CZ20012603A3 - Orgánové ochranné roztoky - Google Patents

Description

Přítomný vynález se týká použití polysulfatovaných glykosaminoglykanů s obsahem síry alespoň 12,5 % pro výrobu farmaceutických prostředků pro inhibici interferonem-γ indukované up-regulace proteinů třídy MHC I a MHC II a ICAM1. Přítomný vynález se dále týká orgánových ochranných roztoků, které obsahují polysulfatované glykosaminoglykany, a způsobů ochrany orgánových transplantátů ex vivo.

Dosavadní stav techniky

Použití glykosaminoglykanů a obzvláště pak heparinů a heparinoidů při výrobě farmaceutických prostředků pro léčení cirkulačních poruch je dobře známo.

Nedávno bylo popsáno použití glykosaminoglykanů pro léčení skupiny dalších chorob. US patent č. 5 236 910 popisuje použití glykosaminoglykanů při léčení diabetické nefropatie a neuropatie. Použití nízkomolekulárních heparinů pro stejnou indikaci bylo popsáno v publikaci autora van der Piji, J. Amer. Soc. Nephrol., 2' 456 až 462 (1997).

US patent č. 5 032 679 se týká použití glykosaminoglykanů pro inhibici proliferace buněk hladké svaloviny a s ní spojených onemocnění.

V US patentu č. 4 966 894 je popsáno použití polysulfatovaných heparinů pro léčení chorob zapříčiněných retroviry.

Gralínski a kol. popsal modulaci systému komplementu • · · ·

• · « • · β · polysulfatovanými hepariny.

V publikaci Clin. Exp. Immunol., 107, 578 až 584 (1997) se autor Douglas a kol. zabývá antagonistickým účinkem zánět-iniciujícího účinku interferonu-γ s heparinem, heparansulfatem nebo heparinu-podobnými molekulami. Heparin může ovlivnit imunogenní efekt interferonu-γ.

Při transplantacích orgánů jsou častým jevem nežádoucí rejekční reakce. Pro prevenci vzniku těchto rejekčních reakcí bylo vyvinuto množství různých postupů. Nejprve byly porovnávány histokompatibilní antigeny dárce a příjemce. Transplantují se pouze takové orgány, u kterých jsou dárce a příjemce maximálně identičtí, nebo jejichž antigeny jsou maximálně histokompatibilní.

Nicméně i přes toto vše stále dochází k nežádoucím rejekčním reakcím. Například k akutní rejekci ledvinového allogenního transplantátu dochází v tom případě, kdy jsou allogenní MHC antigeny rozpoznány T-lymfocyty, což vede k lýze tubulárních buněk. Dále může dojít k takzvané reakci graft versus host, což je silná reakce proti příjemci vycházející z dárcových imunitních buněk, které jsou transplantovány společně s orgánem. V tomto případě dochází k vytváření cytotoxických T buněk a protilátek proti organismu hostitele.

Pro další redukci rizika rejekce transplantátu se orgány po odběru okamžitě zmrazí a skladují se v ochranném roztoku. Navíc se příjemci podají prostředky, které suprimují hostitelovu imunitní odpověď.

V literatuře byla popsána celá série orgánových ochranných roztoků. V publikaci Collins a kol., Lancet, 2_, • · · ·

1219 (1969) jsou popsány intracelulámí elektrolytové roztoky pro konzervaci orgánů. V publikaci Sacks a kol., Lancet, 1, 1024 (1973) popsal roztoky, které mají osmoticky stabilizační účinek. ATP-MgCl₂, AMP-MgCl₂ a inosin byly popsány jako přípravky, které mají v takovýchto roztocích příznivé účinky (N. J. Siegel a kol., Am. J. Physiol., 254, F530 (1983); Belzer a kol., Transpl. Proč., 16, 161 (1984)). US patent č.

920 004 popisuje roztok obsahující mannitol, adenosin a ATP-MgCl₂. US patenty č. 4 798 824 a č. 4 873 230 popisují orgánový ochranný roztok obsahující hydroxyethyl-škrob. V US patentu č. 4 879 283 je popsán roztok obsahující KH₂PO₄,

MgSO₄, adenosin, allopurinol, rafinózu a hydroxyethylcelulózu. Tento roztok je též znám jako roztok Univerzity Wisconsinu (UW solution = University of Wisconsin solution) a byl popsán jako roztok vhodný pro úspěšnou konzervaci jater, ledviny a srdce (Jamíeson a kol., Transplantation, 4 6, 517 (1988); Ploeg a kol., Transplantation, 4 6, 191 (1988); a W.

N. Wicomb, Transplantation, 47, 733 (1988)). V US patentu č.

200 398 je popsán další přídatný přípravek pro tyto ochranné roztoky, a. to kyselina glukuronová, její soli a estery.

Navzdory úspěchu dosaženému v ochraně orgánů pro transplantací a supresí nežádoucích orgánových rejekcí, zůstává nadále potřeba tyto postupy dále zdokonalovat.

Podrobný popis vynálezu

Předmětem tedy je dosažení dalšího zdokonalení, jednak v ochraně orgánů před transplantací, stejně jako v jejím průběhu a stejně jako v další redukci nebezpečí orgánové rejekce.

Tohoto cíle se dosáhne prostřednictvím polysulfa• · · · » · tovaných glykosaminoglykanů s obsahem síry alespoň 12,5 % hmotnostních, které se použijí pro výrobu farmaceutických prostředků pro ínhíbici interferonem-γ' indukované up-regulace proteinů třídy MHC I a MHC II a ICAM-1.

