CN1339944A - 器官保护溶液 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及含有聚硫酸化糖胺聚糖类的器官保护溶液。

Description

器官保护溶液
本发明涉及具有至少12.5％的硫含量的聚硫酸化糖胺聚糖类在制备用于抑制干扰素γ诱导的增量调节MHC I型、MHC II型蛋白质和ICAM1的药物制剂中的用途。本发明进一步涉及含有聚硫酸化糖胺聚糖类的器官保护溶液和保护体内移植器官的方法。
糖胺聚糖类且特别是肝素和类肝素在制备用于治疗循环障碍的药物制剂中的用途是众所周知的。
最近以来，已经描述了用于一系列其它疾病的糖胺聚糖类的用途。因此，US5,236,910中要求保护糖胺聚糖类在治疗糖尿病性肾病和神经病中的用途。van der Pijl等已经描述了低分子量肝素在相同适应症中的用途(J Americ Soc Nephrol，1997，8：456-462)。
US5,032,679中要求保护糖胺聚糖类在抑制平滑肌细胞增殖和相关疾病中的用途。
在US4,966,894中要求保护聚硫酸化肝素在治疗由逆转录病毒导致的疾病。
Gralinski等已经描述了用聚硫酸化肝素调制补体系统。
在Clin Exp Immunol(1997，107：578-584)中，Douglas等已经研究了用肝素、硫酸乙酰肝素或肝素样分子拮抗γ干扰素的炎症促进作用。肝素能够影响γ干扰素的免疫原性作用。
当移植器官时，不需要的排斥反应时常发生。为了预防这类排斥反应，已经采用了大量不同的途径。因此且最重要的是，已经比较了供体和受体的组织相容性抗原。仅将供体和受体最大程度相同或具有极为相似组织相容性抗原的那些器官进行移植。
尽管如此，但是不合需要的器官排斥仍然持续发生。例如，发生急性肾异源移植排斥，其中由T淋巴细胞识别异源-MHC抗原是需要裂解管状细胞的主要作用。进一步需要使用植入了器官的所谓“移植物抗宿主反应”即一种对来自供体免疫细胞的受体的强烈反应。形成细胞毒性T细胞和抗体以抵抗宿主生物体。
为了进一步降低移植排斥的危险，在将器官摘除后立即将其冷冻并在器官保护溶液中贮存。此外，给该受体服用抑制受体免疫防御的药物。
在文献中，已经描述了完整系列的器官保护溶液。因此，Collins等(Lancet，vol 2，1969：1219)描述了用于保存器官的胞内电解质溶液。Sacks SA(Lancet，vol 1，1973：1024)描述了具有渗透稳定作用的溶液。已经描述了ATP-MgCl2、AMP-MgCl2和肌苷在这类溶液中作为合适试剂(Siegel，NJ等，Am J Physiol，254：F530，1983；Belzer等，Transpl Proc 16：161，1984)。US4,920,004要求保护含有甘露糖醇、腺苷和ATP-MgCl2的溶液。US4,798,824和US4,873,230要求保护含有羟乙基淀粉的器官保护溶液。在US4,879,283中要求保护含有KH2PO4、MgSO4、腺苷、别嘌呤醇、棉子糖和羟乙基纤维素的溶液。它也称作威斯康星大学溶液(＝UW溶液)。据记载该溶液可用于成功保存肝、肾和心脏(Jamieson等，Transplantation，vol46，1988：517；Ploeg等Transplantation，vol 46，1988：191；和Wicomb WN，Transplantation，vol 47，1988：733)。在US5,200，398中描述了在这类保护溶液中使用葡糖醛酸、其盐和酯类作为其它的添加剂。
尽管在保护移植器官和抑制不合需要的器官排斥方面获得了成功，但是仍然存在对进一步对其进行改进的需求。
