stable expression of olone in plant cells.

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Description

一- 明 細 書 オー ロ ンに糖を転移する活性を有する蛋白質をコ一 ドする遺伝子 発明分野
本発明は、 オーロ ンに糖を転移する活性を有する蛋白質をコー ド する遺伝子、 蛋白質及びその利用方法に関する ものである。 背景技術
花色は主にフラボノ ィ ド、 カロテノ ィ ド、 ベタ レイ ンの 3 種の色 素に基づいている。 黄色は、 主にカロテノ ィ ド及びべタ レイ ンに由 来するこ とが多いが、 一部の植物の黄色はフラボノ ィ ドに由来する 。 フラボノ ィ ド色素の中で黄色花の発現に関係する と考えられる主 な色素は、 カルコ ン類、 オーロ ン類、 黄色フラボノ ール類の三つの グループに分けられる （斎藤、 バイオホルティ 1 、 p49 - 57、 1 990 ) o
オー ロ ンは、 2 つのフ ヱニル基がジ ヒ ドロフ ラ ンの 3 つの炭素原 子を介して結合している物質であり、 オーロ ンと しては、 4， 6， 4 ' - ト リ ヒ ドロキシォ一ロ ン、 オー レゥ シ ジ ン、 スノレフ レチ ン、 ブラ ッ クテアチン等が知られている。 例えば、 金魚草には、 オー レゥ シジ ンとブラ ッ クテアチンが、 スターチスにはオーレゥ シジンが、 アサ ガオにはオーレゥ シジンが、 ダリ アにはスルフ レチン力く、 ムギワラ ギクにはブラ ッ クテアチンが、 キクイモにはスルフ レチンが含まれ ている。
一般にフラボノ ィ ドはァ シル化、 配糖化、 メ チル化などの修飾を 受けており、 カロテノ ィ ド、 ベタ レイ ンも配糖化されているこ とが 多い。 さまざまな修飾のう ちでも配糖化は、 1 ) 色素の安定性と溶 解性の増大への寄与、 2 ) 色調に大きな影響を及ぼすァシル化のた めの前段階と しての存在、 3 ) 配糖化されたフラボノ ィ ドによるコ ピグメ ン ト効果など花色にと って重要な役割を担っている。
金魚草では、 フラボノ イ ドの 1 種である黄色色素オーロ ン （ォ一 レゥ シ ジ ン、 ブラ ッ ク テアチ ン） はフ ラボノ ィ ドの 7位に対応する その 6位を配糖化された形で存在している こ とが報告されており、 また他のオーロ ンを含む植物でもオーロ ンは配糖体と して存在する こ とから、 配糖化はオーロ ンが安定して存在するために必要である と考えられる。
フラボノ ィ ドへの糖転移酵素遺伝子および酵素活性はさまざまな 植物由来のものについて報告がなされている。
例えば、 フラボノ ィ ドの 3位に糖を転移する UDP -グルコース ： フ ラ ボノ イ ド 3 — ダルコ シル ト ラ ンスフ ェ ラ 一ゼ （ 3 G T ) をコ ー ド する遺伝子は、 トウモロコ シ、 大麦、 金魚草をはじめと して多 く の 植物から得られており、 詳細に解析されている （The Flavonids: A dvanced in research since 1986. Published by Chapman & Hall, 1993)。
また、 フラボノ ィ ドの 5位に糖を転移する UDP -グルコース ： フラ ボノ イ ド 5 — グルコ シル ト ラ ンスフ ヱ ラ 一ゼ （ 5 G T ) をコー ドす る遺伝子は、 シソ、 ト レニァ及びバーペナからク ローニングされて いる （国際公開番号 ； W099/05287) 。
しかしながら、 フラボノ ィ ドの 7 位に糖を転移する UDP -ダルコ一 ス ： フラボノ イ ド 7 —ダルコ シル トラ ンスフ ェ ラ ーゼ （ 7 G T ) を コー ドする遺伝子は、 グレープフルーツでフラバノ ン特異的 7 —グ ルコ シル トラ ンスフ ヱラーゼの精製の報告があるのみである （Arch ives of biochemistry and biophysics 282, 1, 1990， 50-57) 0 オーロ ンの 6 位に糖を転移する酵素について、 キク科植物のク レ . ォプシス · グラディ フ ロラ ( Creops i s grandi flora) で、 オーロ ン の一種であるスルフ レチ ンの 6位に糖を転移する反応を測定した例 はある （Plant science 122, 1997, 125-131) 力く、 部分精製標品を 思いて酵素学的性質を調べたにとどま っており、 純粋な形まで精製 された報告はない。
一方、 シソ科植物コガネバナの毛状根からフラボンの 1 種である 、 バイカ レイ ン （baicalein)の 7位にグルコースを転移する活性を 持つ糖転移酵素遺伝子 · PS. b UFGTlが単離されたとの報告がある （ 1997年、 第 1 5回日本植物細胞分子生物学会発表） 。 この遺伝子産 物は、 ア ン ト シァニジ ン及びフラボノ ールの 7位にも糖を転移でき るこ とが報告されている （第 1 5回日本植物細胞分子生物学会発表 ) 力く、 オーロ ンに対しては報告されていない。
pS. b UFGTlに相同性の高い遺伝子と しては、 すでにタバコ由来の ISlOa 及び IS5aが報告されている （Plant molecular biology, 31: 1061-1072， 1996)が、 7位への糖転移活性 （7GT 活性） については 調べられていない。
