HRP20010605A2 - Organoprotective solutions - Google Patents

Organoprotective solutions Download PDF

Info

Publication number
HRP20010605A2
HRP20010605A2 HR20010605A HRP20010605A HRP20010605A2 HR P20010605 A2 HRP20010605 A2 HR P20010605A2 HR 20010605 A HR20010605 A HR 20010605A HR P20010605 A HRP20010605 A HR P20010605A HR P20010605 A2 HRP20010605 A2 HR P20010605A2
Authority
HR
Croatia
Prior art keywords
solutions
mhc class
icam
mmol
heparin
Prior art date
Application number
HR20010605A
Other languages
English (en)
Inventor
Fokko J Van Der Woude
Benito Yard
Dieter Herr
Volker Laux
Christian Peter Lorentz
Original Assignee
Knoll Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from DE29900874U external-priority patent/DE29900874U1/de
Application filed by Knoll Ag filed Critical Knoll Ag
Publication of HRP20010605A2 publication Critical patent/HRP20010605A2/hr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/02—Preservation of living parts
    • A01N1/0205—Chemical aspects
    • A01N1/021—Preservation or perfusion media, liquids, solids or gases used in the preservation of cells, tissue, organs or bodily fluids
    • A01N1/0226—Physiologically active agents, i.e. substances affecting physiological processes of cells and tissue to be preserved, e.g. anti-oxidants or nutrients
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
    • A61K31/737—Sulfated polysaccharides, e.g. chondroitin sulfate, dermatan sulfate