因此目的是在移植之前的器官保护方面和在移植过程中以及在进一步降低器官排斥的危险方面获得进一步改进。
通过使用制备用于抑制γ干扰素诱导的增量调节MHC I型、MHC II型蛋白质和ICAM 1的药物制剂的硫含量为至少12.5％(重量)的聚硫酸化糖胺聚糖类已经实现了这一目的。
本发明还涉及含有一定量的聚硫酸化糖胺聚糖的器官保护溶液，其中所述的聚硫酸化糖胺聚糖具有至少12.5％的硫含量，该器官保护溶液适于有效维持细胞完整性和细胞存活力的药物制剂。
例如，也包括器官保护溶液在内的为本发明用途所制备的药物制剂可以含有上述化合物作为其生理活性盐或酯类形式的游离化合物、其互变异构体和/或异构体形式或游离化合物及各种盐的组合形式。作为合适的生理上有效的盐值得注意的是：例如Na、Ca或Mg盐。同样，与类似于二乙胺、三乙胺或三乙醇胺这样的有机碱形成的盐是合适的。所述药物制剂可以有利地含有至少一种游离物质或至少一种其盐形式的化合物或它们的混合物。
用于本发明的聚硫酸化糖胺聚糖类(＝粘多糖类)是带负电荷的多糖类(＝聚糖类)，它们由二糖类的不同连接单元组成，例如，其中类似于D葡糖醛酸或L艾杜糖醛酸这样的所谓糖醛酸的一个分子以糖苷方式与类似于葡糖胺或半乳糖胺这样的氨基糖的第3或4位连接。在二糖中至少有一种糖带有可以通过氧原子或氮原子结合的带负电荷的羧酸酯或硫酸酯基团。与糖醛酸类以及与硫酸酯基团的糖胺聚糖类的反应是强酸性的。这些酸性反应基团实际上已经部分存在而是有价值的以便例如通过以合成方式将硫酸化引入化合物而达到本发明所需的硫酸化程度。作为硫酸化方法，文献中描述了作为实例的用硫酸和硫-氯酸的硫酸化(US4,727,063，US，4,948,881)、用硫-氯酸吡啶溶液的硫酸化(Wolfrom等，J Am Chem Soc，1953，75，1519)或用亚硝酸的硫酸化(Shively等，Biochemistry，vol 15 no 18，1976：3932)。其它的方法是本领域技术人员众所周知的。实例是类似于肝素、硫酸乙酰肝素、硫酸角质素、硫酸皮肤素、软骨素或硫酸软骨素这样的天然糖胺聚糖类的硫酸化用途。硫酸乙酰肝素的结构符合肝素的结构，与后者对比其差异在于它具有较少的N和O硫酸酯基和多个正乙酰基。
糖胺聚糖类可以容易地分离自诸如肠粘膜这样的动物组织或分离自猪和牛的耳。例如，使用于分离糖胺聚糖类的组织自溶并将其用强碱提取。接下来蛋白质产生凝结物且例如将其通过酸化沉淀。在施用所述沉淀的类似于乙醇或丙酮这样的极性非水溶液后，通过用有机溶剂提取而除去脂肪。通过蛋白水解消化最终将蛋白质除去而由此回收了糖胺聚糖类。例如，Charles等(Biochem J，vol 30，1936：1927-1933)和Coyne E在Chemistry and Biology of Heparin(Elsevier Publishers，North Holland，NY，Lunblad RL，ed 1981)中描述了用于分离肝素的方法。
优选可以对分离自然来源的这些糖胺聚糖类通过如在US5,013,724中作为实例所述或如上所述将其聚硫酸化而进行另一种衍生化。通过这类聚硫酸化，糖胺聚糖类由此具有的硫含量为6-15％(重量)。为了用于本发明或用于药物制剂，选择硫含量至少为12.5％(重量)的聚硫酸化糖胺聚糖类。优选这类聚硫酸化糖胺聚糖类具有的硫含量为13-16％(重量)、优选13-15％(重量)、特别良好的是13.5-14.5％(重量)。将这些物质用于制备适合于抑制γ干扰素诱导的增量调节MHC I型、MHC II型蛋白质和ICAM 1的药物制剂。优选的是使用生理有效量的这类物质用于治疗和预防与γ干扰素诱导的增量调节MHC I型、MHC II型蛋白质和ICAM 1相关的疾病。在这些物质的衍生物中，还包括可改进根据它们的作用、稳定性和尤其是它们从体内的消除能力而使用的聚硫酸糖胺聚糖类的应用特性的化合物。
