WO2000043407A1 - Medicaments - Google Patents

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WO2000043407A1
WO2000043407A1 PCT/JP2000/000185 JP0000185W WO0043407A1 WO 2000043407 A1 WO2000043407 A1 WO 2000043407A1 JP 0000185 W JP0000185 W JP 0000185W WO 0043407 A1 WO0043407 A1 WO 0043407A1
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Eiji Kobayashi
Tuo-Ping Li
Tatsuji Enoki
Takanari Tominaga
Hiroaki Sagawa
Ikunoshin Kato
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Takara Shuzo Co., Ltd.
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Definitions

  • the present invention relates to a therapeutic agent, and more particularly, to a physiologically active substance useful in the field of medicine and a pharmaceutical.
  • apoptosis also known as apoptosis; suicide death or self-destruction of cells
  • This apoptosis unlike necrosis, which is pathological cell death, is death that has been integrated into the cell's own genes from the beginning. In other words, some external or internal factors trigger the activation of genes that program apoptosis, resulting in the biosynthesis of the programmed death protein and, in some cases, the inactive form in the cell. Existing programmed death proteins are activated. It is thought that the active form of the dead protein produced in this way causes the cell itself to be degraded, resulting in death.
  • An object of the present invention is to provide a substance having a physiological function such as an apoptosis-inducing action and useful in the field of medicine and its use.
  • the first invention of the present invention has the general formula I:
  • X is OH or OS0 3 H
  • R is a substituent other than OH, by the substituents which it leaves, 3, and 3-position of 6-anhydroerythromycin galactose or its sulfated body
  • the second invention of the present invention relates to a medicament for treating or preventing a disease which is sensitive to the compound represented by the general formula I, containing the compound represented by the general formula I as an active ingredient.
  • the third invention of the present invention relates to a food or beverage containing, diluting and Z or adding the compound represented by the general formula I.
  • FIG. 1 is a diagram showing a 1 H-NMR spectrum of compound (8).
  • FIG. 2 is a diagram showing a 1 H-NMR spectrum of compound (7).
  • FIG. 3 is a diagram showing a 1 H-NMR spectrum of the compound (10).
  • FIG. 4 is a diagram showing a 1 H-NMR spectrum of compound (9).
  • FIG. 5 is a diagram showing a 1 H-NMR spectrum of the compound (12).
  • FIG. 6 is a diagram showing a 1 H-NMR spectrum of the compound (11).
  • FIG. 7 is a diagram showing a 1 H-NMR spectrum of compound (14).
  • FIG. 8 is a diagram showing a 1 H-NMR spectrum of compound (18).
  • FIG. 9 is a diagram showing a 1 H-NMR spectrum of compound (17).
  • FIG. 10 is a diagram showing a 1 H-NMR spectrum of compound (20).
  • FIG. 11 A diagram showing a 1 H-NMR spectrum of compound (19).
  • FIG. 12 is a diagram showing a 1 H-NMR spectrum of compound (22).
  • Figure 1 3 Compound (2) in the medium when cultured with the addition of N0 2 - is a graph showing the concentration.
  • Figure 14 Compound in the medium (7) was added and when cultured N0 2 - is a graph showing the concentration.
  • Figure 1 5 Compound in the medium when cultured with the addition of (9) N0 2 - is a graph showing the concentration.
  • Figure 1 6 is a diagram showing an N0 2 concentration in the medium when it is cultured by adding the compound (1 1).
  • Figure 1 7 compound in the medium when cultured with the addition of (14) N0 2 - is a graph showing the concentration.
  • Figure 1 8 compound in the medium (1 7) was added when cultured N0 2 - is a graph showing the concentration.
  • Figure 1 9 Compound (1-9) added to N0 in the medium when cultured in 2 - is a graph showing the concentration.
  • Figure 20 Compound in the medium when the (21) was added to the culture N0 2 - is a graph showing the concentration.
  • Figure 21 Ru FIG der showing the PGE 2 concentration in the medium when cultured in various culture conditions.
  • Figure 22 is a diagram showing an N0 2 concentration in the medium when cultured in various culture conditions.
  • Figure 23 Ru FIG der showing the PGE 2 concentration in the medium when cultured in various culture conditions.
  • Figure 24 A diagram showing the results of gas chromatography.
  • Figure 25 Diagram showing the calibration curve of the area ratio between DGE and the partial preparation and the corresponding weight ratio between DGE and the internal preparation.
  • Figure 26 Diagram showing the time course of the conversion from various compounds to DGE.
  • Figure 27 Diagram showing the concentration of IL-10 in the culture supernatant when cultured under each culture condition. '' Detailed description of the invention Hereinafter, the present invention will be described specifically.
  • the method for producing the compound represented by the general formula I is not particularly limited, but the compound can be obtained, for example, by a chemical synthesis method according to a method known per se. For example, as shown in the following Examples, it can be obtained by introducing a desired substituent (R) into the hydroxyl group at the 4-position of 3,6-anhydrogalactose or a sulfated product thereof.
  • the compound represented by the general formula I refers to a compound represented by the general formula I, an aldehyde derivative represented by the general formula II, and a hydrate derivative represented by the general formula III. means.
  • the structures of the compounds represented by the general formulas 1 to 1 I I can be represented by other expressions. However, the compounds represented by the general formulas, including those and possible tautomers thereof, can be used.
  • ⁇ I I I will be represented by I I.
  • the configuration in the general formulas I to III is not particularly limited as long as the desired activity is obtained, and may be D-type, L-type or a mixture thereof.
  • the compound represented by the formula I is, for example, a compound represented by the general formula IV under physiological conditions in which the reducing terminal 3,6-anhydrogalactose or a sulfated form thereof is
  • the compound represented by the changed general formula IV has an apoptosis-inducing ability, an anticancer effect, an active oxygen production inhibitory effect, a nitric oxide production inhibitory effect, an ⁇ -daricosidase inhibitory activity, an interleukin production in a physiological environment. It exhibits physiological activities such as inhibitory activity, hemoxygenase production inducing activity and immunomodulatory activity.
  • R is a substituent other than ⁇ , and acts as a leaving group in a reaction to produce a compound represented by the general formula IV, for example, and forms 3,6-anhydrogalactose or a sulfated form thereof. Any material that can introduce an unsaturated bond between the 3rd and 4th positions and / or that shows tissue-specific affinity may be used.
  • R include saturated hydrocarbons, unsaturated hydrocarbons, aromatic hydrocarbons, sugars, sugar chains, nucleic acids, lipids, peptides, proteins, glycoproteins, glycolipids, phospholipids, etc. .
  • the bonding mode at the 4-position between R and 3,6-anhydrogalactose or a sulfated product thereof is broken in a reaction to produce a compound represented by the general formula IV Any examples may be used, but examples thereof include an ester bond and an ether bond.
  • the compound represented by the general formula I is specifically localized at a specific location in a specific organ, cell, organ, or the like, and at that position.
  • a compound represented by the general formula IV is generated, and the physiological activity can be expressed at a specific target site. Further, the expression time and intensity can be controlled.
  • the compound represented by the general formula I It is also possible to increase the absorbability of the substance into the living body.
  • a specific substituent as R it does not immediately exhibit activity after administration, is efficiently absorbed into the body, is concentrated at an arbitrary location, and is expressed only by the general formula IV at that site. The physiological activity of the compound can be expressed.
  • a prodrug for in vivo production of a compound represented by V is provided.
  • the prodrug may be a compound represented by the general formula I as an active ingredient, combined with a known pharmaceutical carrier, and formulated by a method known per se.
  • the composition is formulated with a pharmaceutically acceptable liquid or solid carrier and, if necessary, used as a solvent, dispersant, emulsifier, buffer, stabilizer, excipient, binder.
  • tablets, granules, powders, powders, capsules and other solid preparations, usually liquid preparations, suspensions and emulsion preparations can be prepared by adding a disintegrant, a lubricant and the like. Further, it can be made into a dried product which can be made into a liquid form by adding an appropriate carrier before use.
  • the prodrug can be administered either as an oral preparation or a parenteral preparation such as an injection or an infusion.
  • Pharmaceutical carriers can be selected according to the above-mentioned administration forms and dosage forms.
  • oral preparations for example, starch, lactose, sucrose, mannitol, carboxymethylcellulose, corn starch, inorganic salts, etc. are used. You. Further, in preparing the oral preparation, a binder, a disintegrant, a surfactant, a lubricant, a fluidity promoter, a flavoring agent, a coloring agent, a flavor, and the like can be further blended.
  • a compound represented by the general formula I which is an active ingredient of prodrug, is used as a diluent in distilled water for injection, physiological saline, aqueous solution of budose, Vegetable oil, sesame oil, peanut oil, soybean oil, corn oil, propylene glycol, polyethylene glycol, etc., dissolved or suspended, and if necessary, disinfectants, stabilizers, isotonic agents, soothing agents, etc. It is prepared by adding.
  • the prodrug of the present invention is administered by an appropriate administration route depending on the formulation.
  • the administration method is also not particularly limited, and can be internal, external, or by injection.
  • the injection can be administered, for example, intravenously, intramuscularly, subcutaneously, intradermally, etc., and external preparations also include suppositories and the like.
  • the dosage of prodrug is appropriately determined depending on the form, administration method, purpose of use, and the age, weight, and symptoms of the patient to which the drug is applied, and is not constant, but generally includes the effective amount contained in the drug product.
  • the amounts of the components are from 10 / xg to 200 mg Z kg per adult per day. Of course, since the dosage varies depending on various conditions, a dosage smaller than the above-mentioned dosage may be sufficient, or may be required beyond the range.
  • the agent of the present invention can be administered orally as it is, or can be taken daily by adding it to any food or drink.
  • the compound represented by the general formula I of the present invention has an antioxidant activity such as an apoptosis-inducing activity, an anti-cancer activity, an active oxygen production inhibiting activity, a lipid peroxide radical production inhibiting activity, a nitric oxide production inhibiting activity, and the like.
  • Antioxidants such as apoptosis-inducing agents, anticancer agents, active oxygen production inhibitors, peroxidative lipid radical production inhibitors, nitric oxide production inhibitors, antibacterial agents, antiviral agents, Such as anti-mutagenic agents, hypoglycemic inhibitors, anti-lipid agents, immunomodulators, anti-inflammatory agents, anti-allergic agents, cytokine production regulators, anti-rheumatic agents, anti-diabetic agents, hemoxigenase production inducers, etc.
  • a medicament for treating or preventing a disease sensitive to a compound can be produced.
  • the apoptosis-inducing agent of the present invention containing the compound represented by the general formula I as an active ingredient is useful for eliminating autoreactive lymphocytes, cancer cells, virus-infected cells, and the like of autoimmune disease patients. It is effective, and by causing apoptosis in desired tissues and cells, unnecessary or harmful cells can be naturally eliminated from the living body.
  • Diseases for which the apoptosis-inducing agent of the present invention is effective include, for example, autoimmune diseases such as systemic lupus erythematosus, immune-mediated glomerulonephritis, multiple sclerosis, and collagen disease, and rheumatism.
  • the apoptosis-inducing agent of the present invention can be used in an apoptosis-inducing method, which comprises elucidation of apoptosis-inducing mechanism, apoptosis-inducing agent, apoptosis induction
  • the compound represented by the general formula I used in the present invention is useful for suppressing the production of an oxidizing substance, for example, active oxygen, and an antioxidant containing the compound as an active ingredient such as an active oxygen production inhibitor is active oxygen. It is useful for treating or preventing diseases caused by Z production or excess.
  • Active oxygen can be broadly classified into radical and non-radical active oxygen.
  • the radical active oxygen includes a hydroxy radical, a hydroxyperoxy radical, a peroxy radical, an alkoxy radical, nitrogen dioxide, nitric oxide (hereinafter abbreviated as No), a thiyl radical, and a superoxide.
  • non-radical active oxygen includes singlet oxygen, hydrogen peroxide, lipid hydroperoxide, hypochlorous acid, ozone, and peroxynitrite. All are involved in many pathologies, including various inflammatory diseases, diabetes, cancer, arteriosclerosis, neurological diseases, and ischemia-reperfusion injury.
  • oxidative stress is related to various diseases as described above. They are constantly exposed to diseases caused by oxidative stress, or situations that lead to worsening of the disease. Therefore, the antioxidant of the present invention, for example, an active oxygen production inhibitor is also useful for the prevention, treatment or prevention of deterioration caused by such oxidative stress.
  • the antioxidant used in the present invention that can suppress the production of lipid peroxide radicals, that is, the antioxidant containing the compound represented by the general formula I as an active ingredient, is a lifestyle habit due to oxidative stress. It is useful for prevention and treatment of disease.
  • NO is the main body of endothelial cell-derived vascular smooth muscle relaxing factor (EDRF) [Nature, Vol. 327, pp. 524-526 (1987)].
  • EDRF vascular smooth muscle relaxing factor
  • the disease that requires suppression of NO production is not particularly limited.
  • systemic blood pressure decrease blood pressure response decrease
  • diabetes vascular dysfunction due to toxic shock or treatment with certain cytokines, etc.
  • diseases such as pathogenic vasodilation, tissue damage, cardiovascular ischemia, hyperalgesia, cerebral ischemia, diseases involving angiogenesis, and cancer.
  • vascular skin growth factor vascular permeability factor plays an important role in this process.
  • VEGF vascular skin growth factor vascular permeability factor
  • the NO production inhibitor of the present invention also suppresses VEGF production in cancer cells by suppressing NO production, and as a result, angiogenesis around cancer tissues is inhibited.
  • the NO production inhibitor of the present invention is administered to mice in which cancer cells have been implanted subcutaneously to form a solid tumor, the formation of blood vessels around the cancer tissue becomes insufficient, and the cancer falls off.
  • Nitrosamines are a group of compounds consisting of secondary amines and nitro groups attached to the nitric acid group. Are known, many of which are carcinogenic to animals by damaging DNA. Nitrosamines are also implicated in human carcinogenesis and are usually produced by the reaction of nitrites with amines in the stomach. NO reacts with amines to produce nitrosamines even under pH neutral physiological conditions. NO production is increased in patients with liver fluke infection and cirrhosis, which are epidemiologically highly related to cancer. Therefore, carcinogenesis in a high-risk group can be particularly prevented by administering the NO production inhibitor of the present invention to prevent an increase in NO production. As described above, the NO production inhibitor of the present invention exhibits a carcinostatic action in two stages: suppression of carcinogenesis and inhibition of vascular neogenesis in cancer tissues.
  • NO also induces the edema characteristic of inflammatory lesions, a vascular permeability enhancement action [Maeda et al., Japanese Journal of Cancer, Kansa, Jisaichi (Japanese Journal of Cancer). Research), Vol. 85, pp. 331-334 (1994)], and enhances the biosynthesis of prostaglandins, which are inflammatory mediators [Salvemini et al., Proceedings of Ob. National Academy of Sciences '' USA
  • NO reacts quickly with superoxide radicals to form peroxynitrite ion, and peroxynitrite. It is also believed that nitrate causes inflammatory cell and tissue damage.
  • NO production is induced when activated immune cells enter the organ and release cytodynamic forces.
  • Insulin-dependent diabetes mellitus is a disease caused by the specific destruction of knee island cells, and is thought to be destruction by NO.
  • the synovial fluid in the affected area of patients suffering from rheumatoid arthritis, rheumatoid arthritis, gouty arthritis, and arthritis associated with Behcet's disease is affected by the normal joints of the patient and those of healthy individuals. It contains higher concentrations of NO than synovial fluid.
  • NO production inhibitor of the present invention During cerebral ischemia and after reperfusion, NO production increases, with concomitant damage to brain tissue.
  • NO production inhibitor of the present invention By administering the NO production inhibitor of the present invention to a patient during cerebral ischemia, damage to brain tissue is reduced and the prognosis is improved.
  • Arachidonic acid metabolism is greatly involved in causing tissue inflammation and pain.
  • Arachidonic acid derived from cell membrane phospholipids is metabolized in the body into three components, prostaglandins, prostacyclins, and thromboxanthin, by the action of cyclooxygenase.
  • prostaglandins have blood flow increase additive effects on vasodilation and organs associated therewith, especially prostaglandin E 2 in inflammatory site 1 2 by the blood flow increasing action, edema and leukocyte infiltration increase.
  • Compound represented by the general formula I of the present invention it has a prostaglandin E 2 synthesis inhibiting activity.
  • pharmaceutical comprising the compound represented by Formula I of the present invention as an active ingredient is useful for treating or preventing a disease requiring the prostaglandin E 2 synthesis inhibition. That is, by administering the onset Ming prostaglandin E 2 synthesis inhibitors, suppressing the biosynthesis of prostaglandins, can be expressed analgesic, anti-inflammatory effects.
  • prostaglandin E 2 synthesis inhibitors of the present invention to control the biosynthesis of prostaglandins by oxidative stress It is also useful for the prevention, treatment or prevention of various diseases and illnesses as described above.
  • NO induces edema, which is characteristic of inflammatory lesions, that is, induces vascular hyperpermeability and enhances the biosynthesis of prostaglandins, which are inflammatory mediators. than be, NO production suppression effect and prostaglandin E 2 synthesis inhibiting effect of the present ⁇ act synergistically analgesic, various diseases with anti-inflammatory effects and oxidative stress, prevention of diseases, in the treatment or prevention of deterioration It produces a synergistic effect.
  • Examples of the cytokine in the present invention include interleukin.
  • Interleukins are a general term for proteinaceous biologically active substances produced by lymphocytes, monocytes, and the like. At present, the existence of interleukins 1-18 is known. Examples of interleukins include IL-6 and IL-10.
  • IL-6 The cDNA of IL-6 was cloned as a differentiation factor that induces terminal differentiation of B cells.
  • IL-16 is involved not only in the immune response, but also in the differentiation of cells of the hematopoietic and nervous systems, as well as in acute reactions.In addition, IL-16 is closely related to the development of various immune disorders, inflammatory diseases, and lymphoid tumors. ing. In addition, IL-16 induces antibody production against B cells It produces IgM, IgG, and IgA immunoglobulins, but does not participate in class switches, unlike IL-4. IL-6 also acts as a growth factor for B cell / plasma sites. On the other hand, it is also involved in the T cell system, and proliferates and differentiates T cells.
