KR20010104329A

KR20010104329A - 기관보호 용액

Info

Publication number: KR20010104329A
Application number: KR1020017009105A
Authority: KR
Inventors: 포코 요트. 반데르보우데; 베니토 야르트; 디이터 헤르; 폴케르 라욱스; 크리슈티안 페터 로렌츠
Original assignee: 독터. 호르스트 하스칼, 잉에 린스; 크놀 게엠베하
Priority date: 1999-01-20
Filing date: 2000-01-14
Publication date: 2001-11-24
Also published as: CN1339944A; CZ20012603A3; TR200102093T2; HK1045238A1; HUP0105189A3; MXPA01007279A; BG105703A; ZA200105572B; HUP0105189A2; SK10232001A3; JP2004513060A; IL144237A0; CA2359482A1; HRP20010605A2

Abstract

본 발명은 다중황산화 글리코스아미노-글리칸을 함유하는 기관보호 용액에 관한 것이다.

Description

기관보호 용액{Organoprotective Solutions}

순환계 장애의 치료를 위한 제약 제제의 제조에 글리코스아미노-글리칸, 특히 헤파린 및 헤파리노이드를 사용하는 것은 잘 알려져 있다.

보다 최근에는, 다른 일련의 영양물에 글리코스아미노-글리칸을 사용하는 것이 기재된 바 있다. 즉, US 제5,236,910호는 당뇨성 신장병 및 신경 장애의 치료에 대한 글리코스아미노-글리칸의 용도를 특허 청구하고 있다. 이와 동일한 증상에 대한 저분자량의 헤파린의 용도는 반 데르 피즐(van der Pijl) 등에 의해 설명된 바 있다(J Americ Soc Nephrol, 1997, 8: 456-462).

US 제5,032,679호는 평활근 세포의 증식 및 관련 질병의 억제를 위한 글리코스아미노-글리칸의 용도를 특허청구하고 있다.

US 제4,966,894호에서는 레트로 바이러스로 인한 질병을 치료하기 위한 다중황산화 헤파린이 특허청구되어 있다.

그랄린스키(Gralinski) 등은 다중황산화 헤파린의 보체계(complement system)의 조절을 설명한 바 있다.

더글라스(Douglas) 등은 문헌 [Clin Exp Immunol, (1997, 107: 578-584)]에서 헤파린, 헤파란 설페이트 또는 헤파린 유사 분자를 이용하여 인터페론 γ의 염증 촉진 효과를 길항작용하는 것을 연구한 바 있다. 헤파린은 인터페론 γ의 면역 효과에 영향을 미칠 수 있다.

기관이 이식되었을 때, 원치않는 거부 반응이 자주 발생한다. 이러한 거부 반응을 예방하기 위해, 여러가지 상이한 방법들이 시도되어 왔다. 따라서 가장 먼저, 제공자 및 수혜자의 조직 적합성 항원이 비교되어 왔다. 이러한 기관들은, 제공자 및 수혜자가 최대한 동일하거나 매우 유사한 조직 적합성 항원을 지닌 경우에만 이식된다.

그럼에도 불구하고, 원치않는 거부 반응이 끊임없이 발생하였다. 즉, 예를 들어, 관상 세포의 용해(lysis)를 수반하는 주효과를 지닌 T 림프구에 의해 동종MHC 항원이 인식되는 경우에 급성 신장 동종이식 거부 반응이 발생한다. 이는 추가로, 기관과 함께 이식된 제공자의 면역 세포로부터 기인한, 수혜자에 대한 강한 반응인 소위 "이식편 대 숙주 반응"을 수반한다. 세포독성 T 세포 및 항체는 숙주 유기체에 대항하여 형성된다.

이식 거부의 위험을 더욱 감소시키기 위하여, 기관들은 떼어낸 직후에 냉동되고 기관보호 용액 중에 저장된다. 또한, 수혜자는 수혜자의 면역 방어를 억제하는 약물을 투여받는다.

문헌에, 모든 시리즈의 기관보호 용액이 기재된 바 있다. 즉, 콜린스(Collins) 등은 기관 보존용 세포내 전해질 용액을 설명하였다(Lancet, vol 2, 1969: 1219). 색스(Sacks) SA는 삼투압적 안정화 효과를 갖는 용액을 설명하였다(Lancet, vol 1, 1973: 1024). ATP-MgCl₂, AMP-MgCl₂및 이노신이 상기 용액에 적합한 작용물로 기재된 바 있다(Siegel, NJ 등, Am J Physiol, 254: F530, 1983; Belzer 등, Transpl Proc 16: 161, 1984). US 제4,920,004호는 만니톨, 아데노신 및 ATP-MgCl₂를 함유하는 용액을 특허청구하고 있다. US 제4,798,824호 및 동 제4,873,230호는 히드록시-에틸 전분을 함유하는 기관보호 용액을 특허청구하고 있다. US 제4,879,283호에는 KH₂PO₄, MgSO₄, 아데노신, 알로푸리놀, 라피노스 및 히드록시-에틸 셀룰로오스를 함유하는 용액이 특허청구되어 있다. 이 용액은 유니버스티 오브 위스콘신(University of Wisconsin) 용액(=UW 용액)으로도 알려져 있다. 이 용액은 간, 신장 및 심장의 보존에 성공적인 것으로 기재되어 있다(Jamieson 등, Transplantation, vol 46, 1988: 517; Ploeg 등, Transplantation, vol 46, 1988: 191; 및 Wicomb WN, Transplantation, vol 47, 1988: 733). US 제5,200,398호에는, 이러한 보호 용액 중의 추가의 첨가제로서 글루쿠론산, 그의 염 및 에스테르가 기재되어 있다.

