WO2000042842A1 - Organprotektive lösungen - Google Patents

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WO2000042842A1
WO2000042842A1 PCT/EP2000/000264 EP0000264W WO0042842A1 WO 2000042842 A1 WO2000042842 A1 WO 2000042842A1 EP 0000264 W EP0000264 W EP 0000264W WO 0042842 A1 WO0042842 A1 WO 0042842A1
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icam
glycosaminoglycans
heparin
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PCT/EP2000/000264
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Fokko J. Van Der Woude
Benito Yard
Dieter Herr
Volker Laux
Christian Peter Lorentz
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Knoll Aktiengesellschaft
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    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
    • A61K31/737—Sulfated polysaccharides, e.g. chondroitin sulfate, dermatan sulfate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/02—Preservation of living parts
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A01N1/0205—Chemical aspects
    • A01N1/021—Preservation or perfusion media, liquids, solids or gases used in the preservation of cells, tissue, organs or bodily fluids
    • A01N1/0226—Physiologically active agents, i.e. substances affecting physiological processes of cells and tissue to be preserved, e.g. anti-oxidants or nutrients

Definitions

  • the invention relates to the use of polysulfated glycosaminoglycans with a sulfur content of at least 12.5% for the production of pharmaceutical preparations for inhibiting the interferon- ⁇ -induced upregulation of the MHC class I, MHC class II proteins and ICAM-1.
  • the invention further relates to organ-protective solutions containing polysulfated glycosaminoglycans and a method for the ex-vivo protection of transplant organs.
  • glycosaminoglycans and especially of
  • Heparins and heparinoids for the manufacture of pharmaceutical preparations for the treatment of circulatory disorders are well known.
  • glycosaminoglycans in a number of other diseases has recently been described.
  • No. 5,236,910 claims the use of glycosaminoglycans in the treatment of diabetic nephropathy and neuropathy.
  • the use of low molecular weight heparins for the same indication is described by van der Pijl et al. (J. Americ. Soc. Nephrol. 1997, 8: 456-462).
  • tubular cells leads. Furthermore, the so-called "graft versus host reaction” results in a strong reaction of the donor's immune cells transmitted with the organ against the recipient. Cytotoxic T cells and antibodies against the host organism are formed.
  • the organs are cooled immediately after removal and stored under an organ protection solution.
  • the recipient is given medication to protect the immune system
  • This object was achieved by using polysulfated glycosaminoglycans with a sulfur content of at least 12.5% by weight for the production of pharmaceutical preparations for inhibiting the interferon- ⁇ -induced upregulation of the MHC class I, MHC class II proteins and ICAM-1 solved.
  • the invention also relates to organ-protective solutions containing a quantity of a suitable pharmaceutical preparation with a sulfur content of at least 12.5% by weight of a polysulfated glycosaminoglycan which is effective for maintaining cell integrity and vitality.
  • the pharmaceutical preparations prepared for the use according to the invention can contain the abovementioned compounds as free compounds, in the form of their physiologically active salts or esters, their tautomeric and / or isomeric forms or in the form of the Combination of the free compounds and the various salts included.
  • the Na, Ca or Mg salts may be mentioned by way of example as advantageous physiologically active salts. Salts with organic bases such as diethylamine, triethylamine or triethanolamine are also suitable.
  • the pharmaceutical preparations can advantageously contain at least one free substance or at least one compound in the form of their salt or mixtures thereof.
  • heparan sulfate corresponds to that of heparin, but it has fewer N- and O-sulfate groups and more N-acetyl groups.
  • Glycosaminoglycans can advantageously be isolated from tissues of animals 20 such as the intestinal mucosa or from ears of pigs or cattle.
  • the tissues used are, for example, autolyzed to isolate the glycosaminoglycans and extracted with alkali.
  • the protein is then allowed to coagulate and is precipitated, for example, by acidification. After the precipitate has been taken up in a polar, non-aqueous solvent, such as ethanol or acetone, the fats are removed by extraction with an organic solvent.
  • the proteins are finally removed by proteolytic digestion and the glycosaminoglycans are thus obtained. Charles et al. (Biochem. J., Vol.
  • glycosaminoglycans isolated from natural sources advantageously also receive a derivatization by polysulfation, as is described, for example, in US Pat. No. 5,013,724 or as described above.
  • the glycosaminoglycans have a sulfur content
  • Polysulfated glycosaminoglycans which have a sulfur content of at least 12.5% by weight are selected for the use according to the invention or for the pharmaceutical preparations. These polysulfated glycosaminoglycans advantageously have a sulfur content of 13 to
  • Low molecular weight polysulfated heparins and / or dermatan sulfates in the form of the free acid or in the form of a salt with physiologically compatible bases or mixtures of these compounds are particularly advantageous. These substances have a low anti-coagulant effect and are therefore particularly suitable for the treatment and prevention in the use according to the invention.
  • Preferred salts of the polysulfated glycosaminoglycans are, for example, the sodium, calcium and magnesium salts.
  • Low molecular weight glycosaminoglycans for example low molecular weight heparins and / or dermatan sulfates, can be produced by a number of methods. The production of low molecular weight heparins via depolymerization using nitrous acid is described, for example, in EP-B-0 037 319 or in Biochemistry Vol. 15, 1976: 3932. Low molecular weight heparin or low molecular weight glycosaminoglycans can also be produced with enzymes (Biochem. J. Vol. 108, 1968: 647), with sulfuric acid and chlorosulfonic acid (FRNo.
  • organ-protective solutions Another object of the invention is organ-protective solutions.
  • the advantageous addition of the polysulfated glycosaminoglycans to organ-protective solutions allows the organs to be stored after removal from the donor organism, that is to say ex vivo, by inhibiting the interferon- ⁇ -induced upregulation of the MHC class I, MHC class II proteins and Further improve ICAM-1.
  • the organs should advantageously be cooled, as is known to the person skilled in the art. A number of such solutions as described above are known from the literature.
  • the solutions generally contain salts, buffers, substances which are intended to stabilize the organs osmotically or which are intended to prevent oxidation, such as sugar or 5 sugar alcohols, proteins, amino acids, lower carboxylic acids, purines, pyrimidines or pharmaceutical active ingredients.
  • substances which are intended to stabilize the organs osmotically or which are intended to prevent oxidation, such as sugar or 5 sugar alcohols, proteins, amino acids, lower carboxylic acids, purines, pyrimidines or pharmaceutical active ingredients.
  • the following may be mentioned as examples of such substances: raffinose, glucose, potassium dihydrogen phosphate, dipotassium hydrogen phosphate, potassium chloride, potassium hydrogen carbonate, sodium hydrogen carbonate, magnesium sulfate, magnesium chloride, adenosine, albumin, mannitol, citrate, verapamil, allopurinol, insulin, dexethyl methasone, hydroxyl starch, hydroxyl Glucuronic acid.
  • organ-protective solutions 15 means that the organs can be transplanted in a better state or can be stored longer than previously, so that rejection reactions can be reduced.
  • the polysulfated glycosaminoglycans can, as far as possible, be administered orally or parenterally to transplant patients or transplant donors before the transplant. Post-treatment of the patients with the substances is also conceivable.
  • polysulfated glycosaminoglycans are in the organ-protective solutions or in the other pharmaceutical preparations in amounts of 10 mg / 1 to 10,000 mg / 1, advantageously in amounts of 10 mg / 1 to 5,000 mg / 1, preferably in amounts of
  • an osmotically stabilizing substance advantageously contain hydroxyethyl starch.
  • compositions have the following composition: a) 10 mg / 1 to 10,000 mg / 1 polysulfated glycosaminoglycans with a sulfur content of at least 12.5% by weight, 5 to 100 g / 1 hydroxyethyl starch and 5 to 100 mmol raffinose or b) 10 mg / 1 to 10,000 mg / 1 polysulfated
  • glycosaminoglycans with a sulfur content of at least 12.5% by weight 5 to 100 g / 1 hydroxyethyl starch, 5 to 100 mmol raffinose, 5 to 40 mmol KH 2 P0 4 , 1 to 50 mmol MgSOa, 1 to 50 mmol adenosine, 0.5 to 5 mmol allopurinol or 1 to 10 mmol glutathione.
  • polysulfated glycosaminoglycans can be used together with conventional formulation aids for the treatment of patients.
  • compositions used according to the invention can be administered orally or parenterally (subcutaneously, intravenously, intramuscularly, intraperitoneally) in a customary manner; oral or intravenous applications are preferred.
  • the dosage depends on the age, condition and weight of the patient and on the type of application.