今までの報告から、 フラボノ ィ ドを基質とする糖転移酵素は、 フ ラボノ ィ ド間でも基質特異性に大きな差があるこ とが知られている 。 例えば、 リ ン ドウ由来のフラボノ ィ ドー 3 —糖転移酵素遺伝子を ク ロー ン化し大腸菌で発現させ、 活性を測定したところ、 デルフ ィ 二ジ ンに対する糖転移活性を 100 %と した際、 シァニジ ンに対して は 61、 ペラルゴ二ジンに対しては 38%の活性を示し、 アン ト シァニ ジンに対しては良好な活性である。 一方、 フラボノ ールである、 ケ ンフ ヱ ロール、 ケルセチン及びミ リ セチンに対してはそれぞれ、 7. 0 %、 6.5 %及び、 4.4 %の活性しか示さない。 さ らに、 ジヒ ドロ フラボノ ールに対しては全く糖を転移しない （Tanaka et al. Plan t Cell Physiol. 37， 711, 1996)。 また、 ブ ドウ由来のフラボノ ィ ドー 3 —糖転移酵素遺伝子をク ロ 一ン化し大腸菌で活性を測定したと ころ、 シァニジ ンに対する Kmは 30 ζ Μ 、 Vmaxは 905 nkatal s/mgであるのに対し、 ケルセチンに対す Kmは 15 /M 、 11^ は18.9 nkatals/mg であり、 反応速度に大きな 差があった （Ford et al. J. Biol. Chem. 273, 9224, 1998) 。
これらの報告は、 糖転移酵素はフラボノ ィ ドの種類を認識できる こ と、 およびあるフラボノ ィ ドへの糖転移活性から他のフラボノ ィ ドへの糖転移活性を容易に類推できないこ とを示している。
発明の開示
このよ う に、 フラボノ ィ ドを基質とする糖転移酵素は、 基質特異 性に大きな差があり、 既に知られている糖転移酵素から、 特定のフ ラボノ ィ ドへの糖転移酵素活性を予測するこ とは困難であった。 そこで、 本発明者らは、 フラボノ ィ ド色素のう ち、 オー ロ ンに糖 を転移する活性を有する蛋白質をコ一 ドする遺伝子を得るこ とを課 題と し、 本発明を完成した。
本発明者らは、 コガネバナ由来の pS. b UFGT1遺伝子産物が、 ォー ロ ンへの糖転移活性を有しているこ とを明らかに し、 この遺伝子を プロ一ブと してさ らに金魚草 （Ant i rrhinum ma j us)よりォ一ロ ンに 糖を転移する活性を有する蛋白質をコ一 ドする遺伝子を取得した。
また、 金魚草より得られた該遺伝子をプローブと して、 さ らにべ チュニァ （Petunia hybrida)よ りォ一口 ンに糖を転移する活性を有 する蛋白質をコー ドする遺伝子を 2種類取得した。
従って本発明は、 オーロ ンに糖を転移する活性を有する蛋白質を コー ドする遺伝子を提供する。 さ らには、 配列番号 2、 8 又は 10に 記載のア ミ ノ酸配列を有するオーロ ンに糖を転移する活性を有する 蛋白質をコー ドする遺伝子を提供する。 本発明はさ らに、 配列番号 2、 8 又は 1 0記載のァ ミ ノ酸配列に対 して 1 個又は複数個のァ ミ ノ酸の付加、 欠失及び Z又は他のア ミ ノ 酸による置換によ り修飾されているァ ミ ノ酸配列を有し、 且つォ一 ンに糖を転移する活性を有している蛋白質をコー ドする遺伝子を 提供する。
本発明はさ らに、 配列番号 ： 2、 8又は 1 0のいずれかに記載のァ ミ ノ酸配列をコ一 ドする塩基配列又はその部分を有する核酸とス ト リ ンジェン 卜な条件下でハイブリ ダィズし、 且つォ一ロ ンに糖を転 移する活性を有している蛋白質をコー ドする遺伝子を提供する。 本発明はまた、 上記遺伝子を含んでなるベク タ一を提供する。 本発明はさ らに、 上記べク タ一により形質転換された宿主を提供 する。 この宿主は、 微生物、 植物細胞、 動物細胞等の細胞であって もよ く 、 また植物体であってもよい。
本発明はまた、 上記宿主を培養、 栽培または飼育する こ とにより オーロ ンに糖を転移する活性を有する蛋白質の製造方法を提供する こ とができる。
本発明はまた、 オーロ ンを有する植物において、 上記遺伝子を植 物体内に導入し、 該遺伝子を発現せしめ、 生成した蛋白質により植 物体内のオーロ ンに糖を転移させる こ とにより植物体内におけるォ
—ロ ンの安定化方法を提供する。
また、 オーロ ンを持たない植物においては、 オーロ ン合成酵素遺 伝子を導入し、 発現させて新たな色の花を作出する場合も、 同様に 本発明により得られる遺伝子を発現させる こ とによ り、 オーロ ンを 安定的に発現させる こ とができる。 図面の簡単な説明
図 1 はプラス ミ ド p E S B GT - 1 の作製方法を示す図である。 図 2 はプラス ミ ド pETAmGTlの作製方法を示す図である。 発明の実施の形態
—まず、 黄色の金魚草の花弁の c DNA ライブラ リ ーを作成する。 得 られた c DNA ライブラ リ ーを、 コガネバナ由来のフラボノ イ ド 7 — 糖転移酵素遺伝子である pS. b UFGTlを用いてスク リ ーニングし、 ク ローンを得る。 そ して、 このク ローンから得られるプラス ミ ドを分 離し、 塩基配列を決定する。