이식용 기관의 보호 및 원치않는 기관 거부의 억제는 성공하였지만, 추가의 개선사항이 여전히 요구된다.

본 발명은 MHC 군 I(MHC Class I), MHC 군 II(MHC Class II) 단백질 및 ICAM 1의 인터페론 γ-유도 상향 조절(up-regulation) 억제용 제약 제제의 제조에, 황 함량이 12.5% 이상인 다중황산화 글리코스아미노-글리칸을 사용하는 것에 관한 것이다. 본 발명은 또한 다중황산화 글리코스아미노-글리칸을 함유하는 기관(器官)보호 용액 및 이식 기관의 생체외 보호 방법에 관한 것이다.

<도 1>

IFN γ로 자극한 후에 PTEC에서의 투여량 관련 MHC 군 I, 군 II 및 ICAM 1의 발현. 세포를 여러가지 농도의 IFN γ로 72 시간에 걸쳐 자극하였다. 그 후, MHC 군 I의 발현 (왼쪽 척도), MHC 군 II의 발현 (오른쪽 척도) 및 ICAM 1의 발현 (왼쪽 척도)을 FACS (=유동 세포계수법)으로 측정하였다. 측정 결과는 대표적인 실험의 평균 형광 강도로 도표에 나타내었다.

<도 2>

IFN γ 자극 HUVEC 세포의 MHC 및 ICAM 1의 발현에 대한 헤파린의 영향. IFN γ 자극 (100 ng/ml, 72 시간 동안, 짙은색 막대) 또는 비자극 (옅은색 막대) HUVEC를 여러 농도의 헤파린으로 자극하는 동안 항온처리하였다. 그 후, MHC 및 ICAM 1 발현을 FACS로 측정하였다. 측정 결과는 대표적인 실험의 평균 형광 강도로 도표에 나타내었다.

<도 3>

IFN γ 자극 PTEC 세포의 MHC 및 ICAM 1의 발현에 대한 헤파린의 영향. IFNγ 자극 (10 ng/ml, 72 시간 동안) 또는 비자극 PTEC를 여러 농도의 헤파린으로 자극하는 동안 항온처리하였다. 그 후, 3 종의 복제된 배양물의 MHC 및 ICAM 1의 발현을 FACS로 측정하였다. 도 3a는 MHC 군 I의 발현을 나타내었다. 도 3b는 MHC 군 II의 발현을 나타내었다. 도 3c는 ICAM 1의 발현을 나타내었다. 측정 결과를 평균 형광 강도 +/- 2 SD로 도표에 나타내었다.

<도 4>

IFN γ자극 세포의 MHC 및 ICAM 1 의 발현에 대한 여러가지 헤파린 및 글리코스아미노-글리칸의 효과. IFN γ 자극 (10 ng/ml, 72 시간 동안, 충실(solid) 막대) 또는 비자극 (평행사선 막대) HUVEC 세포를, 자극하는 동안에 3 mg/ml 농도의 여러가지 헤파린 또는 글리코스아미노-글리칸과 함께 항온처리하였다. 그 후, MHC 및 ICAM 1의 발현을 FACS로 측정하였다. 도 4a는 MHC 군 I의 발현을 나타내고, 도 4b는 MHC 군 II의 발현을 나타내고, 도 4c는 ICAM 1의 발현을 나타내었다. 측정 결과는 평균 형광 강도 +/- 2 SD로 도표에 나타내었다.

<도 5>

IFN γ자극 PTEC 세포의 MHC 및 ICAM 1의 발현에 대한 여러가지 헤파린 및 글리코스아미노-글리칸의 효과. IFN γ 자극 (10 ng/ml, 72 시간 동안, 충실 막대) 또는 비자극 (평행사선 막대) PTEC 세포를, 자극하는 동안에 3 mg/ml 농도의 여러가지 헤파린 또는 글리코스아미노-글리칸과 함께 항온처리하였다. 그 후, MHC 및 ICAM 1의 발현을 FACS로 측정하였다. 도 5a는 MHC 군 I의 발현을 나타내고, 도 5b는 MHC 군 II의 발현을 나타내고, 도 5c는 ICAM 1의 발현을 나타내었다. 측정결과는 대표적인 실험의 평균 형광 강도로 도표에 나타내었다.

<도 6>

IFN γ자극 (10 ng/ml, 72 시간 동안) PTEC 세포의 MHC 및 ICAM 1의 발현 억제에 대한 GAG 6 내지 8 및 헤파린의 효과 비교. PTEC 세포를, 자극하는 동안에 여러 농도의 GAG 6 (가장 짙은 회색 막대), GAG 7 (충실 평행사선 막대), GAG 8 (성긴 평생사선 막대) 및 헤파린 (옅은 회색 막대)과 함께 항온처리하였다. 그 후, MHC 및 ICAM 1의 발현을 FACS로 측정하였다. 또한 이러한 항원의 발현을 GAG의 부재 (-GAG) 또는 IFN γ의 부재(-IFN)하에 측정하였다. 도 6a는 MHC 군 I의 발현을 나타내고, 도 6b는 MHC 군 II의 발현을 나타내고, 도 6c는 ICAM 1의 발현을 나타내었다. 측정 결과는 대표적인 실험의 평균 형광 강도 +/- 2 SD로 도표에 나타내었다.

