WO2000032627A1 - Nouvelle substance physiologiquement active et ses procedes d'obtention et d'utilisation - Google Patents

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WO2000032627A1
WO2000032627A1 PCT/JP1999/006649 JP9906649W WO0032627A1 WO 2000032627 A1 WO2000032627 A1 WO 2000032627A1 JP 9906649 W JP9906649 W JP 9906649W WO 0032627 A1 WO0032627 A1 WO 0032627A1
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WO
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polypeptide
seq
salt
senr
amino acid
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PCT/JP1999/006649
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English (en)
French (fr)
Inventor
Masaaki Mori
Michiko Abe
Yukio Shimomura
Tsukasa Sugo
Chieko Kitada
Original Assignee
Takeda Chemical Industries, Ltd.
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/57509—Corticotropin releasing factor [CRF] (Urotensin)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/72—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants for hormones
    • G01N2333/726—G protein coupled receptor, e.g. TSHR-thyrotropin-receptor, LH/hCG receptor, FSH
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value

Definitions

  • the present invention relates to a novel polypeptide having ligand activity for SENR (sensory epithelium neuropeptide-like receptor), which is a G protein-coupled receptor protein. And DNA encoding the same.
  • SENR sensor epithelium neuropeptide-like receptor
  • G protein conjugated guanine nucleot i de-binding protein
  • PCR Polymerase Chain Reaction
  • G protein-coupled receptor proteins have a low homology to known receptor proteins, and are similar in primary structure except for the receptor receptor subtype of known ligands. It was difficult to estimate the ligand by gender alone. On the other hand, it has been estimated from genetic analysis that many unknown G-protein coupled receptors have been found, and that there are still many unknown corresponding ligands. Few examples have identified ligands for an G protein-coupled receptor.
  • GRL104 snail o-phan G protein-coupled receptor
  • S ENR G-protein-coupled receptor
  • S ENR has a low homology with the somatosustin receptor (SSTR4), but it has not been known what its ligand is.
  • GPR 14 Marchese, A., Genomics, 29, 335-344, 1995 reported by Marchese, A. et al. Is the same reception as SENR.
  • Ligands to SENR, a G protein-coupled receptor expressed in the central nervous system, circulatory system, reproductive system, immune system, digestive system, urinary system, sensory system, etc. are considered to be useful as pharmaceuticals.
  • the present inventors have found that it is possible to screen for a compound that alters the binding between the ligand as the activator and the above-mentioned SENR.
  • polypeptide containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7, or an amide or ester thereof, or a salt thereof;
  • polypeptide according to (1) above wherein the substantially identical amino acid sequence is the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 21, or an amide thereof, an ester thereof, or a salt thereof;
  • a medicament comprising the polypeptide according to (1) or an amide or ester thereof or a salt thereof, or the precursor protein or a salt thereof according to (3);
  • a medicament comprising the DNA according to (5) or (7) above, (15) a central function regulator, a circulatory function regulator, a heart function regulator, a renal function regulator, a urinary function regulator Or the drug according to the above (13) or (14), which is a sensory organ function regulator,
  • SENR comprising the polypeptide according to (1) or an amide or ester thereof or a salt thereof, or the precursor protein or a salt thereof according to (3) and the polypeptide according to (1) Or its amide Or a screening kit of a compound thereof or a salt thereof, or a compound or a salt thereof, which changes the binding property to the precursor protein or the salt thereof according to the above (3).
  • a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 22, or an amide thereof, an ester thereof, or a salt thereof
  • a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 22 or a S ENR comprising the amide or ester or salt thereof and the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 22
  • a prophylactic / therapeutic agent for hypertension characterized by containing the compound according to (20) or a salt thereof,
  • SENR or a salt thereof, which comprises an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 26, or
  • Figure 1 shows the cDNA sequence of rat SENR isolated by PCR using rat whole brain cDXA. (SEQ ID NO: 3).
  • FIG. 2 shows a diagram showing the results of measuring the activity of the HPLC fraction prepared from the bushu spinal cord extract to promote the release of arachidonic acid metabolites from the CH0 / SENR cell line.
  • FIG. 3 is a view showing the behavior of the arachidonic acid metabolite releasing activity of HPLC fraction # 33 in Example 6 with respect to the treatment with pronase.
  • FIG. 4 shows the results of measuring the activity of promoting the release of arachidonic acid metabolites specific to CH0 / SENR for the fraction purified by the CN column (Develos CN-UG-5) in Example 7. The figure is shown.
  • FIG. 5 shows the results of measuring the activity of promoting the release of arachidonic acid metabolites specific to CH0 / SENR for the fraction purified by the CN column (Develosil CN-UG-5) in Example 7. The figure is shown.
  • FIG. 6 is a diagram showing the results of measuring the activity of promoting the release of arachidonic acid metabolites specific to CH0 / SENR for the fraction purified by the 0DS column (Wakosyl-II 3C18HG) in Example 7. .
  • FIG. 7 is a diagram showing the results of measuring the activity of the fraction purified by the 0DS column (Wakos HI I 3C18HG) in Example 7 which promotes the release of arachidonic acid metabolites specific to CHO / SE'R. .
  • FIG. 8 shows the entire nucleotide sequence of the cDNA of the SENR ligand precursor protein isolated from the cDNA of the spinal cord and the entire amino acid sequence of the SENR ligand precursor protein translated from the cDNA.
  • ⁇ indicates the sequence of SENR ligand polypeptide.
  • FIG. 9 is a graph showing the activity of synthetic arachidonic acid metabolites to release arachidonic acid on the CH0 / SENR cell line.
  • FIG. 10 shows a diagram showing the contractile activity of a synthetic synthetic SENR ligand on rat thoracic aortic ring specimens.
  • FIG. 11 shows a diagram illustrating the arachidonic acid metabolite releasing activity of a synthetic human SENR ligand (human urotens in II) on CHO / hSENR cell lines.
  • FIG. 12 is a diagram showing the binding activity of the synthetic Pseudo SENR ligand to the CH0 / SENR cell membrane fraction.
  • FIG. 13 shows a diagram showing the binding activity of the synthetic human SENR ligand to the CHO / hSENR cell membrane fraction.
  • FIG. 14 shows the entire nucleotide sequence of the cDNA of the human SENR ligand precursor protein isolated from the human whole brain cDNA and the entire amino acid sequence of the human SENR ligand precursor protein translated therefrom.
  • the sequence enclosed by the mouth is the sequence of the PSE SENR ligand polypeptide.
  • substantially the same refers to the activity of a polypeptide or protein, for example, the binding activity between a ligand and a receptor (SENR), physiological properties such as physiological properties, and the like. Means the same thing. Amino acid substitutions, deletions, additions or insertions often do not result in significant changes in the physiological or chemical properties of the polypeptide or protein, in which case the substitutions, deletions, additions or insertions are made.
  • the modified polypeptide will be substantially identical to the polypeptide without such substitutions, deletions, additions or insertions.
  • Substantially identical substitutions of amino acids in the amino acid sequence can be selected, for example, from other amino acids of the class to which the amino acid belongs.
  • Non-polar (hydrophobic) amino acids include alanine, leucine, isoleucine, norin, proline, phenylalanine, tributofan, methionine and the like.
  • Polar (neutral) amino acids include glycine, serine, threonine, cysteine, tyrosine, asparagine, and glutamine.
  • Positively charged (basic) amino Acids include arginine, lysine, histidine and the like. Examples of negatively charged (acidic) amino acids include aspartic acid and glutamic acid.
  • polypeptide of the present invention or its amide or its ester or its salt is a ligand for SENR, and specifically, SEQ ID NO: 7 Or a amide thereof, an amide thereof, an ester thereof or a salt thereof, which contains the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by
  • polypeptide of the present invention or its amide or its ester or its salt (hereinafter sometimes simply referred to as the polypeptide of the present invention), its production method and use will be described in more detail below.
  • the polypeptide of the present invention includes human tissues from any warm-blooded animal (eg, guinea pig, rat, mouse, bush, hidge, horse, monkey, etc.) (eg, pituitary gland, kidney, brain, kidney) , Liver, gonad, thyroid, gall bladder, bone marrow, adrenal gland, skin, muscle, lung, digestive tract, blood vessel, heart, etc.) or a cell derived from a cell, etc., and the amino acid represented by SEQ ID NO: 7 Any polypeptide that has the same or substantially the same amino acid sequence as the sequence may be used.
  • polypeptide of the present invention may be substantially the same as the polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 and the polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 in addition to the polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7.
  • Polypeptides having the same activity for example, polypeptides containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 21
  • Substantially the same activity includes, for example, receptor binding activity, signal transduction activity and the like.
  • Substantially the same means that the receptor binding activity and the like are the same in nature.
  • the strength and strength of the receptor binding activity and the like, and the quantitative factors such as the molecular weight of the polypeptide may be different.
  • the polypeptide having an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 is the third from the N-terminal of the polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7.
  • Amino acid (Thr) is replaced with another amino acid (eg, Ala, Leu, He, Val, Pro, Phe, Trp, Met, Gly, Ser, Cys, Tyr, Asn, Gin, Arg, Lys, His, Asp, Glu) and a polypeptide containing an amino acid sequence substituted with Glu).
  • polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 contains an amino acid sequence (SEQ ID NO: 8) in which the third amino acid (Thr) from the N-terminus is substituted with Pro.
  • Amino acid sequence in which the third amino acid (Thr) from the N-terminus of the polypeptide and the polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 is replaced with Ser (SEQ ID NO: 21) And the like are preferred examples.
  • the polypeptide has an N-terminus (amino terminus) at the left end and a C-terminus (carboxyl terminus) at the right end in accordance with the convention of peptide notation.
  • C-terminus is usually in force Rupokishiru group (-C00H) or carboxylate (-C00 -) is a, C-terminal, may be an amide (-C0NH 2) or ester (-C00R).
  • R of the ester such as methyl, Echiru, n- propyl, Flip E alkyl groups such as isopropyl or n- butyl, cyclopentyl, C 3, such as carboxymethyl Le cyclohexane - 8 cycloalkyl group, phenyl, "- naphthyl C 6 _ 12 ⁇ Li Lumpur groups, benzyl, phenethyl, phenylene Lou CI_ 2 alkyl le such as benzhydryl, or ⁇ - naphthylmethyl etc. ⁇ - naphthyl - a C 7 _ 14 Ararukiru groups such as C Bok 2 alkyl Other examples include a bivaloyloxymethyl group commonly used as an oral ester.
  • a salt with a physiologically acceptable base for example, alkali metal or the like
  • an acid organic acid or inorganic acid
  • Physiologically acceptable acid addition salts are preferred.
  • Such salts include, for example, salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid) or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid) , Tartaric acid, cunic acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid).
  • inorganic acids eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid
  • organic acids eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid
  • Tartaric acid cunic acid, malic acid, oxalic acid
  • the polypeptide of the present invention can be produced by a method for purifying a polypeptide from tissues or cells of a human warm-blooded animal, or can be produced according to the polypeptide synthesis method described later. Further, it can also be produced by culturing a transformant containing a DNA encoding a polypeptide described below. In the case of producing from a human warm-blooded animal tissue or cells, a human warm-blooded animal tissue Alternatively, after homogenizing the cells, extraction is performed with an acid, an organic solvent, etc., and the extract is subjected to chromatography such as salting out, dialysis, gel filtration, reverse phase chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography, etc. Purification and isolation can be achieved by combining the above.
  • the polypeptide of the present invention can be produced according to a method for synthesizing a polypeptide known per se, or by cleaving a polypeptide containing the polypeptide of the present invention with an appropriate peptidase.
  • a method for synthesizing a peptide for example, any of a solid phase synthesis method and a liquid phase synthesis method may be used. That is, the objective peptide can be produced by condensing a partial peptide or amino acid capable of constituting the polypeptide of the present invention with the remaining portion, and removing the protective group when the product has a protective group. Can be.
  • Known methods for condensation and elimination of the protecting group include, for example, the methods described in the following 1 to 5.
  • the polypeptide of the present invention can be purified and isolated by a combination of ordinary purification methods such as solvent extraction, distillation, column chromatography, liquid chromatography, and recrystallization.
  • the polypeptide obtained by the above method is a free form, it can be converted to an appropriate salt by a known method, and conversely, when the polypeptide is obtained as a salt, it can be converted to a free form by a known method. Can be done.
  • a commercially available resin for peptide synthesis suitable for amide formation can be used.
  • resins include chloromethyl resin, hydroxymethyl resin, benzhydrylamine resin, aminomethyl resin, 4-benzyloxybenzyl alcohol resin, 4-methylbenzhydrylamine resin, PAM resin, Hydroxymethylmethylphenylacetamidomethyl resin, polyacrylamide resin, 4- (2 ', 4'-dimethoxyphenyl-hydroxymethyl) phenoxy resin, 4- (2', 4'-dimethoxyphenyl-Fmoc Aminoethyl) phenoxy resin and the like.
  • an amino acid having an ⁇ -amino group and a side chain functional group appropriately protected is condensed on the resin in accordance with the sequence of the target peptide according to various condensation methods known per se.
  • the peptide is cleaved from the resin, and at the same time, various protecting groups are removed.
  • an intramolecular disulfide bond formation reaction is carried out in a highly diluted solution to obtain the desired polypeptide.
  • luposimides include DC DC, ⁇ ′-diisopropylcarboimide, and ⁇ -ethyl-N ′-(3-dimethylaminopropyl) carbopimide.
  • Activation with these can be accomplished by adding the protected amino acid directly to the resin along with a racemization inhibitor additive (eg, HOBt, HOOBt, etc.), or as a symmetrical acid anhydride or HOB ester or HOOBt ester. It can be added to the resin after activation of the previously protected amino acid.
  • a racemization inhibitor additive eg, HOBt, HOOBt, etc.
  • the solvent used for condensation of the protected amino acid with the activated resin can be appropriately selected from solvents known to be usable for peptide condensation reactions.
  • acid amides such as N, N-dimethylformamide, N, N-dimethylacetamide, and N-methylpyrrolidone
  • halogenated hydrocarbons such as methylene chloride and chloroform
  • alcohols such as trifluoroethanol
  • Sulfoxides such as dimethyl sulfoxide
  • tertiary amines such as pyridine
  • ethers such as dioxane and tetrahydrofuran
  • nitriles such as acetate nitrile and propionitrile
  • esters such as methyl acetate and ethyl acetate
  • An appropriate mixture of the above is used.
  • the reaction temperature is appropriately selected from a range known to be usable for the peptide bond formation reaction, and is usually appropriately selected from a range of about 120 ° C to 50 ° C.
  • the activated amino acid derivative is usually used in a 1.5 to 4-fold excess.
  • Examples of the protecting group for the amino group of the starting amino acid include Z, Boc, Yuichi Shari-pentyloxycarbonyl, isobornyloxycarbonyl, 4-methoxybenzyloxycarbonyl, CutZ, Br-Z, and adaman.
  • Tyloxycarbonyl trifluoroacetyl, phthaloyl, formyl, 2-nitrophenylsulfene , Diphenylphosphinochioil, Fmoc and the like.
  • the hydroxyl groups of serine and threonine can be protected, for example, by esterification or etherification.
  • Suitable groups for this esterification include, for example, lower alkanoyl groups such as acetyl group, aroyl groups such as benzoyl group, and groups derived from carbon such as benzyloxycarbonyl group and ethoxycarbonyl group.
  • groups suitable for etherification include, for example, a benzyl group, a tetrahydrovinylil group, and a butyl group.
  • the protecting group of the phenolic hydroxyl group of tyrosine include Bz l, C l 2 and -Bz
  • Examples of the protecting group for histidine imidazole include Tos, 4-methoxy-2,3,6-trimethylbenzenesulfonyl, DNP, benzyloxymethyl, Bum, Boc, Trt, and Fmoc.
  • Activated carboxyl groups of the raw materials include, for example, the corresponding acid anhydrides, azides, active esters [alcohols (eg, pentachlorophenol, 2,4,5-trichlorophenol, 2,4- Dinitrophenol, cyanomethyl alcohol, paranitrophenol, H0NB, N-hydroxysuccinimide, N-hydroxyphthalimide, esters with HOB t)].
  • the activated amino group of the raw material includes, for example, the corresponding phosphoric amide.
  • Methods for removing (eliminating) the protecting group include catalytic reduction in the presence of a catalyst such as Pd black or Pd carbon in a stream of hydrogen, as well as anhydrous hydrogen fluoride, methanesulfonic acid, and trifluorosulfonic acid.
  • the elimination reaction by the above-mentioned acid treatment is generally carried out at a temperature of 120: to 40 ° C.
  • a cation scavenger such as 4-butanedithiol or 1,2-ethanedithiol.
  • the 2,4-dinitrophenyl group used as an imidazole protecting group for histidine is removed by thiophenol treatment, and the formyl group used as an indole protecting group for tributophan is replaced with 1,2-ethanedithiol and 1,4-butane described above.
  • an amide form of a polypeptide first, after amidating the ⁇ -carboxyl group of the carboxyl-terminal amino acid, the peptide chain is extended to a desired chain length on the amino group side, and A peptide from which only the protecting group for the terminal ⁇ -amino group was removed and a peptide (or amino acid) from which only the protecting group for the C-terminal carboxyl group was removed, and both peptides were mixed in the above-mentioned mixed solvent. To condense. Details of the condensation reaction are the same as described above. After purifying the protected peptide obtained by the condensation, all the protecting groups are removed by the above-mentioned method to obtain a desired crude polypeptide. The crude polypeptide is purified by using various known purification means, and the main fraction is freeze-dried to obtain an amide of the desired polypeptide.
  • an ester of the polypeptide the carboxy-terminal amino acid is condensed with a desired alcohol to form an amino acid ester.
  • An ester of the desired polypeptide can be obtained in the same manner as the amide of the tide.
  • the polypeptide of the present invention contains the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7, and has the same effect as that of the polypeptide, for example, a central nervous function regulating effect, circulating Any polypeptide may be used as long as it has a function of regulating function, a function of regulating heart function, a function of regulating kidney function, a function of regulating urinary function, or a function of regulating sensory organ function.
  • Examples of such a polypeptide include a peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 21 described above.
  • the polypeptide of the present invention can be further used as an antigen for preparing an antibody against the polypeptide.
  • an antigen for preparing an antibody against the polypeptide.
  • partial peptides such as the N-terminal peptide, C-terminal peptide and central peptide of the polypeptide of the present invention are used. It is possible.
  • a peptide containing individual domains may be used, but a peptide containing a plurality of domains at the same time may be used.
  • the partial peptide in this specification also has an amide (_C0NH 2 ) or ester at the C-terminal.
  • ester group examples are the same as in the case of the polypeptide described above.
  • the partial peptide has a carboxyl group or a hydroxyl group at a position other than the C-terminus, those in which those groups are amidated or esterified are also included in the partial peptide of the present invention. The ester at this time
  • polypeptide of the present invention or its partial peptide may be a fusion protein with a protein whose function or property is well known.
  • the salt of the partial peptide of the polypeptide of the present invention those similar to the aforementioned salts of the polypeptide are used.
  • the partial peptide of the polypeptide of the present invention or its amide or its ester or its salt can be prepared by the same synthetic method as in the case of the polypeptide of the present invention described above, or by converting the polypeptide of the present invention to an appropriate peptide. It can be produced by cutting with a peptidase.
  • the DNA encoding the polypeptide of the present invention may be a DNA containing a DNA encoding a polypeptide having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7. Anything may be used. Further, it may be any of genomic DNA, genomic DNA library, cDNA derived from the above-mentioned tissue and cells, cDNA library derived from the above-described tissues and cells, and synthetic DNA.
  • the vector used for the library may be any of bacteriophage, plasmid, cosmid, phagemid and the like. Alternatively, it can also be directly amplified by reverse transcriptase polymerase chain reaction (hereinafter abbreviated as RT-PCR method) using an RNA fraction prepared from the above-mentioned tissues and cells.
  • RT-PCR method reverse transcriptase polymerase chain reaction
  • the polypeptide having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 includes, as described above, the amino acid represented by SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 21
  • the DNA containing the DNA encoding the polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8 is, for example, a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 27.
  • DNA containing DNA is exemplified.
  • Examples of DNA containing DNA encoding a polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 21 include SEQ ID NO: 28.
  • Examples of a DNA containing a DNA encoding a polypeptide having an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 include, for example, SEQ ID NO: 27 or SEQ ID NO: 28 About 80% or more with base sequence, preferred Or more preferably about 90% or more, more preferably about 95% or more, more preferably about 98% or more.
  • Examples of the DNA containing a DNA encoding a polypeptide containing an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 include, for example, 1) SEQ ID NO: 27 or SEQ ID NO: 2 One or two or more (preferably about 1 to 30, preferably about 1 to 10, and more preferably (1 or 2)) bases in the base sequence represented by 8 are deleted 1 or 2 or more of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 27 or SEQ ID NO: 28 (preferably about 1 to 30, preferably about 1 to 10, more preferably Is a base sequence to which (1 or 2)) bases are added, 3 1 or 2 or more (preferably about 1 to 30) in the base sequence represented by SEQ ID NO: 27 or SEQ ID NO: 28 , Preferably, about 1-10, more preferably (1 or 2) 1 or 2 or more (preferably about 1 to 30; preferably 1 to 3) of the base sequence represented by SEQ ID NO: 27 or SEQ ID NO: 28, in which the base is inserted.
  • a DNA containing a DNA having a base sequence of about 10 to about 10, more preferably (1 or 2) amino acids substituted with another base, or a DNA having a base sequence obtained by combining them is also included. More specifically, (1) a DNA capable of binding to a receptor protein containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 under stringent conditions (2) contains the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 due to the degeneracy of the genetic code, which hybridizes with the sequence of the DNA containing For example, DNA encoding a polypeptide having the same amino acid sequence as the sequence of the DNA containing the DNA having the ability to bind to the receptor protein and the ability not to form a hybrid with the sequence defined in (1) may be used.
  • Examples of the DNA that hybridizes with the sequence of the DNA containing the DNA encoding the protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 include, for example, SEQ ID NO: : A nucleotide sequence having about 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more homology with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 28. And the like containing DNA.
  • the present invention encodes a polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7; the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8; and the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 21.
  • a DNA fragment containing a partial nucleotide sequence of DNA is also preferably used as a DNA detection probe.
  • DNA encoding the polypeptide of the present invention can also be produced by the following genetic engineering techniques.
  • the DNA library or the like can be cloned by a PCR method known per se using a synthetic DNA primer having a partial nucleotide sequence of the polypeptide of the present invention.
  • a synthetic DNA primer having a partial nucleotide sequence of the polypeptide of the present invention.
  • hybridization of the DNA incorporated into an appropriate vector with, for example, a DNA fragment having a partial or entire region of the polypeptide of the present invention or a synthetic DNA You can sort by one shot.
  • the hybridization is performed according to, for example, the method described in Mo ecu arC 1 on ng (2nd ed .; J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989).
  • the DNA encoding the cloned polypeptide of the present invention can be used as it is depending on the purpose, or can be digested with a restriction enzyme or added with a linker if desired.
  • the DNA may have ATG as a translation initiation codon at the 5 'end and TAA, TGA or TAG as a translation stop codon at the 3' end. These translation initiation codon and translation termination codon can also be added using a suitable synthetic DNA adapter.
  • the expression vector of the polypeptide of the present invention can be prepared by, for example, (a) cutting out a DNA fragment of interest from DNA encoding the polypeptide of the present invention, and (mouth) converting the DNA fragment into an appropriate expression vector. It can be produced by ligating downstream of one of the promoters.
  • Escherichia coli-derived plasmids eg, pBR322, pBR325, pUC12, pUC13
  • Bacillus subtilis-derived plasmids eg, pUB110, TP5, pC194
  • Yeast-derived plasmids eg, pSH19, pSH15
  • pacteriophages such as ⁇ phage
  • animal viruses such as retrovirus, vaccinia virus, and baculovirus are used.
  • the promoter used in the present invention may be any promoter as long as it is appropriate for the host used for gene expression.
  • an expression vector containing an enhancer, a splicing signal, a polyA addition signal, a selection marker, an SV40 replication origin (hereinafter sometimes abbreviated as SV40 ori), etc. may be used. be able to.
  • selectable markers include dihydrofolate reductase (hereinafter sometimes abbreviated as dhfr) gene [methotrexet (MTX) resistance], ampicillin resistance gene (hereinafter sometimes abbreviated as Amp 1 ), Neomycin resistance gene (hereinafter sometimes abbreviated as Neo, G418 resistance), etc.
  • DHF R gene when used as a selection marker by using CHO (dh fr-) cells, thymidine is used.
  • a signal sequence suitable for the host is added to the N-terminal side of the polypeptide or its partial peptide. If the host is a bacterium belonging to the genus Escherichia, a ⁇ ⁇ signal is added. If the host is Bacillus, ⁇ -amylase, signal sequence, subtilisin signal If the host is an animal cell, for example, if the host is an animal cell, for example, if the host is an yeast cell, the host cell is a yeast; Signal sequence, ⁇ ; —interferon signal sequence, antibody molecule, signal sequence, etc. can be used.
  • a bacterium belonging to the genus Escherichia for example, a bacterium belonging to the genus Escherichia, a bacterium belonging to the genus Bacillus, a yeast, an insect or an insect cell, an animal cell and the like are used.
  • Escherichia coli examples include Escherichia coli K12, DH1 [Processings of the National Academy of Sciences] Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 60, 160 (1968)], JM 103 (Nucleic Acids Research, Nucleic Acids Research), 9 309 (1 981)], J A221 (Journal of Molecular Biology), 120 volumes, 5 17 (1 978)], HB 101 (Journal of Molecular Biology) Bumore Kiura-I Biology, Vol. 41, 459 (1969)], C600 [Genetics, Vol. 39, 440 (1954)], etc. are used.
  • Bacillus subtilis MI114 Gene, 24, 255 (1983)]
  • 207-21 Journal of Biochemistry, 95 Vol. 87 (1984)].
  • yeast for example, Saccharomyces cerevisiae AH22, AH22R, NA87-11A, DKD-5D, 20B-12 and the like are used.
  • insects for example, silkworm larvae are used [Maeda et al., Nature, Vol. 315, 592 (1985)].
  • insect cells for example, when the virus is Ac NPV, a cell line derived from a larva of night rob moth (Spodoptera frugiperda cell; Sf cell), Trichoplusia ni
  • MG1 cells derived from the midgut HighFive cells derived from Trichoplusiani eggs, cells derived from Mamestra brassicae, cells derived from Estigmena acrea, and the like are used.
  • viruses When the virus is BmNPV, a cell line derived from silkworm (Bombyx mori N; BmN cell) is used.
  • Sf cells include Sf9 cells (ATCC CRL1711) and Sf21 cells [Vaughn, JL et al., In vitro, Vol. 13, pp. 213-217. (1977)] is used.
  • animal cells examples include monkey COS-7 cells, Vero cells, Chinese hamster cells CH ⁇ , DHFR gene-deficient Chinese hamster cells CH ⁇ (dh fr-CHO cells), mouse L cells, mouse 3T3 cells, mouse myeoma cells, human HEK293 cells, human FL cells, 293 cells, C127 cells, BALB 3T3 cells, Sp-2ZO cells, etc. Used.
  • Transformation of insect cells or insects is performed according to the method described in, for example, Bio / Technology, 6, 47-55 (1988).
  • Transformation of animal cells is performed, for example, according to the method described in Virology, 52, 456 (1973).
  • the above-described method for selecting cells by clonal selection of cells in which the expression vector introduced into the animal cells is integrated into the chromosome is used. is there. Specifically, a transformant is selected using the above-mentioned selection marker as an index. Furthermore, a stable animal cell line having a high expression ability of the polypeptide of the present invention can be obtained by repeatedly performing clone selection on the animal cells obtained using the selection marker as described above.
  • the MTX concentration is gradually increased and the cells are cultured, and a resistant strain is selected, thereby encoding the polypeptide of the present invention or a partial peptide thereof together with the dhfr gene.
  • DNA can also be amplified intracellularly to obtain higher expressing animal cell lines.
  • the polypeptide of the present invention can be produced by culturing the above transformant under conditions capable of expressing the DNA encoding the polypeptide of the present invention, and producing and accumulating the polypeptide of the present invention. .
  • a liquid medium is suitable as a medium used for culturing, and a carbon source necessary for the growth of the transformant is contained therein.
  • Nitrogen sources inorganic substances and others.
  • carbon sources include glucose, dextrin, soluble starch, and sucrose.
  • nitrogen sources include ammonium salts, nitrates, corn chips, liquor, peptone, casein, meat extract, soybean meal, and potato extract.
  • inorganic or organic substances such as calcium chloride, sodium dihydrogen phosphate, and magnesium chloride.
  • yeast, vitamins, growth promoting factors and the like may be added.
  • the pH of the medium is preferably about 5-8.
  • a medium for culturing Escherichia bacteria for example, glucose, M9 medium containing noric acid [Miller, Journal of Experiments in Molecular Genetics, 431-433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972 ] Is preferred.
  • a drug such as 3 / 3-indolylacrylic acid can be added to make the promoter work efficiently.
  • culturing is usually performed at about 15 to 43 ° C for about 3 to 24 hours, and if necessary, aeration and stirring may be added.
  • the cultivation is usually performed at about 30 to 40 ° C for about 6 to 24 hours, and if necessary, aeration and stirring can be applied.
  • the culture medium When culturing a transformant in which the host is an insect cell, the culture medium may be Grace's Insect Medium (Grace.TCC, Nature, 195, 788 (1962)), such as 10% serum-inactivated serum. Those to which additives are appropriately added are used. Preferably, ⁇ of the medium is adjusted to about 6.2 to 6.4. Culture is usually performed at about 27 ° C for about 3 to 5 days, and aeration and agitation are added as necessary.
  • MEM medium containing 5-20% fetal bovine serum (Science, 122, 501 (1952)], DMEM medium [Virology OHrology], 8, 396 (1959)], RPM 1640 Medium [Journal of the American Medical Association, Vol. 199, May 19 (1967)], Medium 199 [Processing of the American Society] 1 The Proceeding of the Society for the Biological Medicine, Vol. 73, 1 (1950)] is used.
  • the pH is about 6-8.
  • Cultivation is usually performed at about 30 to 40 ° C for about 15 to 60 hours, and aeration and stirring are added as necessary.
  • CH ⁇ (dhfr-) cells and the dhfr gene are used as selection markers, it is preferable to use a DMEM medium containing dialyzed fetal serum containing almost no thymidine.
  • polypeptide of the present invention can be separated and purified from the above culture by, for example, the following method.
  • the cells or cells are collected by culturing, and the cells or cells are collected by a known method, and suspended in an appropriate buffer. After the cells or cells are destroyed by thawing or the like, a method of obtaining a crude extract of the polypeptide by centrifugation or filtration may be used as appropriate.
  • the buffer may contain a protein denaturing agent such as urea or guanidine hydrochloride, or a surfactant such as Triton X-100 (registered trademark, sometimes abbreviated as TM hereinafter).
  • the bacterial cells or cells are separated from the supernatant by a method known per se, and the supernatant is collected.
  • Purification of the polypeptide of the present invention contained in the thus obtained culture supernatant or extract can be carried out by appropriately combining known separation and purification methods.
  • These known separation and purification methods include salting out and solvent precipitation.
  • Methods that mainly use differences in molecular weight such as methods using solubility, dialysis, ultrafiltration, gel filtration, and SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, and differences in charge, such as ion-exchange chromatography.
  • Methods that use specific affinity such as affinity chromatography, methods that use differences in hydrophobicity, such as reversed-phase high-performance liquid chromatography, isoelectric focusing, and chromatofocusing. A method utilizing the difference between the isoelectric points is used.
  • the thus-obtained polypeptide of the present invention when obtained in a free form, it can be converted to a salt by a method known per se or a method analogous thereto, and conversely, when the polypeptide of the present invention is obtained in a salt, it is a known method Alternatively, it can be converted into a free form or another salt by a method analogous thereto.
  • the polypeptide of the present invention produced by the recombinant can be arbitrarily modified or the polypeptide can be partially removed by applying an appropriate protein modifying enzyme before or after purification.
  • an appropriate protein modifying enzyme for example, trypsin, chymotrypsin, arginyl endopeptidase, proteinase, glycosidase and the like are used.
  • the presence of the polypeptide of the present invention thus produced can be measured by enzyme immunoassay using a specific antibody or the like.
  • the DNA encoding the polypeptide of the present invention or the polypeptide of the present invention includes (1) exploring the physiological action of the polypeptide of the present invention, (2) preparing a synthetic oligonucleotide probe or PCR primer, and (3) a ligand for SENR. Acquisition of DNA encoding precursor protein, ⁇ ⁇ Development of receptor-binding assay system using recombinant receptor protein expression system, screening of drug candidate compounds, ⁇ Acquisition of antibody and antiserum 6 Development of diagnostic agents using DNA, RNA, antibodies or antiserum 7 Central nervous function regulators, circulatory function regulators, heart function regulators, renal function regulators, urinary function regulators, sensory organ function regulators It can be used for the development of pharmaceuticals such as drugs, and gene therapy.
  • SENR agonist or an anginaist specific to a warm-blooded animal such as a human by a receptor binding assay using a recombinant SENR expression system described below.
  • a second strike or an evening gonist can be used as a preventive or therapeutic agent for various diseases.
  • the polypeptide of the present invention or the DNA encoding the same are those recognized as ligands by SENR expressed in the central nervous system, circulatory system, heart, kidney, urinary system or sensory system. Therefore, it is useful as a safe and low toxic drug. Since the polypeptide of the present invention or the DNA encoding the same is involved in central nervous system function control, circulatory function control, heart function control, kidney function control, urinary function control or sensory organ control, etc.
  • senile dementia cerebrovascular dementia
  • degenerative degenerative diseases caused by systemic transformation eg, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Pick's disease, Huntington's disease, etc.
  • high (low) blood pressure e.g., a low blood pressure
  • renal disease eg. : Chronic renal failure, nephritis, etc.
  • heart disease eg, heart failure, acute myocardial infarction, etc.
  • frequent urination urinary incontinence
  • hearing loss olfactory abnormalities
  • visual abnormalities e.g., visual abnormalities, etc.
  • the polypeptide of the present invention or DNA encoding the same is used as the above-mentioned medicament, it can be formulated according to a conventional method.
  • aseptic with orally as tablets, capsules, elixirs, microcapsules and the like, coated with sugar coating or enteric coating as necessary, or with water or other pharmaceutically acceptable liquids It can be used parenterally in the form of injections, such as solutions or suspensions.
  • the compound or a salt thereof is mixed with a physiologically acceptable carrier, flavoring agent, excipient, vehicle, preservative, stabilizer, binder and the like in a unit dosage form generally required for a recognized pharmaceutical practice. It can be manufactured by doing.
  • the amount of the active ingredient in these preparations is such that a suitable dosage in the specified range can be obtained.
  • the DNA When using the DNA of the present invention, the DNA may be used alone or in a retrovirus vector. After insertion into a suitable vector such as a vector, an adenovirus vector, an adenovirus associated virus vector, etc., it can be carried out in a conventional manner.
  • a suitable vector such as a vector, an adenovirus vector, an adenovirus associated virus vector, etc.
  • a suitable leavening agent, a lubricant such as magnesium stearate, a sweetening agent such as sucrose, lactose or saccharin, and a flavoring agent such as peppermint, cocoa oil or cellulose are used.
  • the unit dosage form is a capsule, the above type of material can further contain a liquid carrier such as an oil or fat.
  • Sterile compositions for injection can be formulated according to standard pharmaceutical practice, such as dissolving or suspending the active substance in vehicles such as water for injection, and naturally occurring vegetable oils such as sesame oil and coconut oil. it can.
  • aqueous liquids for injection include physiological saline, isotonic solutions containing glucose and other adjuvants (eg, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.).
  • Agents such as alcohols (eg, ethanol), polyalcohols (eg, propylene glycol, polyethylene glycol), non-ionic surfactants (eg, polysorbate 80 (TM), HCO-50) Good.
  • the oily liquid include sesame oil and soybean oil, which may be used in combination with benzyl benzoate, benzyl alcohol and the like as a solubilizing agent.
  • buffers eg, phosphate buffer, sodium acetate buffer
  • soothing agents eg, benzalkonium chloride, proforce hydrochloride, etc.
  • stabilizers eg, human serum albumin, polyethylene glycol, etc.
  • a preservative eg, benzyl alcohol, phenol, etc.
  • an antioxidant eg, an antioxidant, and the like.
  • the prepared injection solution is usually filled in a suitable ampoule.
  • the preparations obtained in this way are safe and low toxic, so they can be used, for example, in humans and mammals (eg, mice, rats, guinea pigs, egrets, sheep, sheep, bush, horses, cats, dogs, monkeys, etc.). Can be administered.
  • the dosage of the polypeptide of the present invention or the DNA encoding the same varies depending on the symptoms and the like. 1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg.
  • the single dose varies depending on the subject, target organ, symptoms, and administration method. For example, in the case of parenteral injection, it may be used for adult patients with heart failure (weight 6 kg).
  • parenteral injection it may be used for adult patients with heart failure (weight 6 kg).
  • about 0.01 to 30:11, preferably about 0.1 to 2 Omg, and more preferably about 0.1 to 10 mg per day should be administered by intravenous injection. It is convenient. For other animals, the dose can be administered in terms of 60 kg.
  • the precursor protein of the polypeptide of the present invention or its salt, its production method and use will be described in more detail below.
  • Examples of the precursor protein of the polypeptide of the present invention or a salt thereof include, for example, the N-terminus or (and) the C-terminus of the above-described protein of the present invention.
  • the precursor protein of the present invention includes a protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 or SEQ ID NO: 29, etc. Is used.
  • the precursor protein of the present invention can be used in any tissue of human warm-blooded animals (for example, guinea pig, rat, mouse, bush, hidge, magpie, monkey, etc.) (for example, pituitary gland, kidney, brain, Kidney, liver, gonad, thyroid, gall bladder, bone marrow, adrenal gland, A protein derived from skin, muscle, lung, gastrointestinal tract, blood vessel, heart, etc.) or a cell, etc., and an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 or SEQ ID NO: 29; Any protein may be used as long as it has the same or substantially the same amino acid sequence.