  • IL-16 is also involved in the hematopoietic system and, in concert with IL-3, proliferates hematopoietic stem cells by shortening the GO phase. It also promotes megakaryocyte maturation and induces an increase in platelets. IL-16 is also involved in the acute phase reaction of the living body, such as bacterial virus infection and malignant tumors, which responds immediately. IL-16 is also involved in the nervous system, is secreted from nervous system cells such as glioblastoma astrocytoma, and also works to induce nervous system differentiation. B cells are activated in rheumatoid arthritis and systemic erythematous tomato, and high levels of IL-6 are present in the patient's synovial fluid.
  • IL-6 Blood levels of IL-6 are very high in the Castleman syndrome group, which is characterized by systemic lymphadenopathy. In patients with atrial myxoma exhibiting autoimmune disease-like symptoms, large amounts of IL-6 are produced from tumor cells. In addition, since the proliferation of myeloma cells derived from patients with multiple myeloma is suppressed by the anti-IL-6 antibody, IL-6 is highly likely to be a self-growth factor for myeloma cells.
  • urine from patients with primary glomerulonephritis also contains IL-6, and IL-16 acts as a growth factor for renal mesangial cells (see Kohei Takazono and Kazuo Sugamura, Bio Bio cience term library: cytokines and growth factors ", pages 28-29, Yodosha (1995)).
  • IL-16 acts as a growth factor for renal mesangial cells (see Kohei Takazono and Kazuo Sugamura, Bio Bio cience term library: cytokines and growth factors ", pages 28-29, Yodosha (1995)).
  • administration of the compound used in the present invention can suppress the production of IL-16 and treat or prevent the symptoms. it can.
  • diseases requiring suppression of IL-10 production include, for example, diseases accompanied by reduced immunity, and the compounds of the present invention are useful for such diseases.
  • Hemoxigenase has two isozymes, HO-1 at 33 kDa and HO-12 at 36 kDa.
  • HO-2 has a structure in which an extra amino acid sequence consisting of 20 amino acid residues is added to the side of HO-1. The homology of the remaining part is 40-50. / o, but the higher order structure is very similar. Both have a hydrophobic region at the C-terminus, where they bind to the microsomal membrane. Trypsinization of the microsomal lysate yields a soluble fraction with heme-degrading activity. Thus, the large domain containing the active center appears to protrude toward the cytoplasm.
  • HO-1 is an inducible enzyme, a substrate of heme, heavy metal ions, certain organic compounds, hydrogen peroxide, or various cells depending on chemical and physical factors such as heat shock UV irradiation and ischemia. Is remarkably induced.
  • HO-2 is a constitutive enzyme and is expressed in various tissues, but is particularly active in the brain and testis. H O decomposes heme into biliverdin, C ⁇ , and iron, and biliverdin is further converted to bilirubin by a reductase.
  • This bilirubin has an antioxidant effect of fatty acids, a scavenging effect of lipid radicals, an inhibitory effect on the production of phospholipids, neutral fats and cholesterol hydroperoxides by oxygen radicals generated in large quantities due to phagocytosis of neutrophils, etc. It has an antioxidant activity such as low density lipoprotein (LDL) production, which is deeply involved in the onset of arteriosclerosis, and an antioxidant such as singlet oxygen, which is important in vivo as an endogenous antioxidant. Has a role.
  • LDL low density lipoprotein
  • Various radicals act not only on lipids, but also on various biological substances such as proteins and nucleic acids to cause chronic diseases and cancer. Bilirubin reduces such various radicals. Ed.
  • An immunomodulator containing the compound represented by the general formula I as an active ingredient has an immunomodulatory effect such as an inhibitory effect on lymphocyte blastogenesis and a mixed lymphocyte reaction. It is useful as a therapeutic or prophylactic agent for diseases caused by abnormal system or immune factors.
  • lymphocyte juvenile dagger reaction is a reaction in which mitogen binds to a receptor on the surface of a lymphocyte, activates the lymphocyte, and promotes its division and proliferation.
  • a mixed lymphocyte reaction is a mixed culture of lymphocytes obtained from allogeneic animals, which induces lymphocyte activation due to a mismatch between major histocompatibility antigens, leading to lymphocyte division and proliferation. The reaction is accelerated.
  • the immunomodulator of the present invention suppresses these reactions and causes autoimmune diseases caused by abnormally increased lymphocytes, such as chronic nephritis, chronic colitis, It is particularly useful for treating or preventing chronic diseases such as type 1 diabetes and rheumatoid arthritis, and is also useful for suppressing transplant rejection.
  • apoptosis-inducing agent of the present invention a compound represented by the general formula I may be used as an active ingredient, which may be formulated in combination with a known pharmaceutical carrier.
  • the production of the apoptosis-inducing agent can be carried out according to the above-mentioned method for producing a prodrug.
  • the apoptosis-inducing agent is administered by an appropriate administration route according to the formulation.
  • the administration method is also not particularly limited, and may be internal use, external use or injection.
  • the injection can be administered, for example, intravenously, intramuscularly, subcutaneously, intradermally, etc., and external preparations include suppositories and the like.
  • the dose of the apoptosis-inducing agent is appropriately determined depending on the formulation, administration method, purpose of use, and the age, weight, and symptoms of the patient to which it is applied.
  • the amounts of the ingredients are 10 ⁇ g to 2 OO mg Z kg per adult per day.
  • the dose varies depending on various conditions, so that a dose lower than the above-mentioned dose may be sufficient, or may be necessary beyond the range.
  • the drug of the present invention can be administered orally as it is, or can be added to any food or drink and taken daily.
  • a compound represented by the general formula I may be used as an active ingredient, and may be formulated into a combined preparation with a known pharmaceutical carrier.
  • the production of the anticancer agent can be carried out according to the method for producing a mouth drag described above.
  • the anticancer agent is administered by an appropriate route depending on the formulation.
  • the method of administration is not particularly limited, and it can be administered internally or externally.
  • injectables can be administered, for example, intravenously, intramuscularly, subcutaneously, intradermally, etc., and external preparations also include suppositories and the like.
  • the dose of the anticancer drug is appropriately determined depending on the dosage form, administration method, purpose of use, and the age, weight, and symptoms of the patient to which it is applied, and is not fixed, but is generally included in the drug product.
  • the amount of active ingredient used is between 10 g and 20 mg / kg of adult daily. Of course, since the dosage varies depending on various conditions, a smaller amount than the above-mentioned dosage may be sufficient, or may be required beyond the range.
  • the drug of the present invention is orally administered as it is, or added to any food or drink to take it daily. You can also take it.
  • an antioxidant an active oxygen production inhibitor, a lipid peroxide radical production inhibitor, and a NO production inhibitor containing a compound represented by the general formula I as an active ingredient can be produced according to the apoptosis-inducing agent described above.
  • the dose, dosage, and usage may be used according to the above-mentioned apoptosis-inducing agent according to the symptoms.
  • the antioxidant, active oxygen production inhibitor, lipid peroxide radical production inhibitor, and NO production inhibitor are administered by an appropriate route depending on the formulation.
  • the method of administration is not particularly limited, and can be internal, external, or by injection.
  • Injectables can be administered, for example, intravenously, intramuscularly, subcutaneously, intradermally, etc., and external preparations also include suppositories and the like.
  • the dosage of antioxidants, active oxygen production inhibitors, lipid peroxide radical production inhibitors, and NO production inhibitors depends on the dosage form, administration method, intended use, and the age, weight, It is set appropriately according to the symptoms and is not fixed, but generally the amount of the active ingredient contained in the preparation is from 10 / zg to 200 mg Z kg per adult per day. Of course, since the dosage varies depending on various conditions, a smaller amount than the above-mentioned dosage may be sufficient, or may be required to exceed the range.
  • the medicament of the present invention can be administered orally as it is, or it can be taken daily by adding it to any food or drink.
  • the compound represented by the general formula I exhibits an inhibitory activity on ⁇ -glycosidase, for example, sucrose, by converting into a compound represented by the general formula IV in vivo, and the compound represented by the general formula I is effective. It is possible to produce a blood glucose elevation inhibitor, an antihyperlipidemic agent, an antiobesity agent, an antidiabetic agent and the like as components. These medicaments can be produced according to the apoptosis-inducing agent, and the dose and usage may be used according to the apoptosis-inducing agent according to the symptoms of the disease to be treated or prevented.
  • foods or beverages containing, diluted and / or containing the compound represented by the general formula I have an apoptosis-inducing effect, an anti-cancer effect, and an anti-cancer effect.
  • Diseases susceptible to compounds represented by general formula I due to oxidative action, anti-pathogenic microbial activity, anti-mutagenic activity, etc. for example, diseases requiring induction of apoptosis, cancerous diseases, requiring suppression of active oxygen production Disease, NO production suppression required It is extremely useful for ameliorating and preventing symptoms of diseases, diseases caused by pathogenic microorganisms, and diseases caused by mutagens.
  • the method for producing the food or beverage of the present invention is not particularly limited, and examples thereof include cooking, processing, and production using commonly used food or beverage production methods. It is sufficient that the compound represented by the general formula I is contained, added and / or diluted as an active ingredient.
  • the food or beverage of the present invention contains, dilutes, and / or is added the compound represented by the general formula I, and if it contains a necessary amount for expressing its physiological function, it is particularly shaped.
  • an orally ingestible form such as a tablet, a granule, and a capsule is also included.
  • the food or beverage of the present invention contains a compound represented by the general formula I having a physiological activity, and by ingesting them due to their physiological functions such as an apoptosis-inducing action and an anti-cancer action, cancer prevention and cancer are prevented. It is a health food or beverage that has a symptom ameliorating effect or a prophylactic effect of a disease susceptible to the compound represented by the general formula I, such as an inhibitory effect.
  • the compound represented by the general formula I has an antioxidant activity such as an active oxygen production inhibitory effect and a lipid peroxide radical production inhibitory effect, and is used as an antioxidant for antioxidant foods or an antioxidant beverage.
  • Antioxidants for example, active oxygen production inhibitors, lipid peroxide radical production inhibitors, NO production inhibitors and the like can be used in the production of antioxidant foods or beverages.
  • the present invention provides a sweetener containing the compound represented by the general formula I. That is, the compound represented by the general formula I has a sweet taste, and is useful as an active ingredient of a low-potency sweetener instead of sugar.
  • the compound represented by the general formula I has no acute toxicity even when orally administered to a mouse an effective amount of its biological activity.
  • Example 1
  • the compound (3) required here can be obtained by the method of Haworth et al. [Imperial collection of Science and Technology, pp. 620-631 (1940)] as shown in the following reaction formula II. After leading ⁇ -O-methyl-D-galactopyranose [compound (1)] to 3,6-anhydro-D-galactose [compound (2)], this was converted to the method of Hirase et al. [Bulletin of the Chemical Society of Japan, Vol. 41, pp. 626-628 (1968)], and was synthesized by conversion to 1,2-O-isopropylidene.
  • the trichloroimidate form of sugar is the method of Kobayashi et al.
  • FIG. 1 is a diagram showing a 1 H-NMR spectrum of compound (8).
  • the horizontal axis represents the chemical shift value (ppm), and the vertical axis represents the signal intensity.
  • the compound (8) (8 Omg) was dissolved in dichloromethane (3 Om1), to which trifrenolerosulfonic acid / water (2.85 ml / 0.15 ml) was added, followed by stirring at room temperature for 3 hours.
  • the reaction solution was diluted with ethyl acetate 3 O Oml and washed with saturated aqueous sodium hydrogen carbonate.
  • FIG. 2 is a diagram showing a 1 H-NMR spectrum of the compound (7).
  • the horizontal axis represents the chemical shift value (ppm), and the vertical axis represents the signal intensity.
  • FIG. 3 is a diagram showing a 1 H-NMR spectrum of the compound (10).
  • the horizontal axis represents the chemical shift value (ppm), and the vertical axis represents the signal intensity.
  • FIG. 4 is a diagram showing a 1 H-NMR spectrum of compound (9).
  • the horizontal axis represents the chemical shift value (ppm), and the vertical axis represents the signal intensity.
  • FIG. 5 is a diagram showing a 1 H-NMR spectrum of the compound (12).
  • the horizontal axis represents the chemical shift value (ppm), and the vertical axis represents the signal intensity.
  • the structure was analyzed by (MS) ((DX302) mass spectrometer (manufactured by JEOL Ltd.)).
  • FIG. 6 is a diagram showing a 1 H-NMR spectrum of the compound (11).
  • the horizontal axis represents the chemical shift value (P pm), and the vertical axis represents the signal intensity. Note that the assignment of peaks in 1 H — NMR is as shown in the following formula X.
  • Compound (14) was converted to a nuclear magnetic resonance (NMR) spectrum (JNM-A500 (manufactured by JEOL Ltd.), a mass spectrum (MS) (DX302) mass spectrometer (manufactured by JEOL Ltd.)) Structural analysis.
  • NMR nuclear magnetic resonance
  • MS mass spectrum
  • DX302 mass spectrum
  • FIG. 7 is a diagram showing a 1 H-NMR spectrum of compound (14).
  • the horizontal axis represents the chemical shift value (ppm), and the vertical axis represents the signal intensity.
  • the assignment of peaks in 1 H-NMR is as shown in the following formula XI.
  • FIG. 8 is a diagram showing a 1 H-NMR spectrum of compound (18).
  • the horizontal axis represents the chemical shift value (ppm), and the vertical axis represents the signal intensity.
  • FIG. 9 is a chart showing 1 H-NMR of the compound (17).
  • the horizontal axis represents the chemical shift value (ppm), and the vertical axis represents the signal intensity.
  • FIG. 10 shows the 1 H-NMR spectrum of the compound (20).
  • the horizontal axis indicates the chemical shift value (ppm), and the vertical axis indicates the signal intensity.
  • FIG. 11 shows the 1 H-NMR spectrum of the compound (19).
  • the horizontal axis represents the chemical shift value (ppm), and the vertical axis represents the signal intensity.
  • FIG. 12 shows a 1 H-NMR spectrum of the compound (22).
  • the horizontal axis represents the chemical shift value (ppm), and the vertical axis represents the signal intensity.
  • the sample was subjected to thin-layer chromatography using 1 as a developing solvent and detected with orcinol sulfuric acid.
  • Example 3 the compounds (2), (11), (14) and (17) synthesized in Example 1 were also converted to DGE.
  • HL-60 (A TCC CCL-240) cultured at 37 ° C in RPMI 1640 medium (Bio-Itsutaka 1) containing 10% fetal bovine serum (JRH) treated at 56 ° C for 30 minutes at RPM 2.5 x 10 5 in I 1640 medium 4.
  • RPMI 1640 medium Bio-Itsutaka 1 containing 10% fetal bovine serum (JRH) treated at 56 ° C for 30 minutes at RPM 2.5 x 10 5 in I 1640 medium 4.
  • the suspension was adjusted to 5 ml.
  • the cultured cells were observed under an optical microscope.
  • Compound (2) had a final concentration of 5 mM
  • compound (7) had a final concentration of 100 / M
  • compound (9) had a final concentration of 150 ⁇
  • compound (11) had a final concentration of Concentration 150 ⁇
  • Compound (14) final concentration 150 / ⁇ ⁇ or more Condensation of nuclei, shrinkage of cells, and formation of apoptotic bodies were observed in the cultured cells added with. These phenomena were not observed in the control cultured cells added with 50 Oml of physiological saline.
  • a portion of the cells cultured for 24 to 48 hours was sampled in the same manner as in Example 4, stained with 0.4% trypan blue, observed under an optical microscope, and stained blue with unstained cells and viable cells. The number of dead cells is measured, and the compound that survives 50%
  • the survival rate in 24 hours and 48 hours 5 There are some compounds that show a large difference between the two, and some do not.This is because the time until the onset of activity such as the rate at which the R group is eliminated and an unsaturated bond is introduced between the 3- and 4-positions of anhydrogalactose or the absorption rate. As shown in the results, it is possible to control the timing of the physiological activity by changing R as shown in the results. In addition, the survival rate in 48 hours 5 . Is considered to indicate the final strength of the biological activity, and similarly, by changing R, the expression strength of the biological activity can be controlled.
  • OmM compound (7) 1.25, 2.5, 5.0 mM compound (9), 0.625, 1.25.2.5 mM compound (1 1), 1.25, 2 5.5.0 mM compound (14), 1.25, 2.5, 5.0 mM compound (17), 1.25, 2.5, 5.0 mM compound (19 ), 1.25, 2.5, by adding an aqueous solution of 5. 0 mM of compound (2 1), after further 1 2 hour incubation, NO is N0 2 concentration produced by oxidation in the medium A measurement was made. As controls, a category without LPS and IFN- ⁇ and a category without added material were set.
  • the N 0 2 -concentration in the medium was calculated from a calibration curve prepared with known concentrations of Na 2 N 2 dissolved in the above medium. All measurements were performed in triplicate.
  • compound (2) had a final concentration of 25 / ⁇
  • compound (7) had a final concentration of 25 ⁇
  • compound (9) had a final concentration of 50 ⁇
  • compound (11) had a final concentration of 25 ⁇ .
  • FIG. 20 is a diagram showing an N0 2 concentration in the medium when the compound (21) was cultured by adding respectively.
  • the horizontal axis represents the culture conditions
  • the vertical axis represents the NO 2 -concentration ( ⁇ ).
  • Prostaglandin E 2 ELISAKIT manufactured by Neogen, Code. 404 110. All measurements were performed in triplicate.
  • FIG. 2. 1 is a view to view the prostaglandin E 2 concentration in the medium when cultured in the culture conditions.
  • the horizontal axis shows the culture conditions, and the vertical axis shows the prostaglandin E 2 concentration (ngZml).
  • Example 1 The compound (7) described in Example 1 was suspended in olive oil (manufactured by Nacalai Tesque) at 1% to prepare a 1% suspension of the compound (7).
  • Peritoneal cells were suspended in a 1 0 6/11 11 to 1 0% ⁇ shea fetal serum-containing R PM 1 1 640 medium, 5 in addition to the 4 8-well microtiter plate at 5 0 0 mu 1
  • the cells were cultured at 37 ° C for 2 hours in the presence of% carbon dioxide, and then the culture supernatant was removed to obtain adherent cells and used as peritoneal macrophages.
  • Dalbecco's improved medium containing 10% fetal serum, no phenol red, and 2 mM L-glutamine was added to each well.
  • FIG. 2. 2 shows a N0 2 _ concentration of culture ground when cultured in the culture conditions
  • the horizontal axis represents the culture conditions
  • the vertical axis N0 2 - shows the concentration (mu Micromax).
  • Example 1 The compound (7) described in Example 1 was suspended in olive oil (manufactured by Nacalai Tesque) at 1% to prepare a 1% suspension of the compound (7).