根据优选情况，应使用具有约1000-2000道尔顿、优选1500-9000道尔顿且特别是2000-9000道尔顿而最佳是2000-6000道尔顿的平均分子量的肝素和/或硫酸皮肤素。特别有利的是游离酸形式或与生理上可耐受的碱类形成的盐形式的低分子量聚硫酸化肝素和/或硫酸皮肤素或由这类化合物制备的混合物。这类物质具有轻度的抗凝结作用且因此在用于本发明时特别适用于治疗和预防。例如，聚硫酸化糖胺聚糖类的优选的盐是钠、钙和镁盐。
可以通过一系列方法来制备低分子量糖胺聚糖类、例如低分子量肝素和/或硫酸皮肤素。例如，EP-B-0 037 319或Biochemistry，vol15，1976：3932中描述了通过使用亚硝酸解聚来生产低分子量肝素。还可以使用下列物质或方法完成低分子量肝素或低分子量糖胺聚糖类的制备：酶类(Biochem J，vol 108，1968：647)；硫酸和硫氯酸(FR No2,538,404，同时硫酸化)；过碘酸盐或诸如γ照射(EP-A-0 269937)或超声(Fuchs等，Lebensm Unters Forsch，vol 198，1994：486-490)这样的物理方法。
本发明的另外的用途是器官保护溶液。通过对器官保护溶液适当施用聚硫酸化糖胺聚糖类可以通过抑制γ干扰素诱导的增量调节MHC I型、MHC II型蛋白质和ICAM 1而进一步提高对从供体生物体中摘除后即来自体内的器官的贮存能力。作为本领域技术人员所公知的，优选应将所述器官冷冻。
如上所述的一系列这样的溶液从文献中已知。这些溶液一般含有盐、缓冲液、认为可以以渗透方式使器官稳定或认为可防止氧化的物质诸如糖或糖醇类、蛋白质、氨基酸、低级羧酸类、嘌呤类、嘧啶类或药物活性剂。作为这类物质的实例，可提及的是下列物质：棉子糖、葡萄糖、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、氯化钾、碳酸氢钾、碳酸氢钠、硫酸镁、氯化镁、腺苷、清蛋白、甘露糖醇、柠檬酸盐、维拉帕米、别嘌呤醇、胰岛素、地塞米松、羟乙基淀粉、谷胱甘肽或葡糖醛酸。
本发明预计的器官保护溶液的用途可使得以更好的条件移植器官或以比通常的时间期限长的时间期限贮存它们以便可以减少排斥反应成为可能。
为了进一步降低器官排斥的危害，如果可能，可以在移植前将聚硫酸化糖胺聚糖类经口服或非肠道方式给予移植患者或移植供体。在手术后用这些物质治疗患者也是切实可行的。
器官保护溶液或其它药物制剂中聚硫酸化糖胺聚糖类的含量为10mg/l-10,000mg/l、优选的含量为10mg/l-5000mg/l、更优选的含量为50mg/l-3000mg/l且最优选的含量为100mg/l-3000mg/l。另外，5-100g/l含有羟乙基淀粉的渗透稳定物质是有利的。
进一步有利的器官保护溶液具有下列组成：a)10mg/l-10,000mg/l的硫含量为至少12.5％(重量)的聚硫酸化糖胺聚糖类、5-100g/1羟乙基淀粉和5-100mmol棉子糖；或b)10mg/l-10,000mg/l的硫含量为至少12.5％(重量)的聚硫酸化糖胺聚糖类、5-100g/l羟乙基淀粉、5-100mmol棉子糖、5-40mmol KH2PO4、1-50mmol MgSO4、1-50mmol腺苷、0.5-5mmol别嘌呤醇或1-10mmol谷胱甘肽。
为了治疗患者，可以将聚硫酸化糖胺聚糖类与常用配方加工物质一起使用。
可以以通常的口服或非肠道方式(皮下、静脉内、肌内、腹膜内方式)给予用于本发明的药物制剂，其中优选口服或静脉内应用方式。