  • Substantially the same activity includes, for example, receptor binding activity, signal transduction activity and the like. Substantially the same means that the receptor binding activity and the like are the same in nature. Therefore, the strengths such as the strength of the receptor binding activity and the quantitative factors such as the molecular weight of the protein may be different.
  • Examples of the precursor protein of the present invention include: (1) one or more (preferably 1 to 30) amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 or SEQ ID NO: 29; (Preferably about 1 to 10, more preferably (1 or 2)) amino acid sequence (s), (2) SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 or SEQ ID NO: 29 An amino acid sequence to which one or more amino acids (preferably about 1 to 30, preferably about 1 to 10, and more preferably (1 or 2)) in the amino acid sequence have been added; SEQ ID NO: 18, 1 or 2 or more (preferably about 1 to 30, preferably 1 to: about L0) in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19 or SEQ ID NO: 29.
  • amino acids are inserted Amino acid sequence, 4 SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 1 9, or SEQ ID NO: 29 with one or two or more of ⁇ amino acid sequence represented (preferably about 1 to about 30, preferably, About 1 to 10 amino acids, more preferably (1 or 2) amino acids substituted with another amino acid, or a protein containing an amino acid sequence obtained by combining them is also included. .
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8 As a precursor protein of the polypeptide of the present invention containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8, specifically, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 18 or SEQ ID NO: 19 is contained. And the quality of the evening
  • a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 29, etc. can give.
  • the precursor protein has an N-terminus (amino terminus) at the left end and a C-terminus (carboxyl terminus) at the right end, according to the convention of peptide notation.
  • the precursor protein of the present invention containing the amino acid sequence represented by the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 or SEQ ID NO: 29, or the like usually has a carboxyl group at the C-terminus ( —C00H) or carboxylate (—C00—), but the C terminal may be amide (—C0NH 2 ) or ester (—C00R).
  • Is a ester of scale such as methyl, Echiru, n - propyl, C WINCH 6 alkyl group such as isopropyl or n- Bed chill, cyclopentyl, C 3 _ 8 cyclo alkyl group such as cyclohexyl, phenyl, " - C 6 _ 1 2 7 aryl group such as naphthyl, benzyl, phenethyl, phenylene Lou such benzhydryl - 2 alkyl or a- naphthylmethyl etc. a- naphthyl - C i _ 2 C 7 such as an alkyl - 1 4 Aral kill.
  • Examples of the salt of the precursor protein of the present invention include the same as those exemplified above as the salt of the polypeptide of the present invention.
  • the precursor protein of the present invention can be prepared by a method for purifying a protein from the tissue or cells of a human warm-blooded animal according to the method for producing the polypeptide of the present invention described above. It can be produced or can be produced according to the protein synthesis method. Further, it can also be produced by culturing a transformant containing a DNA encoding the precursor protein of the present invention according to the method for producing the polypeptide of the present invention described above.
  • the tissues or cells of human warm-blooded animals are homogenized, and then extracted with an acid or an organic solvent.
  • the extract is subjected to salting out, dialysis, and gel filtration. It can be purified and isolated by combining chromatography such as reverse phase chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography and the like.
  • a commercially available resin for peptide synthesis suitable for amide formation can be used.
  • a resin for example, the above-mentioned resin for peptide synthesis or the like is used.
  • an amino acid having an ⁇ -amino group and a side chain functional group appropriately protected is condensed on the resin in accordance with the sequence of the target peptide according to various known condensation methods.
  • the peptide is cleaved from the resin and, at the same time, various protecting groups are removed.
  • an intramolecular disulfide bond formation reaction is carried out in a highly diluted solution to obtain the desired precursor protein of the present invention. get.
  • the precursor protein of the present invention contains an amino acid sequence identical or substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, or SEQ ID NO: 29 described above.
  • Precursor protein having the same action as the polypeptide of the present invention for example, a central nervous function controlling action, a circulatory function controlling action, a heart function controlling action, a kidney function controlling action, a urinary function controlling action or a sensory organ function controlling action. You may have what you have.
  • the precursor protein of the present invention can be further used as an antigen for preparing an antibody against the precursor protein.
  • the protein as such an antigen is the precursor protein of the present invention in addition to the above-mentioned precursor protein of the present invention.
  • N-terminal peptide, C-terminal peptide, partial peptide such as central peptide, etc. are used.
  • a peptide containing each domain individually can be used, but a peptide containing a plurality of domains at the same time may be used.
  • the same salts as the aforementioned salts of the precursor protein are used.
  • the partial peptide of the precursor protein of the present invention or its amide, ester or salt thereof can be prepared by the same synthetic method as in the case of the precursor protein described above, or the precursor protein of the present invention can be prepared with an appropriate peptidase. It can be manufactured by cutting.
  • the DNA encoding the precursor protein of the present invention encodes a protein containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 or SEQ ID NO: 29. Any DNA may be used as long as it contains DNA. Further, it may be any of genomic DNA, genomic DNA library, the above-described tissue / cell-derived cDNA, the above-mentioned tissue-cell-derived cDNA library, and synthetic DNA.
  • the vector used for the library may be any of bacteriophage, plasmid, cosmid, phagemid and the like.
  • the RNA fraction can be directly amplified by reverse transcriptase polymerase chain reaction (hereinafter abbreviated as RTPCR method) using an RNA fraction prepared from the above-mentioned tissue / cell.
  • RTPCR method reverse transcriptase polymerase chain reaction
  • DNA containing a DNA encoding a protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 or SEQ ID NO: 29 for example, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 or SEQ ID NO: 30, and DNA containing a DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 30, etc., as well as SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16,
  • % Or more preferably about 60% or more, more preferably about 70% or more, more preferably about 80% or more, particularly preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more. And the like containing DNA.
  • Examples of the DNA containing a DNA encoding a protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 or SEQ ID NO: 29 include: For example, 1 1 or 2 or more (preferably about 1 to 30, preferably 1 to 30) of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 or SEQ ID NO: 30 Approximately 10 nucleotides, more preferably (1 or 2) nucleotide sequence deleted, (2) SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 or SEQ ID NO: 30 A base sequence to which one or more (preferably about 1 to 30, preferably about 1 to 10, and more preferably (1 or 2)) bases are added in the base sequence; 15; SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 17 or sequence No .: 1 or 2 or more (preferably about 1 to 30, preferably about 1 to 10, more preferably (1 or 2)) bases in the base sequence represented by 30 have been inserted 1 or 2
  • an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 or SEQ ID NO: 29 under stringent conditions DNA derived from a mammal that hybridizes with the sequence of the DNA containing the DNA encoding the protein contained therein, (2) SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 or SEQ ID NO: 29 due to degeneracy of the genetic code Is Does not hybridize with the sequence of the DNA containing the DNA encoding the protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence and the sequence specified in (1), DNA encoding a protein having a sequence is used. Hybridization can be performed according to a method known per se or a method analogous thereto.
  • SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 or SEQ ID NO: 29 A sequence containing a DNA encoding a protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 29.
  • the hybridizing DNA includes, for example, about 70% or more, preferably about 80% or more, of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 or SEQ ID NO: 30.
  • DNA containing a nucleotide sequence having a homology of about 90% or more, most preferably about 95% or more is used.
  • DNA fragment containing the nucleotide sequence is also preferably used as a DNA detection probe.
  • the DNA encoding the precursor protein of the present invention can also be produced by a genetic engineering technique in the same manner as the above-described polypeptide of the present invention.
  • the DNA encoding the precursor protein of the present invention or the precursor protein of the present invention includes: (1) searching for a physiological action of the precursor protein (or the polypeptide of the present invention); Preparation of a primer or PCR primer, 3 Obtaining DNA encoding the polypeptide of the present invention, ⁇ ⁇ Development of a receptor-binding atsei system using a recombinant receptor expression system and Screening of drug candidates, 5Obtaining antibodies and antisera, ⁇ ⁇ Development of diagnostics using DNA and RNA, antibodies or antisera, 7Central nervous function regulators, cardiovascular function regulators, cardiac function regulators It can be used for the development of medicines such as renal function regulators, urinary function regulators, and sensory organ function regulators, and gene therapy.
  • the receptor-uncoupled Atsushi system using the recombinant SENR expression system described below can be used to screen a specific SENR agonist or angulinist for warm-blooded animals such as humans.
  • an angel gonist can be used as a preventive or therapeutic agent for various diseases.
  • the precursor protein of the present invention or the DNA encoding the same are those recognized as ligands by SENR expressed in the central nervous system, circulatory system, heart, kidney, urinary system or sensory organ system, etc. Therefore, it is useful as a safe and low-toxic drug.
  • the precursor protein of the present invention or the DNA encoding the same are involved in central nervous system function control, circulatory function control, heart function control, kidney function control, urinary function control, sensory organ control, etc.
  • dementia due to senile dementia cerebrovascular dementia, regression and metabolic disease of phylogenic transformation (eg, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Pick's disease, Huntington's disease, etc.) (Eg, chronic renal failure, nephritis, etc.), heart disease (eg, heart failure, acute myocardial infarction, etc.), pollakiuria, urinary incontinence, hearing loss, olfactory abnormalities, visual abnormalities, etc. it can.
  • phylogenic transformation eg, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Pick's disease, Huntington's disease, etc.
  • heart disease eg, heart failure, acute myocardial infarction, etc.
  • pollakiuria urinary incontinence
  • hearing loss olfactory abnormalities
  • visual abnormalities visual abnormalities, etc. it can.
  • the precursor protein of the present invention or a DNA encoding the same can be formulated according to a conventional method.
  • tablets, capsules, elixirs, microcapsules, and the like coated with sugar coating or enteric coating as needed, orally, or aseptic solution with water or other pharmaceutically acceptable liquids, Or they can be used parenterally in the form of injections such as suspensions.
  • the compound or a salt thereof is generally recognized together with a physiologically acceptable carrier, flavoring agent, excipient, vehicle, preservative, stabilizer, binder and the like. It can be manufactured by mixing in the unit dosage form required for the formulation. The amount of the active ingredient in these preparations is such that a suitable dosage in the specified range can be obtained.
  • additives that can be mixed with tablets, capsules, and the like, the same additives as those described above can be used.
  • aqueous liquids for injection include physiological saline, isotonic solutions containing glucose and other adjuvants (eg, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.).
  • Agents such as alcohols (eg, ethanol), polyalcohols (eg, propylene glycol, polyethylene glycol), nonionic surfactants (eg, polysorbate 80 (TM), HCO-50) may be used in combination.
  • the oily liquid include sesame oil and soybean oil, which may be used in combination with benzyl benzoate, benzyl alcohol and the like as a solubilizing agent.
  • buffers eg, phosphate buffer, sodium acetate buffer
  • soothing agents eg, benzalkonium chloride, proforce hydrochloride, etc.
  • stabilizers eg, human serum albumin, polyethylene glycol, etc.
  • storage Agents eg, benzyl alcohol, phenol, etc.
  • antioxidants eg, antioxidants and the like.
  • the prepared injection solution is usually filled in a suitable ampoule.
  • the preparations obtained in this way are safe and have low toxicity, so they can be used, for example, in humans and mammals (for example, mice, rats, guinea pigs, egrets, higgs, bush dogs, dogs, cats, dogs, monkeys). Can be administered.
  • mammals for example, mice, rats, guinea pigs, egrets, higgs, bush dogs, dogs, cats, dogs, monkeys.
  • the dosage of the precursor protein of the present invention or the DNA encoding the same may vary depending on the symptoms and the like.
  • (As 60 kg) per day from about 0.1 to 100 mg, preferably from about 1.0 to 50 mg, more preferably from about 1.0 to 20 mg.
  • the single dose varies depending on the subject of administration, target organ, symptoms, administration method, etc. It is convenient to administer about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 2 Omg, more preferably about 0.1 to 10 mg per day by intravenous injection. In the case of other animals, the dose can be administered in terms of 60 kg.
  • S ENR amino acids identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 26 SENR or a salt thereof characterized in that it contains a sequence, or 1 to 30 or less, preferably 1 to 10 or less in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 26 1 to 30 amino acids, preferably 1 to 10 amino acids are added (or inserted) to the amino acid sequence represented by the amino acid sequence having the amino acid deleted, SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 26.
  • Amino acid sequence or SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 2 SENR or a salt thereof, which is a protein containing an amino acid sequence in which 1 to 30 amino acids, preferably 1 to 10 amino acids in the amino acid sequence represented by 6, are substituted with another amino acid. can give.
  • the partial peptide of SENR used in the present invention may be any partial peptide of SENR of the present invention described above.
  • SENR protein molecules of the present invention And a site having a binding activity to the polypeptide of the present invention.
  • S ENRs or partial peptides thereof used in the present invention are described in Tal, M. et al., Biochem. Biophys. Res.Commun., 209, 752-759, 1995, Marchese, A .. Genomics, 29, 335-344, 1995, and can be produced by the same method as that described in EP 859052 or a method analogous thereto, or by the same method as the above-described polypeptide of the present invention. can do.
  • the salt of S ENR or a partial peptide thereof used in the present invention include those similar to the above-mentioned salts of the polypeptide of the present invention.
  • the DNA encoding the SENR or the partial peptide thereof used in the present invention may be any DNA containing the DNA encoding the SENR or the partial peptide thereof. Further, it may be any of genomic DNA, genomic DNA library, the above-described tissue / cell-derived cDNA, the above-described tissue / cell-derived cDNA library, and synthetic DNA.
  • the vector used for the library may be any of bacteriophage, plasmid, cosmid, phagemid and the like.
  • the RNA can be directly amplified by RT-PCR using an RNA fraction prepared from the above-mentioned tissue / cell.
  • DNA encoding S ENR or a partial peptide thereof used in the present invention can be obtained by the method described in Tal, M.
  • polypeptide of the present invention its precursor protein, DNA and antibody encoding the polypeptide or precursor protein will be specifically described below.
  • DNA encoding the polypeptide of the present invention may be used as a polypeptide or as an agent for preventing or treating SENR deficiency. Can be used.
  • the polypeptide of the present invention since the polypeptide of the present invention, its precursor protein or SENR is reduced in vivo, the physiological effects of ligands (control of central nervous function, circulatory function, cardiac function, kidney When there is a patient who cannot expect a function of regulating a function, a function of regulating a urinary function or a function of regulating a sensory organ function), (a) administering the DNA encoding the polypeptide of the present invention or its precursor protein to the patient and expressing Or (mouth) by inserting a DNA encoding the polypeptide of the present invention or its precursor protein into brain cells or the like and expressing the same, and then transplanting the brain cells into the patient.
  • the DNA encoding the polypeptide or the precursor protein thereof of the present invention can be used as a safe and low-toxicity agent for preventing or treating a deficiency of the polypeptide or the precursor protein.
  • the DNA is inserted alone or into an appropriate vector such as a retrovirus vector, an adenovirus vector, an adenovirus associated virus vector, and the like. It can be carried out according to the same means as when a DNA encoding the polypeptide of the present invention or its precursor protein or a partial peptide thereof is used as a medicine.
  • This quantification method can be used, for example, in combination with a competition method. That is, by bringing the sample into contact with the polypeptide of the present invention or its precursor protein, the concentration of S ENR or a salt thereof, or a partial peptide of S ENR or a salt thereof in the sample can be measured.
  • the polypeptide By using S ENR or its salt or its partial peptide or its salt, or by constructing a recombinant SENR expression system and using a receptor binding system using this expression system, the polypeptide Alternatively, a compound (eg, a peptide, a protein, a non-peptide compound, a synthetic compound, a fermentation product, etc.) or a salt thereof that changes the binding property of the precursor protein to S ENR can be screened. Such compounds have cell stimulatory activity via SENR
  • “Altering the binding to a ligand” includes both the case of inhibiting the binding to the ligand and the case of promoting the binding to the ligand.
  • polypeptide containing an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 22 or an amide or an ester or a polypeptide thereof, in addition to the above, as the polypeptide of the present invention or its precursor protein Salt, and its precursor protein or its salt are used.
  • polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 22, its amide or its ester or its salt, and its precursor protein or its salt are the above-mentioned polypeptide of the present invention or its amide or its amide Esters or their salts, and their precursor proteins or their salts can be produced by the same method.
  • polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 22 and the DNA encoding the precursor protein are the above-described polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 22; Any DNA may be used as long as it contains DNA encoding a body protein. Further, it may be any of genomic DNA, genomic DNA library, the above-described tissue / cell-derived cDNA, the above-described tissue / cell-derived cDNA library, and synthetic DNA.
  • the vector used for the library may be any of pacteriophage, plasmid, cosmid, phagemid and the like. Also, from the above-described tissue and cells Amplification can also be performed directly by the RT-PCR method using the prepared RNA fraction.
  • polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 22 and the DNA encoding the precursor protein used in the present invention are the same as the above-described polypeptide of the present invention and the DNA encoding the precursor protein. It can be obtained by the method of (1).
  • polypeptide of the present invention refers to the above-mentioned “polypeptide of the present invention”.
  • a polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 22 and “a precursor of the polypeptide of the present invention” is the “precursor of the polypeptide of the present invention” and “sequence” No. 22 as a precursor of the polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 22.
  • DNA encoding the polypeptide of the present invention refers to "DNA encoding the polypeptide of the invention” and "DNA encoding the polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 22", and "encoding the precursor of the polypeptide of the invention.”
  • DNA means the above-mentioned "DNA encoding the precursor of the polypeptide of the present invention” and "DNA encoding the precursor of the polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 22" .
  • the present invention relates to (i) a case where the polypeptide of the present invention or its precursor protein is brought into contact with S ENR or a salt thereof or a partial peptide or a salt thereof, and (ii) ) The above-mentioned SENR or a salt thereof or the SE A polypeptide of the present invention or a precursor protein thereof and a test compound, which are compared with a case where the partial peptide of NR or a salt thereof is contacted with the polypeptide of the present invention or a test compound thereof; It is intended to provide a method for screening a compound or a salt thereof which alters the binding property to SENR as described above.
  • the polypeptide of the present invention or its precursor protein is brought into contact with the above-mentioned SENR or a partial peptide of said SENR; and (ii) the above-mentioned S ENR or the above-mentioned S ENR
  • the polypeptide of the present invention or its precursor protein and a test compound are brought into contact with the partial peptide of Example 1, the amount of ligand binding to the S ENR or the partial peptide of the S ENR, cell stimulating activity, etc. are measured. Then compare.
  • a compound that activates SENR for example, the polypeptide of the present invention or its precursor protein
  • the compound that activates SENR and the test compound contain SENR SENR-mediated cell stimulating activity when contacted with cells (eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca release, intracellular cAMP production, intracellular cGMP production, inositol phosphate production, cell membrane Potential fluctuation, phosphorylation of intracellular protein, activation of c-fos, activity of promoting or suppressing pH reduction, etc.) and comparing them.
  • SENR SENR-mediated cell stimulating activity when contacted with cells (eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca release, intracellular cAMP production, intracellular cGMP production, inositol phosphate production, cell membrane Potential fluctuation, phosphorylation of intracellular protein, activation of c-fos, activity of promoting or suppressing pH reduction, etc.) and comparing them
  • a compound that activates SENR (eg, the polypeptide of the present invention or its precursor protein) is brought into contact with SENR expressed on the cell membrane by culturing a transformant containing DNA encoding SENR. And when a compound that activates SENR and a test compound are brought into contact with SENR expressed on the cell membrane by culturing a transformant containing DNA encoding SENR.
  • S ENR-mediated cell stimulating activity eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ release, intracellular cAMP production, intracellular cGMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein Phosphorylation, activation of c-fos, activity of promoting or suppressing pH reduction, etc.
  • S ENR-mediated cell stimulating activity eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ release, intracellular cAMP production, intracellular cGMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein Phosphorylation, activation of c-fos, activity of promoting or suppressing pH reduction, etc.
  • the SENR used in the screening method of the present invention may be any as long as it contains the above-described SENR or partial peptide of SENR. Fractions and the like are preferred. However, since it is extremely difficult to obtain human-derived organs, S ENR expressed in large amounts using recombinants is suitable for screening.
  • the cell When a cell containing SENR is used, the cell may be immobilized with dataraldehyde, formalin, or the like.
  • the immobilization method can be performed according to a method known per se.
  • the cell containing S ENR refers to a host cell that has expressed S ENR, Examples of the host cell include the aforementioned Escherichia coli, Bacillus subtilis, yeast, insect cells, animal cells, and the like.
  • the membrane fraction refers to a fraction abundant in cell membrane obtained by disrupting cells and then obtained by a method known per se.
  • Cells can be crushed by crushing the cells with a Potter-Elvehjem homogenizer, crushing with a Warlinda blender or Polytron (Kinematica), crushing with ultrasonic waves, or pressing the cells from a thin nozzle while applying pressure with a French press. Crushing by erupting.
  • centrifugal fractionation methods such as differential centrifugation and density gradient centrifugation are mainly used.
  • the cell lysate is centrifuged at a low speed (500 rpm to 3000 rpm) for a short time (typically about 1 minute to 10 minutes), and the supernatant is further centrifuged at a higher speed (15000 rpm to 30000 rpm) for 30 min. Centrifuge for 1 minute to 2 hours, and use the resulting precipitate as the membrane fraction.
  • the membrane fraction is rich in expressed SENR and membrane components such as cell-derived phospholipids and membrane proteins.
  • the amount of SENR in the cell or membrane fraction containing the SENR is preferably 10 to 10 molecules per cell, and more preferably 10 to 10 molecules per cell.
  • an appropriate SENR fraction and a labeled polypeptide of the present invention are used.
  • Peptides or their precursor proteins are used.
  • the SENR fraction is preferably a natural SENR fraction or a recombinant SENR fraction having an activity equivalent thereto.
  • the equivalent activity indicates equivalent ligand binding activity and the like.
  • the labeled ligand a labeled ligand, a labeled ligand analog compound, or the like is used. For example, ligands labeled with [H], [I], [C], [S], etc. Which can be used.
  • a cell containing the S ENR or a membrane fraction of the cell is used for screening.
  • Prepare the receptor preparation by suspending in a suitable buffer.
  • the buffer may be any buffer as long as it does not inhibit the binding between the ligand and the receptor, such as a phosphate buffer of pH 4 to 10 (preferably pH 6 to 8) or a buffer of Tris-HCl.
  • a surfactant such as CHAPS, Tween-80 (Kao-Atlas), digitonin, and dexcholate can be added to the buffer.
  • protease inhibitors such as PMS F, louptin, E-64 (manufactured by Peptide Research Institute), and peptide sutin are added for the purpose of suppressing the degradation of the receptor of the present invention by the protease and the protease. You can also.
  • a fixed amount (500 cpm to 500,000 cpm) of the labeled polypeptide of the present invention is added to 0.0 linl to 10 ml of the receptor solution, and 10 to 10 M The test compound is allowed to coexist.
  • a reaction tube containing a large excess of an unlabeled polypeptide of the present invention is also prepared to determine the non-specific binding amount (NSB).
  • the reaction is carried out at 0 to 50 ° C, preferably 4 to 37 ° C, for 20 minutes to 24 hours, preferably 30 minutes to 3 hours.
  • the reaction solution is filtered through a glass fiber filter or the like, washed with an appropriate amount of the same buffer, and the radioactivity remaining on the glass fiber filter is measured with a liquid scintillation counter or a counter.
  • Count in the absence of substances that antagonize nonspecific binding amount from the (B Q) when (NS B) a count obtained by subtracting the (B.- NSB) was 1 0 0% specific binding (B- NSB) Can be selected as a candidate substance having a competitive inhibition ability.
  • Is based on SENR-mediated cell stimulating activity eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca release, intracellular cAAiP production, intracellular cGMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuations, intracellular protein phosphorus Oxidation, activation of c-fos, activity for promoting or suppressing pH decrease, etc.
  • SENR-mediated cell stimulating activity eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca release, intracellular cAAiP production, intracellular cGMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuations, intracellular protein phosphorus Oxidation, activation of c-fos, activity for promoting or suppressing pH decrease, etc.
  • SENR-mediated cell stimulating activity eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca release, intracellular cAAiP production, intracellular cGMP production,
  • cells expressing an appropriate SENR are required.
  • the cells expressing the SENR of the present invention are preferably the above-mentioned recombinant SENR-expressing cell lines.
  • Test compounds include, for example, peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, and the like.
  • the kit for screening a compound or a salt thereof that alters the binding between a polypeptide or its precursor protein and SENR of the present invention includes SENR or a salt thereof, a partial peptide of SENR or a salt thereof, a cell containing SENR, Alternatively, it contains the membrane fraction of cells containing S ENR and the polypeptide of the present invention or its precursor protein.
  • Examples of the screening kit of the present invention include the following.
  • CH ⁇ cells expressing S ENR were subcultured on a 12-well plate at 5 ⁇ 10 cells / well, and cultured at 37 ° C, 5% CO 2 , and 95% air for 2 days.
  • Ligand labeled with [CHCI], [c], [s], etc. Dissolve in a suitable solvent or buffer solution and store at 4 ° C or -20 ° C. Dilute.
  • polypeptide of the present invention or its precursor protein is dissolved in PBS containing 0.1% ⁇ serum albumin (Sigma) so as to be ImM, and stored at ⁇ 20 ° C.
  • the compound or a salt thereof obtained by using the screening method or the screening kit of the present invention is a compound that changes the binding (inhibits or promotes the binding) between the polypeptide of the present invention or its precursor protein and SENR. Specifically, it is a compound having a cell stimulating activity via S ENR or a salt thereof (so-called S ENR agonist), or a compound having no such stimulating activity (so-called S ENR antagonist). Examples of the compound include peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, and fermentation products. These compounds may be novel compounds or known compounds.
  • a specific method of evaluating whether the above is a S ENR agonist or an evening gonist may follow the following (i) or (ii).
  • a compound that changes the binding property of the polypeptide of the present invention or its precursor protein to S ENR (particularly, inhibits the binding) by performing the binding assay shown in the screening methods 1) to 3) above. After obtaining, it is determined whether or not the compound has the above-described SENR-mediated cell stimulating activity.
  • the compound having a cell stimulating activity or a salt thereof is a SENR agonist and has the activity. None of the compounds or their salts are S ENR Engonist.
  • test compound is brought into contact with cells containing SENR, and the cell stimulating activity mediated by SENR is measured.
  • the compound having a cell stimulating activity or a salt thereof is a S ENR agonist.
  • a compound that activates SENR for example, the polypeptide of the present invention, its precursor protein or S ENR agonist
  • a test compound is brought into contact with cells containing S ENR
  • the cell stimulating activity via S ENR is measured and compared.
  • a compound or a salt thereof capable of decreasing the cell stimulating activity of a compound that activates SENR is a S ENR antagonist.
  • the S ENR agonist has the same activity as the physiological activity of the polypeptide of the present invention or its precursor protein on S ENR, the S ENR agonist and the polypeptide of the present invention or its precursor protein have the same activity. Similarly, it is useful as a safe and low toxic drug.
  • S ENR antagonists are useful as safe and low toxic drugs that can suppress the receptor activity since they can suppress the physiological activity of the polypeptide of the present invention against S ENR.
  • SENR agonists may be associated with dementia caused by, for example, senile dementia, cerebral vascular dementia, dysplastic metamorphic disease (eg, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Pick's disease, Huntington's disease, etc.).
  • senile dementia cerebral vascular dementia
  • dysplastic metamorphic disease eg, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Pick's disease, Huntington's disease, etc.
  • Treatment of diseases such as blood pressure, kidney disease (eg, chronic renal failure, nephritis, etc.), heart disease (eg, heart failure, acute myocardial infarction, etc.), pollakiuria, urinary incontinence, hearing loss, olfactory abnormalities, visual abnormalities, etc. It can be used as a prophylactic agent.
  • diseases such as blood pressure, kidney disease (eg, chronic renal failure, nephritis, etc.), heart disease (eg, heart failure, acute myocardial infarction, etc.), pollakiuria, urinary incontinence, hearing loss, olfactory abnormalities, visual abnormalities, etc. It can be used as a prophylactic agent.
  • salt of the compound for example, a pharmaceutically acceptable salt or the like is used.
  • examples include salts with inorganic bases, salts with organic bases, salts with inorganic acids, salts with organic acids, and salts with basic or acidic amino acids.
  • Suitable examples of the salt with an inorganic base include, for example, alkali metal salts such as sodium salt and potassium salt, alkaline earth metal salts such as calcium salt and magnesium salt, and aluminum salt and ammonium salt.
  • salt with an organic base examples include, for example, trimethylamine, triethylamine, pyridine, picoline, 2,6-lutidine, ethanolamine, jenoylamine, triethanolamine, cyclohexylamine, and dicycloamine.
  • salts with inorganic acids include salts with hydrochloric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, phosphoric acid, and the like.
  • Suitable examples of salts with organic acids include, for example, formic acid, acetic acid, propionic acid, fumaric acid, oxalic acid, tartaric acid, maleic acid, citric acid, succinic acid, malic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, benzoic acid And salts with acids and the like.
  • Preferred examples of the salt with a basic amino acid include, for example, salts with arginine, lysine, and olutinine.
  • Preferred examples of the salt with an acidic amino acid include, for example, salts with aspartic acid, glutamic acid, and the like. .
  • An antibody for example, a polyclonal antibody or a monoclonal antibody
  • an antiserum against the polypeptide of the present invention or its precursor protein can be used as the polypeptide of the present invention. It can be produced by using a peptide or its precursor protein as an antigen according to a known method for producing an antibody or antiserum.
  • a polyclonal antibody can be produced according to the method described below.
  • the polyclonal antibody against the polypeptide of the present invention or its precursor protein can be produced according to a method known per se or a method analogous thereto.
  • a complex of an immunizing antigen (antigen such as a polypeptide) and a carrier protein is formed, and a warm-blooded animal (eg, a mammal (eg, a heron, a sheep, a goat, a rat) is produced in the same manner as in the method for producing a monoclonal antibody described below.
  • mice Immunize mice, guinea pigs, pests, pests, horses, and birds (eg, chickens, wild birds, wild birds, ducks, geese, peas), etc., and contain antibodies from the immunized animals to the polypeptide of the present invention. It can be produced by collecting the product and separating and purifying the antibody.
  • the type of carrier protein and the mixing ratio between carrier and hapten are determined by the carrier.
  • Any antibody can be cross-linked at any ratio as long as antibodies can be efficiently produced against the hapten that has been cross-linked and immunized.
  • serum albumin, thyroglobulin, keyhole lindet, etc. A method of coupling hemosyanin or the like at a weight ratio of about 0.1 to 20 and preferably about 1 to 5 with respect to one hapten is used.
  • various condensing agents can be used for force coupling between the hapten and the carrier.
  • the substance itself is located at a site where antibody production is possible with respect to the warm-blooded animal.
  • Complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance antibody production ability upon administration.
  • the administration is usually performed once every about 2 to 6 weeks, for a total of about 3 to 10 times.
  • the polyclonal antibody is preferably collected from blood, ascites, and the like, of the mammal immunized by the above method.
  • the antibody titer against the polypeptide of the present invention or its precursor protein in the antiserum can be measured in the same manner as the antibody titer of the hybridoma culture supernatant described later.
  • the antibody can be separated and purified according to the same method for separating and purifying immunoglobulin as described later for the monoclonal antibody.
  • a monoclonal antibody can be produced according to the method described below. [Preparation of monoclonal antibody]
  • the polypeptide of the present invention or its precursor protein may be a warm-blooded animal (eg, a mammal warm-blooded animal (eg, a heron, a sheep, a goat, a rat, a mouse, a guinea pig, a horse, a horse, a horse), a bird ( For example, chickens, pigs, ducks, geese, and quail) are administered by themselves or together with a carrier or diluent to a site where antibody production is possible.
  • Complete Freund's adjuvant ⁇ Incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance the antibody-producing ability upon administration. Administration is usually performed once every 2 to 6 weeks, for a total of about 2 to 10 times.
  • an individual having an antibody titer is selected from the above-mentioned warm-blooded animal, for example, a mouse, immunized with the antigen, and the spleen or lymph node is collected 2 to 5 days after the final immunization.
  • monoclonal antibody-producing hybridomas can be prepared.
  • the measurement of the antibody titer in the antiserum can be performed, for example, by using the labeled polypeptide of the present invention, its precursor protein, or a partial peptide thereof described below. 0 o
  • the fusion operation can be performed according to a known method, for example, the method of Köhler and Milstein [Nature, 256, 495 (1975) 3].
  • the fusion promoter include polyethylene glycol (PEG) and Sendai virus.
  • PEG polyethylene glycol
  • Sendai virus Preferably, PEG is used.
  • myeloma cells examples include NS-1, P3U1, SP2Z0, AP-1, and the like, with P3U1 being preferred.
  • the preferred ratio between the number of antibody-producing cells (spleen cells) and the number of myeloma cells used is about 1: 1 to 20: 1, and the PEG (preferably PEG 1000 to PEG 6000) power is about 10 to 80%.
  • Cell fusion can be carried out efficiently by adding at a concentration of 20 to 40 ° C, preferably 30 to 37 ° C, for 1 to 10 minutes.
  • the polypeptide antigen of the present invention or its precursor protein antigen can be directly or together with a carrier.
  • the polypeptide of the labeled present invention added, monochromatic to the polypeptide or precursor protein of the present invention bound to a solid phase - a method for detecting a monoclonal antibody and the like.
  • the monoclonal antibody against the polypeptide of the present invention or its precursor protein can be selected according to a method known per se or a method analogous thereto.
  • HAT hypoxanthine, aminopterin, thymidine
  • a medium for cells As a selection and breeding medium, any medium can be used as long as hybridomas can grow.
  • RPMI 1640 medium containing 1 to 20%, preferably 10 to 20% fetal bovine serum, GIT medium containing 1 to 10% fetal bovine serum (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
  • a serum-free culture medium for hybridoma culture SFM-101, Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.
  • SFM-101 serum-free culture medium for hybridoma culture
  • the culture temperature is usually from 20 to 40 ° C, preferably about 37 ° C.
  • the cultivation time is usually 5 days to 3 weeks, preferably 1 week to 2 weeks.
  • Culture is usually performed under 5% carbon dioxide gas.
  • the antibody titer of the hybridoma culture supernatant can be measured in the same manner as the measurement of the antibody titer to the polypeptide of the present invention in the antiserum.
  • Separation and purification of the monoclonal antibody against the polypeptide of the present invention or its precursor protein can be carried out by the same method as that used for ordinary polyclonal antibody separation and purification of immunoglobulin (eg, salting out, alcohol precipitation, isoelectric precipitation). Method, electrophoresis, adsorption / desorption using an ion exchanger (eg, DEAE), ultracentrifugation, gel filtration, antigen-bound solid phase, or active antibodies such as protein A or protein G to collect only antibodies And a specific purification method of dissociating the bond to obtain an antibody].
  • immunoglobulin eg, salting out, alcohol precipitation, isoelectric precipitation.
  • electrophoresis eg, electrophoresis, adsorption / desorption using an ion exchanger (eg, DEAE), ultracentrifugation, gel filtration, antigen-bound solid phase, or active antibodies such as protein A or protein G to collect only antibodies
  • ion exchanger
  • the antibody against the polypeptide of the present invention or the precursor protein thereof produced according to the methods (a) and (b) described above can specifically recognize the polypeptide of the present invention or the precursor protein thereof, respectively. It can be used for quantification of the polypeptide of the present invention or its precursor protein in a test wave, particularly for quantification by a sandwich immunoassay.
  • the present invention provides, for example,
  • one antibody is an antibody that recognizes the N-terminal of the polypeptide of the present invention or its precursor protein, and the other antibody is the present antibody.
  • a method for quantifying the polypeptide of the present invention or its precursor protein in a test wave which is an antibody that reacts with the C-terminal of the polypeptide of the present invention or its precursor protein.
  • the polypeptide of the present invention or its precursor protein can be measured using a monoclonal antibody that recognizes the polypeptide of the present invention or its precursor protein, and can also be detected by tissue staining or the like.
  • the antibody molecule itself may be used, or F (ab ') 2 , Fab', or Fab fraction of the antibody molecule may be used.
  • the measuring method using the antibody of the present invention is not particularly limited, and the amount of the antibody, the antigen, or the antibody-antigen complex corresponding to the amount of the antigen (eg, the amount of the polypeptide) in the liquid to be measured is determined chemically or Any measurement method may be used as long as it is detected by a physical means and is calculated from a standard curve prepared using a standard solution containing a known amount of antigen.
  • nephrometry, a competitive method, an immunometric method and a sandwich method are preferably used, but in terms of sensitivity and specificity, a sandwich method described later is particularly preferable.
  • Examples of the labeling agent used in the measurement method using a labeling substance include a radioisotope, an enzyme, a fluorescent substance, and a luminescent substance.
  • a radioisotope for example, [I], [I], [H :), [C] and the like are preferable.
  • the enzyme a stable and high specific activity is preferable.
  • 3-galactosidase, / 3-darco Fern, alkaline phosphatase, peroxidase, malate dehydrogenase, etc. fluorescent substances such as fluorescamine and fluorescein isothiosinate, and luminescent substances such as luminol and luminol derivatives , Luciferin, lucigenin and the like.
  • a biotin-avidin system can be used for binding the antibody or antigen to the labeling agent.
  • the carrier include insoluble polysaccharides such as agarose, dextran, and cellulose; synthetic resins such as polystyrene, polyacrylamide, and silicon; and glass.
  • the test solution is reacted with the insolubilized anti-polypeptide antibody (primary reaction), and further reacted with the labeled anti-polypeptide antibody (secondary reaction).
  • the amount of the polypeptide in the test wave can be quantified by measuring the amount of the peptide.
  • the primary reaction and the secondary reaction may be performed in the reverse order, may be performed simultaneously, or may be performed at staggered times.
  • the labeling agent and the method of insolubilization can be in accordance with those described above.