Přítomný vynález se navíc týká orgánových ochranných roztoků obsahujících určité množství polysulfatovaných glykosaminoglykanů s obsahem síry alespoň 12,5 % pro přípravu příslušných farmaceutických přípravků, které účinně udržují buněčnou integritu a vitalitu.

Farmaceutické prostředky vyrobené pro použití podle přítomného vynálezu zahrnují například orgánové ochranné roztoky, stejně jako mohou obsahovat výše zmíněné sloučeniny jako volné sloučeniny, jako fyziologicky aktivní solí nebo estery, jejich tautomerní a/nebo izomerní formy nebo ve formě kombinace volných sloučenin a různých solí. Pozornost si zasluhující a vhodné fyziologicky účinné soli jsou například sodné, vápenaté a horečnaté soli. Obdobně jsou též vhodně soli s organickými bázemi, jako například soli diethylaminu, triethylaminu nebo triethanolaminu. Farmaceutické prostředky mohou s výhodou obsahovat alespoň jednu volnou látku nebo alespoň jednu sloučeninu ve formě její soli nebo jejích směsí.

Polysulfatované glykosaminoglykany (tedy mukopolysacharidy) použité podle přítomného vynálezu jsou polysacharidy s negativním nábojem (neboli glykany) obsahující různě spojené jednotky disacharidů, ve kterých je například jedna molekula kyseliny uronové, jako je kyselina D-glukuronová nebo kyselina L-iduronová, prostřednictvím glykosidové vazby spojena v poloze 3 nebo 4 aminocukru, například glukosaminu nebo galaktosaminu. Alespoň jeden z cukrů disacharidů vlastní negativně nabitou karboxylatovou • · · · nebo sulfátovou skupinu, která může být navázána prostřednictvím atomu kyslíku nebo dusíku. Glykosaminoglykany reagují silně kysele s uronovými kyselinami a s esterovými skupinami kyseliny sírové. Tyto kysele reagující skupiny jsou částečně přítomné již přirozeně, avšak jsou hodnotné pro udržení požadovaného stupně sulfatace nutného pro přítomný vynález pro syntetické vestavování skupin do sloučeniny. Stejně jako sulfatační metody jsou v literatuře popsány například způsoby sulfatace s kyselinou sírovou a kyselinou chlorsírovou (US patent č. 4 727 063 a č. 4 948 881), sulfatace s kyselinou chlorsírovou v pyridinu (Wolfrom a kol., J. Am. Chem. Soc., 75, 1519 (1953)) nebo sulfatace s kyselinou dusičnou (Shively a kol., Biochemistry, 18, 15, 3932 (1976)). Odborníkovi v oboru jsou známé i jiné způsoby. Pro sulfataci lze použít například přírodní glykosaminoglykany jako heparin, heparansulfat, keratansulfat, dermatansulfat, chondroitin nebo chondroitinsulfat. Struktura heparansulfatu odpovídá struktuře heparinu s rozdílem, že oproti heparinu obsahuje heparansulfat méně N- a O-sulfatových skupin a více n-acetylových skupin.

Glykosaminoglykany mohou být snadno izolovány ze zvířecí tkáně, například ze střevní sliznice nebo- z uší prasat a dobytka. Tkáň použitá pro izolaci glykosaminoglykanů je například autolysována a extrahována alkalickými látkami. Potom se protein nechá koagulovat a precipituje se, například okyselením. Po přidání sraženiny do polárního nevodného roztoku, například ethanolu nebo acetonu, se tuky odstraní extrakcí organickým rozpouštědlem. Způsobem proteolytické digesce se proteiny definitivně odstraní a tím se dostanou glykosaminoglykany. Způsoby izolace heparinu jsou popsány například v publikacích Charles a kol., J. Biochem., 30, 1927 až 1933 (1936) a E. Coyne, Chemistry and Biology of • · · ·

Heparin, Elsevier Publishers, North Holland, NY, Lundblad RL, vydáno 1981).

Tyto glykosaminoglykany izolované z přírodních zdrojů mohou být s výhodou připraveny jiným způsobem, jako jejich polysulfatací, jak je například popsáno v US patentu č. 5 013 724, nebo způsoby popsanými výše. Při použití tohoto způsobu polysulfatace vykazují poté glykosaminoglykany obsah síry 6 až 15 % hmotnostních. Pro použití podle přítomného vynálezu nebo pro farmaceutické prostředky se vyberou polysulfatované glykosaminoglykany s obsahem síry alespoň 12,5 % hmotnostních. S výhodou mají tyto polysulfatované glykosaminoglykany mají obsah síry 13 až 16 % hmotnostních, výhodně 13 až 15 % hmotnostních a obzvláště výhodně 13,5 až

14,5 % hmotnostních. Tyto látky se použijí pro přípravu farmaceutických prostředků, které jsou vhodné k inhibici interferonem-γ indukované up-regulace proteinů MHC tříd I a II a proteinů ICAM-1. Tyto látky se s výhodou použijí ve fyziologicky účinném množství pro léčení.a prevenci onemocnění asociovaných s interferonem-γ indukovanou upregulací proteinů MHC tříd I a II a proteinů ICAM-1. Mezi deriváty těchto látek jsou též zahrnuty sloučeniny, které zlepšují aplikační vlastnosti polysulfatovaných glykosaminoglykanů použitých vzhledem k jejich účinkům, jejich stabilitě a jejich odbourávání, obzvláště v lidském těle.