  • FIG. 23 shows the results. That is, FIG. 23 is a diagram showing the concentration of PGE 2 in the culture medium when cultured under each culture condition. The horizontal axis shows the culture conditions, and the vertical axis shows the PGE 2 concentration (ng / m 1).
  • Example 10
  • HL-60 cells ATCC CCL-240 in 100% fetal serum containing 100 ⁇ hydroxyperia (Gibco) containing R RI1640 medium (Bio-Wita Corporation, 12-702F) ) Were suspended at 5 x 10 5 m1.
  • fetal serum containing 100 ⁇ hydroxyperia (Gibco) containing R RI1640 medium (Bio-Wita Corporation, 12-702F)
  • the cells were collected by centrifugation, and suspended again in RPMI 1640 medium containing 100 ⁇ l of hydroxyperyla and 10% fetal serum (manufactured by Gibco) at 5 ⁇ 10 5 Zm 1.
  • 5 ml was added to each well of a 6-well microtiter plate.
  • the hydroxy ⁇ rare untreated cells were suspended H L-60 cells so that 1 X 1 0 5 or Zm 1 to 1 0% ⁇ Shi (manufactured by Gibco) fetal serum-containing RPM 1 1 640 medium, 5 ml was added to each well of a 6-well microtiter plate. 50 ⁇ l of 30, 22.5, 15 and 7.5 mM DGE in water, or 60,
  • reaction product (alditol acetate) was dissolved in acetone and analyzed by gas chromatography under the following conditions.
  • FIG. 24 is a diagram showing the results of gas chromatography, in which the vertical axis indicates the detection intensity (mV) and the horizontal axis indicates the retention time (minute).
  • DGE's high-purity purified products (0.5, 2.5, 12.5, 62.5, 312.5 ⁇ g) contain 2-deoxy-glucose (20, 20, 200, 200, 200 // g), dissolve in the medium ( ⁇ 1), and use 4.0 equivalents of NaBH 4 (preliminary experiments confirmed that there is no difference between 3.0 and 10 equivalents).
  • the mixture was reduced at room temperature for 4 hours. Thereafter, each sample was subjected to the same operation as described above to form an alditol acetate, and then analyzed by gas chromatography under the same conditions as above. From the obtained gas chromatography results, a calibration curve was created based on the area ratio between DGE and the internal standard, and the corresponding weight ratio between DGE and the internal standard.
  • Figure 25 shows the results.
  • Fig. 25 shows a calibration curve of the area ratio between DGE and the internal standard and the corresponding weight ratio between DGE and the internal standard.
  • the vertical axis is the area ratio between DGE and the internal standard, and the horizontal axis is the horizontal axis. Shows the weight ratio of DGE to the internal standard.
  • FIG. 26 shows the time course of the conversion rate from each compound to DGE obtained from the results. That is, FIG. 26 is a diagram showing the time course of the conversion rate from each compound to DGE, where the vertical axis shows the DGE generation rate (%) and the horizontal axis shows the incubation time (hour).
  • aqueous solution of 100 gZm1 lipopolysaccharide (LPS, manufactured by Sigma, L-2012) of 1 was added and cultured for 18 hours.
  • the content of interleukin 10 (IL-10) in the culture supernatant was determined by Enzymimno Sandwich Attach (ELISA; Mouse
  • IL-10 ELISA Kit manufactured by Endogen.
  • a sample and a category to which no LPS aqueous solution was added were set. All measurements were performed in duplicate.
  • FIG. 27 is a diagram showing the concentration of IL-10 in the culture supernatant when cultured under each culture condition.
  • the horizontal axis shows the culture conditions, and the vertical axis shows the IL-10 concentration (pml).
  • the image was transferred to 1 PVHO 00 10) at a constant voltage of 15 V for 25 minutes.
  • the PVDF membrane after the transfer was blocked at 4 ° C. overnight in a block ace (manufactured by Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd., UK-B25) solution.
  • the membrane after the block was washed with phosphate buffered saline containing ⁇ . 1% Tween 20 for 15 minutes three times under gentle shaking.
  • the cells were incubated in phosphate buffered saline containing 10% Block Ace containing 200 ng / ml anti-hemoxygenase 1 antibody (N-19; Santa Cruz, sc-7696) and 0.1% Tween 20 for 1 hour.
  • antioxidants such as apoptosis-inducing agents, anticancer agents, active oxygen production inhibitors, lipid peroxide radical production inhibitors, NO production inhibitors, antipathogenic microbial agents, freshness preservatives, and antimutations
  • a compound represented by the general formula I which is useful as an active ingredient of a drug substance, a hypoglycemic inhibitor, or an antihyperlipidemic agent, and for treating a disease which is susceptible to the compound containing the compound as an active ingredient.
  • a prophylactic medicament is provided.
  • the compound is a drug for inducing apoptosis, a drug for cancer control, a drug for inhibiting active oxygen production, a drug for inhibiting NO production, etc., an antioxidant drug, a drug for anti-pathogenic microorganisms, a drug for suppressing blood glucose elevation, It is useful as an active ingredient in lipemic drugs, etc., and foods or beverages containing, diluted, or added with the compound are capable of inducing apoptosis, carcinogenesis, inhibiting active oxygen production, and inhibiting NO production.
  • Antioxidant action, anti-pathogen It is useful as a functional food or beverage that has a microbial inhibitory action, an anti-mutagenic action, a blood sugar rise inhibitory action, an anti-obesity action, etc., and induces apoptosis in diseased cells of cancer patients and viral disease patients, thereby causing these diseases.
  • Foods or drinks that are effective in preventing or improving symptoms are provided.
  • the above-mentioned compound of the present invention can cause apoptosis in cancer cells by ingesting it orally as a food or beverage, and thus the food of the present invention Or the beverage has an excellent effect on preventing gastrointestinal cancer and improving symptoms.
  • the above-mentioned food or beverage is also excellent as a food or beverage for antioxidant stress due to its antioxidant effect such as the active oxygen production inhibitory effect.
  • the present invention also provides a sweetener containing the compound represented by the general formula I, and is useful as a low-calorie sweetener in the fields of foods and beverages.
  • the compound represented by the general formula I is converted in vivo into the compound represented by the general formula IV, and is particularly useful for constructing a tissue-specific drug delino cell system of the compound represented by the general formula IV. It is.

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Description

治療剤 技術分野
本発明は、 治療剤、 さらに詳しくは、 医薬の分野で有用な生理活性物質および 明
該物質の用途に関する。 背景技術
書
近年、 細胞組織の死に関し、 アポトーシス （apoptosis；ァポプトーシスとも いう。 自爆死あるいは細胞自滅） という様式が注目されている。
このアポトーシスは、 病理的細胞死である壊死と異なり、 細胞自身の遺伝子に 最初から組込まれている死である。 すなわち、 何らかの外部的または内部的要因 が引き金となってアポトーシスをプログラムする遺伝子が活性化されることによ り、 プログラム死タンパク質が生合成され、 また、 ある場合には不活性型として 細胞内に存在するプログラム死タンパク質が活性化される。 こうして生成した活 性型プロダラム死タンパク質により細胞自体が分解され、 死に至ると考えられて いる。
このようなアポトーシスを所望の組織、 細胞で発現せしめることができれば、 不要もしくは有害な細胞を自然の形で生体から排除することが可能となり、 極め て意義深いものである。 発明の目的
本発明の目的は、 アポトーシス誘発作用等の生理機能を有し、 医薬の分野で有 用な物質およびその用途を提供することにある。 発明の要旨
本発明を概説すれば、 本発明の第 1の発明は、 一般式 I ：
Figure imgf000004_0001
(式中、 Xは OHまたは OS03Hであり、 Rは OH以外の置換基で、 当該置換 基はそれが離脱することにより、 3， 6—アンヒドロガラクトースまたはその硫 酸化体の 3位と 4位に不飽和結合を導入できる置換基および Zまたは組織特異的 親和性を示す置換基である）
で表される化合物に関する。
本発明の第 2の発明は、 一般式 Iで表される化合物を有効成分として含有する 一般式 Iで表される化合物に感受性を示す疾患の治療用または予防用の医薬に関 する。
本発明の第 3の発明は、 一般式 Iで表される化合物を含有、 希釈および Zまた は添加してなる食品または飲料に関する。 図面の簡単な説明
図 1 ：化合物 (8) の1 H— NMRスぺク トルを示す図である。
図 2 ：化合物 (7) の1 H— NMRスぺク トルを示す図である。
図 3 ：化合物 （10) の1 H— NMRスぺクトルを示す図である。
図 4 ：化合物 （9) の1 H— NMRスぺク トルを示す図である。
図 5 ：化合物 （12) の1 H— NMRスぺクトルを示す図である。
図 6 ：化合物 （1 1) の1 H— NMRスぺクトルを示す図である。
図 7 ：化合物 （14) の1 H— NMRスぺクトルを示す図である。
図 8 ：化合物 （18) の1 H— NMRスぺクトルを示す図である。
図 9 ：化合物 （17) の1 H— NMRスぺク トルを示す図である。
図 10 ：化合物 （20) の1 H— NMRスぺク トルを示す図である。
図 1 1 ：化合物 （1 9) の1 H— NMRスぺク トルを示す図である。
図 12 ：化合物 （22) の1 H— NMRスぺク トルを示す図である。 図 1 3 ：化合物 （2) を添加して培養したときの培地中の N02-濃度を示す図 である。
図 14 ：化合物 （7) を添加して培養したときの培地中の N02-濃度を示す図 である。
図 1 5 ：化合物 （9) を添加して培養したときの培地中の N02 -濃度を示す図 である。
図 1 6 ：化合物 （1 1) を添加して培養したときの培地中の N02 濃度を示す 図である。
図 1 7 ：化合物 （14) を添加して培養したときの培地中の N02-濃度を示す 図である。
図 1 8 ：化合物 （1 7) を添加して培養したときの培地中の N02-濃度を示す 図である。
図 1 9 ：化合物 （1 9) を添加して培養したときの培地中の N02 -濃度を示す 図である。
図 20 ：化合物 （21) を添加して培養したときの培地中の N02-濃度を示す 図である。
図 21 ：各種培養条件下で培養したときの培地中の PGE2濃度を示す図であ る。
図 22 ：各種培養条件下で培養したときの培地中の N02 濃度を示す図である。 図 23 ：各種培養条件下で培養したときの培地中の PGE2濃度を示す図であ る。
図 24 ：ガスクロマトグラフィーの結果を示す図である。
図 25 ： DGEと內部標品の面積比と、 対応する DGEと内部標品の重量比の 検量線を示す図である。
図 26 ：各種化合物から DGEへの変換率の時間経過を示す図である。
図 27 ：各培養条件で培養したときの培養上清中の I L— 10の濃度を示す図 である。 ' 発明の詳細な説明 以下、 本発明を具体的に説明する。
本発明において一般式 Iで表される化合物の製造方法は、 特に限定するもので はないが、 当該化合物は、 例えば、 自体公知の方法による化学合成法によって、 得ることができる。 例えば、 以下の実施例に示すごとく、 3， 6—アンヒドロガ ラクトースまたはその硫酸化体の 4位の水酸基に目的の置換基 （R) を導入する ことにより得ることができる。
本明細書において、 以下、 一般式 Iで表される化合物とは、 一般式 Iで表され る化合物、 一般式 I Iで表されるそのアルデヒド体、 また一般式 I I Iで表され るその抱水体を意味する。 一般式 1〜 1 I Iで表される化合物の構造は、 他の表 現で表すことも可能であるが、 それらも含め、 また、 可能なそれらの互換異性体 も含め、 一般式！〜 I I Iで表すこととする。 また一般式 I〜 I I Iにおける立 体配置は、 所望の活性が得られる限り、 特に限定するものではなく D—型、 L— 型またはそれらの混合物であってもよい。
Figure imgf000006_0001
Figure imgf000006_0002