酵素活性を有する蛋白質は、 その酵素活性に必須の領域と、 酵素 活性のために必須でない領域を有し、 必須でない領域が 1 または複 数個のァ ミ ノ酸の欠失、 付加及び/又は他のァ ミ ノ酸による置換に より修飾されてもその酵素活性が維持される こ とが知られている。 従って、 本発明は、 配列番号 ： 2、 8又は 10に示すア ミ ノ酸配列を 有する蛋白質のみならず、 配列番号 ： 2、 8又は 10に示すア ミ ノ酸 配列において、 1 個から複数個のア ミ ノ酸配列の欠失、 付加、 及び /又は他のァ ミ ノ酸による置換により修飾されているァ ミ ノ酸配列 を有し、 且つオーロ ンに糖を転移する活性を有している蛋白質、 及 び該蛋白質をコー ドする遺伝子も本発明に含まれる。
修飾されるア ミ ノ酸数は、 例えば 50個以下、 好ま し く は 30個以下 、 例えば 20個以下又は 10個以下である。
本発明の配列番号 ： 2、 8又は 10に示すア ミ ノ酸配列を有する蛋 白質をコー ドする遺伝子は、 cDNAまたはゲノ ム DNA と して、 金魚草 又はペチュニアから得るこ とができる。 c DNA のク ロ一ニ ング方法 は、 実施例 2〜 3及び 6 に具体的に記載されている。 ゲノ ム DNA を 得るには、 金魚草又はペチュニアから常法に従ってゲノ ムライブラ リ ーを作製し、 それを前記 cDNA又はその断片により常法に従ってス ク リ ーニングするこ とにより得るこ とができる。 本発明の配列番号 ： 2、 8又は 10に示すア ミ ノ酸配列に対して修 飾されたァ ミ ノ酸配列を有する蛋白質をコ一 ドする遺伝子は、 配歹 番号 ： 2、 8又は 10に示すア ミ ノ酸配列を有する蛋白質をコー ドす る DNA 、 例えば cDNAの塩基配列を、 部位特定変異誘導、 PCR 法等、 遺伝子を操作するため常法に従って修飾するこ とにより作製する こ とができる。
酵素活性を有する蛋白質をコ一 ドする遺伝子がク ローニ ングされ れば、 該遺伝子又はその部分とハイブリ ダィズする核酸は、 同様の 酵素活性をコ一 ドし且つもとの蛋白質と類似するァ ミ ノ酸配列をコ — ドしているこ とが多い。 従って本発明は、 配列番号 ： 2、 8 又は 10のいずれかに記載のア ミ ノ酸配列をコー ドする塩基配列又はその 部分を有する核酸とス ト リ ンジェン 卜な条件下でハイブリ ダィズし 、 且つオーロ ンに糖を転移する活性を有する蛋白質をコー ドする遺 伝子を提供する。
上記のハイブリ ダイゼ一ショ ンの条件において、 洗浄条件と して は、 5 X SSC 、 0. 1 % SDS 、 50°Cが好ま しく 、 さ らに好ま しく は 2 X SSC 、 0. 1 % SDS 、 50°C、 さ らに好ま しく は 0. 1 x SSC 、 0. 1 % SDS 、 50°Cである。
また、 上記のハイブリ ダィゼ一シ ヨ ンにおいて、 配列番号 ： 2、 8又は 10に記載のア ミ ノ酸配列をコー ドする塩基配列の部分を有す る核酸を使用する場合、 その核酸の長さは少な く と も 17塩基対の長 さを有し、 好ま し く は少なく と も 100 塩基対の長さを有する。 ハイ プリ ダイゼ一 シ ョ ンの対象となる核酸と しては、 例えばコガネバナ 、 金魚草、 ペチュニア、 スターチス、 アサガオ、 ダ リ ア、 ムギワ ラ ギク、 キクイモなどから調製した核酸、 好ま し く はゲノ ム DNA ライ ブラ リ 一又は cDNAライブラ リ ーが使用される。
本発明はまた、 オーロ ンへの糖転移活性を有する上記の蛋白質の 製造方法を提供する。 この方法は、 前記の蛋白質をコー ドする DNA を含んでなるベク タ一を宿主に導入し、 そ して該宿主を培養し、 又 は成育させ、 そ して所望により前記蛋白質を採取するこ とを特徴と する。 宿主と しては宿主細胞でもよ く 、 また植物等の生物体であつ てもよい。
宿主細胞と しては、 原核細胞、 特に細菌細胞、 例えば大腸菌 （Es cherichia col i) 、 バシルス （Bacillus) 属細菌、 例えばバシルス ' サブチ リ ス （Bacillus subtil is)ヽ バシルス . ブレ ビス （Bacill us Brevis)等、 下等真核生物、 例えば真菌類、 例えば酵母、 例えば サッカロ ミ セス （Saccharomyces)属酵母、 例えばサッ カロ ミ セス ' セ レ ヒ シェ (Saccharomyces cerev i s iae) 、 あるいは糸；!犬菌、 列え ばァスペルギルス （Aspergi llus)属糸状菌、 例えばァスペルギルス * 才 リ ゼ一 （Aspergillus oryzae) 、 ァスぺノレギノレス · 二力、、一 (As pergi 1 lus niger)等力く挙けられる。
さ らに高等真核生物細胞宿主と しては、 昆虫細胞、 例えばカイ コ の細胞、 動物細胞、 例えば CH0 細胞、 ヒ ト培養細胞、 例えば HeLa細 胞等が挙げられる。
本発明の遺伝子はまた、 生物体、 例えば植物等において発現せし めることができる。