Description

Ovaj se izum odnosi na korištenje poli-sulfatiziranih glikozamino-glikana sa sadržajem sumpora od najmanje 12.5% težinskog udjela, u proizvodnji farmaceutskih pripravaka za inhibiranje interferonom γ-inducirane regulacije MHC Klase I, MHC Klase II proteina i ICAM 1. Izum se nadalje odnosi na otopine za zaštitu organa koje sadržavaju poli-sulfatizirane glikozamino-glikane i na proces ex vivo zaštite organa za transplantaciju.
Korištenje glikozamino-glikana, posebice heparina i heparinoida u proizvodnji farmaceutskih pripravaka za tretman cirkulatornih poremećaja je dobro poznato.
No u novije vrijeme, opisuje se i korištenje glikozamino-glikana za tretiranje nekih dodatnih bolesti. Tako US 5,236,910 navodi korištenje glikozamino-glikana u tretmanu dijabetske nefropatije i neuropatije. Korištenje niskomolekularnih heparina za istu indikaciju je opisano od strane van der Pijl et al (J Americ Soc Nephrol, 1997, 8:456-462).
US 5,032,679 ističe korištenje glikozamino-glikana za inhibiranje proliferacije glatkih mišićnih stanica i sličnih bolesti.
US 4,966,894 poli-sulfatizirani heparini se navode za tretman bolesti koje su prouzročili retro virusi.
Gralinski et al opisuje modulaciju komplementarnog sustava sa poli-sulfatiziranim heparinima.
U Clin Exp mmunol (1997, 107:578-584) ispitivana je antagonizacija inflamacijom promovirajućeg efekta interferona γ sa heparinom, heparin sulfatom ili molekulama nalik heparinu, što je izvedeno od strane Douglas et al. Heparin je u poziciji da utječe na imunogeni efekt interferona γ.
Kada organi bivaju transplantirani, reakcije neželjenog odbacivanja se često dešavaju. Da bi se prevenirale takve reakcije odbacivanja, poduzimaju se brojni različiti načini djelovanja. Najčešće se uspoređuju histokompatibilni antigeni donora i recipijenta. Samo oni organi dolaze u obzir za transplantaciju gdje su donor i recipijent maksimalno identični ili pak kada imaju veoma slične histokompatibilne antigene.
No unatoč rečenom, ipak se u velikom broju slučajeva još uvijek pojavljuje neželjeno odbacivanje organa. Tako se primjerice, akutno odbacivanje bubrežnog alotransplantata dešava gdje je prepoznavanje alo-MHC antigena od strane T limfocita glavni efekt koji dovodi do lize tubularnih stanica. Nadalje se sa sa tzv. «reakcija transplantat protiv stanice domaćina» dešava snažna reakcija na recipijenta od strane donorovih imunoloških stanica, koje bivaju transplantirane zajedno sa organom. Citotoksične T stanice i antitijela stvaraju se protiv organizma domaćina.
Kako bi se nadalje smanjio rizik odbacivanja transplantata, organi se pothlađuju nakon njihovog uklanjanja iz organizma donora i skladište s otopinom za zaštitu organa. Nadalje, recipijentu se daje medikament koji supresira reakciju njegovog imunološkog odgovora.
U literaturi se opisuje mnoštvo otopina za zaštitu organa- Tako Collins et al (Lancet, vol 2, 1969:1219) opisuje intracelularne elektrolitičke otopine za konzerviranje organa. Sacks SA (Lancet, vol 1, 1973: 1024) opisuje otopine koje imaju stabilizirajući osmotski efekt. ATP-MgCl2, AMP-MgCl2 i inozin se opisuju kao pogodni agensi u takovim otopinama (Siegel, NJ et al, Am J Physiol, 254: F530, 1983; Belzer et al, Transpl Proc 16:161, 1984). US 4,920,004 navodi otopinu koja sadržava manitol, adenozin i ATP-MgCl2. US 4,798,824 i US 4,873,230 navode otopinu za zaštitu organa koja sadržava hidroksi-etil škrob. U US 4,879,283 navodi se otopina koja sadržava KH2PO4, MgSO4, adenozin, alopurinol, rafinozu i hidroksi-etil celulozu. Također je poznata pod imenom Univerzitet Wisconsin otopina (=UV otopina). Ova se otopina opisuje za slučaj uspješne konzervacije jetre, bubrega i srca (Jamieson et al, Transplatation, vol 46, 1988: 517; Ploeg et al, Transplantation vol 46, 1988: 191; and Wicomb WN, Transplantation, vol. 47, 1988:733). U US 5,200,398 opisuje se dodatni aditiv sa glukuronskom kiselinom za takve zaštitne otopine, njegove soli i esteri.
Pored uspjeha koji je postignut u očuvanju organa za transplantaciju i supresiranju neželjenog odbacivanja organa, još uvijek ostaje potreba za daljnja poboljšanja i unaprjeđenja.
Tako je postavljen cilj daljnjeg poboljšavanja kako u zaštiti organa prije transplantacije, tako i za vrijeme transpalantacije, te i u smanjivanju opasnosti od odbacivanja organa.
Ovo je postignuto korištenjem poli-sulfatiziranih glikozamino-glikana sa sadržajem sumpora od najmanje 12.5% (težinskog udjela) za proizvodnju farmaceutskih pripravaka za inhibiranje interferon γ-inducirane regulacije MHC Klase I, MHC Klase II proteina i ICAM 1.
Izum se nadalje odnosi na otopine za zaštitu organa koje sadržavaju određenu količinu poli-sulfatiziranih glikozamino-glikana sa sadržajem sumpora od najmanje 12.5% za pogodne farmaceutske pripravke koji efikasno održavaju stanični integritet i vitalnost.
Farmaceutski pripravci proizvedeni za korištenje u kontekstu ovog izuma, koji također sadržavaju primjerice otopine za zaštitu organa, mogu sadržavati gore navedene supstance u obliku njihovih fiziološki aktivnih soli ili estera, njihove tautomerne i/ili izomerne oblike ili mogu pak biti u obliku kombinacije slobodnih supstanci i različitih soli. Kao pogodne fiziološki efikasne soli navode se primjerice soli Na, Ca, ili Mg. Također su pogodne soli sa organskim bazama kao što su dietilamin, trietilamin ili trietanolamin. Farmaceutski pripravci mogu također sadržavati barem jednu slobodnu supstancu ili barem jednu supstancu u obliku njezinih soli ili njihove smjese.
Poli-sulfatizirani glikozamino-glikani (= mukopolisaharidi) koji se koriste u kontekstu ovog izuma su negativno nabijeni polisaharidi (=glikani) koji se sastoje od različito povezanih jedinica disaharida u kojima primjerice, jedna molekula tzv. uronske kiseline, kao što je D glukuronska kiselina ili L iduronska kiselina, je glikozidnim vezom vezana na 3. ili 4. poziciju amino-šećeru nalik glukozamina ili galakoamina. Barem jedan od šećera u disaharidu posjeduje negativno nabijenu karboksilatnu ili sulfatnu grupu koja može biti vezana s pomoću atoma kisika ili dušika. Glikozamino-glikani reagiraju izrazito kiselo sa uronskim kiselinama i grupama estera sumporne kiseline. Ovakve kiselinski reaktivne grupe su djelomično već prisutne u prirodi no njihova je posebna vrijednost u tome da održavaju nivo sulfatizacije koja se inače u kontekstu ovog izuma izvodi sintetskom introdukcijom, kao što je primjerice sulfatizacija u supstanci. Kao metode sulfatizacije, u literaturi se navode kao primjeri, sulfatizacija sumpornom kiselinom i sumpor-klornom kiselinom (US 4,727,063; US 4,948,881), sulfatizacija sa sumpor-klornom kiselinom u piridinu (Wolfrom et al, J Am Chem Soc, 1953, 75 1519) ili sulfatizacija sa dušičastom kiselinom (Shively et al, Biochemistry, vol 15, no 18, 1976: 3932). Daljnje metode su dobro poznate ljudima iz struke. Primjeri su korištenje, za sulfatizaciju, prirodnih glikozamino-glikana kao što su heparin, heparan sulfat, keratan sulfat, dermatan sulfat, hondroitin ili hondroitin sulfat. Struktura heparan sulfata korespondira strukturi heparina uz razliku da sadržava manje N i O sulfatnih grupa i više n acetilnih grupa.