剂量取决于患者的年龄、疾病情况和体重以及应用类型。
糖胺聚糖类最有利的施用剂量为0.1-500mg/kg体重/天。就非肠道施用而言，所给予的糖胺聚糖类的最佳剂量为0.1-30mg/kg体重/天；就口服施用而言，剂量为0.2-500mg/kg体重/天，其中可以分一次剂量或几次剂量施用所给予的剂量。例如，还可以给予至少一种低分子量肝素和/或其聚硫酸化衍生物和/或至少一种低分子量硫酸皮肤素和/或其聚硫酸化衍生物的混合物，就非肠道应用而言，其剂量为0.1-30mg/kg体重/天；或就口服应用而言，其剂量为0.2-500mg/kg。
在含有用于治疗和预防与器官移植相关的疾病的聚硫酸化糖胺聚糖类的药物制剂中，主要包括用于口服或非肠道应用的常用盖仑应用剂型，无论它是固体还是液体，诸如片剂、包衣片、胶囊、粉剂、颗粒剂、锭剂、栓剂、溶液或悬浮液。可以按照常规方式制备它们。可以将活性剂与常用的盖仑加工物质一起进行加工，所述的盖仑加工物质如片剂粘合剂、填充剂、防腐剂、片剂崩解剂、流动调节物质、软化剂、增湿剂、分散剂、乳化剂、溶剂、阻滞剂、抗氧化剂和/或抛射剂气体(参见H Sucker等：Pharmazeutische Technologie，Thieme-Verlag，Stuttgart，1991)。由此获得的应用剂型含有通常为0.1％-90％(重量)量的活性剂。
为了生产片剂、包衣片、锭剂和硬胶囊，还可以将聚硫酸化糖胺聚糖类与药物惰性无机或有机赋形剂一起加工。作为这类用于片剂、包衣片、锭剂和硬胶囊的赋形剂，还可以使用乳糖、玉米淀粉或其衍生物、滑石、硬脂酸或其盐。就软胶囊而言，植物油、蜡类、脂肪、半固体和液体多元醇适合用作赋形剂。
为了制备溶液和糖浆，合适的赋形剂是：例如水、多元醇、蔗糖、转化糖、葡萄糖等。就注射用溶液而言，水、醇类、多元醇、甘油、植物油适合用作赋形剂。就栓剂而言，合适的赋形剂是天然或硬化油、蜡类、脂肪、半固体或液体多元醇等。
药物制剂可以另外含有防腐剂、溶剂、稳定剂、增湿剂、乳化剂、增甜剂、着色剂、芳香剂、用于改变渗透压的盐、缓冲剂、保护层和/或抗氧化剂。
实施例
为了进行实验，可以使用PTEC(＝近端小管上皮细胞)和HUVEC细胞(＝人脐静脉内皮细胞)。用Detrisac等所述的方法(Kidney Int25，1984：383)培养PTEC细胞。将PTEC细胞置于用胶原蛋白I(Sigma，St Louis MO)和胎牛血清(＝FCS，Gibco BRL)包被的组织培养瓶中。培养基由“Eagles氏培养基”组成，该培养基根据Dulbecco和Ham’s F12培养基(两种培养基均来自Gibco BRL)以1∶1的比例进行了改良，补充了胰岛素(5μg/ml)、运铁蛋白(5μg/ml)、硒(5ng/ml)、氢化可的松(36ng/ml)、三碘甲腺原氨酸(4pg/ml)、表皮生长因子(10ng/ml)和青霉素/链霉素[(5IU/ml，5μg/ml)，均来自Sigma]。该细胞系获自不同来源诸如移植前组织的活检、不能用于移植的异源移植和来自正常手术的肾样品。使用1-4代细胞进行本实验。通过用上皮膜抗原(＝EMA，Dako Glostrup，Denmark)和用腺苷-脱氨酶-结合蛋白(承蒙Dr Dinjens提供，University Hospital，Maastricht，Netherlands)进行阳性标记来表征PTEC。
使用Jaffe等所述的方法从新鲜的脐带中回收HUVEC细胞(＝人脐带静脉内皮细胞)(来源于脐静脉的人内皮细胞培养物。由形态学和免疫学标准鉴定。J Clin Invest 52，1973：2745-2756)。将该过程简述如下：