S výhodou se použijí hepariny a/nebo dermatansulfat s průměrnou molekulovou hmotností 1000 až 2000 Daltonů, s výhodou s molekulovou hmotností v rozmezí 1500 až 9000 Daltonů a obzvláště výhodně se použijí sloučeniny s molekulovou hmotností v rozmezí 2000 až 9000 Daltonů, optimálně s molekulovou hmotností v rozmezí 2000 až 6000 Daltonů. Obzvláště výhodné jsou nízkomolekulární • · · ·

·· polysulfatované hepariny a/nebo deřmatansulfaty. ve formě volné kyseliny nebo ve formě soli s fyziologicky přijatelnými bázemi nebo směsmi připravenými z těchto sloučenin. Tyto sloučeniny mají mírný antikoagulační účinek a jsou proto obzvláště vhodné pro léčení a. prevenci, pokud se použijí podle přítomného vynálezu. Výhodné soli polysulfatovaných glykosaminoglykanů jsou například sodné, vápenaté a hořečnaté soli.

Nízkomolekulární glykosaminoglykany, například nízkomolekulární hepariny a/nebo deřmatansulfaty, mohou být připraveny různými způsoby. V dokumentu EP-B-0 037 319 nebo v publikaci Biochemistry, 15, 3932 (1976) je popsána příprava nízkomolekulárních heparinů cestou depolymerace za použití kyseliny dusité. Příprava nízkomolekulárních heparinů a nízkomolekulárních glykosaminoglykanů může být též provedena za použití enzymů ( Biochem. J., 108, 647 (1968)), kyseliny sírové nebo kyseliny chlorsírové (dokument FRČ. 2 538 404, simultánní sulfatace), nebo za použití perjodistanu, nebo fyzikálními způsoby, například ozářením paprsky-γ (EP-A0 269 937) nebo ultrazvukem (Fuchs a kol., Lebensm a kol., Lebensm Unters Forsch, 198, 486 až 490 (1994)).

Další použití podle přítomného vynálezu se týká orgánových ochranných roztoků. Prostřednictvím přidání polysulfatovaných glykosaminoglykanů do orgánových ochranných roztoků může být dále zlepšeno skladování orgánů po jejich odstranění z těla dárce, tedy ex vivo, a to prostřednictvím inhibiceinterferonem-γ indukované up-regulace proteinů třídy MHC I a MHC II a ICAM-1. Orgány se s výhodou zmrazí, jak je odborníkovi v oboru známo.

Série těchto roztoků popsaných výše jsou v literatuře známé. Tyto roztoky obecně obsahují soli, pufry, látky pro • ♦ • 9 osmotickou stabilizaci orgánů, nebo látky zabraňující oxidaci, například cukry nebo cukrové alkoholy, proteiny, aminokyseliny, nižší karboxylové kyseliny, puriny, pyrimidiny nebo jiné farmaceutické přípravky. Jako příklady těchto látek mohou být uvedeny následující: rafinóza, glukóza, dihydrogenfosforečnan draselný, hydrogenfosforečnan draselný, chlorid draselný, hydrogenuhličitan draselný, hydrogenuhličitan sodný, síran hořečnatý, chlorid hořečnatý, adenosin, albumin, mannitol, citrát, verapamil, allopurinol, insulin, dexamethason, hydroxyethyl-škrob, glutathion nebo kyselina glukuronová.

Podle přítomného vynálezu se zamýšlí použít orgánové ochranné roztoky, které umožnění transplantovat orgány za lepších podmínek či skladovat tyto orgány po delší časové období, než je běžné, tudíž lze redukovat rejekční reakce.

Pro další redukci rizika orgánové rejekce je možné podat polysulfatované glykosaminoglykany příjemcům transplantátů nebo dárcům transplantátů, pokud je to možné, perorálně či parenterálně před transplantací. V úvahu připadá i pooperační léčení pacientů těmito látkami.

Polysulfatované glykosaminoglykany jsou obsaženy v orgánových ochranných roztocích nebo v jiných farmaceutických prostředcích v množství 10 až 10 000 mg/litr, s výhodou v množství 10 až 5 000 mg/litr, výhodněji v množství 50 až 3 000 mg/litr a nejvýhodněji v množství 100 až 3 000 mg/litr. Dále je výhodné přidat osmoticky stabilizující látku obsahující hydroxyethyl-škrob v množství 5 až 100 g/litr.

Další výhodné orgánové ochranné roztoky mají následující složení:

• · · ·

a) 10 až 10 000 mg/litr polysulfatovaných glykosamino-glykanů s obsahem síry alespoň 12,5 % hmotnostních, 5 až 100 g/litr hydroxyethylškrobu a 5 až 100 mmol rafinózy; nebo

b) 10 až 10 000 mg/litr polysulfatovaných glykosamino-glykanů s obsahem síry alespoň 12,5 % hmotnostních, 5 až 100 g/litr hydroxyethylškrobu a 5 až 100 mmol rafinózy, 5 až 40 mmol KH2PO4, 5 až 40 mmol KH2PO4, 1 až 50 mmol MgSCU, 1 až 50 mmol adenosinu, 0,5 až 5 mmol allopurinolu nebo 1 až 10 mmol glutathionu.

Pro léčení pacientů mohou být polysulfatované glykosaminoglykany použity společně s látkami obvykle používanými ve farmaceutických formulacích.

Farmaceutické přípravky zamýšlené pro použití podle přítomného vynálezu mohou být podány obvyklým způsobem perorálně či parenterálně (tedy subkutánně, intravenózně, intramuskulárne, intraperitoneálně), s tím, že perorální nebo intravenózní způsob podání je výhodný.