Glikozamino-glikani mogu jednostavno biti izolirani iz životinjskih tkiva kao što je intestinalna mukoza ili iz uha svinje i goveda. Tkivo korišteno za izolaciju glikozamino-glikana je primjerice autolizirano i ektrahirano s alkalnom supstancom. Slijedeće je da se protein ostavlja da koagulira i potom se precipitira, primjerice dodavanjem kiseline. Nakon uvođenja precipitata u polarnu ne-vodenu otopinu kao što je etanol ili aceton, masti bivaju uklonjene ekstrakcijom s organskim otapalom. Uz pomoć proteolitičke digestije, proteini bivaju odmah uklonjeni, a dobiveni glikozamino-glikani. Charles et al, (Biochem J, vol 30, 1936: 1927-1933) i Coyne E u Chemistry and Biology of Heparin (Elsevier Publishers, North Holland, NY, Lunblad RL, ed 1981) opisuju primjerice metode izolacije heparina.
Ovakvim glikozamino-glikanima izoliranim iz prirodnih tkiva, može se pridodati slijedeća derivacija tako da ih se poli-sulfatizira kao što je primjerice opisano u US 5,013,724 ili kao što je to gore navedeno. Uz pomoć takve polisulfatizacije, glikozamino-glikani pokazuju sadržaj sumpora od 6-15% (težinskog udjela). Za korištenje u kontekstu ovog izuma ili za farmaceutske pripravke, odabiru se poli-sulfatizirani glikozamino-glikani koji sadržavaju barem 12.5% (težinskog udjela) sumpora. Preferabilno, takvi poli-sulfatizirani glikozamino-glikani imaju sadržaj sumpora 13-16% (težinskog udjela), preferabilno 13-15% (težisnkog udjela), a u najboljem slučaju 13.5-14.5% (težinskog udjela). Takve se supstance koriste za proizvodnju farmaceutskih pripravaka koji su pogodni za inhibiranje interferon γ-inducirane regulacije MHC Klase I, MHC Klase II proteina i ICAM 1. Prednost se daje korištenju takvih supstanci u količini koja je fiziološki efikasna za tretman i prevenciju bolesti koje su povezane sa interferon γ-induciranom regulacijom MHC Klase I, MHC Klase II proteina i ICAM1. Između različitih derivata, također su sadržane supstance koje poboljšavaju svojstva aplikacije poli-sulfatiziranih glikozamino-glikana, korištenih poradi njihovog efekta, njihove stabilnosti i načina njihove eliminacije, posebice se misli na eliminaciju iz tijela.
Prvenstveno se trebaju koristiti, heparini i/ili dermatan sulfati s prosječnom molekularnom težinom od 1000 do 2000 Daltona, preferabilno 1500 do 9000 Daltona, u još boljem slučaju 2000 do 9000 Daltona, a optimalno je korištenje molekula težine 2000 i 6000 Daltona. Posebice se preferiraju nisko molekularni poli-sulfatizirani heparini i/ili dermatan sulfati u obliku slobodnih kiselina ili pak u obliku soli sa fiziološki tolerabilnim bazama ili smjesama takvih komponenti. Takve supstance imaju mali anti-koagulacijski efekt, te su tako posebice pogodne za tretman i prevenciju kada se koriste u kontekstu ovog izuma. Preferirane soli poli-sulfatiziranih glikozamino-glikana su primjerice, soli natrija, kalcija i magnezija.
Niskomolekularni glikozamino-glikani, kao npr. niskomolekularni heparini i/ili dermatan sulfati mogu biti proizvedeni naviše načina. Proizvodnja niskomolekularnih heparina preko de-polimerizacije uz pomoć dušične kiseline se opisuje primjerice u EP-B-0 0 37 319 ili u Biochemistry, vol 15, 1976: 3932. Proizvodnja niskomolekularnog heparina ili niskomolekularnih glikozamin-glikana može se također postići enzimima (Biochem J, vol. 108, 1968: 647), sa sumpornom kiselinom i sumpor-klornom kiselinom (FR No 2,538,404, simultana sulfatizacija), fizikalnim metodama kao što je γ radijacija (EP-A-0 269 937) ili ultra zvuk (Fuchs et al, Lebensm Unters Forsch, vol 198, 1994: 486-490).
Daljnje korištenje u kontekstu ovog izuma je u obliku otopina za zaštitu organa. Uz pomoć pogodnog načina aplikacije poli-sulfatiziranih glikozamino-glikana u otopine za zaštitu organa, skladištenje organa nakon njihovog uklanjanja iz organizma donora, primjerice ex vivo može nadalje biti poboljšano inhibiranjem interferon γ-inducirane regulacije MHC Klase I, MHC Klase II proteina i ICAM 1. Organi bi trebali biti pothlađeni, kao što je to dobro poznato ljudima iz struke.
Mnoge takve gore navedene otopine se opisuju u literaturi. Otopine općenito sadržavaju soli, pufere, supstance koje imaju zadatak da stabiliziraju organe osmotski ili koje bi trebale prevenirati oksidaciju šećera ili šećernih alkohola, proteina, amino kiselina, nižih karbiksiličnih kiselina, purina, pirimidina ili farmaceustkih agenasa. Kao primjeri za takve supstance, spominju se slijedeće supstance: rafinoza, glukoza, kalij dihidrogen fosfat, dikalij hidrogen fosfat, kalij klorid, kalij hidrogen karbonat, natrij hidrogen karbonat, magnezij sulfat, magnezij klorid, adenozin, albumin, manitol, citrat, verapamil, alopurinol, inzulin, deksmetazon, hidroksi etil škrob, glutation ili glukuronska kiselina.
Korištenje koje prvenstveno predviđa ovaj izum vodi ka mogućnosti transplantacije organa u boljim uvjetima njihovog skladištenja za duži period vremena, no što je to bilo prije uobičajeno. Tako se reakcija odbacivanja može reducirati na najmanju moguću mijeru.
Da bi se nadalje reducirao rizik odbacivanja organa, poli-sulfatizirani glikozamino-glikani bivaju unašani u organizam donora ili organizam pacijenta, a gdje je to moguće oralno ili parenteralno prije same transplantacije. Također je koristan post-operativni tretman spomenutim supstancama.
Poli-sulfatizirani glikozamino-glikani sadržani su u otopinama za zaštitu organa ili u druim farmaceustkim pripravcima u količinama od 10 mg/l do 10,000 mg/l, preferabilno u količinama od 10 mg/l do 5000 mg/l, u još boljem slučaju u količini 50 mg/l do 3000 mg/l, a u najboljem slučaju u količinama od 100 mg/l do 3000 mg/l. Nadalje, prednost je kada takve otopine sadržavaju 5 do 100 g/l osmotski stabilizirajuće supstance koja također podrazumijeva sadržaj hidroksi etil škroba.