  • the glycosaminoglycans are advantageously applied in a dose of 0.1 to 500 mg / kg body weight / day.
  • the glycosaminoglycans are advantageously administered in a dose of 0.1 to 30 mg / kg of body weight / day, in the case of oral use in a dose of 0.2 to 500 mg / kg of body weight / day, the administered Dose can be administered in a single dose or in multiple doses.
  • Mixtures of, for example, at least one low molecular weight heparin and / or its polysulfated derivative and / or at least one low molecular weight dermatan sulfate and / or its polysulfated derivative are also used in a dose of 0.1 to 30 mg / kg body weight / day with parenteral administration or in one Dose of 0.2 to 500 mg / kg / day administered orally.
  • pharmaceutical preparations containing the polysulfated glycosaminoglycans for the treatment and prevention of diseases in connection with organ transplants are to be understood as all galenical forms of application customary for oral or parenteral use, whether solid or liquid, such as tablets, film-coated tablets, capsules, powders, granules, dragees , Suppositories, solutions or suspensions. These are manufactured in the usual way.
  • the active ingredients can be processed with the usual pharmaceutical auxiliaries such as tablet binders, fillers, preservatives, tablet disintegrants, flow regulators, plasticizers, wetting agents, dispersants, emulsifiers, solvents, retardants, antioxidants and / or propellants (cf. H.
  • the polysulfated glycosaminoglycans can also be processed with pharmaceutically inert, inorganic or organic excipients. Lactose, corn starch or derivatives thereof, talc, stearic acid or salts thereof can be used as such excipients for tablets, dragees and hard gelatin capsules. Vegetable oils, waxes, fats, semi-solid and liquid polyols are suitable excipients for soft gelatin capsules.
  • Suitable excipients for the production of solutions and syrups are e.g. Water, polyols, sucrose, invert sugar, glucose and the like.
  • Suitable excipients for injection solutions are water, alcohols, polyols, glycerin, vegetable oils. Natural or hardened oils, waxes, fats, semi-liquid or liquid polyols and the like are suitable as excipients for suppositories.
  • the pharmaceutical preparations can also contain preservatives, solubilizers, stabilizers. Wetting agents, emulsifying agents, sweetening agents, coloring agents, flavoring agents. Contain salts for changing the osmotic pressure, buffers, coating agents and / or antioxidants.
  • PTEC poximal tubular epithelial cells
  • HUVEC human umbilical vein endothelial cells
  • the culture medium consisted of the Dulbecco modified "Eagle's Medium” and Ham's F12 medium (both from Gibco BRL) in a 1: 1 ratio, supplemented with insulin (5 ⁇ g / ml), transferrin (5 ⁇ g / ml), selenium (5 ng / ml), hydrocortisone (36 ng / ml), triidothyronine (4 pg / ml), epidermal growth factor (10 ng / ml) and penicillin / streptomycin [(5IE / ml, 5 ⁇ g / ml), all of Sigma].
  • the endothelial cells were isolated from umbilical cord veins by digestion with Collagenase V (Sigma, St. Louis MO, 20 minutes at 37 ° C). The veins were then rinsed with sterile culture medium and the endothelial cells were collected.
  • FCS fetal calf serum
  • the cells were cultured in 25 cm 2 bottles coated with 1% gelatin (Sigma, St. Louis Mo).
  • HUVEC cells were characterized by their positive staining using the factor VIII-related antigen (Dako, High Wycombe, UK) and the endothelial marker EN4 (CD31).
  • Confluent monolayers from PTEC or HUVEC cells were treated with trypsin and seeded in 24-well plates. When confluence was reached, the cells were stimulated with IFN- ⁇ (Sigma, St. Louis MO) for 72 h in the presence or absence of various concentrations of different heparinoids, which were found in various heparins such as Heparin-Braun ® from Braun-Melsungen, Melsungen, Germany, low molecular weight heparin Fragmin ® P from Pfrimmer Kabi, Er Weg, Germany and modified low molecular weight heparin from Knoll AG, Ludwigshafen, Germany.
  • IFN- ⁇ Sigma, St. Louis MO
  • the chlorate was used in concentrations of 50 to 150 mM. It was added to the medium 24 hours before the addition of IFN- ⁇ . The stimulation with IFN- ⁇ was carried out in the presence of chlorate.
  • Sodium chloride was used as an osmolar control.
  • the cultivated cells were obtained after cultivation with a trypsin EDTA treatment for flow cytometry.
  • the cells of the individual batches were brought together and then divided into two test tubes and washed. Antibodies that do not bind to cell isotypes and that are coupled to RPE and FITC (from Dako, Glostrup, Denmark) and Cy-5 (from Dianowa, Hamburg, Germany) were added to the first test tube. This approach was taken as a negative control for the FACS background.
  • the cells in the second batch were antibodies against MHC class I (RPE-conjugated, W6 / 32, Dako), against MHC class II (Cy-5-conjugated, CR3 / 43, Dianova) and against ICAM 1 (FITC-conjugated, Dianova) marked in concentrations according to the manufacturer.
  • MHC class I, class II and ICAM-1 proteins were modulated in PTEC by IFN- ⁇ depending on the dose.
  • the MHC class I and ICAM-1 expression was already regulated by a concentration of 50 ng / ml IFN- ⁇ .
  • the same concentration of IFN- ⁇ the MHC class II expression in PTEC increased (see Figure 1).
  • Corresponding results were obtained with the cultivated HUVEC cells.
  • both HUVEC and PTEC cultures were stimulated with IFN- ⁇ in the presence or absence of heparin.
  • the addition of heparin in concentrations of 0.03 to 3 mg / ml to HUVEC cultures completely prevents the "upregulation" of MHC class I and ICAM-1 proteins caused by 100 ng / ml IFN- ⁇ .
  • the induction of the MHC class II proteins was also suppressed in these cells by the addition of heparin.
  • Heparin itself had no influence on the expression of the three antigens examined (FIG. 2) in the absence of IFN- ⁇ .
  • the heparinoids were all tested at 3 mg / ml for their ability to inhibit MHC class I and ICAM-1 after iFN- ⁇ stimulation.
  • the MHC Class II tests were performed with 10 ng / ml IFN- ⁇ stimulation.
  • the supersulfated GAG (GAG 6-8) were able to inhibit the expression of MHC and ICAM-1 in both HUVEC and PTEC after IFN- ⁇ stimulation.
  • desulfated-N-acetylated GAG GAG 1-5) could not influence the MHC and ICAM-1 expression in these cells after IFN- ⁇ stimulation (FIGS. 4a-c and 5a-c).
  • 125 IFN- ⁇ can bind.
  • Desulfated-N-acetylated GAGs that have very few sulfate groups (GAG 3-5) can no longer do this.
  • Desulfated-N-acetylated GAG with a higher sulfate content (GAG 1 and 2) still bind 125 IFN- ⁇ , but significantly less than heparin or supersulfated GAG.
  • the binding of 125 IFN- ⁇ to heparin or GAG bound to nitrocellulose filters can be blocked by a 3000-fold excess of heparin in the binding solution. Under these conditions, there was no longer any binding to GAG 1 and 2, while the binding to heparin, fragmin and supersulfated GAG was significantly reduced (FIG. 8).
  • Tab. 1 Properties of the various heparins and glycosaminoglycans used in this study *)
  • IFN- ⁇ stimulated HUVEC cells Effect of heparin on MHC and ICAM-1 expression of IFN- ⁇ stimulated HUVEC cells.
  • IFN- ⁇ stimulated (100 ng / ml, for 72 hours, gray bars) or non-stimulated (white bars) HUVEC were incubated with different heparin concentrations during the stimulation.
  • the MHC and ICAM-1 expression was then determined using the FACS. The results are shown in the figure as the average fluorescence intensity of a representative experiment.
  • IFN- ⁇ stimulated PTEC cells Effect of heparin on the MHC and ICAM-1 expression of IFN- ⁇ stimulated PTEC cells.
  • the MHC and ICAM-1 expression of three replicated cultures were then determined using the FACS.
  • 3a shows the MHC class I expression.
  • 3b shows the MHC class II expression.
  • 3c shows the ICAM-1 expression. The results are shown in the figure as an average fluorescence intensity +/- 2 SD.
  • IFN- ⁇ stimulated HUVEC cells Effect of various heparins and glycosaminoglycans on the MHC and ICAM-1 expression of IFN- ⁇ stimulated HUVEC cells.
  • IFN- ⁇ stimulated (10 ng / ml, for 72 hours, filled bars) or non-stimulated (hatched bars) HUVEC cells were incubated with various heparins or glycosaminoglycans in a concentration of 3 mg / ml during the stimulation period.