<도 7>

IFN γ에 의해 초래된 PTEC 세포의 MHC 및 ICAM 1의 발현의 자극 정도에 대한 NaClO₃의 효과. IFN γ자극 하루 전에 PTEC 세포를 삼투압 조절용 NaClO₃(충실 막대) 150 mM 또는 NaCl (평행사선 막대) 150 mM로 처리하였다. 그 후, 세포를 동일한 농도의 NaClO₃또는 NaCl의 존재하에 여러 농도의 IFN γ로 72 시간 동안 자극하였다. 그 후, 3 종의 복제 배양물의 MHC 및 ICAM 1 발현을 FACS로 측정하였다. 도 7a는 MHC 군 I의 발현을 나타내고, 도 7b는 MHC 군 II의 발현을 나타내었다. 도 7c는 ICAM 1의 발현을 나타내었다. 측정 결과는 평균 형광 강도 +/- 2 SD로 도표에 나타내었다. 스튜던트 T 시험에서 1 개의 별표는 p<0.05를 나타내고 2 개의 별표는 p<0.01를 나타내었다.

<도 8>

헤파린, 프래그민 및 여러가지 다른 글리코스아미노-글리칸에 대한¹²⁵IFN γ의 결합. 상기 기재된 바와 같이 제조된 니트로셀룰로오스 필터상에 헤파린(Hep), 글리코스아미노-글리칸 (GAG) 1 내지 8 및 프래그민 (Fragm)을 얼룩지게 하였다. 니트로셀룰로오스 띠를 3000 배 과량의 헤파린의 존재 또는 부재하에¹²⁵IFN γ과 함께 항온처리하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 기관 거부의 위험을 더욱 감소시키는 것과, 이식 전과 그 과정에서 기관 보호와 관련된 추가의 개선사항 모두를 달성하는 것이다.

상기 목적은 MHC 군 I, MHC 군 II 단백질 및 ICAM 1의 인터페론 γ-유도 상향 조절을 억제하기 위한 제약 제제의 제조에, 황 함량이 12.5 (중량)% 이상인 다중황산화 글리코스아미노-글리칸을 사용함으로써 성취되었다.

본 발명은 또한 세포 보전성 및 생명력을 효과적으로 유지하기에 적합한 제약 제제를 위한, 황 함량이 12.5% 이상인 다중황산화 글리코스아미노-글리칸을 다량 함유하는 기관보호 용액에 관한 것이다.

본 발명에 따라 사용하기 위해 제조된 제약 제제(이 또한, 예를 들어 기관보호 용액을 포함함)는 상술한 화합물을 이들의 생리학적 활성 염 또는 에스테르 형태, 이들의 호변체 및(또는) 이성질체 형태의 유리 화합물, 또는 유리 화합물과 여러가지 염의 조합 형태로 함유할 수 있다. 생리학적으로 효과적인 적합한 염으로는, 예를 들어 Na, Ca 또는 Mg 염이 알려져 있다. 이와 마찬가지로, 디에틸아민, 트리에틸아민 또는 트리에탄올아민과 같은 유기 염기를 포함하는 염이 적합하다. 이러한 제약 제제는 유리하게는 1 종 이상의 유리 물질 또는 1 종 이상의 화합물을 염 또는 혼합물 형태로 함유할 수 있다.

본 발명에 따라서 사용되는 다중황산화 글리코스아미노-글리칸 (=뮤코-다당류)은 다양하게 연결된 이당류 단위들로 이루어진 음하전된 다당류 (=글리칸)이며, 이것은, 예를 들어 D 글루쿠론산 또는 L 이두론산과 같은, 소위 우론산 1 개 분자가 글루코스아민 또는 갈락코아민과 같은 아미노 당의 3 번째 또는 4 번째 위치에서 글리코사이드 결합되어 있다. 이당류내의 1 종 이상의 당은 산소 또는 질소 원자에 의해 결합될 수 있는 음하전된 카르복실레이트 또는 설페이트기를 포함한다. 글리코스아미노-글리칸은 황산 에스테르기 뿐만 아니라 우론산과 강한 산성 반응한다. 이러한 산성 반응기들의 일부는 천연으로 존재하지만, 예를 들어 화합물을 합성적으로 황산화시켜 본 발명에 요구되는 황산화도를 얻는 데 유용하다. 황산화 방법으로는 예를 들어, 황산 및 황-염소산을 사용한 황산화(US 제4,727,063호, 동 제4,948,881호), 피리딘 중의 황-염소산을 사용한 황산화(Wolfrom 등, J Am Chem Soc, 1953, 75, 1519) 또는 질산을 사용한 황산화(Shively 등, Biochemistry, vol 15, no 18, 1976: 3932)가 문헌에 기재되어 있다. 추가의 방법은 당업계의 숙련자들에게 잘 공지되어 있다. 황산화의 예로는 헤파린, 헤파란 설페이트, 케라탄 설페이트, 더마탄 설페이트, 콘드로이틴 또는 콘드로이틴 살페이트와 같은 천연 글리코스아미노-글리칸을 사용하는 것이 있다. 헤파란 설페이트의 구조는, 헤파린에 비해 보다 적은 N 및 O 설페이트기 및 보다 많은 n 아세틸기를 지닌다는 차이점을 제외하고는 헤파린에 상응한다.

글리코스아미노-글리칸은 장관점막과 같은 동물 조직 또는 돼지 및 소의 귀로부터 용이하게 단리할 수 있다. 글리코스아미노-글리칸의 단리에 사용되는 조직은 예를 들어, 자가붕괴되고 알칼리를 사용하여 추출된다. 다음으로 상기 단백질을 방치하여 응고시킨 후, 예를 들어 이를 산성화시킴으로써 침전시킨다. 이 침전물을 에탄올 또는 아세톤과 같은 극성의 무수 용액에 투여한 후, 지방은 유기 용매를 사용한 추출에 의해 제거된다. 단백질 가수 분해 침지에 의해, 단백질은 궁극적으로 제거되어 글리코스아미노-글리칸이 회수된다. 챨스(Charles) 등의 문헌(Biochem J, vol 30, 1936: 1927-1933) 및 코이네(Coyne) E의 문헌(Chemistry and Biology of Heparin (Elsevier Publishers, North Holland, NY, Lunblad RL, ed 1981)에는, 예를 들어 헤파린의 단리 방법을 기재하고 있다.