Nadalje je pogodno ako otopine za zaštitu organa imaju slijedeći sastav:
a) 10 mg/l do 10,000 mg/l poli-sulfatiziranih glikozamino-glikana sa sadržajem sumpora od barem 12.5% (težinskog udjela), 5 do 100 g/l hidroksi etil škroba i 5 do 100 mmol rafinoze, ili
b) 10 mg/l do 10,000 mg/l poli-sulfatiziranih glikozamino-glikana sa sadržajem sumpora od barem 12.5% (težinskog udjela), 5 do 100 g/l hidroksi etil škroba i 5 do 40 mmol KH2PO4, 1 do 50 mmol MgSO4, 1 do 50 mmol adenozina, 0.5 do 5 mmol alopuronila ili 1 do 10 mmola glutationa.
Za tretman pacijenata, poli-sulfatizirani glikozamino-glikani mogu biti korišteni zajedno sa uobičajenom formulom za procesne supstance.
Farmaceutski pripravci namijenjeni za korištenje u kontekstu ovog izuma mogu biti aplicirani na uobičajen način, oralno ili parenteralno (subkutano, intravenozno, intramuskularno, intraperitonealno), s time da se preferira oralna ili intravenska aplikacija.
Doziranje će ovisiti o pacijentovoj starosti, kondiciji i tjelesnoj težini, te o tipu aplikacije.
Glikozamino-glikani se prvenstveno apliciraju u dozama od 0.1 do 500 mg/kg tjelesne težine dnevno. U slučaju parenteralne aplikacije, glikozamino-glikani se paliciraju u dozama od 0.1 do 30 mg/kg tjelesne težine dnevno, a u slučaju oralne aplikacije u dozama od 0.2 do 500 mg/kg tjelesne težine dnevno, gdje aplicirana doza može biti unešena u obliku jedne doze ili u nekoliko porcija. Također u slučaju smjesa, primjerice, barem jedna niskomolekularna molekula heparina i/ili njezin poli-sulfatizirani derivat i/ili barem jedan niskomolekularni dermatan sulfat i/ili njegov poli-sulfatizirani derivat bivaju aplicirani u dozama od 0.1 do 30 mg/kg tjelesne težine dnevno u slučaju parenteralne palikacije ili pak u dozama od 0.2 do 500 mg/kg tjelesne težine dnevno u slučaju oralne aplikacije.
Između farmaceutskih pripravaka koji sadržavaju poli-sulfatizirane glikozamino-glikane za tretman i prevenciju bolesti koje su povezane sa transplantacijom organa, jedan u principu sadržava uobičajeni galenski oblik aplikacije za oralnu ili parenteralnu aplikaciju, bio on kruti ili tekući, kao što su primjerice tablete, prevučene pilule, kapsule, prašci, granulati, dražeji, supozitorije, otopine ili suspenzije. Oni se proizvode na uobičajeni način. Aktivni sastojci mogu biti procesirani sa uobičajenim galenskim procesnim materijalima kao što su vezni materijali za tablete, punjenja, prezervativi, tabletni eksplozivi, supstance za regulaciju protoka, omekšivači, ovlaživači, disperzirajući agensi, emulzifikatori, otapala, retardanti, antioksidansi i/ili propelantski plinovi (cf H Sucker et al: Pharmazeutische Technologie, Thieme-Verlag, Stuttgart, 1991). Oblici aplikacije dobiveni na taj način sadržavaju aktivni sastojak u količini od 0.1 do 90% težinskog udjela.
U proizvodnji tableta, prevučenih pilula, dražeja i čvrstih gel kapsula, poli-sulfatizirani glikozamino-glikani mogu također biti procesirani sa farmaceutski inertnim, anorganskim ili organskim ekscipijentima. Kao takvi ekscipijenti za tablete, dražeje i čvrste gel kapsule, mogu se koristiti laktoza, kukuruzni škrob, ili njihovi derivati, talk, stearinska kiselina ili njihove soli. U slučaju mekanih gel kapsula, biljnih ulja, voskova, masti; polu čvrsti i tekući polioli su pogodni kao ekscipijenti.
Za proizvodnju otopina i sirupa, pogodni ekscipijenti su primjerice voda, polioli, sukroza, invertni šećer, glukoza itd. Za injekcijske otopine, kao pogodni ekscipijenti koristit će se voda, alkoholi, polioli, glicerin, biljna ulja. Za supozitorije će se korititi prirodna i čvrsta ulja, voskovi, masnoće, polutekući i tekući polioli itd.
Farmaceutski pripravci mogu nadalje sadržavati prezervative, agense za otapanje, stabilizatore, ovlaživače, emulzifikatore, zaslađivače, boju, aromatske agense, soli za modifikaciju osmotskog pritiska, pufere, zaštitne slojeve i/ili antioksidanse.
Primjeri
Za eksperimentalne svrhe, mogu se koristiti PTEC (= proksimalne tubularne epitelne stanice) i HUVEC stanice (= humane umbilikalne venske endotelne stanice). PTEC stanice se kultiviraju metodom koja je opisana od Detrisac et al (Kidney Int 25, 1984: 383). PTEC stanice se uvode u bočice za tkivnu kulturu koje su obložene sa kolagenom I (Sigma, St Louis MO) i fetalnim goveđim serumom (= FCS, Gibco BRL). Medij za kulturu koji se sastoji od «Eagle's Medium» koji je modificiran u skladu sa Dulbecco and Ham's F21 medijem (oba od Gibco BRL) u omjeru 1:1, koji je nadopunjen inzulinom (5 μg/ml), transferinom (5 μg/ml), selenom (5 ng/ml), hidrokortizonom (36 ng/ml), tri-idotironinom (4 pg/ml), epidermalnim faktorom rasta (10 ng/ml) i penicilin/streptomicinom [(5 IU/ml, 5 μg/ml) sve od Sigme]. Stanične linije su dobiven iz različitih izvora, primjerice biopsije tkiva prije transplantacije, alografta koji nisu iskoristivi za transplantate i iz normalnih kirurških uzoraka bubrega. Eksperimenti su izvedeni sa stanicama iz linija 1 do 4. PTEC su karakterizirane uz pomoć pozitivnog označavanja s epitelnim membranskim antigenom (= EMA, Dako Glostrup, Denmark), te sa adenozin-deaminaza-vezujućim proteinom (donirao Dr Dinjens, University Hospital, Maastricht, Netherlands).
HUVEC stanice (= endotelne stanice iz humane umbilikalne kordijalne vene) dobivene su iz svježih umbilikalnih žila metodom koja je opisana od strane Jaffe et al (Culture of Human Endothelial Cells Derived from Umbilical Veins. Identification by Morphologic and Immunologic Criteria. J Clin Invest 52, 1973: 2745-2756). Procedura se nadalje ukratko opisuje:
Endotelne stanice su izolirane iz umbilikalnih kordijalnih vena digestijom sa Kolagenazom V (Sigma, st Louis MO, 20 minuta na 37°C). Potom se vene ispiru sa sterilnim medijem kulture, te se sakupljaju endotelne stanice. Medij kulture se sastoji od Medium 199 (Gibco BRL) koji je nadopunjen sa 15% fetalnim goveđim serumom (= FCS), endotelnim faktorom staničnog rasta i antibioticima penicilinom i streptomicinom. Stanice bivaju kultivirane u 25 cm2 bočicama koje su obložene sa 1% želatinom (Sigma, st Louis MO).
Svi su eksperimenti izvedeni sa stanicama iz treće do šeste generacije stanične kulture. HUVEC stanice su karakterizirane pozitivnim bojanjem sa Faktorom VIII antigenom (Dako, High Wycombe, UK) i endotelnim markerom EN4 (CD31).
IFN γ stimulacija, tretman sa heparinom i natrij kloratom