本発明の DNA を含んでなるベクタ一、 特に発現べク タ一は発現制 御領域を含有し、 発現制御領域は宿主細胞に依存する。 例えば、 細 菌発現べク タ一のプロモーターと しては、 trc プロモータ一、 tac プロモーター、 lac プロモータ一、 T7プロモータ一等を使用するこ とができ、 酵母発現ベクターのプロモーターと しては、 例えば解糖 系酵素遺伝子のプロモータ一、 例えばグリ セロアルデヒ ド 3 リ ン酸 デヒ ドロゲナ一ゼプロモータ一、 ガラ ク トキナ一ゼプロモーター等 を使用することができ、 また、 動物細胞用発現ベク ターのプロモ一 ターと しては、 ウィ ルスプロモータ一を使用する こ とができる。 培養物から、 オーロ ンに糖を転移する活性を有する蛋白質を採取 するには、 液体ク ロマ ト グラフ ィ ー、 ァフ ィ 二ティ 一ク ロマ ト グラ 2 ィ 一等、 蛋白質の単離、 精製に用いられる常用手段を用いるこ と ができる。
現在の技術水準をもってすれば、 さ らに、 この c DNAを、 構成的な あるいは誘導型のプ口モータ一の制御下に連結し、 ァグロバクテ リ ゥムを用いるシステムあるいはパーティ クルガン、 エレク ト ロポー レ一シ ヨ ンを用いる システムで、 植物例えばペチュニア、 バラ、 力 —ネーシ ヨ ン、 キク、 ト レニァ、 バーべナ、 ガ一ベラ、 タバコ、 ィ チゴ、 トルコギキヨ ウ、 リ ン ドウ、 グラ ジオラス、 チュー リ ップ等 に導入すれば、 花弁などでォ一口 ンに糖を転移する活性を有する蛋 白質をコー ドする遺伝子を発現させるこ と も可能である。
オーロ ンに糖を転移する活性を有する蛋白質が発現した花弁など ではォ一口 ンが配糖化され、 ォ一口 ンが安定化するこ とが予想され る。 このようにして得られた植物は、 従来の品種には存在しないよ うな色調の花を提供するこ とができる。
また、 オーロ ンを持たない植物においては、 オーロ ン合成酵素遺 伝子を導入し、 発現させ、 さ らに本発明のオーロ ンに糖を転移する 活性を有する蛋白質をコー ドする遺伝子を同時に導入し、 発現させ るこ とにより、 オーロ ンを安定的に発現させ、 黄色の色調を有する 新たな植物を提供するこ とができる。 前記オーロ ンを持たない植物 と してはペチュニア、 ト レニァ、 タバコなどが挙げられる。 実施例
以下に本発明の実施例を示し、 発明を詳細に述べる。
実施例 1 . コガネバナ由来 p S . b UFGT 1遺伝子産物のォ一ロ ンへの 糖転移活性の測定
コガネバナ由来 pS. b UFGTl遺伝子のォ一口 ンへの糖転移活性につ いて、 以下に記載の方法により作製した大腸菌での発現ベク ター pE SiGT- 1を用いて測定した。
まず、 pS. b UFGTl遺伝子を以下の 2種類のプライマーを用いて PC R 反応を行い、 Ndel及び BamHI サイ トを導入した。
5' -ATA ACT ACA TAT GGG ACA ACT CCAC-3' (配列番号 ： 3 )
5' -CAG AAC AGG ATC CAC ACG TAA TTT A-3' (配列番号 ： 4 )
PCR 反応液は、 pSBGT- 1 300ng 、 lx Native Pfu DNA ポ リ メ ラ一 ゼ反応緩衝液 （Stratagene) 、 0.2mM dNTPs 、 プライマー各 4pg/〃 1 、 Native Pfu DNAポ リ メ ラーゼ 2.5Uからなる総体積 50〃 1 に調整 した。 反応は、 95°Cで 3分反応させた後、 95°C · 1 分、 50°C · 2分 及び 72°C · 2分の反応を 1 サイ クルと し、 30サイ クル行い、 最後に 72°Cで 7分間処理した。
得られた PCR 産物を Ndel及び BamHI で消化し、 同じ く Ndel及び Ba mHI で消化した pET- 3aベクター （Stratagene) と連結し、 pESBGT - 1 を構築した （図 1 ) 。 pESBGT - 1および pET-3aベク タ一を用いて、 そ れぞれェピク リ ア ン * コ リ （Epicurian Coli) BL2KDE3) (Stratag ene)に形質転換した。 形質転換株は、 ア ン ピ シ リ ン 50 g/mlを含む L B培地 3 mlで 37°Cで一晩振とう培養した。 その前培養 500 1 を 、 ア ン ピシ リ ン 50〃 g/mlを含む L B培地 50mlに加え A600 = 0.6 〜 1. 0 に達するまで培養した後、 IPTG (イ ソプロ ピル - /3 チォガラ ク ト ビラノ シ ド） を終濃度 0.5mM になるよ う加え、 28°Cで 4 時間培 養し、 冷却遠心機 （ 5000rpm， 10分間、 4 °C ) で、 集菌した。
ペレツ トを 5 mlの緩衝液 （lOmMリ ン酸ナ ト リ ウム、 pH6.5， ImM /3—メルカプ トエタノ ール（2- ME)) に懸濁し、 超音波破砕機で大腸 菌を破砕した後、 遠心分離 （15， 000rpm， 5分、 4 °C ) し、 得られた 上清を粗酵素液と し、 以下の酵素反応に用いた。
酵素活性はオーレウ ンジンに加えて、 ナ リ ンゲニン又はルテオ リ ンを基質と して測定した。