천연 공급원으로부터 단리된 이러한 글리코스아미노-글리칸은 바람직하게는, 예를 들어 US 제5,013,724호 또는 상기에 기재된 바와 같이, 이들을 다중황산화시킴으로써 또다른 유도체로서 수득될 수 있다. 이러한 다중황산화에 의해, 글리코스아미노-글리칸은 6 내지 15 (중량)%의 황 함량을 나타낸다. 본 발명에 따른 용도 또는 제약 제제를 위한 용도로서, 황 함량이 12.5 (중량)% 이상인 다중황산화 글리코스아미노-글리칸이 선택된다. 바람직하게는, 이러한 다중황산화 글리코스아미노-글리칸의 황 함량은 13 내지 16 (중량)%, 바람직하게는 13 내지 15 (중량)%, 특히 바람직하게는 13.5 내지 14.5 (중량)%이다. 이러한 물질은 MHC 군 I, MHC 군 II 단백질 및 ICAM 1의 인터페론 γ-유도 상향 조절을 억제하는 데 적합한 제약 제제의 제조에 사용된다. 이러한 물질을 MHC 군 I, MHC 군 II 단백질 및 ICAM 1의 인터페론 γ-유도 상향 조절과 연관된 질병의 치료 및 예방에 생리학적 유효량으로 사용하는 것이 바람직하다. 상기 물질의 유도체 중 하나는, 사용되는 다중황산화 글리코스아미노-글리칸의 효과, 안정성 및 특히 신체로부터의 제거를 고려한 투약 특성을 개선시키는 화합물을 또한 포함한다.

평균 분자량 약 1000 내지 2000 달톤, 바람직하게는 1500 내지 9000 달톤,특히 2000 내지 9000 달톤, 임의로는 2000 내지 6000 달톤의 헤파린 및(또는) 더마탄 설페이트가 사용되어야 한다. 유리 산, 또는 생리학적으로 허용가능한 염기를 포함하는 염 또는 이러한 화합물로부터 제조된 혼합물 형태의 저분자량 다중황산화 헤파린 및(또는) 더마탄 설페이트가 특히 유리하다. 이러한 물질들은 약간의 항응고화 효과를 지니므로 본 발명에 따라 사용시 치료 및 예방에 적합하다. 다중황산화 글리코스아미노-글리칸의 염으로는, 예를 들어 나트륨, 칼슘 및 마그네슘 염이 바람직하다.

저분자량의 글리코스아미노-글리칸, 예를 들어 저분자량의 헤파린 및(또는) 더마탄 설페이트는 일련의 방법으로 제조될 수 있다. 아질산을 이용한 탈중합반응을 통해 저분자량의 헤파린을 제조하는 것은, 예를 들어 EP-B-0 037 319호 또는 문헌(Biochemistry, vol 15, 1976: 3932)에 기재되어 있다. 저분자량의 헤파린 또는 저분자량의 글리코스아미노-글리칸은 효소를 이용하여(Biochem J, vol 108, 1968: 647), 황산 및 황-염소산을 이용하여(FR 제2,538,404호, 동시적 황산화), 페리오데이트를 이용하거나 γ방사(EP-A-0 269 937호) 또는 초음파(Fuchs 등, Lebensm Unters Forsch, vol 198, 1994: 486-490)와 같은 물리적인 방법을 이용하여 제조될 수 있다.

본 발명에 따른 또다른 용도는 기관보호 용액이다. 제공자의 기관으로부터 떼어낸 후(즉, 생체외) 기관 저장은, 다중황산화 글리코스아미노-글리칸을 기관보호 용액에 적절히 투여하여 MHC 군 I, MHC 군 II 단백질 및 ICAM 1의 인터페론 γ-유도 상향 조절을 억제함으로써 더욱 향상될 수 있다. 바람직하게는, 기관은 당업계의 숙련자들에게 알려진 바와 같이 냉동시켜야 한다.

상기 기재된 일련의 용액은 문헌으로부터 알려져 있다. 이러한 용액은 일반적으로 염, 완충제, 기관을 삼투압적으로 안정화시키거나 산화를 예방하는 것으로 여겨지는 물질, 예컨대 당 또는 당 알콜, 단백질, 아미노산, 저급 카르복실산, 푸린, 피리미딘 또는 제약 제제를 포함한다. 이러한 물질의 예로는, 라피노스, 글루코스, 인산이수소칼륨, 인산수소이칼륨, 염화칼륨, 탄산수소칼륨, 탄산수소나트륨, 황산마그네슘, 염화마그네슘, 아데노신, 알부민, 만니톨, 구연산염, 베라파밀, 알로푸리놀, 인슐린, 덱스메타손, 히드록시-에틸 전분, 글루아티온 또는 글루쿠론산을 들 수 있다.

기관보호 용액용으로 의도된 본 발명은, 기존에 비하여 보다 나은 조건에서의 기관 이식 또는 보다 오랜 기간의 기관 저장을 가능하게 하여 거부 반응을 감소시킬 수 있다.

기관 거부의 위험을 더욱 감소시키기 위하여, 다중황산화 글리코스아미노-글리칸을 이식 전의 이식 환자 또는 이식 제공자에게 가능한 경우, 경구 또는 비경구 투여할 수 있다. 환자의 수술 후에 이 물질로 치료하는 것 또한 가능하다.