本発明の代表的な化合物である 3， 6—アンヒドロガラクトースまたはその硫 酸化体を還元末端に有し、 その 3， 6—アンヒドロガラクトースまたはその硫酸 化体の 4位に Rが結合した一般式 Iで表される化合物は、 例えば、 還元末端の 3 , 6—アンヒドロガラクトースまたはその硫酸化体が、 生理条件下で一般式 I V ：
Figure imgf000007_0001
( I V)
(Y、 Zは Hまたは C H2 O H、 ただし、 Zが C H2 O Hのとき、 Yは H、 Zが H のとき、 Yは一 C H2 O Hである）
で表される化合物に変化する。
変化した一般式 I Vで表される化合物は、 生理的環境下においてアポトーシス 誘発能、 抗癌作用、 活性酸素産生抑制作用、 一酸化窒素産生抑制作用、 α—ダリ コシダ一ゼ阻害活性、 インターロイキン産生抑制活性、 ヘムォキシゲナーゼ産生 誘導活性または免疫調節作用等の生理作用を示す。
本発明において Rは ΟΗ以外の置換基であって、 例えば、 一般式 I Vで表され る化合物を生成する反応において、 脱離基として作用し、 3， 6—アンヒ ドロガ ラクトースまたはその硫酸化体の 3位と 4位の間に不飽和結合を導入できるもの および/または組織特異的親和性を示すものであればよい。 Rの例としては、 飽 和炭化水素、 不飽和炭化水素、 芳香族炭化水素、 糖、 糖鎖、 核酸、 脂質、 ぺプチ ド、 タンパク質、 糖タンパク質、 糖脂質、 リン脂質等をあげることができる。
Rと 3， 6—アンヒドロガラクト一スまたはその硫酸化体の 4位の結合様式と しては、 特に限定はなく、 例えば、 一般式 I Vで表される化合物を生成する反応 において結合が切れるものであればよいが、 エステル結合、 エーテル結合等が例 示される。
Rとして、 組織親和性を示す特定の置換基を用いることにより、 特定の臓器、 細胞、 器官等の特定の場所に一般式 Iで表される化合物を特異的に局在させ、 そ の位置で該置換基が外れることにより、 一般式 I Vで表される化合物が生成し、 目的の特定の部位でその生理活性を発現させることができる。 また、 さらに発現 する時間、 強さをコントロールすることができる。
さらに、 Rとして特定の置換基を用いることにより、 一般式 Iで表される化合 物の生体への吸収性を上げることもできる。 すなわち、 Rとして特定の置換基を 用いることにより、 投与後において直ぐには活性を発現せず、 効率よく体内に吸 収され、 任意の局所に濃縮された後、 その部位でのみ一般式 I Vで表される化合 物の生理活性を発現させることができる。
すなわち、 本努明により一般式 Iで表される化合物を有効成分とする一般式 I
Vで表される化合物の生体内での生成用のプロドラグが提供される。
当該プロドラグとしては、 一般式 Iで表される化合物を有効成分とし、 これを 公知の医薬用担体と組合せ、 自体公知の方法により製剤化すればよい。 一般的に は、 当該組成物を薬学的に許容できる液状または固体状の担体と配合し、 力っ必 要に応じて溶剤、 分散剤、 乳化剤、 緩衝剤、 安定剤、 賦形剤、 結合剤、 崩壊剤、 滑沢剤等を加えて、 錠剤、 顆粒剤、 散剤、 粉末剤、 カプセル剤等の固形剤、 通常 液剤、 懸濁剤、 乳剤等の液剤とすることができる。 また、 これを使用前に適当な 担体の添加によつて液状となし得る乾燥品とすることができる。
当該プロドラグは、 経口剤や、 注射剤、 点滴用剤等の非経口剤のいずれによつ ても投与することができる。
医薬用担体は、 上記投与形態および剤型に応じて選択することができ、 経口剤 の場合は、 例えば、 デンプン、 乳糖、 白糖、 マンニット、 カルボキシメチルセル ロース、 コーンスターチ、 無機塩等が利用される。 また、 経口剤の調製に当って は、 さらに、 結合剤、 崩壊剤、 界面活性剤、 潤沢剤、 流動性促進剤、 矯味剤、 着 色剤、 香料等を配合することもできる。
一方、 非経口剤の場合は、 自体公知の方法に従い、 プロドラグの有効成分であ る一般式 Iで表される化合物を希釈剤としての注射用蒸留水、 生理食塩水、 ブド ゥ糖水溶液、 注射用植物油、 ゴマ油、 落花生油、 大豆油、 トウモロコシ油、 プロ ピレンダリコール、 ポリエチレングリコール等に溶解ないし懸濁させ、 必要に応 じ、 殺菌剤、 安定剤、 等張化剤、 無痛化剤等を加えることにより調製される。 本発明のプロドラグは、 製剤形態に応じた適当な投与経路で投与される。 投与 方法も特に限定はなく、 内用、 外用および注射によることができる。 注射剤は、 例えば、 静脈内、 筋肉内、 皮下、 皮内等に投与することができ、 外用剤には座剤 等も包含される。 プロドラグとしての投与量は、 その製剤形態、 投与方法、 使用目的およびこれ に適用される患者の年齢、 体重、 症状によって適宜設定され、 一定ではないがー 般には、 製剤中に含有される有効成分の量が成人 1日当り 1 0 /x g〜2 0 0 m g Z k gである。 もちろん投与量は、 種々の条件によって変動するので、 上記投与 量より少ない量で十分な場合もあるし、 あるいは範囲を超えて必要な場合もある。 本発明の薬剤はそのまま経口投与するほか、 任意の飲食品に添カ卩して日常的に摂 取させることもできる。
本発明の一般式 Iで表される化合物はアポトーシス誘発活性、 制がん活性、 活 性酸素産生抑制活性、 過酸化脂質ラジカル産生抑制活性、 一酸化窒素産生抑制活 性等の抗酸化活性、 抗病原微生物活性、 抗変異原活性、 免疫調節作用、 抗炎症作 用、 抗アレルギー作用、 サイトカイン産生調節作用、 抗リウマチ作用、 抗糖尿病 作用、 ヘムォキシゲナーゼ産生誘導活性等の生理活性を有し、 一般式 Iで表され る化合物を有効成分とし、 アポト一シス誘発を要する疾患、 がん性疾患、 活性酸 素産生抑制を要する疾患、 過酸化脂質ラジカル産生抑制を要する疾患、 一酸化窒 素産生抑制、 または免疫調節、 炎症抑制、 アレルギー抑制、 サイトカイン産生調 節を要する疾患、 ヘムォキシゲナーゼ産生誘導を要する疾患等の治療剤または予 防剤、 すなわち、 アポトーシス誘発剤、 制がん剤、 活性酸素産生抑制剤、 過酸ィ匕 脂質ラジカル産生抑制剤、 一酸化窒素産生抑制剤等の抗酸化剤、 抗菌剤、 抗ウイ ルス剤、 抗変異原剤、 血糖上昇抑制剤、 抗高脂質剤、 免疫調節剤、 抗炎症剤、 抗 アレルギー剤、 サイトカイン産生調節剤、 抗リウマチ剤、 抗糖尿病剤、 ヘムォキ シゲナ一ゼ産生誘導剤等の当該化合物に感受性を示す疾患の治療用または予防用 医薬を製造することができる。
すなわち、 一般式 Iで表される化合物を有効成分として含有する本発明のアポ トーシス誘発剤は、 自己免疫疾患患者の自己反応性リンパ球、 がん細胞、 ウィル ス感染細胞等を排除するのに有効であり、 アポトーシスを所望の組織、 細胞で発 現させることにより、 不要もしくは有害な細胞を自然の形で生体から排除するこ とができる。 本発明のアポト一シス誘発剤が有効な疾患としては、 例えば、 全身 性エリテマトーデス、 免疫介在性糸球体腎炎、 多発性硬化症、 膠原病等の自己免 疫疾患、 リウマチ等である。 本発明のアポトーシス誘発剤はアポト一シス誘発方法に使用することができ、 該方法はアポトーシス誘発機構の解明、 アポトーシス誘発剤、 アポトーシス誘発
P且害剤のスクリーニング等に有用である。
本発明に使用する一般式 Iで表される化合物は酸化物質、 例えば、 活性酸素の 産生抑制に有用であり、 該化合物を有効成分とする活性酸素産生抑制剤等の抗酸 化剤は活性酸素の産生おょぴ Zまたは過剰が起因となる疾病の治療または予防に 有用である。
活性酸素は、 大きくラジカルと非ラジカルの活性酸素に分類することができる。 ラジカル系活性酸素には、 ヒドロキシラジカル、 ヒドロキシペルォキシラジカル、 ペルォキシラジカル、 アルコキシラジカル、 二酸化窒素、 一酸化窒素 （以下、 N oと略す） 、 チイルラジカル、 スーパーォキシドがある。 一方、 非ラジカル系活 性酸素には、 一重項酸素、 過酸化水素、 脂質ヒドロペルォキシド、 次亜塩素酸、 オゾン、 ペルォキシ亜硝酸がある。 いずれも多くの病態、 すなわち、 各種の炎症 性疾患、 糖尿病、 がん、 動脈硬化、 神経疾患、 虚血再灌流障害などと関わりがあ る。
生体内では絶えずいくつかの経路で低濃度の活性酸素が生成している。 これは 生理的にミトコンドリアなどの電子伝達系から漏出するスーパーォキシドゃ過酸 化水素、 銅や鉄などの遷移金属が触媒することによるヒドロキシラジカル、 好中 球や単球などによって生成される感染防御のための次亜塩素酸、 アルギニンの分 解により生成する N Oなど、 いずれも避けることのできないものである。 これら の活性酸素生成に対して、 生体は活性酸素消去系としての酵素、 低分子化合物を もち、 生成と消去のバランスを保っている。 し力 し、 これらの経路がなんらかの 原因で活性化されたり、 逆に消去系が不活性化されて、 活性酸素生成系が消去系 に対して優位に立った場合、 生体は酸化的障害を受けることになる。 このような 状態は酸化ストレスといわれる。
さらに、 生体内のバランスがずれた場合だけでなく、 大気や食品などの生体外 のものからも、 生体は常に酸化ストレスにさらされており、 日常生活を送る上で 酸ィ匕ストレスは避けることができない。
すなわち、 酸化ストレスは上記のように、 様々な疾患と関わりがあり、 生体は、 常に酸化ストレスによる疾患、 あるいは、 疾病の悪化につながる状況にさらされ ている。 したがって、 このような酸ィ匕ストレスが引き起こす疾病の予防、 治療あ るいは悪化防止にも、 本発明の抗酸化剤、 例えば活性酸素産生抑制剤は有用であ る。
また、 酸化ストレスに必ずつきまとうのが脂質過酸化反応であり、 この反応は 過酸化脂質ラジカルができると一挙に進む反応である。 そこで生成される 4—ヒ ドロキシー 2—ノネナール （HNE) はグルタチオンやタンパク質を特異的な標 的とする毒性アルデヒドである。 その HNEとタンパク質との反応生成物が、 様々な病態組織において検出されており、 酸化ストレスの関わる疾患病態の誘発 因子ではないかと考えられている。 そのため、 過酸化脂質ラジカルの生成を抑え ることのできる本発明に使用される抗酸化物質、 すなわち一般式 Iで表される化 合物を有効成分として含有する抗酸化剤は酸化ストレスによる生活習慣病疾患の 予防および治療に有用である。
NOは内皮細胞由来血管平滑筋弛緩因子 （EDRF) の本体である [ネーチヤ 一 (Nature) 、 第 327卷、 第 524〜 526頁 （1 987) ] 。 本発明により
N O産生の抑制を必要とする疾病治療剤または予防剤が提供される。
本発明において、 NO産生の抑制を必要とする疾病とは、 特に限定はないが、 例えば、 毒性ショックやある種のサイトカインによる治療等による全身性血圧低 下、 血圧応答低下、 糖尿病、 血管機能不全、 病因性血管拡張、 組織損傷、 心臓血 管系虚血、 痛感過敏症、 脳虚血、 血管新生を伴う疾病、 がん等の疾病を含むもの である。
固形がんの増大に血管新生は必須であるが、 血管內皮増殖因子 血管透過性亢 進因子 （VEGF) はこの過程に重要な役割を演じている。 様々ながん細胞にお いて VEGFが NOによって誘導される。 本発明の NO産生抑制剤は NO産生を 抑制することによってがん細胞の VEGF産生も抑制し、 その結果、 がん組織周 辺での血管新生が阻害される。 がん細胞を皮下に移植して固形腫瘍を形成させた マウスに本発明の NO産生抑制剤を投与すると、 がん組織の周辺の血管の形成が 不十分となり、 がんは脱落する。
ニトロソァミンは 2級アミンにニト口ソ基が付カ卩した一群の化合物で数百種類 が知られており、 その多くが DN Aに損傷を加えることにより動物に対して発が ん性を示す。 ニトロソァミンはヒ トの発がんにも深く関わっているとされており、 通常、 胃の中で亜硝酸塩とァミンとが反応することによって生成する。 NOは p H中性の生理的条件下でもァミンと反応してニトロソァミンを生成する。 また、 疫学的にがんとの関係が高い肝吸虫感染患者や肝硬変患者において NO産生は亢 進している。 したがって、 本発明の NO産生抑制剤を投与して NO産生の亢進を 防ぐことによって特にハイリスクグループの発がんを予防することができる。 以 上のように、 本発明の NO産生抑制剤は発がんの抑制とがん組織における血管新 生阻害という 2段階で制がん作用を示す。
NOはまた、 炎症性病変に特徴的に認められる浮腫、 すなわち血管透過性充進 作用を誘発し [マエダ （Maeda) ら、 ジャパニーズ ·ジャーナル ·ォブ ·カンサ 一 · ジサ一チ (Japanese Journal of Cancer Research) 、 第 85卷、 第 331 〜334頁 （1994) ] 、 また、 炎症性メデイエ一ターであるプロスタグラン ジン類の生合成を亢進させる [サルベミニ （Salvemini) ら、 プロシーデイング ズ ·ォブ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェンシズ ' USA
(Proceedings of National Academy of Sciences, USA 、第 90卷、 第 724 0〜7244頁 （1993) ] 。 一方、 NOはスーパーォキシドラジカルと速や かに反応してペルォキシ亜硝酸ィオンを生じ、 ペルォキシ亜硝酸ィオンが炎症性 の細胞、 組織障害を引き起こすとも考えられている。
活性化された免疫細胞が臓器に入り込みサイト力インを放出すると、 NOの産 生が誘導される。 インスリン依存型糖尿病は膝島 細胞が特異的に破壊されるこ とによって引き起こされる疾患であり、 NOによる破壊であるとされている。 ま た、 慢'|~生関節性リウマチ、 変形性関節リウマチ、 痛風性関節炎、 ベ一チヱット病 に伴う関節炎の患者の病変部の関節液には同患者の正常な関節や健常人の関節の 関節液に比べて高濃度の NOが含まれている。 これらの患者に本発明の NO産生 抑制剤を投与すると病変部における NO産生を抑制し、 症状が改善する。
脳虚血中および再灌流後には NO産生が増大し、 それに伴って脳組織が損傷を 受ける。 脳虚血時に患者に本発明の NO産生抑制剤を投与することにより脳組織 の損傷が軽減され、 予後が改善される。 組織の炎症および疼痛の惹起にはァラキドン酸代謝が大きく関与している。 細 胞膜リン脂質由来のァラキドン酸は、 体内でシクロォキシゲナ一ゼの作用により プロスタグランジン、 プロスタサイクリン、 トロンボキサンチンの三者に代謝さ れる。 このうちプロスタグランジンは血管拡張作用とそれに伴う臓器への血流増 加作用を有するが、 特に炎症部位においてはプロスタグランジン E2と 1 2がその 血流増加作用により、 浮腫と白血球浸潤を増加させる。 本発明の一般式 Iで表さ れる化合物は、 プロスタグランジン E2合成抑制活性を有する。 従って、 本発明 の一般式 Iで表される化合物を有効成分として含有する医薬は、 プロスタグラン ジン E2合成抑制を要する疾患の治療または予防に有用である。 すなわち、 本発 明のプロスタグランジン E2合成抑制剤を投与することにより、 プロスタグラン ジンの生合成を抑制すると、 鎮痛、 抗炎症作用を発現させることができる。 さら に、 炎症部分に浸潤した白血球は活性酸素を生産し、 酸化ストレス状態を引き起 こすため、 プロスタグランジンの生合成を抑制する本発明のプロスタグランジン E2合成抑制剤は、 酸化ストレスによる先に述べたような様々な疾患、 疾病の予 防、 治療あるいは悪化防止にも有用である。
また、 先にも述べたように、 N Oは、 炎症性病変に特徴的に認められる浮腫、 すなわち血管透過性亢進作用を誘発し、 炎症性メデイエ一ターであるプロスタグ ランジン類の生合成を充進させることより、 本宪明の N O産生抑制効果とプロス タグランジン E2合成抑制効果は相乗的に作用し、 鎮痛、 抗炎症作用と酸化スト レスによる様々な疾患、 疾病の予防、 治療あるいは悪化防止に相乗効果を発現す る。
本発明におけるサイトカインとしては、 例えばインターロイキンが挙げられる。 インターロイキンは、 リンパ球、 単球などが生産するタンパク質性生物活性物質 の総称である。 現在ではインタ一ロイキン 1〜1 8の存在が知られている。 イン ターロイキンとしては、 例えば I L— 6、 I L— 1 0が挙げられる。
I L— 6は、 B細胞の最終分化を誘導する分化因子としてその cDNAがクロー二 ングされた。 I L一 6は、 免疫応答だけでなく、 造血系、 神経系の細胞分化や急 性反応に関与しており、 さらに、 種々の免疫異常や炎症性疾患、 リンパ系腫瘍の 発症とも密接に関係している。 また、 I L一 6は、 B細胞に対し抗体産生を誘導 し、 I g M、 I g G、 I g Aの各クラスの免疫グロブリンを産生するが、 I L— 4とは異なりクラススィッチには関与しない。 また、 I L— 6は、 B細胞ゃプラ ズマサイトの增殖因子としても働いている。 一方、 T細胞系にも関与しており、 T細胞を増殖させたり、 分化させたりする。 I L一 6は、 造血系にも関与してお り、 I L— 3と協調して、 G O期を短縮させることにより造血幹細胞を増殖させ る。 また、 巨核球の成熟を促し血小板の増加を誘導する。 I L一 6は、 細菌ゃゥ ィルス感染、 悪性腫瘍など生体が即座に反応する急性期反応にも関与している。 I L一 6は、 神経系にも関与しており、 グリオブラストーマゃァストロサイト一 マなどの神経系細胞から分泌され、 神経系の分化誘導にも働く。 慢性関節リウマ チゃ全身性エリ トマト一デスでは、 B細胞の活性化がみられ、 患者の関節液中に 高濃度の I L— 6が存在する。 全身性リンパ節腫脹を特徴とする Castleman症候 群では、 血中 I L— 6濃度が非常に高い。 自己免疫疾患様症状をしめす心房粘液 腫の患者では、 腫瘍細胞から大量の I L— 6が産生されている。 また、 多発性骨 髄腫患者由来のミエローマ細胞の増殖が抗 I L— 6抗体で抑制されることより、 I L—6は、 ミエローマ細胞の自己増殖因子である可能性が高い。 さらに、 原発 性糸球体腎炎患者の尿中にも I L— 6が含まれており、 I L一 6が腎メサンギゥ ム細胞の増殖因子として働いている （宫園浩平および菅村和夫編、 「B i o S c i e n c e用語ライブラリー：サイトカイン ·増殖因子」 、 2 8— 2 9頁、 羊土 社 （1 9 9 5 ) ) 。 このような I L一 6の異常産生が病体の原因と考えられる疾 患には、 本発明に使用する化合物を投与することで、 I L一 6の産生を抑制し、 症状を治療または予防することができる。
また、 I L— 1 0産生抑制を要する疾患としては、 例えば免疫の低下を伴う疾 患が挙げられ、 このような疾患に対して本発明の化合物は有用である。
ヘムォキシゲナーゼ （H O) には、 3 3 k D aの H O— 1と 3 6 k D aの HO 一 2の 2つのアイソザィムが存在する。 HO—2は、 H O— 1の 側に 2 0 ァミノ酸残基からなるァミノ酸配列が余分についた構造を持っている。 残りの部 分の相同性は 4 0〜 5 0。/oであるが、 高次構造は良く類似している。 両者ともに C末端部に疎水性領域があり、 この部分でミクロソーム膜に結合している。 ミク 口ソームをトリプシン処理するとヘム分解活性を有する可溶性画分が得られるこ と力 ら、 活性中心を含む大きなドメインは細胞質側に突き出ていると思われる。
H O— 1は、 誘導酵素であり、 基質であるヘム、 重金属イオン、 ある種の有機 化合物、 過酸化水素、 あるいは、 熱ショック U V照射、 虚血というような化学的、 物理的要因によって種々の細胞で顕著に誘導される。 HO— 2は構成酵素で、 各 組織で発現しているが、 特に脳や精巣で活性が高い。 H Oは、 ヘムをビリベルジ ン、 C〇、 鉄に分解し、 ビリベルジンは、 さらに還元酵素により、 ビリルビンと なる。 このビリルビンには、 脂肪酸の抗酸化作用、 脂質ラジカルのスカベンジ作 用、 好中球の貪食などに伴い大量に発生する酸素ラジカルによるリン脂質、 中性 脂肪、 コレステロールのヒドロペリオキシドの産生抑制作用、 動脈硬化発症と深 く関与する L D L (Low density lipoprotein) の産生抑制作用、 一重項酸素の ス力べンジ作用等の抗酸化物質としての活性があり、 内因性抗酸化物質として生 体内で重要な役割を担っている。 各種ラジカルは、 脂質だけでなく、 タンパク質、 核酸など様々な生体物質に作用して、 慢性疾患、 癌を引き起こす要因となってい るが、 ビリルビンは、 このような各種ラジカルを減少させる （ポルフィリン研究 会編 「ポルフィリン ·ヘムの生命科学：遺伝病 ·がん ·工学応用などへの展開」 、 東京化学同人 （1 9 9 5 ) ) 。 つまり、 H Oを誘導することにより、 抗酸化活性 を有するビリルビンの産生が誘導され、 各種ラジカルによる疾患を治療または予 防することができる。 本発明に使用する化合物は H Oの産生を誘導し、 上記のよ うな HO産生誘導を要する疾患の治療または予防に対して有用である。