Srasli mono-slojevi PTEC i HEVEC stanica se tretiraju sa tripsinom, te se potom rasađuju u ploče od 24 čašice. Kada je postignuto sraštavanje, stanice se stimuliraju sa IFN γ (Sigma, St Louis MO) tijekom 72 sata, u prisustvu ili odsustvu različitih heparinoida u različitim koncentracijama, sadržanim u različitim heparinima kao što su Heparin-Braun® od Braun-Melsungen, Melsungen, Germany, niskomolekularni Heparin Fragmin® P od Pfrimmer Kabi, Erlangen, Germany i modificirani niskomolekularni heparin od Knoll AG, Ludwigshafen, Germany.
U nekim eksperimentima, medij kulture je nadopunjen sa natrij kloratom kako bi se inhibirala sulfatizacija sa stanično vezanim heparan sulfat proteoglikanom (= HSPG). Klorat je korišten u koncentracijama od 50 do 150 mM. Dodaje s eu medij 24 sata prije aplikacije IFN γ. Stimulacija sa IFN γ se izvodi u prisustvu klorata. Natrij klorid se koristi kao osmotska kontrola. Kultivirane stanice se nakon kultivacije tretiraju tripsinom EDTA za protočnu citometriju
Protočna citometrija
Stanice iz različitih depozita se dovode u kontakt i potom razdvajaju u dvije test tube i ispiru. Antitijela koja se ne vežu na stanične izotope i koja su vezana sa RPE i FITC (od Dako, Glostrup, Denmark) i Cy-5 (od Dianowa, Hamburg, Germany) se apliciraju u prvu test tubu. Ovaj se depozit koristi kao negativna kontrola za FACS pozadinu. Stanice u drugom depozitu se označavaju s antitijelima koja su označena antitijelima protiv MHC Klase I (RPE konjugirana, W6/32, Dako), protiv MHC Klase II (Cy-5 konjugirana, CR3/43, ianova) i protiv ICAM 1 (FITC konjugirana, Dianova) u koncentracijama kako je to navedeno od strane proizvođača. Nakon inkubiranja stanica tijekom 30 minuta na 4°C, one se ispiru i analiziraju protočnom citometrijom (FACScan, Becton Dickinson). Najmanje 10,000 pozitivnih rezultata je analizirano. Rezultati se izražavaju kao intenzitet fluorescencije (= mean fluorescence intensity = MFI).
Dot-blot analize
Za izvođenje ovakvog tipa analize, pripremaju se tanke trake nitro-celulozne membrane u koje se aplicira 1 μg heparina, Fragmin i drugi različiti N de-sulfatizirani acetilizirani glikozamino-glikani (= GAGs, svi u koncentracijama od 1 mg/l). Nakon sušenja, trake se fiksiraju sa 1% glutaraldehidom + 0.5% cetil-piridinim klorida da bi se spriječili gubici GAG, te potom odmah slijedi ispiranje sa Tris puferom. Pripravljene trake se konačno eksponiraju na Kodak film.
Statističke analize
Značenje promjena u ekspresiji antigena se određuje uz pomoć Student's T testa. P vrijednosti <0.05 se uzimaju kao značajne.
Rezultati
Ekspresija MHC Klase I, MHC Klase II i ICAM 1 proteina je modulirana u PTEC sa IFN γ u ovisnosti o doziranju. Ekspresija MHC Klasa I i ICAM 1 proteina je regulirana koncentracijom od 50 ng/ml IFN γ. Nadalje, istom koncentracijom IFN γ, podiže se ekspresija MHC Klasa II u PTEC (pogledaj sliku 1). Korespondirajući rezultati su dobiveni sa kultiviranim HUVEC stanicama.
Da bi se izučavao utjecaj heparina na sposobnost IFN γ da modulira ekspresiju MHC i ICAM 1, stimuliraju se HUVEC i PTEC kulture sa IFN γ u prisustvu ili odsustvu heparina. Aplikacija heparina u HUVEC kulture u koncentracijama od 0.03 do 3 mg/ml u potpunosti sprječava regulaciju MHC Klase I i ICAM 1 proteina što je uzrokovano sa 100 ng/ml IFN γ. Tako, aplikacijom heparina i indukcija MHC Klase I proteina biva supresirana u stanicama. Heparin sam za sebe, u odsusutvu IFN γ nema utjecaja na ekspresiju tri proučavana antigena (Slika 2).
U usporedivim eksperimentima sa PTEC, također može biti pokazano kako sa 100 ng/ml IFN γ, inducirana regulacija ICAM 1 proteina i indukcija MHC Klase II proteina može biti inhibirana sa heparinom. Regulacija MHC Klase I proteina sa IFN γ, ne može međutim biti pod utjecajem djelovanja heparina. Da bi se ispitala činjenica, da li regulacija MHC Klase I proteina inducirana sa neznatnim IFN γ koncentracijama može biti blokirana sa heparinom, izvedeni su isti eksperimenti sa 10 ng/ml IFN γ-stimuliranim stanicama. Proizašlo je da heparin, sam po sebi, u koncentracijama od 3 mg/ml ima samo marginalni utjecaj na regulaciju MHC Klase I proteina sa IFN γ (pogledaj sliku 3a). Nasuprot tome, indukcija MHC Klase II i regulacija ICAM 1 proteina su značajno inhibirane sa 0.03 mg/ml heparina (p<0.01) (pogledaj slike 3b i c). Da bi se izučavao utjecaj stupnja slfatizacije heparina na inhibiciju ekspresije MHC i ICAM 1 nakon stimulacije sa IFN γ, ispitivani su različiti heparinoidi u okviru ovog test sustava (Tablica 1). Svi heparinoidi su testirani u koncentracijama od 3 mg/ml na njihovu sposobnost inhibicije MHC Klase I i ICAM 1 proteina nakon stimulacije sa IFN γ. Testovi MHC Klase II su izvedeni stimulacijom sa 10 ng/ml IFN γ. U usporedni sa normalnim i niskomolekularnim heparinima, super-sulfatizirani GAG (GAG 6-8) inhibira ekspresiju MHC i ICAM 1, kako u HUVEC, tako i u PTEC nakon stimulacije sa IFN γ. Nasuprot tome, desulfatizirani N acetilizirani GAG (GAG 1-5) ne može imati utjecaja na ekspresiju MHC i ICAM 1 nakon stimulacije sa IFN γ (slike 4a-c i 5a-c). Evidentna je jasna tendencija da su super-sulfatizirane GAG molekule znatno efikasnije u inhibiciji od normalnih i niskomolekularnih heparina. To je još jasnije prikazano sa PTEC kulturama (slika 5a). Daljnji pokusi sa različitim doziranjem sa niskomolekularnim heparinima, sa GAG 6-8 molekulama, te sa PTEC stanicama nakon stimulacije sa 10 ng/ml IFN γ, pokazali su da aplikacija GAG 6-8 u koncentracijama od 0.03 mg/ml u IFN γ stimulirane kulture, značajno inhibira ekspresiju MHC i ICAM 1 (p<0.05). Heparin pod ovim uvjetima nije pokazao značajan utjecaj na ekspresiju MHC Klase i i Klase II, dok je pod ovim uvjetima ICAM 1 bila inhibirana od strane heparina; no međutim u značajno manjoj mjeri nego što je to slučaj sa super-sulfatiziranim GAG (slika 6a-c). Ovi su rezultati jasno pokazali da su super-sulfatizirane molekule GAG mnogo efikasnije od kompariranih heparina u inhibiranju ekspresije MHC i ICAM 1 proteina.
Da bi se izučavala činjenica da li stupanj sulfatizacije glikozamino-glikana ima važan utjecaj na inhibirajući efekt od strane GAG na ekspresiju MHC i ICAM 1 proteina nakon stimulacije sa IFN γ, PTEC stanice su inkubirane u prisustvu NaClO3. Na taj se način očekivalo da sulfatizacija HSPG bude blokirana. Kao kontrola, stanice su tretirane ekvimolarnim koncentracijama NaCl. Tada su obje količine stimulirane sa IFN γ u koncentracijama od 0 do 10 ng/ml. Iako je IFN γ još uvijek bio u mogućnosti da modulira ekspresiju MHC i ICAM 1 proteina u PTEC stanicama tretiranim sa NaClO3, ipak je takva modulacija bila značajno manja nego u slučaju sa stanicama koje su bile tretirane sa NaCl (pogledaj slike 7a-c). To znači da stupanj sulfatizacije HSPG igra važnu ulogu u modulaciji ekspresije ovih antigena sa IFN γ.