다중황산화 글리코스아미노-글리칸은 기관보호 용액 또는 다른 제약 제제중에 10 mg/l 내지 10,000 mg/l, 바람직하게는 10 mg/l 내지 5000 mg/l, 더욱 바람직하게는 50 mg/l 내지 3000 mg/l, 가장 바람직하게는 100 mg/l 내지 3000 mg/l의 양으로 함유된다. 또한, 히드록시-에틸 전분을 함유하는 삼투압적으로 안정한 물질은 5 내지 100 g/l가 유리하다.

또다른 기관보호 용액의 조성으로, a) 황 12.5 (중량)% 이상, 히드록시-에틸 전분 5 내지 100 g/l 및 라피노스 5 내지 100 mmol을 포함하는 다중황산화 글리코스아미노-글리칸 10 mg/l 내지 10,000 mg/l, 또는 b) 황 12.5 (중량)% 이상, 히드록시-에틸 전분 5 내지 100 g/l, 라피노스 5 내지 100 mmol, KH₂PO₄5 내지 40 mmol, MgSO₄1 내지 50 mmol, 아데노신 1 내지 50 mmol, 알로푸리놀 0.5 내지 5 mmol 또는 글루타티온 1 내지 10 mmol을 포함하는 다중황산화 글리코스아미노-글리칸 10 mg/l 내지 10,000 mg/l이 유리하다.

환자의 치료를 위해, 다중황산화 글리코스아미노-글리칸은 일반적인 공식 처리 물질과 함께 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 용도로 의도된 제약 제제는 경구 또는 비경구(피하, 정맥내, 근육내, 복막내)의 일반적인 경로로 투여될 수 있으며, 경구 또는 정맥내 투여가 바람직하다.

투여량은 환자의 나이, 상태 및 체중, 및 투여 형태에 따라 좌우된다.

글리코스아미노-글리칸은 매일, 체중 1 kg 당 0.1 내지 500 mg의 투여량으로 투여되는 것이 가장 바람직하다. 비경구 투여의 경우, 글리코스아미노-글리칸은 매일, 체중 1 kg 당 0.1 내지 30 mg의 투여량으로 투여되는 것이 가장 바람직하며, 경구 투여의 경우 매일, 체중 1 kg 당 0.2 내지 500 mg의 투여량으로 투여하는 것이 바람직하며, 이 때 1 회 또는 수회에 걸쳐 투여될 수 있다. 예를 들어, 1 종 이상의 저분자량 헤파린 및(또는) 그의 다중황산화 유도체 및(또는) 1 종 이상의저분자량 더마탄 설페이트 및(또는) 그의 다중황산화 유도체의 혼합물 또한 매일, 체중 1 kg 당 0.1 내지 30 mg의 투여량으로 비경구 투여되거나, 또는 경구 투여의 경우에 매일, 체중 1 kg 당 0.2 내지 500 mg의 투여량으로 투여된다.

기관 이식과 연관된 질병의 치료 및 예방을 위한 다중황산화 글리코스아미노-글리칸을 함유하는 제약 제제 중 하나는 원칙적으로 경구 또는 비경구 투여용의 일반적인 생약 투여 형태(고상 또는 액상), 예를 들어 정제, 코팅 정제, 캡슐제, 산제, 과립제, 당의정, 좌제, 용액제 또는 현탁제를 포함한다. 이들은 일반적인 방법으로 제조된다. 활성화제는 일반적인 생약 처리 물질, 예컨대 정제 결합제, 충전제, 방부제. 정제 방출제(explosive), 유동 조절 물질, 연화제, 습윤제, 분산제, 유화제, 용제, 지연제, 항산화제 및(또는) 추진용 기체와 함께 처리될 수 있다(H Sucker 등: Pharmazeutische Technologie, Thieme-Verlag, Stuttgart, 1991 참조). 이렇게 수득된 투여 형태는 일반적으로 활성화제를 0.1 중량% 내지 90 중량%의 양으로 함유한다.

정제, 코팅 정제, 당의정 및 경질 겔 캡슐제를 제조하는 경우, 다중황산화 글리코스아미노-글리칸은 또한 제약적으로 불활성인 무기 또는 유기 부형제와 함께 처리될 수 있다. 정제, 당의정 및 경질 겔 캡슐제를 위한 이러한 부형제로서 락토스, 담황색 전분 또는 그의 유도체, 활석, 스테아르산 또는 그의 염을 사용할 수 있다. 연질 겔 캡슐제의 경우, 식물성유, 왁스, 지방, 반고상 및 액상의 폴리올이 부형제로 적합하다.

용액제 및 시럽제의 제조에 적합한 부형제로는, 예를 들어 물, 폴리올, 수크로스, 전화당, 글루코스 등이 있다. 주사 용액제로는, 물, 알콜, 폴리올, 글리세린, 식물성유가 부형제로 적합하다. 좌제의 경우엔, 적합한 부형제로는 천연 또는 경화 오일, 왁스, 지방, 반액상 또는 액상 폴리올 등이 있다.

제약 제제는 방부제, 용제, 안정화제, 습윤제, 유화제, 감미료, 색소, 방향제, 삼투압 조절용 염, 완충제, 보호층 및(또는) 항산화제를 더 함유할 수 있다.