  • the MHC and ICAM-1 expression was then determined using the FACS.
  • 4a shows the MHC class I expression.
  • 4b shows the MHC class II expression.
  • 4c shows the ICAM-1
  • IFN- ⁇ stimulated PTEC cells Effect of various heparins and glycosaminoglycans on the MHC and ICAM-1 expression of IFN- ⁇ stimulated PTEC cells.
  • IFN- ⁇ stimulated (10 ng / ml, for 72 hours, filled bars) or non-stimulated (hatched bars) PTEC cells were incubated with various heparins or glycosaminoglycans in a concentration of 3 mg / ml during the stimulation period.
  • the MHC and ICAM-1 expression was then with the FACS determined.
  • Fig. 5a shows the MHC class I expression.
  • 5b shows the MHC class II expression.
  • 5c shows the ICAM-1 expression. The results are shown in the figure as the average fluorescence intensity of a representative experiment.
  • GAG 6-8 and heparin in their effect to inhibit the MHC and ICAM-1 expression of IFN- ⁇ (10 ng / ml, for 72 hours) PTEC cells.
  • the PTEC cells were incubated with various concentrations of GAG6 (), GAG7 (), GAG8 () and heparin () during the stimulation period.
  • the MHC and ICAM-1 expression was then determined using the FACS. Expression of these antigens was also determined in the absence of GAG (-GAG) or in the absence of IFN- ⁇ (-IFN).
  • 6a shows the MHC class I expression.
  • 6b shows the MHC class II expression.
  • 6c shows the ICAM-1 expression. The results are shown in the figure as an average fluorescence intensity +/- 2 SD.
  • Heparin Heparin
  • GAG glycosaminoglycan 1 to 8
  • Fragmin Fragmin

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Abstract

Die Erfindung betrifft organprotektive Lösungen, enthaltend polysulfatierte Glykosaminoglykane.

Description

Organprotektive Lösungen
Beschreibung
Die Erfindung betrifft die Verwendung von polysulfatierten Glykosaminoglykanen mit einem Schwefelgehalt von mindestens 12,5 % zur Herstellung von pharmazeutischen Zubereitungen zur Hemmung der Interferon-γ induzierten Hochregulierung der MHC- Klasse I-, MHC-Klasse Il-Proteine und ICAM-1. Die Erfindung betrifft weiterhin organprotektive Lösungen enthaltend polysulfatierten Glykosaminoglykane und ein Verfahren zum ex-vivo Schutz von Transplantatorganen.
Die Verwendung von Glykosaminoglykanen und speziell von
Heparinen und Heparinoiden zur Herstellung von pharmazeutischen Zubereitungen zur Behandlung von Durchblutungsstörungen ist wohl bekannt .
In neuerer Zeit wurde die Verwendung von Glykosaminoglykanen bei einer Reihe weiterer Krankheiten beschrieben. So beansprucht US 5,236,910 die Verwendung von Glykosaminoglykanen bei der Behandlung von diabetischer Nephropathie und Neuropathie. Die Verwendung niedermolekularer Heparine für die gleiche Indikation wird von van der Pijl et al. (J. Americ. Soc. Nephrol. 1997, 8: 456 - 462) beschrieben.
US 5,032,679 beansprucht die Verwendung von Glykosaminoglykanen zur Hemmung der Proliferation von glatten Muskelzellen und den damit verbundenen Krankheiten.
In US 4,966,894 werden polysulfatierte Heparine zur Behandlung von Krankheiten, die durch Retroviren verursacht werden, beansprucht .
Von Gralinski et al. wird die Modulierung des Komplementsystems durch polysulfatierte Heparine beschrieben.
In Clin. Exp. Immunol. (1997, 107: 578 - 584) wird von Douglas et al. die Antagonisierung der entzündungsfordernden Wirkung von Interferon-γ mit Heparin, Heparansulfat oder Heparin-ähnlichen Molekülen untersucht. Heparin ist in der Lage die immunogene Wirkung von Interferon-γ zu beeinflussen.
Bei der Transplantation von Organen kommt es immer wieder zu unerwünschten Abstoßungsreaktionen. Zur Verhinderung dieser Abstoßungsreaktionen werden eine Vielzahl von verschiedenen Wegen beschritten. So werden zunächst die Histokompatibilitätsantigene von Spender und Empfänger verglichen. Es werden nur Organe trans- plantiert, deren Spender und Empfänger möglichst identische oder sehr ähnliche Histokompatibilitätsantigene haben. 5
Trotzdem kommt es immer wieder zu einer unerwünschten Organ- abstoßung. Dabei kommt es beispielsweise zu einer akuten renalen Allograft-Abstoßung, bei der die Erkennung der allo-MHC-Antigene durch T-Lymphozyten der Haupteffekt ist, der zu einer Lyse der
10 Tubularzellen führt. Weiterhin kommt es dabei bei der sogenannten "Graft versus host reaction" zu einer starken Reaktion der mit dem Organ übertragenen Immunzellen des Spenders gegen den Empfänger. Es werden zytotoxische T-Zellen und Antikörper gegen den Wirtsorganismus gebildet.
15
Um das Risiko einer Transplantatabstoßung weiter zu verringern werden die Organe sofort nach Entnahme gekühlt und unter einer Organprotektionslösung gelagert. Des weiteren werden dem Empfänger Medikamente verabreicht, die die Immunabwehr
20 des Empfängers supprimieren.
In der Literatur sind eine ganze Reihe von organprotektiven Lösungen beschrieben worden. So werden von Collins et al. (Lancet, Vol. 2, 1969: 1219) intrazelluläre Elektrolytlösungen
25 zur Konservierung der Organe beschrieben. Sacks S.A. (Lancet, Vol. 1, 1973: 1024) beschreibt Lösungen, die einen osmotisch stabilisierenden Effekt haben. Als vorteilhafte Agenzien in derartigen Lösungen werden ATP-MgCl2, AMP-MgCl2 und Inosin beschrieben (Siegel, N.J. et al., Am. J. Physiol. 254: F530,
30 1983, Beizer et al., Transpl. Proc. 16: 161, 1984). US 4,920,004 beansprucht eine Lösung, die Mannitol, Adenosin und ATP-MgCl enthält. US 4,798,824 und US 4,873,230 beanspruchen eine organprotektive Lösung, die Hydroxyethylstärke enthalten. In US 4,879,283 wird eine Lösung beansprucht, die KH2Pθ4, MgS04,
35 Adenosin, Allopurinol, Raffinose und Hydroxethylcellulose enthält. Sie ist als sogenannte University of Wisconsin Lösung (= UW-Lösung) bekannt. Diese Lösung wurde für die erfolgreiche Konservierung von Leber, Niere und Herz beschrieben (Jamieson et al., Transplantation, Vol. 46, 1988: 517, Ploeg et al., Trans-
40 plantation, Vol. 46, 1988: 191 und Wico b, W.N. , Transplantation, Vol. 47, 1988: 733). In US 5,200,398 wird mit Glucuronsäure, deren Salze und Ester ein weiterer Zusatz in diesen Protektionslösungen beschrieben.
45 Trotz der erreichten Erfolge in der Protektion der Organe für die Transplantation und in der Unterdrückung unerwünschter Organabstoßung besteht nach wie vor ein Bedarf zur weiteren Verbesserung.
Es bestand deshalb die Aufgabe eine weitere Verbesserung sowohl bei der Organprotektion vor und für die Transplantation zu erreichen als auch die Gefahr der Organabstoßung weiter zu verringern.
Diese Aufgabe wurde durch die Verwendung von polysulfatierten Glykosaminoglykanen mit einem Schwefelgehalt von mindestens 12,5 Gew.-% zur Herstellung von pharmazeutischen Zubereitungen zur Hemmung der Interferon-γinduzierten Hochregulierung der MHC-Klasse I-, MHC-Klasse II-Proteine und ICAM-1 gelöst.
Die Erfindung betrifft außerdem organprotektive Lösungen enthaltend eine zum Erhalt der Zellintegrität und Zellvitalität wirksame Menge eines polysulfatierten Glykosaminoglykans mit einem Schwefelgehalt von mindestens 12,5 Gew. -% geeignete pharmazeutische Zubereitungen.