Dávkování je závislé na věku, stavu a hmotnosti pacienta a na typu aplikace.

Glykosaminoglykany se nejúčinněji podávají v dávce 0,1 až 500 mg/kg tělesné hmotnosti za den. V případě parenterálního způsobu podávání se glykosaminoglykany nejlépe podají v dávce 0,1 až 30 mg/kg tělesné hmotnosti za den, v případě perorálního způsobu podávání se glykosaminoglykany nejlépe podají v dávce 0,2 až 500 mg/kg tělesné hmotnosti za den, přičemž podávaná dávka může být aplikována v jedné dávce nebo v dávkách několika. Také směsi, například směs alespoň jednoho nízkomolekulárního heparinu a/nebo jeho polysulfatovaného derivátu a/nebo alespoň jednoho • ·· ·

nízkomolekulárního dermatansulfatu a/nebo jeho polysulfatovaného derivátu se podávají v dávce 0,1 až 30 mg/kg tělesné hmotnosti za den pro případ perenterálního prostředku, nebo v dávce 0,2 až 500 mg/kg tělesné hmotnosti za den v případě podání perorálního.

Mezí farmaceutické prostředky obsahující polysulfatované glykosaminoglykany pro léčení a prevenci chorob souvisejících s orgánovými transplantacemi v zásadě patří obvyklé farmaceutické formulace pro perorální nebo parenterální způsob podání, pevné i kapalné, v podobě tablet, povlečených tablet, kapslí, prášku, granulátu, dražé, čípků, roztoků nebo suspenzí. Tyto formulace se připraví obvyklým způsobem. Účinné složky mohou být zpracovány společně s obvykle používanými farmaceutickými přípravky, které se v těchto případech používají, jako jsou například tabletová pojidla, plnidla, konzervační přípravky, látky napomáhající rozpadu tablety, látky regulující tok, změkčovadla, zvlhčovadla, dispergační látky, emulgátory, rozpouštědla, přípravky zpomalující uvolňování, antioxidační přípravky a/nebo hnací plyny (H. Sucker a kol., Pharmazeutische Technologie, Thieme-Verlag, Stuttgart (1991)). Takto připravené dávkové formy obvykle obsahují účinnou látku, v množství 0,1 až 90 % hmotnostních.

Pro přípravu tablet, povlečených tablet, dražé a tvrdých želatinových kapslí mohou být polysulfatované glykosaminoglykany také zpracovány s farmaceuticky inertními anorganickými či organickými excipienty. Jako takovéto excipienty pro tablety, dražé a tvrdé želatinové kapsle lze použít laktózu, kukuřičný škrob či jejich deriváty, mastek, kyselinu stearovou nebo její soli. Pro měkké želatinové kapsle jsou vhodnými excipienty rostlinné oleje, vosky, tuky, polotuhé .a kapalné polyoly.

9 9 9

Pro výrobu roztoků a sirupů jsou vhodnými excipienty například voda, polyoly, sacharóza, invertní cukr, glukóza a látky těmto podobné. Pro případ injekčních roztoků jsou jako excipienty vhodné voda, alkoholy, polyoly, glycerin a rostlinné oleje. Pro čípky jsou vhodnými excipienty přírodní nebo ztužené oleje, vosky, tuky, polotekuté nebo kapalné polyoly atd.

Farmaceutické prostředky mohou dále obsahovat konzervační přípravky, rozpouštědla, stabilizační přípravky, zvlhčovači přípravky, emulgační přípravky, sladidla, barvidla, aromatické přípravky, soli nebo látky modifikující osmotický tlak, pufry, ochranné vrstvy a/nebo antioxidanty.

Příklady provedení vynálezu

Pro následující příklady je možné použít PTEC buňky (tj. epiteliální buňky proximálních tubulů) a HUVEC buňky (tj. endoteliální buňky lidské umbilikální vény). PTEC buňky se kultivují způsobem popsaným v publikaci Detrisac a kol., Kidney Int., 25, 383 (1984). Tyto PTEC se buňky umístí do láhví pro tkáňové, kultury potažených kolagenem I. typu (Sigma, St. Louis, MO) a obsahujících fetální telecí sérum (FCS, Gibco, BRL). Kultivační médium se skládá z Eaglova média modifikovaného podle Dulbecca a z Hamova F12 média (obě od firmy Gibco, BRL) v poměru 1:1, a toto kultivační médium je obohaceno 5 pg/ml inzulínu, 5 pg/ml transferrinu, 5 pg/ml selenu, 36 ng/ml hydrokortizonu, 4 pg/ml trijodthyroninu, 10 ng/ml epidermálního růstového faktoru 5 IU/ml penicilinu a 5 pg/ml streptomycinu (všechny složky jsou od firmy Sigma). Všechny buněčné linie se získají od různých zdrojů, například z bíopsií z předem transplantované tkáně, aloimplantátů, které nejsou použitelné pro transplantaci, a z normálních chirurgických ledvinových vzorků. Experimenty se provedou z pasáží buněk 1 až 4. PTEC buňky se charakterizují prostřednictvím pozitivního značení epiteliálním membránovým antigenem (EMA, Dako Glostrup, Dánsko) a adenosin-deamiázovým vazebným proteinem ( s díky poskytnuto Dr. Dinjensem, University Hospital, Maastricht, Nizozemsko).