실험을 위하여, PTEC (= 근위 관상 상피세포) 및 HUVEC 세포 (=인간 배꼽정맥 내피세포)를 사용할 수 있다. PTEC 세포를 데트리삭(Detrisac) 등에 의해 기술된 방법(Kidney Int 25, 1984: 383)으로 배양하였다. PTEC 세포를 콜라겐(Collagen) I (시그마(Sigma), 미국 미주리주 세인트 루이스 소재) 및 송아지 태아 혈청 (= FCS, Gibco(깁코) BRL)으로 코팅된 조직 배양병에 정착시켰다. 배지는 둘베코(Dulbecco) 및 햄(Ham)의 F12 배지 (모두 깁코 BRL사제)에 따라 1:1의 비율로 변경된 "이글(Eagle) 배지"로 이루어졌으며, 이를 인슐린 (5 ㎍/ml), 트랜스페린 (5 ㎍/ml), 셀레늄 (5 ng/ml), 히드로코르티손 (36 ng/ml), 트리-이도티로닌 (4 pg/ml), 상피 성장 인자 (10 ng/ml) 및 페니실린/스트렙토마이신 [(5IU/ml, 5 ㎍/ml), 모두 시그마사제]로 보충하였다. 예비이식 조직 생체검사물,이식에 사용 불가한 동종이식체와 같은 다양한 공급원 및 일반 외과용 신장 샘플로부터 세포계를 얻었다. 이 실험을 단계 1 내지 4에 걸쳐 세포를 사용하여 수행하였다. PTEC는 상피막 항원(= EMA, 덴마크 소재의 다코 글로스트럽(Dako Glostrup)사제) 및 아데노신-디아미나아제-결합 단백질(고맙게도 네덜란드 소재의 마아스트리히트 대학 병원의 딘젠스(Dinjens) 박사에 의해 공급됨)을 사용한 양성 표지(positive marking)에 의해 특징지어졌다.

HUVEC 세포(= 인간 탯줄 정맥의 내피세포)를 제프(Jeffe) 등에 의해 기술된 방법(Culture of Human Endothelial Cells Derived from Umbilical Veins. Identification by Morphologic and Immunologic Criteria. J Clin Invest 52, 1973: 2745-2756)으로 새로운 탯줄로부터 회수하였다. 이 수순은 하기에 간략히 설명된다.

내피세포를 콜라겐아제 V (시그마, 미국 미주리주 세인트 루이스 소재, 37 ℃에서 20 분)를 이용한 침지에 의해 탯줄 정맥으로부터 단리하였다. 그 후, 정맥을 무균 배지로 세정하고 내피세포를 수집하였다. 배지는 15% 송아지 태아 혈청(= FCS)으로 보충된 메디엄(Medium) 199 (깁코 BRL), 내피세포 성장 인자 및 항생 페니실린 및 스트렙토마이신으로 구성되었다. 세포를 1% 젤라틴(시그마, 미국 미주리주 세인트루이스 소재)으로 코팅된 25 cm²병에서 배양시켰다.

모든 실험을 3 내지 6 번째 세포 배양 단계로부터의 세포를 사용하여 수행하였다. HUVEC 세포는 팩터(Factor) VIII 관련 항원 (다코(Dako), 영국 하이 위콤소재) 및 내피 표지 EN4 (CD31)을 이용한 세포의 양성 컬러링에 의해 특징지워졌다.

PTEC 및 HUVEC 세포의 융합 단일층을 트립신으로 처리하고, 24-웰 플레이트에 유포시켰다. 융합이 이루어졌을 때, 상이한 헤파린, 예를 들어 독일 멜성겐 소재의 브라운-멜성겐(Braun-Melsungen)사제 헤파린-브라운(Heparin-Braun(등록상표)), 독일 에를랑겐 소재의 프리머 카비(Pfrimmer Kabi)사제 저분자량의 헤파린 프래그민(Heparin Fragmin(등록상표)) 및 독일 루드빅샤펜 소재의 크놀 아게(Knoll AG)사제 저분자량의 변형된 헤파린에 함유된 다양한 농도의 상이한 헤파리노이드의 존재 또는 부재하에 72 시간 동안 IFN γ(시그마)로 세포들을 자극하였다.

일부 실험에서는, 세포-결합 헤파란 설페이트 프로테오글리칸(= HSPG)에 의해 배양 보존액이 황산화되는 것을 방지하기 위하여 배양 보존액에 염소산나트륨을 보충하였다. 이 염소산염을 50 내지 150 mM의 농도로 사용하였다. 이 염소산염을 IFN γ를 투여하기 24 시간 전에 배지에 첨가하였다. 염소산염의 존재하에 IFN γ를 이용한 자극을 수행하였다. 염소산나트륨을 삼투압 조절용으로 사용하였다. 배양 후의 배양 세포는 유동 세포계수를 위해 트립신 EDTA 처리로 회수하였다.

<유동 세포계수법>

다양한 침전물의 세포를 모은 후, 2 개의 시험관으로 나누어 담아 세척하였다. 세포 동위체에 결합하지 않고 RPE 및 FITC(덴마크 글로스트럽 소재의 다코사제)와 결합된 항체를 제1 시험관에 투여하였다. 이 침전물을 FACS 배후방사량의 음성 조절용으로 사용하였다. 제2 침전물 중의 세포를 제조사가 표기한 농도의 MHC 군 I (RPE 결합됨, W6/32, 다코사제), MHC 군 II (Cy-5 결합됨, CR3/43, 디아노바(Dianova)사제) 및 ICAM 1 (FITC 결합됨, 디아노바사제)에 대한 항체를 이용하여 표시하였다. 세포를 4 ℃에서 30 분 동안 항온처리한 후, 제2 침전물 중의 세포를 세척하고, 유동 세포계수법(FACScan, 벡톤 디킨슨(Becton Dickinson))으로 분석하였다. 10,000 개 이상의 양성 결과물을 분석하였다. 그 결과를 평균 형광 강도(=MFI)로 나타냈다.