Die für die erfindungsgemäße Verwendung hergestellten pharmazeutischen Zubereitungen, worunter beispielsweise auch die organ- protektiven Lösungen zu verstehen sind, können die oben genannten Verbindungen als freie Verbindungen, in Form ihrer physiologisch wirksamen Salze oder Ester, deren tautomeren und/oder isomeren Formen oder in Form der Kombination aus den freien Verbindungen und den verschiedenen Salzen enthalten. Als vorteilhafte physio- logisch wirksame Salze seien die Na-, Ca- oder Mg-Salze beispielhaft genannt. Auch Salze mit organischen Basen wie Diethylamin, Triethylamin oder Triethanolamin sind geeignet. Die pharmazeutischen Zubereitungen können vorteilhaft mindestens eine freie Substanz oder mindestens eine Verbindung in Form ihres Salzes oder Mischungen dieser enthalten.
Unter den für die erfindungsgemäße Verwendung benutzten polysulfatierten Glykosaminoglykanen (= Mucopolysaccharide) sind negativ geladene Polysaccharide (= Glykane) zu verstehen, die aus unterschiedlich verknüpften Einheiten von Disacchariden bestehen, in denen z.B. 1 Molekül einer sogenannten Uronsäure wie D-Glucuronsäure oder L-Iduronsäure mit der 3- oder 4-Stellung eines Aminozuckers wie Glukosamin oder Galactosamin glykosidisch verbunden ist. Mindestens einer der Zucker im Disaccharid besitzt eine negativ geladene Carboxylat- oder Sulfatgruppe, die über ein Sauerstoff oder Stickstoffatom gebunden sein kann. Durch die Uronsäuren sowie die Schwefelsäureestergruppen reagieren Glykosaminoglykane stark sauer. Diese sauer reagierenden Gruppen sind zum Teil schon natürlicherweise vorhanden, werden aber vorteilhaft, um den erfindungsgemäß erforderlichen Sulfatierungsgrad zu erreichen, durch beispielsweise eine Sulfatierung synthetisch 5 in die Verbindungen eingeführt. Als Sulfatierungsmethoden werden in der Literatur beispielsweise die Sulfatierung mit Schwefelsäure und Chlorsulfonsäure (US 4,727,063, US 4,948,881), die Sulfatierung mit Chlorsulfonsäure in Pyridin (Wolfrom et al., J. Am. Chem. Soc. 1953, 75, 1519) oder die Sulfatierung mit
10 salpetriger Säure (Shively et al . , Biochemistry Vol. 15, No. 18, 1976: 3932) beschrieben. Weitere Methoden sind dem Fachmann wohl bekannt. Beispiele werden für die Sulfatierung natürliche Glykosaminoglykane wie Heparin, Heparansulfat, Keratansulfat, Dermatansulfat, Chondroitin oder Chondroitinsulfat verwendet.
15 Der Aufbau des Heparansulfat entspricht dem des Heparins, wobei es jedoch gegenüber diesem weniger N- und O-Sulfatgruppen und mehr N-Acetylgruppen besitzt.
Glykosaminoglykane lassen sich vorteilhaft aus Geweben von Tieren 20 wie der Darmmucosa oder aus Ohren von Schweinen oder Rindern isolieren. Die verwendeten Gewebe werden zur Isolierung der Glykosaminoglykane beispielsweise autolysiert und mit Alkali extrahiert. Anschließend läßt man das Protein koagulieren und präzipitiert es beispielsweise durch Änsäuerung. Nach Aufnahme 25 des Präzipitats in einem polaren nicht wäßrigen Lösungsmittel wie Ethanol oder Aceton werden die Fette über Extraktion mit einem organischen Lösungsmittel entfernt. Durch proteolytischen Verdauung werden schließlich die Proteine entfernt und so die Glykosaminoglykane gewonnen. Charles et al. (Biochem. J. , Vol. 30 30, 1936: 1927 - 1933) und Coyne, E in Che istry and Biology of Heparin (Elsevier Publishers, North Holland, N.Y., Lunblad, R.L., eds., 1981) sind Methoden zur Isolierung von beispielsweise Heparin zu entnehmen.
35 Diese aus natürlichen Quellen isolierten Glykosaminoglykane erhalten vorteilhafterweise noch eine Derivatisierung durch Polysulfatierung wie es beispielhaft in US 5,013,724 beschrieben wird oder wie es oben beschrieben wurde. Durch diese Polysulfatierung weisen die Glykosaminoglykane eine Schwefelgehalt
40 von 6 bis 15 Gew.-% auf. Für die erfindungsgemäße Verwendung bzw. für die pharmazeutischen Zubereitungen werden polysulfatierte Glykosaminoglykane ausgewählt, die einen Schwefelgehalt von mindestens 12,5 Gew.-% haben. Vorteilhaft haben diese polysulfatierten Glykosaminoglykane einen Schwefelgehalt von 13 bis
45 16 Gew.-%, bevorzugt von 13 bis 15 Gew.-%, besonders bevorzugt von 13,5 bis 14,5 Gew.-%. Diese Substanzen werden zur Herstellung von pharmazeutischen Zubereitungen verwendet, zur Hemmung der Interferon-γ induzierten Hochregulierung der MHC-Klasse I-, MHC- Klasse II-Proteine und ICAM-1 geeignet sind. Bevorzugt werden diese Substanzen in einer physiologisch wirksamen Menge zur Behandlung und Prävention von Krankheiten, die mit einer durch Interferon-γ induzierten Hochregulierung der MHC-Klasse I-, MHC- Klasse II-Proteine und ICAM-1 verbunden sind, verwendet. Unter Derivaten der Substanzen sind außerdem Verbindungen zu verstehen, die die Anwendungseigenschaften der verwendeten polysulfatierten Glykosaminoglykane bezüglich ihrer Wirkung, ihrer Stabilität und ihrer Eliminierung speziell aus dem Körper verbessern.
Vorteilhaft werden als Glykosaminoglykane Heparine und/oder Dermatansulfat mit einem mittleren Molekulargewicht von 1000 bis 20000 Dalton, bevorzugt zwischen 1500 bis 9000 Dalton, besonders bevorzugt zwischen 2000 bis 9000 Dalton, ganz besonders bevorzugt zwischen 2000 bis 6000 Dalton verwendet. Besonders vorteilhaft sind niedermolekulare polysulfatierte Heparine und/oder Dermatan- sulfate in Form der freien Säure oder in Form eines Salzes mit physiologisch verträglichen Basen oder Mischungen aus diesen Verbindungen. Diese Substanzen haben eine geringe anti-koagula- torische Wirkung und sind deshalb für die Behandlung und Prävention in der erfindungsgemäßen Verwendung besonders geeignet. Bevorzugte Salze der polysulfatierten Glykosaminoglykane sind beispielsweise die Natrium-, Calcium- und Magnesiumsalze.
Niedermolekulare Glykosaminoglykane beispielsweise niedermolekulare Heparine und/oder Dermatansulfate lassen sich durch eine Reihe von Methoden herstellen. Die Herstellung niedermolekularer Heparine über Depolymerisation mit Hilfe salpetriger Säure wird beispielsweise in EP-B-0 037 319 oder in Biochemistry Vol. 15, 1976: 3932 beschrieben. Die Herstellung niedermolekularen Heparins bzw. niedermolekularer Glykosaminoglykane kann auch mit Enzymen (Biochem. J. Vol. 108, 1968: 647), mit Schwefelsäure und Chlorsulfonsäure (FRNo. 2,538,404, gleichzeitig Sulfatierung), mit Periodat oder mit physikalischen Methoden erfolgen wie γ-Strahlung (EP-A-0 269 937) oder Ultraschall (Fuchs et al., Lebensm. Unters. Forsch. Vol. 198, 1994: 486 - 490) erfolgen.
Ein weiterer erfindungsgemäßer Gegenstand sind organprotektive Lösungen. Durch die vorteilhafte Zugabe der polysulfatierten Glykosaminoglykane zu organprotektiven Lösungen läßt sich die Lagerung der Organe nach Entnahme aus dem SpenderOrganismus, das heißt ex-vivo, durch Hemmung der Interferon-γ induzierten Hochregulierung der MHC-Klasse I-, MHC-Klasse II-Proteine und ICAM-1 weiter verbessern. Vorteilhaft sollten die Organe, wie dem Fachmann bekannt ist, gekühlt werden. Aus der Literatur sind eine Reihe von derartigen Lösungen wie oben beschrieben bekannt. Die Lösungen enthalten in der Regel Salze, Puffer, Substanzen, die die Organe osmotisch stabilisieren sollen oder die eine Oxidation verhindern sollen wie Zucker oder 5 Zuckeralkohole, Proteine, Aminosäuren, niedere Carbonsäuren, Purine, Pyrimidine oder pharmazeutische Wirkstoffe. Beispielhaft seien für derartige Substanzen die folgenden genannt: Raffinose, Glucose, Kaliumdihydrogenphosphat, Dikaliumhydrogenphosphat, Kaliumchlorid, Kaliumhydrogencarbonat, Natriuhydrogencarbonat , 10 Magnesiumsulfat, Magnesiumchlorid, Adenosin, Albumin, Mannitol, Citrat, Verapamil, Allopurinol, Insulin, Dexmethason, Hydroxy- ethylstärke, Glutathion oder Glukuronsäure.