  • the antibody used for the solid phase antibody or the labeling antibody is not necessarily one type, and a mixture of two or more types of antibodies is used for the purpose of improving the measurement sensitivity and the like. You may.
  • the anti-polypeptide or its precursor protein antibody used in the primary reaction and the secondary reaction is a polypeptide of the present invention.
  • Antibodies with different binding sites for the peptide or its precursor protein are preferably used. That is, the antibody used in the primary reaction and the secondary reaction may be, for example, an antibody used in the secondary reaction if the antibody used in the secondary reaction recognizes the C-terminal of the polypeptide of the present invention or its precursor protein.
  • the antibody used preferably has a portion other than the C-terminal, for example, an N-terminal. 0 L
  • the antibody against the polypeptide of the present invention or its precursor protein can be used in a measurement system other than the sandwich method, for example, a competition method, an immunometric method, or a nephrometry method.
  • competition method after the antigen in the test solution and the labeled antigen are allowed to react competitively with the antibody, the unreacted labeled antigen is separated from (F) and the labeled antigen (B) bound to the antibody. Then, the amount of B or F is measured to determine the amount of antigen in the test solution.
  • This reaction method uses a soluble antibody as an antibody, performs a B / F separation using polyethylene glycol, a liquid phase method using a second antibody against the antibody, or a solid phase antibody as the first antibody. Alternatively, a solid phase method using a soluble first antibody and an immobilized antibody as the second antibody is used.
  • the antigen in the test solution and the immobilized antigen are subjected to a competitive reaction with a certain amount of the labeled antibody, and then the solid phase and the liquid phase are separated.
  • the antigen is allowed to react with an excessive amount of the labeled antibody, then the immobilized antigen is added, and the unreacted labeled antibody is bound to the solid phase, and then the solid phase and the liquid phase are separated.
  • the amount of label in either phase is measured to quantify the amount of antigen in the test solution.
  • nephelometry the amount of insoluble sediment generated as a result of an antigen-antibody reaction in a gel or in a solution is measured. Even when the amount of antigen in the test solution is small and only a small amount of sediment is obtained, laser nephrometry utilizing laser scattering is preferably used.
  • the polypeptide of the present invention or its precursor protein can be quantified with high sensitivity by using an antibody against the polypeptide of the present invention or its precursor protein.
  • a disease involving the polypeptide of the present invention or its precursor protein can be diagnosed.
  • Diseases involving the polypeptide of the present invention or its precursor protein include, for example, senile dementia, cerebral vascular dementia, regressive and degenerative diseases of phylogenic variants (eg, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Pick's disease, Hunch Dementia, high (low) blood pressure, renal disease (eg, chronic renal failure, nephritis, etc.), heart disease (eg, heart failure, acute myocardial infarction, etc.), pollakiuria, urinary incontinence, hearing loss, Diseases such as olfactory abnormalities and visual abnormalities are listed.
  • test solution can be prepared from a mammal to be tested (eg, human, egret, sheep, goat, rat, mouse, guinea pig, porcupine, porcine, bush) by a method known per se.
  • the test liquid includes, for example, blood, lymph, urine, and the like.
  • DNA Deoxyribonucleic acid
  • C DNA Complementary deoxyribonucleic acid
  • Y thymine or cytosine
  • N Thymine, cytosine, adenine or guanine
  • R adenine or guanine
  • RNA ribonucleic acid
  • mRNA messenger ribonucleic acid
  • TFA trifluoroacetic acid
  • EIA Enzymimno
  • H is or H: histidine
  • Trp or W Tribute fan
  • Trt Trityl
  • sequence numbers in the sequence listing in the present specification indicate the following sequences. o 7
  • Fig. 3 shows synthetic DNA used for screening of cDNA encoding rat SENR protein.
  • SENR expression Riborobe used to measure the expression level of SENR receptor protein mRNA in each clone of the CH0 cell line is shown.
  • FIG. 2 shows an amino acid sequence obtained from the result of N-terminal amino acid sequence analysis of a ligand peptide for SENR purified from bush spinal cord.
  • FIG. 2 shows the amino acid sequence obtained from the result of N-terminal amino acid sequence analysis of a ligand peptide for SENR purified from bush spinal cord.
  • Example 2 shows the amino acid sequence of rat SENR protein confirmed in Example 2.
  • 1 shows the entire nucleotide sequence of porcine SENR ligand precursor protein cDNA.
  • 1 shows the entire amino acid sequence of the SENR ligand precursor protein.
  • Figure 2 shows the complete amino acid sequence of the porcine SENR ligand precursor protein.
  • ⁇ Shows the nucleotide sequence of the cDNA encoding a part of the SENR ligand precursor protein.
  • Example 20 shows the entire amino acid sequence of the human SENR protein confirmed in Example 20.
  • SEQ ID NO: 21 Shows the DNA sequence of 21 ( ⁇ ligand).
  • Fig. 4 shows the synthetic DNA used for RACE-PCR to obtain the 5 'partial sequence of cDXA encoding the SENR ligand precursor protein.
  • Fig. 4 shows the synthetic DNA used for RACE-PCR to obtain the 5 'partial sequence of cDXA encoding the SENR ligand precursor protein.
  • ⁇ 2> Shows the nucleotide sequence of the 5'-side partial sequence of cDXA that encodes the SENR ligand precursor protein.
  • Fig. 4 shows the synthetic DNA used for RACE-PCR to obtain the 3 'partial sequence of the cDNA encoding the SENR ligand precursor protein.
  • Fig. 2 shows a synthetic DM used for RACE-PCR to obtain a partial sequence at the 3 'side of cDNA encoding the SENR ligand precursor protein.
  • FIG. 2 shows the nucleotide sequence of the 3′-side partial sequence of cDN′A encoding SENR ligand precursor protein.
  • Fig. 2 shows the synthetic D'A used to obtain the full-length sequence of cDN'A encoding the SENR ligand precursor protein.
  • Figure 2 shows the synthesis used to obtain the full-length sequence of the cDNA encoding the SENR ligand precursor protein. [SEQ ID NO: 39]
  • the transformant Escherichia coli XL1 Blue / pZ puro5 containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 17 obtained in Example 10 described later has been produced on August 23, 1999 by the Ministry of International Trade and Industry, Deposited with the National Institute of Advanced Industrial Science (NI BH) under the deposit number F ERM BP-6859, and deposited with the Fermentation Research Institute (IFO) on March 18, 1999 under the deposit number IF ⁇ 16272.
  • NI BH National Institute of Advanced Industrial Science
  • IFO Fermentation Research Institute
  • the transformant Escherichia coli XL1 Blue / pZl-puro9 containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 16 obtained in Example 10 described below has been produced on August 23, 1999 by the Ministry of International Trade and Industry, It has been deposited with the National Institute of Advanced Industrial Science (NI BH) under the deposit number F ERM B P-6860 and with the Fermentation Research Institute (IFO) since March 18, 1999 as the deposit number IF ⁇ 16273.
  • NI BH National Institute of Advanced Industrial Science
  • IFO Fermentation Research Institute
  • the transformant Escherichia coli T0P10 / pCR-buro containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 36 obtained in Example 36 described below has been used since November 8, 1999, It has been deposited with the National Institute of Advanced Industrial Science (NI BH) under the deposit number FERM BP-6932 and with the Fermentation Research Institute (IFO) as the deposit number IFO 16332 since October 27, 1999.
  • NI BH National Institute of Advanced Industrial Science
  • IFO Fermentation Research Institute
  • a reverse transcription reaction was performed using a random primer.
  • the reagent of the evening RNA PCR ver. 2 kit was used.
  • this reverse transcription product was used as type I, and amplification by PCR was performed using synthetic DM primers of SEQ ID NOS: 1 and 2.
  • the synthetic DNA primer was constructed so that the gene in the region translated into the receptor protein was amplified, but at this time, a nucleotide sequence recognized by the restriction enzyme Sal I was added to the 5 'side of the gene, and Recognition sequences for the respective restriction enzymes were added to the 5 'and 3' sides so that the nucleotide sequence recognized by the restriction enzyme Spe I was added to the 3 'side.
  • the composition of the reaction mixture was 1 M each of cDNA type 5 mK synthetic DNA primer, 0.2 mM dNTPs, 1 mM MgCl KOD (King of DNA) DNA polymerase 1 / zl, and the buffer provided with the enzyme. The volume was 50 l.
  • Cycles for amplification were performed using a thermal cycler (PerkinElmer) and heating at 94 ° C for 60 seconds, followed by 94 ° C for 30 seconds, 59 ° C for 30 seconds, and 74 ° C for 60 seconds. This cycle was repeated 35 times. Confirmation of the amplification product was carried out by electrophoresis on 0.8% agarose gel followed by ethidium umbide staining.
  • Example 2 Subcloning and Insertion of PCR Product into Plasmid Vector Confirmation of Amplified cDNA Sequence by Decoding Base Sequence of cDNA Part
  • the reaction product after PCR performed in Example 1 was separated using a 0.8% low-melting point agarose gel, and the band was cut out with a force razor, followed by fragmentation, phenol extraction, and phenol chromatography. DNA was recovered by mouth-form extraction and ethanol precipitation. The recovered DNA was subcloned into the plasmid vector pCR-Script Amp SK (+) according to the prescription of PCR-Script TM A Immediate SK (+) Cloning Kit (Stratagene). I did it. This was introduced into Escherichia coli JM109 competent cell (Takara Shuzo), transformed, and clones having cDNA inserts were selected on LB agar medium containing ampicillin and X-gal, and the white color was obtained.
  • SENR sensor epithelial neuropeptide-1 ike receptor
  • Plasmids were prepared from Plasmid Midi Kit (Qiagen) from Escherichia coli clones transformed with the obtained plasmids, and cut with restriction enzymes Sal I and Spe I to cut out inserts. After the electrophoresis, the insert DNA was cut out from the agarose gel with a force razor, and then recovered by performing fragmentation, phenol extraction, phenol / cloth form extraction, and ethanol precipitation.
  • plasmid DNA of pAKKO-SENR was prepared using P1 asmid Midi Kit (Qiagen). This was introduced into CHOdhfr-cells using CellPhect Transfection Kit (Amersham Pharmacia Biotech) according to the attached protocol. 10 / zg of DNA was used as a coprecipitation suspension with calcium phosphate, and added to a 10 cm dish in which 5 ⁇ 10 5 or 1 ⁇ 10 s CHO dhfr cells had been seeded 24 hours before.
  • the expression level of the full-length SENR receptor protein mRNA of 68 clones of the CH0 / SENR strain established in Example 3 was measured using Cytostar T Plate (Amersham Pharmacia Biotech) according to the attached protocol as follows. . Each clone of the CH0 / SENR strain was seeded on each wel 1 of the Cytostar T Plate at 2.5 ⁇ 10 4 cells and cultured for 24 hours, and the cells were fixed with 10% formalin. After 0.25% Triton X-100 was added to each well to increase cell permeability, 35 S-labeled riboprobe of SEQ ID NO: 4 was added and hybridized.
  • Free riboprobe was digested by adding 20 mg / ml RNaseA to each well, the plate was washed well, and the radioactivity of the hybridized riboprobe was measured with a Topcounter. Higher radioactivity strains have higher mRNA expression levels. Two clones with high mRNA expression levels (# 36 and 61) were used in the following experiments, but clone number 61 was mainly used.
  • Example 5 Detection of an activity contained in the spinal cord extract, which specifically promotes the release of arachidonic acid metabolites from the CH0 / SENR cell line
  • the high performance liquid chromatography (HPLC) fraction of bushu spinal cord extract was prepared by the method described below. After purchase from Tokyo Shibaura Organ Co., Ltd., slaughtered on the day of treatment and extirpated, 350 g (10 cows) of bush spinal cord stored on ice was finely cut and poured into distilled water, which was immediately boiled. Boil for a minute. Immediately after boiling, the mixture was ice-cooled, 84 ml of acetic acid was added to a final concentration of 1.0 M, and the mixture was crushed using a Polytron (20,000 rpm, 6 minutes). The homogenate is centrifuged (8,000 rpm> 30 minutes), and the supernatant is collected.
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • the column After washing the column with 300 ml of 1.0 M acetic acid, the column was eluted with 300 ml of 60% acetonitrile containing 0.1% trifluoroacetic acid. The eluate was concentrated under reduced pressure, the solvent was distilled off, and the concentrate was lyophilized. Dissolve approximately 0.2 g of the lyophilized product in 14 ml of 10% acetonitrile containing 0.1% trifluoroacetic acid, and add 7 ml of the solution to a C18 column (1 ⁇ 1 solution, TSKgel ODS-80 TM (21.
  • CH0 / SENR cells and mock CH0 cells were seeded on a 24-well plate at 5 ⁇ 10 4 cells / well, and cultured for 24 hours, and [3 ⁇ 4] arachidonic acid was added to a concentration of 0.25 Ci / well.
  • [3 ⁇ 4] Sixteen hours after addition of arachidonic acid, the cells were washed with Hank's reagent (HBSS) containing 0.05% serum albumin (BSA), and 2 ⁇ l of the above-described HPLC fractionated DMS0 solution (spinal cord 2) was added to each we11. gE) was added, and 500 xl of HBSS containing 0.05% BSA was added.
  • HBSS Hank's reagent
  • BSA serum albumin
  • HPLC fraction # 33 which showed the arachidonic acid metabolite releasing activity on CH0 / SENR cells in Example 5 was converted to a protease, Pronase (Sigma, protease Type XIV (P5147) ) To determine if the active substance is proteinaceous.
  • HPLC fraction of the above spinal cord extract (# 33) Add 4 il to 0.2 M ammonium acetate 2001, add pronase 3 and incubate for 2 hours, then heat for 10 minutes in boiling water To inactivate pronase. To this was added 2 ml of distilled water containing 0.05 mg of BSA and 0.05 mg of CHAPS, and then freeze-dried. In order to examine the effects of pronase itself or heating and lyophilization, heat treatment of pronase only, HPLC fraction only, and pronase only followed by HPLC fractionation followed by freezing. Dried.
  • Example 7 Purification of an active substance showing arachidonic acid metabolite-releasing activity specifically to CH0 cells expressing SENR from spinal cord
  • the ether layer containing the lipid was separated by using a gel and the aqueous layer was collected.
  • the extract defatted with ether was concentrated under reduced pressure by an evaporator to completely remove the ether.
  • the concentrated solution was filtered through a glass fiber filter paper (Advantech, DP70 (90 ⁇ )), and a C18 (Yemushii, YMCgel ODS-AM 120-S50) column was filled with a half of the filtrate in a glass column (30 ⁇ X 240 mm). Was added.
  • the column was washed with 400 ml of 1.0 M acetic acid and eluted with 500 ml of 60% acetonitrile containing 0.1% trifluoroacetic acid.
  • each fraction was added to SENR-expressing CH0 cells by the method described in Example 5 and the arachidonic acid metabolite releasing activity was measured. Activity was observed in fractions # 31 and # 32. These fractions # 31 (1) and # 32 (2) were separately purified in the same manner as shown below. Each active fraction was concentrated under reduced pressure to remove the solvent, and then lyophilized. This was dissolved in 10 ml of 10 mM ammonium formate containing 10% acetonitrile, added to a cation exchange column (Toso-I, TSKgel SP-5PW (20 ⁇ ⁇ 150 mm)), and then added to 10 mM acetonitrile containing 10% acetonitrile.
  • a cation exchange column Toso-I, TSKgel SP-5PW (20 ⁇ ⁇ 150 mm
  • the column was eluted with a gradient from to 300 mM ammonium formate. For both 1 and 2, the activity was recovered around 140 mM ammonium formate.
  • the active fraction was lyophilized, dissolved in 1.0 ml of 10% acetonitrile containing 0.1% trifluoroacetic acid, and 0.5 ml each was added to a diphenyl column (separation group, Vydac 219-TP54). Thereafter, it was eluted with a concentration gradient of 26% to 31% acetate nitrile containing 0.1% trifluoroacetic acid. HPLC was performed twice, and the eluate was collected in two batches.
  • Amino acid sequence analysis of an active substance that specifically exhibits arachidonic acid metabolite-releasing activity on the CH0 / SENR cells purified in Example 7 was performed. Since the active substance was estimated to be a protein or a peptide as shown in Example 6, amino-terminal amino acids were analyzed by Procise 494 Protein Sequencer using the eluate containing an active peak. Sequence analysis was performed. As a result, the sequences shown in SEQ ID NOs: 5 and 6 were obtained. No amino acid was detected at residues 6 and 11.
  • active substance 2 was subjected to reductive nopyridylethylation using tributylphosphine and 4-vinylpyridine, and sequence analysis was performed.As a result, no amino acid was detected in the 11th residue. Eyes detected pyridylethyl cysteine. Thus, it was presumed that the sixth and eleventh residues of active substance I are cysteines, and that these two Cys residues form an intramolecular disulfide bond. Similarly, the active substance ⁇ with a similar structure has residues 6 and 11 that are cysteines, and these two Cys residues form an intramolecular disulfide bond. It was presumed that a joint was formed. From the above, SEQ ID NOs: 7 and 8 were determined as the deduced amino acid sequences of the two active substances.
  • Example 9 Acquisition of partial sequence of bushu SENR ligand precursor protein by PCR method Using human urotensin II (Coulouarn, Y. et al. Pro atl) registered in GenBank database using bushu genomic DNA (Clontech) Acad. Sci. USA, vol. 95, pp. 15803-15808 (1998)) Primer of SEQ ID NOS: 10 and 11, which is a partial sequence of the base sequence (accession No. AA535545) encoding a part of the precursor protein was used to carry out a PCR reaction.
  • the composition of the reaction solution was 1 M each of the synthetic primers, 500 ng of type II DNA, 0.2 mM dNTPs, 1.25 units of ExTaq DNA polymerase (Takara Shuzo), and a buffer attached to the enzyme, and the total reaction solution was 20 // 1. Cycles for amplification were performed using thermal zaiclaichi (PerkinElmer) at 94 'for 4 minutes, followed by 94 30 seconds, 60T: 30 seconds, 72 ° C and 15 seconds, twice.
  • RNA was prepared from the spinal cord by Isogen (Futtsubon Gene), a poly (A) + RNA fraction was prepared using Oligotex (dT) 30 (Takara Shuzo). Using the Superscript Lamda System for cDNA Synthesis and ⁇ cloning kit (Gibco BRL) from the poly (A) + RNA 2 and introducing cDNA into ⁇ Not I / Sal I Arm according to the manual, Gigapack III Gold (Stratagene) ) was used to create a cDNA library for the spinal cord. Of these, 1.6 ⁇ 10 6 pfu (plaque forming unit) was mixed with E.
  • coli Y1090ZL incubated at 37: for 15 minutes, added with 0.7% agarose (FMC) LB, and plated on 121 1.5% agar LB plates.
  • FMC 0.7% agarose
  • a nitrocellulose filter was placed on the plate to transfer the plaque.
  • the file was denatured by alkali treatment, neutralized, dried, and irradiated with 254 nm ultraviolet light, and heated at 80: 30 for 30 minutes to fix the DNA.
  • the filter was incubated in 0.5 M phosphoric acid containing 1 mM EDTA, 73 ⁇ 4 SDS and BSA at 45 ° C. for 4 hours, and then incubated with the probe described below for 16 hours to hybridize.
  • SEQ ID NO: 13 was selected as the positive chain from the sequence obtained in Example 9, and SEQ ID NO: 14 which was the reverse chain partially complementary to this sequence was commissioned and synthesized (Nippon Bioservice). After denaturation at 70 ° C., they were gradually cooled and hybridized with each other, and radiolabeled with Klenow enzyme in the presence of [ 32 P] dCTP (DuPont). Further, it was purified by a Nick column (Amersham Pharmacia Biotech) and used for hybridization at a concentration of 1,000,000 cpm / ml.
  • SEQ ID NO: 17 was a splicing variant of SEQ ID NO: 15, in which, assuming that the ATG of the translation initiation codon ATG is the first, C from the 101st position to G at the 208th position was deleted.
  • the corresponding amino acid sequences are SEQ ID NO: 18 for SEQ ID NOs: 15 and 16, and SEQ ID NO: 19 for SEQ ID NO: 17.
  • All of the precursor proteins were precursors of bushu SENR ligand 2 (SEQ ID NO: 8).
  • FIG. 8 shows the DNA sequence (SEQ ID NO: 15) and the corresponding amino acid sequence (SEQ ID NO: 18) of the bus SENR ligand precursor.
  • Example 11 1 Determination of partial sequence of SENR ligand precursor protein by PCR
  • a PCR reaction was carried out on the genomic DNA (Clontech) using the primers of SEQ ID NOS: 10 and 11 used in Example 9 using type II.
  • the composition of the reaction mixture was 0.5 / M each for synthetic primers, 500 ng of type I DNA, 0.2 mM dNTPs, 2.5 mM MgCl 2 , AmliTaq Gold DNA polymerase (Kin-Elmer).
  • the total reaction volume was 2 1 with 2 ⁇ 1 and the buffer attached to the enzyme.
  • the cycle for amplification was performed using a thermal cycler (Perkin Elmer) at 95 ⁇ 9 minutes, followed by two cycles of 94 ⁇ 15 seconds, 60 ° C ⁇ 20 seconds, and 72 ⁇ 20 seconds.
  • the primer of SEQ ID NO: 11 is a nucleotide sequence encoding a part of the ligand peptide.
  • SEQ ID NO: 21 is determined as the primer SENR ligand.
  • Example 12 Preparation of SENR ligand II: Gly-Pro-Thr-Ser-Glu-Cys-Phe-Trp-Lys-Tyr-Cys-Val (SEQ ID NO: 7)
  • Boc-Va 0CH Factory PAM resin (0.77m mole / g resin) 0.5m mole is put into the reaction tank of peptide synthesizer ABI 430A, and Boc- strategy (NMP-HOBt) Boc-Cys (MeBzl) ), Boc-Tyr (Br-Z), Boc-Lys (Cl-Z), Boc-Trp (CHO), Boc-Phe, Boc-Cys (MeBzl), Boc-Glu (OcHex), Boc-Ser (Bzl ), Boc-Thr (Bzl), Boc-Pro, and Boc-Gly were sequentially introduced to obtain a desired protected peptide resin.
  • Example 12 Thr of Example 12 was replaced with Pro, and the protein was introduced. Excision from the resin, purification of the SH peptide, oxidation, and purification of the SS peptide were performed in the same manner as in Example 12, to obtain 15 mg of white powder.
  • Thr was replaced with Ser in Example 12 and introduced. Excision from the resin, purification of the SH peptide, oxidation, and purification of the SS peptide were performed in the same manner as in Example 12.
  • Boc-Vat 0CH 2 -PA resin (0.77 m mole / g resin) Using 0.5 m mole of Boc-Cys (MeBzl), Boc-Tyr (Br-Z), Boc-Lys (Cl-Z), Boc-Trp (CHO), Boc-Phe, Boc-Cys (MeBzl), Boc-Asp (OcHex), Boc-Pro, Boc-Thr (Bzl), OD
  • Boc-Glu (OcHex) was introduced in order. This resin was treated in the same manner as in Example 12, the peptide was cut out, oxidized and purified.
  • HBSS Hank's reagent
  • BSA serum albumin
  • the synthetic SENR ligand was dissolved in a physiological saline solution containing 0.05% BSA, and administered from the left femoral vein at a concentration of 1, 10, 100 nmol / kg. Blood pressure was recorded continuously with a polygraph (manufactured by NEC Saneisha). Rat blood pressure decreased in a dose-dependent manner, and the SENR ligand polypeptide showed a hypotensive effect on rats.
  • Table 1 shows the antihypertensive effect on the blood pressure (under anesthesia) of rats after administration of 10 nmo 1 / kg of busu SENR ligand. The antihypertensive effect was represented by the mean blood pressure decreased by the administration of the SENR ligand relative to the mean blood pressure before administration.
  • SENR ligand polypeptide 2 (SEQ ID NO: 8) synthesized in Example 13 on rat thoracic aorta were measured by the following method.
  • a 9-12 week old male Wistar rat (purchased from Nippon Charisulliver) was anesthetized with Nembutal Injection (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd., 50 mg / ml sodium pentobarbital, 50 mg / kg intraperitoneal injection), and whole was abdominal aorta. Blood was collected and killed by blood loss. The thoracic aorta was removed from this rat, and a 5-mm-wide ring specimen was prepared.
  • Specimens mixed gas (95% 0 2 -53 ⁇ 4 C0 2 ) was kept at passing air to 37 ° C Krebs Henseleit solution (NaCl 118 mM, C1 4.7 mM , CaCl 2 2.5 mM, KH 2 P0 4 1.2 mM, NaHC0 3 25 mM, MgS0 4 1.2 mM, glucose 10.0 mM) 3 ml were suspended in organ bath filled with, isometric shrink tension minute load transducer (UL - 10GL Minebea Co., Ltd.) via a polygraph (NEC Sanei Company). The static tension was about 0.5 g.
  • Amplification by PCR was performed using human skeletal muscle-derived cDNA (Clontech) as type I and synthetic DM primers of SEQ ID NOS: 23 and 24.
  • the synthetic DNA primer was constructed so that the gene in the region translated into the receptor protein was amplified.
  • a nucleotide sequence recognized by the restriction enzyme SalI was added to the 5 'side of the gene, and Recognition sequences for the respective restriction enzymes were added to the 5 'and 3' sides so that the base sequence recognized by the restriction enzyme Spe I was added to the 'side.
  • the composition of the reaction solution was cDNA type II, synthetic DNA primers, 0.2 iM each, 0.2 mM dNTPs, Advantage2 polymerase mix (Clontech) 11 and the buffer supplied with the enzyme, and the total reaction volume And
  • the cycle for amplification was carried out using a thermal cycler (PerkinElmer), 95 ° C for 60 seconds, followed by 5 cycles of 95 ° C for 30 seconds, 72 ° C for 3 minutes. After that, 95 ° C ⁇ 30 seconds, 70 ° C ⁇ 3 minutes cycle is repeated 5 times, and further 95 ⁇ 30 seconds, 68 ⁇ 3 minutes cycle is repeated 20 times and finally 68 ° C ⁇ 3 minutes Was heated.
  • the reaction product after PCR performed in Example 19 was a 0.8% low melting point agarose gel. Then, the band was cut out with a force razor, and D'A was recovered using GENECLEAN SPIN (Bio101). According to the prescription of Eukaryotic TOPO TM TA Cloning kit (Invitrogen), the recovered DNA was cloned into a plasmid vector for animal cell expression --- pcDNA3.1 / V5 / His to construct a plasmid pcDNA3.1-hSENR for protein expression. .
  • the clone having the cDNA insert was selected in LB agar medium containing ampicillin, and sterilized using a toothpick. Separation gave a transformant coH DH5a / pcDNA3.1-hSENR. Individual clones were cultured in an LB medium containing ampicillin, and plasmid DNA was prepared using Quiawell 8 Ultra Plasmid kit (Qiagen). A portion of the prepared DNA was digested with the restriction enzyme SalI to confirm the size and orientation of the inserted receptor cDNA fragment.
  • the arachidonic acid metabolite releasing activity of human SENR ligand polypeptide (human urotensin II) (SEQ ID NO: 22) at various concentrations synthesized in Example 15 on human SENR-expressing CH0 cells was measured by the following method. . CHO / hSENR cells were seeded at 5 ⁇ 10 4 cells / well on a 24-well plate, cultured for 24 hours, and [3 ⁇ 4] arachidonic acid was added at 0.25 Ci / well.
  • HBSS Hank's reagent
  • BSA serum albumin
  • the cell lysate was centrifuged (LOOO g, 15 minutes) to obtain a supernatant. Next, the supernatant was subjected to ultracentrifugation (Beckman type 30 rotor, 30,000 rpm, 1 hour), and the obtained precipitate was used as a rat SENR-expressing CH0 cell membrane fraction.
  • the measurement of GTPTS binding activity is as follows. Rat SENR-expressing CH0 cell membrane fraction is diluted with membrane dilution buffer (50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.4), 5 mM MgCl, 150 mM NaCl, MGD) for protein concentration of 30 g / ml A cell membrane fraction solution was prepared. Atsushi membrane fraction solution 200/1 was combined with 51.5 nM [ 35 S] -Guanosine 5 '-(rtio) triphosphate (NEN) at a concentration of 21 and various concentrations of Psi SENR ligand (SEQ ID NO: Add 21) and keep the mixture at 25 ° C for 1 hour.
  • membrane dilution buffer 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.4), 5 mM MgCl, 150 mM NaCl, MGD
  • a cell membrane fraction solution was prepared. Atsushi membrane fraction solution 200/1 was combined with 51.5 nM [ 35 S] -Guanosine
  • Human SENR expression CH0 of human SENR ligand (human urotensin II) (SEQ ID NO: 22)
  • the activity of promoting the binding of S] -guanosine 5,-(athio) triphosphate to the cell membrane fraction was measured by the following method. First, the method for preparing the membrane fraction will be described. 1 X 10 8 cells of CHO / hSENR cells 10 ml of homogenate buffer one (10 mM NaHC0 3, 5 mM EDTA, 0.5 mM PMSF, 1 gl Sir statin, 4 ⁇ g / ml E64 , 20 el leu Sir tin) the The mixture was supplemented with water and crushed using a Polytron (12,000 rpm, 1 minute).
  • the cell lysate was centrifuged (1,000 g, 15 minutes) to obtain a supernatant. Next, the supernatant was subjected to ultracentrifugation (Beckman type, 30 mouth overnight, 30,000 rpra, 1 hour), and the obtained precipitate was used as a human SENR-expressing CH0 cell membrane fraction.
  • the measurement of GTPrS binding activity is as follows. Human SENR-expressing CH0 cell membrane fraction was diluted with membrane dilution buffer (50 mM Tris-HCl buffer ( ⁇ 7.4), 5 mM MgCl 2 , 150 mM NaCK 1 M GDP) to obtain a protein concentration of 30; ⁇ g / ml. A cell membrane fraction solution for Atsushi was prepared. 51.5 nM concentration of [ 35 S] -Guanosine 5 '-(r-thio) triphosphate ( ⁇ ) was added to membrane fraction solution 1 for Atsei 1 and human SENR ligand at various concentrations (SEQ ID NO: 22). ) was added and the mixture was kept at 25 ° C for 1 hour.
  • An isotope-labeled mouse SENR ligand for use in a binding inhibition experiment was prepared as follows. Dissolve 5 g of SENR ligand (SEQ ID NO: 21) in 25 1 of 0.4 M sodium acetate (pH 5.6), and add 200 ng of lactoperoxidase. (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), and then 1 mCi of [ 125 1] -sodium iodide (Amersham Pharmacia Biotech) and 200 ng of hydrogen peroxide (10 1) were added. After leaving at room temperature for 10 minutes, 200 ng of hydrogen peroxide (10/1) was further added and left to stand for 10 minutes. This TSKge l ODS-80T S column (4.
  • CH0 / SENR cells were seeded on a 24-well plate at 5 ⁇ 10 4 cells / we 11 and cultured for 48 hours, and then the cells were washed with 0.5 ml of ⁇ medium containing 0.05% BSA (hereinafter The MEM ⁇ medium containing 0.05% BSA is called the reaction buffer).
  • Reaction buffer containing 200 ⁇ [ 125 1] labeled SENR ligand for total binding, 200 pM labeled SENR ligand and M non-isotope labeled labeled SENR ligand for nonspecific binding 0.5 ml each of a reaction buffer containing 200 pM [
  • the rat SENR receptor binding activity of the test sample is expressed as a ratio of the total binding minus the radioactivity of the cell lysate to which the sample was added to the specific binding.
  • Example 2 Using isotopically labeled human SENR ligand and CHO / hSENR cells Binding inhibition experiment
  • Example 25 in analogy to human SENR ligand (SEQ ID NO: 22) [125 1] -labeled below how the binding inhibition experiment using work made the labeled human SENR ligand and human SENR expressing CH0 cells.
  • the CHO / hSENR cells were seeded at 5 ⁇ 10 4 cells / well on a 24-well plate, cultured for 48 hours, and then the cells were washed with 0.5 ml of MEM ⁇ medium containing 0.05% BSA (hereinafter referred to as “0”).
  • reaction buffer one containing total binding temper bell 150 for Romyu [125 1] -labeled human SENR ligand, 150 Romyu to examine the nonspecific binding [ '25 1] labeled human SENR ligand and non Aisoto - flop labeled reaction buffer one including human SENR ligand further sample and 150 M [ '25 1] reaction buffer one containing the labeled human SENR ligand to examine the binding activity against the human SENR receptor, each 0. 5 ml of each cell The mixture was added and reacted at room temperature for 30 minutes.
  • the method of binding inhibition experiment using membrane fraction of the produced [ '25 1] labeled ⁇ shea SENR ligand and rat Bok SENR expressed CH0 cells in Example 25 are shown below.
  • the membrane fraction prepared from the CH0 / SENR cells described in Example 23 was treated with a membrane dilution buffer (50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.4), 5 mM MgCl "0.13 ⁇ 4 BSA, 5 mM EDTA, 0 mM (5 mM PMSF, 1 ⁇ g / ml pepst at in, 4 tg / ml E64, 20 ig / ml leupept in) to make a cell membrane fraction solution for Atsushi with a protein concentration of 4 ⁇ g / ml. . the Atsusi membrane fraction solution for 100 1, total binding 200 M [125 1] to examine the membrane dilution buffer containing labeled ⁇ shea SENR ligand, non yb
  • the rat SENR receptor binding activity of the test sample is expressed as a ratio of the value obtained by subtracting the radioactivity of the cell membrane fraction to which the sample was added from the total binding to the specific binding.
  • FIG. 12 shows the binding activity of various concentrations of the pear SENR ligand.
  • Example 25 in analogy to human SENR ligand (SEQ ID NO: 22) the '25 1] labeled with the steel work [' 25 1] The membrane fraction of labeled human SEN'R ligand and human SENR expressing CH0 cells The method of the binding inhibition experiment used is shown below.
  • the membrane fraction prepared from the CHO / hSENR cells described in Example 24 was treated with a membrane dilution buffer (50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.4), 5 mM MgCl 2 , 0.13 ⁇ 4 BSA, 5 mM EDTA , 0.5 mM PMSF, g / ml pepst at in, 4 Mg / ml E64, 20 (igM leupept in) to obtain a cell membrane fraction solution of Atssay with a protein concentration of 60; g / inl. I made a.
  • a membrane dilution buffer 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.4), 5 mM MgCl 2 , 0.13 ⁇ 4 BSA, 5 mM EDTA , 0.5 mM PMSF, g / ml pepst at in, 4 Mg / ml E64, 20 (igM leupept in)
  • Membrane dilution buffer containing labeled human SENR ligand 100 1 was added to each well and reacted at room temperature for 60 minutes. The mixture was filtered with a filter, and the filter was further subjected to membrane dilution buffer. 1.
  • FIG. 13 shows the binding activities of human SENR ligands at various concentrations.
  • Example 30 Synthetic Escherichia coli SEXR ligand suppresses cAMP synthesis on rat SENR-expressing CH0 cells
  • the cAMP synthesis inhibitory activity on rat SENR-expressing CH0 cells indicated by the mouse SENR ligand (SEQ ID NO: 21) synthesized in Example was measured by the following method. CH0 / SENR cells were seeded on a 24-well plate at 5 ⁇ 10 4 cells / well and cultured for 48 hours. The cells were washed with Hanks buffer (pH 7.4) containing 0.2 mM 3-isobutyl-methylxanthine, 0.05% BSA and 20 mM HEPES (hereinafter, 0.2 mM 3-isobutyl-methylxanthine).
  • reaction buffer 1 Hank's buffer ( ⁇ 7.4) containing 0.053 ⁇ 4 BSA and 20 mM HEPES is referred to as “reaction buffer 1”. Thereafter, 0.5 ml of the reaction buffer was added, and the mixture was incubated in the incubator for 30 minutes. After removing the reaction buffer and adding a new 0.25 ml of reaction buffer to the cells, add 0.25 ml of reaction buffer containing various amounts of SESENR ligand and 2 ⁇ forskolin. The cells were added and reacted at 37 ° C for 24 minutes. The reaction was stopped by adding 100 1 of 20% perchloric acid, and then left on ice for 1 hour to extract intracellular cAMP.
  • the cAMP synthesis inhibitory activity on human SENR-expressing CH0 cells indicated by the human SENR ligand (human urotensin II) (SEQ ID NO: 22) synthesized in Example 15 was measured by the following method. CHO / hSENR cells were seeded at 5 ⁇ 10 4 cells / well on a 24-well plate and cultured for 48 hours.
  • the cells were washed with Hank's buffer (pH 7.4) containing 0.2 m 3 -isobutyl-methylxanthine, 0.05% BSA and 20 mM HEPES (hereinafter, 0.2 mM 3-isobutyl-methylxanthine, 0.05% BSA and 20 mM
  • a Hanks buffer (pH 7.4) containing HEPES is called a reaction buffer).
  • 0.5 ml of a reaction buffer was added, and the mixture was incubated in an incubator for 30 minutes.
  • a PCR reaction was performed using the primers represented by SEQ ID NO: 10 and SEQ ID NO: 11 using the genomic DNA (Clontech) as the ⁇ type.
  • 1 KinElma) 0.4 1 and 10-fold concentrated A immediate 1 iTaq
  • the total amount of the reaction solution was set to 401 in 1/10 volume of Gold buffer.
  • Cycles for amplification were performed using a thermocycler (PerkinElmer) at 95 ° C for 9 minutes, followed by 94 • 15 seconds, 60 ° C for 20 seconds, and ⁇ . 4 cycles of 20 seconds, 94 ° C15 seconds, 52.5 ° C20 seconds, 72 ° C6 cycles of 20 seconds, 94 ° C20 seconds, 52.5 ° C20 seconds, 1T6 cycles of 20 seconds, 94 ° C20 seconds, 50 ° C20 seconds, 72 ° C8 cycles of 20 seconds, 94 ° C15 seconds, 48 ° C20 seconds After repeating the cycle of 72 ° C for 20 seconds 30 times, the mixture was kept at 72 ° C for 7 minutes.