<점-얼룩(dot-blot) 분석>

점-얼룩 분석을 위하여, 좁은 띠의 니트로-셀룰로오스 막을 준비하고, 여기에 헤파린 1 ㎕, 프래그민 및 여러 다른 N 탈황산화 N 아세틸화 글리코스아미노-글리칸 (=GAG, 모두 1 mg/l의 농도임)을 첨가하였다. 건조시킨 후, GAG 손실을 방지하기 위하여 상기 띠를 1% 글루타르알데히드 + 0.5% 세틸-피리디니멈 클로라이드로 고착시키고, 이어서 트리스 완충액으로 세척하였다. 마감된 띠를 마지막으로 코닥(Kodak) 필름에 노출시켰다.

<통계적 분석>

항체 발현 변화의 심각성은 스튜던트(Student) T 시험을 이용하여 측정하였다. 0.05 미만의 P 값은 심각한 것으로 간주하였다.

<결과>

MHC 군 I, II 및 ICAM 1 단백질의 발현을 투여량에 따른 IFN γ에 의해 PTEC중에서 조절하였다. MHC 군 I 및 ICAM 1 발현을 50 ng/ml 농도의 IFN γ에 의해 상향 조절하였다. 또한, 동일한 농도의 IFN γ를 사용하여, PTEC 중의 MHC 군 II 발현을 증가시켰다(도 1 참조). 배양 HUVEC 세포를 이용하여 상응하는 결과를 얻었다.

MHC 및 ICAM 1 발현을 조절하는 IFN γ의 능력에 대한 헤파린의 영향을 연구하기 위해, HUVEC 및 PTEC 배양물 모두를 헤파린의 존재 또는 부재하에 IFN γ로 자극하였다. 0.03 내지 3 mg/ml 농도의 헤파린을 HUVEC 배양물에 투여하여 100 ng/ml의 IFN γ에 의한 MHC 군 I 및 ICAM 1 단백질의 상향 조절을 완전히 방지하였다. 이와 마찬가지로, 헤파린을 투여하여 상기 세포들 중의 MHC 군 I 단백질의 유도를 억제하였다. IFN γ의 부재하에 헤파린 그자체로는 연구된 3 종 항원의 발현에 아무런 영향도 미치지 않았다(도 2).

PTEC를 이용한 비교 실험에서, IFN γ100 ng/ml으로 유도된 ICAM 1의 "상향 조절" 및 MHC 군 II 단백질의 유도는 헤파린에 의해 억제될 수 있다는 것이 나타났다. 그러나, IFN γ를 이용한 MHC 군 I 단백질의 상향 조절은 헤파린에 의해 영향을 받을 수 없었다. 무시할 만큼의 IFN γ농도에 의해 유도된 MHC 군 I 단백질의 상향 조절을 헤파린으로 차단할 수 있는지를 시험하기 위해, IFN γ으로 자극된 세포 10 ng/ml로 동일한 실험을 수행하였다. 3 mg/ml 농도의 헤파린 그 자체만으로는 IFN γ를 이용한 MHC 군 I 단백질의 상향 조절에 최저의 영향을 미치는 것으로 밝혀졌다(도 3a 참조). 이와 반대로, ICAM 1의 상향 조절 뿐만 아니라 MHC 군 II의 유도 모두는 0.03 mg/ml 헤파린에 의해 현저하게 억제되었다(p < 0.01)(도 3b및 3c 참조). IFN γ로 자극한 후의 MHC 및 ICAM 1 발현의 억제에 대한 헤파린 황산화도의 영향을 연구하기 위해, 여러가지의 헤파리노이드를 이 시험 시스템에서 조사하였다(표 1). 헤파리노이드는 IFN γ로 자극한 후의 MHC 군 I 및 ICAM 1을 억제하는 이들의 능력을 측정하기 위해 모두 3 mg/ml 농도로 시험하였다. MHC 군 II 시험은 10 ng/ml IFN γ로 자극하여 수행하였다. 정상의 저분자량 헤파린에 비하여, 초황산화 GAG (GAG 6 내지 8)는 IFN γ로 자극한 후에 PTEC 뿐만 아니라 HUVEC 모두에서 MHC 및 ICAM 1 발현을 억제하였다. 이와 반대로, 탈황산화 N 아세틸화 GAG (GAG 1 내지 5)는 γ로 자극한 후에 상기 세포내의 MHC 및 ICAM 1 발현에 영향을 미칠 수 없었다(도 4a 내지 4c 및 5a 내지 5c). 초황산화 GAG가 정상의 저분자량 헤파린에 비하여 억제에 명백히 더 효과적인 경향이 나타났다. 이러한 사실은 PTEC 배양물로 보다 더 확실해졌다(도 5a). 저분자량 헤파린 및 GAG 6 내지 8 및 10 ng/ml의 IFN γ로 자극한 후의 PTEC 세포를 이용한 투여량과 연관된 추가의 실험은, 0.03 mg/ml 농도의 GAG 6 내지 8을 IFN γ로 자극된 배양물에 투여시 MHC 및 ICAM 1 발현(p < 0.05)을 현저하게 억제함을 나타내었다. 이 조건하에서 헤파린은 MHC 군 I 및 II의 발현에 그다지 효과를 나타내지 않았으며, 마찬가지로 이 조건하에서 ICAM 1은 헤파린에 의해 억제되었지만, 초황산화 GAG에 의한 억제보다는 현저히 덜 억제되었다(도 6a 내지 6c). 이러한 결과는 MHC 및 ICAM 1의 발현의 억제에 있어서 초황산화 GAG가 이에 필적하는 헤파린에 비하여 더 효과적임을 명백하게 나타내었다.