Die erfindungsgemäße Verwendung in den organprotektiven Lösungen 15 führt dazu, daß die Organe in einem besseren Zustand trans- plantiert werden können oder länger als bisher üblich gelagert werden können, so daß Abstoßungsreaktionen verringert werden können.
20 Um das Risiko einer Organabstoßung weiter zu reduzieren, können die polysulfatierten Glykosaminoglykane soweit möglich den Transplantatpatienten oder Transplantatspendern vor der Trans- plantierung oral oder parenteral verabreicht werden. Auch eine Nachbehandlung der Patienten mit den Substanzen ist denkbar.
25
Die polysulfatierten Glykosaminoglykane sind in den organprotektiven Lösungen oder in den sonstigen pharmazeutischen Zubereitungen in Mengen von 10 mg/1 bis 10.000 mg/1, vorteilhaft in Mengen von 10 mg/1 bis 5.000 mg/1, bevorzugt in Mengen von
30 50 mg/1 bis 3.000 mg/1 besonders bevorzugt in Mengen von 100 mg/1 bis 3.000 mg/1 enthalten. Zusätzlich sind 5 bis 100 g/1 einer osmotisch stabilisierenden Substanz vorteilhaft Hydroxyethyl- stärke enthalten.
35 Weitere vorteilhafte organprotektive Lösungen haben die folgende Zusammensetzung: a) 10 mg/1 bis 10.000 mg/1 polysulfatierte Glykosaminoglykane mit einem Schwefelgehalt von mindestens 12,5 Gew.-%, 5 bis 100 g/1 Hydroxyethylstärke und 5 bis 100 mmol Raffinose bzw. b) 10 mg/1 bis 10.000 mg/1 polysulfatierte
40 Glykosaminoglykane mit einem Schwefelgehalt von mindestens 12,5 Gew.-%, 5 bis 100 g/1 Hydroxyethylstärke, 5 bis 100 mmol Raffinose, 5 bis 40 mmol KH2P04, 1 bis 50 mmol MgSOa, 1 bis 50 mmol Adenosin, 0,5 bis 5 mmol Allopurinol oder 1 bis 10 mmol Glutathion.
45 Für die Behandlung der Patienten können die polysulfatierten Glykosaminoglykane zusammen mit üblichen Formulierungshilfsstoffen verwendet werden.
Die erfindungsgemäß verwendeten pharmazeutischen Zubereitungen können in üblicher Weise oral oder parenteral (subkutan, intravenös, intramuskulär, intraperitoneal) verabfolgt werden, bevorzugt werden orale oder intravenöse Applikationen.
Die Dosierung hängt vom Alter, Zustand und Gewicht des Patienten sowie von der Applikationsart ab.
Die Glykosaminoglykane werden vorteilhaft in einer Dosis von 0,1 bis 500 mg/kg Körpergewicht/Tag appliziert. Im Falle einer parenteralen Anwendung werden die Glykosaminoglykane vorteilhafterweise in einer Dosis von 0,1 bis 30 mg/kg Körpergewicht/ Tag, im Falle einer oralen Anwendung in einer Dosis von 0,2 bis 500 mg/kg Körpergewicht/Tag verabreicht, wobei die verabreichte Dosis in einer einmaligen Gabe oder in mehreren Gaben appliziert werden kann. Auch Mischungen aus beispielsweise mindestens einem niedermolekularen Heparin und/oder seinem polysulfatierte Derivat und/oder mindestens einem niedermolekularen Dermatansulfat und/oder seinem polysulfatierten Derivat werden in einer Dosis von 0,1 bis 30 mg/kg Körpergewicht/Tag bei parenteraler Applikation bzw. in einer Dosis von 0,2 bis 500 mg/kg/Tag bei oraler Applikation verabreicht.
Unter pharmazeutischen Zubereitungen, die die polysulfatierten Glykosaminoglykane enthalten, zur Behandlung und Prävention von Krankheiten im Zusammenhang mit Organtransplantationen sind prinzipiell alle für die orale oder parenterale Anwendung gebräuchliche galenischen Applikationsformen ob fest oder flüssig zu verstehen wie Tabletten, Filmtabletten, Kapseln, Pulver, Granulate, Dragees, Suppositorien, Lösungen oder Suspensionen. Diese werden in üblicher Weise hergestellt. Die Wirkstoffe können dabei mit den üblichen galenischen Hilfsmitteln wie Tablettenbindern, Füllstoffen, Konservierungsmitteln, Tablettenspreng- mitteln, Fließreguliermitteln, Weichmachern, Netzmitteln, Dispergiermitteln, Emulgatoren, Lösungsmitteln, Retardierungs- mittein, Antioxidantien und/oder Treibgasen verarbeitet werden (vgl. H. Sucker et al.: Pharmazeutische Technologie, Thieme- Verlag, Stuttgart, 1991) . Die so erhaltenen Applikationsformen enthalten den Wirkstoff normalerweise in einer Menge von 0,1 bis 90 Gew.-%. Zur Herstellung von Tabletten, Lacktabletten, Dragees und Hartgelatinekapseln können die polysulfatierten Glykosaminoglykanen auch mit pharmazeutisch inerten, anorganischen oder organischen Excipientien verarbeitet werden. Als solche Excipientien kann man für Tabletten, Dragees und Hartgelatinekapseln Lactose, Maisstärke oder Derivate davon, Talk, Stearinsäure oder deren Salze verwenden. Für Weichgelatinekapseln eignen sich als Excipientien pflanzliche Öle, Wachse, Fette, halbfeste und flüssige Polyole.
Zur Herstellung von Lösungen und Sirupen eignen sich als Excipientien z.B. Wasser, Polyole, Saccharose, Invertzucker, Glukose und dergleichen. Für Injektionslösungen eignen sich als Excipientien Wasser, Alkohole, Polyole, Glyzerin, vegetabile Öle. Für Suppositorien eignen sich als Excipientien natürliche oder gehärtete Öle, Wachse, Fette, halbflüεsige oder flüssige Polyole und dergleichen.
Die pharmazeutischen Zubereitungen können daneben noch Konser- vierungsmittel, Lösevermittler, Stabilisierungsmittel. Netzmittel, Emulgiermittel, Süssmittel, Färbemittel, Aromatisierungs- mittel. Salze zur Veränderung des osmotischen Druckes, Puffer, Überzugsmittel und/oder Antioxidantien enthalten.
Beispiele
Für die Versuche wurden PTEC- (= poximal tubular epithelial cells) und HUVEC-Zellen (= human umbilical vein endothelial cells) verwendet. Die PTEC-Zellen wurden nach der von Detrisac et al. (Kidney Int. 25, 1984: 383) beschriebenen Methode kultiviert. Die PTEC-Zellen wurden in Gewebekulturflaschen, die mit Collagen I (Sigma St. Louis MO) und Fötalem Kälberserum (= FCS, Gibco BRL) beschichtet waren, angezogen. Das Kulturmedium bestand aus dem nach Dulbecco modifiziertem "Eagle's Medium" und Ham's F12 Medium (beide von Gibco BRL) in einem 1:1 Verhältnis, suble- mentiert mit Insulin (5 μg/ml), Transferrin (5 μg/ml) , Selenium (5 ng/ml), Hydrocortison ( 36 ng/ml), Triidothyronin (4 pg/ml), Epidermal Growth Factor (10 ng/ml) und Penicillin/Streptomycin [(5IE/ml, 5 μg/ml), alle von Sigma]. Die Zellinien wurden aus verschiedenen Quellen erhalten wie Biopsien von Prätransplantatgeweben, Allografts, die für eine Transplantation nicht nutzbar waren, und von normalen chirurgischen Nierenproben. Die Experimente wurden mit Zellen aus den Passagen eins bis vier durchgeführt. PTEC wurden durch eine positive Markierung mit einem epithelialen Membranantigen (= EMA, Dako Glostrup, Dänemark) und dem Adenosindeaminase-bindenden Protein (freundlicherweise von Dr. Dinjens, University Hospital Maastrich, Niederlande) charakterisiert .