—オーレゥ シジンについては、 以下のように酵素活性を測定した。 粗酵素液 に 0.1M Tris-HCl, pH8.0， 0.05% 2-ME 150〃 1 を 加え、 30°Cで 10分間保温した。 その後 4.66mMオーレゥ シジン 5〃 1 、 5mM UDP -グルコース 50〃 1 を加え、 30°Cで 1 時間反応させた。 5 % TFA (ト リ フルォロ酢酸） を含む 90%ァセ トニ ト リ ル 200 ^ 1 を 加え、 反応を停止させた後、 15, 000 rpm、 3分、 4 °Cで遠心分離し 、 得られた上清をフ ィ ルタ一 （ポアサイズ 0.45 Π1 、 4 mm Mi 11 ex - LH、 ミ リ ポア） を用いて不溶物を除去した。 これを液体高速ク ロマ トグラフ ィ 一で分析した。
分析条件は以下の通りである。 カラムは Asahipak-ODP-50 (4.6mm 0 x25Omm、 昭和電工） を用いて、 移動相には A 溶液と して TFAO. 1 % を含む H20 、 B 溶液と して TFA0. 1% を含む 90%CH3CNを用い、 B 液 20 から B 液 100 のリニアグラ ジェン ト 20分間の後 B100% を 5 分間保 持した。 流速は 0.6ml/min.で行った。 検出は A380nm及び島津 PDA 検 出器 SPD- M6A で 250- 400nm の吸収スぺク トルを測定した。
pESBGT- 1を発現させた大腸菌の粗抽出液を反応させたものでは、 基質のオーレゥシジン （保持時間 18. 1分） に加え、 9.7 分、 12.0分 及び 13. 1分に溶出される新たな物質が検出された。 これらは pET- 3a ベク ターを発現させた大腸菌から同様に調製した粗抽出液を反応さ せたものでは、 検出されなかったこ とから pESBGT- 1に由来する蛋白 質によって生じた産物と考えられる。 これらの産物のう ち、 12.0分 に溶出される物質は、 オーレゥ シジン 6—グリ コ シ ドと保持時間お よび吸収スぺク トルが一致した。 他の産物においても吸収スぺク ト ルからォ一レゥ シジン配糖化物と判断される。 また、 ナリ ンゲニン及びルテオリ ンについては以下のように酵素 活性を測定した。
粗酵素液 20 1、 0.1Mクェン酸— リ ン酸緩衝液、 pH 6.5， 25〃 1 一 5 〃 Mの各基質 5 〃 1 、 5mM UDP-グルコース 25〃 1 を含む総体積 250 // 1 で 30°C、 30分間反応させた。 5 % TFAを含む 90 %ァセ トニ ト リル 200 1 を加えて反応を停止させた後、 15, 000 rpm、 3分、 4 °Cで遠心分離し、 得られた上清をフ ィ ルタ一 （ポアサイズ 0.45〃 m 、 4 mm Millex- LH、 ミ リ ポア） を用いて不溶物を除去した。 これ を高速液体ク ロマ トグラフ ィ 一で分析した。
ナリ ンゲニンの分析条件は以下の通りである。 カラムは YMC J' sp here ODS-M80(4.6mm0 xl50mm, YM C ) を用いて、 移動相には A 溶 液と して TFA0.1% を含む H20 、 B 溶液と して TFA0.1¾ を含む 90%CH3 CNを用い B20%から B80%のリニアグラ ジェン ト 10分間の後 B80%を 5分 間保持した。 流速は 0.6ml/min.で行った。 検出は A290nm及び島津 PD A 検出器 SPD- M6A で 250 〜 400nm の吸収スぺク トルを測定した。
ルテオリ ンの分析条件は以下の通りである。 YMC J' sphere 0DS-M 80(4. G ≠ xl50mm) を用いて、 移動相には A 溶液と して TFA0.1 % を 含む H20 、 B 溶液と して TFA0.1% を含む 90%CH3CNを用い B20%から B8 0%のリニアグラ ジェン ト 10分間の後 B80%を 5分間保持した。 流速は 0.6ml/min.で行った。 検出は A330nm及び島津 PDA 検出器 SPD-M6A で 250 〜400nm の吸収スぺク トルを測定した。
ナリ ンゲニンを基質と した場合、 ナ リ ンゲニン （保持時間 9.7分
) に加え、 6.9分に溶出される新たな物質が検出された。 この物質 は、 pET- 3aベクタ一を発現させた大腸菌から同様に調製した粗抽出 液を反応させたものでは、 検出されなかった。 ナ リ ンゲニン 7 — グリ コ シ ドと保持時間は一致したものの吸収スぺク トルがー致せず 、 複数のナリ ンゲニンダルコ シ ドが、 それぞれ微量存在している こ とが示唆される。
ルテオ リ ンを基質と した場合、 ルテオリ ン （保持時間 9.3分） に 加え、 6.4分、 7.7分、 8.0分に溶出される pET- 3aベク タ一を発現 させた大腸菌から同様に調製した粗抽出液を反応させたものでは、 検出されなかった新たな物質が検出された。 このう ち 6.4分に溶出 される物質は、 ルテオリ ン 7 —グリ コ シ ドと保持時間が一致した。 以上のことから、 コガネバナ由来 pS. b UFGT1遺伝子は、 オー レゥ シジンを配糖化できる酵素であるこ とが、 明らかになった。 また、 ルテオリ ンも配糖化できる力く、 ナリ ンゲニンに対しては、 ほとんど 働かないことが明らかになった。
すでにバイカ レイ ン （baicalein)に対しては、 7位に配糖化でき るこ とが明らかになつている。 バイカ レイ ン （baicalein)に対して は、 反応後、 ほぼ 100%が 7配糖化物と して検出されるにも関わらず 、 ナリ ンゲニンに関してはほとんど反応せず、 コガネバナ pS. b UFG Tl遺伝子発現産物もまた基質特異性の高いこ とが明らかとなつた。