  • a thermocycler PerkinElmer
  • the resulting reaction solution 21 was subcloned into a plasmid vector per 2.1 using a T0P0 TA cloning kit (Invitrogen) and introduced into E. coli TOP10. From the resulting transformants using the QIA P rep8 mini prep (Qiagen) to purify the plasmid DNA.
  • the reaction for nucleotide sequence determination was performed using the DyeDeoxy Terminator Cycle Sequence Kit (PerkinElmer) and decoded using a fluorescent automatic sequencer.
  • SEQ ID NO: 20 was obtained as a PCR product, which is considered to encode a part of the sea SENR ligand precursor because of its similarity to the sequence of the bus SENR ligand precursor.
  • Example 33 Preparation of whole brain cDNA
  • PCR was performed using the primer represented by SEQ ID NO: 31.
  • the composition of the reaction solution was as follows: synthetic primer: primer represented by SEQ ID NO: 31 0.5 // M, API: 0.2 M, 0.2 mM dNTPs, 2.5 mM MgCl "AmliTaq Gold DNA polymerase (PerkinElmer)
  • the total reaction volume was 20/1 with 1/10 volume of AmpliTaq Gold buffer concentrated at 0.2 w 1 and 10 times, and the cycle for amplification was performed at 95 ° C using a thermal cycler (Perkin Elmer) After incubating for 9 minutes, the cycle of 95 ° C for 10 seconds and 68 ° C for 1 minute was repeated 40 times.
  • PCR was performed by replacing the primer represented by SEQ ID NO: 31 with the primer represented by SEQ ID NO: 32.
  • the composition of the reaction mixture was 0.5 M for the synthetic primer.
  • AP2 is 0.2 M, 0.2 mM dNTPs, 2.5 mM MgCl 2 , AmpliTaq Gold DNA polymerase (PerkinElmer) 0.2
  • the total reaction volume was 1 in 1/10 volume of 1 and 10 times concentrated AmpliTaq Gold buffer, and the cycle for amplification was to use a thermocycler (PerkinElmer) for 95/9 minutes.
  • Plasmid DNA was purified from the resulting transformant using QIA prep8 mini prep kit (Qiagen) The reaction for nucleotide sequence determination was performed using the Dye Deoxy Terminator Cycle Sequence kit (Pakkin Elmer). Performed using the company), it was deciphered with the fluorescent automatic sequencer, SEQ ID NO: 33 shows the sequence was obtained.
  • Example 35 Acquisition of 3′-side Sequence of Gene Encoding Pecan SENR Ligand Precursor Protein by 3′-RACE Method WO 00/32627 ⁇ Q j PCT / JP99 / 06649
  • Example 3 An equivalent of 4 ng mRNA of the double-stranded cDNA preparation solution obtained in 3 was converted into type III, and represented by the adapter-primer-API and the SEQ ID NO: 34 attached to the Marathon cDNA immediate lification kit (Clontech). PCR was performed using a primer.
  • the composition of the reaction mixture was as follows: the primer represented by SEQ ID NO: 34 was 0.2 / M, the API power was 0.2 M, 0.2 mM dNTPs, 2.5 mM MgCl 2 , and AmpliTaq Gold DNA polymerase.
  • the total reaction volume was 20 with 1/10 volume of 0.2 ⁇ l and 10 times concentrated AmpliTaq Gold buffer.
  • the cycle for amplification was performed by using a thermal cycler (Pink-Elmer, Inc.), keeping the mixture at 95 for 9 minutes, and repeating the cycle at 95: 10 seconds at 68 ° C for 1 minute 40 times.
  • the equivalent of 0 in this reaction solution was converted into type II, and PCR was carried out with the adapter-primer API replaced by AP2 and the primer represented by SEQ ID NO: 34 replaced with the primer represented by SEQ ID NO: 35.
  • the composition of the reaction solution was as follows: for the synthetic primer, the primer represented by SEQ ID NO: 35 was 0.2 M, AP2 was 0.2 M, 0.2 mM dNTPs, 2.5 mM gCl 2 , and AmliTaq Gold DNA polymerase.
  • the total reaction volume was 20 ⁇ l with 1/10 volume of 0.21 and 10 times concentrated AmpliTaq Gold buffer.
  • the cycle for amplification was to use a thermal cycler (PerkinElmer) at 95 ° C for 9 minutes, and then a cycle of 95 ° C for 10 seconds and 66 ° C for 1 minute was repeated 40 times. Then, it was kept at 72 ° C for 10 minutes.
  • the PCR reaction mixture was subjected to electrophoresis using 3.53 ⁇ 4 Nusieve GTG Agarose (Takara Shuzo), and DNA was extracted from the band near 300 bp detected by ethidium bromide staining using the GeneClean Spin kit (Bio 1 (H)).
  • Plasmid per 2.1 was subcloned using TOPO TA cloning kit (Invitrogen) and introduced into Escherichia coli TOP010, and the resulting transformant was transformed into plasmid DNA using QIA prep8 mini prep kit (Qiagen).
  • the nucleotide sequence was purified using the DyeDeoxy Terminator Cycle Sequence kit (Pakkin Elma), and the sequence was read using a fluorescent automatic sequencer. As a result, the sequence shown in SEQ ID NO: 36 was obtained.
  • Example 34 and Example 35 it encodes a peptide SENR ligand precursor protein predicted from the sequence information on the 5 ′ terminal and 3 ′ terminal obtained using the RACE method.
  • the equivalent of 4 ng mRM of the double-stranded cDNA preparation obtained in Example 33 was used as type III, and primers represented by SEQ ID NO: 37 and SEQ ID NO: 38 were used.
  • SEQ ID NO: 37 and SEQ ID NO: 38 were used.
  • the composition of the reaction mixture was set to 0.5 for both primer concentration and 0.2 mM dNTPs, 2.5 mM MgCl 2 , AmpliTaq Gold DNA polymerase (Pakinkin Elmer) 0.1 and 1/10 volume of 10 times concentrated AmpliTaq Gold buffer
  • the total amount of the reaction solution was 201.
  • the cycle for amplification is as follows: Thermal cycler (PerkinElmer), 95 ° C for 9 minutes, 95 ° C for 10 seconds, 62 ° C for 20 seconds, 72 ° for 1 minute Was repeated 40 times, followed by incubation at 72: 10 for 10 minutes.
  • the PCR reaction solution was electrophoresed using 3.5% Nusieve GTG Agarose (Takara Shuzo), and DNA was extracted from a band around 490 bp detected by staining with ethidium bromide using the GeneClean Spin kit (Bio 101). Plasmid per 2.1 was subcloned using T0P0 TA cloning kit (Invitrogen) and introduced into E. coli TOP010. Plasmid DNA was purified from the resulting transformant using QIA prep8 mini prep kit (Qiagen). The reaction for determining the nucleotide sequence was performed using DyeDeoxy Terminator Cycle Sequence kit (PerkinElmer), and the sequence was read using a fluorescent automatic sequencer.
  • SEQ ID NO: 30 The amino acid sequence of the SENR ligand precursor protein translated from SEQ ID NO: 30 is shown in SEQ ID NO: 29.
  • amino acid sequence of the peptide SENR ligand predicted from the amino acid sequence of the peptide SENR ligand precursor protein is shown in SEQ ID NO: 21, and the nucleotide sequence of the DNA encoding it is shown in SEQ ID NO: 28.
  • FIG. 14 shows the entire nucleotide sequence and amino acid sequence of the sea SENR ligand precursor protein.
  • Goby long-jawed mudsucker, Gillichthys inirabilis
  • ⁇ rotensin ⁇ which binds to the C-terminal structure (Cys-Phe-Trp-Lys-Tyr-Cys-Va1) (SEQ ID NO: 39) was used as an antigen to prepare an antibody that recognizes the C-terminal side of the SENR ligand polypeptide.
  • One nig's goblet tensin peptide is combined with 4 mg of bovine thyroglobul in (BTG) with 30 mg of ECDI (1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide Dojindo chemistry), A carrier protein composite was prepared.
  • the inner dialysis solution and complete Freund's adjuvant are mixed, and this is used as an antigen to obtain 20 g of goby mouth tensin II equivalent to Balb / c.
  • Mice female, 6-8 weeks old
  • the complex was mixed with incomplete Freund's adjuvant, and the mixture was used as an antigen for the second immunization.
  • the conjugate was immunized every two weeks with an incomplete adjuvant mixture of bile in until the titer increased.
  • the antibody titer was measured by an enzyme immunoassay using a biotinylated goby mouth tensin peptide.
  • a biotinylated goat mouth tensin peptide [N-biotiny utra Ala'j-urotensin II) is obtained by HPLC separation of the reaction product of NHS-biot in (N-hydroxysuccinimidobiot in) and a no I got it.
  • the ⁇ -terminal was not detected in the obtained ⁇ -terminal label end sequence analysis, which was confirmed.
  • the enzyme immunoassay is as follows.
  • the DNA encoding the polypeptide of the present invention or the polypeptide of the present invention can be obtained by (1) exploring the physiological action of the polypeptide of the present invention, (2) preparing a synthetic oligonucleotide probe or PCR primer, (3) a ligand for SENR, and (2) a precursor. Acquisition of DNA encoding protein, ⁇ ⁇ Development of receptor binding assay using recombinant receptor protein expression system and screening of drug candidate compounds, ⁇ Acquisition of antibody and antiserum, 6 Development of diagnostic agents using DNA, RNA, antibodies or antisera, 7Central nervous function regulators, circulatory function regulators, heart function regulators, kidney function regulators, urinary function regulators, sensory organ function regulators, etc. It can be used for the development of pharmaceuticals, and gene therapy.

Description

明 細 書 新規生理活性物質、 その製造法および用途 技術分野 本発明は、 G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質である S E N R ( sensory epi thel ium neuropept ide- l ike receptor) に対するリガンド活性を有する新規 ポリペプチド及びこれをコードする D N Aなどに関する。 背景技術 多くのホルモンや神経伝達物質は細胞膜に存在する特異的なレセプ夕一を通 じて生体の機能を調節している。 これらのレセプターの多くは共役している guanine nuc leot i de-binding protein (以下、 G蛋白質と略称する場合がある ) の活性化を通じて細胞内のシグナル伝達を行い、 また 7個の膜貫通領域を有 する共通した構造をもっていることから、 G蛋白質共役型レセプ夕一あるいは 7回膜貫通型レセプ夕一と総称される。
このようなホルモンゃ神経伝達物質と G蛋白質共役型レセプ夕一との相互作 用を通じて生体のホメォス夕シスの維持、 生殖、 個体の発達、 代謝、 成長、 神 経系、 循環器系、 免疫系、 消化器系、 代謝系の調節、 感覚受容などの生体にと つて重要な機能調節が行われている。 このように生体機能の調節には様々なホ ルモンや神経伝達物質に対するレセプ夕一蛋白質が存在し、 その機能調節に重 要な役割を果たしていることがわかっているが、 未知の作用物質 （ホルモンや 神経伝達物質など） およびそれに対するレセプ夕一が存在するかどうかについ ては未だ不明なことが多い。
近年、 G蛋白質共役型レセプター蛋白質がその構造の一部にアミノ酸配列の 類似性を示すことを利用して、 ポリメラ一ゼ · チェーン · リアクション (Polymerase Chain Reaction :以下、 PCRと略称する） 法によって新規レセ プ夕一蛋白質をコードする DNAを探索する方法が行われるようになり、 数多 くの、 リガンドが不明ないわゆるォーファン G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質 がクロ一ニングされている（Libert, F. , et al. Science. 244, 569-572, 1989, Welch, S. K. , et al.， Biochem. Biop ys. Res. Commun. , 209, 606-613, 1995, Marchese, A., et al. , Genomics, 23, 609-618, 1994, Marchese, A. , Genomics, 29, 335-344, 1995)。 また、 ゲノム D N Aあるいは c D N Aのランダムな配列 決定によっても、 新規 G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質が次々と見出されてい る（Nomura, N. , et al. , DNA Research 1巻、 27- 35頁、 1994年） 。 これらのォ —ファン G蛋白質共役型レセプター蛋白質のリガンドを決定する一般的な手段 としては、 G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質の一次構造上の類似性から推定す るしかなかった。 しかし、 多くのォーファン G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質 は既知のレセプ夕一とのホモロジ一が低いものが多く、 実際は既知リガンドの レセプ夕一サブタイプである場合を除いては一次構造上の類似性だけでそのリ ガンドを推定することは困難であった。 一方、 遺伝子解析から多くのォ一ファ ン G蛋白質共役型レセプ夕一がみつかっていることから対応する未知のリガン ドがまだ数多く存在していることが推定されているが、 これまで実際にォーフ アン G蛋白質共役型レセプ夕一のリガンドを同定した例は数少ない。
最近、 動物細胞にォーファン G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質をコ一ドする cDNAを導入し、 新規ォピオイドペプチドを探索した例が報告されている （ Reinsheid, R. K. et al. , Science, 270卷、 792-794頁、 1995年、 Menular, J. -C. , et al. , ature 377巻、 532-535頁、 1995年） 。 しかしこの場合は既知 G蛋白 質共役型レセプ夕一蛋白質との類似性や組織分布から、 容易にリガンドはォピ オイドペプチドのファミリーに属することが予想されていた。 ォピオイドレセ プターを介して生体に作用する物質の研究 ·開発の歴史は長く、 種々のアン夕 ゴニスト ·ァゴニス卜が開発されていた。 そこで人為的に合成した化合物群の 中からこの受容体に対するァゴニストを見出し、 それをプローブとして受容体 c DNA導入細胞における受容体の発現を検証した後に、 ァゴニストと同じ様 な細胞内情報伝達系の活性化物質を探索し、 これを精製し、 リガンドの構造を 決定している。
またカタツムリのォ一ファン G蛋白質共役型レセプター （GRL 104) を コードする c DNAを CHO細胞に導入してレセプ夕一発現細胞での特異的な 細胞内遊離カルシウム濃度の上昇を指標として新規生理活性ペプチドを同定し た例が報告されているが （Cox, K. J. A. , et ah, J. Neurosci., 17(4), 1197- 1205, 1997)、 この新規生理活性ペプチドは既知の leucokininと高い相同性を有 し、 GRL 104は既知の leucokininとの反応性もあった。 このようにォ一フ アン G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質の中でリガンドがおおよそ推定されうる ものはほとんどなく、 特に、 既知の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質ファミリ —と類似性が低い場合、 リガンドに関する情報はほとんどなく、 リガンドを推 定することは困難であった。
ォ一ファン G蛋白質共役型レセプ夕一として報告されているものの一つに S ENRがある（Tal, M. et al. , Biochem. Biophys. Res. Co匪 un.， 209, 752- 759, 1995)。 S ENRはソマトス夕チンレセプター （SSTR4) と低いホモロジ 一があるが、 そのリガンドが何であるのかはこれまで不明であった。 なお、 Marchese, A.らによって報告された GP R 14 (Marchese, A. , Genomics, 29, 335-344, 1995) は S E N Rと同一のレセプ夕一である。 中枢神経系、 循環器 系、 生殖器系、 免疫系、 消化器、 泌尿器系器官、 感覚器官等で発現している G 蛋白質共役型レセプターである SENRに対するリガンドは、 医薬として有用 であると考えられるが、 これまでにその構造および機能については明らかにさ れていない。 発明の開示 本発明者らは、 S ENRをコードする c DNAを適当な手段で発現させた細 胞を用い、 特異的な細胞刺激 （シグナル伝達） 活性の測定等を指標に、 該レセ プ夕ー蛋白質がリガンドとして認識するポリペプチドをスクリーニングするこ とに成功した。
さらに、 本発明者らは、 該活性因子であるリガンドと上記 S ENRとの結合 性を変化させる化合物のスクリーニングを行なうことができることを見いだし た。
すなわち、 本発明は、
(1) 配列番号： 7で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有するポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステル またはその塩、
(2) 実質的に同一のアミノ酸配列が配列番号： 8または配列番号： 2 1で表 されるアミノ酸配列である上記 （1) 記載のポリペプチドもしくはそのアミド もしくはそのエステルまたはその塩、
(3) 上記 （1) 記載のポリペプチドの前駆体タンパク質またはその塩、
(4) 配列番号： 18または配列番号： 1 9で表されるアミノ酸配列と同一も しくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する上記 （3) 記載の前駆体タンパ ク質またはその塩、
(5) 上記 （1) 記載のポリペプチドをコードする塩基配列を有する DNAを 含有する DNA、
(6) 配列番号： 27または配列番号： 28で表される塩基配列を有する上記 (5) 記載の DNA、
(7) 上記 （3) 記載の前駆体タンパク質をコードする塩基配列を有する DN Aを含有する DNA、
(8) 配列番号： 1 5、 配列番号： 1 6または配列番号： 1 7で表される塩基 配列を有する上記 （7) 記載の DNA、 (9) 上記 （5) または上記 （7) 記載の DN Aを含有する組換えべクタ一、
(10) 上記 （9) 記載の組換えベクターで形質転換された形質転換体、
(11) 上記 （10) 記載の形質転換体を培養し、 上記 （1) 記載のポリぺプ チドまたは上記 （3) 記載の前駆体タンパク質を生成、 蓄積せしめ、 これを採 取することを特徴とする上記 （1) 記載のポリペプチドもしくはそのアミドも しくはそのエステルまたはその塩、 または上記 （3) 記載の前駆体タンパク質 もしくはその塩の製造法、
(12) 上記 （1) 記載のポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエス テルまたはその塩、 または上記 （3) 記載の前駆体タンパク質もしくはその塩 に対する抗体、
(13) 上記 （1) 記載のポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエス テルまたはその塩、 または上記 （3) 記載の前駆体タンパク質もしくはその塩 を含有してなる医薬、
(14) 上記 （5) または上記 （7) 記載の DN Aを含有してなる医薬、 (15) 中枢機能調節剤、 循環機能調節剤、 心臓機能調節剤、 腎臓機能調節剤 、 泌尿器機能調節剤または感覚器官機能調節剤である上記 （13) または上記 (14) 記載の医薬、
(16) 上記 （1) 記載のポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエス テルまたはその塩または上記 （3) 記載の前駆体タンパク質もしくはその塩を 用いることを特徴とする S ENRと上記 （1) 記載のポリペプチドもしくはそ のアミドもしくはそのエステルまたはその塩、 または上記 （3) 記載の前駆体 タンパク質もしくはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩のスク リーニング方法、
(17) 上記 （1) 記載のポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエス テルまたはその塩、 または上記 （3) 記載の前駆体タンパク質もしくはその塩 を含有してなる SENRと上記 （1) 記載のポリペプチドもしくはそのアミド もしくはそのエステルまたはその塩、 または上記 （3) 記載の前駆体タンパク 質もしくはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニン グ用キッ卜、
(18) 配列番号： 22で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドもし くはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を用いることを特徴とする
S ENRと配列番号： 22で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドも しくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩との結合性を変化させる 化合物またはその塩のスクリ一ニング方法、
(19) 配列番号： 22で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドもし くはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を含有してなる S ENRと 配列番号： 22で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドもしくはその アミドもしくはそのエステルまたはその塩との結合性を変化させる化合物また はその塩のスクリーニング用キット、
(20) 上記 （16) もしくは上記 （18) 記載のスクリーニング方法または 上記 （17) もしくは上記 （19) 記載のスクリーニング用キットを用いて得 られる、 ① SENRと上記 （1) 記載のポリペプチドもしくはそのアミドもし くはそのエステルまたはその塩、 または上記 （3) 記載の前駆体タンパク質も しくはその塩、 または② S ENRと配列番号： 22で表されるアミノ酸配列を 含有するポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩 との結合性を変化させる化合物またはその塩、
(21) 上記 （20) 記載の化合物またはその塩を含有することを特徴とする 高血圧症の予防 ·治療薬、
(22) 上記 （12) 記載の抗体を用いることを特徴とする上記 （1) 記載の ポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩、 または 上記 （3) 記載のタンパク質もしくはその塩の定量方法、 および
(23) 上記 （12) 記載の抗体を含有することを特徴とする上記 （1) 記載 のポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩、 また は請求項 3記載の前駆体夕ンパク質もしくはその塩の機能が関与する疾患の診 断剤などに関する。
さらに、 本発明は、
(24) 哺乳動物由来である上記 （1) 項記載のポリペプチドもしくはそのァ ミドもしくはそのエステルまたはその塩、 または上記 （3) 記載の前駆体タン パク質もしくはその塩、 および
(25) 高 （低） 血圧症、 腎疾患、 心疾患、 頻尿、 尿失禁、 難聴、 嗅覚異常、 視覚異常などの疾病の治療 '予防剤である上記 （1 3) または （14) 記載の 医薬などを提供するものである。 本発明におけるポリペプチドに対する SE NRに関して、 具体的には、 上述の公知の S ENRまたはその塩などがあげら れるのみならず、
(26) 配列番号： 9または配列番号： 26で表されるアミノ酸配列と同一も しくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有することを特徴とする S E N Rまた はその塩、 または
(27) SENRが、 配列番号： 9または配列番号： 26で表されるアミノ酸 配列中の 1個以上 30個以下、 好ましくは 1個以上 10個以下のアミノ酸が欠 失したアミノ酸配列、 配列番号： 9または配列番号： 26で表されるアミノ酸 配列に 1個以上 30個以下、 好ましくは 1個以上 10個以下のアミノ酸が付加 した （または挿入された） アミノ酸配列、 あるいは配列番号： 9または配列番 号： 26で表されるアミノ酸配列中の 1個以上 30個以下、 好ましくは 1個以 上 10個以下のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列を含有する 蛋白質である上記 （26) 項記載の SENRまたはその塩などに関する。 図面の簡単な説明
図 1はラット全脳 cDXAを用いて PCR法によって単離したラット SENRの cDNA配列 を示す （配列番号： 3) 。
図 2はブ夕脊髄抽出物から調製した HPLCフラクションについて CH0/SENR細胞株 からのァラキドン酸代謝物の遊離を促進する活性を測定した結果を示す図を示 す。
図 3は実施例 6中の HPLC分画 #33のァラキドン酸代謝物遊離活性のプロナ一ゼ 処理に対する挙動を示す図を示す。
図 4は実施例 7中の CNカラム （Deve l os i l CN-UG-5) で精製した画分について CH0/SENRに特異的なァラキドン酸代謝物の遊離を促進する活性を測定した結果 を示す図を示す。
図 5は実施例 7中の CNカラム （Deve l os i l CN-UG-5) で精製した画分について CH0/SENRに特異的なァラキドン酸代謝物の遊離を促進する活性を測定した結果 を示す図を示す。
図 6は実施例 7中の 0DSカラム （Wakos i l- I I 3C18HG) で精製した画分について CH0/SENRに特異的なァラキドン酸代謝物の遊離を促進する活性を測定した結果 を示す図を示す。
図 7は実施例 7中の 0DSカラム （Wakos H-I I 3C18HG) で精製した画分について CHO/SE 'Rに特異的なァラキドン酸代謝物の遊離を促進する活性を測定した結果 を示す図を示す。
図 8はブ夕脊髄 cDNAより単離したブ夕 SENRリガンド前駆体蛋白質 cDNAの全塩基 配列およびそれから翻訳されるブ夕 SENRリガンド前駆体蛋白質の全アミノ酸配 列を示す。
□内は SENRリガンドポリべプチドの配列である。
図 9は合成ブ夕 SENRリガンドの CH0/SENR細胞株に対するァラキドン酸代謝物遊 離活性を示す図を示す。
図 1 0は合成ブ夕 SENRリガンドのラット胸部大動脈リング標本に対する収縮活 性を示す図を示す。 図 1 1は合成ヒト SENRリガンド （ヒト uro tens i n I I) の CHO/hSENR細胞株に対す るァラキドン酸代謝物遊離活性を示す図を示す。
図 1 2は合成ゥシ SENRリガンドの CH0/SENR細胞膜画分に対する結合活性を示す 図を示す。
図 1 3は合成ヒト SENRリガンドの CHO/hSENR細胞膜画分に対する結合活性を示 す図を示す。
図 1 4はゥシ全脳 cDNA より単離したゥシ SENR リガンド前駆体蛋白質 c DNAの全塩基配列およびそれから翻訳されるゥシ SENR リガンド前駆体蛋白 質の全アミノ酸配列を示す。 口で囲まれた配列は、 ゥシ SENRリガンドポリべ プチドの配列である。
発明を実施するための最良の形態 本明細書において、 「実質的に同一」 とはポリペプチドまたはタンパク質の 活性、 例えば、 リガンドと受容体 （S E N R) の結合活性、 生理的な特性など 力^ 実質的に同じことを意味する。 アミノ酸の置換、 欠失、 付加あるいは挿入 はしばしばポリぺプチドまたは夕ンパク質の生理的な特性や化学的な特性に大 きな変化をもたらさないが、 こうした場合その置換、 欠失、 付加あるいは挿入 を施されたポリペプチドは、 そうした置換、 欠失、 付加あるいは挿入のされて いないものと実質的に同一であるとされるであろう。 該アミノ酸配列中のアミ ノ酸の実質的に同一な置換物としては、 たとえばそのアミノ酸が属するところ のクラスのうち他のアミノ酸類から選ぶことができうる。 非極性 （疎水性） ァ ミノ酸としては、 ァラニン、 ロイシン、 イソロイシン、 ノ リン、 プロリン、 フ ェニルァラニン、 トリブトファン、 メチォニンなどがあげられる。 極性 （中性 ) アミノ酸としてはグリシン、 セリン、 スレオニン、 システィン、 チロシン、 ァスパラギン、 グルタミンなどがあげられる。 陽電荷をもつ （塩基性） ァミノ 酸としてはアルギニン、 リジン、 ヒスチジンなどがあげられる。 負電荷をもつ (酸性） アミノ酸としては、 ァスパラギン酸、 グルタミン酸などがあげられる 本発明のポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその 塩は、 S E N Rに対するリガンドであり、 具体的には、 配列番号： 7で表され るアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリべ プチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩などがあげられ る。
本発明のポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその 塩 （以下、 単に本発明のポリペプチドと称する場合がある） 、 その製造法およ び用途を以下にさらに詳細に説明する。
本発明のポリペプチドとしては、 ヒトゃ温血動物 （例えば、 モルモット、 ラ ット、 マウス、 ブ夕、 ヒッジ、 ゥシ、 サルなど） のあらゆる組織 （たとえば、 下垂体、 塍臓、 脳、 腎臓、 肝臓、 生殖腺、 甲状腺、 胆のう、 骨髄、 副腎、 皮膚 、 筋肉、 肺、 消化管、 血管、 心臓など） または細胞などに由来するポリべプチ ドであって、 配列番号： 7で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同 一のアミノ酸配列を含有するポリべプチドであれば如何なるものであってもよ い。 例えば、 本発明のポリペプチドとしては、 配列番号： 7で表されるァミノ 酸配列を含有するポリペプチドなどの他に、 配列番号： 7で表されるアミノ酸 配列を含有するポリペプチドと実質的に同質の活性を有するポリペプチド （例 えば、 配列番号： 8または配列番号： 2 1で表されるアミノ酸配列を含有する ポリペプチドなど） などがあげられる。 実質的に同質の活性としては、 例えば レセプ夕一結合活性、 シグナル伝達活性などがあげられる。 実質的に同質とは 、 レセプ夕一結合活性などが性質的に同質であることを示す。 したがって、 レ セプ夕一結合活性の強さなどの強弱、 ポリペプチドの分子量などの量的要素は 異なっていてもよい。 配列番号： 7で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有 するポリペプチドとして具体的には、 配列番号： 7で表されるアミノ酸配列を 含有するポリペプチドの N末端から 3番目のアミノ酸 （Th r) が他のアミノ 酸 （例、 Ala, Leu, He, Val, Pro, Phe, Trp, Met, Gly, Ser, Cys, Tyr, Asn, Gin, Arg, Lys, His, Asp, Glu) に置換されているアミノ酸配列を含有するポ リペプチドなどがあげられる。 なかでも、 配列番号： 7で表されるアミノ酸配 列を含有するポリペプチドの N末端から 3番目のアミノ酸 （Th r) が P r o に置換されているアミノ酸配列 （配列番号： 8) を含有するポリペプチドおよ び配列番号： 7で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドの N末端から 3番目のアミノ酸 （Th r) が S e rに置換されているアミノ酸配列 （配列番 号： 2 1) などが好ましい例としてあげられる。