Die HUVEC-Zellen (= Endothelzellen aus humanen Nabelschnurvenen) wurden aus frischen Nabelschnüren mit der von Jaffe et al .
(Culture of human endothelial cells derived from umbilical veins. Identification by morphologic and immunologic criteria, J. Clin. Invest. 52, 1973: 2745 - 2756) beschriebenen Methode gewonnen. Die Vorgehensweise ist kurz beschrieben wie folgt:
Die Endothelzellen wurden aus Nabelschnurvenen durch Verdau mit Collagenase V (Sigma, St. Louis MO, 20 Minuten bei 37°C) isoliert. Anschließend wurden die Venen mit sterilem Kulturmedium gespült und die Endothelzellen gesammelt. Das Kulturmedium besteht aus Medium 199 (Gibco BRL), das mit 15 % Fötalem Kälberserum (= FCS), Endothelial Cell Growth Factor und den Antibiotika Penicillin und Streptomycin supplementiert war. Die Zellen wurden in 25 cm2 Flaschen, die mit 1 % Gelatine (Sigma, St. Louis Mo) überzogen waren, kultiviert.
Alle Experimente wurden mit Zellen aus der dritten bis sechsten Zellkulturpassage durchgeführt. Die HUVEC-Zellen wurden durch ihre positive Färbung mittels dem Faktor VIII-verwandten Antigen (Dako, High Wycombe, UK) und dem endothelialen Marker EN4 (CD31) charakterisiert.
IFN-γ Stimulierung, Heparin und Natriumchlorat-Behandlung
Konfluente Monolayers von PTEC- oder HUVEC-Zellen wurden mit Trypsin behandelt und in 24-well Platten ausgesät. Bei Erreichen der Konfluenz wurden die Zellen mit IFN-γ (Sigma, St. Louis MO) für 72 h in Gegenwart oder Abwesenheit verschiedener Konzentrationen unterschiedlicher Heparinoide stimuliert, die in verschiedenen Heparinen wie Heparin-Braun® von der Firma Braun-Melsungen, Melsungen, Deutschland, niedermolekulares Heparin Fragmin® P von der Firma Pfrimmer Kabi, Erlangen, Deutschland und modifiziertes niedermolekulares Heparin von der Firma Knoll AG, Ludwigshafen, Deutschland enthalten sind.
In einigen Experimenten wurde das Kulturmedium mit Natriumchlorat supplementiert, um die Sulfatierung von zellgebundenem Heparan- sulfatproteoglycan (= HSPG) zu inhibieren. Das Chlorat wurde in Konzentrationen von 50 bis 150 mM verwendet. Es wurde 24 Stunden vor der Zugabe von IFN-γ zum Medium gegeben. Die Stimulierung mit IFN-γ wurde in Gegenwart von Chlorat durchgeführt. Natriumchlorid wurde als osmolare Kontrolle verwendet. Die kultivierten Zellen wurden nach Kultivierung mit einer Trypsin-EDTA-Behandlung für die Durchflußzytometrie gewonnen.
Durchflußzytometrie
Die Zellen der einzelnen Ansätze wurden zusammengeführt und anschließend in zwei Reagenzgläschen aufgeteilt und gewaschen. Antikörper, die nicht an Zell-Isotypen binden und die an RPE und FITC (von Dako, Glostrup, Dänemark) und Cy-5 (von Dianowa, Hamburg, Deutschland) gekoppelt waren, wurden zum ersten Reagenzgläschen gegeben. Dieser Ansatz wurde als negative Kontrolle für den FACS-Hintergrund genommen. Die Zellen im zweiten Ansatz wurden mit Antikörpern gegen MHC Klasse I (RPE-konjugiert, W6/32, Dako), gegen MHC Klasse II (Cy-5-konjugiert, CR3/43, Dianova) und gegen ICAM 1 (FITC-konjugiert, Dianova) in Konzentrationen nach Angaben der Hersteller markiert. Nach Inkubation der zellen für 30 min bei 4°C wurden diese gewaschen und mit der Durchflußzytometrie (FACScan, Becton Dickinson) analysiert. Es wurden mindestens 10000 positive Ereignisse analysiert. Die Ergebnisse wurden als Hauptfluoreszenzintensität (= ean flurescence intensity = MFI) ausgedrückt.
Dotblotanalysen
Für die Dotblotanalysen wurden schmale Streifen einer Nitrozellulosemembran vorbereitet, auf die je 1 μl Heparin, Frag in und verschiedene andere N-desulfatierte-N-acetylierte Glykosaminoglykane (= GAG, alle in einer Konzentration von 1 mg/1) aufgebracht wurden. Nach Trocknung wurden die Streifen mit 1 % Glutaraldehyd + 0,5 % Cetylpridiniumchlorid fixiert, um GAG Verluste zu verhindern, und anschließend mit Tris-Puffer gewaschen. Die fertigen Streifen wurden schließlich auf einem Kodak-Film exponiert.
Statistische Analyse
Die Signifikanz der Veränderungen in der Antigenexpression wurden mit Hilfe des Student's T-Test bestimmt. P-Werte < 0,05 wurden als Signigikant angenommen.
Ergebnisse
Die Expression von MHC Klasse I-, Klasse II- und ICAM-1-Proteinen wurde in PTEC durch IFN-γ abhängig von der Dosis moduliert. Die MHC Klasse I und ICAM-1 Expression wurde schon durch eine Konzentration von 50 ng/ml IFN-γ aufreguliert. Zusätzlich wird durch die gleiche Konzentration an IFN-γ die MHC Klasse II Expression in PTEC erhöht (siehe Figur 1). Entsprechende Ergebnisse wurden mit den kultivierten HUVEC-Zellen erhalten.
Um den Einfluß von Heparin auf die Fähigkeit von IFN-γ die MHC und ICAM-1 Expression zu modulieren zu untersuchen, wurden sowohl HUVEC- als auch PTEC-Kulturen mit IFN-γ in Gegenwart oder Abwesenheit von Heparin stimuliert. Die Zugabe von Heparin in Konzentrationen von 0,03 bis 3 mg/ml zu HUVEC-Kulturen verhindert komplett die durch 100 ng/ml IFN-γ verursachte "Upregulation" von MHC Klasse I- und ICAM-1-Proteinen. Auch die Induktion der MHC Klasse II-Proteinen wurde in diesen Zellen durch die Zugabe von Heparin unterdrückt. Heparin selbst hatten in Abwesenheit von IFN-γ keinen Einfluß auf die Expression der drei untersuchten Antigene (Figur 2 ) .
In vergleichbaren Experimenten mit PTEC konnte ebenfalls gezeigt werden, daß die durch 100 ng/ml IFN-γ-ind zierte "Hochregulierung" (= Upregulation) von ICAM-1 und die Induktion der MHC Klasse II- Proteine durch Heparin inhibiert werden kann. Die Hochregulierung von MHC Klasse I-Proteinen durch IFN-γ konnte mit Heparin jedoch nicht beeinflußt werden. Um zu testen, ob die Hochregulierung der MHC Klasse I-Proteine, die durch geringe IFN-γ-Konzentration indu- ziet wurden, durch Heparin blockiert werden kann, wurden dieselben Experimente mit durch 10 ng/ml IFN-γ stimulierten Zellen durchgeführt. Es zeigte sich, daß Heparin selbst bei Konzentrationen von 3 mg/ml nur einen marginalen Einfluß auf die Hochregulierung von MHC Klasse I durch IFN-γ hat (siehe Figur 3a) . Im Gegensatz dazu wird sowohl die Induktion von MHC Klasse II als auch die Hochregulierung von ICAM-1 schon signifikant durch 0,03 mg/ml Heparin (p < 0,01) inhibiert (siehe Figur 3 b und c) . Um den Einfluß des Sulfatierungsgrads des Heparins auf die Inhibierung der MHC- und ICAM-1-Expression nach IFN-γ Stimulation zu untersuchen, wurden verschiedene Heparinoide in diesem Testsystem untersucht (Tabelle I) . Die Heparinoide wurden alle in einer Konzentration von 3 mg/ml auf ihre Fähigkeit hin zur Hemmung der MHC-Klasse I und ICAM-1 nach iFN-γ-Stimulierung getestet. Die MHC Klasse II Tests wurden mit einer Stimulation durch 10 ng/ml IFN-γ durchgeführt. Vergleichbar mit den normalen und niedermolekularen Heparinen konnten die supersulfatierten GAG (GAG 6-8) die Expression von MHC und ICAM-1 sowohl in HUVEC als auch in PTEC nach IFN-γ-Stimulierung inhibieren. Im Gegensatz dazu konnten desulfatierte-N-acetylierte GAG (GAG 1-5) die MHC und ICAM-1 Expression in diesen Zellen nach IFN-γ-Stimulierung (Figur 4a-c und 5a-c) nicht beeinflussen. Es zeigte sich eine klare Tendenz, daß supersulfatierte GAG deutlich effektiver in der Hemmung waren als normale und niedermolekulare Heparine. Dies war ausgeprägter bei PTEC Kulturen (Figur 5a) . Weitere Dosis-abhängige Versuche mit niedermolekularen Heparinen und GAG 6-8 und mit PTEC-Zellen nach Stimulation mit 10 ng/ml IFN-γ zeigten, daß durch die Zugabe von GAG 6-8 in Konzentrationen von 0,03 mg/ml zu IFN-γ stimulierten Kulturen die MHC und ICAM-1 Expression signifikant inhibiert (p < 0,05) werden konnte. Heparin zeigte unter diesen Bedingungen keine signifikanten Einfluß auf die MHC Klasse I und II Expression. ICAM-1 wurde unter diesen Bedingungen ebenfalls durch Heparin inhibiert; allerdings deutlich geringer als durch supersulfatierte GAG (Figur 6a-c) . Diese Ergebnisse zeigten deutlich, daß supersulfatierte GAG effektiver in der Inhibierung der MHC und ICAM-1 Expression sind als vergleichbares Heparin.