HUVEC buňky (endoteliální buňky lidské umbilikální vény) se získají z čerstvých pupečníků způsobem popsaným v publikaci Jaffe a kol., Culture of Human 'Endothelial Cells Derived from Umbilical Veins, Identification by Morphologic and Immunologic Criteria, J. Clin. Invest., 52, 2745 až 2756 (1973). Tento postup je následující.

Endoteliální buňky se izoluji z pupečníkových vén natrávením kolagenázou typu V (Sigma, St. Louis, MO), které se provádí při teplotě 37 °C po dobu 20 minut. Poté se vény promyjí sterilním kultivačním médiem a endoteliální buňky se seberou. Kultivační médium sestává z média 199 (Gibco BRL) obohaceného 15% fetálním telecím sérem (FCS), endoteliálním růstovým faktorem a antibiotiky penicilinem a streptomycinem. Buňky se kultivují v nádobách se dnem o ploše 25 cm² potaženými 1% želatinou (Sigma, St. Louis, MO).

Všechny experimenty se provedou s buňkami ze třetí až šesté kultivační pasáže. HUVEC buňky se charakterizují pomocí jejich pozitivního barvení antigenem příbuzným s faktorem VIII (Dako, High Wycombe, UK) a endoteliálním markérem EN4 (CD 31).

Stimulace INF-γ, zpracovaní s heparinem a chlorečnanem sodným

Splývající mono-vrstvy PTEC a HUVEC buněk se zpracují s trypsinem a rozprostřou se na plotnu se 24 jamkami. Poté, co. se dosáhne splynutí, se buňky stimulují interferonem-γ (Sigma, St. Louis, MO) po dobu 72 hodin za přítomnosti či bez přítomnosti různých heparinoidů v odlišných koncentracích, které jsou obsaženy v různých heparinech, jako jsou například Heparín-Braun® od firmy Braun-Melsungen, Melsungen, Německo, nízkomolekulární Heparin-Fragmin® od firmy Pfrimmer Kabi, Erlangen, Německo a modifikovaný nízkomolekulární heparin od firmy Knoll AG, Ludwigshafen, Německo.

V některých experimentech se kultivační médium obohatí chlorečnanem sodným, za účelem inhibice sulfatace prostřednictvím na buňky navázaného proteoglykanu heparansulfatu (HSPG). Chlorečnan se použije v koncentracích 50 až 150 mM. Přidá se do média 24 hodin před podáním interferonu-γ. Stimulace interferonem-γ se provede za pŮítomnosti chlorečnanu. Pro kontrolu osmolality se použije chlorid sodný. Kultivované buňky se po kultivaci obnoví zpracováním s trypsinem EDTA pro průtokovou cytometrii.

Průtoková cytometrie

Buňky z rozdílných vrstev se spojí a následně se rozdělí do dvou testovacích zkumavek a promyjí se. Do první testované zkumavky se přidají protilátky, které se nevážou na buněčné izotopy, a které jsou spojeny s RPE a FITC (od firmy Dako, Glostrup, Dánsko a Cy-5 (od firmy Dianova, Hamburg, Německo). Tato vrstva se použije jako negativní kontrola pro FACS pozadí. Buňky druhé vrstvy se označí protilátkami proti antigenům MHC třídy I (RPE konjugované, W6/32, Dako), protilátkami proti antigenům MHC třídy II (Cy-5 konjugované, CR3/43, Dianova) a protilátkami proti antigenům ICAM-1 (FITC konjugované, Dianova) v koncentracích doporučených výrobcem. Po inkubací buněk po dobu 30 minut při teplotě 4 °C se • 4 • 4 ····

4

promyjí a analyzují se průtokovou cytometrií (FACScan, Becton Díckínson). Analyzuje se alespoň 10 000 pozitivních případů. Výsledky se vyjádří.jako střední intenzita fluorescence (MFI, mean fluorescence intensity).

Dot-blot analýzy

Pro dot-blot analýzy se připraví úzké proužky nitrocelulózové membrány, na které se aplikuje 1 pl heparinů, Fragminu a různých jiných N-desulfatovaných a N-acetylovaných glykosaminoglykanů (GAG, všechny v koncentraci 1 mg/litr). Po vysušení se proužky fixují 1% glutaraldehydem a 0,5% cetylpridinimum-chloridem za účelem zabránění ztráty glykosaminoglykanů a následně se promyjí Tris pufrem.

Definitivní proužky se nakonec exponují na Kodak film.

Statistická analýza

Signifikance změn v expresi antigenu se stanoví za pomoci Studentova T testu, p hodnoty menší než 0,05 se považují za signifikantní.

Výsledky

Exprese proteinů MHC třídy I, MHC třídy II a ICAM-1 je u PTEC buněk modifikována interferonem-γ, a to v závislosti na dávce. Exprese proteinů MHC třídy I a ICAM-1 je upregulována koncentrací interferonu-γ 50 ng/ml. Navíc při stejné koncentraci interferonu-γ se zvyšuje i koncentrace molekul MHC třídy II (viz obr. 1). Obdobné výsledky se dostanou při použití kultivovaných HUVEC buněk.

Za účelem studia vlivu heparinů na schopnost interferonu-γ modulovat expresi molekul MHC a ICAM-1 se obě,

·· ··· · • · ♦ · • · • · · ·· tedy HUVEC a PTEC, kultury stimulují interferonem-γ za přítomnosti či nepřítomnosti heparinu. Podání heparinu v koncentracích 0,03 až 3 mg/ml do HUVEC kultury kompletně zabrání up-regulaci proteinů MHC třídy I a ICAM-1, která byla navozena 100 ng/ml interferonu-γ. Obdobně je podáním heparinu suprimována indukce proteinů MHC třídy I na těchto buňkách. Heparin jako takový nemá bez přítomnosti interferonu-γ žádný vliv na expresi tří zkoumaných antigenů (viz obr. 2).