Da bi se razjasnila činjenica, da li molekule GAG moraju biti sulfatizirane za IFN γ vezivanje, izvedeni su eksperimenti vezivanja sa 125IFN γ. Rezultati su pokazali da i heparin i super-sulfatizirane molekule GAG mogu vezivati 125IFN γ. To međutim nije moguće sa de-sulfatiziranim N acetiliziranim molekulama GAG koje pokazuju samo nekoliko sulfatnih grupa (GAG 3-5). De-sulfatizirane N acetilizirane molekule GAG sa većim sadržajem sulfata (GAG 1 i 2) još uvijek vežu 125IFN γ, no u značajno manjoj mjeri nego to čini heparin ili super-sulfatizirane molekule GAG. Vezivanje 125IFN γ na heparin ili GAG, koji su vezani na nitrocelulozne filtere, može biti blokirano sa 3000-strukim viškom heparina u otopini za vezivanje. Pod takvim uvjetima, ne dešava se vezivanje na GAG 1 i 2, dok vezivanje na heparin, Fragmin i super-sulfatizirane molekule GAG biva značajno reducirano (slika 8).
Tablica 1: Svojstva različitih heparina
i glikozamino-glikana*) koji su korišteni u ovoj studiji ;Ime Sulfat Fxa FIIa ;[%] [IU/mg] [IU/mg] Mp Mr ;De-sulfatizirani N ;acetilizirani ;heparinoidi ;GAG 1 7.3 0 0 3289 3802 ;GAG 2 6.4 0 0 2992 3548 ;GAG 3 5.5 0 0 2869 3382 ;GAG 4 3.4 0 0 2364 2800 ;GAG 5 1.2 0 0 1618 2074 ;Sulfatizirani ;Heparinoidi ;GAG 6 14.2 26.1 39 7800 8360 ;GAG 7 14.2 21.5 30 6000 7700 ;GAG 8 13.7 25.8 28 5500 6300 ;Komercijalno ;dostupni ;heparinoidi ;Braun ND ND ND 14,000 18,000 ;Fragmin P ND 160 70 4900 6000 ;*) Svojstva različitih heparina i glikozamin-glikana korištenih u ovoj studiji: Mp: ukupna težina podijeljena sa vrojem molekula; MW molekularna težina, ND – nije determinirano, FIIa i Fxa aktivnost je determinirana u skladu s metodom koja je opisana od Handeland et al (Assay of Unfractionated and LMW Heparin with Chromogenic Substrates: Twin Methods with Factor Xa and Thrombin, Thrombosis res 1984, 35:627) sa prvim internacionalnim standardom za niskomolekularni heparin (uvedeno 1987, broj 85/600).
Slika 1
O doziranju ovisna ekspresija MHC Klasa I, Klasa II i ICAM 1 u PTEC nakon stimulacije sa IFN γ. Ove su stanice stimulirane tijekom 72 sata sa različitim IFN γ koncentracijama. Tako je određena ekspresija MHC Klase I (lijeva skala), MHC Klase II (desna skala) i ICAM 1 (lijeva skala), determinirana sa FACS (= protočna citometrija). Rezultati su navedeni u slici kao intenzitet fluorescencije reprezentativnog eksperimenta.
Slika 2
Efekt heparina na ekspresiju MHC i ICAM 1 u HUVEC stanicama. IFN γ-stimulirane (100 ng/ml, tijekom 72 sata, siva linija) ili nestimulirane (bijela linij) HUVEC su inkubirane za vrijeme stimulacije sa različitim koncentracijama heparina. Ekspresija MHC i ICAM 1 je potom određena sa FACS. Rezultati su prikazani na slici kao intenzitet fluorescencije reprezentativnog eksperimenta.
Slika 3
Efekt heparina na ekspresiju MHC i ICAM 1 u PTEC stanicama koje su stimulirane sa IFN γ. IFN γ-stimulirane (10 ng/ml, tijekom 72 sata) ili nestimulirane PTEC su inkubirane za vrijeme stimulacije sa različitim koncentracijama heparina. Ekspresija MHC i ICAM 1 u tri replicirane kulture je tada određena sa FACS. Slika 3a prikazuje ekspresiju MHC Klase. Slika 3b prikazuje ekspresiju MHC Klase II. Slika 3c prikazuje ekspresiju ICAM 1. Rezultati su prikazani na slici kao intenzitet fluorescencije +/- 2 SD.
Slika 4
Efekti različitih heparina i glikozamino-glikana na ekspresiju MHC Klase I i ICAM 1 proteina u IFN γ-stimuliranim stanicama. IFN γ stimulirane HUVEC stanice (10 ng/ml, tijekom 72 sata, glatka pruga) i nestimulirane stanice (isprugana pruga) se inkubiraju sa različitim heparinima u koncentraciji od 3 mg/ml za vrijeme stimulacijskog perioda. Ekspresija MHC i ICAM 1 se potom određuje sa FACS. Slika 4a pokazuje ekspresiju MHC Klase I, slika 4b pokazuje ekspresiju MHC Klase II, a slika 4c pokazuje ekspresiju ICAM 1. Rezultati su prikazani kao intenzitet fluorescencije +/- 2 SD.
Slika 5
Efekti različitih heparina i glikozamino-glikana na ekspresiju MHC i ICAM 1 proteina u IFN γ-stimuliranim PTEC stanicama. IFN γ stimulirane PTEC stanice (10 ng/ml, tijekom 72 sata, glatka pruga) i nestimulirane stanice (isprugana pruga) se inkubiraju sa različitim heparinima ili glikozamino-glikanima u koncentraciji od 3 mg/ml za vrijeme stimulacijskog perioda. Ekspresija MHC i ICAM 1 se potom određuje sa FACS. Slika 5a pokazuje ekspresiju MHC Klase I, slika 5b pokazuje ekspresiju MHC Klase II, a slika 5c pokazuje ekspresiju ICAM 1. Rezultati su prikazani kao intenzitet fluorescencije reprezentativnog eksperimenta.
Slika 6
Usporedba GAG 6-8 i heparina s obzirom na njihov efekt inhibiranja ekspresije MHC i ICAM 1, IFN γ-stimuliranih (10 ng/ml, tijekom 72 sata) PTEC stanica. PTEC stanice se inkubiraju sa različitim koncentracijama GAG 6(), GAG 7(), GAG 8() i heparina() za vrijeme stimulacijskog perioda. Ekspresija MHC I ICAM 1 je potom određena sa FACS. Ekspresija ovih antigena je također determinirana u odsustvu GAG (-GAG) ili pak u odsustvu IFN γ (-IFN). Slika 6a prikazuje ekspresiju MHC I, slika 6b prikazuje ekspresiju MHC II i slika 6c prikazuje ekspresiju ICAM 1. Rezultati su prikazani slikovno kao intenzitet fluorescencije +/- 2 SD.
Slika 7
Efekt NaClO3 na stimulaciju ekspresije MHC i ICAM 1, u PTEC stanicama koje su stimulirane sa IFN γ. PTEC stanice su tretirane jedan dan prije IFN γ stimulacije sa 150 mM NaClO3 (glatka pruga) ili sa 150 mM NaCl (isprugana pruga) što je poslužilo kao osmolarna kontrola. Potom su stanice stimulirane tijekom 72 sata sa različitim koncentracijama IFN γ u prisusutvu iste koncentracije NaClO3 ili NaCl. Ekspresija MHC i ICAM 1 u tri replikantne kulture je potom određena sa FACS. Slika 7a prikazuje ekspresiju MHC I, slika 7b prikazuje ekspresiju MHC II i slika 7c prikazuje ekspresiju ICAM 1. Rezultati su prikazani slikovno kao intenzitet fluorescencije +/- 2 SD. Zvjezdica označava p<0.05, a dvije zvjezdice označavaju p<0.01 rezultate dobivene upotrebom Student T testa.
Slika 8
Vezivanje 125IFN γ na heparin, Fragmin i različite druge glikozamino-glikane. Heparin (Hep), glikozamino-glikan (GAG) 1 do 8 i Fragmin (Fragm) su podvrgnuti blottingu na nitroceluloznom fliteru koji je dobiven kako je to već naprijed opisano. Nitrocelulozne trake su inkubirane sa 125IFN γ u prisustvu ili odsustvu 3000-strukog viška heparina.