Zur Untersuchung ob der Sulfatierungsgrad der Glykosaminoglykane einen wichtigen Einfluß auf die inhibierende Wirkung der GAG auf die MHC und ICAM-1 Expression nach IFN-γ Stimulation hat, wurden PTEC-Zellen in Gegenwart von NaC103 inkubiert. Dadurch sollte die Sulfatierung von HSPG blockiert werden. Als Kontrolle wurden die Zellen mit äquimolare Konzentrationen NaCl behandelt. Anschließend wurden beide Ansätze mit IFN-γ in Konzentrationen von 0 bis 10 ng/ml stimuliert. Obwohl IFN-γ noch in der Lage war die MHC und ICAM-1 Expression in den NaC103 behandelten PTEC-Zellen zu modulieren, war diese Modulation jedoch im Vergleich zu den NaCl behandelten Zellen deutlich geringer (siehe Figur 7a-c) . Dies bedeutet, daß der Sulfatierungsgrad von HSPG eine wichtige Rolle bei der Modulation der Expression dieser Antigene durch IFN-γ spielt.
Zur Klärung ob GAGs für die IFN-γ Bindung sulfatiert sein müssen, wurden Bindungsstudien mit 125IFN-γ durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten, daß sowohl Heparin als auch supersulfatierte GAGs
125IFN-γ binden können. Dies können desulfatierte-N-acetylierte GAGs, die nur sehr wenig Sulfatgruppen aufweisen (GAG 3-5), nicht mehr. Desulfatierte-N-acetylierte GAG mit einem höheren Sulfatanteil (GAG 1 und 2) binden noch 125IFN-γ, jedoch deutlich weniger als Heparin oder supersulfatierte GAG. Die Bindung von 125IFN-γ an auf Nitrocellulosefilter gebundenes Heparin oder GAG kann durch einen 3000fachen Überschuß an Heparin in der Bindungslösung blockiert werden. Unter diesen Bedingungen erfolgte keine Bindung mehr an GAG 1 und 2, während die Bindung an Heparin, Fragmin und supersulfatierten GAG deutlich reduziert war (Figur 8) . Tab . 1 : Eigenschaften der verschiedenen in dieser Studie benutzten Heparine und Glykosaminoglykane*)
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*) Eigenschaften der verschiedenen in dieser Studie benutzten Heparine und Glykosaminoglykane: MP: Gesamtgewicht geteilt durch die Anzahl der Moleküle; Mw: Molekulargewicht, ND, nicht bestimmt, Flia and Fxa Aktivität wurde nach der von Handeland et al. (Assay of unfractionated and LMW heparin with chromogenic Substrates: twin methods with factor Xa and thrombin, Thrombosis Res. 1984, 35: 627) beschriebenen Methode mit dem ersten internationalen Standard für ein niedermolkulares Heparin bestimmt (eingeführt 1987, Code NO. 85/600).
Figur 1
Dosis-abhängige MHC Klasse I, Klasse II und ICAM-1 Expression in PTEC nach IFN-γ Stimulation. Die Zellen wurden über 72 Stunden mit verschiedenen IFN-γ Konzentrationen stimuliert. Danach wurde die Expression von MHC Klasse I (linke Skala), MHC Klasse II (rechte Skala) und ICAM-1 (linke Skala) mit dem FACS (= Durchflußzytometrie) bestimmt. Die Ergebnisse werden in der Figur als durchschnittliche Fluoreszenzintensität eines repräsentativen Experiments wiedergegeben. Figur 2
Effekt von Heparin auf die MHC und ICAM-1 Expression von IFN-γ stimulierten HUVEC-Zellen. IFN-γ stimulierte (100 ng/ml, für 72 Stunden, graue Balken) oder nicht stimulierte (weiße Balken) HUVEC wurden mit verschiedenen Heparinkonzentrationen während der Stimulierung inkubiert. Die MHC und ICAM-1 Expression wurde danach mit dem FACS bestimmt. Die Ergebnisse werden in der Figur als durchschnittliche Fluoreszenzintensität eines repräsentativen Experiments wiedergegeben.
Figur 3
Effekt von Heparin auf die MHC und ICAM-1 Expression von IFN-γ stimulierten PTEC-Zellen. IFN-γ stimulierte (10 ng/ml, für 72 Stunden) oder nicht stimulierte PTEC wurden mit verschiedenen Heparinkonzentrationen während der Stimulierung inkubiert. Die MHC und ICAM-1 Expression dreier replizierter Kulturen wurden danach mit dem FACS bestimmt. Fig. 3a zeigt die MHC Klasse I Expression. Fig. 3b zeigt die MHC Klasse II Expression. Fig. 3c zeigt die ICAM-1 Expression. Die Ergebnisse werden in der Figur als durchschnittliche Fluoreszenzintensität +/- 2 SD wiedergegeben.
Figur 4
Effekt verschiedener Heparine und Glykosaminoglykane auf die MHC und ICAM-1 Expression von IFN-γ stimulierten HUVEC-Zellen. IFN-γ stimulierte (10 ng/ml, für 72 Stunden, gefüllte Balken) oder nicht stimulierte (schraffierte Balken) HUVEC-Zellen wurden mit verschiedenen Heparinen oder Glykosaminoglykanen in einer Konzentrationen von 3 mg/ml während der Stimulationsperiode inkubiert. Die MHC und ICAM-1 Expression wurde danach mit dem FACS bestimmt. Fig. 4a zeigt die MHC Klasse I Expression. Fig. 4b zeigt die MHC Klasse II Expression. Fig. 4c zeigt die ICAM-1
Expression. Die Ergebnisse werden in der Figur als durchschnittliche Fluoreszenzintensität +/- 2 SD wiedergegeben.
Figur 5
Effekt verschiedener Heparine und Glykosaminoglykane auf die MHC und ICAM-1 Expression von IFN-γ stimulierten PTEC-Zellen. IFN-γ stimulierte (10 ng/ml, für 72 Stunden, gefüllte Balken) oder nicht stimulierte (schraffierte Balken) PTEC-Zellen wurden mit verschiedenen Heparinen oder Glykosaminoglykanen in einer Konzentrationen von 3 mg/ml während der Stimulationsperiode inkubiert. Die MHC und ICAM-1 Expression wurde danach mit dem FACS bestimmt. Fig.5a zeigt die MHC Klasse I Expression. Fig. 5b zeigt die MHC Klasse II Expression. Fig. 5c zeigt die ICAM-1 Expression. Die Ergebnisse werden in der Figur als durchschnittliche Fluoreszenzintensität eines repräsentativen Experiments wiedergegeben.
Figur 6
Vergleich von GAG 6-8 und Heparin in ihrer Wirkung die MHC und ICAM-1 Expression von IFN-γ stimulierten (10 ng/ml, für 72 Stunden) PTEC-Zellen zu inhibieren. Die PTEC-Zellen wurden mit verschiedenen Konzentrationen an GAG6 ( ) , GAG7 ( ) , GAG8 ( ) und Heparin ( ) während der Stimulationsperiode inkubiert. Die MHC und ICAM-1 Expression wurde danach mit dem FACS bestimmt. Die Expression dieser Antigene wurde auch in Abwesenheit von GAG (-GAG) oder in der Abwesenheit von IFN-γ (-IFN) bestimmt. Fig. 6a zeigt die MHC Klasse I Expression. Fig. 6b zeigt die MHC Klasse II Expression. Fig. 6c zeigt die ICAM-1 Expression. Die Ergebnisse werden in der Figur als durchschnittliche Fluoreszenzintensität +/- 2 SD wiedergegeben.