本明細書におけるポリぺプチドはぺプチド標記の慣例に従って左端が N末端 (アミノ末端) 、 右端が C末端 （カルボキシル末端） である。 ①配列番号： 7 で表されるアミノ酸配列、 ②配列番号： 8で表されるアミノ酸配列、 ③配列番 号： 2 1で表されるアミノ酸配列で表されるアミノ酸配列などを含有するポリ ペプチドは C末端が通常力ルポキシル基 （-C00H)またはカルボキシレート（-C00 ―)であるが、 C末端がアミド （-C0NH2)またはエステル (-C00R)であってもよい 。 エステルの Rとしては、 例えばメチル、 ェチル、 n—プロピル、 イソプロピ ルもしくは n—ブチルなどのじェ アルキル基、 シクロペンチル、 シクロへキシ ルなどの C3— 8シクロアルキル基、 フエニル、 《—ナフチルなどの C6_12ァリ ール基、 ベンジル、 フエネチル、 ベンズヒドリルなどのフエ二ルー Ci_2アルキ ル、もしくは α—ナフチルメチルなどの α—ナフチル— C卜2アルキルなどの C 7_14ァラルキル基のほか、 経口用エステルとして汎用されるビバロイルォキシ メチル基などがあげられる。
本発明のポリペプチドの塩としては、 生理学的に許容される塩基 （例えばァ ルカリ金属など） や酸 （有機酸、 無機酸） との塩が用いられるが、 とりわけ生 理学的に許容される酸付加塩が好ましい。 このような塩としては例えば無機酸 (例えば、 塩酸、 リン酸、 臭化水素酸、 硫酸） との塩、 あるいは有機酸 （例え ば、 酢酸、 ギ酸、 プロピオン酸、 フマル酸、 マレイン酸、 コハク酸、 酒石酸、 クェン酸、 リンゴ酸、 シユウ酸、 安息香酸、 メタンスルホン酸、 ベンゼンスル ホン酸） との塩などが用いられる。
本発明のポリペプチドは、 ヒトゃ温血動物の組織または細胞からポリべプチ ドを精製する方法によって製造することもできるし、 後述のポリぺプチド合成 法に準じて製造することもできる。 また、 後述するポリペプチドをコードする D N Aを含有する形質転換体を培養することによつても製造することができる ヒトゃ温血動物の組織または細胞から製造する場合、 ヒトゃ温血動物の組織 または細胞をホモジナイズした後、 酸、 有機溶媒などで抽出を行い、 該抽出液 を、 塩析、 透析、 ゲル濾過、 逆相クロマトグラフィー、 イオン交換クロマトグ ラフィ一、 ァフィ二ティークロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを組 み合わせることにより精製単離することができる。
上記したように本発明のポリペプチドは、 自体公知のポリべプチドの合成法 に従って、 あるいは本発明のポリペプチドを含有するポリペプチドを適当なぺ プチダーゼで切断することによって製造することができる。 ぺプチドの合成法 としては、 例えば固相合成法、 液相合成法のいずれによっても良い。 すなわち 、 本発明のポリぺプチドを構成し得る部分べプチドもしくはアミノ酸と残余部 分とを縮合させ、 生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより 目的のペプチドを製造することができる。 公知の縮合方法や保護基の脱離とし てはたとえば、 以下の①〜⑤に記載された方法があげられる。
① M. Bodanszky および M. A. Onde t t i、 ペプチド シンセシス （Pept i de Synthes i s) , In tersc i ence Pub l i shers, New York (1966年)
② Schroederおよび Luebke、 ザ ペプチド（The Pept i de) , Academi c Press, New York ( 1965年）
③泉屋信夫他、 ペプチド合成の基礎と実験， 丸善 (株） （1975年）
④矢島治明 および榊原俊平、 生化学実験講座 1、 タンパク質の化学 IV、 205、 (1977年）
⑤矢島治明監修、 続医薬品の開発 第 14巻 ペプチド合成 広川書店
また、 反応後は通常の精製法、 たとえば、 溶媒抽出 ·蒸留 ·カラムクロマト グラフィー ·液体クロマトグラフィー ·再結晶などを組み合わせて本発明のポ リぺプチドを精製単離することができる。 上記方法で得られるポリペプチドが 遊離体である場合は、 公知の方法によって適当な塩に変換することができるし 、 逆に塩で得られた場合は、 公知の方法によって遊離体に変換することができ る。
ポリペプチドのアミド体は、 アミド形成に適した市販のペプチド合成用樹脂 を用いることができる。 そのような樹脂としては例えば、 クロロメチル樹脂、 ヒドロキシメチル榭脂、 ベンズヒドリルァミン樹脂、 アミノメチル樹脂、 4一 ベンジルォキシベンジルアルコール樹脂、 4—メチルベンズヒドリルアミン樹 脂、 PAM樹脂、 4ーヒドロキシメチルメチルフエニルァセトアミドメチル樹脂、 ポリアクリルアミド樹脂、 4— ( 2 ' , 4 ' -ジメトキシフエ二ル一ヒドロキシメ チル） フエノキシ樹脂、 4— ( 2 ' , 4 ' -ジメトキシフエニル一 Fmocアミノエチ ル） フエノキシ樹脂などをあげることができる。 このような樹脂を用い、 α— ァミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、 目的とするペプチドの配 列通りに、 自体公知の各種縮合方法に従い、 樹脂上で縮合させる。 反応の最後 に樹脂からペプチドを切り出すと同時に各種保護基を除去し、 必要に応じて高 希釈溶液中で分子内ジスルフィ ド結合形成反応を実施し、 目的のポリペプチド を取得する。
上記した保護されたアミノ酸の縮合に関しては、 ペプチド合成に使用できる 各種活性化試薬を用いることができるが、 特に、 カルポジイミド類がよい。 力 ルポジイミド類としては DC Ν, Ν' -ジイソプロピルカルポジイミド、 Ν-ェチル - N' -（3-ジメチルァミノプロピル） カルポジイミドなどがあげられる。 これらに よる活性化にはラセミ化抑制添加剤 （例えば、 H0B t、 HOOB tなど）とともに保護 されたアミノ酸を直接樹脂に添加するかまたは、 対称酸無水物または HOB tェス テルあるいは HOOBtエステルとしてあらかじめ保護されたアミノ酸の活性化を 行ったのちに樹脂に添加することができる。 保護されたアミノ酸の活性化ゃ樹 脂との縮合に用いられる溶媒としては、 ぺプチド縮合反応に使用しうることが 知られている溶媒から適宜選択されうる。 たとえば N， N—ジメチルホルムァ ミド、 N , N—ジメチルァセトアミド、 N—メチルピロリドンなどの酸アミド 類、 塩化メチレン、 クロ口ホルムなどのハロゲン化炭化水素類、 トリフルォロ エタノールなどのアルコール類、 ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類 、 ピリジンなどの三級アミン類、 ジォキサン、 テトラヒドロフランなどのエー テル類、 ァセ卜二トリル、 プロピオ二トリルなどの二トリル類、 酢酸メチル、 酢酸ェチルなどのエステル類あるいはこれらの適宜の混合物などが用いられる 。 反応温度はペプチド結合形成反応に使用され得ることが知られている範囲か ら適宜選択され、 通常約一 2 0 °C〜5 0 °Cの範囲から適宜選択される。 活性化 されたアミノ酸誘導体は通常 1 . 5ないし 4倍過剰で用いられる。 ニンヒドリ ン反応を用いたテス卜の結果、 縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行うこ となく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を行うことができる。 反応を 繰り返しても十分な縮合が得られないときには、 無水酢酸またはァセチルイミ ダゾ一ルを用いて未反応アミノ酸をァセチル化して、 後の反応に影響を及ぼさ ないようにすることができる。
原料アミノ酸のァミノ基の保護基としては、 たとえば、 Z、 Boc、 夕一シャリ —ペンチルォキシカルボニル、 イソボルニルォキシカルボニル、 4ーメトキシ ベンジルォキシカルボニル、 C卜 Z、 Br-Z、 ァダマンチルォキシカルボニル、 卜 リフルォロアセチル、 フタロイル、 ホルミル、 2—ニトロフエニルスルフエ二 ル、 ジフエニルホスフイノチオイル、 Fmocなどがあげられる。 カルボキシル基 の保護基としては、 たとえば Rとして上記した アルキル基、 C 3 _ 8シクロ アルキル基、 C 7 _ 1 4 7ラルキル基の他、 2—ァダマンチル、 4一二トロべンジ ル、 4—メトキシベンジル、 4—クロ口ベンジル、 フエナシル基およびべンジ ルォキシカルボニルヒドラジド、 夕一シャリーブトキシカルボニルヒドラジド 、 トリチルヒドラジドなどがあげられる。
セリンおよびスレオニンの水酸基は、 たとえばエステル化またはエーテル化 によって保護することができる。 このエステル化に適する基としては例えばァ セチル基などの低級アルカノィル基、 ベンゾィル基などのァロイル基、 ベンジ ルォキシカルボニル基、 エトキシカルボニル基などの炭素から誘導される基な どがあげられる。 また、 エーテル化に適する基としては、 たとえばベンジル基 、 テトラヒドロビラ二ル基、 夕ーシャリーブチル基などである。
チロシンのフエノール性水酸基の保護基としては、 たとえば Bz l、 C l 2 -Bzし
2—ニトロベンジル、 Br-Z、 夕ーシャリーブチルなどがあげられる。
ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、 Tos、 4 -メトキシ- 2, 3, 6-トリ メチルベンゼンスルホニル、 DNP、 ベンジルォキシメチル、 Bum、 Boc、 Tr t、 Fmoc などがあげられる。
原料のカルボキシル基の活性化されたものとしては、 たとえば対応する酸無 水物、 アジド、 活性エステル [アルコール （たとえば、 ペンタクロロフエノ一 リレ、 2, 4， 5-トリクロ口フエノール、 2, 4 -ジニトロフエノール、 シァノメチルァ ルコール、 パラニトロフエノール、 H0NB、 N-ヒドロキシスクシミド、 N-ヒドロ キシフタルイミド、 HOB t ) とのエステル] などがあげられる。 原料のアミノ基 の活性化されたものとしては、 たとえば対応するリン酸アミドがあげられる。 保護基の除去 （脱離） 方法としては、 たとえば Pd黒あるいは Pd炭素などの触 媒の存在下での水素気流中での接触還元や、 また、 無水フッ化水素、 メタンス ルホン酸、 トリフルォロメ夕ンスルホン酸、 トリフルォロ酢酸あるいはこれら の混合液などによる酸処理や、 ジイソプロピルェチルァミン、 トリェチルアミ ン、 ピぺリジン、 ピぺラジンなどによる塩基処理、 また液体アンモニア中ナト リゥムによる還元などもあげられる。 上記酸処理による脱離反応は一般に一 2 0 ：〜 4 0 °Cの温度で行われるが、 酸処理においてはァニソール、 フエノール 、 チオアニソ一ル、 メタクレゾール、 パラクレゾール、 ジメチルスルフイド、 1, 4-ブタンジチオール、 1, 2 -エタンジチオールのようなカチオン捕捉剤の添加 が有効である。 また、 ヒスチジンのイミダゾ一ル保護基として用いられる 2, 4- ジニトロフエニル基はチォフエノール処理により除去され、 トリブトフアンの インドール保護基として用いられるホルミル基は上記の 1, 2 -エタンジチオール 、 1, 4 -ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による脱保護以外に、 希水酸化 ナトリウム、 希アンモニアなどによるアルカリ処理によっても除去される。 原料の反応に関与すべきでない官能基の保護および保護基、 ならびにその保 護基の脱離、 反応に関与する官能基の活性化などは公知の基あるいは公知の手 段から適宜選択しうる。
ポリペプチドのアミド体を得る別の方法としては、 まず、 カルボキシル末端 アミノ酸の α—カルボキシル基をアミド化した後、 アミノ基側にペプチド鎖を 所望の鎖長まで延ばした後、 該ペプチド鎖の Ν末端の α—ァミノ基の保護基の みを除いたペプチドと C末端のカルボキシル基の保護基のみを除いたペプチド (またはアミノ酸） とを製造し、 この両ペプチドを上記したような混合溶媒中 で縮合させる。 縮合反応の詳細については上記と同様である。 縮合により得ら れた保護ペプチドを精製した後、 上記方法によりすベての保護基を除去し、 所 望の粗ポリぺプチドを得ることができる。 この粗ポリぺプチドは既知の各種精 製手段を駆使して精製し、 主要画分を凍結乾燥することで所望のポリペプチド のアミド体を得ることができる。
ポリペプチドのエステル体を得るにはカルボキシ末端アミノ酸のひ一力ルポ キシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステルとした後、 ポリぺプ チドのアミド体と同様にして所望のポリペプチドのエステル体を得ることがで さる。
本発明のポリペプチドとしては、 上記した配列番号： 7で表されるアミノ酸 配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、 該ポリペプチドと 同様の作用、 例えば中枢神経機能調節作用、 循環機能調節作用、 心臓機能調節 作用、 腎臓機能調節作用、 泌尿器機能調節作用または感覚器官機能調節作用な どを有しているものであれば、 どのようなポリペプチドであってもよい。 この ようなポリペプチドとしてはたとえば、 上記した配列番号： 8または配列番号 ： 2 1で表されるアミノ酸配列を有するペプチドをあげることができる。
本発明のポリぺプチドはさらに該ポリぺプチドに対する抗体の調製のための 抗原として用いることができる。 このような抗原としてのポリペプチドは上記 した本発明のポリぺプチドの他に、 上記本発明のポリぺプチドの N末端べプチ ド、 C末端ペプチド、 中央部分のペプチドなどの部分ペプチドなどが用いられ る。
部分ペプチドとしては、 個々のドメインを個別に含むペプチドも用い得るが 、 複数のドメインを同時に含む部分のぺプチドでも良い。
本明細書における部分ペプチドも C末端がアミド （_C0NH2)またはエステル
(-C00R)であってもよい。 ここでエステル基の例としては上記したポリペプチド の場合と同様である。 該部分ペプチドが C末端以外にカルボキシル基または力 ルポキシレートを有している場合、 それらの基がアミド化またはエステル化さ れているものも本発明の部分ペプチドに含まれる。 この時のエステルとしては
、 例えば、 上記した C末端のエステルなどが用いられる。
本発明のポリペプチドまたはその部分ペプチドは、 さらに、 機能あるいは性 質がよく知られているタンパク質との融合タンパク質であってもよい。
本発明のポリペプチドの部分ペプチドの塩としては、 前述のポリペプチドの 塩と同様のものが用いられる。 本発明のポリぺプチドの部分べプチドもしくはそのアミドもしくはそのエス テルまたはその塩は、 上記した本発明のポリペプチドの場合と同様の合成法に 従って、 あるいは本発明のポリぺプチドを適当なぺプチダーゼで切断すること によって製造することができる。
本発明のポリペプチドをコードする DNAとしては、 配列番号： 7で表され るアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリべ プチドをコードする DN Aを含有する DN Aであればいかなるものであっても よい。 また、 ゲノム DNA、 ゲノム DNAライブラリ一、 前記した組織 '細胞 由来の c DNA、 前記した組織 ·細胞由来の c DNAライブラリー、 合成 DN Aのいずれでもよい。 ライブラリ一に使用するべクタ一はバクテリオファ一ジ 、 プラスミド、 コスミド、 ファージミドなどいずれであってもよい。 また、 前 記した組織 · 細胞より RN A画分を調製したものを用いて直接 Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (以下、 R T- P C R法と略称する) によって増幅することもできる。
ここで、 配列番号： 7で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一 のアミノ酸配列を含有するポリペプチドとしては、 上述のとおり、 配列番号： 8または配列番号： 2 1で表されるアミノ酸配列などがあげられるが、 配列番 号： 8で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードする DNAを 含有する DNAとしては、 例えば、 配列番号： 27で表される塩基配列を有す る DN Aを含有する DN Aなどがあげられ、 配列番号： 2 1で表されるァミノ 酸配列を含有するポリペプチドをコードする DN Aを含有する DN Aとしては 、 例えば、 配列番号： 28で表される塩基配列を有する DNAを含有する DN Aなどがあげられる。
配列番号： 7で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有 するポリペプチドをコードする DNAを含有する DNAとしては、 例えば、 配 列番号： 27または配列番号： 28で表される塩基配列と約 80%以上、 好ま しくは約 9 0 %以上、 さらに好ましくは約 9 5 %以上、 より好ましくは約 9 8 %以上の相同性を有する塩基配列を有する D N Aを含有する D N Aなどがあげ られる。
また、 配列番号： 7で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列 を含有するポリペプチドをコードする D N Aを含有する D N Aとしては、 例え ば、 ①配列番号： 2 7または配列番号： 2 8で表される塩基配列中の 1または 2個以上 （好ましくは 1〜3 0個程度、 好ましくは、 1〜 1 0個程度、 さらに 好ましくは （1または 2個） ） の塩基が欠失した塩基配列、 ②配列番号： 2 7 または配列番号： 2 8で表される塩基配列中の 1または 2個以上 （好ましくは 1〜3 0個程度、 好ましくは、 1〜 1 0個程度、 さらに好ましくは （1または 2個） ) の塩基が付加した塩基配列、 ③配列番号： 2 7または配列番号： 2 8 で表される塩基配列中の 1または 2個以上 （好ましくは 1〜 3 0個程度、 好ま しくは、 1〜 1 0個程度、 さらに好ましくは （1または 2個） ） の塩基が揷入 された塩基酸配列、 ④配列番号： 2 7または配列番号： 2 8で表される塩基配 列中の 1または 2個以上 （好ましくは 1〜3 0個程度、 好ましくは、 1〜 1 0 個程度、 さらに好ましくは （1または 2個） ） の塩基が他の塩基で置換された ァミノ酸配列、 または⑤それらを組み合わせた塩基配列を有する D N Aを含有 する D N Aなども含まれる。 より具体的には、 （1)ストリンジェン卜な条件下 で配列番号： 7で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ 酸配列を含有するレセプ夕一蛋白質に対する結合能を有する D N Aを含有する D N Aの有する配列とハイブリダィズする哺乳動物由来の D N A、 （2)遺伝コー ドの縮重のため配列番号： 7で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に 同一のアミノ酸配列を含有するレセプ夕一タンパク質に対する結合能を有する D N Aを含有する D N Aの有する配列および（1)に定められている配列とハイ ブリツド形成しない力 同一アミノ酸配列をもつポリペプチドをコードする D N Aなどが用いられる。 ハイブリダィゼーシヨンは、 自体公知の方法あるいは それに準じた方法に従って行うことができる。 上記ス卜リンジェントな条件と しては、 例えば 42°C、 50%ホルムアミド、 4 X S S P E ( 1 X S S P E = 150mM NaCl, lOmM NaH9P04-H20, ImM EDTA pH7.4) 5 Xデンハート溶液、 0. 1 %SDSである。
配列番号： 7で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ 酸配列を含有する夕ンパク質をコードする DNAを含有する D N Aの有する配 列とハイブリダィズする DNAとしては、 例えば、 配列番号： 27または配列 番号： 28で表される塩基配列と約 70 %以上、 好ましくは約 80%以上、 さ らに好ましくは約 90%以上、 最も好ましくは約 95%以上の相同性を有する 塩基配列を含有する DNAなどが用いられる。
また、 本発明の①配列番号： 7で表されるアミノ酸配列、 ②配列番号： 8で 表されるアミノ酸配列、 ③配列番号： 2 1で表されるアミノ酸配列などを含有 するポリペプチドをコードする DNAの部分塩基配列を含有する DNA断片は DN A検出プローブとしても好ましく用いられる。
本発明のポリペプチドをコードする DNAは以下の遺伝子工学的手法によつ ても製造することができる。
本発明のポリペプチドを完全にコードする DN Aのクローニングの手段とし ては、 本発明のポリペプチドの部分塩基配列を有する合成 DNAプライマーを 用いて自体公知の PC R法によって前記 DN Aライブラリ一等から目的とする DNAを増幅するか、 または適当なベクターに組み込んだ DNAを例えば本発 明のポリペプチドの一部あるいは全領域を有する DN A断片もしくは合成 DN Aを用いて標識したものとのハイブリダィゼ一シヨンによって選別することが できる。ハイブリダィゼ一ションの方法は、例えば Mo 1 ecu 1 ar C 1 on i ng ( 2 nd ed. ； J. Sambrook et al. , Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) に記載の方法 などに従って行われる。 また、 市販のライブラリーを使用する場合、 添付の使 用説明書に記載の方法に従って行う。 クローン化された本発明のポリペプチドをコ一ドする DN Aは目的によりそ のまま、 または所望により制限酵素で消化したり、 リンカ一を付加したりして 使用することができる。 該 DN Aはその 5 ' 末端側に翻訳開始コドンとしての ATGを有し、 また 3' 末端側には翻訳終止コドンとしての TAA、 TGAま たは TAGを有していてもよい。 これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは 、 適当な合成 DNAアダプタ一を用いて付加することもできる。
本発明のポリペプチドの発現べクタ一は、 例えば、 （ィ） 本発明のポリぺプ チドをコードする DNAから目的とする DNA断片を切り出し、 （口） 該 DN A断片を適当な発現べクタ一中のプロモーターの下流に連結することにより製 造することができる。
ベクタ一としては、 大腸菌由来のプラスミド （例、 pBR 322， p BR 3 25， pUC 1 2, pUC 13) 、 枯草菌由来のプラスミド （例、 pUB 1 1 0， TP 5, p C 1 94) 、 酵母由来プラスミド （例、 p SH 19, pSH 1 5) 、 λファージなどのパクテリオファージ、 レトロウイルス， ワクシニア ウィルス， バキュロウィルスなどの動物ウィルスなどが用いられる。
本発明で用いられるプロモーターとしては、 遺伝子の発現に用いる宿主に対 応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。
形質転換する際の宿主が動物細胞である場合には、 SV40由来のプロモー 夕一、 レトロウイルスのプロモー夕一、 メタ口チォネインプロモーター、 ヒー トショックプロモーター、 サイトメガロウィルスプロモーター、 SRo;プロモ 一夕一などが利用できる。 宿主がェシエリヒア属菌である場合は、 t r pプロ モー夕一、 T 7プロモー夕一、 l a cプロモー夕一、 r e cAプロモータ一、 λ PLプロモータ一、 1 p pプロモーターなどが、 宿主がバチルス属菌である 場合は、 SPO lプロモ一夕一、 SPO 2プロモーター、 p e nPプロモー夕 —など、 宿主が酵母である場合は、 PHO 5プロモーター、 PGKプロモー夕 ―、 GAPプロモーター、 ADH 1プロモー夕一、 GALプロモー夕一などが 好ましい。 宿主が昆虫細胞である場合は、 ボリヘドリンプロモータ一、 P 10 プロモー夕一などが好ましい。
発現ベクターには、 以上の他に、 所望によりェンハンサー、 スプライシング シグナル、 ポリ A付加シグナル、 選択マーカー、 SV40複製オリジン （以下 、 S V40 o r iと略称する場合がある） などを含有しているものを用いるこ とができる。 選択マーカーとしては、 例えば、 ジヒドロ葉酸還元酵素 （以下、 d h f rと略称する場合がある） 遺伝子 〔メソトレキセ一卜 （MTX) 耐性〕 、 アンピシリン耐性遺伝子 （以下、 Amp 1 "と略称する場合がある） 、 ネオマ イシン耐性遺伝子 （以下、 Ne oと略称する場合がある、 G418耐性） 等が あげられる。 特に、 CHO (dh f r— ) 細胞を用いて DHF R遺伝子を選択 マーカ一として使用する場合、 チミジンを含まない培地によっても選択できる また、 必要に応じて、 宿主に合ったシグナル配列を、 ポリペプチドまたはそ の部分ペプチドの N端末側に付加する。 宿主がェシエリヒア属菌である場合は 、 ρΙιοΑ·シグナル配列、 Ο即 A · シグナル配列などが、 宿主がバチルス属菌で ある場合は、 α—アミラーゼ，シグナル配列、 サブチリシン · シグナル配列な どが、 宿主が酵母である場合は、 メイティングファクタ一ひ（MF α) ·シグナ ル配列、 インベル夕一ゼ ·シグナル配列など、 宿主が動物細胞である場合には 、 例えばインシュリン ·シグナル配列、 ο;—インターフェロン ·シグナル配列 、 抗体分子，シグナル配列などがそれぞれ利用できる。
このようにして構築されたポリペプチドをコードする DNAを含有するべク 夕一を用いて、 形質転換体を製造することができる。
宿主としては、 たとえばェシエリヒア属菌、 バチルス属菌、 酵母、 昆虫また は昆虫細胞、 動物細胞などが用いられる。
ェシエリヒア属菌としては、 ェシエリヒア ·コリ （Escherichia coli) K 1 2 · DH 1 〔プロシ一ジングズ ·ォブ ·ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ · サイェンシィズ.ォブ.ザ .ユーエスェ一 （Proc. Natl. Acad. Sci. USA) ， 60巻， 160 (1 968)〕 ， J M 1 03 〔ヌクイレック 'ァシッズ ' リサ ーチ， （Nucleic Acids Research) ， 9巻， 309 (1 98 1)〕 ， J A22 1 〔ジャーナル.ォブ.モレキュラー.バイォロジ一（journal of Molecular Biology ) 〕 ， 120卷， 5 1 7 (1 978)〕 ， HB 10 1 〔ジャーナル ·ォブ ·モレ キユラ一 'バイオロジー， 41卷， 459 (1 969)〕 ， C 600 〔ジエネテ イツクス （Genetics) ， 39卷， 440 (1954)〕 などが用いられる。
バチルス属菌としては、 たとえばバチルス，サチルス （Bacillus subtilis) M I 1 14 〔ジーン， 24巻， 255 (1 983)〕 ， 207 - 2 1 〔ジャーナ ル 'ォブ 'バイオケミストリー （Journal of Biochemistry) ， 95巻， 87 ( 1984)] などが用いられる。
酵母としては、 たとえばサッカロマイセス セレピシェ （Saccharomyces cerevisiae) AH22, AH 22 R ， NA87 - 1 1 A, DKD— 5D， 20 B- 12などが用いられる。
昆虫としては、 例えばカイコの幼虫などが用いられる 〔前田ら、 ネィチヤ一 (Nature) , 3 15巻， 592 (1985)〕 。
昆虫細胞としては、 例えば、 ウィルスが Ac NPVの場合は、 夜盗蛾の幼虫 由来株化細胞 (Spodoptera frugiperda cell ； S f細胞) 、 Trichoplusia niの
ΤΜ
中腸由来の MG 1細胞、 Trichoplusianiの卵由来の HighFive 細胞、 Mamestra brassicae由来の細胞または Estigmena acrea由来の細胞などが用いられる。 ゥ ィルスが BmNP Vの場合は、 蚕由来株化細胞 （Bombyx mori N； BmN細胞） などが用いられる。 該 S f細胞としては、 例えば、 S f 9細胞 （ATCC CRL1711 ) 、 S f 2 1細胞 〔以上、 Vaughn, J.L ら、 イン 'ヴィ トロ （in Vitro) ， 1 3卷， 2 13— 2 17頁 （ 1 977年） 〕 などが用いられる。
動物細胞としては、 たとえばサル COS— 7細胞， Vero細胞， チャイニーズ ハムスター細胞 CH〇， DHFR遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞 CH 〇 （dh f r—CHO細胞） ， マウス L細胞， マウス 3T3細胞、 マウスミエ口 一マ細胞， ヒ卜 HEK293細胞、 ヒト FL細胞、 293細胞、 C 127細胞 、 BALB 3T3細胞、 S p— 2ZO細胞などが用いられる。
ェシエリヒア属菌を形質転換するには、 たとえばプロシ一ジングズ .ォブ · ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェンジィズ ·ォブ ·ザ ·ュ一エスェ 一 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA) ， 69巻， 2 1 10 (1 972)やジーン (Gene) , 17巻， 107 ( 1982)などに記載の方法に従って行なわれる。 バチルス属菌を形質転換するには、 たとえばモレキュラー ·アンド ·ジエネ ラル ·ジエネティックス （Molecular & General Genetics) ， 168卷， 1 1 1 ( 1979)などに記載の方法に従って行われる。
酵母を形質転換するには、 たとえばプロシージングズ ·ォブ ·ザ ·ナショナ ル'アカデミー'ォブ ·サイェンシィズ ·ォブ ·ザ'ュ一エスエー （Proc. Natl. Acad. Sci. USA) , 75巻， 1929 ( 1978)に記載の方法に従って行な われる。
昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、 たとえばバイオ Zテクノロジー （ Bio/Technology) , 6巻， 47— 55頁 （1988年） などに記載の方法に従つ て行なわれる。
動物細胞を形質転換するには、 たとえばヴイロロジー （Virology) , 52巻 , 456 (1973)に記載の方法に従って行なわれる。
発現べクタ一の細胞への導入方法としては、 例えば、 リポフエクシヨン法 〔 Feigner, P. L. et al. プロシージングズ ·ォブ 'ザ 'ナショナル 'アカデミー •ォブ 'サイェンジィズ 'ォブ ·ザ'ユーエスエー（Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America) ， 84巻， 7413 頁 （1 987年） 〕 、 リン酸カルシウム法 [Graham, F. L. and van der Eb, A. J.ヴィロロジ一 （Virology) ， 52巻， 456— 467頁 （1 973年） 〕 、 電気穿孔法 〔Nuemann, E. et al. ェンボ ·ジャーナル （EMBO J. ) ， 1巻， 8 L 5
4 1— 8 4 5頁 （1 9 8 2年） 〕 等があげられる。
このようにして、 本発明のポリペプチドをコードする D N Aを含有する発現 ベク夕一で形質転換された形質転換体が得られる。
なお、 動物細胞を用いて、 本発明のポリペプチドを安定に発現させる方法と しては、 上記の動物細胞に導入された発現ベクターが染色体に組み込まれた細 胞をクローン選択によって選択する方法がある。 具体的には、 上記の選択マー カーを指標にして形質転換体を選択する。 さらに、 このように選択マーカーを 用いて得られた動物細胞に対して、 繰り返しクローン選択を行なうことにより 本発明のポリぺプチドの高発現能を有する安定な動物細胞株を得ることができ る。 また、 d h f r遺伝子を選択マ一カーとして用いた場合、 M T X濃度を徐 々に上げて培養し、 耐性株を選択することにより、 d h f r遺伝子とともに、 本発明のポリペプチドまたはその部分ペプチド等をコードする D N Aを細胞内 で増幅させて、 さらに高発現の動物細胞株を得ることもできる。
上記の形質転換体を本発明のポリペプチドをコードする D N Aが発現可能な 条件下で培養し、 本発明のポリペプチドを生成、 蓄積せしめることによって、 本発明のポリぺプチドを製造することができる。
宿主がェシエリヒア属菌、 バチルス属菌である形質転換体を培養する際、 培 養に使用される培地としては液体培地が適当であり、 その中には該形質転換体 の生育に必要な炭素源、 窒素源、 無機物その他が含有せしめられる。 炭素源と しては、 たとえばグルコース、 デキストリン、 可溶性澱粉、 ショ糖など、 窒素 源としては、 たとえばアンモニゥム塩類、 硝酸塩類、 コーンスチ一プ， リカー 、 ペプトン、 カゼイン、 肉エキス、 大豆粕、 バレイショ抽出液などの無機また は有機物質、 無機物としてはたとえば塩化カルシウム、 リン酸二水素ナトリウ ム、 塩化マグネシウムなどがあげられる。 また、 酵母、 ビタミン類、 生長促進 因子などを添加してもよい。 培地の p Hは約 5〜8が望ましい。
ェシエリヒア属菌を培養する際の培地としては、 例えばグルコース、 カザミ ノ酸を含む M 9培地 〔ミラ一 （Miller) ， ジャーナル 'ォブ'ェクスペリメン ッ 'イン 'モレキュラ一 · ジエネティックス (Journal of Experiments in Molecular Genetics) ， 43 1—433， Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972〕 が好ましい。 ここに必要によりプロモーターを効率よく働かせ るために、 たとえば 3 /3—インドリルアクリル酸のような薬剤を加えることが できる。
宿主がェシエリヒア属菌の場合、 培養は通常約 1 5〜43°Cで約 3〜24時 間行い、 必要により、 通気や撹拌を加えることもできる。
宿主がバチルス属菌の場合、 培養は通常約 30〜 40 °Cで約 6〜 24時間行 ない、 必要により通気や撹拌を加えることもできる。
宿主が酵母である形質転換体を培養する際、 培地としては、 たとえばバーク ホールダー （Burkholder) 最小培地 〔Bostian, K. L. ら、 「プロシ一ジングズ •ォブ ·ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェンシィズ ·ォブ ·ザ ·ュ —エスエー （Proc. Natl. Acad. Sci. USA) ， 77巻， 4505 (1980) 〕 や 0. 5%カザミノ酸を含有する SD培地 〔Bitter, G. A. ら、 「プロシージ ングズ ·ォブ ·ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェンシィズ ·ォブ · ザ 'ュ一エスエー （Pro Natl. Acad. Sci. USA) , 8 1巻， 5330 (1 984) 〕 があげられる。 培地の ρΗは約 5〜 8に調整するのが好ましい。 培 養は通常約 20ΐ：〜 35°Cで約 24〜72時間行い、 必要に応じて通気や撹拌 を加える。
宿主が昆虫細胞である形質転換体を培養する際、 培地としては、 Grace's Insect Medium (Grace. T. C. C. ,ネイチヤー (Nature) , 195, 788(1962)) に非動 化した 10 %ゥシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。 培地の ρΗは約 6. 2〜6. 4に調整するのが好ましい。 培養は通常約 27 °Cで約 3 〜5日間行い、 必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、 培地としては、 たとえば約 5〜20 %の胎児牛血清を含む MEM培地 〔サイエンス （Science) ， 122巻 ， 50 1 ( 1 952)〕 ， DMEM培地 〔ヴイロロジー OHrology) , 8巻， 3 96 (1959)〕 ， RP M l 1640培地 〔ジャーナル ·ォブ ·ザ ·アメリカ ン ·メティカ レ 'アソシエーション (The Journal of the American Medical Association) 199巻， 5 19 (1967)〕 ， 199培地 〔プロシ一ジング' ォブ 'ザ'ソサイエティ ·フォ一 'ザ'バイオロジカル ·メディスン（Proceeding of the Society for the Biological Medicine) ， 73巻， 1 (1 950)〕 な どが用いられる。 pHは約 6〜8であるのが好ましい。 培養は通常約 30で〜 40°Cで約 1 5〜60時間行い、 必要に応じて通気や撹拌を加える。
特に CH〇 (dhfr-) 細胞および dhfr遺伝子を選択マ一カーとして用いる場 合には、 チミジンをほとんど含まない透析ゥシ胎児血清を含む D M E M培地を 用いるのが好ましい。
上記培養物から本発明のポリペプチドを分離精製するには、 例えば下記の方 法により行なうことができる。
本発明のポリペプチドを培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、 培 養後、 公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、 これを適当な緩衝液に懸濁し、 超音波、 リゾチームおよび Zまたは凍結融解などによって菌体あるいは細胞を 破壊したのち、 遠心分離やろ過によりポリペプチドの粗抽出液を得る方法など が適宜用い得る。 緩衝液の中に尿素や塩酸グァニジンなどの夕ンパク変性剤や 、 トリトン X— 100 (登録商標。 以下、 TMと省略することがある。 ） など の界面活性剤が含まれていてもよい。
培養液中にポリペプチドが分泌される場合には、 培養終了後、 自体公知の方 法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、 上清を集める。
このようにして得られた培養上清、 あるいは抽出液中に含まれる本発明のポ リペプチドの精製は、 自体公知の分離 ·精製法を適切に組み合わせて行なうこ とができる。 これらの公知の分離、 精製法としては、 塩析ゃ溶媒沈澱法などの 溶解度を利用する方法、 透析法、 限外ろ過法、 ゲルろ過法、 および S D S—ポ リアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、 イオン交換ク口マトグラフィ一などの荷電の差を利用する方法、 ァフィ二ティ 一クロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、 逆相高速液体クロ マトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、 等電点電気泳動法やクロマ トフオーカシングなどの等電点の差を利用する方法などが用いられる。
かくして得られる本発明のポリペプチドが遊離体で得られた場合には、 自体 公知の方法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、 逆に 塩で得られた場合には自体公知の方法あるいはそれに準じる方法により、 遊離 体または他の塩に変換することができる。
なお、 組換え体が産生する本発明のポリペプチドを、 精製前または精製後に 適当な蛋白修飾酵素を作用させることにより、 任意に修飾を加えたり、 ポリべ プチドを部分的に除去することもできる。 蛋白修飾酵素としては、 例えば、 ト リプシン、 キモトリブシン、 アルギニルエンドべプチダーゼ、 プロテインキナ ーゼ、 グリコシダ一ゼなどが用いられる。
かくして生成する本発明のポリペプチドの存在は特異抗体を用いたェンザィ ムィムノアッセィなどにより測定することができる。
本発明のポリペプチドをコ一ドする D N Aまたは本発明のポリペプチドは、 ①本発明のポリぺプチドの有する生理作用の探索、 ②合成オリゴヌクレオチド プローブあるいは P C Rのプライマーの作成、 ③ S E N Rのリガンドゃ前駆体 タンパク質をコードする D NAの入手、 ④組換え型レセプ夕一タンパク質の発 現系を用いたレセプ夕ー結合ァッセィ系の開発と医薬品候補化合物のスクリ一 ニング、 ⑤抗体および抗血清の入手、 ⑥ D NA、 R N A、 抗体または抗血清を 用いた診断薬の開発、 ⑦中枢神経機能調節剤、 循環機能調節剤、 心臓機能調節 剤、 腎臓機能調節剤、 泌尿器機能調節剤、 感覚器官機能調節剤などの医薬の開 発、 ⑧遺伝子治療等に用いることができる。 特に、 後述の組換え型 S E N Rの発現系を用いたレセプ夕一結合アツセィ系 によって、 ヒトなどの温血動物に特異的な S E N Rァゴニストまたはアン夕ゴ 二ストをスクリーニングすることができ、 該ァゴ二ストまたはアン夕ゴニスト を各種疾病の予防 ·治療剤などとして使用することができる。
さらに、 上記⑦に関し、 本発明のポリペプチドまたはそれをコードする D N Aは中枢神経系、 循環器系、 心臓、 腎臓、 泌尿器系または感覚器官系などで発 現している S E N Rがリガンドとして認識するものであるので、 安全で低毒性 な医薬として有用である。 本発明のポリペプチドまたはそれをコードする D N Aは中枢神経機能調節作用、 循環機能調節作用、 心臓機能調節作用、 腎臓機能 調節作用、 泌尿器機能調節作用あるいは感覚器官調節作用などに関与している ことから、 たとえば老人性痴呆、 脳血管性痴呆、 系統変成型の退行変成疾患 （ 例：アルツハイマー病、 パーキンソン病、 ピック病、 ハンチントン病など） に 起因する痴呆、 高 （低） 血圧症、 腎疾患 （例：慢性腎不全、 腎炎など） 、 心疾 患 （例：心不全、 急性心筋梗塞など） 、 頻尿、 尿失禁、 難聴、 嗅覚異常、 視覚 異常などの疾病の治療 ·予防剤として用いることができる。
本発明のポリペプチドまたはそれをコ一ドする D NAを上述の医薬として使 用する場合、 常套手段に従って製剤化することができる。 例えば、 必要に応じ て糖衣や腸溶性被膜を施した錠剤、 カプセル剤、 エリキシル剤、 マイクロカブ セル剤などとして経口的に、 あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得 る液との無菌性溶液、 または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用でき る。 例えば、 該化合物またはその塩を生理学的に認められる担体、 香味剤、 賦 形剤、 べヒクル、 防腐剤、 安定剤、 結合剤などとともに一般に認められた製薬 実施に要求される単位用量形態で混和することによつて製造することができる 。 これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な用量が得られるよ うにするものである。