一般式 Iで表される化合物を有効成分とする免疫調節剤はリンパ球幼若化反応 抑制作用、 混合リンパ球反応抑制等の免疫調節作用を有し、 当該免疫調節剤はこ れらの免疫系、 免疫因子の異常が起因となる疾病の治療剤または予防剤として有 用である。
なお、 リンパ球幼若ィ匕反応とは、 マイトジェンがリンパ球表面の受容体に結合 し、 リンパ球を活性化させ、 その分裂、 増殖を促す反応である。 混合リンパ球反 応とは、 同種異系の動物より得られたリンパ球を混合培養することにより、 主要 組織適合抗原の不一致によるリンパ球の活性化が誘導され、 リンパ球の分裂、 増 殖が促進される反応である。 本発明の免疫調節剤はこれらの反応を抑制し、 リン パ球の異常亢進が起因となる自己免疫性疾患、 例えば慢性腎炎、 慢性大腸炎、 I 型糖尿病、 慢性関節リウマチ等の慢性の疾患の治療または予防に特に有用であり、 また移植片拒絶反応の抑制においても有用である。
本発明のアポトーシス誘発剤としては、 一般式 Iで表される化合物を有効成分 とし、 これを公知の医薬用担体と組合せ製剤化すればよい。 当該アポトーシス誘 発剤の製造は上記のプロドラグの製造方法に準じ行うことができる。
当該アポトーシス誘発剤は、 製剤形態に応じた適当な投与経路で投与される。 投与方法も特に限定はなく、 内用、 外用および注射によることができる。 注射剤 は、 例えば、 静脈内、 筋肉内、 皮下、 皮内等に投与することができ、 外用剤には 座剤等も包含される。
アポトーシス誘発剤としての投与量は、 その製剤形態、 投与方法、 使用目的お よびこれに適用される患者の年齢、 体重、 症状によって適宜設定され、 一定では ないが、 一般には製剤中に含有される有効成分の量が成人 1日当り 1 0 ^ g〜2 O O m g Z k gである。 もちろん、 投与量は、 種々の条件によって変動するので、 上記投与量より少ない量で十分な場合もあるし、 あるいは範囲を超えて必要な場 合もある。 本発明の薬剤はそのまま経口投与するほか、 任意の飲食品に添加して 日常的に摂取させることもできる。
本発明の制がん剤としては、 一般式 Iで表される化合物を有効成分とし、 これ を公知の医薬用担体と組合せ製剤化すればょレ、。 当該制がん剤の製造は上記のプ 口ドラグの製造方法に準じ行うことができる。
当該制がん剤としては、 製剤形態に応じた適当な投与経路で投与される。 投与 方法も特に限定はなく、 内用、 外用おょぴ注射によることができる。 注射剤は、 例えば静脈内、 筋肉内、 皮下、 皮内等に投与することができ、 外用剤には座剤等 も包含される。
制がん剤としての投与量は、 その製剤形態、 投与方法、 使用目的およびこれに 適用される患者の年齢、 体重、 症状によって適宜設定され、 一定ではないが、 ― 般には製剤中に含有される有効成分の量が成人 1日当り 1 0 g〜2 0 O m g / k gである。 もちろん投与量は、 種々の条件によって変動するので、 上記投与量 より少ない量で十分な場合もあるし、 あるいは範囲を超えて必要な場合もある。 本発明の薬剤はそのまま経口投与するほか、 任意の飲食品に添加して日常的に摂 取させることもできる。
また、 一般式 Iで表される化合物を有効成分とする抗酸化剤、 活性酸素産生抑 制剤、 過酸化脂質ラジカル産生抑制剤、 N O産生抑制剤は上記アポトーシス誘発 剤に準じ製造することができ、 用量、 用法はその症状に応じ、 上記アポトーシス 誘発剤に準じて、 使用すればよい。
抗酸化剤、 活性酸素産生抑制剤、 過酸化脂質ラジカル産生抑制剤、 N O産生抑 制剤剤としては、 製剤形態に応じた適当な投与経路で投与される。 投与方法も特 に限定はなく、 内用、 外用および注射によることができる。 注射剤は、 例えば、 静脈内、 筋肉内、 皮下、 皮内等に投与することができ、 外用剤には座剤等も包含 される。
抗酸化剤、 活性酸素産生抑制剤、 過酸化脂質ラジカル産生抑制剤、 N O産生抑 制剤としての投与量は、 その製剤形態、 投与方法、 使用目的およびこれに適用さ れる患者の年齢、 体重、 症状によって適宜設定され、 一定ではないが、 一般には 製剤中に含有される有効成分の量が成人 1日当り 1 0 /z g〜2 0 0 m g Z k gで ある。 もちろん投与量は、 種々の条件によって変動するので、 上記投与量より少 ない量で十分な場合もあるし、 あるいは範囲を超えて必要な場合もある。 本発明 の薬剤はそのまま経口投与するほ力、 任意の飲食品に添加して日常的に摂取させ ることもできる。
さらに、 一般式 Iで表される化合物は生体内で一般式 I Vで表される化合物に 変化することにより α—グリコシダーゼ、 例えば、 シユークラーゼに阻害活性を 示し、 一般式 Iで表される化合物を有効成分とする血糖上昇抑制剤、 抗高脂血症 剤、 抗肥満剤、 抗糖尿病剤等を製造することができる。 これらの医薬は上記アポ トーシス誘発剤に準じ製造することができ、 用量、 用法は治療、 予防目的の疾病 の症状に応じ、 上記アポトーシス誘発剤に準じて、 使用すればよい。
つぎに、 一般式 Iで表される化合物を含有、 希釈および Ζまたは添加してなる 食品または飲料 （以下、 本発明の食品または飲料と称す） は、 そのアポトーシス 誘発作用、 制がん作用、 抗酸化作用、 抗病原微生物活性、 抗変異原活性等により、 一般式 Iで表される化合物に感受性を示す疾患、 例えば、 アポトーシス誘発を要 する疾患、 がん性疾患、 活性酸素産生抑制を要する疾患、 N O産生抑制を要する 疾患、 病原微生物による疾患、 変異原により惹起される疾患等の症状改善、 予防 に極めて有用である。
本発明の食品または飲料の製造法は、 特に限定はないが、 調理、 加工および一 般に用いられている食品または飲料の製造法による製造を挙げることができ、 製 造された食品または飲料に一般式 Iで表される化合物が有効成分として含有、 添 加および/または希釈されていれば良い。
本発明の食品または飲料としては、 一般式 Iで表される化合物が含有、 希釈お よび/または添加されており、 その生理機能を発現するための必要量が含有され ていれば特にその形状に限定は無く、 タブレット状、 顆粒状、 カプセル状等の形 状の経口的に摂取可能な形状物も包含する。
本発明の食品または飲料は生理活性を有する一般式 Iで表される化合物を含有 し、 これらのアポトーシス誘発作用、 制がん作用等の生理機能によって、 これら を摂取することにより発がん予防、 がん抑制効果等の一般式 Iで表される化合物 に感受性を示す疾患の症状改善作用または予防作用を示す健康食品または飲料で あり、 特に胃 §健康保持に有用な食品または飲料である。
また、 一般式 Iで表される化合物は、 活性酸素産生抑制作用、 過酸化脂質ラジ カル産生抑制作用等の抗酸化活性を有し、 抗酸化用食品用の抗酸化剤または抗酸 化用飲料用の抗酸化剤、 例えば、 活性酸素産生抑制剤、 過酸化脂質ラジカル産生 抑制剤、 NO産生抑制剤等として抗酸化用食品または抗酸化用飲料の製造に使用 することができる。
さらに、 本発明により、 一般式 Iで表される化合物を含有する甘味料が提供さ れる。 すなわち、 一般式 Iで表される化合物は、 甘味を有し、 砂糖に代わる低力 口リ一甘味料の有効成分として有用である。
一般式 Iで表される化合物は、 その生理活性の有効量をマウスに経口投与して も急性毒性は認められない。 実施例
以下、 実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、 本発明はこれらの 実施例に限定されるものではない。 実施例 1
( 1 ) 1， 2— O—イソプロピリデン一 3， 6—アンヒドロー D—ガラクトー ス (1， 2 - 0 - isopropylidene- 3, 6 - anhydro - D - galactose) [化合物 ( 3； 」
3， 6—アンヒドロガラクトースの 4位の水酸基に特異的に様々な置換基を導 入するために、 反応式 I ：
Figure imgf000019_0001
に示す方法を用いた。
すなわち、 化合物 （3 ) の 4位の水酸基に目的の置換基 （R) を導入した後、 酸性条件下で 1， 2— 0-ィソプロピリデン基のみを除去した。
ここで必要とされる化合物 （3 ) は、 下記の反応式 I Iに示した様にハウォー ス (Haworth) らのカ法 [Imperial collection of Science and Technology、 第 620〜631頁（1940) ] により、 α— O—メチルー D—ガラクトピラノース [化合物 ( 1 ) ] を 3， 6—アンヒドロ一 D—ガラクト一ス [化合物 （2 ) ] にまで導い た後、 これをヒラセ (Hirase) らの方法 [Bulletin of the Chemical Society of Japan, 第 41卷、 第 626~628頁（1968) ] により、 1， 2— O—イソプロピリデ ン化することにより合成した。
Figure imgf000020_0001
(2) 糖供与体の合成
本実施例における化合物 (3) への糖の導入は全て、 シュミット （Schmidt) らが開発したトリクロロアセトイミデート法 [Liebigs ann. Chem.，第 1249〜1256 頁（1983)] により行った。
糖のトリクロロイミデート体はコバヤシ （Kobayashi) らの方法
[Carbohydrate Research，第 201卷，第 δ1〜67頁（1"0) ] 等に従い、 下記反応式 I I Iに示すような方法により合成した。
Figure imgf000020_0002
この方法により、 下記式 V〜V I Iでそれぞれ表される化合物 （4) 、 (5) 、 (6) の合成を行った。
Figure imgf000020_0003
(v)
Figure imgf000021_0001
(V I)
6
Figure imgf000021_0002
(V I I)
(3) 4— O—べンゾィルー 3， 6—アンヒドロ一 D—ガラクトース （4— 0~ benzoyl - 3， 6 - anhydro - D - galactose) [化合物 (7) ]
( i ) 4—0—ベンゾィル一 1， 2— O—イソプロピリデンー 3， 6—アン ヒ ト ロ一 D—フ フク トース (4— 0— benzoyl - 1, 2— O~isopropylidene— 3， 6— anhydro - D- galactose [化合物 （8) ]
化合物 （3) 10 Omg (0. 5mmo 1 )、 無水安息香酸 (ナカライテスク ： Co d e. 042-24) 1 70mg (0. 75 mm o 1 )および 4—ジメチノレア ミノピリジン （ナカライテスク ： Co d e. 129-22) 1 2. 2mg (0.
1 mmo 1 )をジクロロメタン 5 m 1に溶解し、 氷冷後、 トリェチルァミン（ナカ ライテスク ： Co d e. 348-05) 104m l (0. 75mmo l ) を添カロ し、 室温で 2時間攪拌した。
反応液を濃縮後、 へキサン：醉酸ェチル = 1 1 ： 2を展開溶媒としたシリカゲ ルクロマトグラフィーにより化合物 （8) 146mgを得た。 化合物 （8) の構 劍军析を、 核磁気共鳴 （NMR) スぺク トル （JNM—A500 (日本電子社 製)） により行った。
1 H-NMR δ 1.37(3H, s,Me)、 1.64(3H, s, Me)s 4.09 (1H, dd, J=3.5,16.5Hz, H - 6)、
4.17 (1H, d, J=10.5Hz, H-6)、 4.35 (1H, dd, J=2.5, 5Hz， H— 2)、 4.56 (1H, m, H- 5)、 4.68 (1H, d, J=5Hz, H - 3)、 5.48 (1H, d, J=2.5Hz， H— 1)、 5.71 (1H， d, J=l.5Hz， H— 4)、 7.43 (2H, t, J=8.5Hz， Bzl)、 7.59 (1H， td, J=l, 8.5， Bzl)、 8.00 (2H, dd, J=l, 8.5, Bzl) ただし、 サンプルは重ク口口ホルムに溶解し、 クロ口ホルムのプロトンの化学 シフト値を 7. 24 p pmとして表した。
図 1は化合物 (8) の1 H— NMRスペク トルを示す図である。 図 1において、 横軸は化学シフト値（p pm)、 縦軸はシグナルの強度を示す。
( i i) 化合物 (7)
化合物 （8) 8 Omgをジクロロメタン 3 Om 1に溶解し、 トリフノレオロ醉酸 /水（2. 85m'l /0. 1 5m l)を添加し、 室温で 3時間攪拌した。 反応液を 酢酸ェチル 3 O Om lで希釈し、 飽和重曹水で洗浄した。 有機層を減圧濃縮し、 クロ口ホルム：メタノ一ル= 25 : 1を展開溶媒としたシリ力ゲルク口マトグラ フィ一により下記式 V I I Iで表される化合物 （7) 52m gを得た。 化合物 (7) を核磁気共鳴（NMR)スペク トル （ J NM— A500 (日本電子社製）） 、 質量スぺク トル （MS) (DX302) 質量分析計（日本電子社製)） により構造 解析した。
Figure imgf000022_0001
(V I I I)
^-NMR
化合物 （7) を重クロ口ホルムに溶解し、 核磁気共鳴による構造解析を行った。 図 2は化合物 （7) の1 H— NMRスぺクトルを示す図である。 図 2において、 横軸は化学シフト値 （p pm) 、 縦軸はシグナルの強度を示す。
その結果、 この物質は 3, 6—アンヒドロー D—ガラクトースが重クロ口ホル ム中で 1位アルデヒドがへミアセータール結合 （α， β) との平衡関係を持った めに、 シグナルの帰属は不可能であった。 ただし、 化合物 （8) の 1， 2— Ο— イソプロピリデン由来のシグナル （図 1中、 δ ΐ. 37 p pm、 1. 64 p pm のシグナル） の消失および、 アルデヒ ド由来のシグナル （図 2中、 S 9. 75 p pmのシグナル） の生成は確認された。
F AB-MS
m/z 267 (M+H) + グリセロールをマトリックスに用いた。
(4) 4-0- (β-Ό-2, 3， 4， 6—テトラー Ο—ァセチルガラク トビ ラノシル） -3, 6—アンヒドロ一 D—ガラクトース （4一 0— (J3—D - S^ .e- tetra—O—acetylgaiactopyranosy —S, 6—anhydro—D—gaiactose) [ィ匕合物
(9) ]
( 1 ) 4 -0- (β-Ό-2, 3， 4， 6—テトラー Ο—ァセチルガラタ トピ ラノシル） 一 1， 2—0—イソプロピリデンー3， 6—アンヒドロー D—ガラク 卜ース (4-0- ( β -D-2, 3, 4, 6-tetra-0-acetylgalactopyranosyl) -1, 2-0 - isopropylidene— 3， 6— anhydro— D— galactose) [ィ匕合物 丄 0 ) ]
化合物 （4) 355mg (0. 72mmo 1 ) 、 化合物 （3) 146mg (0. 72mmo 1 ) にアルゴン雰囲気下、 ジクロロメタン 2 m 1を添加し、 氷/食塩 で一 20°Cに氷冷した。 ここに、 CF3 S03 S i (CH3) 3 (東京化成： TO 8 71)32m l (0. 14 mm o 1 ) / 2 m 1ジクロロメタンを徐々に添カロし、 _ 20 °Cで 1. 5時間撹拌した。 反応液に飽和重曹水、 酢酸ェチルを添加した後、 有機層を回収した。 この有機層をへキサン：酢酸ェチル =1 ： 1を展開溶媒とし た薄層クロマトグラフィーに供じると、 R O. 45付近に目的の生成物を検 出した。 さらに、 有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、 減圧濃縮しへキ サン：酢酸ェチル =5 ： 4を展開溶媒としたシリカゲルクロマトグラフィーによ り、 化合物 （1 0) 10 lmgを得た。 化合物 （10) の構^!析を、 核磁気 共鳴 （NMR) スペク トル （JNM— A500 (日本電子社製） ） により行った。
1 H-NMR
δ 1.29(3H, s,Me), 1· 51 (3H， s， Me)、 1.94(3H, s, Ac), 1.97 (3H, s， Ac)、
1.98 (3H, s, Ac), 2.08 (3H, s, Ac) , 3.90(2H,m)、 3.96(1H， d, J=10Hz, H-6a)、
4.06 (1H， dd, J=6, 11Hz, H-6b)、 4.11 (1H, dd, J=7, 11Hz, H- 6b)、
4.23 (1H, dd, J=3, 5Hz, H— 2a)、 4.36 (1H, d， J=5Hz, H-3a)、 4.42 (1H, m, H - 5a)、 4.47 (IH, d, J=L 5Hz, H-4a)、 4.52 (IH, d, J=8Hz, H - lb)、 4.95 (IH, dd, J=3.5， lOHz, H- 3b)、 5.11 (IH, dd, J=8, lOHz, H— 2b)、 5.33 (1H， d, J=3.5Hz， H— 4b)、
5.35 (IH, d, J=3. OHz，H- la)
ただし、 サンプルは重クロ口ホルムに溶解し、 クロ口ホルムのプロトンの化学 シフト値を 7. 24 p pmとして表した。
図 3は化合物 （10) の1 H— NMRスぺクトルを示す図である。 図 3におい て、 横軸は化学シフト値（p pm)、 縦軸はシグナルの強度を示す。
( i i) 化合物 (9)
ί匕合物 （10) 44mgをジクロロメタン 1 Om 1に溶解し、 トリフノレォロ齚 酸 /水（1. 14m 1 /6 Om 1 )を添加し、 室温で 3時間攪拌した。 反応液を減 圧濃縮し、 クロ口ホルム：メタノ一ル= 19 : 1を展開溶媒としたシリ力ゲルク 口マトグラフィ一により化合物 （9) 9mgを得た。 化合物 (9) の構造角?析を、 核磁気共鳴（NMR)スぺクトル（JNM— A500 (日本電子社製)）により行った。
1 H-NMR
δ 1.91(3H, s,Ac)、 1.99(3H, s, Ac), 2.02 (3H, s, Ac), 2.11 (3H, s, Ac)、
3.45 (IH, dd, J=3.5， 6.5Hz， H-2a)、 3.81 (IH, dd, J=3, lOHz, H-6a)、
3.87 (IH, dd, J=4.5, lOHz, H-6a)、 3.91(1H, t, J=3.5Hz, H-3a)、 4.23 (4H， m)、
4.37 (1H， dt, J=3, 4.5Hz, H—5a)、 4.89 (IH, d, J=8Hz, H - lb)、 4.93 (1H， d, J=6.5Hz, H - la)、 5.05 (IH, dd, J=8， lOHz, H- 2b)、 5.22 (1H， dd, J=3, lOHz, H- 3b)、
5.35 (IH, d, J=3.0Hz, H- 4b)
ただし、 サンプルは重水に溶解し、 HODの化学シフト値を 4. 65 p pmと して表した。
図 4は化合物 （9) の1 H— NMRスぺクトルを示す図である。 図 4において、 横軸は化学シフト値（p pm)、 縦軸はシグナルの強度を示す。
なお、 iH— NMRにおけるピークの帰属の番号は下記式 I Xのとおりである。
Figure imgf000025_0001
(i x)
(5) 4— O— ]3— D—グルコピラノシルー 3， 6—アンヒ ドロ一D—ガラク 卜ース (4-0- β -D-glucopyranosyl-3, 6-anhydro-D-galactose) [化合物 (1 1) ]
( i ) 4— Ο— (β-Ό- 2, 3， 4， 6—テトラ _〇ーァセチルダルコビラ ノシル） ー1， 2— Ο—イソプロピリデン一 3， 6—アンヒドロ一 D—ガラクト ース (4-0- ( β - D- 2, 3， 4, 6-tetra-0-acetylglucopyranosyl) - 1, 2-0- i sopropyli dene- 3, 6- anhydro - D- galactose) [化合物 (1 2) ]
化合物 （5) 1. 22 g (2. 47mmo 1 ) 、 化合物 （ 3 ) 3 54 m g ( 1 · 75mmo 1 ) にァノレゴン雰囲気下、 ジクロロメタン 1 0 m 1を添加し、 氷/食 塩で一 20°Cに氷冷した。 ここに、 CF3 S03 S i (CH3) 3 1 00m l (0.