V porovnatelných experimentech s PTEC buňkami se podobně ukázalo, že up-regulace proteinů ICAM-1 a indukce proteinů MHC třídy II, která byla navozena 100 ng/ml interferonu-γ, může být inhibována heparinem. Up-regulace proteinů MHC třídy I navozená interferonem-γ však heparinem nemůže být ovlivněna. Pro zjištění, zdali lze up-regulaci proteinů MHC třídy I indukovanou zanedbatelnou koncentrací interferonu-γ blokovat heparinem, se shodné experimenty provedou s buňkami stimulovanými 10 ng/ml interferonu-γ. Ukázalo se, že heparin sám o sobě v koncentracích 3 mg/ml má pouze marginální vliv na ovlivnění up-regulace proteinů MHC třídy I interferonem-γ (viz obr. 3a). Naopak jak indukce proteinů MHC třídy II, tak up-regulace proteinů ICAM-1, jsou signifikantně inhibovány 0,03 mg/ml heparinu, přičemž hodnota p je menší než 0,01 (viz obr. 3b a 3c). Za účelem zjištění vlivu stupně sulfatace heparinu na inhibící exprese proteinů MHC a ICAM-1 po stimulaci interferonem-γ se v tomto testovacím systému prozkoumaly různé heparinoidy (tabulka 1). Tyto heparinoidy se všechny testují v koncentraci 3 mg/ml na jejich schopnost inhibovat proteiny MHC třídy I a ICAM-1 po jejich stimulaci interferonem-γ. Testování na proteiny MHC třídy II se provede po stimulaci 10 ng/ml interferonu-γ. Obdobnp jako u běžných a nízkomolekulárních heparinů inhibují supersulfatované glykosaminoglykany (GAG 6 až 8) expresi proteinů MHC a ICAM-1, jak u HUVEC, tak u PTEC buněk po ···· ·· ···· stimulaci interferonem-γ. Oproti tomu desulfatované Nacetylované glykosaminoglykany (GAG 1 až 5) nemohou ovlivnit expresi MHC a ICAM-1 u těchto buněk po stimulaci interferonem-γ (obr. 4a až 4c a 5a až 5c). Je evidentní jasná tendence indikující, že supersulfatované glykosaminoglykany jsou evidentně účinnější v inhibici než běžné a nízkomolekulární hepariny. Tento fakt je zřetelněji vyjádřen u PTEC kultur (obr. 5a). Další dávku-zkoumající pokusy s nízkomolekulárními hepariny a glykosaminoglykany 6 až 8 a s PTEC buňkami stimulovanými 10 ng/ml interferonu-γ ukazují, že po podání glykosaminoglykanů 6 až 8 v koncentracích 0,03 mg/ml k buněčným kulturám stimulovaným interferonem-γ vede k signifikantní inhibici exprese proteinů MHC a ICAM-1 (přičemž p je menší než 0,05). Za těchto podmínek nebyl prokázán žádný významný vliv heparinu na expresi MHC třídy I a II, ICAM-1 je za těchto podmínek inhibován heparinem obdobně, nicméně zřetelně méně než supersulfatovanými glykosaminoglykany (obr. 6a až 6c) .. Tyto výsledky jasně značí, že supersulfatované glykosaminoglykany jsou v inhibici exprese proteinů MHC a ICAM-1 účinnější než srovnatelný heparin.

Za účelem studia, zdali má stupeň sulfatace glykosaminoglykanů důležitý vliv na inhibiční účinek glykosaminoglykanů na expresi proteinů MHC a ICAM-1 po jejich stimulaci interferonem-γ, se PTEC buňky inkubují za přítomnosti chlorečnanu sodného. Předpokládá se, že je tímto způsobem blokována sulfatace HSPG. Jako kontrola se použijí buňky zpracované s ekvimolárními koncentracemi chloridu sodného. Potom se obě vrstvy stimulují interferonem-γ v koncentracích 0 až 10 ng/ml. Ačkoliv interferon-γ moduluje expresi proteinů MHC a ICAM-1 u PTEC buněk zpracovaných s chlorečnanem sodným, je tato modulace značně menší u buněk zpracovaných chloridem sodným (viz obr. 7a až 7c). Z toho • ·»·· ·· · • · * · « • · ··· t· • » · • · • · • · *· ·· ···· ·· ♦»·· « · · • · · • · · • · · · ·· ·· vyplývá, že stupeň sulfatace HSPG hraje důležitou roli v modulaci exprese těchto antigenů po stimulaci interferonemY·

Pro objasnění, zdali musí být glykosaminoglykany sulfatované pro vazbu interferonu-γ, provedou se vazebné studie s použitím ^interferonu-y. Výsledky z této studie ukazují, že jak heparin, tak supersulfatované glykosaminoglykany mohou vázat' ¹²⁵interferon~Y. Tuto vlastnost nelze prokázat u desulfatovaných N-acetylovaných glykosaminoglykanů s několika sulfátovými skupinami (glykosaminoglykany 3 až 5). Desulfatované N-acetylované glykosaminoglykany s vyšším podílem sulfátových skupin (glykosaminoglykany 1 a 2) také vážou ¹²⁵interferon-γ, aviSak zřetelně méně, než heparin nebo supersulfatované glykosaminoglykany. Vazba ¹²⁵interferonu-Y na heparin nebo glykosaminoglykany, které jsou navázány na nitrocelulózové filtry, může být blokována 3000-násobným přebytkem heparinu ve vazebném roztoku. Za těchto podmínek nedochází k dalším vazbám na glykosaminoglykanech 1 a 2, zatímco vázání na heparin, Fragmin a supersulfatované glykosaminoglykany je značně zredukováno (obr. 8).