本発明の D N Aを用いる場合は、 該 D N Aを単独またはレトロウイルスべク ター、 アデノウイルスベクタ一、 アデノウイルスァソシエーテッドウィルスべ クタ一などの適当なベクタ一に挿入した後、 常套手段に従がつて実施すること ができる。
錠剤、 カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、 例えばゼラ チン、 コーンスターチ、 トラガントガム、 アラビアゴムのような結合剤、 結晶 性セルロースのような賦形剤、 コーンスターチ、 ゼラチン、 アルギン酸などの ような膨化剤、 ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、 ショ糖、 乳糖また はサッカリンのような甘味剤、 ペパーミント、 ァカモノ油またはチェリ一のよ うな香味剤などが用いられる。 調剤単位形態がカプセルである場合には、 前記 タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。 注射の ための無菌組成物は注射用水のようなべヒクル中の活性物質、 胡麻油、 椰子油 などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実 施にしたがって処方することができる。
注射用の水性液としては、 例えば、 生理食塩水、 ブドウ糖やその他の補助薬 を含む等張液 （例えば、 D—ソルビトール、 D—マンニトール、 塩化ナトリウ ムなど） などがあげられ、 適当な溶解補助剤、 たとえばアルコール （たとえば エタノール） 、 ポリアルコール （たとえばプロピレングリコール、 ボリエチレ ングリコール） 、 非イオン性界面活性剤 （たとえばポリソルべ一ト 8 0 (™) 、 H C O - 5 0 ) などと併用してもよい。 油性液としてはゴマ油、 大豆油など があげられ、 溶解補助剤として安息香酸ベンジル、 ベンジルアルコールなどと 併用してもよい。
また、 緩衝剤 （例えば、 リン酸塩緩衝液、 酢酸ナトリウム緩衝液） 、 無痛化 剤 （例えば、 塩化ベンザルコニゥム、 塩酸プロ力インなど） 、 安定剤 （例えば 、 ヒト血清アルブミン、 ポリエチレングリコ一ルなど） 、 保存剤 （例えば、 ベ ンジルアルコール、 フエノールなど） 、 酸化防止剤などと配合してもよい。 調 製された注射液は通常、 適当なアンプルに充填される。 このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、 例えばヒトゃ哺乳 動物 （例えば、 マウス、 ラッ卜、 モルモット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） に対して投与することができる。
本発明のポリペプチドまたはそれをコードする D N Aの投与量は、 症状など により差異はあるが、 経口投与の場合、 一般的に成人の心不全患者 （体重 60 k gとして） においては、 一日につき約 0. 1から 100mg、 好ましくは約 1 . 0から 50mg、 より好ましくは約 1. 0から 20mgである。 非経口的に 投与する場合は、 その 1回投与量は投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法など によっても異なるが、 たとえば注射剤の形では成人の心不全患者 （体重 6 O k gとして） への投与においては、 一日につき約 0. 0 1から 30：11 程度、 好 ましくは約 0. 1から 2 Omg程度、 より好ましくは約 0. 1から 10mg程 度を静脈注射により投与するのが好都合である。 他の動物の場合も、 60 kg 当たりに換算した量を投与することができる。
本発明のポリぺプチドの前駆体夕ンパク質またはその塩、 その製造法および 用途を以下にさらに詳細に説明する。
本発明のポリペプチドの前駆体タンパク質またはその塩 （以下、 本発明の前 駆体タンパク質と称する場合がある） としては、 例えば、 前記した本発明の夕 ンパク質の N末端または （および） C末端に 1個または 2個以上、 好ましくは 1〜200個程度、 より好ましくは 1〜120個程度、 さらに好ましくは 50 〜120個程度のアミノ酸が結合したタンパク質またはその塩である。
具体的には、 本発明の前駆体タンパク質は、 配列番号： 1 8、 配列番号： 1 9または配列番号： 29で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一 のァミノ酸配列を有するタンパク質などが用いられる。
また、 本発明の前駆体タンパク質は、 ヒトゃ温血動物 （例えば、 モルモット 、 ラット、 マウス、 ブ夕、 ヒッジ、 ゥシ、 サルなど） のあらゆる組織 （たとえ ば、 下垂体、 腾臓、 脳、 腎臓、 肝臓、 生殖腺、 甲状腺、 胆のう、 骨髄、 副腎、 皮膚、 筋肉、 肺、 消化管、 血管、 心臓など） または細胞などに由来するタンパ ク質であって、 配列番号： 18、 配列番号： 1 9または配列番号： 29で表さ れるァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタン パク質であれば如何なるものであってもよい。 実質的に同質の活性としては、 例えばレセプ夕一結合活性、 シグナル伝達活性などがあげられる。 実質的に同 質とは、 レセプ夕一結合活性などが性質的に同質であることを示す。 したがつ て、 レセプ夕一結合活性の強さなどの強弱、 タンパク質の分子量などの量的要 素は異なっていてもよい。
配列番号： 18、 配列番号： 19または配列番号： 29で表されるアミノ酸 配列と実質的に同一のアミノ酸配列として具体的には、 配列番号： 18、 配列 番号： 1 9または配列番号： 29で表されるアミノ酸配列と約 50%以上、 好 ましくは約 60%以上、 さらに好ましくは約 70%以上、 より好ましくは約 8 0%以上、 特に好ましくは約 90%以上、 最も好ましくは約 95%以上の相同 性を有するアミノ酸配列を示す。
また、 本発明の前駆体タンパク質としては、 例えば、 ①配列番号： 18、 配 列番号： 1 9または配列番号： 29で表されるアミノ酸配列中の 1または 2個 以上 （好ましくは 1〜30個程度、 好ましくは、 1〜10個程度、 さらに好ま しくは （1または 2個） ） のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、 ②配列番号： 18、 配列番号： 19または配列番号： 29で表されるアミノ酸配列中の 1ま たは 2個以上 （好ましくは 1〜30個程度、 好ましくは、 1〜10個程度、 さ らに好ましくは （1または 2個） ） のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、 ③配 列番号： 18、 配列番号： 1 9または配列番号： 29で表されるアミノ酸配列 中の 1または 2個以上 （好ましくは 1〜30個程度、 好ましくは、 1〜： L 0個 程度、 さらに好ましくは （1または 2個） ） のアミノ酸が挿入されたアミノ酸 配列、 ④配列番号： 18、 配列番号： 1 9または配列番号： 29で表されるァ ミノ酸配列中の 1または 2個以上 （好ましくは 1〜30個程度、 好ましくは、 1〜 1 0個程度、 さらに好ましくは （1または 2個） ） のアミノ酸が他のアミ ノ酸で置換されたァミノ酸配列、 または⑤それらを組み合わせたァミノ酸配列 を含有するタンパク質なども含まれる。
配列番号： 8で表されるアミノ酸配列を含有する本発明のポリペプチドの前 駆体タンパク質として、 具体的には、 配列番号： 1 8または配列番号： 1 9で 表されるァミノ酸配列を含有する夕ンパク質などがあげられ、
配列番号： 2 1で表されるアミノ酸配列を含有する本発明のポリペプチドの 前駆体タンパク質として、 具体的には、 配列番号： 2 9で表されるアミノ酸配 列を含有する夕ンパク質などがあげられる。
本明細書における前駆体タンパク質はべプチド標記の慣例に従って左端が N 末端 （ァミノ末端） 、 右端が C末端 （カルボキシル末端） である。 例えば、 配 列番号： 1 8、 配列番号： 1 9または配列番号： 2 9で表されるアミノ酸配列 で表されるアミノ酸配列などを含有する本発明の前駆体タンパク質は C末端が 通常カルボキシル基 （- C00H)またはカルボキシレート（-C00— )であるが、 C末 端がアミド （-C0NH2)またはエステル（-C00R)であってもよい。 エステルの尺と しては、 例えばメチル、 ェチル、 n —プロピル、 イソプロピルもしくは n—ブ チルなどの C卜6アルキル基、 シクロペンチル、 シクロへキシルなどの C 3 _ 8シ クロアルキル基、 フエニル、 《—ナフチルなどの C 6 _ 1 27リール基、 ベンジル 、 フエネチル、 ベンズヒドリルなどのフエ二ルー — 2アルキル、 もしくは a— ナフチルメチルなどの a—ナフチル— C i _ 2アルキルなどの C 7— 1 4ァラルキル あげられる。
本発明の前駆体タンパク質の塩としては、 例えば、 上記の本発明のポリぺプ チドの塩として例示したものと同様のものなどがあげられる。
本発明の前駆体タンパク質は、 上述の本発明のポリペプチドの製造法に準じ て、 ヒトゃ温血動物の組織または細胞からタンパク質を精製する方法によって 製造することもできるし、 タンパク質合成法に準じて製造することもできる。 また、 上述の本発明のポリペプチドの製造法に準じて、 本発明の前駆体タンパ ク質をコードする D N Aを含有する形質転換体を培養することによつても製造 することができる。
ヒトゃ温血動物の組織または細胞から製造する場合、 ヒトゃ温血動物の組織 または細胞をホモジナイズした後、 酸、 有機溶媒などで抽出を行い、 該抽出液 を、 塩析、 透析、 ゲル濾過、 逆相クロマトグラフィー、 イオン交換クロマトグ ラフィ一、 ァフィ二ティークロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを組 み合わせることにより精製単離することができる。
本発明の前駆体タンパク質のアミド体は、 アミド形成に適した市販のぺプチ ド合成用樹脂を用いることができる。 そのような樹脂としては例えば、 上記の ペプチド合成用樹脂などが用いられる。 このような樹脂を用い、 α _アミノ基 と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、 目的とするペプチドの配列通りに 、 自体公知の各種縮合方法に従い、 樹脂上で縮合させる。 反応の最後に樹脂か らペプチドを切り出すと同時に各種保護基を除去し、 必要に応じて高希釈溶液 中で分子内ジスルフィ ド結合形成反応を実施し、 目的の本発明の前駆体タンパ ク質を取得する。
本発明の前駆体タンパク質としては、 上記した配列番号： 1 8、 配列番号： 1 9または配列番号： 2 9で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同 —のアミノ酸配列を含有し、 該本発明のポリペプチド質と同様の作用、 例えば 中枢神経機能調節作用、 循環機能調節作用、 心臓機能調節作用、 腎臓機能調節 作用、 泌尿器機能調節作用または感覚器官機能調節作用などを前駆体夕ンパク 質自身が有しているものであってもよい。
本発明の前駆体タンパク質はさらに該前駆体タンパク質に対する抗体の調製 のための抗原として用いることができる。 このような抗原としてのタンパク質 は上記した本発明の前駆体タンパク質の他に、 上記本発明の前駆体タンパク質 WO 00/32627 „「 PCT/JP99扁 49
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の N末端ペプチド、 C末端ペプチド、 中央部分のペプチドなどの部分ペプチド などが用いられる。
部分べプチドとしては、 個々のドメインを個別に含むぺプチドも用い得るが 、 複数のドメインを同時に含む部分のペプチドでも良い。
本発明の前駆体タンパク質の部分ペプチドの塩としては、 前述の前駆体タン パク質の塩と同様のものが用いられる。
本発明の前駆体タンパク質の部分ペプチドまたはそのアミド、 エステルもし くはその塩は、 上記した前駆体タンパク質の場合と同様の合成法に従って、 あ るいは本発明の前駆体タンパク質を適当なぺプチダーゼで切断することによつ て製造することができる。
本発明の前駆体タンパク質をコードする DNAとしては、 配列番号： 18、 配列番号： 19または配列番号： 29で表されるアミノ酸配列と同一もしくは 実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードする DNAを含有 する DNAであればいかなるものであってもよい。 また、 ゲノム DNA、 ゲノ ム DNAライブラリー、 前記した組織 ·細胞由来の c DNA、 前記した組織- 細胞由来の c DNAライブラリー、 合成 DNAのいずれでもよい。 ライブラリ —に使用するべクタ一はバクテリオファージ、 プラスミド、 コスミド、 ファー ジミドなどいずれであってもよい。 また、 前記した組織 ·細胞より RNA画分 を調製したものを用レ て直接 Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (以下、 R T-P C R法と略称する）によって増幅することもできる。 ここで、 配列番号： 18、 配列番号： 19または配列番号： 29で表される アミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク 質をコードする DNAを含有する DNAとしては、 例えば、 配列番号： 15、 配列番号： 16、 配列番号： 17または配列番号： 30で表される塩基配列を 有する DNAを含有する DNAなどがあげられる他、 配列番号： 15、 配列番 号： 16、 配列番号： 17または配列番号： 30で表される塩基配列と約 50 3 D
%以上、 好ましくは約 60%以上、 さらに好ましくは約 70 %以上、 より好ま しくは約 80%以上、 特に好ましくは約 90%以上、 最も好ましくは約 95% 以上の相同性を有する塩基配列を有する DN Aを含有する DN Aなどがあげら れる。
また、 配列番号： 18、 配列番号： 1 9または配列番号： 29で表されるァ ミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質 をコードする DNAを含有する DNAとしては、 例えば、 ①配列番号： 15、 配列番号： 1 6、 配列番号： 1 7または配列番号： 30で表される塩基配列中 の 1または 2個以上 （好ましくは 1〜 30個程度、 好ましくは、 1〜 10個程 度、 さらに好ましくは （1または 2個） ） の塩基が欠失した塩基配列、 ②配列 番号： 1 5、 配列番号： 16、 配列番号： 1 7または配列番号： 30で表され る塩基配列中の 1または 2個以上 （好ましくは 1〜 30個程度、 好ましくは、 1〜10個程度、 さらに好ましくは （1または 2個） ） の塩基が付加した塩基 配列、 ③配列番号： 1 5、 配列番号： 1 6、 配列番号： 1 7または配列番号： 30で表される塩基配列中の 1または 2偭以上 （好ましくは 1〜30個程度、 好ましくは、 1〜10個程度、 さらに好ましくは （1または 2個） ） の塩基が 挿入された塩基酸配列、 ④配列番号： 1 5、 配列番号： 1 6、 配列番号： 1 7 または配列番号： 30で表される塩基配列中の 1または 2個以上 （好ましくは 1〜30個程度、 好ましくは、 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは （1または 2個） ） の塩基が他の塩基で置換されたアミノ酸配列、 または⑤それらを組み 合わせた塩基配列を有する DN Aを含有する DN Aなども含まれる。
より具体的には、 （1)ストリンジェン卜な条件下で配列番号： 1 8、 配列番 号： 1 9または配列番号： 29で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的 に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードする DNAを含有する D N Aの有する配列とハイブリダィズする哺乳動物由来の DNA、 （2)遺伝コード の縮重のため配列番号： 18、 配列番号： 1 9または配列番号： 29で表され るアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパ ク質をコ一ドする DNAを含有する DNAの有する配列および（1)に定められ ている配列とハイブリツド形成しないが、 同一アミノ酸配列をもつタンパク質 をコードする DNAなどが用いられる。 ハイブリダィゼ一シヨンは、 自体公知 の方法あるいはそれに準じた方法に従って行うことができる。 上記ストリンジ ェントな条件としては、 例えば 42t:、 50%ホルムアミド、 4XSSPE(1 X S S PE = 150mM NaCl, lOmM NaH2P04-Ho0, ImM EDTA pH7.4), 5Xデンハ一 ト溶液、 0. 1%SDSである。
配列番号： 18、 配列番号： 19または配列番号： 29で表されるアミノ酸 配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質をコ一 ドする DN Aを含有する DN Aの有する配列とハイブリダィズする DN Aとし ては、 例えば、 配列番号： 15、 配列番号： 16、 配列番号： 17または配列 番号： 30で表される塩基配列と約 70 %以上、 好ましくは約 80%以上、 さ らに好ましくは約 90%以上、 最も好ましくは約 95%以上の相同性を有する 塩基配列を含有する DNAなどが用いられる。
また、 本発明の配列番号： 18、 配列番号： 19または配列番号： 29で表 されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する夕 ンパク質をコ一ドする DN Aの部分塩基配列を含有する DN A断片は DN A検 出プローブとしても好ましく用いられる。
本発明の前駆体タンパク質をコ一ドする DNAは上記した本発明のポリぺプ チドと同様にして遺伝子工学的手法によっても製造することができる。
本発明の前駆体タンパク質をコードする DNAまたは本発明の前駆体タンパ ク質は、 ①本発明の前駆体タンパク質 （または本発明のポリペプチド） の有す る生理作用の探索、 ②合成オリゴヌクレオチドプロ一ブあるいは PC Rのブラ イマ一の作成、 ③本発明のポリペプチドをコードする DN Aの入手、 ④組換え 型レセプ夕一タンパク質の発現系を用いたレセプター結合アツセィ系の開発と 医薬品候補化合物のスクリーニング、 ⑤抗体および抗血清の入手、 ⑥ D NA、 R NA、 抗体または抗血清を用いた診断薬の開発、 ⑦中枢神経機能調節剤、 循 環機能調節剤、 心臓機能調節剤、 腎臓機能調節剤、 泌尿器機能調節剤、 感覚器 官機能調節剤などの医薬の開発、 ⑧遺伝子治療等に用いることができる。
特に、 後述の組換え型 S E N Rの発現系を用いたレセプ夕一結合アツセィ系 によって、 ヒトなどの温血動物に特異的な S E N Rァゴニストまたはアン夕ゴ 二ストをスクリーニングするごとができ、 該ァゴニス卜またはアン夕ゴニスト を各種疾病の予防 ·治療剤などとして使用することができる。
さらに、 上記⑦に関し、 本発明の前駆体タンパク質またはそれをコードする D N Aは中枢神経系、 循環器系、 心臓、 腎臓、 泌尿器系または感覚器官系など で発現している S E N Rがリガンドとして認識するものであるので、 安全で低 毒性な医薬として有用である。 本発明の前駆体タンパク質またはそれをコード する D N Aは中枢神経機能調節作用、 循環機能調節作用、 心臓機能調節作用、 腎臓機能調節作用、 泌尿器機能調節作用あるいは感覚器官調節作用などに関与 していることから、 たとえば老人性痴呆、 脳血管性痴呆、 系統変成型の退行変 成疾患 （例：アルツハイマー病、 パーキンソン病、 ピック病、 ハンチントン病 など） に起因する痴呆、 高 （低） 血圧症、 腎疾患 （例：慢性腎不全、 腎炎など ) 、 心疾患 （例：心不全、 急性心筋梗塞など） 、 頻尿、 尿失禁、 難聴、 嗅覚異 常、 視覚異常などの疾病の治療 ·予防剤として用いることができる。
本発明の前駆体タンパク質またはそれをコードする D NAを上述の医薬とし て使用する場合、 常套手段に従って製剤化することができる。 例えば、 必要に 応じて糖衣や腸溶性被膜を施した錠剤、 カプセル剤、 エリキシル剤、 マイクロ カプセル剤などとして経口的に、 あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容 し得る液との無菌性溶液、 または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用 できる。 例えば、 該化合物またはその塩を生理学的に認められる担体、 香味剤 、 賦形剤、 べヒクル、 防腐剤、 安定剤、 結合剤などとともに一般に認められた 製剤に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる 。 これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な用量が得られるよ うにするものである。
錠剤、 カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、 上記の添加 剤と同様のものなどを用いることができる。
注射用の水性液としては、 例えば、 生理食塩水、 ブドウ糖やその他の補助薬 を含む等張液 （例えば、 D—ソルビトール、 D—マンニトール、 塩化ナトリウ ムなど） などがあげられ、 適当な溶解補助剤、 たとえばアルコール （たとえば エタノール） 、 ポリアルコール （たとえばプロピレングリコール、 ポリエチレ ングリコール） 、 非イオン性界面活性剤 （たとえばポリソルベート 8 0 (™) 、 H C O— 5 0 ) などと併用してもよい。 油性液としてはゴマ油、 大豆油など があげられ、 溶解補助剤として安息香酸ベンジル、 ベンジルアルコールなどと 併用してもよい。
また、 緩衝剤 （例えば、 リン酸塩緩衝液、 酢酸ナトリウム緩衝液） 、 無痛化 剤 （例えば、 塩化ベンザルコニゥム、 塩酸プロ力インなど） 、 安定剤 （例えば 、 ヒト血清アルブミン、 ポリエチレングリコールなど） 、 保存剤 （例えば、 ベ ンジルアルコール、 フエノールなど） 、 酸化防止剤などと配合してもよい。 調 製された注射液は通常、 適当なアンプルに充填される。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、 例えばヒトゃ哺乳 動物 （例えば、 マウス、 ラット、 モルモット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） に対して投与することができる。
本発明の前駆体タンパク質またはそれをコードする D NAの投与量は、 症状 などにより差異はあるが、 経口投与の場合、 一般的に成人の心不全患者 （体重
6 0 k gとして） においては、 一日につき約 0. 1から 1 0 0 m g、 好ましくは 約 1 . 0から 5 O m g、 より好ましくは約 1 . 0から 2 0 m gである。 非経口 的に投与する場合は、 その 1回投与量は投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法 などによっても異なるが、 たとえば注射剤の形では成人の心不全患者 （体重 6 0 k gとして） への投与においては、 一日につき約 0. 0 1から 30mg程度 、 好ましくは約 0. 1から 2 Omg程度、 より好ましくは約 0. 1から 10m g程度を静脈注射により投与するのが好都合である。 他の動物の場合も、 60 k g当たりに換算した量を投与することができる。
本発明における S ENRとしては、 上記のとおり、 Tal, M. et al. , Biochem. Biophys. Res. Commun. , 209, 752-759, 1995に記載のもの、 Marchese, A., Genomics, 29, 335-344, 1995に記載のもの、 EP 859052号に記載のものなどが あげられるのみならず、 配列番号： 9または配列番号： 26で表されるァミノ 酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有することを特徴とす る SENRまたはその塩、 または、 配列番号： 9または配列番号： 26で表さ れるアミノ酸配列中の 1個以上 30個以下、 好ましくは 1個以上 10個以下の アミノ酸が欠失したアミノ酸配列、 配列番号： 9または配列番号： 26で表さ れるアミノ酸配列に 1個以上 30個以下、 好ましくは 1個以上 1 0個以下のァ ミノ酸が付加した （または挿入された） アミノ酸配列、 あるいは配列番号： 9 または配列番号： 26で表されるアミノ酸配列中の 1個以上 30個以下、 好ま しくは 1個以上 10個以下のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配 列を含有する蛋白質である S E N Rまたはその塩などがあげられる。
また、 本発明で用いられる S ENRの部分ペプチドは前記した本発明の S E NRの部分ペプチドであれば何れのものであってもよいが、 例えば、 本発明の SENR蛋白質分子のうち、 細胞膜の外に露出している部位であって、 本発明 のポリべプチドとの結合活性を有するものなどが用いられる。 これら本発明で用いられる S ENRまたはその部分ペプチドは、 Tal, M. et al. , Biochem. Biophys. Res. Commun. , 209, 752-759, 1995に記載の方法、 Marchese, A.. Genomics, 29, 335-344, 1995に記載の方法、 EP 859052号に記 載の方法と同一またはそれらに準じた方法によって製造することができるし、 上述の本発明のポリペプチドと同様の方法によっても製造することができる。 また、 本発明で用いられる S ENRまたはその部分ペプチドの塩としては、 上記の本発明のポリペプチドの塩と同様のものなどがあげられる。
本発明で用いられる S ENRまたはその部分ペプチドをコ一ドする DNAと しては、 上記の S ENRまたはその部分ペプチドをコードする DNAを含有す る DNAであればいかなるものであってもよい。 また、 ゲノム DNA、 ゲノム DNAライブラリ一、 前記した組織 ·細胞由来の c DNA、 前記した組織 ·細 胞由来の c DNAライブラリー、 合成 DNAのいずれでもよい。 ライブラリ一 に使用するべクタ一はバクテリオファージ、 プラスミド、 コスミド、 ファージ ミドなどいずれであってもよい。 また、 前記した組織 ·細胞より RN A画分を 調整したものを用いて直接 RT— PCR法によって増幅することもできる。 本 発明で用いられる S ENRまたはその部分ペプチドをコ一ドする DNAは、 Tal, M. et al. , Biochem. Biophys. Res. Commun. , 209, 752-759, 1995に記 載の方法、 Marchese, A., Genomics, 29, 335-344, 1995に記載の方法、 EP 859052 号に記載の方法と同一またはそれらに準じた方法によって得ることもできる。 本発明のポリペプチド、 その前駆体タンパク質、 該ポリペプチドまたは前駆 体タンパク質をコ一ドする DNAおよび抗体などの用途について、 以下に具体 的に説明する。
(1) ポリペプチド欠乏症の予防 ·治療剤 S E N Rに対する本発明のポリべプチドおよびその前駆体タンパク質が有す る作用に応じて、 本発明のポリべプチドをコ一ドする D NAをポリペプチドま たは S E N R欠乏症の予防 ·治療剤としても使用することができる。
例えば、 生体内において、 本発明のポリペプチド、 その前駆体タンパク質ま たは S E N Rが減少しているためにリガンドの生理作用 （中枢神経機能調節作 用， 循環機能調節作用、 心臓機能調節作用、 腎臓機能調節作用、 泌尿器機能調 節作用あるいは感覚器官機能調節作用など） が期待できない患者がいる場合に 、 （ィ） 本発明のポリペプチドまたはその前駆体タンパク質をコードする D N Aを該患者に投与し発現させることによって、 あるいは （口） 脳細胞などに本 発明のポリペプチドまたはその前駆体タンパク質をコードする D N Aを挿入し 発現させた後に、 該脳細胞を該患者に移植することなどによって、 該患者の脳 細胞におけるポリペプチドまたはその前駆体タンパク質の量を増加させ、 ポリ ペプチドまたはその前駆体タンパク質の作用を充分に発揮させることができる 。 したがって、 本発明のボリペプチドまたはその前駆体タンパク質をコードす る D NAは、 安全で低毒性なポリペプチドまたはその前駆体タンパク質の欠乏 症の予防 ·治療剤などとして用いることができる。
上記 D N Aを上記治療剤として使用する場合は、 該 D NAを単独あるいはレ トロウィルスベクタ一、 アデノウイルスベクター、 アデノウイルスァソシェ一 テツドウィルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、 上記した本発明 のポリべプチドまたはその前駆体タンパク質もしくはそれらの部分ペプチドを コードする D N Aを医薬として使用する場合と同様の手段に従って実施するこ とができる。
( 2 ) ポリペプチドに対する S E N Rの定量法 本発明のポリペプチドまたはその前駆体タンパク質は S E N Rまたはその塩 やその部分ペプチドまたはその塩に対して結合性を有しているので、 生体内に おける S ENRもしくはその塩、 または該 S ENRの部分ペプチドまたはその 塩の濃度を感度良く定量することができる。
この定量法は、 例えば競合法と組み合わせることによって用いることができ る。 すなわち、 被検体を本発明のポリペプチドまたはその前駆体タンパク質と 接触させることによって被検体中の S ENRもしくはその塩、 または S ENR の部分べプチドもしくはその塩の濃度を測定することができる。
具体的には、 例えば、 以下の①または②などに記載の自体公知の方法あるい はそれに準じる方法に従って用いることができる。
①入江寛編 「ラジオィムノアツセィ」 （講談社、 昭和 49年発行）
②入江寛編 「続ラジオィムノアツセィ」 （講談社、 昭和 54年発行）
(3) SENRと、 本発明のポリペプチドまたはその前駆体タンパク質 （以下 、 リガンドまたはポリペプチドと略称する場合がある。 ） との結合性を変化さ せる化合物のスクリーニング方法
S ENRまたはその塩やその部分ペプチドもしくはその塩を用いるか、 また は組換え型 S E N Rの発現系を構築し、 該発現系を用いたレセプ夕一結合ァッ セィ系を用いることによって、 ポリペプチドまたはその前駆体タンパク質と S ENRとの結合性を変化させる化合物 （例えば、 ペプチド、 タンパク質、 非べ プチド性化合物、 合成化合物、 発酵生産物など） またはその塩をスクリーニン グすることができる。 このような化合物には、 SENRを介して細胞刺激活性
(例えば、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 C a 遊離、 細胞 内 cAM P生成、 細胞内 c GMP生成、 イノシトールリン酸産生、 細胞膜電位 変動、 細胞内タンパク質のリン酸化、 c一 f o sの活性化、 pHの低下などを 促進する活性または抑制する活性など） を有する化合物 （即ち SENRァゴニ スト） と該細胞刺激活性を有しない化合物 （即ち SENRアン夕ゴニスト） な どが含まれる。 「リガンドとの結合性を変化させる」 とは、 リガンドとの結合 を阻害する場合とリガンドとの結合を促進する場合の両方を包含するものであ る。
上記スクリーニング方法においては、 本発明のポリペプチドまたはその前駆 体タンパク質として、 上記のものに加えて、 配列番号： 22で表されるァミノ 酸配列を含有するポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまた はその塩、 およびその前駆体タンパク質またはその塩が用いられる。
配列番号： 22で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドもしくはそ のアミドもしくはそのエステルまたはその塩、 およびその前駆体タンパク質ま たはその塩は上記の本発明のポリぺプチドもしくはそのアミドもしくはそのェ ステルまたはその塩、 およびその前駆体タンパク質またはその塩と同様の方法 によって製造することができる。
また、 配列番号： 22で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチド、 そ の前駆体タンパク質をコードする DNAは、 上記の配列番号： 22で表される ァミノ酸配列を含有するポリペプチド、 その前駆体タンパク質をコードする D NAを含有する DNAであればいかなるものであってもよい。 また、 ゲノム D NA、 ゲノム DNAライブラリー、 前記した組織 ·細胞由来の c DNA、 前記 した組織 ·細胞由来の c DNAライブラリ一、 合成 DNAのいずれでもよい。 ライブラリーに使用するベクターはパクテリオファージ、 プラスミド、 コスミ ド、 ファージミドなどいずれであってもよい。 また、 前記した組織 ·細胞より R N A画分を調整したものを用いて直接 RT— PC R法によって増幅すること もできる。 本発明で用いられる配列番号： 22で表されるアミノ酸配列を含有 するポリペプチド、 その前駆体タンパク質をコードする DNAは、 上記の本発 明のポリペプチド、 その前駆体タンパク質をコードする DNAと同様の方法に より得ることができる。
以下、 S ENRと本発明のポリペプチドまたはその前駆体タンパク質との結 合性を変化させる化合物のスクリーニング方法の説明においては、 「本発明の ポリペプチド」 は、 上記の 「本発明のポリペプチド」 および 「配列番号： 22 で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチド」 を意味し、 「本発明のポリ ペプチドの前駆体」 は、 上記の 「本発明のポリペプチドの前駆体」 および 「配 列番号： 22で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドの前駆体」 を意 味する。
さらに、 以下、 SENRと本発明のポリペプチドまたはその前駆体タンパク 質との結合性を変化させる化合物のスクリーニング方法の説明においては、 「 本発明のポリペプチドをコードする DNA」 は、 上記の 「本発明のポリべプチ ドをコードする DNA 」 および 「配列番号： 22で表されるアミノ酸配列を含 有するポリペプチドをコードする DN A 」 を意味し、 「本発明のポリペプチド の前駆体をコードする DNA 」 は、 上記の 「本発明のポリペプチドの前駆体を コードする DNA 」 および 「配列番号： 22で表されるアミノ酸配列を含有す るポリペプチドの前駆体をコードする DN A 」 を意味する。
すなわち、 本発明は、 （ i) S ENRもしくはその塩または該 S ENRの部 分べプチドもしくはその塩に、 本発明のポリぺプチドまたはその前駆体夕ンパ ク質を接触させた場合と （ii) 上記した SENRもしくはその塩または該 SE N Rの部分べプチドもしくはその塩に、 本発明のポリぺプチドまたはその前駆 体タンパク質および試験化合物を接触させた場合との比較を行なうことを特徴 とする本発明のポリペプチドまたはその前駆体タンパク質と上記した SENR との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する 。
本発明のスクリーニング方法においては、 （ i) 上記した SENRまたは該 S E N Rの部分ペプチドに、 本発明のポリペプチドまたはその前駆体タンパク 質を接触させた場合と （ii) 上記した S ENRまたは該 S ENRの部分べプチ ドに、 本発明のポリペプチドまたはその前駆体タンパク質および試験化合物を 接触させた場合における、 例えば該 S ENRまたは該 S ENRの部分ペプチド に対するリガンドの結合量、 細胞刺激活性などを測定して、 比較する。
本発明のスクリーニング方法は具体的には、
①標識した本発明のポリペプチドまたはその前駆体タンパク質を、 上記した S ENRもしくはその塩または S ENRの部分ペプチドまたはその塩に接触させ た場合と、 標識した本発明のポリペプチドまたはその前駆体タンパク質および 試験化合物を S ENRもしくはその塩または S ENRの部分ペプチドもしくは その塩に接触させた場合における、 標識した本発明のポリペプチドまたはその 前駆体タンパク質の該 S ENRもしくはその塩、 または該部分ペプチドもしく はその塩に対する結合量を測定し、 比較することを特徴とする本発明のポリべ プチドまたはその前駆体タンパク質と SENRとの結合性を変化させる化合物 またはその塩のスクリーニング方法、
②標識した本発明のポリペプチドまたはその前駆体タンパク質を、 S ENRを 含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合と、 標識した本発明のポ またはその前駆体夕ンパク質および試験化合物を S E N Rを含有す る細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合における、 標識した本発明のポ リペプチドまたはその前駆体タンパク質の該細胞または該膜画分に対する結合 量を測定し、 比較することを特徴とする本発明のポリペプチドまたはその前駆 体タンパク質と S ENRとの結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリ 一二ング方法、
③標識した本発明のポリぺプチドまたはその前駆体夕ンパク質を、 S E N Rを コードする DNAを含有する形質転換体を培養することによつて細胞膜上に発 現した S ENRに接触させた場合と、 標識した本発明のポリペプチドまたはそ の前駆体タンパク質および試験化合物を S ENRをコードする DNAを含有す る形質転換体を培養することによつて細胞膜上に発現した S E N Rに接触させ た場合における、 標識した本発明のポリべプチドまたはその前駆体夕ンパク質 の S ENRに対する結合量を測定し、 比較することを特徴とする本発明のポリ ペプチドまたはその前駆体タンパク質と S ENRとの結合性を変化させる化合 物またはその塩のスクリーニング方法、
④ SENRを活性化する化合物 （例えば、 本発明のポリペプチドまたはその前 駆体タンパク質） を SENRを含有する細胞に接触させた場合と、 SENRを 活性化する化合物および試験化合物を S ENRを含有する細胞に接触させた場 合における、 SENRを介した細胞刺激活性 （例えば、 ァラキドン酸遊離、 ァ セチルコリン遊離、 細胞内 Ca 遊離、 細胞内 c AMP生成、 細胞内 c GMP 生成、 イノシトールリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内タンパク質のリン酸 化、 c一 f o sの活性化、 pHの低下などを促進する活性または抑制する活性 など） を測定し、 比較することを特徴とする本発明のポリペプチドまたはその 前駆体タンパク質と S ENRとの結合性を変化させる化合物またはその塩のス クリーニング方法、 および
⑤ SENRを活性化する化合物 （例えば、 本発明のポリペプチドまたはその前 駆体タンパク質など） を S E N Rをコードする D N Aを含有する形質転換体を 培養することによつて細胞膜上に発現した S E N Rに接触させた場合と、 S E NRを活性化する化合物および試験化合物を、 S ENRをコードする DNAを 含有する形質転換体を培養することによつて細胞膜上に発現した S E N Rに接 触させた場合における、 S ENRを介する細胞刺激活性 （例えば、 ァラキドン 酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 C a2+遊離、 細胞内 c AMP生成、 細胞 内 c GMP生成、 イノシトールリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内タンパク 質のリン酸化、 c— f o sの活性化、 pHの低下などを促進する活性または抑 制する活性など） を測定し、 比較することを特徴とする本発明のポリペプチド またはその前駆体タンパク質と S E N Rとの結合性を変化させる化合物または その塩のスクリーニング方法などである。
本発明のスクリーニング方法の具体的な説明を以下にする。
まず、 本発明のスクリーニング方法に用いる S ENRとしては、 上記の SE NRまたは S ENRの部分ペプチドを含有するものであれば何れのものであつ てもよいが、 ヒトゃ温血動物の臓器の膜画分などが好適である。 しかし、 特に ヒト由来の臓器は入手が極めて困難なことから、 スクリーニングに用いられる ものとしては、 組換え体を用いて大量発現させた S ENRなどが適している。
SENRを製造するには、 前述の方法などが用いられる。
本発明のスクリーニング方法において、 S ENRを含有する細胞あるいは該 細胞膜画分などを用いる場合、 後述の調製法に従えばよい。
SENRを含有する細胞を用いる場合、 該細胞をダルタルアルデヒド、 ホル マリンなどで固定化してもよい。 固定化方法はそれ自体公知の方法に従って行 うことができる。
S ENRを含有する細胞としては、 S ENRを発現した宿主細胞をいうが、 該宿主細胞としては、 前述の大腸菌、 枯草菌、 酵母、 昆虫細胞、 動物細胞など があげられる。
膜画分としては、 細胞を破砕した後、 それ自体公知の方法で得られる細胞膜 が多く含まれる画分のことをいう。細胞の破砕方法としては、 Potter— Elvehjem 型ホモジナイザーで細胞を押し潰す方法、 ワーリンダブレンダ一やポリトロン (Kinematica社製） による破砕、 超音波による破砕、 フレンチプレスなどで加 圧しながら細胞を細いノズルから噴出させることによる破砕などがあげられる 。 細胞膜の分画には、 分画遠心分離法や密度勾配遠心分離法などの遠心力によ る分画法が主として用いられる。 例えば、 細胞破砕液を低速 （500 r pm〜 3000 r pm) で短時間 （通常、 約 1分〜 10分） 遠心し、 上清をさらに高 速 （15000 r pm〜30000 r pm) で通常 30分〜 2時間遠心し、 得 られる沈澱を膜画分とする。 該膜画分中には、 発現した SENRと細胞由来の リン脂質や膜タンパク質などの膜成分が多く含まれる。