Claims (7)

1. Otopine za zaštitu organa, naznačene time, da sadržavaju određeni kvantitet slijedećih komponenti koje su efikasne za održavanje staničnog integriteta i vitalnosti: a) 10 mg/ml do 10,000 mg/ml poli-sulfatiziranih glikozamino-glikana sa sadržajem sumpora od najmanje 12.5% težinskog udjela b) 5 do 100 g/l hidroksi etil škroba
2. Otopine za zaštitu organa, u skladu sa zahtjevom 1, naznačene time, da sadržavaju a) 10 mg/l do 10,000 mg/l poli-sulfatiziranih glikozamino-glikana sa sadržajem sumpora od najmanje 12.5% težinskog udjela b) 5 do 100 g/l hidroksi etil škroba c) 5 do 100 mmol rafinoze
3. Otopine za zaštitu organa, u skladu sa zahtjevima 1 i 2, naznačene time, da sadržavaju a) 10 mg/l do 10,000 mg/l poli-sulfatiziranih glikozamino-glikana sa sadržajem sumpora od najmanje 12.5% težinskog udjela b) 5 do 100 g/l hidroksi etil škroba c) 5 do 100 mmol rafinoze d) 5 do 40 mmol KH2PO4 e) 1 do 50 mmol MgSO4 f) 1 do 50 mmol adenozina g) 0.5 do 5 mmol alopurinola h) 1 do 10 mmol glutationa
4. Primjena otopina za zaštitu organa, u skladu sa zahtjevima od 1 do 3, naznačena time, da služi u proizvodnji farmaceutskih pripravaka za inhibiranje γ-interferonom inducirane regulacije MHC Klase I, MHC Klase II i ICAM 1 proteina.
5. Primjena otopina za zaštitu organa, u skladu sa zahtjevom 4, naznačena time, da služi za tretman i prevenciju bolesti koje su povezane sa γ-interferon induciranom regulacijom MHC Klase I, MHC Klase II i ICAM l proteina. Crteži
6. Primjena otopina za zaštitu organa, u skladu sa zahtjevima 4 ili 5, naznačena time, da služi za tretman pacijenata na kojima se poduzima transplantacija.
7. Primjena otopina za zaštitu organa, u skladu sa zahtjevom 4, naznačena time, da služi za zaštitu i pohranjivanje organa koji će biti upotrijebljeni za transplantaciju.
HR20010605A 1999-01-20 2001-08-16 Organoprotective solutions HRP20010605A2 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE29900874U DE29900874U1 (de) 1999-01-20 1999-01-20 Organprotektive Lösungen
PCT/EP2000/000264 WO2000042842A1 (de) 1999-01-20 2000-01-14 Organprotektive lösungen