Figur 7
Wirkung von NaC103 auf den Umfang der durch IFN-γ bewirkten Stimulierung der MHC und ICAM-1 Expression in PTEC-Zellen. Die PTEC-Zellen waren einen Tag vor der IFN-γ Stimulierung mit 150 πiM NaC103 (gefüllte Balken) oder 150 mM NaCl (schraffierte Balken) als osmolare Kontrolle behandelt worden. Danach wurden die Zellen mit verschiedenen IFN-γ Konzentrationen für 72 Stunden in Gegen- wart der gleichen Konzentration von NaC103 oder NaCl stimuliert. Die MHC und ICAM-1 Expression von drei Replikakulturen wurden anschließend mit dem FACS bestimmt. Fig. 7a zeigt die MHC Klasse I Expression. Fig. 7b zeigt die MHC Klasse II Expression. Fig. 7c zeigt die ICAM-1 Expression. Die Ergebnisse werden in der Figur als durchschnittliche Fluoreszenzintensität +/- 2 SD wiedergegeben. Ein Stern bedeutet p < 0,05 und zwei Sterne p < 0,01 im Studenten T-Test.
Figur 8
Bindung von 125IFN-γ an Heparin, Fragmin und verschiedene andere Glykosaminoglykane. Heparin (Hep), Glykosaminoglykan (GAG) 1 bis 8 und Fragmin (Fragm) wurden auf einen Nitrocellulosefilter gebloted, der wie oben beschrieben hergestellt wurde. Die Nitro- cellulosestreifen wurden mit 125IFN-γ in Gegenwart oder Abwesenheit eines 3000 fachen Überschusses an Heparin inkubiert.

Claims

Patentansprüche
1. Organprotektive Lösungen enthaltend eine zum Erhalt der Zellintegrität und Zellvitalität wirksame Menge folgender Bestandteile:
a) 10 mg/1 bis 10.000 mg/1 polysulfatierte Glykosaminoglykane mit einem Schwefelgehalt von mindestens 12,5 Gew.-% b) 5 bis 100 g/1 Hydroxyethylstärke.
2. Organprotektive Lösung nach Anspruch 1 enthaltend
a) 10 mg/1 bis 10.000 mg/1 polysulfatierte Glykosaminoglykane mit einem Schwefelgehalt von mindestens 12, 5 Gew.-% b) 5 bis 100 g/1 Hydroxyethylstärke c) 5 bis 100 mmol Raffinose.
Organprotektive Lösung nach Anspruch 1 oder 2 enthaltend
a) 10 mg/1 bis 10.000 mg/1 polysulfatierte Glykosaminoglykane mit einem Schwefelgehalt von mindestens 12, 5 Gew. -% b) 5 bis 100 g/1 Hydroxyethylstärke c) 5 bis 100 mmol Raffinose d) 5 bis 40 mmol KH2P04 e) 1 bis 50 mmol MgSÜ4 f) 1 bis 50 mmol Adenosin g) 0,5 bis 5 mmol Allopurinol h) 1 bis 10 mmol Glutathion.
4. Verwendung von organprotektiven Lösungen nach den Ansprüchen 1 bis 3 zur Herstellung von pharmazeutischen Zubereitungen zur Inhibierung von γ-Interferon-induzierter Hochregulation von MHC Klasse I- und MHC Klasse II-Proteinen und ICAM-1.
5. Verwendung von organprotektiven Lösungen nach Anspruch 4 zur Behandlung und Prävention von Krankheiten, die mit der γ-Interferon-induzierter Hochregulation von MHC Klasse I- und MHC Klasse II-Proteinen und ICAM-1 assoziert sind.
Zeichn.
6. Verwendung von organprotektiven Lösungen nach Anspruch 4 oder 5 zur Behandlung von Transplantatpatienten.
7. Verwendung von organsprotektiven Lösungen nach Anspruch 4 oder 5 zum Schutz und zur Lagerung von Organen, die für
Transplantationen verwendet werden sollen.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103478118A (zh) * 2013-10-09 2014-01-01 山东省农业科学院畜牧兽医研究所 一种用于细胞培养的组织块的冷冻保存方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4727063A (en) * 1982-12-28 1988-02-23 Sclavo Depolymerized and supersulfated heparin, process for its preparation and pharmaceutical compositions
US4879283A (en) * 1985-10-03 1989-11-07 Wisconsin Alumni Research Foundation Solution for the preservation of organs
US4966894A (en) * 1987-12-24 1990-10-30 Basf Aktiengesellschaft Polysulfated heparins for treating diseases caused by retroviruses

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2478646A2 (fr) 1980-03-20 1981-09-25 Choay Sa Composition mucopolysaccharidique ayant une activite regulatrice de la coagulation, medicament la contenant et procede pour l'obtenir
US4948881A (en) 1982-12-28 1990-08-14 Sanofi Process for the depolymerization and sulfation of polysaccharides
FR2584728B1 (fr) * 1985-07-12 1987-11-20 Choay Sa Procede de sulfatation de glycosaminoglycanes et de leurs fragments
US4798824A (en) 1985-10-03 1989-01-17 Wisconsin Alumni Research Foundation Perfusate for the preservation of organs
IT1213384B (it) 1986-11-24 1989-12-20 Lab Derivati Organici Mediolan Processo per la preparazione controllata di gilcosaminoglicani a basso peso molecolare.
DE3882310T2 (de) 1987-09-18 1994-01-27 Eastman Kodak Co Polymerteilchen, auf die Gelatine aufgepfropft ist.
US5032679A (en) 1988-12-15 1991-07-16 Glycomed, Inc. Heparin fragments as inhibitors of smooth muscle cell proliferation
US5104787A (en) * 1990-03-05 1992-04-14 Lindstrom Richard L Method for apparatus for a defined serumfree medical solution useful for corneal preservation
IT1245907B (it) 1991-05-17 1994-10-25 Alfa Wassermann Spa Uso dei glicosaminoglicani nel trattamento della nefropatia diabetica e della neuropatia diabetica.
US5200398A (en) 1991-09-12 1993-04-06 Mount Sinai Hospital Corporation Composition for the preservation of organs comprising glucuronic acid or a physiologically tolerated salt or ester thereof

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4727063A (en) * 1982-12-28 1988-02-23 Sclavo Depolymerized and supersulfated heparin, process for its preparation and pharmaceutical compositions
US4879283A (en) * 1985-10-03 1989-11-07 Wisconsin Alumni Research Foundation Solution for the preservation of organs
US4966894A (en) * 1987-12-24 1990-10-30 Basf Aktiengesellschaft Polysulfated heparins for treating diseases caused by retroviruses

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DOUGLAS, M. S. (1) ET AL: "Examination of the mechanism by which heparin antagonizes activation of a model endothelium by interferon-gamma (IFN-gamma.", CLINICAL AND EXPERIMENTAL IMMUNOLOGY, (1997) VOL. 107, NO. 3, PP. 578-584., XP000913469 *
GRALINSKI, MICHAEL R. ET AL: "LU 51198, a highly sulfated, low-molecular-weight heparin derivative, prevents complement-mediated myocardial injury in the perfused rabbit heart.", JOURNAL OF PHARMACOLOGY AND EXPERIMENTAL THERAPEUTICS, (1997) VOL. 282, NO. 2, PP. 554-560., XP000913494 *
See also references of EP1143793A1 *
YARD, BENITO A. (1) ET AL: "Sulfation - dependent down - regulation of interferon-gamma-induced major histocompatibility complex class I and II and intercellular adhesion molecule-1 expression on tubular and endothelial cells by glycosaminoglycans.", TRANSPLANTATION (BALTIMORE), (NOV. 15, 1998) VOL. 66, NO. 9, PP. 1244-1250., XP000913518 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103478118A (zh) * 2013-10-09 2014-01-01 山东省农业科学院畜牧兽医研究所 一种用于细胞培养的组织块的冷冻保存方法
CN103478118B (zh) * 2013-10-09 2014-11-26 山东省农业科学院畜牧兽医研究所 一种用于细胞培养的组织块的冷冻保存方法

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