4mmo 1 ) /2m lジクロロメタンを徐々に添加し、 一 20。じで 2. 5時間撹 拌した。 反応液に飽和重曹水、 酢酸ェチルを添加した後、 有機層を回収した。 こ の有機層をへキサン：齚酸ェチル = 1 ： 1を展開溶媒とした薄層クロマトグラフ ィ一に供じると、 1 £値0. 4 5付近に目的の生成物を検出した。 さらに、 有機 層を無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、 減圧濃縮しへキサン：酢酸ェチル = 5 ： 4を展開溶媒とたシリカゲルクロマトグラフィーにより、 化合物 （1 2) 2 3 Omgを得た。 化合物 （1 2) の構 军析を、 核磁気共鳴 （NMR) スぺクト ル （ J NM— A4 500 (B本電子社製)）により行った。
1 H-NMR
δ 1.29(3H， s，Me)、 1· 51 (3H, s， Me)、 1.94(3H, s, Ac), 1.97(3H， s, Ac)、
1.98(3H，s，Ac)、 2.02 (3H， s, Ac)、 3.69 (1H, ddd， J=2.5, 5, 10Hz, H— 5b)、
3.89 (1H, dd, J=3, 10Hz, H— 6a)、 3.96 (1H, d, J=10Hz, H - 6a)、 4.09 (IH, dd, J=2.5, 12.5Hz, H-6b)、 4.17 (1H， dd, J=5, 12.5Hz, H- 6b)、
4.22 (IH, dd, J=3.5, 4.5Hz, H-2a)、 4.36 (IH, d, J=4.5Hz， H- 3a)、 4.43 (IH, m, H- 5a)、
4.45 (IH, d, J=l.5Hz, H-4a)、 4.57 (1H， d, J=7.5Hz， H - lb)、
4.90 (1H， dd, J=7.5， 10Hz, H - 2b)、 4.99 (1H， t， J=10Hz, H- 3b)、 5.14 (IH, t, J=10Hz, H - 4b)、 5.34(lH,d， J=3, 5Hz,H—la)
ただし、 サンプルは重クロ口ホルムに溶解し、 クロ口ホルムのプロ トンの化学 シフト値を 7. 24 p pmとして表した。 図 5は化合物 （1 2) の1 H— NMR スぺク トルを示す図である。 図 5において、 横軸は化学シフト値（p pm)、 縦軸 はシグナルの強度を示す。
( i i ) 4—O— ]3—D—ダルコビラノシルー 1， 2—0—イソプロピリデン
—3， 6—アンヒドロー D—ガラクトース （4一 0 -3— D - glucopyranosyl— 1，2 - 0~ isopropylidene-3, o-annydro-D-galactose) [ィ匕合物 (13) ]
化合物 （12) 23 Omgをメタノール 5m 1に溶解し、 0. 1 Nナトリウム メトキシド /メタノール溶液 1. 5m lを添加し、 室温で 30分間撹拌した。 こ の反応液をク口口ホルム：メタノール == 5： 1を展開溶媒とした薄層クロマトグ ラフィ一に供じると、 R O. 3付近に目的の生成物を検出した。 反応液を炭 酸ガスで中和し、 減圧濃縮後、 クロ口ホルム ：メタノール =5 ： 1を展開溶媒と したシリカゲルクロマトグラフィーにより化合物 （1 3) 90mgを得た。
( i i i ) 化合物 （1 1)
水 4m lに化合物 （1 3) 90mgを溶解し、 0. 1 N硫酸溶液 2m lを添加 し、 95 °Cにて 2時間攪拌した。 この反応液をブタノール：エタノ一ル：水 = 5 : 5 : 1を展開溶媒とした薄層クロマトグラフィーに供じると、 Rf値 0. 5 付近に目的の生成物を検出した。 反応液を炭酸バリウムで中和し、 沈殿を除去後、 水溶液を凍結乾燥し、 化合物 （1 1) 64mgを得た。 化合物 （1 1) を核磁気 共鳴（NMR)スペク トル（ J NM— A500 (日本電子社製））、 質量スペク トル
(MS)((DX302)質量分析計（日本電子社製)）により構造解析した。
1 H-NMR
S3.18(1H, dd,J=8,9Hz,H- 2b)、 3· 27 (1H， t, J=9Hz， H— 3b)、 3.39(2H,m)、
3.52 (1H， dd, J=3.5, 6Hz, H - 2a)、 3.60 (IH, dd, J=6.5, 12.5Hz, H- 6b)、 .73 (1H, dd, J=2.5, lOHz, H-6a)、 3.82 (1H, dd, J=2.5， 12.5Hz, H- 6b)、
3.88 (1H， dd, J=4.5, lOHz, H— 6a)、 3.95 (1H， dd, J=3.5， 5Hz, H-3a)、
.16 (1H, dd, J=2.5, 5Hz, H-4a)、 4.35 (1H， dt, J=2.5, 4.5Hz, H— 5a)、
4.45 (1H, d， J=8Hz, H— lb)、 4.89 (1H, d, J=6Hz, H-la)
ただし、 サンプルは重水に溶解し、 HODの化学シフト値を 4. 65 p pmと して表した。 図 6は化合物 （1 1) の1 H— NMRスぺク トルを示す図である。 図 6において、 横軸は化学シフト値（P pm)、 縦軸はシグナルの強度を示す。 なお、 1 H _ NM Rにおけるピークの帰属は下記式 Xのとおりである。
Figure imgf000027_0001
(X)
FAB-MS
m/z 325 (M+H) + グリセロールをマトリツグスに用いた。
(6) 4— O— ]3—マルトトリオシル一 3， 6—アンヒ ドロ一 D—ガラクト一 ス （4- 0- - maltotoriosyl- 3, 6- anhydro_D- galactose) [化合物 （14) ]
( i ) 4-0- (ドデカー O—ァセチルマルトトリオシル） —1， 2— O—ィ ソプロピリデン _3， 6—アンヒドロー D—ガラク トース （4 - 0~(dodeca - 0- acetylmaltotoriosyl) -1, 2 - 0-isopropylidene- 3， o - anhydro-D - galactose) [ィヒ 合物 (1 5) ]
化合物 （6) 5. 1 g (4. 75mmo l ) 、 化合物 （ 3 ) 96 Omg (4. 75 mm o 1 ) にアルゴン雰囲気下、 ジクロロメタン 30m lを添加し、 氷/食 塩で一 20°Cに氷冷した。 ここに、 CF3 S03 S i (CH3) 320 Om 1 (0. 95mmo 1 )ノ21!11ジクロロメタンを徐々に添カ卩し、 一 20°Cで 1. 5時間 撹拌した。 反応液に飽和重曹水、 酢酸ェチルを添加した後、 有機層を回収した。 この有機層をへキサン：酢酸ェチル = 1 ： 2を展開溶媒とした薄層クロマトダラ フィ一に供じると、 1¾ ^直0. 4付近に目的の生成物を検出した。 さらに、 有機 層を無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、 減圧濃縮し、 へキサン：酢酸ェチル = 2： 1を展開溶媒としたシリカクロマトにより、 化合物 （1 5) 936mgを得 た。
( i i ) 1， 2—0—イソプロピリデン一 4— O—マルト トリオシル一3， 6 —アンヒ ドロ一 D—ガラク トース (1， 2 - 0— isopropylidene— 4 - O~maltotoriosyl -
3， 6— anhydro_D- galactose) [化合物 （1 6) ]
化合物 （15) 936mgをメタノール 45m 1に溶解し、 0. 1 Nナトリウ ムメトキシド メタノール溶液 4. 5 m 1を添加し、 室温で 1時間撹拌した。 こ の反応液をクロ口ホルム：メタノール =1 ： 1を展開溶媒とした薄層クロマトに 供じると、 R f値 0. 5付近に目的の生成物を検出した。 反応液を炭酸ガスで中 和し、 減圧濃縮後、 クロ口ホルム：メタノール =1 ： 1を展開溶媒としたシリカ ゲルクロマトグラフィーにより化合物 （16) 457mgを得た。
( i i i) 化合物 (14)
0. 02N硫酸溶液 1 5m 1に化合物 （1 6) 457mgを溶解し、 95°Cに て 2時間攪拌した。 この反応液をプタノール：エタノール：水 = 5： 5 ： 1を展 開溶媒とした薄層クロマトグラフィーに供じると、 R O. 5付近に目的の生 成物を検出した。 反応液を炭酸バリウムで中和し、 沈殿を除去後、 水溶液を凍結 乾燥し、 化合物 （14) 390mgを得た。
化合物 （14) を核磁気共鳴（NMR)スぺク トル（ J NM— A500 (日本電子 社製)）、 質量スぺク トル (MS) (DX 302)質量分析計（日本電子社製)）により 構造解析した。
1 H-NMR
S 3.22 (1H， dd, J=8, 9.5Hz, H- 2b)、 3.30 (IH, t, J=9.5Hz, H - 3b)、
3.46 (IH, dd, J=4， 10Hz, H_2c)、 3.50 (IH, dd, J=4, 10Hz, H-2d)、 3.5〜3.75 (14H, m)、 3.83 (3H, ra)、 3.88 (IH, dd, J=5, 10.5Hz, H-6a)、 3.94 (1H， dd, J=2.5， 5Hz, H - 4a)、
4.16 (IH, dd, J=2.5， 5Hz, H-5a)、 4.46 (IH, d, J=8Hz, H-lb)、 4.46 (1H， d, J=6.5Hz, H - la), 5.27(2H,d, J=4Hz，H - Id, lc)
ただし、 サンプルは重水に溶解し、 HODの化学シフト値を 4. 65 p pmと して表した。 図 7は化合物 （14) の1 H— NMRスぺク トルを示す図である。 図 7において、 横軸は化学シフト値（p pm)、 縦軸はシグナルの強度を示す。 なお、 1 H— NMRにおけるピークの帰属は下記式 X Iのとおりである。
Figure imgf000029_0001
14
(X I) FAB-MS
m/z 649 (M+H) + グリセロールをマトリックスに用いた。
(7) 4— O—ベンジル一 3， 6—アンヒ ドロ一 D—ガラクトース （4-0- benzyl-3, 6-anhydro-D-galactose) [ィ匕合物 (1 7) ]
( i ) 4— O—ベンジノレ一 1， 2— O—イソプロピリデン一 3， 6—アンヒ ド 口一 D—ガラク卜ース (4-0-benzyl-l, 2-0-isopropylidene-3, 6-anhydro-D- galactose) [化合物 (18) ]
化合物 （3) 20 Omg (1 mmo 1 ) にアルゴン雰囲気下、 ジクロロメタン 10mlを添加し氷/食塩で一 20°Cに氷冷した。 ここに、 ベンジル一 2， 2, 2 - トリクロロアセトイミデート（東京化成： B 1483) 28 Oml (1. 5 mmo 1 ) 、 CF3 S03 S i (CH3) 336 m 1 (0. 2 mmo 1 ) Z 2 m 1ジクロロ メタンを徐々に添加し、 ー20°じで1. 5時間撹拌した。 反応液に飽和重曹水、 酢酸ェチルを添加した後、 有機層を回収した。 この有機層をへキサン：酢酸ェチ ル =6 ： 1を展開溶媒とした薄層クロマトグラフィーに供じると、 R f値 0. 2 付近に目的の生成物を検出した。 さらに、 有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥 した後、 減圧濃縮しへキサン：酢酸ェチル = 6 ： 1を展開溶媒とたシリカゲルク 口マトグラフィ一により、 ィ匕合物 （1 8) 87mgを得た。 化合物 （18) を核 磁気共鳴（NMR)スぺク トルにより構 ?析した。
1 H-NMR 340
28 δ 1.34(3H， s,Me)、 1.52(3H, s, Me)、 4.1 (2H, m, H - 6)、 4.33 (1H， dd, J=3， 4.5Hz, H— 2)、 4.35 (1H, d, J=3Hz, H-4)、 4.38 (1H, m, H - 5)、 4.54 (1H, d, J=4.5Hz, H - 3)、
4.57aH，d， J=12Hz，一 C — )、 4.65 (1H, d, J=12Hz，— C 一）、 5.43 (1H, d, J=3Hz，， H - 1)、 7.32 (5H, m, Ph)
ただし、 サンプルは重クロ口ホルムに溶解し、 クロ口ホルムのプロトンの化学 シフト値を 7. 24 p pmとして表した。
図 8は化合物 （18) の1 H— NMRスぺク トルを示す図である。 図 8におい て、 横軸は化学シフト値（p pm)、 縦軸はシグナルの強度を示す。
( i i) 化合物 （1 7)
化合物（18) 8 Omgをジクロロメタン 3 Om 1に溶解し、 トリフルォロ酢酸 Z水 (3. 8m l /0. 2m l ) を添加し、 室温で 3時間攪拌した。 反応液を酢 酸ェチル 300 m 1で希釈し重曹水で洗浄した。 有機層を減圧濃縮し、 クロロホ ルム：メタノール =25 ： 1を展開溶媒とたシリカゲルクロマトグラフィーによ り下記式 X I Iで表される化合物 （1 7) 52m gを得た。 化合物 （1 7) を核 磁気共鳴（NMR)スぺクトル（J NM-A500 (日本電子社製)）、 質量スぺクト ル (M S ) ( (D X 302 )質量分析計（日本電子社製)）により構 ?析した。
O-f .
(X I I)
1 H-NMR
化合物 （1 7) を重クロ口ホルムに溶解し、 核磁気共鳴による構造解析を行つ た。 図 9は、 化合物 （1 7) の1 H— NMRを示す図である。 図 9において、 横 軸は化学シフト値 （p pm) 、 縦軸はシグナルの強度を示す。
その結果、 この物質は 3， 6—アンヒドロ一 D—ガラク トースが重クロ口ホル ム中で、 1位アルデヒドがへミアセータール結合（ひ， J3)との平衡関係にあるた めに、 シグナルの帰属は不可能であった。 し力 し、 化合物 （18) の 1， 2— O 一^ f ソプロピリデン由来のシグナル （図 8中、 δ ΐ. 34 p pm、 1. 52 p D mのシグナル） の消失および、 アルデヒド由来のシグナル （図 9中、 δ 9. 65 p pmのシグナル） の生成は確認された。
F AB-MS
m/z 253 (M+H) + グリセロールをマトリックスに用いた。
(8) 4— O—ァセチル一 3， 6—アンヒドロー D—ガラクトース （4 - 0~ acetyl- 3, 6 - anhydro- D - galactose [化合物 (1 9) ]
( i ) 4— O—ァセチルー 1， 2— O— ^ f ソピリデンー 3， 6—アンヒドロ一 D—フ> /フク 卜一ス 4 - 0~acetyl - 1， 2- 0 - isopylidene - 3， 6 - anhydro_D- galactose) [化合物 20]
化合物 （3) 20 Omg (1 mmo 1 ) 、 無水酢酸 (ナカライテスタ ： Co d e . 042-24) 1 13ml (1. 21^110 1) ぉょび4- Dimethylaminopyridine (ナカライテスク ： C o d e . 129— 22) 24 m g (0. 2mmo 1 ) をジクロロメタン 10m 1に溶解し、 氷冷後、 トリェチルァ ミン （ナカライテク ： C o d e . 348-05) 166ml (1. 2 mmo 1 ) を添加し、 室温で 1時間攪拌した。
反応液を濃縮後、 へキサン：酢酸ェチル =2 ： 1を展開溶媒とたシリカクロマ トにより化合物 （20) 21 Omgを得た。 化合物 （20) の構造解析を、 核磁 気共鳴 （NMR) スペク トル （JNM— A500 (日本電子社製） ) により行つ た。
1 H-NMR
dl.30 (3H, s,Me) 1.54(3H, s,Me), 2· 02 (3H， s, Ac)、 3.93 (1H, dd, J=3.5, 10Hz, H- 6)、 4.05 (1H, d, J=10Hz, H— 6)、 4.24 (1H， dd, J=3， 5Hz, H— 2)、 4.37 (1H， m, H— 5)、
4.48 (1H, d, J=5Hz, H-3)、 5.38 (1H, d, J=3Hz, H - 1)、 5.40 (1H， d, J=l.5Hz, H— 4) 伹、 サンプルは重クロ口ホルムに溶解し、 残留クロロホノレムのプロトンの化学 シフト値を 7. 24 p pmとして表した。
図 10に、 化合物 （20) の1 H— NMRスぺクトルを示す。 図 10において、 横軸は化学シフト値 （p pm) 、 縦軸はシグナルの強度を示す。
( i i) 化合物 （19)
化合物 （8) 20 Omgを 70%酢酸水溶液 1 5m 1に溶解し、 95°C、 2時間 攪拌した。 反応液を減圧濃縮し、 クロ口ホルム：メタノール = 1 7 ： 1を展開溶 媒としたシリカクロマトにより化合物 (7) l O Omgを得た。 ィ匕合物 (20) を核磁気共鳴 （NMR) スぺク トル（ J NM— A 500 (日本電子社製)）、 質量ス ぺクトル (MS) ( (DX 3 0 2) 質量分析計 （日本電子社製） ) により構 ?析 した。
1 H-NMR
d2.03 (3H, s, Ac)、 3.59 (IH, dd, J=4， 6.5Hz, H- 2)、 3.82 (1H， dd, J=l.5,画 z, H-6)、
3.87 (IH, dd, J=4， lOHz)、 3.99 (IH, dt, J=4Hz, H - 3)、 4.27 (IH, ddt, J=l.5, 4Hz)、
4.89 (1H， d， J=6.5Hz， H - 1)、 5.01 (IH, d, J=4Hz, H— 4)
但し、 サンプルは重水に溶解し、 HODの化学シフト値を 4. 6 5 p pmとし - し/こ。
図 1 1に、 化合物 （1 9) の1 H— NMRスぺク トルを示す。 図 1 1において、 横軸は化学シフト値 （p p m) 、 縦軸はシグナルの強度を示す。
なお、 1 H— NMRにおけるピークの帰属は下記式 X I I Iのとおりである。
Figure imgf000032_0001
FAB-MS
m/z 20 5 (M+H) + グリセロールをマトリックスに用いた。
(9) 4—0—ペンチル一 3， 6—アンヒ ドロー D—ガラク トース （4一 0 - hexyl-3, 6- anhydro - D- galactose) [化合物 (2 1 ) ]
( i ) 4— O—ペンチルー 1， 2— O ソピリデン一 3， 6—アンヒ ドロー Ό—フ Jフクトース (,4-0-pentyl-l, 2—0— isopyliaene— 3, 6— anhydro - D— galactose) [化合物 (2 2) ]
化合物 （3) 20 Omg (1 mmo 1 ) をジメチルホルムアミド 4 m 1に溶解 し、 氷冷下、 水素化ナトリウム （ナカライテスク ： C o d e . 04 2- 24) 3 Omg (1. 2 mmo 1 ) を加え室温で 3 0分攪拌した。 氷冷下、 ヨウ化ペンタ ン （東京化成： 1 0066) 26 Oral (2mmo 1 ) を 1時間攪拌した。
反応液を洗浄、 濃縮した後、 へキサン：酢酸ェチル =8： 1を展開溶媒とたシ リカクロマトにより化合物 （22) 270mgを得た。 化合物 （22) の構 军 析を、 核磁気共鳴 （NMR) スぺク トル （J NM—A500 (ョ本電子社製） ) により行った。
1 H-NMR
d0.87(3H，m，H - 11)、 1.29 (4H， m, H— 9， 10)、 1.33 (3H, s, Me) , 1.56 (2H， m， H - 8)、 1.56 (3H, s,Me), 3.50 (2H， m, H - 7)、 3· 98 (1H, dd, J=3, 10Hz， H - 6)、
4.02(lH,d, J=10Hz,H— 6)、 4.28(1H， dd, J=3, 5Hz， H— 2)、 4.36 (1H, m, H— 5)、
4.46 (1H， d， J=5Hz, H— 3)、 5.41 (1H， d, J=3Hz, H-l)
但し、 サンプルは重クロ口ホルムに溶解し、 残留クロ口ホルムのプロ トンの化 学シフト値を 7. 24 p pmとして表した。
図 12に、 化合物 （22) の1 H— NMRスぺク トルを示す。 図 12において、 横軸は化学シフト値 （p pm) 、 縦軸はシグナルの強度を示す。
( i i) 化合物 (21)
化合物 （22) 27 Omgをジクロロメタン 3 Om 1に溶解し、 トリフルォロ 酢酸/水 （2. 85m l /0. 1 5m l ) を添カ卩し、 室温 3時間攪拌した。 反応 液を酢酸ヱチル 30 Om 1で希釈し重曹水で洗浄した。 有機層を減圧濃縮し、 ク ロロホルム：メタノール =25： 1を展開溶媒としたシリカクロマトにより化合 物 （21) 10 Omgを得た。 化合物 （21) を質量スペク トル (MS) ( (DX 302) 質量分析計 （0本電子社製） ） により構 ^^祈した。 化合物 （21) の 化学式を下記式 X I Vに示す。
(XI )
Figure imgf000033_0001
FAB-MS
m/z 233 (M + H) + グリセロールをマトリックスに用いた。 実施例 2
実施例 1で合成した化合物 （7) 、 化合物 (9) をそれぞれ最終濃度 1 0 mM となるように、 1 0%子ゥシ血清入り RPM I 1 640培地に溶解した。 これら のサンプルを 3 7°C、 4時間静置後、 1 m 1をクロ口ホルム：メタノ一ル= 5 ：
1を展開溶媒とした薄層クロマトグラフィ一に供し、 オルシノール硫酸で検出し た。
その結果、 いずれのサンプルからも一般式 I Vで表される化合物の Zが CH2 OHであって、 Yが Hである化合物 （L—グリセロー 1， 5—エポキシ一 1ひ /3， 6—ジヒドロキシ一シス一へキサ _ 3—ェン一 2—オン：以下、 DGEと称す） と同一の R f値（=0. 5)にスポットが検出された。
また、 実施例 1で合成した化合物 (2) 、 化合物 （1 1) 、 化合物 （1 4) 、 化合物 （1 7) についても DGEへの変換が見られた。 実施例 3
5 6°C、 30分間処理した牛胎児血清 （ J RHバイオサイエンス社製） を 1 0%含む RPM I 1 64 0培地 （ギブコ社製） にて 3 7°Cで培養したヒト前骨髄 性白血病細胞 HL— 60 (ATCC CCL- 240) を同培地で 5000個/ 90 // 1となるように懸濁した。 この懸濁液を 9 6穴プレート （ファルコン社 製） に 90 μ 1ずつ分注し、 それぞれの懸濁液に対して、 実施例 1で得た化合物 (2) の 200 mM水溶液、 化合物 （ 7 ) の 5 0 mM水溶液、 化合物 （ 9 ) の 5 0 mM水溶液、 化合物 .（ 1 1 ) の 1 0 0 mM水溶液、 化合物 （1 4) の 1 00 m M水溶液、 化合物 （1 7) の 20 mM水溶液、 化合物 （ 1 9 ) の 1 2. 5 mM水 溶液、 化合物 （2 1 ) の 1 2. 5mM水溶液をろ過滅菌し、 滅菌水で 2倍、 4倍、 8倍、 1 6倍、 3 2倍、 64倍及び 1 28倍希釈した希釈液及び水をそれぞれ 1
0 μ 1ずつ添加し、 3 7°C、 5%炭酸ガス存在下で培養し、 培養開始後 4 8時間 後に 「アポトーシス実験プロトコ一ノレ」 〔秀潤社、 田沼靖ー監修、 第 1 5 6頁 (1 9 94) 〕 に従って MTT法により測定した吸光度から生細胞数を比較した。 この結果、化合物 （2) 、 （7) 、 （9) 、 （1 1) 、 （1 4) 、 （1 7) 、 (1 9) および （21) はヒト前骨髄性白血病細胞 HL— 60細胞に対して増殖 抑制活性を示した。 さらに、 この結果をもとに、 50%の増殖抑制を示す濃度 (I C0) を算出し表 1に表した。
I C50 ( μ Μ)
化合物 (2) 860
化合物 (7) 104, 18
化合物 (9) 1 12. 72
化合物 (1 1) 145, 55
化合物 (14) 1 13, 32
化合物 (1 7) 204 62
化合物 (1 9) 320
化合物 （21) 160
実施例 4
56 °C、 30分間処理したゥシ胎児血清 ( J R H社製） を 10 %含む R P M I 1640培地 （バイオゥイツタカ一社製） にて 37°Cで培養した HL-60 (A TCC CCL— 240) を RPM I 1640培地にて 2. 5 X 105個ノ4.