該 SENRを含有する細胞や膜画分中の SENRの量は、 1細胞当たり 10 〜10 分子であるのが好ましく、 10 〜10 分子であるのが好適である。な お、 発現量が多いほど膜画分当たりのリガンド結合活性 （比活性） が高くなり 、 高感度なスクリーニング系の構築が可能になるばかりでなく、 同一ロットで 大量の試料を測定できるようになる。
本発明のボリべプチドまたはその前駆体タンパク質と SENRとの結合性を 変化させる化合物をスクリーニングする前記の①〜③を実施するためには、 適 当な S E N R画分と、 標識した本発明のポリペプチドまたはその前駆体タンパ ク質が用いられる。 SENR画分としては、 天然型の SENR画分か、 または それと同等の活性を有する組換え型 S ENR画分などが望ましい。 ここで、 同 等の活性とは、 同等のリガンド結合活性などを示す。 標識したリガンドとして は、 標識したリガンド、 標識したリガンドアナログ化合物などが用いられる。 例えば 〔 H〕 、 〔 I〕 、 〔 C〕 、 〔 S〕 などで標識されたリガンドな どを利用することができる。
具体的には、 本発明のポリペプチドまたはその前駆体タンパク質と S ENR との結合性を変化させる化合物のスクリーニングを行うには、 まず S ENRを 含有する細胞または細胞の膜画分を、 スクリーニングに適したバッファ一に懸 濁することによりレセプ夕一標品を調製する。 バッファーには、 pH4〜1 0 (望ましくは pH6〜8) のリン酸バッファ一、 トリス—塩酸バッファ一など のリガンドとレセプ夕一との結合を阻害しないバッファーであればいずれでも よい。 また、 非特異的結合を低減させる目的で、 CHAP S、 Twe e n- 8 0 (花王—アトラス社） 、 ジギトニン、 デォキシコレ一卜などの界面活性剤 をバッファ一に加えることもできる。 さらに、 プロテアーゼによるレセプ夕一 や本発明のポリペプチドの分解を抑える目的で PMS F、 ロイぺプチン、 E— 64 (ペプチド研究所製） 、 ぺプス夕チンなどのプロテアーゼ阻害剤を添加す ることもできる。 0. 0 linl〜 1 0m lの該レセプ夕ー溶液に、 一定量 （500 0 c pm~5 00 000 c pm) の標識した本発明のポリペプチドを添加し、 同時に 1 0 〜1 0 Mの試験化合物を共存させる。 非特異的結合量 （NS B) を知るために大過剰の未標識の本発明のポリペプチドを加えた反応チュー ブも用意する。 反応は 0 から 50°C、 望ましくは 4°Cから 3 7°Cで 2 0分か ら 24時間、 望ましくは 3 0分から 3時間行う。 反応後、 ガラス繊維濾紙等で 濾過し、 適量の同バッファーで洗浄した後、 ガラス繊維濾紙に残存する放射活 性を液体シンチレーシヨンカウンターまたはァ—カウンターで計測する。 拮抗 する物質がない場合のカウント（BQ) から非特異的結合量 （NS B) を引いた カウント （B。― NSB) を 1 0 0 %とした時、 特異的結合量 （B— NSB) が 例えば 50 %以下になる試験化合物を拮抗阻害能力のある候補物質として選択 することができる。
本発明のポリべプチドまたはその前駆体タンパク質と S ENRとの結合性を 変化させる化合物をスクリーニングする前記の④〜⑤の方法を実施するために は、 S ENRを介する細胞刺激活性 （例えば、 ァラキドン酸遊離、 ァセチルコ リン遊離、 細胞内 Ca 遊離、 細胞内 cAAiP生成、 細胞内 c GMP生成、 ィ ノシトールリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内タンパク質のリン酸化、 c— f o sの活性化、 pHの低下などを促進する活性または抑制する活性など） を 公知の方法または市販の測定用キットを用いて測定することができる。 具体的 には、 まず、 S ENRを含有する細胞をマルチウエルプレート等に培養する。 スクリーニングを行うにあたっては前もつて新鮮な培地あるいは細胞に毒性を 示さない適当なバッファーに交換し、 試験化合物などを添加して一定時間ィン キュペートした後、 細胞を抽出あるいは上清液を回収して、 生成した産物をそ れぞれの方法に従って定量する。 細胞刺激活性の指標とする物質 （例えば、 ァ ラキドン酸など） の生成が、 細胞が含有する分解酵素によって検定困難な場合 は、 該分解酵素に対する阻害剤を添加してアツセィを行なってもよい。 また、 c AMP産生抑制などの活性については、 フォルスコリンなどで細胞の基礎的 産生量を増大させておいた細胞に対する産生抑制作用として検出することがで きる。
細胞刺激活性を測定してスクリーニングを行なうには、 適当な SENRを発 現した細胞が必要である。 本発明の S ENRを発現した細胞としては、 前述の 組換え型 S ENR発現細胞株などが望ましい。
試験化合物としては、 例えばペプチド、 タンパク、 非ペプチド性化合物、 合 成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液などがあげ られる。
本発明のポリべプチドまたはその前駆体タンパク質と SENRとの結合性を 変化させる化合物またはその塩のスクリーニング用キットは、 SENRまたは その塩、 S ENRの部分ペプチドまたはその塩、 SENRを含有する細胞、 あ るいは S ENRを含有する細胞の膜画分、 および本発明のポリペプチドまたは その前駆体タンパク質を含有するものである。 b
本発明のスクリーニング用キッ卜の例としては、 次のものがあげられる。
1. スクリーニング用試薬
①測定用緩衝液および洗浄用緩衝液
Hanks' Balanced Salt Solution (ギブコ社製） に、 0. 05%のゥシ血清ァ ルブミン （シグマ社製） を加えたもの。
孔径 0.45 のフィル夕一で濾過滅菌し、 4°Cで保存するか、 あるいは用 時調製しても良い。
② S ENR標品
S ENRを発現させた CH〇細胞を、 12穴プレートに 5X 10 個/穴で継 代し、 37°C、 5%C02、 95 % a i rで 2日間培養したもの。
③標識リガンド
C H C I〕 、 〔 c〕 、 〔 s〕 などで標識したリガンド 適当な溶媒または緩衝液に溶解したものを 4 °Cあるいは— 20 °Cにて保存し 、 用時に測定用緩衝液にて 1 Mに希釈する。
④リガンド標準液
本発明のポリペプチドまたはその前駆体タンパク質を 0. 1 %ゥシ血清アル ブミン （シグマ社製） を含む PBSで ImMとなるように溶解し、 — 20°Cで 保存する。
2. 測定法
① 12穴組織培養用プレートにて培養した SENRを発現させた細胞を、 測定 用緩衝液 1 m 1で 2回洗浄した後、 490 1の測定用緩衝液を各穴に加える
©10 〜10 Mの試験化合物溶液を 5 1加えた後、 標識した本発明の ペプチドまたはその前駆体タンパク質を 5 1加え、 室温にて 1時間反応させ る。 非特異的結合量を知るためには試験化合物のかわりに 10 Mのリガンド を 5 1加えておく。 b ό
③反応液を除去し、 lm 1の洗浄用緩衝液で 3回洗浄する。 細胞に結合した標 識リガンドを 0.2 N \TaOH— 1 %SDSで溶解し、 4mlの液体シンチレ 一夕一 A (和光純薬製） と混合する。
④液体シンチレーシヨンカウンター （ベックマン社製） を用いて放射活性を測 定し、 Percent Maximum Binding (PMB) を次の式で求める。
式
PMB= [ (B-NS B) / (BQ— NSB) ] X 100
PMB： Percent Maximum Binding
B ：検体を加えた時の値
NSB： Non-specific Binding (非特異的結合量）
B。 ：最大結合量
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られ る化合物またはその塩は、 本発明のポリペプチドまたはその前駆体タンパク質 と SENRとの結合を変化させる （結合を阻害あるいは促進する） 化合物であ り、 具体的には S ENRを介して細胞刺激活性を有する化合物またはその塩 （ いわゆる S ENRァゴニスト） 、 あるいは該刺激活性を有しない化合物 （いわ ゆる S ENRアンタゴニスト） である。 該化合物としては、 ペプチド、 タンパ ク、 非ペプチド性化合物、 合成化合物、 発酵生産物などがあげられ、 これら化 合物は新規な化合物であってもよいし、 公知の化合物であってもよい。
上記 S ENRァゴニス卜であるかアン夕ゴニス卜であるかの具体的な評価方 法は以下の （ i) または （ii) に従えばよい。
( i ) 前記①〜③のスクリーニング方法で示されるバインディング ·アツセィ を行い、 本発明のポリペプチドまたはその前駆体タンパク質と S ENRとの結 合性を変化させる （特に、 結合を阻害する） 化合物を得た後、 該化合物が上記 した SENRを介する細胞刺激活性を有しているか否かを測定する。 細胞刺激 活性を有する化合物またはその塩は S ENRァゴニストであり、 該活性を有し ない化合物またはその塩は S ENRアン夕ゴニストである。
(ii) (a)試験化合物を SENRを含有する細胞に接触させ、 上記 SENRを介 した細胞刺激活性を測定する。 細胞刺激活性を有する化合物またはその塩は S ENRァゴニストである。
(b) SENRを活性化する化合物 （例えば、 本発明のポリペプチド、 その前駆体 タンパク質または S ENRァゴニストなど） を S ENRを含有する細胞に接触 させた場合と、 S ENRを活性化する化合物および試験化合物を S ENRを含 有する細胞に接触させた場合における、 S ENRを介した細胞刺激活性を測定 し、 比較する。 SENRを活性化する化合物による細胞刺激活性を減少させ得 る化合物またはその塩は S ENRアン夕ゴニストである。
該 S ENRァゴニス卜は、 S ENRに対する本発明のポリペプチドまたはそ の前駆体タンパク質が有する生理活性と同様の作用を有しているので、 本発明 のポリぺプチドまたはその前駆体夕ンパク質と同様に安全で低毒性な医薬とし て有用である。
逆に、 S ENRアン夕ゴニストは、 S ENRに対する本発明のポリペプチド が有する生理活性を抑制することができるので、 該レセプ夕ー活性を抑制する 安全で低毒性な医薬として有用である。
本発明のポリぺプチドまたはその前駆体夕ンパク質は中枢神経機能調節作用 、 循環機能調節作用、 心臓機能調節作用、 腎臓機能調節作用、 泌尿器機能調節 作用あるいは感覚器官調節作用などに関与していることから、 SENRァゴニ ストは、 たとえば老人性痴呆、 脳血管性痴呆、 系統変成型の退行変成疾患 （例 ：アルツハイマー病、 パーキンソン病、 ピック病、 ハンチントン病など） に起 因する痴呆、 高 （低） 血圧症、 腎疾患 （例：慢性腎不全、 腎炎など） 、 心疾患 (例：心不全、 急性心筋梗塞など） 、 頻尿、 尿失禁、 難聴、 嗅覚異常、 視覚異 常などの疾病の治療 ·予防剤として用いることができる。
上記のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる 化合物の塩としては、 例えば、 薬学的に許容可能な塩などが用いられる。 例え ば、 無機塩基との塩、 有機塩基との塩、 無機酸との塩、 有機酸との塩、 塩基性 または酸性アミノ酸との塩などがあげられる。
無機塩基との塩の好適な例としては、 例えばナトリウム塩、 カリウム塩など のアルカリ金属塩、 カルシウム塩、 マグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩 、 ならびにアルミニウム塩、 アンモニゥム塩などがあげられる。
有機塩基との塩の好適な例としては、 例えばトリメチルァミン、 トリェチル ァミン、 ピリジン、 ピコリン、 2， 6—ルチジン、 エタノールァミン、 ジェ夕 ノ一ルァミン、 トリエタノールァミン、 シクロへキシルァミン、 ジシクロへキ シルァミン、 N, N ' —ジベンジルエチレンジァミンなどとの塩あげられる。 無機酸との塩の好適な例としては、 例えば塩酸、 臭化水素酸、 硫酸、 リン酸 などとの塩があげられる。
有機酸との塩の好適な例としては、 例えばギ酸、 酢酸、 プロピオン酸、 フマ ル酸、 シユウ酸、 酒石酸、 マレイン酸、 クェン酸、 コハク酸、 リンゴ酸、 メタ ンスルホン酸、 ベンゼンスルホン酸、 安息香酸などとの塩があげられる。
塩基性アミノ酸との塩の好適な例としては、 例えばアルギニン、 リジン、 ォ ルチニンなどとの塩があげられ、 酸性アミノ酸との好適な例としては、 例えば ァスパラギン酸、 グルタミン酸などとの塩があげられる。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られ る化合物またはその塩を上述の医薬として使用する場合、 上記の本発明のポリ ペプチドまたはその前駆体タンパク質を医薬として実施する場合と同様にして 製剤化 ·投与することができる。
( 4 ) 本発明のポリペプチドまたはその前駆体タンパク質に対する抗体または 抗血清の製造
本発明のポリペプチドまたはその前駆体タンパク質に対する抗体 （例えば、 ポリクローナル抗体、 モノクローナル抗体） または抗血清は、 本発明のポリべ プチドまたはその前駆体夕ンパク質を抗原として用い、 自体公知の抗体または 抗血清の製造法に従って製造することができる。
例えば、 ポリクロ一ナル抗体は、 後述の方法に従って製造することができる
[ポリクローナル抗体の作製]
本発明のポリペプチドまたはその前駆体タンパク質に対するポリクローナル 抗体は、 それ自体公知あるいはそれに準じる方法にしたがって製造することが できる。 例えば、 免疫抗原 （ポリペプチド等抗原） とキャリアータンパク質と の複合体をつくり、 後述のモノクローナル抗体の製造法と同様に温血動物 （例 えば、 哺乳動物 （例、 ゥサギ、 ヒッジ、 ャギ、 ラット、 マウス、 モルモット、 ゥシ、 ゥマ、 ブ夕） 、 鳥類 （例、 ニヮトリ、 ノ、ト、 ァヒル、 ガチョウ、 ゥズラ ) など） に免疫を行ない、 該免疫動物から本発明のポリペプチドに対する抗体 含有物を採取して、 抗体の分離精製を行なうことにより製造できる。
哺乳動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキヤリァ一タンパク質との 複合体に関し、 キャリアータンパク質の種類およびキャリア一とハプテン （本 発明のポリペプチドまたはその部分ペプチド） との混合比は、 キャリアーに架 橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率良くできれば、 どの様なものを どの様な比率で架橋させてもよいが、 例えば、 ゥシ血清アルブミン、 ゥシサイ ログロブリン、 キーホール · リンぺット ·へモシァニン等を重量比でハプテン 1に対し、 約 0 . 1〜2 0、 好ましくは約 1〜5の割合でカプルさせる方法が用 いられる。
また、 ハプテンとキャリア一の力プリングには、 種々の縮合剤を用いること ができるが、 ダルタルアルデヒドやカルポジイミド、 マレイミド活性エステル 、 チオール基、 ジチォピリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる 縮合生成物は、 上記温血動物に対して、 抗体産生が可能な部位にそれ自体あ ο (
るいは担体、 希釈剤とともに投与される。 投与に際して抗体産生能を高めるた め、 完全フロイントアジュバントゃ不完全フロイントアジュバントを投与して もよい。 投与は、 通常約 2〜 6週毎に 1回ずつ、 計約 3〜 1 0回程度行なわれ る。
ポリクローナル抗体は、 上記の方法で免疫された哺乳動物の血液、 腹水など 、 好ましくは血液から採取される。
抗血清中の本発明のポリペプチドまたはその前駆体タンパク質に対する抗体 価の測定は、 後述のハイプリドーマ培養上清の抗体価の測定と同様にして測定 できる。 抗体の分離精製は、 後述のモノクローナル抗体の分離精製と同様の免 疫グロプリンの分離精製法に従って行なうことができる。
また、 モノクローナル抗体は、 後述の方法に従って製造することができる。 〔モノクローナル抗体の作製〕
( a ) モノクロナール抗体産生細胞の作製
本発明のポリペプチドまたはその前駆体タンパク質は、 温血動物 （例えば、 哺乳温血動物 （例、 ゥサギ、 ヒッジ、 ャギ、 ラット、 マウス、 モルモット、 ゥ シ、 ゥマ、 ブ夕） 、 鳥類 （例、 ニヮトリ、 ハ卜、 ァヒル、 ガチョウ、 ゥズラ） など） に対して投与により抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、 希 釈剤とともに投与される。 投与に際して抗体産生能を高めるため、 完全フロイ ントアジュバントゃ不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。 投与は 通常 2〜 6週毎に 1回ずつ、 計 2〜 1 0回程度行われる。
モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、 抗原を免疫された上記の温 血動物、 たとえばマウスなどから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の 2〜5日後に脾臓またはリンパ節を採取し、 それらに含まれる抗体産生細胞を 骨髄腫細胞と融合させることにより、 モノクローナル抗体産生ハイプリドーマ を調製することができる。 抗血清中の抗体価の測定は、 例えば後記の標識化し た本発明のポリべプチド、 その前駆体タンパク質またはそれらの部分べプチド 0 o
と抗血清とを反応させたのち、 抗体に結合した標識剤の活性を測定することに よりなされる。 融合操作は既知の方法、 たとえばケ一ラーとミルスタインの方 法 〔ネイチヤー （Nature)、 256、 495 (1975)3 等に従い実施できる。 融合促進 剤としてはポリエチレングリコール （PEG) やセンダイウィルスなどがあげ られる力^ 好ましくは PEGが用いられる。
骨髄腫細胞としてはたとえば NS— 1、 P 3U1、 SP 2Z0、 AP— 1な どがあげられるが、 P 3U1が好ましく用いられる。 用いられる抗体産生細胞 (脾臓細胞） 数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は 1 ： 1〜20 ： 1程度であ り、 PEG (好ましくは PEG 1000〜PEG 6000) 力 10〜80%程 度の濃度で添加され、 20〜40°C、 好ましくは 30〜37°Cで 1〜10分間 インキュベートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。
本発明のポリぺプチドまたはその前駆体夕ンパク質に対する抗体産生ハイブ リドーマのスクリーニングには種々の方法が使用できるが、 たとえば本発明の ポリべプチド抗原またはその前駆体タンパク質抗原を直接あるいは担体ととも に吸着させた固相 （例、 マイクロプレート） にハイプリドーマ培養上清を添加 し、 次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体 （細胞融合に 用いられる細胞がマウスの場合、 抗マウス免疫グロプリン抗体が用いられる） またはプロテイン Aを加え、 固相に結合した本発明のポリペプチドまたはその 前駆体夕ンパク質に対するモノクローナル抗体を検出する方法、 抗免疫グロブ リン抗体またはプロテイン Aを吸着させた固相にハイプリドーマ培養上清を添 加し、 放射性物質や酵素などで標識した本発明のポリペプチドを加え、 固相に 結合した本発明のポリペプチドまたはその前駆体タンパク質に対するモノクロ —ナル抗体を検出する方法などがあげられる。
本発明のポリぺプチドまたはその前駆体夕ンパク質に対するモノク口一ナル 抗体の選別は、 自体公知あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができ る。 通常 HAT (ヒポキサンチン、 アミノプテリン、 チミジン） を添加した動 物細胞用培地で行なわれる。 選別および育種用培地としては、 ハイプリドーマ が生育できるものならばどのような培地を用いても良い。 例えば、 1〜2 0 % 、 好ましくは 1 0〜2 0 %の牛胎児血清を含む R P M I 1 6 4 0培地、 1〜1 0 %の牛胎児血清を含む G I T培地 （和光純薬工業 （株） ） あるいはハイプリ ドーマ培養用無血清培地 （S F M— 1 0 1、 日水製薬 （株） ） などを用いるこ とができる。 培養温度は、 通常 2 0〜4 0 °C、 好ましくは約 3 7 °Cである。 培 養時間は、 通常 5日〜 3週間、 好ましくは 1週間〜 2週間である。 培養は、 通 常 5 %炭酸ガス下で行なわれる。 ハイプリドーマ培養上清の抗体価は、 上記の 抗血清中の本発明のポリぺプチドに対する抗体価の測定と同様にして測定でき る。
( b ) モノクロナ一ル抗体の精製
本発明のポリべプチドまたはその前駆体タンパク質に対するモノクローナル 抗体の分離精製は通常のポリクローナル抗体の分離精製と同様に免疫グロプリ ンの分離精製法 〔例、 塩析法、 アルコール沈殿法、 等電点沈殿法、 電気泳動法 、 イオン交換体 （例、 D E A E ) による吸脱着法、 超遠心法、 ゲルろ過法、 抗 原結合固相あるいはプロテイン Aあるいはプロテイン Gなどの活性吸着剤によ り抗体のみを採取し、 結合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕 に従って行 われる。
上記の （a ) および （b ) の方法に従って製造させる本発明のポリペプチド またはその前駆体タンパク質に対する抗体は、 それぞれ本発明のポリペプチド またはその前駆体タンパク質を特異的に認識することができるので、 被検波中 の本発明のポリぺプチドまたはその前駆体夕ンパク質の定量、 特にサンドィッ チ免疫測定法による定量などに使用することができる。
すなわち、 本発明は、 例えば、
( i ) 本発明のポリペプチドまたはその前駆体タンパク質に反応する抗体と 、 被検波および標識した本発明のポリべプチドまたはその前駆体タンパク質と を競合的に反応させ、 該抗体に結合した標識した本発明のポリペプチドまたは その前駆体タンパク質の割合を測定することを特徴とする被検液中の本発明の ポリペプチドまたはその前駆体タンパク質の定量法、
( i i ) 被検液と担体上に不溶化した抗体および標識化された抗体とを同時あ るいは連続的に反応させたのち、 不溶化担体上の標識剤の活性を測定すること を特徴とする被検波中の本発明のポリペプチドまたはその前駆体タンパク質の 定量法において、 一方の抗体が、 本発明のポリペプチドまたはその前駆体タン パク質の N端部を認識する抗体で、 他方の抗体が本発明のポリべプチドまたは その前駆体タンパク質の C端部に反応する抗体であることを特徴とする被検波 中の本発明のポリペプチドまたはその前駆体タンパク質の定量法を提供する。 本発明のポリペプチドまたはその前駆体タンパク質を認識するモノクロ一ナ ル抗体を用いて本発明のポリペプチドまたはその前駆体タンパク質の測定を行 なえるほか、 組織染色等による検出を行なうこともできる。 これらの目的には 、 抗体分子そのものを用いてもよく、 また、 抗体分子の F ( a b ' ) 2 、 F a b ' 、 あるいは F a b画分を用いてもよい。 本発明の抗体を用いる測定法は、 特に 制限されるべきものではなく、 被測定液中の抗原量 （例えばポリペプチド量） に対応した抗体、 抗原もしくは抗体一抗原複合体の量を化学的または物理的手 段により検出し、 これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線 より算出する測定法であれば、 いずれの測定法を用いてもよい。 例えば、 ネフ ロメトリー、 競合法、 ィムノメトリック法およびサンドイッチ法が好適に用い られるが、 感度、 特異性の点で、 後述するサンドイッチ法を用いるのが特に好 ましい。
標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、 放射性同位元素、 酵 素、 蛍光物質、 発光物質などがあげられる。 放射性同位元素としては、 例えば 〔 I〕 、 〔 I〕 、 〔 H：) 、 〔 C〕 などが、 上記酵素としては、 安定 で比活性の大きなものが好ましく、 例えば 3—ガラクトシダーゼ、 /3—ダルコ シダ一ゼ、 アルカリフォスファタ一ゼ、 パーォキシダ一ゼ、 リンゴ酸脱水素酵 素等が、 蛍光物質としては、 フルォレスカミン、 フルォレツセンイソチオシァ ネートなどが、 発光物質としては、 ルミノール、 ルミノール誘導体、 ルシフエ リン、 ルシゲニンなどがそれぞれあげられる。 さらに、 抗体あるいは抗原と標 識剤との結合にピオチン一アビジン系を用いることもできる。
抗原あるいは抗体の不溶化に当っては、 物理吸着を用いてもよく、 また通常 タンパク質あるいは酵素等を不溶化、 固定化するのに用いられる化学結合を用 いる方法でもよい。 担体としては、 ァガロース、 デキストラン、 セルロースな どの不溶性多糖類、 ポリスチレン、 ポリアクリルアミド、 シリコン等の合成樹 脂、 あるいはガラス等があげられる。
サンドイッチ法においては不溶化した抗ポリペプチド抗体に被検液を反応さ せ （1次反応） 、 さらに標識化抗ポリペプチド抗体を反応させ （2次反応） た のち、 不溶化担体上の標識剤の活性を測定することにより被検波中のポリぺプ チド量を定量することができる。 1次反応と 2次反応は逆の順序に行っても、 また、 同時に行なってもよいし時間をずらして行なってもよい。
標識化剤および不溶化の方法は前記のそれらに準じることができる。 また、 サンドイッチ法による免疫測定法において、 固相用抗体あるいは標識用抗体に 用いられる抗体は必ずしも 1種類である必要はなく、 測定感度を向上させる等 の目的で 2種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。
本発明のサンドイッチ法による本発明のポリペプチドまたはその前駆体夕ン パク質の測定法においては、 1次反応と 2次反応に用いられる抗ポリペプチド またはその前駆体タンパク質抗体は本発明のポリべプチドまたはその前駆体夕 ンパク質の結合する部位が相異なる抗体が好ましく用いられる。 即ち、 1次反 応および 2次反応に用いられる抗体は、 例えば、 2次反応で用いられる抗体が 、 本発明のポリペプチドまたはその前駆体タンパク質の C端部を認識する場合 、 1次反応で用いられる抗体は、 好ましくは C末端部以外、 例えば N末端部を 0 L
認識する抗体が用いられる。
本発明のポリぺプチドまたはその前駆体夕ンパク質に対する抗体をサンドィ ッチ法以外の測定システム、 例えば、 競合法、 ィムノメトリック法あるいはネ フロメトリ一などに用いることができる。 競合法では、 被検液中の抗原と標識 抗原とを抗体に対して競合的に反応させたのち、 未反応の標識抗原と（F ) と抗 体と結合した標識抗原 （B ) とを分離し （B Z F分離） 、 B， Fいずれかの標 識量を測定し、 被検液中の抗原量を定量する。 本反応法には、 抗体として可溶 性抗体を用い、 B / F分離をポリエチレングリコール、 前記抗体に対する第 2 抗体などを用いる液相法、 および、 第 1抗体として固相化抗体を用いるか、 あ るいは、 第 1抗体は可溶性のものを用い第 2抗体として固相化抗体を用いる固 相化法とが用いられる。
ィムノメトリック法では、 被検液中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識化 抗体に対して競合反応させた後固相と液相を分離するか、 あるいは、 被検液中 の抗原と過剰量の標識化抗体とを反応させ、 次に固相化抗原を加え未反応の標 識化抗体を固相に結合させたのち、 固相と液相を分離する。 次に、 いずれかの 相の標識量を測定し被検液中の抗原量を定量する。
また、 ネフロメトリーでは、 ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果生 じた不溶性の沈降物の量を測定する。 被検液中の抗原量が僅かであり、 少量の 沈降物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用するレーザーネフロメト リーなどが好適に用いられる。
これら個々の免疫学的測定法を本発明の測定方法に適用するにあたっては、 特別の条件、 操作等の設定は必要とされない。 それぞれの方法における通常の 条件、 操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて本発明のポリペプチド、 そ の前駆体タンパク質またはそれらの部分べプチドの測定系を構築すればよレ ^。 これらの一般的な技術手段の詳細については、 総説、 成書などを参照すること ができる 〔例えば、 入江 寛編 「ラジオィムノアツセィ〕 （講談社、 昭和 4 9 ο 6
年発行） 、 入江 寛編 「続ラジオィムノアツセィ〕 （講談社、 昭和 54年発行 ) 、 石川栄治ら編 「酵素免疫測定法」 （医学書院、 昭和 53年発行） 、 石川栄 治ら編 「酵素免疫測定法」 （第 2版） （医学書院、 昭和 57年発行） 、 石川栄 治ら編 「酵素免疫測定法」 （第 3版） （医学書院、 昭和 62年発行） 、 「Methods in ENZYMOLOGYj Vol. 70 (I誦 unochemical Techniques (Par t A))、 同書 Vol. 73 (Immunochemical Techniques (Part B))、 同書 Vol. 74 (Immunochemical Techniques (Part C)) 、 同書 Vol. 84 (Immunochemical Techniques (Part D:Selected Immunoassays)) ^ 同書 Vol. 92 (Immunochemical Techniques (Part E:Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods))、 同書 Vol. 121 (Immunochemical Techniques (Part I:Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies)) (以上、 アカデミックプレス社発行）など参照〕 。
以上のように、 本発明のポリぺプチドまたはその前駆体夕ンパク質に対する 抗体を用いることによって、 本発明のポリペプチドまたはその前駆体タンパク 質を感度良く定量することができる。
被検波中の本発明のポリぺプチドまたはその前駆体夕ンパク質を定量するこ とによって、 本発明のポリペプチドまたはその前駆体タンパク質が関与する疾 患を診断することができる。 本発明のポリべプチドまたはその前駆体タンパク 質が関与する疾患としては、 例えば、 老人性痴呆、 脳血管性痴呆、 系統変成型 の退行変成疾患 （例：アルツハイマー病、 パーキンソン病、 ピック病、 ハンチ ントン病など） に起因する痴呆、 高 （低） 血圧症、 腎疾患 （例：慢性腎不全、 腎炎など） 、 心疾患 （例：心不全、 急性心筋梗塞など） 、 頻尿、 尿失禁、 難聴 、 嗅覚異常、 視覚異常などの疾病があげられる。 被検液は被検哺乳動物 （例、 ヒト、 ゥサギ、 ヒッジ、 ャギ、 ラット、 マウス、 モルモット、 ゥシ、 ゥマ、 ブ 夕） から自体公知の方法によって調製できる。 被検液としては、 例えば、 血液 、 リンパ液、 尿などがあげられる。
本明細書および図面において、 塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、 I UP AC - I UB Commission on Biochemical Nomenclature による田各号あ るいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、 その例を下記する。 ま たアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、 特に明示しなければ L体を示 すものとする。
DNA ：デォキシリボ核酸
C DNA ：相補的デォキシリボ核酸
A ：アデニン
T ：チミン
G ：グァニン
C ：シ卜シン
Y ：チミンまたはシトシン
N ：チミン、 シトシン、 アデニンまたはグァニン
R ：アデニンまたはグァニン
M ：シトシンまたはアデニン
W ：チミンまたはアデニン
S ：シトシンまたはグァニン
RNA ： リボ核酸
mRNA ：メッセンジャーリボ核酸
dATP ：デォキシアデノシン三リン酸
dTTP ：デォキシチミジン三リン酸
dGTP ：デォキシグアノシン三リン酸
dCTP ：デォキシシチジン三リン酸
ATP ：アデノシン三リン酸
EDTA ：エチレンジァミン四酢酸
SDS ： ドデシル硫酸ナトリウム
TFA ： トリフルォロ酢酸 E I A ：ェンザィムィムノ
G 1 yまたは G ： グリシン
A 1 aまたは A ：ァラニン
Va 1または V ：バリン
Le uまたは L ： ロイシン
I 1 eまたは I ：イソロイシン
S e rまたは S ：セリン
Th rまたは T ：スレ才ニン
Cy sまたは C ： システっン
Me tまたは M ：メチォニン
G 1 uまたは E ： グルタミン酸
As pまたは D ：ァスパラギン酸
L y sまたは K ： リジン
A r gまたは R ：アルギニン
H i sまたは H ： ヒスチジン
Ph eまたは F ： フエ二ルァラニン
Ty rまたは Y ：チロシン
T r pまたは W ： トリブトファン
P r oまたは P ：プロリン
As nまたは N ：ァスパラギン
G 1 nまたは Q ： グルタミン pG 1 u ： ピログルタミン酸
Me ：メチル基
E t ：ェチル基
Bu ：ブチル基
P h ：フエニル基 TC ：チアゾリジン— 4 (R) —カルボキサミド基
Bom ：ベンジルォキシメチル
NMP ： N—メチルピロリ ドン
PAM ：フエ二ルァセ卜アミドメチル
また、 本明細書中で繁用される置換基、 保護基および試薬を下記の記号で表 記する。
To s ： p—トルエンスルフォニル
HONB： N—ヒドロキシ一 5—ノルボルネンー 2， 3—ジカルボキシイミ
H
B z 1 ：ベンジル
Z ：ベンジルォキシカルボニル
B r -Z ： 2—ブロモベンジルォキシカルボニル
C 1 -Z ： 2—クロルべンジルォキシカルボニル
B o c ： t一ブチルォキシカルボニル
HOB t ： 1—ヒドロキシベンズトリアゾール
DCC： Ν、 Ν'—ジシクロへキシルカルポジイミド
TFA： トリフルォロ酢酸
Fmo c ： N— 9—フルォレニルメ卜キシカルボニル
DNP：ジニトロフエニル
Bum：夕一シャリーブトキシメチル
T r t ： トリチル
Me B z 1 ： 4—メチルベンジル
CHO:ホルミル
NMP： N—メチルピロリドン
Oc He X ：シクロへキシルエステル
本願明細書の配列表の配列番号は、 以下の配列を示す。 o 7
〔配列番号： 1〕
ラット SENRタンパク質をコ一ドする cDNAのスクリーニングに使用した合成 DNAを示す。
〔配列番号： 2〕
ラット SENRタンパク質をコ一ドする cDNAのスクリ一ニングに使用した合成 DNAを示す。
〔配列番号： 3〕
5'側に制限酵素 Sal Iの認識する塩基配列が付加され、 また 3'側に制限酵素 Spe Iの認識する塩基配列が付加されたラット SENR夕ンパク質 cDNAの全塩基配列を 示す。
〔配列番号： 4〕
SENR発現 CH0細胞株の各クローンにおける SENRレセプ夕一タンパク質 mRNAの 発現量を測定するために使用した r iboprobeを示す。
〔配列番号： 5〕
ブ夕脊髄から精製された SENRに対するリガンドペプチドの N末端アミノ酸配 列解析の結果から得られたァミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 6〕
ブ夕脊髄から精製された SENRに対するリガンドペプチドの N末端アミノ酸配 列解析の結果から得られたアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 7〕
ブ夕脊髄から精製された SENRに対するリガンドペプチドの N末端アミノ酸配 列解析の結果から決定されたァミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 8〕
ブ夕脊髄から精製された SENRに対するリガンドぺプチドの N末端アミノ酸配 列解析の結果から決定されたァミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 9〕 b o
実施例 2で確認されたラット SENRタンパク質のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 10〕
ブ夕 SENRリガンド前駆体夕ンパク質をコードする cDNAの部分配列を取得する のに使用した合成 DNAを示す。
〔配列番号： 1 1〕
ブ夕 SENRリガンド前駆体タンパク質をコードする cDNAの部分配列を取得する のに使用した合成 DNAを示す。
〔配列番号： 12〕
ブ夕 SENRリガンド前駆体タンパク質の一部をコードする cDNAの塩基配列を示 す。
〔配列番号： 13〕
ブ夕 SENRリガンド前駆体タンパク質をコ一ドする cDNAのスクリ一ニングに使 用した合成 DNAプローブを示す。
〔配列番号： 14〕
ブタ SENRリガンド前駆体タンパク質をコードする cDNAのスクリーニングに使 用した合成 DNAプローブを示す。
〔配列番号： 15〕
ブ夕 SENRリガンド前駆体タンパク質 cDNAの全塩基配列を示す。
〔配列番号： 16〕
ブ夕 SENRリガンド前駆体タンパク質 cDNAの全塩基配列を示す。
〔配列番号： 17〕
ブタ SENRリガンド前駆体夕ンパク質 cDNAの全塩基配列を示す。
〔配列番号： 18〕
ブ夕 SENRリガンド前駆体夕ンパク質の全アミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 19〕
ブタ SENRリガンド前駆体タンパク質の全アミノ酸配列を示す。 b 9
〔配列番号： 20〕
ゥシ SENRリガンド前駆体タンパク質の一部をコードする cDNAの塩基配列を示 す。
〔配列番号： 21〕
ゥシ SENRリガンドペプチドのァミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 22〕
ヒト SENRリガンドポリペプチド （ヒト uro tens in I I ) のアミノ酸配列を示す 〔配列番号： 23〕
ヒト SENRタンパク質をコ一ドする cDNAのスクリーニングに使用した合成 DNA を示す。
〔配列番号： 24〕
ヒト SENRタンパク質をコ一ドする cDNAのスクリーニングに使用した合成 DNA を示す。
〔配列番号： 25〕
5'側に制限酵素 Sai Iの認識する塩基配列が付加され、 また 3'側に制限酵素 Spe Iの認識する塩基配列が付加されたヒト SENRタンパク質 cDNAの全塩基配列を示 す。
〔配列番号： 26)
実施例 20で確認されたヒト SENRタンパク質の全アミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 27〕
配列番号： 8 (ブ夕リガンド 2 ) の D N A配列を示す。
〔配列番号： 28〕
配列番号： 2 1 (ゥシリガンド） の D N A配列を示す。
〔配列番号： 29〕
ゥシ SENRリガンド前駆体タンパク質の全アミノ酸配列を示す。 〔配列番号： 30〕
ゥシ SENRリガンド前駆体夕ンパク質 cDNAの全塩基配列を示す。
〔配列番号： 31〕
ゥシ SENRリガンド前駆体タンパク質をコードする cDXAの 5'側部分配列を取得 するための RACE- PCRに使用した合成 DNAを示す。
〔配列番号： 32〕
ゥシ SENRリガンド前駆体タンパク質をコードする cDXAの 5'側部分配列を取得 するための RACE-PCRに使用した合成 DNAを示す。
〔配列番号： 33〕
ゥシ SENRリガンド前駆体タンパク質をコ一ドする cDXAの 5'側部分配列の塩基 配列を示す。
〔配列番号： 34〕
ゥシ SENRリガンド前駆体タンパク質をコードする cDNAの 3'側部分配列を取得 するための RACE- PCRに使用した合成 DNAを示す。
〔配列番号： 35〕
ゥシ SENRリガンド前駆体夕ンパク質をコードする cDNAの 3'側部分配列を取得 するための RACE-PCRに使用した合成 DMを示す。
〔配列番号： 36〕
ゥシ SENRリガンド前駆体タンパク質をコードする cDN'Aの 3'側部分配列の塩基 配列を示す。
〔配列番号： 37〕
ゥシ SENRリガンド前駆体タンパク質をコードする cDN'Aの全長配列を取得する ために使用した合成 D 'Aを示す。
〔配列番号： 38〕
ゥシ SENRリガンド前駆体タンパク質をコ一ドする cDNAの全長配列を取得する ために使用した合成 を示す。 〔配列番号： 39〕
SENRリガンドポリぺプチドの C末端側を認識する抗体を作製するための抗原 として使用したハゼゥ口テンシン Πペプチドのァミノ酸配列を示す。 後述の実施例 10で得られた配列番号： 15で表される塩基配列を含有する 形質転換体 Escherichia coli XL1 Blue/pZl-puro2 は、 1999年 8月 23日 から通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所 （N I BH) に寄託番号 F ERM BP— 6858として、 財団法人発酵研究所 （ I F O) に 1999年 3 月 18日から寄託番号 I FO 16271として寄託されている。
後述の実施例 10で得られた配列番号： 17で表される塩基配列を含有する 形質転換体 Escherichia coli XL1 Blue/pZ卜 puro5 は、 1999年 8月 23日 から通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所 （N I BH) に寄託番号 F ERM BP— 6859として、 財団法人発酵研究所 （I FO) に 1999年 3 月 18日から寄託番号 I F〇 16272として寄託されている。
後述の実施例 10で得られた配列番号： 16で表される塩基配列を含有する 形質転換体 Escherichia coli XL1 Blue/pZl-puro9 は、 1999年 8月 23日 から通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所 （N I BH) に寄託番号 F ERM B P- 6860として、 財団法人発酵研究所 （ I FO) に 1999年 3 月 18日から寄託番号 I F〇 16273として寄託されている。
後述の実施例 36で得られた配列番号： 36で表される塩基配列を含有する 形質転換体 Escherichia coli T0P10/pCR-buroは、 1999年 11月 8日から通 商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所 （N I BH) に寄託番号 FERM BP— 6932として、 財団法人発酵研究所 （I FO) に 1999年 10月 2 7日から寄託番号 I FO 16332として寄託されている。 実施例 以下に実施例を示して、 本発明をより詳細に説明するが、 これらは本発明の 範囲を限定するものではない。