Publications (1)

Publication Number Publication Date
HRP20010605A2 true HRP20010605A2 (en) 2003-04-30

Family

ID=8068203

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HR20010605A HRP20010605A2 (en) 1999-01-20 2001-08-16 Organoprotective solutions

Country Status (14)

Country Link
JP (1) JP2004513060A (hr)
KR (1) KR20010104329A (hr)
CN (1) CN1339944A (hr)
BG (1) BG105703A (hr)
CA (1) CA2359482A1 (hr)
CZ (1) CZ20012603A3 (hr)
HK (1) HK1045238A1 (hr)
HR (1) HRP20010605A2 (hr)
HU (1) HUP0105189A3 (hr)
IL (1) IL144237A0 (hr)
MX (1) MXPA01007279A (hr)
SK (1) SK10232001A3 (hr)
TR (1) TR200102093T2 (hr)
ZA (1) ZA200105572B (hr)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111418581A (zh) * 2020-06-10 2020-07-17 上海伯豪生物技术有限公司 用于保持组织样本高细胞活性的保存液及保存方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN1339944A (zh) 2002-03-13
CZ20012603A3 (cs) 2003-12-17
TR200102093T2 (tr) 2001-11-21
HK1045238A1 (zh) 2002-11-22
KR20010104329A (ko) 2001-11-24
HUP0105189A3 (en) 2003-08-28
MXPA01007279A (es) 2002-06-04
BG105703A (en) 2002-05-31
ZA200105572B (en) 2003-01-06
HUP0105189A2 (hu) 2002-04-29
SK10232001A3 (sk) 2002-06-04
JP2004513060A (ja) 2004-04-30
IL144237A0 (en) 2002-05-23
CA2359482A1 (en) 2000-07-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Laurent et al. Hyaluronan 1
Guyton et al. Inhibition of rat arterial smooth muscle cell proliferation by heparin. In vivo studies with anticoagulant and nonanticoagulant heparin.
Clavien et al. Lymphocyte adherence in the reperfused rat liver: mechanisms and effects
US5643712A (en) Method for treating and rendering grafts nonthrombogenic and substantially nonimmunogenic using an extracellular matrix coating
CA1316828C (en) Compounds having anti-metastatic and/or anti-inflammatory activity
EP3260116B1 (en) Compositions and methods for stabilized polysaccharide formulations
JPH06507635A (ja) 病理学的過程の予防および／または治療用組成物
Hällgren et al. Accumulation of hyaluronan (hyaluronic acid) in myocardial interstitial tissue parallels development of transplantation edema in heart allografts in rats.
EP3100736A1 (en) Sirtuin inducer, tissue repairing agent, hepatocyte growth factor inducer, tissue homeostasis maintenance agent, and tlr4 agonist, having hyaluronic acid fragment as active ingredient
DE69838732T2 (de) Heparinähnliche verbindungen, ihre herstellung und verwendung zur verhinderung arterieller thrombose, verbunden mit vaskulärer verletzung und eingriffen
US20070197471A1 (en) Treatment of degenerative cartilage conditions in a mammal with Glycosidasc Inhibitors
Ganz et al. Does reperfusion extend necrosis? A study in a single territory of myocardial ischemia--half reperfused and half not reperfused.
CA2106558A1 (en) Blood preserving composition and method for preserving blood
EP0669827B1 (en) Compositions for the regulation of cytokine activity
JP2011516572A (ja) アクチン細胞骨格再編成及び細胞間ギャップ形成調節の方法
HRP20010605A2 (en) Organoprotective solutions
EP0979097A1 (en) Hgf for treating acute renal failure
US6313104B1 (en) Organoprotective solutions
EA001099B1 (ru) Инъекционное лекарственое средство &#34;цитофлавин&#34;, обладающее цитопротекторным действием
CN1210461A (zh) 对活性氧组份不良反应的治疗和预防
JOHNSSON et al. Recovery of hyaluronan during perfusion of small bowel transplantation reflects rejection
Read et al. The matrix components of the epiphyseal growth plate and articular cartilages from dogs treated with ammonium tetrathiomolybdate, a copper antagonist
RU2121323C1 (ru) Раствор для лечения заболеваний и повреждений роговицы &#34;кератан с&#34;
EP3307279B1 (en) Method for preventing transplant failure in a host.
Ernst Treatment modalities in experimentally induced acute liver failure

Legal Events

Date Code Title Description
A1OB Publication of a patent application
OBST Application withdrawn