5m 1となるように懸濁した。
この懸濁液 4. 5m lに対し、 10、 50、 100 mMの化合物 （2) 、 500、 1000、 1 500 / Mの化合物 (7) 、 750、 1500、 3000 Mの化 合物 （9) 、 750、 1 500、 3000 / Mの化合物 （1 1) 、 750、 1 5 00、 3000 /Mの化合物 （14) 水溶液を 50 Oml '添加し、 37°C、 5% 二酸化炭素存在下で、 24時間培養した。
培養細胞を光学顕微鏡下で観察し、 化合物 （2) は、 最終濃度 5mM、 化合物 (7) は、 最終濃度 100 / M、 化合物 （9) は、 最終濃度 150μΜ、 化合物 (1 1) は、 最終濃度 150 μ Μ、 化合物 （14) は、 最終濃度 1 50 /ζ Μ以上 の添加培養細胞に核の凝縮、 細胞の縮小、 アポトーシス小体の形成をそれぞれ確 認した。 なお、 対照の生理食塩水 50 Oml添加培養細胞においてはこれらの現 象は認められなかった。
つ！/ヽで、 上記と同様の方法で 24時間と 48時間培養した細胞を用い、 細胞ェ 学別冊実験プロトコールシリーズアポトーシス実験プロトコール （秀潤社） 12
9- 130ページ記載の方法で F AC S c a nを用いたアポトーシス細胞の測定、 バイオマニュアル UPシリーズ 最新アポトーシス実験法 （羊土社） 61-63 ページ記載の方法で DN Aの断片化の解析を行った。 その結果、 化合物 （2) は、 最終濃度 5mM、 24時間で、 化合物 (7) は、 最終濃度100/xM、 ィ匕合物 (9) は、 最終濃度 1 50 /M、 化合物 （1 1) は、 最終濃度 1 50 /M、 化合 物 （14) は、 最終濃度 1 50 //M以上の添加培養細胞にアポトーシス細胞を、 化合物 （2) は、 最終濃度 5mM、 24時間、 最終濃度 1 mM、 48時間、 化合 物 （7) は、 最終濃度 100 μΜ、 化合物 (9) は、 最終濃度 1 50 / Μ、 24 時間、 化合物 （1 1) は、 最終濃度 1 5 ΟμΜ、 化合物 （14) は、 最終濃度 7 5 以上の添加培養細胞に DN Αの断片化を確認した。 なお、 対照の生理食塩 水 50 Om 1添加培養細胞においてはこれらの現象は認められなかった。 実施例 5
実施例 4と同様の方法で 24、 48時間培養した細胞を一部サンプリングし、 0. 4 %トリパンブルーで染色後、 光学顕微鏡で観察し、 染色されていなレ、生細 胞と青く染色された死細胞の細胞数の測定を行い、 生残率が 50%になる化合物
(2) 、 (7) 、 （9) 、 （1 1) および （14) の濃度 （生残率 5。 (mM) ) をもとめた。 その結果を表 2に示す。 表 2
24時間 48時間
化合物 （2) 18130 3400
化合物 (7) 122.96 101.19
化合物 (9) 17247.65 189.06
化合物 (1 1 ) 1264.18 152.43
化合物 (1 4) 550.85 150.47
以上のように、 24時間と 4 8時間で生残率 5。に大きく差が出る化合物と差が でない化合物があるが、 これは R基が脱離しアンヒドロガラクトースの 3位と 4 位の間に不飽和結合を導入する速度あるいは吸収速度など活性発現までの時間を 反映しており、 結果が示すように Rを変化させることにより生理活性の発現時期 もコントロールすることができる。 さらに、 4 8時間での生残率 5。は、 最終的な 生理活性の強さを示していると考えられ、 同様に Rを変化させることにより生理 活性の発現強さもコント口ールすることができる。 実施例 6
1 0%ゥシ胎児血清 （ギブコ社製） 含有、 フエノールレッド不含、 2mM L —グルタミン （ライフテックオリエンタル社製、 C o d e . 2 50 3 0 - 1 4 9) 含有ダルベッコ改良イーグル培地 （バイオウイタカ一社製、 1 2 - 9 1 7 F) に RAW2 64. 7細胞 （ATCC T I B 7 1 ) を 3 X 1 05個 m 1 になるように懸濁し、 4 8穴マイクロタイタープレートのゥエルに 5 0 0 μ 1ず つ加えて 5 %炭酸ガス存在下、 3 7 で 1 2時間培養した。
各ゥエルに 1 0 μ 1の 2 5 μ g/m 1 リポポリサッカライド （L P S、 シグマ 社製、 C o d e . L- 20 1 2) あるいは 1 0 // 1の 2. 5 // g //m l L P Sと 1 0 μ 1の 500U "mインターフェロン 0 ( I FN— γ、 コスモバイオ社販売、 Code. MG- I FN, G e n z y m e社製） を添加し、 さらに試料として、 1 0 μ ΐの 1. 2 5、 2. 5、 5. 0 mMの化合物 （2) 、 1. 2 5、 2. 5、 5. OmMの化合物 （7) 、 1. 25、 2. 5、 5. 0 mMの化合物 （9) 、 0. 6 25， 1. 25. 2. 5 mMの化合物 （1 1) 、 1. 25、 2. 5， 5. 0 mM の化合物 （1 4) 、 1. 25、 2. 5、 5. 0 mMの化合物 （1 7) 、 1. 25、 2. 5、 5. 0 mMの化合物 （1 9) 、 1. 25、 2. 5、 5. 0 mMの化合物 (2 1) の水溶液を添加して、 さらに 1 2時間培養した後、 NOが培地中で酸化 されることによって生ずる N02 濃度の測定を行った。 なお、 対照として LPS と I FN— γを加えない区分およひ 料を加えない区分を設定した。
上記培養後、 1 00 μ 1の培地に 1 00 /X 1の 4 %ダリース試薬 （シグマ社製、 Co d e. G44 10) を加え、 室温で 1 5分間放匱した後、 490 nmにおけ る吸光度を測定した。
上記培地に溶解した既知の濃度の N a N02で作製した検量線から培地中の N 02 -濃度を計算した。 測定はすべて 3連で行った。
この結果、 化合物 （2) は最終濃度 25 / Μ、 化合物 （7) は最終濃度 25 μ Μ、 化合物 (9) は最終濃度 50 μΜ、 化合物 （1 1) は最終濃度 25 μ Μ、 化 合物 （14) は最終濃度 2 5 μΜ、 化合物 （1 7) は最終濃度 50 μΜ、 化合物 (1 9) は最終濃度 25 μ Μ、 化合物 （2 1) は最終濃度 25 μ Μで、 L P Sあ るいは LPSと I FN— γによる NO産生誘導を抑制した。
その結果を図 1 3〜20に示す。 すなわち、 図 1 3は化合物 （2) 、 図 14は 化合物 （7) 、 図 1 5は化合物 (9) 、 図 1 6は化合物 （1 1) 、 図 1 7は化合 物 （ 1 4) 、 図 1 8は化合物 （1 7) 、 図 1 9は化合物 （1 9) 、 図 20は化合 物 （21) をそれぞれ添加して培養した時の培地中の N02 濃度を示す図である。 図 1 3〜20において、 横軸は培養条件を、 縦軸は N02-濃度 （μΜ) を示す。 実施例 7
1 0%ゥシ胎児血清含有ダルベッコ改良イーグル培地 （バイオウイタカ一社製、
Co d e. 1 2— 604 F) に RAW264. 7細胞を 3 X 1 05個/ m 1にな るように懸濁し、 48穴マイクロタイタープレートのゥエルに 500 1ずつカロ えて 5%炭酸ガス存在下、 3 7 °Cで 6時間培養した。 実施例 1で調製した化合物 (7) 、 （14) 、 （1 7) をそれぞれ最終濃度が 50、 1 00、 1 00 μΜ となるように添加し、 さらに、 5時間培養した。 その後、 各ゥエルに 5 0 /z gノ m 1 リポポリサッカライド （L P S、 シグマ社製、 C o d e . L— 20 1 2) 水 溶液 1 Ο μ 1を添加して、 1 2時間培養した後プロスタグランジン Ε2の量を測 定した。 なお、 対照として L P Sを加えない区分及ぴ化合物 (7) 、 （1 4) 、 (1 7) を加えない区分を設定した。
上記培養後、 培養上清中のプロスタグランジン E2量をプロスタグランジン E2 E L I S A K I T (ネオジェン社製、 C o d e . 404 1 1 0) を用い測定し た。 測定は全て 3連で行った。
この結果、 化合物 （7) 、 （1 4) 、 （1 7) はいずれも L P Sによるプロス タグランジン E2産生誘導を抑制した。 その結果を、 図 2 1に示す。 すなわち、 図 2 1は各培養条件下で培養した時の培地中のプロスタグランジン E2濃度を示 す図である。 図 2 1において横軸は培養条件を、 縦軸はプロスタグランジン E2 濃度 （ngZml) を示す。 実施例 8
実施例 1記載の化合物 (7) をォリーブオイル （ナカライテスク社製） に 1 % になるように懸濁して化合物 （7) 1 %懸濁液を調製した。
d d yマウス （日本 S L C ; メス、 7週齢） に上記調製の化合物 （7) 1 %懸 濁液を 1日 1回、 1 5日間で 1 2回、 1 0または、 3 Om 1 Zk gの投与量で、 強制経口投与した。 なお、 対照として水道水を同様に強制経口投与した。 また、 各群 3匹ずつで行った。 この後、 腹腔内に 1 0%ゥシ胎児 清含有 RPM I 1 6 4 0培地 （バイオウイタカ一社製、 C o d e . 1 2— 70 2 F) を 4m l注入し、 よくマッサージした後ぬきとり 3匹分をまとめて腹腔細胞を得た。 1 0%ゥシ胎 児血清含有 R PM 1 1 640培地に腹腔細胞を 1 06個/1111となるように懸濁 し、 4 8穴マイクロタイタープレートに 5 0 0 μ 1ずつ加えて 5%炭酸ガス存在 下、 3 7°Cで 2時間培養し、 その後、 培養上清を除去して接着性細胞を得て腹腔 マクロファージとして用いた。 各ゥエルに新たに 1 0%ゥシ胎児血清含有、 フエ ノールレッド不含、 2 mM L -グルタミン含有ダルべッコ改良ィ一グル培地 (バイオウイタカ一社製、 C o d e . 1 2— 9 1 7 F) を 5 0 0 / 1ずつ加え、 1 0 μ 1の 5 μ g/m 1 リポポリサッカライド （LPS、 シグマ社製、 Co d e. L- 20 1 2) 、 200 OUZm 1インターフェロン γ ( I FNy コスモバイ ォ社販売、 Co d e. GZM-MG- I FN) 水溶液を添加して更に 1 2時間培 養した後、 NOが培地中で酸化されることによつて生ずる N 02—濃度の測定を実 施例 6記載の方法で行つた。 なお、 対照として L P S、 I FN7水溶液を加えな い区分を設定した。 また、 測定は全て 3連で行った。
この結果、 1 0または、 30mlZk gの化合物 （7) を経口投与したマウス より調製した腹腔マクロファージにおいて顕著な NO産生抑制が認められ、 寒天 オリゴ糖は自由飲水において、 強い NO産生抑制作用を示した。
その結果を図 22に示す。 すなわち、 図 2 2は各培養条件で培養したときの培 地中の N02_濃度を示す図であり、 横軸は培養条件を、 縦軸は N02-濃度 (μ Μ) を示す。 実施例 9
実施例 1記載の化合物 （7) をォリーブオイル （ナカライテスク社製） に 1% になるように懸濁して化合物 （7) 1 %懸濁液を調製した。
d d yマウス （日本 S LC ;メス、 7週齢） に上記調製の化合物 (7) 1 %懸 濁液を 1日 1回、 1 5 S間で 1 2回、 1 0または、 3 Om 1 Zk gの投与量で、 強制経口投与した。 なお、 対照として水道水を同様に強制経口投与した。 また、 各群 3匹ずつで行った。 この後、 腹腔内に 1 0 %ゥシ胎児血清含有 R PMI 1 6
40培地 （バイオウイタカ一社製、 C o d e. 1 2— 70 2 F) を 4m l注入し、 よくマッサージした後ぬきとり 3匹分をまとめて腹腔細胞を得た。 1 0%ゥシ胎 児血清含有 RPMI 1 640培地に腹腔細胞を 1 06個ノ m lとなるように懸濁 し、 48穴マイクロタイタープレートに 500 μ 1ずつ加えて 5%炭酸ガス存在 下、 3 7 °Cで 2時間培養し、 その後、 培養上清を除去して接着性細胞を得て腹腔 マクロファージとして用いた。 各ゥエルに新たに 10 %ゥシ胎児血清含有ダルべ ッコ改良イーグル培地 （バイオウイタカ一社製、 Co d e. 1 2— 604 F) を
500 ^ 1ずつ加え、 10 μ 1の 50 μ g/m 1 リポポリサッカライド （L P S、 シグマ社製、 C o d e. L-20 1 2) 水溶液を添加して更に 1 2時間培養した 後プロスタグランジン E2 (PGE2) の量を測定した。 なお、 対照として LP S を加えない区分を設定した。
上記培養後、 培養上清中のプロスタダランジン E2量をプロスタグランジン E2 EL I SA K I T (ネオジェン社製、 Co d e. 404 1 1 0) を用い測定し た。 また、 測定は全て 3連で行った。
この結果、 1 0または、 S Om l Zk gの化合物 (7) を経口投与したマウス より調製した腹腔マクロファージにおいて顕著な P G E2産生抑制が認められ、 寒天オリゴ糖は自由飲水において、 強い PGE2産生抑制作用を示した。
その結果を図 23に示す。 すなわち、 図 23は各培養条件で培養したときの培 地中の PGE2濃度を示す図であり、 横軸は培養条件を、 縦軸は PGE2濃度 （n g /m 1 ) を示す。 実施例 1 0
1 00 μΜヒドロキシゥレアを含む 1 0%ゥシ胎児血清 （ギブコ社製） 含有 R ΡΜ I 1 640培地 （バイオウイタカ一社製、 1 2— 702 F) に HL— 60細 胞 （ATCC CCL— 240) を 5 X 1 05個 m 1となるように懸濁し、 1 0 cmシャーレに 20m 1加えて 5%炭酸ガス存在下、 3 7°Cでー晚培養し、 細 胞を G 1期に停止させた。 この細胞を遠心分離により回収し、 再度 1 00 μΜヒ ドロキシゥレアを含む 1 0%ゥシ胎児血清 （ギブコ社製） 含有 RPMI 1 640 培地に 5 X 1 05個 Zm 1となるように懸濁し、 6穴マイクロタイタープレート の各ゥエルに 5 m 1ずつ加えた。 一方、 ヒドロキシゥレア未処理細胞として、 H L-60細胞を 1 0%ゥシ胎児血清 （ギブコ社製） 含有 RPM 1 1 640培地に 1 X 1 05個 Zm 1となるように懸濁し、 6穴マイクロタイタープレートの各ゥ エルに 5 m 1ずつ加えた。 ヒドロキシゥレア処理細胞区分のそれぞれのゥェルに 30、 22. 5、 1 5、 7. 5 mMの D G E水溶液 50 μ 1、 あるいは、 60、
45、 30、 1 5mMの化合物 （7) ジメチルスルホキシド溶液 25 μ 1、 1 0 0、 75、 50、 25 mMの化合物 （1 7) ジメチルスルホキシド溶液 25 μ \ を添加し、 また、 ヒドロキシゥレア未処理細胞区分のそれぞれのゥエルに 8、 6、 4、 2mMの DGE水溶液 50 ju し 30、 22. 5、 1 5、 7. 5 mMの化合 W 00 3407