通过用胶原酶V消化(Sigma，St Louis MO，37℃下20分钟)从脐带静脉中分离内皮细胞。此后，用无菌培养基冲洗静脉并收集内皮细胞。该培养基由补充了15％胎牛血清(＝FCS)、内皮细胞生长因子和抗生素青霉素和链霉素的培养基199(Gibco BRL)组成。在用1％明胶(Sigma，St Louis MO)包被的25cm2瓶中培养细胞。
使用从第三至第六细胞培养物传代的细胞进行全部实验。通过用因子VIII-相关抗原(Dako，High Wycombe，UK)和内皮标记EN4(CD31)对HUVEC细胞进行阳性染色而表征它们。IFNγ刺激、肝素和氯酸钠处理
将融合单层PTEC和HUVEC细胞用胰蛋白酶处理并分散在24-孔平板中。当达到融合时，将该细胞在有或没有包含在不同肝素内的不同浓度的不同类肝素存在的情况下用IFNγ(Sigma，St Louis MO)刺激72小时，所述的不同肝素诸如：来自Braun-Melsungen，Melsungen，Germany的Hepairn-Braun；来自Pfrimmer Kabi，Erlangen，Germany的低分子量Hepairn FragminP；和来自Knoll AG，Ludwigshafen，Germany的修饰的低分子量肝素。
在某些实验中，将培养基用氯酸钠补充以便抑制使用细胞结合的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(＝HSPG)的硫酸化。氯酸盐的使用浓度为50-150mM。在给予IFNγ前24小时向培养基中加入氯酸盐。在有氯酸盐存在的情况下用IFNγ进行刺激。将氯化钠用作容积克分子的对照。在培养后用胰蛋白酶EDTA处理来回收培养的细胞用于流式细胞计量术。流式细胞计量术
将各种保藏物的细胞放在一起且随后分入两只试管并洗涤。对第一只试管给予不与细胞同位素结合且与RPE和FITC(来自Dako，Glostrup，Denmark)和Cy-5(来自Dianowa，Hamburg Germany)连接的抗体。将这种保藏物用作FACS背景的阴性对照。将第二种保藏物中的细胞用抗MHC I型(RPE缀合的，W6/32，Dako)、抗MHC(MCH)II型(Cy-5缀合的，CR3/43，Dianova)和抗ICAM 1(FITC缀合的，Dianova)的制造商指示浓度的抗体进行标记。在4℃下将细胞培养30分钟后，将后者洗涤并用流式细胞计量术(FACScan，BectonDickinson)分析。分析了至少10,000个阳性情况。将结果表示为平均荧光强度(＝平均荧光强度＝MFI)。斑点分析
为了进行斑点分析，制备硝化纤维素膜的窄条，对其施用1μl肝素、片段化蛋白和各种其它N脱硫酸化的N乙酰化糖胺聚糖类(＝GAGs，浓度均为1mg/l)。干燥后，将这些条状物用1％戊二醛+0.5％鲸蜡基氯化吡啶鎓固定以便防止GAG损失且随后用Tris缓冲液洗涤。最终使成品条状物在Kodak胶片上曝光。统计学分析
使用斯氏T检验测定抗原表达改变的显著性。将P值＜0.05看作具有显著性差异。结果
MHC I型、MHC II型和ICAM 1蛋白质在PTEC中的表达由IFNγ视剂量的不同来调制。MHC I型和ICAM 1的表达由浓度为50ng/ml的IFNγ来增量调节。此外，使用相同浓度的IFNγ，MHC II型在PTEC中的表达得到了提高(参见附图1)。使用培养的HUVEC细胞获得了相应的结果。
为了研究肝素对IFNγ调制MHC和ICAM 1表达能力的影响，在有或没有肝素存在的情况下用IFNγ刺激HUVEC和PTEC培养物。对HUVEC培养物施用浓度为0.03-3mg/ml的肝素完全防止了由100ng/ml IFNγ导致的MHC I型和ICAM 1蛋白质的增量调节。同样，通过施用肝素在这些细胞中抑制了MHC I型蛋白质的诱导作用。肝素本身在没有IFNγ存在的情况下对所研究的这三种抗原的表达没有影响(附图2)。