実施例 2. 金魚草花弁 cDNAラィブラ リ 一の構築
花弁の cDNAライブラ リ ーは以下の方法により作製した。 黄色の金 魚草 （エローバタフライ） の新鮮な花弁 5 gから R. McGookin らの Method in Molecular Biology vol. 2 (Humana Press Inc. 1984) に詳細に示されているチオシァン酸グァニジン · 塩化セシゥムを用 いる方法で RNA を得、 ォリ ゴテッ クス dT30 (日本ロ シュ） を用いて polyA + RNA を精製した。 この polyA + RNA から、 cDNA合成キッ ト、 Un 卜 XRベク タ一キッ ト （Stratagene) を用いて、 cDNAライブラ リ 一を 構築した。 得られたライブラ リ 一は、 1.6 105 プラーク形成ュニ ッ ト （pfu)からなつていた。
実施例 3 , 完全長オーロ ン糖転移酵素遺伝子の取得
実施例 2 により得られた金魚草 cDNAライブラ リ ーを、 コガネバナ 毛状根由来フラボノ ィ ド 7 —糖転移酵素遺伝子である pS. b UFGT1 の全長を用いてスク リ ーニングした。 ライブラ リ ーのスク リ ーニン グはノ ンラ ジオシステム DNA 検出キッ ト （ベー リ ンガー） を用いて 行った。 ノヽイブリ ダィゼ一シ ヨ ンは、 37。Cでー晚行い、 フ イ ノレター の洗浄は 5 X SSC 、 0.1%SDSを用いて 50°Cで 30分間行った。 約 20万 プラークをスク リ ーニングし、 最終的に 2 つのク ローンを得た。 方 法は Molecular Cloning (Sambrook e t. al . Cold Spring Harbour L aboratory Press, 1989)によった c
2 つのク ローンは、 ま ったく 同 じ長さの配列をコ一 ドしていたの で、 一方を pAmGTlと名づけ、 塩基配列を決定した。
塩基配列はオ リ ゴヌ ク レオチ ドプライマ一を合成し、 DNA Sequen cer model 310 (Applied B i osy s t ems)を用いて決定した。 塩基配列 と推定ァ ミ ノ酸配列を配列表 · 配列番号 1 に示した。
pAmGTlは、 481 ア ミ ノ酸からなる分子量 53.9kDa の蛋白質をコー ドする 1751bpの遺伝子 AmGTl を含んでいた。
実施例 4 . 大腸菌における AmGTl cDNAの発現
AmGTl 遺伝子の発現は、 pET System (Stratagene) を用いて行つ た。
最初に、 Ndel及び BamHI サイ トを導入するために、 以下に示すプ ライマー 2種 pETAmGT5' 及び pETAmGT3' を用いて PCR 反応を行った pETAmGT5' ： 5' -ATA ACT ACA TAT GGG AAA ACT TCA C_3' (配列番 号 ： 5 )
pETAmGT3' ： 5' -GAA CAG GAT CCA CAC ACT AGA AGT CA-3' (配列 番号 ： 6 )
PCR 反応液は、 pAmGTl lOOng, lxク ローン化 Pfu DNA ポ リ メ ラー ゼ反応緩衝液 （Stratagene) 、 0.2mM dNTPs 、 プライマ—各 0.5pmo M 1 、 ク ロ一ン化 Pfu DNA ポ リ メ ラ一ゼ 5.0 からなる総体積 1 00〃 1 に調整した。 反応は、 95°Cで 45秒反応させた後、 95°C · 45秒 、 50°C · 45秒及び 72°C · 2分の反応を 25サイ クル行い、 最後に 72°C で 10分間処理した。 得られた PCR 産物を pCR2.1 T0P0 ベク タ一 （ IN VITR0GEN) にサブク ロ一ニングした。
このようにして得られたプラス ミ ド pTOPO- ETAmGTl のい く つかの ク ロー ンを M13 Reverse Primer及び M13(- 20)プライマ一 （T0Y0B0) を用いて ABI PRISM ™ BigDye ™ Terminator Cycle Sequencing R eady Reaction Kit (Applied B i osys tems)を用いて反応し、 DNA Se quencer model 310 (Applied B i osys tems)を用いて、 両端の塩基酉己 列を確認した。 pTOPO- ETAmGTl を Ndel、 BamHI および Sealで制限酵 素処理し得られた約 2.7Kb のフ ラ グメ ン トを pET- 3a ベク タ一 （St ratagene) の Ndelと BamHI サイ トに連結し、 プラス ミ ド pETAmGTlを 得た （図 2 ) 。 pETAmGTlを用いて、 ェピク リ ア ン · コ リ （Epi curia n Col i) BL2KDE3) (Stratagene)に形質転換した。
実施例 5. AmGTl cDNA組換え蛋白の糖転移酵素活性の測定
実施例 4 にて得られた形質転換株は、 実施例 1 に示したよう に培 養、 抽出 し、 酵素活性を測定した。