··«· ·· «··· ·· ···· • · ··

Tábulka 1

Vlastnosti různých heparinů a glykosaminoglykanů *) použitých v této studii

Název	Fxa sulfát (%)	Fila		Mr
(IU/mg a	IU/mg)
Desulfatované N-acety(	.ováné heparinoidy
GAG 1	7,3	0	0	3289	3802
GAG 2	6, 4	0	0	2992	3548
GAG 3	5,5	0	0	2869	3382
GAG 4	3,4	0	0	2364	2800
GAG 5	1,2	0	0	1618	2074
Sulfatované heparinoidy
GAG 6	14,2	26,1	39	7800	8360
GAG 7	14,2	21,5	30	6000	7700
GAG 8	13,7	25,8	28	5500	6300
Komerčně	dostupné heparinoidy
Braun	NS	NS	NS	14000	18000
Fragmin P NS	160	70	4900	6000

*) Vlastnosti různých heparinů a glykosaminoglykanů použitých v této studii:

M_p: celková hmotnost dělená počtem molekul;

M_w: molekulová hmotnost;

NS: nestanoveno;

účinnost Fila a Fxa se stanoví způsobem popsaným v publikaci Handeland a kol., Assay of Unfractioned and LMW Heparin with Chromogenic Substrates: Twin Methods with Factor Xa and Thrombin (Stanovení frakcionovaných heparinů a heparinů s nízkou molekulovou hmotností prostřednictvím chromogenního substrátu: Dvojité metody s použitím faktoru Xa a trombinu), Thrombosis Res., 35, 627 (1984) s prvním mezinárodním standardem pro nízkomolekulární heparin (zaveden v roce 1987, kód č. 85/600).

·♦ ··· ·

Obr. 1

Na dávce závislá exprese proteinů MHC třídy I a II a ICAM-1 u PTEC buněk po stimulaci interferonem-γ

Buňky se stimulují po dobu 72 hodin různými koncentracemi interferonu-γ. Poté se stanoví exprese proteinů MHC třídy I (levý sloupec) a třídy II (pravý sloupec) a ICAM1 (levý sloupec) prostřednictvím FACS (průtokové cytometrie). Výsledky jsou uvedeny na ilustraci jako střední intenzita fluorescence v reprezentativním experimentu.

Obr. 2

Účinek heparinu na expresi MHC a ICAM-1 na HUVEC buňkách stimulovaných interferonem-γ

Interferonem-γ stimulovaní HUVEC buňky (100 ng/ml, stimulace po dobu 72 hodin, šedý sloupec) a nestimulované HUVEC buňky (bílý sloupec) se inkubují za stimulace různými koncentracemi heparinu. Poté se stanoví exprese MHC a ICAM-1 metodou FACS. Výsledky jsou uvedeny na ilustraci jako střední intenzita fluorescence v reprezentativním experimentu.

Obr. 3

Účinek heparinu na expresí MHC a ICAM-1 na PTEC buňkách stimulovaných interferonem-γ

Interferonem-γ stimulovaní PTEC buňky (10 ng/ml, stimulace po dobu 72 hodin) a nestimulované PTEC buňky (bílý sloupec) se inkubují v průběhu stimulace různými koncentracemi heparinu. Exprese MHC a ICAM-1 ve třech replikovaných kulturách se poté stanoví metodou FACS. Obr. 3a ilustruje expresi MHC třídy I. Obr. 3b ilustruje expresi MHC třídy II. Obr. 3c ilustruje expresi ICAM-1. Výsledky jsou uvedeny na ilustraci jako střední intenzita fluorescence + /2 . směrodatná odchylka.

Obr. 4

Účinek různých heparinů a glykosaminoglykanů na expresi MHC a ICAM-1 buňkami stimulovanými interferonem-γ

Interferonem-γ stimulované HUVEC buňky (10 ng/ml, stimulace po dobu 72 hodin, vyplněný sloupec) a néstimulované HUVEC buňky (šrafováný sloupec) se v průběhu stimulační periody inkubují s různými hepariny a glykosaminoglykany v koncentraci 3 mg/ml. Exprese MHC a ICAM-1 třemi replikovanými kulturami se poté stanoví metodou FACS. Obr. 4a ilustruje expresi MHC třídy I. Obr. 4b ilustruje expresi MHC třídy II a obr. 3c ilustruje expresi ICAM-1. Výsledky jsou uvedeny na ilustraci jako střední intenzita fluorescence +/2 . směrodatná odchylka.

Obr. 5

Účinek různých heparinů a glykosaminoglykanů na expresi MHC a ICAM-1 na PTEC buňkách stimulovaných interferonem-y

Interferonem-γ stimulovánl PTEC buňky (10 ng/ml, stimulace po dobu 72 hodin, vyplněný sloupec) a nestimulované PTEC buňky (šrafovaný sloupec) se inkubují v průběhu stimulace různými hepariny a glykosaminoglykany v koncentraci mg/ml. Exprese MHC a ICAM-1 se poté stanoví metodou FACS. Obr. 5a ilustruje expresi MHC třídy I. Obr. 5b ilustruje expresi MHC třídy II a obr. 3c ilustruje expresi ICAM-1.