IFN γ로 자극한 후의 MHC 및 ICAM 1 발현에 대한 GAG의 억제 효과에 글리코스아미노-글리칸의 황산화도가 중요한 영향을 미치는지를 연구하기 위해, PTEC 세포를 NaCl0₃의 존재하에 항온처리하였다. 이 방식으로, HSPG의 황산화는 차단되는 것으로 가정하였다. 대조군으로, 상기 세포를 등몰의 NaCl로 처리하였다. 그 후, 침전물 모두를 0 내지 10 ng/ml 농도의 IFN γ로 자극하였다. IFN γ는 여전히 NaClO₃로 처리된 PTEC 세포에서의 MHC 및 ICAM 1 발현을 조절하는 위치에 있었지만, 이러한 조절은 NaCl로 처리된 세포의 경우보다 상당히 적다(도 7a 내지 7c 참조). 이는 HSPG의 황산화도가 IFN γ를 이용한 상기 항원들의 발현을 조절하는 데 중요한 역할을 하는 것을 의미한다.

GAG가 IFN γ결합을 위해 황산화되어야 하는지를 밝히기 위해,¹²⁵IFN γ를 이용하여 결합 연구를 수행하였다. 연구 결과는 초황산화 GAG 뿐만 아니라 헤파린 모두가¹²⁵IFN γ를 결합할 수 있음을 나타내었다. 이는 약간의 설페이트기만을 나타내는 탈황산화 N 아세틸화 GAG (GAG 3 내지 5)에 의해서는 더이상 이루어질 수 없다. 보다 높은 비율의 설페이트기를 지닌 탈황산화 N 아세틸화 GAG (GAG 1 및 2)는 여전히¹²⁵IFN γ를 결합할 수 있지만, 헤파린 또는 초황산화 GAG에 비하여 현저히 덜하였다. 니트로셀룰로오스 필터에 결합된 GAG 또는 헤파린에 대한¹²⁵IFN γ의 결합은 결합 용액 중의 3000 배 과량의 헤파린에 의해 차단될 수 있었다. 이러한 조건하에, 헤파린, 프래그민 및 초황산화 GAG에 대한 결합이 현저하게 감소된 한편, GAG 1 및 2에 대한 결합은 더이상 발생하지 않았다(도 8).

본 연구에 사용된 여러가지 헤파린 및 글리코스아미노-글리칸*)의 특성
명칭	설페이트[%]	FXa[IU/mg]	FIIa[IU/mg]	M_p	M_r
탈황산화 N 아세틸화 헤파리노이드
GAG 1	7.3	0	0	3289	3802
GAG 2	6.4	0	0	2992	3548
GAG 3	5.5	0	0	2869	3382
GAG 4	3.4	0	0	2364	2800
GAG 5	1.2	0	0	1618	2074
황산화 헤파리노이드
GAG 6	14.2	26.1	39	7800	8360
GAG 7	14.2	21.5	30	6000	7700
GAG 8	13.7	25.8	28	5500	6300
상업적으로 이용가능한 헤파리노이드
브라운	ND	ND	ND	14,000	18,000
프래그민 P	ND			4900	6000
*) 본 연구에 사용된 여러가지 헤파린 및 글리코스아미노-글리칸의 특성:M_p: 분자수로 나 눈 총 중량; M_w분자량, ND-측정되지 않음.FIIa 및 FXa 활성은 한델란트 등에 의해 기술된 방법(Assay of Unfractionated and LMW Heparin with Chromogenic Substrates: Twin Methods with Factor Xa and Thrombin, Thrombosis Res 1984, 35: 627)에 따라 저분자량 헤파린에 대한 제1 국제 기준(1987년에 소개됨, 코드 넘버 85/600)으로 측정하였다.

Claims

a) 황 함량이 12.5 중량% 이상인 다중황산화 글리코스아미노-글리칸 10 mg/l 내지 10,000 mg/l, 및

b) 히드록시-에틸 전분 5 내지 100 g/l

를 세포 보전성 및 세포 생명력을 유지하는 데 효과적인 양으로 함유하는 기관(器官)보호 용액.
제1항에 있어서,

a) 황 함량이 12.5 중량% 이상인 다중황산화 글리코스아미노-글리칸 10 mg/l 내지 10,000 mg/l,

b) 히드록시-에틸 전분 5 내지 100 g/l, 및

c) 라피노스 5 내지 100 mmol

을 함유하는 기관보호 용액.
제1항 또는 제2항에 있어서,

a) 황 함량이 12.5 중량% 이상인 다중황산화 글리코스아미노-글리칸 10 mg/l 내지 10,000 mg/l,

b) 히드록시-에틸 전분 5 내지 100 g/l,

c) 라피노스 5 내지 100 mmol,

d) KH₂PO₄5 내지 40 mmol,

e) MgSO₄1 내지 50 mmol,

f) 아데노신 1 내지 50 mmol,

g) 알로푸리놀 0.5 내지 5 mmol, 및

h) 글루타티온 1 내지 10 mmol

을 함유하는 기관보호 용액.
MHC 군 I (MHC Class I) 및 MHC 군 II (MHC Class II) 단백질 및 ICAM 1의 γ인터페론 유도 상향 조절(up-regulation) 억제용 제약 제제를 제조하기 위한, 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 기관보호 용액의 용도.
제4항에 있어서, MHC 군 I 및 MHC 군 II 단백질 및 ICAM 1의 γ인터페론 유도 상향 조절과 연관된 질병의 치료 및 예방을 위한 기관보호 용액의 용도.
제4항 또는 제5항에 있어서, 이식 환자의 치료를 위한 기관보호 용액의 용도.
제4항 또는 제5항에 있어서, 이식에 사용될 기관의 보호 및 저장을 위한 기관보호 용액의 용도.