在与PTEC的比较实验中，同样证明使用100ng/ml的IFNγ诱导的ICAM 1的“增量调节”和MHC II型蛋白质的诱导作用可以被肝素所抑制。然而，使用肝素不会影响使用IFNγ对MHC I型蛋白质的增量调节。为了测试由可忽略IFNγ浓度所诱导的MHC I型蛋白质的增量调节是否可以被肝素所阻断，用10ng/ml IFNγ刺激的细胞进行了相同的实验。结果是3mg/ml浓度的肝素本身仅对使用IFNγ增量调节MHC I型具有最低限度的影响(参见附图3a)。相比之下，MHC II型的诱导作用和ICAM 1的增量调节均受到0.03mg/ml肝素的显著抑制(p＜0.01)(参见附图3b和c)。为了研究肝素硫酸化程度对用IFNγ刺激后抑制MHC和ICAM 1表达的影响，在测试系统中检验了不同的类肝素(表1)。均以3mg/ml的浓度测试了在用IFNγ刺激后类肝素抑制MHC I型和ICAM1的能力。使用10ng/ml IFNγ进行刺激的方法来进行MHC II型试验。与正常和低分子量肝素类似，超硫酸化GAG(GAG 6-8)抑制用IFNγ刺激后MHC和ICAM 1在HUVEC和PTEC中的表达。相比之下，脱硫酸化N乙酰化GAG(GAG 1-5)不会影响用IFNγ(γ)刺激后MHC和ICAM1在这些细胞中的表达(附图4a-c和5a-c)。超硫酸化GAGs在抑制作用方面显然比正常和低分子量肝素有效这一明显的倾向是显而易见的。这种情况在使用PTEC培养物时更为显著(附图5a)。在用10ng/mlIFNγ刺激后使用低分子量肝素和GAG 6-8以及使用PTEC细胞进行的进一步剂量相关试验表明对IFNγ刺激的培养物施用浓度为0.03mg/ml的GAG 6-8显著抑制MHC和ICAM 1的表达(p＜0.05)。肝素在这些条件下没有表现出对MHC I型和II型表达的显著影响，ICAM 1在这些条件下同样受到肝素的抑制；然而，这种情况明显低于超硫酸化GAG(附图6a-c)。这些结果清楚地表明超硫酸化GAGs在抑制MHC和ICAM 1表达方面比类似的肝素更为有效。
为了研究糖胺聚糖类的硫酸化程度对用IFNγ刺激后对MHC和ICAM1表达的抑制作用是否具有重要影响，在有NaClO3存在的情况下培养PTEC细胞。以这种方式，认为HSPG的硫酸化被阻断。作为对照，将细胞用等摩尔浓度的NaCl处理。然后用浓度为0-l0ng/ml的IFNγ刺激两种保藏物。尽管IFNγ仍然能够调制MHC和ICAM 1在用NaClO3处理的PTEC细胞中的表达，不过这类调制作用显著低于使用用NaCl处理的细胞产生的调制作用(参见附图7a-c)。这意味着HSPG的硫酸化程度在使用IFNγ调制这些抗原表达方面起重要作用。
为了澄清是否为IFNγ结合而必须使GAGs硫酸化，使用125IFNγ进行了结合研究。结果表明肝素和超硫酸化GAGs均可以结合125IFNγ。仅带有几个硫酸酯基的脱硫酸化N乙酰化GAGs(GAG 3-5)不再可能具有这种作用。具有大量硫酸酯基的脱硫酸化N乙酰化GAGs(GAGl和2)仍然结合125IFNγ，但明显低于肝素或超硫酸化GAGs。125IFNγ与和硝化纤维素滤膜结合的肝素或GAG的结合可以在结合溶液中被3000倍过量的肝素所阻断。在这样的条件下，未发生与GAGl和2的更多结合，同时与肝素、片段化蛋白和超硫酸化GAGs的结合明显减少(附图8)。
表1：在本研究中所用的各种肝素和糖胺聚糖类*)的特性
名称  硫酸因子xa  因子IIa                  Mp      Mr