40 物 （7) ジメチルスルホキシド溶液 2 5 μ 1、 80、 6 0、 40、 20 mMの化 合物 （1 7) ジメチルスルホキシド溶液 2 5 μ 1を添加して、 さらに 4 8時間培 養した。 その後、 培養液を回収し遠心分離により細胞を集め、 5m lの新しい 1 0 %ゥシ胎児血清 （ギブコ社製） 含有 R P M I 1 640培地に懸濁し、 そのうち 1 0 0 1を用いてプレミックス WS Τ— 1セノレプロリファレーシヨンアツセィ システム （宝酒造社製、 ΜΚ400) により生細胞数を測定した。
この結果、 ヒドロキシゥレア処理した細胞に対する 50%増殖阻害濃度 （I C 50) はどのサンプルにおいても未処理の細胞と比較して高くなつていた。 その結 果を表 3に示す。 すなわち、 表 3は各サンプルとその I C50 (μΜ) をまとめた 表である。 このことより、 DGE及びその前駆体である化合物 （7) および化合 物 （1 7) のような化合物 （R— Ah G a 1化合物と称する） は、 G 1期にァレ ストしている細胞に対しては毒性が低いことが明らかになった。 つまり、 生体に おいては、 ほとんどの細胞が G 1期にァレストした状態であると考えられること から、 DGE及びその前駆体である R— AhG a 1化合物は、 生体に対して毒性 の少ない薬剤であると考えられる。 表 3 ヒ ドロキシゥレア処理細胞 ヒドロキシゥレア未処理細胞
(μ m) (μ m)
DGE 1 0 1. 2 4 9. 5
化合物 （ 7 ) 1 5 0. 6 7 9. 1
化合物 （1 7) 264. 5 1 8 9. 8
実施例 1 1
( 1) ガスクロマトグラフィーによる DGE検出条件の確立
DGE (2mg) 及ぴ內部標品である 2- Deoxy- glucose (ナカライテスク ： C o d e . 1 0 7 - 2 2) ( 2 m g ) を 200 μ 1の水に溶解し、 3当量の N a B H4を添加して、 室温にて 4時間還元した。 反応液を無水酢酸で中和、 濃縮乾固 した後、 ピリジン （1ml ) 、 無水酢酸 （1m l) と 4ージメチルァミノピリジ ンを加えて、 超音波をかけながら 1時間ァセチル化反応を行った。 反応液をクロ 口ホルム （2m l ) で希釈し、 氷冷しながら飽和炭酸水素ナトリウム溶液を加え て反応を止めた。 有機層を冷水で数回洗浄して、 無水硫酸マグネシウムで乾燥し てから、 濃縮乾固した。 得られた反応物 （アルジトールアセテート体） をァセト ンに溶解してガスクロマトグラフィ一により以下の条件で分析した。
機種 ： shimadzu-17A (島津製作所)
カラム： Ultra 2 Capillary Colu腿（0.32mmX25m) (Hewlett-Packard)
温度 ： 160→220°C、 3 °C /分
検出 ： FID
その結果、 DGEは 1 5. 443分に、 2- Deoxy-glucoseは 20. 456分に 検出された。 その結果を図 24に示す。 すなわち図 24はガスクロマトグラフィ 一の結果を示す図であり、 縦軸は検出強度 （mV) 横軸は保持時間 （分） を示す。
(2) 検量線の作成
DGEの高純度精製品 （0. 5， 2. 5， 1 2. 5， 62. 5， 31 2. 5 μ g) に内部標品である 2- Deoxy- glucose (それぞれ 20， 20， 200， 200， 200 // g) を混合し、 培地 （ΙΟΟμ 1) に溶かしたのち、 4. 0当量の NaBH 4 (予備実験では 3. 0〜10当量には差異がないことを確認） を用いて、 室温 にて 4時間還元した。 以降、 各サンプルについて上記と同様の操作を行い、 アル ジトールアセテート体化した後、 ガスクロマトにより上記と同様の条件で分析し た。 得られたガスクロマトグラフィ一の結果から、 D G Eと内部標品の面積比、 及び対応する DGEと内部標品の重量比により検量線を作成した。 その結果を図 25に示す。 すなわち、 図 25は DGEと内部標品の面積比と、 対応する DGE と内部標品の重量比の検量線を示す図であり、 縦軸は DG Eと内部標品の面積比、 横軸は DG Eと内部標品の重量比を示す。
(3) 各化合物から培地中に生じる DGEの定量
化合物 （2) (◊) 、 (7) (X) 、 （1 1) (▲) 、 （14) (謹） 、 (17) (拿） 、 （19) (*) 、 （21) ( I ) 、 およびァガロビオース (♦) ：!〜 3 m gをそれぞれ 1 m 1の培地に溶解したのち、 37 °Cにインキュべ ートして、 経時的に （4、 8、 12、 24、 48時間） 培地を 200 μ 1ずつ採 取した。 採取した直後に上記と同様の操作を行い、 得られたアルジトールァセテ ―ト体をガスクロマトグラフィ一により上記と同様の条件で分析した。 得られた 結果から D G Εと内部標品の面積比により検量線から D G Εの量を算出した。 この結果より得られた各化合物からの DGEへの変換率の時間経過を図 26に 示す。 すなわち、 図 26は各化合物から DGEへの変換率の時間経過を示す図で あり、 縦軸は DGEの生成率 （％) 、 横軸はインキュベーション時間 （時間） を 示す。 実施例 12
10%ゥシ胎児血清 （ギブコ社製） 含有、 ダルベッコ改良ィーグノ 地 （バイ ォウイタカ一社製、 12- 604 F) に RAW264. 7細胞 （ATCC Τ I Β 71) を 3 X 105個 Zm 1になるように懸濁し、 48穴マイクロタイタ 一プレートのゥエルに 0. 5 m 1ずつ加えて 5 %炭酸ガス存在下、 37°Cでー晚 培養した。 各ゥエルに 5 μ 1の 10mM 化合物 （14) 水溶液あるいは 1 μ 1 の 25 mM 化合物 (7) 、 50 mM 化合物 （1 7) ジメチルスルホキシド溶 液を添加して、 さらに 5時間培養したのち、 5 / 1の 100 gZm 1 リポポリ サッカライド （LPS、 シグマ社製、 L-2012) 水溶液を添加して 18時間 培養し、 培養上清を回収した。 培養上清中のインターロイキン 10 (I L—1 0) の含量はェンザィムィムノサンドイッチアツセィ （EL I SA ; Mo u s e
I L一 10 EL I SA K i t, エンドジェン社製） で測定した。 なお、 対照 として試料、 LPS水溶液を加えない区分を設定した。 また、 測定は全て 2連で 行った。
この結果、 化合物 （14) 、 化合物 （7) 、 化合物 （1 7) 添加のいずれの区 分においても、 LPS誘導 I L—10産生の抑制が認められた。 その結果を図 2 7に示す。 すなわち、 図 27は各培養条件で培養したときの培養上清中の I L— 10の濃度を示す図であり、 横軸は培養条件を、 縦軸は I L一 10濃度 （p m l) を示す。
また、 これらの化合物について、 1 2— O—テトラデカノィルホルボール 13 一アセテート （TPA) 誘導インターロイキン 6に与える影響について実験を行 なったところ、 TP A誘導 I L-6産生の抑制が認められた。 実施例 13
10%ゥシ胎児血清 （ギブコ社製） 含有、 ダルベッコ改良イーグル培地 （バイ ォウイタカ一社製、 12— 604 F) に RAW264. 7細胞 （ATCC T I B 71) を 3 X 105個 1になるように懸濁し、 6穴マイクロタイター プレートのゥエルに 5 m 1ずつ加えて 5%炭酸ガス存在下、 37。Cでー晚培養し た。 各ゥヱルに 50 μ 1の 1 OmMあるいは 5mM 化合物 （1 1) 、 化合物 (14) 水溶液または 5 μ 1の 5 OmMあるいは 25mM 化合物 （7) または
5 μ 1の 10 OmMあるいは 5 OmM 化合物 （1 7) ジメチルス ホキシド溶 液を添加して 1 2時間培養した。 なお、 ヘムォキシゲナーゼ 1誘導の陽性対照と して 5 i lの 3 mM 15—デォキシ一Δ 12， 14プロスタグランジン J 2 (ケィマンケミカル社製、 18570) ジメチルスルホキシド溶液添加の区分を、 また陰性対照として水添加の区分を設定した。 細胞をスクレイパーによりプレー トより剥がして回収し、 0. 05mMぺプスタチン A (シグマ社製、 P 531 8) 、 0. 2 mMロイぺプチン （シグマ社製、 L 2884) 、 ImMフッ化フエ 二ルメチルスルホニル （ナカライテスク社製、 273— 27) 、 l OmMェチレ ンジァミン四酢酸二水素ニナトリウム、 0. l%Tr i t o n X— 100含有 0. 1M T r i s— HC 1緩衝液 （pH7. 5 ) に懸濁して 1回凍結融解した のち遠心分離により上清をタンパク画分とした。 タンパク画分中のタンパク含量 は M i c r o Bし A P r o t e i n A s s a y x¾. e a g β n t ( ^酒造 社販売ピアス社製、 P741 1) により測定した。 この調製した各タンパク画分 サンプルと等量の 4%ラウリル硫酸ナトリウム （SDS) 、 2%2—メルカプト エタノール、 0. 001 %ブロムフエノールブルー、 20%グリセローノ 有 0.
1 25M トリス一塩酸緩衝液 （pH 6. 8) を混合し 100°Cで 5分間処理し た後、 タンパク量として 10// gを 1 2. 5%SDS—ポリアクリルァミドゲル に負荷し、 20 m Aの定電流で電気泳動した。 泳動後のゲルは、 48 mMトリス、 39mMグリシン、 20%メタノール、 0. 0375 % S D S含有ブロッテイン グ緩衝液により、 トランスプロット S Dセルセミ ドライブ口ッティング装置 （バ ィォラッド社製） を用いて付属のプロトコールにより PVDF膜 （ミリポア社製、
1 PVHO 00 10) に 1 5 Vの定電圧で 25分間転写した。 転写後の PVD F膜はプロックエース （大日本製薬社製、 UK-B 25) 溶液中で一晩 4 °Cでブ ロックした。 ブロック後の膜は◦. l%Twe e n 20含有りん酸緩衝食塩水に より 15分間 3回緩やかな振とう下で洗浄した。 次に 200 n g/ml 抗ヘム ォキシゲナーゼ 1抗体 （N— 1 9 ；サンタクルーズ社製、 s c - 7696) を含 む 10 %ブロックエース、 0. l%Twe e n 20含有りん酸緩衝食塩水中で 1 時間室温で緩やかな振とう下で反応し、 0. l%Twe e n 20含有りん酸緩衝 食塩水により 1 5分間 3回緩やかな振とう下で洗浄した。 次に 0. 1 %パーォキ シダーゼ標識ゥサギ抗ャギ I g G (H+ L) 抗体 （ザィメッドネ ± 、 61— 16
20) を含む 10%ブロックエース、 0. 1 %Twe e n 20含有りん酸緩衝食 塩水中で 1時間室温で緩やかな振とう下で反応し、 0. 1 % T w e e n 20含有 りん酸緩衝食塩水により 1 5分間 5回緩やかな振とう下で洗浄した。 続いて、 P VDF膜をウェスタンブロットケミルミネッセンスリ一ジェントプラス （第一化 学社販売 NENライフサイエンスプロダクツ社製、 NEL 103) を用いて付属 のプロトコールにより染色し、 X線フィルム （コダック社製、 CAT 165 1 454) に感光した。 感光後のフィルムは F PM800 (富士フィルム社製） に より現像した。
その結果いずれの試料の添加区分においてもヘムォキシゲナーゼ 1タンパク由 来のバンドが確認できた。 また、 バンドの強さは各試料の濃度依存的であった。 この結果を表 4に示す。 表中においてへムォキシゲナーゼ 1タンパクのバンドの 強度に応じて、 +の記号を記した。 すなわち、 全くバンドが見られないものは一 であり、 +—、 十、 + +の順にバンドの強度が強くなるものとした。 表 4 試料 ヘムォキシゲナーゼ 1
タンパク質のバンドの強度 水 （陰性対照）
終濃度 1 O O ^M 化合物 （1 1) + +
終濃度 50/iM 化合物 (1 1) +
終濃度 100 /1 M 化合物 （14) + +
終濃度 50 /xM 化合物 （14) +
終濃度 50 //M 化合物 (7) +
終濃度 25μΜ 化合物 （7) +
終濃度 100 //Μ 化合物 （17) + +
終濃度 50//Μ 化合物 (17) +
15-デォキシ- Δ 12， 14プロスタグランジン J 2 +
(陽性対照）
産業上の利用の可能性
本発明によりアポトーシス誘発剤、 制がん剤、 活性酸素産生抑制剤、 過酸化脂 質ラジカル産生抑制剤、 NO産生抑制剤等の抗酸化剤、 抗病原微生物剤、 鮮度保 持剤、 抗変異原剤、 血糖上昇抑制剤、 抗高脂血症剤の有効成分として有用な、 一 般式 Iで表される化合物、 および当該化合物を有効成分とする当該化合物に感受 性を示す疾患の治療用または予防用医薬が提供される。
当該化合物は、 アポトーシス誘発用医薬、 制がん用医薬、 活性酸素産生抑制用 医薬、 NO産生抑制用医薬等の抗酸化用医薬、 抗病原微生物用医薬、 血糖上昇抑 制用医薬、 抗高脂血症用医薬等の有効成分として有用であり、 また当該化合物を 含有、 希釈および Zまたは添加してなる食品または飲料はァポトーシス誘発作用、 制がん作用、 活性酸素産生抑制作用、 NO産生抑制作用等の抗酸化作用、 抗病原 微生物抑制作用、 抗変異原作用、 血糖上昇抑制作用、 抗肥満作用等を有する機能 性食品または飲料として有用であり、 がん患者やウィルス性疾患患者の病変細胞 にアポトーシスを誘発し、 これらの疾患の予防、 症状改善に有効な食品または飲 料が提供される。 とりわけ大腸がん、 胃がん等消化器系のがんの場合、 本発明の 上記化合物を食品、 飲料として経口的に摂取することによりがん細胞にアポトー シスを起こすことができるため、 本発明の食品または飲料は消化器系がんの予防、 症状改善に優れた効果を有している。 さらに、 その活性酸素産生抑制作用等の抗 酸化作用により上記の食品または飲料は抗酸化ストレス用食品または飲料として も優れている。 また本発明により、 一般式 Iで表される化合物を含有する甘味料 が提供され、 低カロリー甘味料として食品、 飲料の分野において有用である。 また、 一般式 Iで表される化合物は生体内において一般式 I Vで表される化合 物に変換し、 一般式 I Vで表される化合物の組織特異的ドラグデリノくリ一システ ムの構築に特に有用である。

Claims

-般式 I
請
Figure imgf000049_0001
(式中、 Xは Ο Ηまたは O S 03 Hでありの、 Rは O H以外の置換基で、 当該置換 基はそれが離脱することにより、 3， 6—アンヒドロガラクトースまたはその硫 酸化体の 3位と 4位に不飽和結合を導入できる置換基およびノまたは組織特異的 親和性を示す置換基である）
で表される化合物。
2 . —般式 Iで表される化合物を有効成分として含有する一般式 Iで表される 化合物に感受性を示す疾患の治療用または予防用の医薬。
3 . 疾患がアポトーシス誘発を要する疾患、 がん細胞増殖抑制を要する疾患、 プロスタグランジン E2合成抑制を要する疾患、 インターロイキン産生抑制を要 する疾患、 ヘムォキシゲナーゼ産生誘導を要する疾患または活性酸素産生抑制を 要する疾患である請求項 2記載の医薬。
4 . 一般式 Iで表される化合物を含有、 希釈および Zまたは添加してなる食品 または飲料。
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