オーレゥ シジンを基質と した場合、 オーレゥ シジン （保持時間 16 .6分） に加え、 10.98分、 11.27分及び 11.85分に溶出される新た な物質が検出された。 これらは pET- 3aべク タ一を発現させた大腸菌 から同様に調製した粗抽出液を反応させたものでは、 検出されなか つたこ とから pESBGT- 1に由来する蛋白質によって生じた産物と考え れな（：）
これらの産物のうち、 10.98分に展開される物質は、 オーレゥ シ ジ ン 6—グリ コシ ドと 11.85分に展開される物質は、 オー レゥ シジ ン 4ーグリ コ シ ドと保持時間が一致した。 以上の結果から AmGTl は、 オーレゥ シジ ンの 6位及び 4 位を配糖 化できることが明らかになった。 11.27分に検出される物質につい てもその吸収スぺク トルからオーレゥ シジン配糖化物であろう と推 察される。
実施例 6. ペチュニア由来のオーロ ン糖転移酵素遺伝子の取得 ペチュニア品種オール ドグロ一 リ 一ブルーの花弁由来の cDNA lib raryを使用 し （Nature366， 276-279, 1993) 、 実施例 3 で得られた 遺伝子 AmGTl の全長を用いてスク リ ーニングした。 ライブラ リ ーの スク リ 一ニングはノ ンラ ジオシステム DNA 検出キッ ト （ベ一 リ ンガ ―) を用いて行った。 ハイブリ ダィゼーシ ヨ ンは、 37°Cでー晚行い 、 フ ィ ルタ一の洗浄は 5 X SSC, 0.1%SDS を用いて 50°Cで 30分間行 つた。 約 20万プラークをスク リ ーニングし、 最終的に 2種類のク ロ —ンを得た。 方法は Molecular Cloning (Sambrook et. al. Cold Sp ring Harbour Laboratory Press, 1989)によった。
2種類のク ローンをそれぞれ pPh7GTa 及び pPh7GTb と名づけ、 塩 基配列を決定した。 塩基配列はォリ ゴヌ ク レオチ ドプラィマ一を合 成し、 DNA Sequencer model 310 (Applied B i osy s tems)を用いて決 定した。 PPh7GTa 中の揷入部の塩基配列と推定ア ミ ノ酸配列をそれ ぞれ配列番号 ： 7及び 8 に示し、 そ して pPh7GTb 中の揷入部の塩基 配列及び推定ァ ミ ノ酸配列をそれぞれ配列番号 ： 9及び 10に示す。
実施例 7. ォ一口 ン配糖化酵素遺伝子の構造解析
pPh7GTa は、 488 ァ ミ ノ酸からなる蛋白質をコ一 ドする 1750bpの 遺伝子 Ph7GTaを含んでおり、 pPh7GTb は、 476 ア ミ ノ酸からなる蛋 白質をコー ドする 1669bpの遺伝子 Ph7GTbを含んでいた。 得られた推 定ア ミ ノ酸配列を用いて、 実施例 3 で得られた金魚草由来の AmGTl 、 コガネバナ由来の pS. b UFGT1と各々比較したところ、 Ph7GTaは、 AmGTl 及び pS. b UFGT1とは、 それぞれ 50%及び 51 %の相同性を示し た。 その他に pS. b UFGT1に相同性の高い遺伝子と して既に報告され ているタバコ由来の IS5a及び ISlOa と比較したところ、 それぞれ 59 %及び 60%の相同性を示した。 同様に、 Ph7GTbは AmGTl 及び pS. b U FJT1とは、 それぞれ 59%及び 56%の相同性を示し、 タバコ由来の IS 5a及び ISlOa と 88%及び 86%の相同性を示した。
一方、 フラボノ ィ ドの 3位を配糖化する酵素遺伝子 （Tanaka et al. (1996) Plant Cell and Physiology 37 : 711 -716 : Fru t ek D， Sch ief elbein JW, Johnston F， Nelson Jr, 0E (1988) Plant molecul ar biology 11 :473-481, Wise RP, Rohde W, Salamini F (1990) P lant molecular biology 14 : 277- 279)や、 フラボノィ ドの 5位を配 糖化する酵素遺伝子 （W099/05287) とは 20〜 25 %程度の相同性しか なく 、 Ph7GTa、 Ph7GTbと も AmGTl 及び pS. b UFGT1と同様にフラボノ イ ド 7 —糖転移酵素遺伝子と予想された。
実施例 8 , 大腸菌における Ph7GTa及び Ph7GTbの cDNAの発現
Ph7GTa遺伝子の発現は、 pET System (Stratagene) を用いて行つ た。 最初に Ndel及び BamHI サイ トを導入するために、 以下に示すプ ライマ一 2種 pETPh7GTa5' 〔5' - ATA ACT ACA TAT GGC TAT TCC CAC A - 3' (配列番号 ： 11) 〕 及び pETPh7GTa3' [5' -GAA CAG GAT CCT AAA AGG ACC T-3' (配列番号 ： 12) 〕 を用いて PCR 反応を行った