       [％]       [IU/mg]     [IU/mg]脱硫酸化N乙酰
化类肝素
GAG1    7.3          0          0         3289      3802
GAG2    6.4          0          0         2992      3548
GAG3    5.5          0          0         2869      3382
GAG4    3.4          0          0         2364      2800
GAG5    1.2          0          0         1618      2074硫酸化类肝素
GAG6    14.2        26.1        39        7800      8360
GAG7    14.2        21.5        30        6000      7700
GAG8    13.7        25.8        28        5500      6300商购的类肝素
Braun   ND           ND         ND        14,000    18,000片段化蛋白P ND          160         70        4900      6000*)在本研究中所用的各种肝素和糖胺聚糖类的特性：Mp：总重除以分子数；Mw分子量；ND-未测定；按照Handeland等所述的方法(使用显色底物检测未分级分离的和LMW肝素：使用因子Xa和凝血酶的双重法，Thrombosis Res 1984，35：627)、F11a和Fxa活性是使用低分子量肝素的第一种国际标准(1987年引入，代码号为85/600)测定的。
附图1
用IFNγ刺激后与剂量相关的MHC I型、II型和ICAM 1在PTEC中的表达。使用不同浓度的IFNγ刺激这些细胞72小时以上。此后，用FACS(＝流式细胞仪)测定MHC I型(左刻度)、MHC II型(右刻度)和ICAM 1(左刻度)的表达情况。附图中给出的结果为有代表性实验的平均荧光强度。附图2
肝素对IFNγ刺激的HUVEC细胞的MHC和ICAM 1表达的作用。在用不同浓度肝素刺激的过程中培养IFNγ刺激的(100ng/ml，72小时，灰条)或未刺激的(白条)HUVEC。此后用FACS测定MHC和ICAM 1的表达情况。附图中给出的结果为有代表性实验的平均荧光强度。附图3
肝素对IFNγ刺激的PTEC细胞的MHC和ICAM 1表达的作用。在用不同浓度肝素刺激的过程中培养IFNγ刺激的(10ng/ml，72小时)或未刺激的PTEC。然后用FACS测定一式三份培养物中MHC和ICAM 1的表达情况。附图3a表示ICAM 1的表达情况。附图3b表示MHC II型的表达情况。附图3c表示ICAM 1的表达情况。附图中给出的结果为平均荧光强度+/-2SD。附图4
肝素和糖胺聚糖类对IFNγ刺激的细胞的MHC(MCH)和ICAM 1表达的作用。在刺激期限中用3mg/ml浓度的不同肝素或糖胺聚糖类培养IFNγ刺激的(10ng/ml，72小时，实心条)或未刺激的(阴影条)HUVEC细胞。此后用FACS测定MHC和ICAM 1的表达情况。附图4a表示MHCI型的表达情况；附图4b表示MHC II型的表达情况；且附图4c表示ICAM 1的表达情况。附图中给出的结果为平均荧光强度+/-2SD。附图5