···· · 9 ·φ • · » » · «

Výsledky jsou uvedeny na ilustraci jako střední intenzita fluorescence v reprezentativním experimentu.

Obr. 6

Porovnání účinku GAG β až 8 a heparinů v jejich schopnosti inhibovat expresi MHC a ICAM-1 na PTEC buňkách stimulovaných interferonem-γ (10 mg/ml, po dobu 72 hodin)

Použijí se interferonem-γ stimulované PTEC buňky (10 ng/ml, stimulace po dobu 72 hodin). Tyto PTEC buňky se v průběhu stimulační periody inkubují s různými koncentracemi GAG6( ), GAG7( ), GAG8( ) a heparinů ( ). Exprese MHC a ICAM1 se poté stanoví metodou FACS. Exprese těchto antigenů se také stanoví za nepřítomnosti GAG (-GAG) nebo za nepřítomnosti interferonu-γ.· Obr. 6a ilustruje expresi MHC třídy I. Obr. 6b ilustruje expresi MHC třídy II a obr. 6c ilustruje expresi ICAM-1. Výsledky jsou uvedeny na ilustraci jako střední intenzita fluorescence +/- 2 . směrodatná odchylka.

Obr. 7

Účinek chlorečnanu sodného na míru stimulace exprese MHC a ICAM-1 na PTEC buňkách stimulovaných interferonem-γ

PTEC buňky se jeden den před stimulací interferonem-γ zpracují se 150 mM chlorečnanu sodného (vyplněný sloupec) nebo se 150 mM chloridu sodného (šrafovaný sloupec) jako osmolární kontrolní stanovení. Potom se buňky stimulované různými koncentracemi interferonu-γ stimulují po dobu 72 hodin za přítomnosti stejných koncentrací chlorečnanu sodného nebo chloridu sodného. Exprese MHC a ICAM-1 třemi replikovanými kulturami se poté stanoví metodou FACS. Obr. 7a « · · ·

ilustruje expresi MHC třídy I, obr. 7b ilustruje expresi MHC třídy II. Obr. 7c ilustruje expresi ICAM-1. Výsledky jsou uvedeny na ilustraci jako střední intenzita fluorescence + /2 . směrodatná odchylka. Hvězdička znamená p < 0,05 a dvě hvězdičky znamenají p < 0,01 ve Studentově T testu.

Obr. 8

Vazba ¹²⁵INF-y na heparin, Fragmin a rožně jiné glykosaminoglykany

Heparin (Hep), glykosaminoglykan (GAG) 1 až 8 a Fragmin (Fragm) se blotují na nitrocelulózový filtr, který .se připraví způsobem popsaným výše. Nitrocelulózové proužky se inkubují ¹²⁵INF-y za pj/ítomnosti či v nepřítomnosti 3000násobného přebytku heparinu.

advcIcH

VŠETECpv, ΔύΡ'·' P^aP,._s;« ,v,,.._i;;řtóKÝ A PAPPPtAÚ ixuva 2

Jo$1 -

Claims (7)

1. PATETOVE NÁROKY

   1. Orgánové ochranné roztoky, vyznačuj se t í m, ze obsahují kvantitativně následující složky, které jsou účinné pro uchovávání buněčné integrity a buněčné vitality:

   a) 10 až 10 000 mg/ml polysulfatovaných glykosaminoglykanů s obsahem síry alespoň 12,5 % hmotnostních;

   b) 5 až 100 g/litr hydroxyethylškrobu.
2. 2. Orgánové ochranné roztoky podle nároku 1, vyznačující se tím, že obsahují:

   aj 10 až 10 000 mg/ml polysulfatovaných glykosaminoglykanů s obsahem síry alespoň 12,5 % hmotnostních;

   b) 5 až 100 g/litr hydroxyethylškrobu;

   c) 5 až 100 mmol rafinózy.
3. 3. Orgánové ochranné roztoky podle nároků 1 a 2, vyznačující se tím, že obsahují:

   a) 10 až 10 000 mg/ml polysulfatovaných glykosaminoglykanů s obsahem síry alespoň 12,5 % hmotnostních;

   b) 5 až 100 g/litr hydroxyethylškrobu;

   c) 5 až 100 mmol rafinózy;

   d) 5 až 40 mmol K2HPO4;

   e) 1 až 50 mmol MgSO₄;

   f) 1 až 50 mmol adenosinu;

   g) 0,5 až 5 mmol allopurinolu;·

   h) 1 až 10 mmol glutathionu.

   • · · · · · • 9 · · · · • * 9 ·· ··
4. 4. Použití orgánových ochranných roztoků podle nároků

   I až 3 pro výrobu farmaceutických prostředků pro inhibici ínterferonem-γ indukované up-regulace proteinů MHC třídy I a

   II a proteinů ICAM-1.
5. 5. Použití orgánových ochranných roztoků podle nároku 4 pro léčení a prevenci chorob souvisejících s interferonem-y indukovanou up-regulací proteinů MHC třídy I a II a proteinů

   ICAM-1.
6. 6. Použití orgánových ochranných roztoků podle nároku 4 nebo 5 pro léčení transplantovaných pacientů.
7. 7. Použití orgánových ochranných roztoků podle nároku 4 nebo 5 pro ochranu a skladování orgánů, které mají být použity k transplantaci.