PCR 反応液は、 pAmGTl lOOng, lxク ローン化 Pfu DNA ポ リ メ ラ一 ゼ反応緩衝液 （Stratagene), 0.2mM dNTPs、 プライマー各 0.5pmo 1 / 1 、 ク ローン化 P f u DNA ポ リ メ ラ一ゼ 5. OUn i t からなる総体積 10 0 1 に調整した。 反応は、 95°Cで 45秒反応させた後、 95°C · 45秒 、 50°C · 45秒、 72°C · 2分の反応を 25サイ クル行い、 最後に 72°Cで 10分間処理した。 得られた PCR 産物を pCR2.1 T0P0 ベク タ一 （ INVI TR0GEN) にサブク ローニングした。 このよう にして得られたプラス ミ ド pTOPO- ETPh7GTaのいく つかのク ローンを ABI PRISM™ BigDye ™ Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Ki t Applied B i osys tems)を用いて反応し、 D A Sequencer mode 1 310 (Appl ied B iosystems)を用いて、 全塩基配列を確認した。 pTOPO- ETPh7GTaを Nd elおよび BamHI で制限酵素処理し得られた約 1.7Kb のフラグメ ン ト を pET- 3aベク ター （Stratagene) の Ndelと BamHI サイ 卜に連結し、 プラス ミ ド pETPhGTaを得た。
pETPhGTaを用いて、 ェピク リ アン · コ リ （ Ep i cur i an Co 1 i ) BL21 (DE3) (Stratagene)に形質転換した。
同様にして Ph7GTbについても Ndel、 BamHI サイ トを導入するため に、 以下に示すプライマ一 2種 pETPh7GTb5' [5' -ATA ACT ACA TAT GGG TCA GCT CCA- 3' (配列番号 ： 13) 〕 及び pETPh7GTb3' 〔5' - C TC GTA CCA TGG AAA ACT ATT CT- 3' (配列番号 ： 14) 〕 を用いて PC R 反応を行った後、 同様にしてプラス ミ ド pETPhGTbを得た。
実施例 9 . Ph7GTa、 Ph7GTb cDNA 組換え蛋白の糖転移酵素活性の
測定
実施例 8 にて得られた形質転換株は、 実施例 1 に示したよう に培 養、 抽出 し、 酵素活性を測定した。 酵素活性は、 オーレゥ シジンを 基質と して、 測定した。 酵素活性は実施例 1 で述べたのと同様に し て測定した。 Ph7GTa及び Ph7GTbについては、 反応産物と してオーレ ゥ シジン 6 —グリ コ シ ドと保持時間及びスぺク トルが一致する ピ一 クが検出された。 また、 Ph7GTaについては、 他に吸収スぺク トルか らオーロ ン配糖体と予想される ピークが、 1 種類、 Ph7GTbについて は、 2種類えられた。
以上の結果から Ph7GTa及び Ph7GTbは、 オーレゥ シジンを配糖化す る活性を持つ酵素をコー ドするこ とが明らかになった。 産業上の利用可能性
本発明により得られた遺伝子発現産物を用いて、 オー ロ ンを配糖 ィヒさせる こ とができた。 これにより、 ォ一ロ ンの植物細胞内におけ る安定発現が可能となつた。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . オーロ ンに糖を転移する活性を有する蛋白質をコー ドする遺 伝子。
2 . 配列番号 2 、 8又は 1 0記載のア ミ ノ酸配列を有し、 且つォー ロ ンに糖を転移する活性を有している蛋白質をコー ドする請求項 1 記載の遺伝子。
3 . 配列番号 2 、 8 又は 1 0記載のア ミ ノ酸配列に対して 1 個又は 複数個のア ミ ノ酸の付加、 欠失及び/又は他のア ミ ノ酸による置換 により修飾されているア ミ ノ酸配列を有し、 且つオーロ ンに糖を転 移する活性を有している蛋白質をコ一 ドする請求項 1 記載の遺伝子 o
4 . 配列番号 ： 2 、 8 又は 1 0に記載のア ミ ノ酸配列をコー ドする 塩基配列又はその部分を有する核酸とス ト リ ンジェン 卜な条件下で ハイブリ ダィズし、 且つォ一ロ ンに糖を転移する活性を有している 蛋白質をコー ドする請求項 1 に記載の遺伝子。
5 . 請求項 1 〜 4 のいずれか 1 項に記載の遺伝子を含んでなるべ ク タ一。
6 . 請求項 5 に記載のベク タ一により形質転換された宿主。
7 . 請求項 1 〜 4 のいずれか 1 項に記載の遺伝子によってコ一 ド される蛋白質。
8 . 請求項 6 に記載の宿主を培養し、 又は成育させ、 そ して該宿 主からォ一ロ ンに糖を転移する活性を有する蛋白質を採取する こ と を特徴とする該蛋白質の製造方法。
9 . 請求項 1 〜 4 のいずれか 1 項に記載の遺伝子が導人された植 物も し く はこれと同 じ性質を有するその子孫又はそれらの組織。
1 0. 請求項 9 に記載の植物またはこれと同じ性質を有するその子 孫の切花。
1 1. 請求項 7記載の蛋白質を作用させてオーロ ンに糖を転移する こ とを特徴とするオーロ ンの安定化方法。
_1 2. 請求項 1 〜 4のいずれか 1項に記載の遺伝子を植物体内に導 入し、 該遺伝子を発現せしめ、 そして生成した蛋白質により植物体 内のオーロ ンに糖を転移することを特徴とする植物体内におけるォ 一口 ンの安定化方法。
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