不同肝素和糖胺聚糖类对IFNγ刺激的PTEC细胞的MHC和ICAM 1表达的作用。在刺激期限中用3mg/ml浓度的不同肝素或糖胺聚糖类培养IFNγ刺激的(10ng/ml，72小时，实心条)或未刺激的(阴影条)PTEC细胞。此后用FACS测定MHC和ICAM 1的表达情况。附图5a表示MHC I型的表达情况；附图5b表示MHC II型的表达情况；且附图5c表示ICAM 1的表达情况。附图中给出的结果为有代表性实验的平均荧光强度。附图6
GAG 6-8和肝素在其抑制IFNγ刺激的(10ng/ml，72小时)PTEC细胞的MHC和ICAM 1表达的作用中的比较。在刺激期限中用不同浓度的GAG6()、GAG7()、GAG8()和肝素()培养PTEC细胞。此后用FACS测定MHC和ICAM 1的表达情况。在没有GAG(-GAG)或没有IFNγ(-IFN)存在的情况下也测定了这些抗原的表达情况。附图6a表示MHC I型的表达情况；附图6b表示MHC II型的表达情况；且附图6c表示ICAM 1的表达情况。附图中给出的结果为平均荧光强度+/-2SD。附图7
NaClO3对由IFNγ引起的对PTEC细胞中MHC和ICAM 1表达的刺激程度的作用。在IFNγ刺激前1天用150mM NaClO3(实心条)或150mM NaCl(阴影条)处理PTEC细胞作为容积克分子对照。此后在有相同浓度的NaClO3或NaCl存在的情况下用不同浓度的IFNγ刺激细胞72小时。然后用FACS测定一式三份培养物中MHC和ICAM 1的表达情况。附图7a表示MHC I型的表达情况。附图7b表示MHC II型的表达情况。附图7c表示ICAM 1的表达情况。附图中给出的结果为平均荧光强度+/-2SD。在斯氏T检验中一个星号表示p＜0.05而两个星号表示p＜0.01。附图8
125IFNγ与肝素、片段化蛋白和各种其它糖胺聚糖类的结合。将肝素(Hep)、糖胺聚糖(GAG)1-8和片段化蛋白(Fragm)印迹在如上所述生产的硝化纤维素滤膜上。将硝化纤维素条在有或没有3000倍过量肝素的情况下用125IFNγ培养。

Claims (7)

1.含有一定量下列成分的用于有效维持细胞完整性和细胞存活力的器官保护溶液：
a)10mg/l-10,000mg/l的硫含量为至少12.5重量％的聚硫酸化糖胺聚糖类；
b)5-100g/l羟乙基淀粉。
2.根据权利要求1所述的器官保护溶液，它含有：
a)10mg/l-10,000mg/l的硫含量为至少12.5重量％的聚硫酸化糖胺聚糖类；
b)5-100g/l羟乙基淀粉；
c)5-100mmol棉子糖。
3.根据权利要求1和2所述的器官保护溶液，它含有：
a)10mg/l-10,000mg/l的硫含量为具有至少12.5重量％的聚硫酸化糖胺聚糖类；
b)5-100g/l羟乙基淀粉；
c)5-100mmol棉子糖；
d)5-40mmol KH2PO4；
e)1-50mmol MgSO4；
f)1-50mmol腺苷；
g)0.5-5mmol别嘌呤醇；
h)1-10mmol谷胱甘肽。
4.权利要求1-3所述的器官保护溶液在制备用于抑制γ干扰素诱导的增量调节MHC I型和MHC II型蛋白质和ICAM 1的药物制剂中的用途。
5.权利要求4所述的器官保护溶液在治疗和预防与γ干扰素诱导的增量调节 MHC I型和MHC II型蛋白质和ICAM 1相关的疾病中的用途。
6.权利要求4或权利要求5所述的器官保护溶液在治疗移植患者中的用途。
7.权利要求4或权利要求5所述的器官保护溶液在保护和贮存计划用于移植的器官中的用途。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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