実施例 1 ラット脳由来 cDNAを用いた PCR法によるラット SENR (=GPR14)受容体 cDNAの増幅
ラット脳由来 poly (A) +RNA (クロ一ンテック社） を铸型とし、 ランダムブラ イマ一を用いて逆転写反応を行なった。 逆転写反応は、 夕カラ RNA PCR ver. 2 キットの試薬を使用した。 次にこの逆転写生成物を铸型として用い、 配列番号 ： 1および 2の合成 DMプライマーを用いて PCR法による増幅を行なった。 合成 DNAプライマ一は受容体蛋白に翻訳される領域の遺伝子が増幅されるように構 築したが、 その際に遺伝子の 5'側に制限酵素 Sal Iの認識する塩基配列が付加さ れ、 また 3'側に制限酵素 Spe Iの認識する塩基配列が付加されるように、 5'側お よび 3'側にそれぞれの制限酵素の認識配列を付加した。 反応液の組成は、 cDNA 铸型 5 mK 合成 DNAプライマー各 1 M、 0. 2 mM dNTPs, 1 mM MgCl KOD (King of DNA) DNAポリメラ一ゼ 1 /z lおよび酵素に付属のバッファーで、 総反応量は 50 lとした。 増幅のためのサイクルはサ一マルサイクラ一 （パーキンエルマ一社 ) を用い、 94°C · 60秒の加熱の後、 94°C · 30秒、 59°C · 30秒、 74°C · 60秒のサ イクルを 35回繰り返した。 増幅産物の確認は、 0. 8%ァガロースゲル電気泳動の 後、 ェチジゥムブ口マイド染色によって行なった。 実施例 2 PCR産物のプラスミドベクターへのサブクローニングおよび挿入 cDNA部分の塩基配列の解読による増幅 cDNA配列の確認
実施例 1で行なった PCR後の反応産物は 0. 8 %の低融点ァガロースゲルを用 いて分離し、 バンドの部分を力ミソリで切り出した後、 細片化、 フエノール抽 出、 フエノ一ル ·クロ口ホルム抽出、 エタノール沈殿を行なって DNAを回収した 。 PCR- Scr ipt™ A即 SK (+)クローニングキット （ストラタジーン社） の処方に従 い、 回収した DNAをプラスミドベクター pCR- Scr ipt Amp SK(+)へサブクロ一ニン グした。 これをェシエリヒア コリ (Escherichia coli) JM109 competent cell (宝酒造） に導入して形質転換した後、 cDNA挿入断片を持つクロ一ンをアンピ シリンおよび X-galを含む LB寒天培地中で選択し、 白色を呈するクローンのみを 滅菌したつま楊枝を用いて分離し、 形質転換体 E. coli JM109/SENRを得た。 個 々のクローンをアンピシリンを含む LB培地で一晩培養し、 QIA prep8 mini prep (キアゲン社） を用いてプラスミド DNAを調製した。 調製した DNAの一部を用い て制限酵素 Sal Iおよび Spe Iによる切断を行ない、 挿入されている受容体 cDNA 断片の大きさを確認した。 塩基配列の決定のための反応は DyeDeoxy Terminator Cycle Sequence Kit (パーキンエルマ一社） を用いて行ない、 蛍光式自動シー ケンサ一を用いて解読した。 得られた 3クローンの配列を解析し全ての配列が報 告されてレ る SENR (sensory epithelial neuropept ide-1 ike receptor)の DNA配 列 （Tal， M. et al. Bioc em. Biophys. Res. Commun. , Vol. 209, pp. 752-759 (1995)) の 5'側に Sal I認識配列が付加し、 3'側に Spe I認識配列が付加した遺伝 子配列と一致することを確認した （図 1および配列番号： 3) 。 なお、 報告さ れている GPR14遺伝子の配列 （Marchese, A. et al. Genomics, vol. 29, pp. 335-344 (1995)) では開始コドンである ATGの Aを 1番目としたとき 945番目が Gで あるが、 SENRの配列および上記で決定した配列では Cである。 実施例 3 SENR発現 CH0細胞の作製
実施例 2で配列が確認されたラッ卜脳由来の SENRの全長アミノ酸配列をコー ドし 5'側に Sal I認識配列が付加し、 また 3'側に Spe I認識配列を付加した遺伝子 が導入されたプラスミ ドによって形質転換された coliのクローンより Plasmid Midi Kit (キアゲン社） を用いてプラスミドを調製し、 制限酵素 Sal I および Spe Iで切断してインサート部分を切り出した。 インサート DNAは電気泳 動後、 ァガロースゲルから力ミソリで切り出し、 次に細片化、 フエノール抽出 、 フエノール ·クロ口ホルム抽出、 エタノール沈殿を行なって回収した。 この インサート DNAを Sal Iおよび Spe Iで切断した動物細胞発現用ベクタープラスミ ド pAKKO- 111H (Hinuma, S. et al. Biochim. Biophys. Acta, Vol. 1219, pp. 251-259 (1994)記載の pAKKOl.11Hと同一のベクタープラスミド） に加え、 T4ラ ィゲ一ス （宝酒造） を用いてライゲーシヨンを行ない、 蛋白発現用プラスミド pAKKO- SENRを構築した。
pAKKO- SENRで形質転換した ^ coH DH5 (ト一ョ一ボー）を培養後、 P 1 asm i d M i d i Kit (キアゲン社） を用いて pAKKO-SENRのプラスミド DNAを調製した。 これを CellPhect Transfection Kit (アマシャムフアルマシアバイオテク社） を用い 添付のプロトコルに従って CHOdhfr—細胞に導入した。 10 /zgの DNAをリン酸カル シゥムとの共沈懸濁液とし、 24時間前に 5 X 105または 1 X 10s個の CHO dhfr細 胞を播種した 10 cmシャーレに添加した。 10%ゥシ胎児血清を含む MEMO;培地で 1 日間培養した後、 継代し、 選択培地である 10%透析ゥシ胎児血清を含む核酸不 含 MEM α培地で培養した。 選択培地中で増殖してくる SENR発現 CH0細胞である形 質転換細胞のコロニー 68クローンを選択した。 実施例 4 全長 SENRレセプタ一夕ンパク質 mRNAの発現量の高い CH0/SENR細胞株 の選択
実施例 3で樹立された CH0/SENR株 68クローンの全長 SENRレセプ夕一タンパク 質 mRNAの発現量を Cytostar T Plate (アマシャムフアルマシアバイオテク社） を用い、 添付のプロトコルに従って以下のように測定した。 CH0/SENR株の各ク ローンを Cytostar T Plateの各 wel 1に 2.5 x 104個ずつ播種して 24時間培養した 後、 10%ホルマリンによって細胞を固定した。 各 wellに 0.25% Triton X- 100を 添加して細胞の透過性をあげた後、 35Sラベルした配列番号： 4の riboprobeを加 えてハイブリダィズさせた。 20 mg/mlの RNaseAを各 wellに加えて遊離の riboprobeを消化し、プレートをよく洗浄した後、ハイブリダィズした riboprobe の放射活性を Topcounterで測定した。 放射活性の高い株が mRNA発現量が高い。 mRNA発現量の高い 2クローン （#36および 61 ) を以下の実験に用いたが、 特にク ローン番号 61を主に用いた。 実施例 5 ブ夕脊髄抽出物に含まれ、 CH0/SENR細胞株から特異的にァラキドン 酸代謝物の遊離を促進する活性の検出
ブ夕脊髄抽出物の高速液体クロマトグラフィー （HPLC) フラクションを以下 に述べる方法で調製した。 東京芝浦臓器㈱より購入した、 処理当日に屠殺して 摘出後は氷冷保存したブ夕脊髄 350 g (10頭分） を細かく切断し、 直ぐに沸騰し た蒸留水 1. 4 1に投じて 10分間煮沸した。 煮沸後、 直ちに氷冷し、 84 mlの酢酸 を加えて終濃度 1. 0 Mとし、 ポリトロン （20, 000 rpm、 6分間） を用いて破砕し た。 破砕液を遠心 （8, 000 rpm> 30分） して上清を取り、 沈殿には 1. 0 M酢酸 1. 4 1を加えて再度ポリトロンによって破砕し、 ー晚攪拌した後、 遠心 （8, 000 rpm 、 30分） して上清を得た。 上清に 2倍量の冷アセトンを 4t:でゆっくり滴下した 後、 1回目の遠心によって得た上清については一晩攪拌し、 2回目の遠心によ つて得た上清については 4時間攪拌した。 アセトンを加えた抽出液は遠心 （ 8, 000 rpm, 30分） して沈殿を除き、 得られた上清からエバポレー夕一によって 減圧化にアセトンを溜去した。 アセトンを除いた抽出液に等量のジェチルェ一 テルを加え、 分液ロートを使って脂質を含むエーテル層を分離して水層を回収 した。 エーテル脱脂した抽出液はエバポレー夕一によって減圧化に濃縮してェ —テルを完全に除去した。 濃縮液をガラス繊維濾紙 （アドバンテック、 DP70 (90 誦 Φ) ) で濾過し、 濾液をガラス製カラム （20 φ X 240 龍） に充填した C18 (ヮ イエムシ一、 YMCgel ODS-AM 120-S50) カラムに添加した。 カラムを 1. 0 M酢酸 300 mlで洗浄後、 0. 1 %トリフルォロ酢酸を含む 60%ァセトニトリル 300 mlで溶 出した。 溶出液を減圧化に濃縮して溶媒を溜去した後、 濃縮液を凍結乾燥した 。 凍結乾燥品約 0. 2 gを 14 mlの 0. 1 %トリフルォロ酢酸を含む 10%ァセトニトリ ルに溶解し、 7 mlずつを C18カラム （1 ^一ソ一、 TSKge l ODS-80™ (21. 5 φ χ 300 mm)) を用いた 10%から 60%の 0.1%トリフルォロ酢酸を含むァセトニトリルの 濃度勾配溶出法による HPLCにかけた。 HPLCは 2回行なった。 溶出液は 60分画に分 取し、 2回分の溶出液をまとめた。 各分画を減圧化に濃縮 ·乾固し、 残渣を 0.35 mlのジメチルスルフォキシド （DMS0) で溶解した。
CH0/SENR細胞および mock CH0細胞を 24穴プレートに 5 x 104 cell/wellで播種 し、 24時間培養後、 [¾]ァラキドン酸を 0.25 Ci/wellとなるよう添加した。 [¾] ァラキドン酸添加 16時間後、 細胞を 0.05% ゥシ血清アルブミン （BSA) を含む ハンクス試液 （HBSS) で洗浄し、 各 we 11に上述の HPLC分画の DMS0溶液 2 μΛ (脊 髄 2 g相当） を加えた 0.05% BSA含有 HBSS 500 xlを添加した。 37°Cで 30分間ィ ンキュペートした後に、 反応液 500 lから 350 1をシンチレ一夕一に加え、 反応中に遊離された [¾]ァラキドン酸代謝物の量をシンチレーシヨンカウン夕 一により測定した。 その結果、 分画番号 33に CH0/SENR細胞特異的なァラキドン 酸代謝物遊離活性が認められた （図 2) 。 図 2中、 ァラキドン酸代謝物の遊離 促進活性は DMS0 2 u lのみを添加したときに遊離された [¾]ァラキドン酸代謝 物の量を 100%として、 HPLCフラクション （2 β\) を加えたときに放出される ァラキドン酸代謝物の量を％として表わした。 分画番号 33に CH0/SENR細胞株に 特異的なァラキドン酸代謝物の遊離を促進する活性が認められた。 分画番号 26 から 29に認められるァラキドン酸代謝物の遊離を促進する活性は mock CH0細胞 にも認められたことから、 CH0/SENR細胞株に特異的なァラキドン酸代謝物の遊 離を促進する活性ではない。 なお、 活性は DMS0のみを添加した対照区のァラキ ドン酸代謝物遊離量に対する百分率で示した。 実施例 6 ブ夕脊髄抽出物中の SENR発現 CH0細胞に対して特異的にァラキドン 酸代謝物遊離活性を示す活性物質のプロナーゼによる失活
実施例 5で CH0/SENR細胞に対するァラキドン酸代謝物遊離活性を示した HPLC 分画 #33を蛋白分解酵素であるプロナ一ゼ （Sigma, protease Type XIV (P5147) ) で処理し、 活性物質が蛋白性であるかを調べた。
上記脊髄抽出物 HPLC分画 （#33) 4 i lを 0. 2 M酢酸アンモニゥム 200 1に加 え、 これにプロナ一ゼ 3 を添加して で 2時間インキュベートした後、 沸 縢水中で 10分間加熱してプロナーゼを失活させた。 これに BSA 0. 05mgおよび CHAPS 0. 05 mgを含む蒸留水 2 mlを加えてから凍結乾燥した。 プロナ一ゼそのも のあるいは加熱および凍結乾燥の影響を調べるため、 プロナーゼのみ、 HPLC分 画のみおよびプロナ一ゼのみを加熱処理した後に HPLC分画を加えたものについ ても同様に処理して凍結乾燥した。 凍結乾燥した各試料を 0. 05 % BSA含有 HBSS 500 /z lに溶解し、 実施例 5に示す方法によって CH0/SENR細胞に添加してァラキ ドン酸代謝物遊離活性を測定した。 結果を図 3に示した。 活性は 0. 05 % BSA含有 HBSS 500 1を加えた we l lのァラキドン酸代謝物遊離量に対する百分率で示し た。 ブ夕脊髄抽出物中の CH0/SENR細胞に対するァラキドン酸代謝物遊離活性を 示す活性物質はプロナ一ゼによって完全に失活したことからこの物質が蛋白も しくはペプチドであることが示された。 実施例 7 ブ夕脊髄からの SENR発現 CH0細胞に対して特異的にァラキドン酸代 謝物遊離活性を示す活性物質の精製
CH0/SENR細胞に対して特異的にァラキドン酸代謝物遊離活性を示す活性物質 をブ夕脊髄から精製した代表例を以下に具体的に述べる。 東京芝浦臓器㈱より 購入した、 処理当日に屠殺して摘出後は氷冷保存したブ夕脊髄 1. 0 kg (50頭分 ) を 40 mM塩酸および 1. 0 M酢酸を含む 70 %アセトン 10 1中でポリトロン （20, 000 rpm、 10分間） を用いて破砕した。 破砕液を遠心 （8, 000 rpm、 30分） して上清 を取り、 沈殿には再度 40 mM塩酸および 1. 0 M酢酸を含む 70 %アセトン 10 1を加 えてポリトロンによって破碎し、 一晩攪拌した後、 遠心 （8, 000 rpm、 30分） し て上清を得た。 上清をまとめ、 エバポレーターによって減圧化にアセトンを溜 去した。 アセトンを除いた抽出液に等量のジェチルエーテルを加え、 分液口一 7 o
トを使って脂質を含むエーテル層を分離して水層を回収した。 エーテル脱脂し た抽出液はエバポレーターによって減圧化に濃縮してエーテルを完全に除去し た。 濃縮液をガラス繊維濾紙 （アドバンテック、 DP70 (90 ππιφ ) ) で濾過し、 濾液の半量をガラス製カラム （30 Φ X 240 mm) に充填した C18 (ヮイエムシ一 、 YMCgel ODS-AM 120-S50) カラムに添加した。 カラムを 1. 0 M酢酸 400 mlで洗 浄後、 0. 1 %トリフルォロ酢酸を含む 60%ァセトニトリル 500 mlで溶出した。 溶 出液を減圧化に濃縮して溶媒を溜去した後、 濃縮液を凍結乾燥した。 残りの半 量についても同様に処理し、 凍結乾燥した。 合計約 1. 9 gの凍結乾燥品を 60 ml の 0. 1 %トリフルォロ酢酸を含む 10%ァセトニトリルに溶解し、 10 mlずつを C18 カラム （1 ソー、 TSKgel ODS-80TS (21. 5 φ χ 300 mm) ) を用いた 10%から 60 %の 0. 1 %トリフルォロ酢酸を含むァセトニトリルの濃度勾配溶出法による HPLCにかけた。 HPLCは 6回行ない、 溶出液は 60分画に分取して 6回分をまとめた 。 各分画について実施例 5に示す方法によって SENR発現 CH0細胞に添加してァラ キドン酸代謝物遊離活性を測定した。 活性は分画 #31および #32に認められた。 これらの分画 #31 (①） および #32 (②） を別々に以下に示すような同一のェ 程で精製した。 それぞれの活性分画を減圧化に濃縮して溶媒を除いた後、 凍結 乾燥した。 これを 10%ァセトニトリルを含む 10 mMギ酸アンモニゥム 10 mlに溶 解し、 陽イオン交換カラム （トーソ一、 TSKgel SP-5PW (20 ιηιηφ χ 150 mm) ) に添加した後、 10%ァセトニトリルを含む 10 mMから 300 mMのギ酸アンモニゥム の濃度勾配によってカラムを溶出した。 ①および②のいずれについても活性は ギ酸アンモニゥム 140 mM付近に回収された。 活性分画を凍結乾燥し、 0. 1 %トリ フルォロ酢酸を含む 10%ァセトニトリル 1. 0 mlに溶解し、 0. 5 mlずつをジフエ 二ルカラム （セパレーシヨングループ、 Vydac 219- TP54) に添加した後、 0. 1 % トリフルォロ酢酸を含む 26%から 31 %のァセ卜二トリルの濃度勾配によって溶 出した。 HPLCは 2回行ない、 溶出液は 2回分をまとめて分取した。 活性は①がァ セトニトリル 27. 1 %付近、 ②が 27. 6%付近に出現した。 それぞれの活性分画を 凍結乾燥し、 0.1 mlの DMSOで溶解し、 さらに 0.4 mlの 0.1 %トリフルォロ酢酸を 含む 10%ァセトニトリルを加えて CNカラム （野村化学、 Develosil CN-UG-5) に 添加した後、 0.1%トリフルォロ酢酸を含む 28.5%から 33.5%のァセトニトリル の濃度勾配によって溶出した。 溶出液はピーク毎に手動で分取した。 活性は① がァセトニトリル 29.7%付近、 ②が 29.9%付近に溶出された （図 4、 5) 。 これ らの活性ピークを含む溶出液を蒸留水で約 2倍に希釈し、 0DSカラム （和光純薬 、 Wakosil-II 3C18HG) に添加した後、 0.1 %ヘプ夕フルォロ酪酸を含む 30%か ら 35%のァセトニトリルの濃度勾配によって溶出した。 活性は①がァセトニト リル 32.2%付近、 ②が 32.5%付近にそれぞれ単一ピークとして出現した （図 6 、 7) 。 実施例 8 ブ夕脊髄から精製された SENR発現 CH0細胞に対して特異的にァラキ ドン酸代謝物遊離活性を示す活性物質のアミノ酸配列の決定
実施例 7で精製された CH0/SENR細胞に対して特異的にァラキドン酸代謝物遊 離活性を示す活性物質のアミノ酸配列解析を行なった。 本活性物質は実施例 6 に示すように蛋白またはべプチドであることが推定されていたので、 活性ピ一 クを含む溶出液を用いてパ一キンエルマ一社 Procise 494 Protein Sequencerに よってァミノ末端アミノ酸配列分析を行なった。 その結果、 配列番号： 5および 6に示す配列が得られた。 6残基目と 11残基目にはアミノ酸が検出されなかった 。 そこで、 活性物質②についてトリブチルフォスフィンと 4-ビニルピリジンを 用いて還元ノピリジルェチル化を行なった後、 配列分析を行なったところ 11残 基目には依然としてァミノ酸が検出されなかつたが、 6残基目はピリジルェチル システィンが検出された。 これにより、 活性物質②の 6残基目および 11残基目は システィンであり、 これら 2つの Cys残基は分子内ジスルフィ ド結合を形成して いることが推定された。 類似した構造を有する活性物質①も同様に 6残基目およ び 11残基目はシスティンであり、 これら 2つの Cys残基は分子内ジスルフィド結 合を形成していることが推定された。 以上より、 2つの活性物質の推定アミノ 酸配列として配列番号： 7および 8が決定された。
実施例 9 PCR法によるブ夕 SENRリガンド前駆体タンパク質の部分配列の取得 ブ夕ゲノム DNA (クロンテック社）を铸型に GenBankデータベースに登録されて いるヒト urotensin II (Coulouarn, Y. et al. Pro atl. Acad. Sci. USA, vol. 95, pp. 15803-15808 (1998)) 前駆体タンパク質の一部をコードする塩基配列 (accession No. AA535545) の部分配列である配列番号： 10および 11の primer を用いて PCR反応を行なった。反応液の組成は、合成プライマー各 1 M、铸型 DNA 500 ng、 0.2 mM dNTPs、 ExTaq DNA polymerase (宝酒造） 1.25 unitおよび酵素 に付属の緩衝液で総反応液量は 20 //1とした。 増幅のためのサイクルは、 サーマ ルザイクラ一 （パーキンエルマ一社） を用い、 94で ' 4分、 の後、 94 30秒、 60T: · 30秒、 72°C · 15秒のサイクルを 2回、 94 · 30秒、 55 · 30秒、 .15 秒のサイクルを 4回、 94 · 30秒、 52.5°C · 30秒、 72°C · 15秒のサイクルを 6回 、 94T: · 30秒、 50 · 30秒、 72で · 15秒のサイクルを 30回繰り返した。 増幅産 物の確認は 1.5%ァガロース電気泳動及びェチジゥムブ口マイド染色によって行 なった。 得られた反応液 2 1を T0P0 TA cloning kit (インビトロジェン社） を 用いてプラスミドベクタ一 per IIへサブクロ一ニングし、 大腸菌 DH5aへ導入し た。 生じた形質転換体から QIA prep8 mini prep (キアゲン社） を用いてプラス ミド DNAを精製した。 塩基配列決定のための反応は DyeDeoxy Terminator Cycle Sequence Kit (パーキンエルマ一社） を用いて行ない、 蛍光式自動シーケンサ —を用いて解読した。 その結果、 ブタ脊髄より精製された SENRリガンドポリべ プチドの部分配列を含むブ夕 SENRリガンド前駆体 cDNAの一部と考えられる塩基 配列 （配列番号： 12) を得た。 この配列をプローブとして実施例 10に記載し たブ夕脊髄 cDNAライブラリ一のスクリーニングを行なった。 o 1
実施例 10 ブ夕脊髄 cDNAライブラリーから得られた SENRリガンド前駆体夕 ンパク質全コ一ド領域を含む cDNAの配列決定
ブ夕脊髄より I s ogen (二ツボンジーン社）により 101 a 1 RNAを調製後、 Oligotex (dT)30 (宝酒造社）を用いて poly (A) + RNA画分を調製した。 この poly (A)+ RNA 2 から Superscript Lamda System for cDNA Synthesis and λ cloning kit ( ギブコ BRL社）を用い、 マニュアルにしたがって λΖίρΙοχ Not I /Sal I Armに cDNA を導入し、 Gigapack III Gold (ストラタジーン社）を用いてパッケージングす ることでブ夕脊髄 cDNAライブラリ一を作成した。このうち 1.6x 106pfu (plaque forming unit) を大腸菌 Y1090ZLと混合し、 37 :で 15分間インキュベートした後 、 0.7%ァガロース （FMC社） LBを加え、 1.5%寒天 LBプレート 121枚に蒔いた。 プレートにニトロセルロースフィルターを置き、 プラークを転写した。 このフ ィル夕一をアルカリ処理することで変性させた後、 中和、 乾燥し、 254 nmの紫 外線を照射して 80 ：で 30分間加熱することで DNAの固定を行なった。 このフィル 夕一を 1 mM EDTA、 7¾ SDSおよび BSAを含む 0.5 Mリン酸中で 45°Cで 4時間イン キュペートした後、 以下に述べるプローブと 16時間インキュベートしてハイブ リダィズした。 プローブは、 実施例 9で得られた配列から正鎖として配列番号： 13およびこの配列と一部相補する逆鎖である配列番号： 14を選んで委託合成 （ 日本バイオサービス社） した。 これらを 70°Cで変性させた後、 徐々に冷却して 互いにハイブリダィズさせ、 [32P]dCTP (デュポン社） 存在下で Kl enow酵素を用 いて放射標識した。 さらに、 Nick カラム （アマシャムフアルマシアバイオテク 社） で精製し、 1, 000, 000 cpm/mlの濃度でハイブリダィズに用いた。 洗浄は 0.1 SDSを含む 0.2 X SSC (二ツボンジーン社製 20 x SSCを希釈） 溶液で室温で 4回、 続いて 65でで 2回行なった。 その後、 -80°Cでォ一トラジオグラフィーを行なつ てハイブリダィズするプラークを検出した。 このスクリーニングにより 9個の独 立したプラークにハイブリダィゼ一シヨンのシグナルが認められた。 これらの 陽性フラ—クから Superscript Lamda System for cDNA Synthesis and λ c loning ki t (ギブコ BRL社） のマニュアルにしたがって in vivo exc i s ion法で 目的のブタ SENRリガンド前駆体 cDNAを含むプラスミ ドを切り出し、 大腸菌 XLlBlueをトランスフォーメーションした。この大腸菌から QIA prep8 mini prep (キアゲン社）を用いてプラスミド DNAを精製した。 塩基配列決定のための反応 は、 DyeDeoxy Terminator Cyc le Sequence Ki t (パーキンエルマ一社） を用い て行ない、 蛍光式自動シーケンサーを用いて解読した。 その結果、 ブ夕 SENRリ ガンド前駆体タンパク質の全配列をコードする 3種類の塩基配列 （配列番号： 15 、 16および 17) が得られた。 配列番号： 15では、 翻訳開始コドン ATGの Aを 1番 目としたとき 129番目の塩基が Tであり配列番号： 16では Cであるが、 翻訳された アミノ酸はともに Asp (GAT, GAC)であり同一である。 配列番号： 17は、 配列番 号： 15の、 翻訳開始コドン ATGの Aを 1番目とすると 101番目の Cから 208番目の Gま でが欠失したスプライシングバリアントであった。 対応するァミノ酸配列は、 配列番号： 15および 16に対して配列番号： 18、 配列番号： 17に対して配列番号 ： 19である。 いずれの前駆体タンパク質もブ夕 SENRリガンド② （配列番号： 8) の前駆体であった。 図 8にブ夕 SENRリガンド前駆体の DNA配列 （配列番号： 15) および対応するアミノ酸配列 （配列番号： 18) を示す。 実施例 1 1 PCR法によるゥシ SENRリガンド前駆体タンパク質の部分配列の 決定
ゥシゲノム DNA (クロンテック社）を铸型に、 実施例 9で用いた配列番号： 10お よび 11の pr imerを用いて PCR反応を行なった。 反応液の組成は、 合成プライマー 各 0. 5 / M、 铸型 DNA 500 ng、 0. 2 mM dNTPs、 2. 5 mM MgCl2、 Am l iTaq Go ld DNA polymerase ひ°一キンエルマ一社） 0. 2 ^ 1および酵素に付属の緩衝液で総反応 液量は 20 1とした。 増幅のためのサイクルは、 サーマルサイクラ一 （パーキン エルマ一社） を用い、 95で · 9分の後、 94 · 15秒、 60°C · 20秒、 72で · 20秒の サイクルを 2回、 94 · 15秒、 55°C · 20秒、 72°C · 20秒のサイクルを 4回、 94 • 20秒、 52.5°C · 20秒、 72で · 20秒のサイクルを 6回、 94°C · 20秒、 50で .20秒 、 72°C · 20秒のサイクルを 8回、 94°C · 30秒、 48で · 20秒、 °C .20秒のサイク ルを 30回繰り返した後、 72 * 5分保温した。 増幅産物の確認は 1.5%ァガ口一 ス電気泳動及びェチジゥムブ口マイド染色によって行なった。 得られた反応液 2 lを T0P0 TA cloning kit (インビトロジェン社）を用いてプラスミドベクタ一 per 2.1へサブクロ一ニングし、 大腸菌 TOP10へ導入した。 生じた形質転換体か ら QIA prep8 mini prep (キアゲン社）を用いてプラスミド DNAを精製した。 塩基 配列決定のための反応は DyeDeoxy Terminator Cycle Sequence Kit (パーキン エルマ一社） を用いて行ない、 蛍光式自動シーケンサ一を用いて解読した。 そ の結果、 PCR産物として、 ブ夕 SENRリガンド前駆体の配列と類似することからゥ シ SENRリガンド前駆体の一部であると考えられる配列番号： 20が得られた。 配 列番号： 11のプライマーはリガンドペプチドの一部をコードする塩基配^であ るが、 ブ夕 SENRリガンドのアミノ酸配列と比較することにより、 ゥシ SENRリガ ンドとして配列番号： 21が決定された。 実施例 12 ブ夕 SENRリガンド①： Gly-Pro-Thr-Ser-Glu-Cys-Phe-Trp-Lys- Tyr-Cys-Val (配列番号： 7) の製造
市販 Boc-Va卜 0CH厂 PAM樹脂 (0.77 m mole/g resin) 0.5 m mole 分をペプチド 合成機 ABI 430Aの反応槽に入れ、 Boc- strategy (NMP-HOBt) ペプチド合成方法 で Boc- Cys(MeBzl), Boc-Tyr (Br-Z), Boc-Lys (Cl-Z), Boc-Trp(CHO), Boc-Phe, Boc-Cys(MeBzl), Boc-Glu(OcHex), Boc-Ser (Bzl), Boc-Thr (Bzl), Boc- Pro, Boc-Gly,を順に導入し目的の保護ペプチド榭脂を得た。 この樹脂 0.59gを P- クレゾール 2.22 g、 1, 4 -ブタンジチオール 1.2 mlと共に無水弗化水素 10 ml中、 O : - 60分撹拌した後、 弗化水素を減圧留去し、 残留物へジェチルエーテル を加え沈殿を濾過した。 この沈殿に 50%酢酸水を加え抽出し、 不溶部分を除 き、 抽出液を十分に濃縮後、 50%酢酸水で充填したセフアデックス G- 25 (商 品名） カラム （2.0 x 80 cm)に付し、 同溶媒で展開、 主要画分を集め LiChroprep (商品名） RP- 18を充填した逆相クロマトカラム （2.6 X 60 cm)に付け 0.1¾TFA 水 200mlで洗浄、 0. 水 300mlと 0.1%TFA含有 40%ァセトニトリル水 300mlを用いた線型勾配溶出を行い、 主要画分を集め濃縮した。 此れを約 4m l の酢酸に溶解し、 蒸留水で 240m 1に希釈の後、 アンモニア水を用い pH7.5に調 整し、 緩やかに空気を吹込み攪拌した。 反応を HPLCで追跡し、 SH体ペプチドの ピークがすべて SS体に変化した事を確認後、 酢酸を加え溶液の pHを 3に調整し 、 上記 LiChroprep (商品名） RP- 18カラムに吸着した。 カラムを 0.1CTFA水 200mlで洗浄後、 0. TFA水 300mlと 0.1%TFA含有 50%ァセトニトリル水 300ml を用いた線型勾配溶出を行い、 主要画分を集め、 凍結乾燥し白色粉末 1 7mg を得た。
質量分析による（M+H)+ 1417.4(計算値 1417.6)
HPLC溶出時間 1 9. 0分
カラム条件
カラム Wakosil 5C18T 4.6 x 100mm
溶離液： A液一 0. TFA水、 B液 _0.1%TFA含有ァセトニトリルを用い A/B ： 95/5〜45/55へ直線型濃度勾配溶出 （ 2 5分）
流速： 1.0 ml /分 実施例 1 3 ブ夕 SENRリガンド②： Gly- Pro- Pro- Ser- Glu-Cys- Phe- Trp- Lys- Tyr-Cys-Val (配列番号： 8) の製造
実施例 12の Thrを Proに変えて導入し、 実施例 12と同様に樹脂からの切り出し 、 SHペプチドの精製、 酸化、 SSペプチドの精製を行い、 白色粉末 1 5mgを得 た。
質量分析による（M+H)+ 1413.4(計算値 1413.4)
HPLC溶出時間 1 9. 3分 カラム条件
カラム Wakosil 5C18T 4.6 x 100mm
溶離液： A液— 0.1¾ TFA水、 B液— 0. TFA含有ァセトニトリルを用い A/B ： 95/5〜45/55へ直線型濃度勾配溶出 （25分）
流速： 1.0 ml /分 実施例 14 ゥシ SENRリガンド： Gly-Pro-Pro-Ser-Glu-Cys-Phe-Trp-Lys-Tyr- Cys-Val (配列番号： 21) の製造
実施例 12の Thrを Serに変えて導入し、 実施例 12と同様に樹脂からの切り出し 、 SHペプチドの精製、 酸化、 SSペプチドの精製を行った。
質量分析による（M+H)+ 1403.5 (計算値 1403.6)
HPLC溶出時間 18. 8分
カラム条件
カラム Wakosil 5C18T 4.6 x 100mm
溶離液： A液— 0. \% TFA水、 B液— 0.1%TFA含有ァセトニ卜リルを用い A/B ： 95/5〜45/55へ直線型濃度勾配溶出 （25分）
流速： 1.0 ml / 分 実施例 1 5 ヒ hSENR Uガンド ： Glu-Thr-Pro-Asp-Cys-Phe-Trp-Lys-Tyr-Cys- Val (ヒト urotensin II、 配列番号： 22) の製造
ヒト SENRリガンド （配列番号： 22) はヒト urotensin IIとして報告されてい る (Coulouarn, Y. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 95, pp. 15803-15808 (1998)) ペプチドと同一である。
巿販 Boc- Va卜 0CH2- PA樹脂 (0.77 m mole/g resin) 0.5 m mole 分を用い実施 例 12と同様に Boc-Cys(MeBzl), Boc-Tyr (Br-Z), Boc-Lys (Cl-Z), Boc-Trp(CHO), Boc-Phe, Boc-Cys(MeBzl), Boc-Asp(OcHex), Boc-Pro, Boc-Thr (Bzl), O D
Boc-Glu(OcHex)を順に導入した。 この樹脂を実施例 12と同様に処理し、 ぺプチ ドの切り出し、 酸化した後精製した。
質量分析による（M+H)÷ 1388.4 (計算値 1388.6)
HPLC溶出時間 19. 0分
カラム条件
カラム Wakosil 5C18T 4.6 x 100mm
溶離液： A液一 0. \% TFA水、 B液—0.1%TFA含有ァセトニトリルを用い A/B ： 95/5〜45/55へ直線型濃度勾配溶出 （25分）
流速： 1.0 ml /分 実施例 16 合成ブ夕 SENRリガンドボリぺプチドの CH0/SENR細胞株に対するァ ラキドン酸代謝物遊離促進活性
実施例 12および 13で合成した種々の濃度の SENRリガンドポリべプチド①ぉよ び② （配列番号： 7および： 8) が示す SENR発現 CH0細胞に対するァラキドン酸代 謝物放出活性を以下の方法により測定した。 CH0/SENR細胞を 24穴プレートに 5 x 104 cell/wellで播種し、 24時間培養後、 [¾]ァラキドン酸を 0.25 Ci/wellとな るよう添加した。 [¾]ァラキドン酸添加 16時間後、細胞を 0.05 ゥシ血清アルブ ミン （BSA) を含むハンクス試液 （HBSS) で洗浄し、 各 we 11に種々の濃度の合成 SENRリガンドポリペプチドを加えた 0.05% BSA含有 HBSS 500 1を添加した。 37 °Cで 30分間インキュベートした後に、 反応液 500 ^から 350 1をシンチレ一 夕一に加え、反応中に遊離された [ ]ァラキドン酸代謝物の量をシンチレーショ ンカウンタ一により測定した。 その結果、 SENRリガンドポリペプチド①および ② （配列番号： 7および： 8) のいずれについてもペプチドの濃度依存的にァラ キドン酸代謝物の培地中への放出が確認された。 （図 9) 。 なお、 活性はバッフ ァーのみを添加した対照区のァラキドン酸代謝物遊離量に対する百分率で示し た。 また、 同様の活性はゥシ SENRリガンド （配列番号： 21) あるいはヒト SENR O ί
リガンド （ヒト urotensin II) (配列番号： 22) を使用しても確認された。 実施例 1 7 合成ブ夕 SENRリガンドポリペプチドの麻酔下ラッ卜の血圧に対す る作用
実施例 12および 13で合成した種々の濃度の SENRリガンドボリぺプチド①ぉよ び② （配列番号： 7および： 8) の麻酔下ラッ卜の血圧に対する作用を以下の方 法により測定した。 8- 9週齢の雄性 Wistar rat (日本クレアより購入） をネンブ タール注射液 (大日本製薬、 50 mg/ml sodium pentobarbital 50 mg/kg腹腔内 投与） により麻酔し、 トランスデューサ一に接続した血圧測定用カテーテル （ SP-55) を左類動脈に、 静脈投与用カテーテル （SP- 35) を左大腿静脈にそれぞ れ揷入した。合成 SENRリガンドは 0.05% BSAを含む生理的食塩水に溶解し、 1, 10, 100 nmol/kgとなるように左大腿静脈より投与した。 血圧は連続してポリグラフ (NEC三栄社製） で記録した。 ラット血圧は用量依存的に低下し、 SENRリガンド ポリべプチドはラットに対して降圧作用を示した。ブ夕 SENRリガンド 10 nmo 1 /kg 投与時のラット血圧 （麻酔下） に対する降圧作用を表 1に示す。 なお、 降圧作用 は投与前の平均血圧に対して SENRリガンド投与によって低下した平均血圧の値 で示した。 また、 同様の活性はゥシ SENRリガンド （配列番号： 21) あるいはヒ ト SENRリガンド （ヒト urotensin II) (配列番号： 22) を使用しても確認され た。 これらのペプチドの降圧作用を表 1に示した。
表 1 ラット血圧
成ゥシ SENRリガン
Figure imgf000090_0001
urotensin II) の降圧作用 投与量 個体数 低下した平均血圧
(10 nmol/kg) (fflmHg, 平均値士標準誤差）
ブ夕 SENRリガンド① 10 34.3 ± 4· 6
ブ夕 SENRリガンド② 10 35.3 ± 3.1
ゥシ SENRリガンド 10 35.7 ± 7.0
ヒト SENRリガンド 10 35.1 ± 5.7 実施例 18 合成ブ夕 SENRリガンドポリべプチドのラット胸部大動脈に対する 収縮作用
実施例 13で合成した種々の濃度の SENRリガンドポリペプチド② （配列番号： 8 ) のラット胸部大動脈に対する作用を以下の方法により測定した。 9-12週齢の 雄性 Wistar rat (日本チヤ一ルスリバ一より購入） をネンブタール注射液 （大 日本製薬、 50 mg/ml sodium pentobarbital, 50 mg/kg腹腔内投与） により麻酔 し、 腹部大動脈より全採血して失血死させた。 このラットより胸部大動脈を摘 出し、 幅 5 mmのリング標本を作製した。 標本を混合ガス （95% 02-5¾ C02) を通 気して 37°Cに保温した Krebs- Henseleit溶液 (NaCl 118 mM、 C1 4.7 mM、 CaCl2 2.5 mM、 KH2P04 1.2 mM、 NaHC03 25 mM、 MgS04 1.2 mM、 glucose 10.0 mM) 3 ml を満たしたオーガンバス中に懸垂し、 等尺性収縮張力を微小荷重変換器 （UL - 10GL ミネベア社） を介してポリグラフ （NEC三栄社） で記録した。 静止張力は 約 0.5 gとした。 内皮の存在は、 10_6 M norepinephrine投与によって惹起した収 縮が 10—5 M acetylcholi ne投与によつて弛緩することを観察することによって確 認した。 ブ夕 SEN'Rリガンドポリペプチドは終濃度 10— '° - 10"7 Mとなるように累 積投与した。 ラット胸部大動脈リング標本は SENRリガンドの添加によって図 10 に示すように用量依存的に収縮した。 また、 同様の活性はブ夕 SENRリガンド① (配列番号： 7) 、 ゥシ SENRリガンド （配列番号： 21) あるいはヒト SEN'Rリガン ド （ヒト urotens in I I) (配列番号： 22) を使用しても確認された。 実施例 1 9 ヒト骨格筋由来 cDNAを用いた PCR法によるヒト SENR(=GPR14)受容 体 cDNAの増巾;
ヒト骨格筋由来 cDNA (クロンテック社） を铸型として用い、 配列番号： 23お よび 24の合成 DMプライマ一を用いて PCR法による増幅を行なった。 合成 DNAプラ イマ一は受容体蛋白に翻訳される領域の遺伝子が増幅されるように構築したが 、 その際に遺伝子の 5'側に制限酵素 Sal Iの認識する塩基配列が付加され、 また 3'側に制限酵素 Spe Iの認識する塩基配列が付加されるように、 5'側および 3'側に それぞれの制限酵素の認識配列を付加した。 反応液の組成は、 cDNA铸型 2. 、 合成 DNAプライマー各 0. 2 i M、 0. 2 mM dNTPs、 Advantage2 po lymerase mix ( クロンテック社） 1 1および酵素に付属のバッファ一で、 総反応量は と した。 増幅のためのサイクルはサーマルサイクラ一 （パーキンエルマ一社） を 用い、 95°C · 60秒の加熱の後、 95°C · 30秒、 72°C · 3分のサイクルを 5回繰り返 し、 その後、 95°C · 30秒、 70°C · 3分のサイクルを 5回繰り返し、 さらに、 95 • 30秒、 68で · 3分のサイクルを 20回繰り返して最後に 68°C · 3分の加熱を行な つた。 増幅産物の確認は、 0. 8%ァガロースゲル電気泳動の後、 ェチジゥムブ口 マイド染色によって行なった。 実施例 2 0 PCR産物のプラスミドベクターへのサブクローニングおよび挿入 cDNA部分の塩基配列の解読による増幅 cDNA配列の確認
実施例 19で行なった PCR後の反応産物は 0. 8 %の低融点ァガロースゲルを用い て分離し、 バンドの部分を力ミソリで切り出した後、 GENECLEAN SPIN (バイオ 1 0 1社） を用いて D'Aを回収した。 Eukaryotic TOPO™ TA Cloning kit (イン ビトロゲン社） の処方に従い、 回収した DNAを動物細胞発現用プラスミドベクタ —— pcDNA3.1/V5/Hisへクローニングしてタンパク発現用プラスミド pcDNA3.1- hSENRを構築した。 これをェシエリヒア コリ (Escherichia coli) DH5 co即 etent cell (東洋紡） に導入して形質転換した後、 cDNA挿入断片を持つク ローンをアンピシリンを含む LB寒天培地中で選択し、 滅菌したつま楊枝を用い て分離して形質転換体 coH DH5a/pcDNA3.1- hSENRを得た。 個々のクロ一ン をアンピシリンを含む LB培地でー晚培養し、 Quiawell 8 Ultra Plasmid kit ( キアゲン社） を用いてプラスミド DNAを調製した。 調製した DNAの一部を用いて 制限酵素 Sal Iによる切断を行ない、 揷入されている受容体 cDNA断片の大きさお よび方向性を確認した。 塩基配列の決定のための反応は DyeDeoxy Terminator Cycle Sequence Kit (パーキンエルマ一社） を用いて行ない、 蛍光式自動シー ケンサ一を用いて解読した。 得られたクローンの配列を解析し、 全ての配列が 報告されているヒ卜 GPR14 (=SENR)遺伝子 (EP 0859052 A1) の配列の 5'側に Sal I認識配列が付加し、 3'側に Spe I認識配列が付加した遺伝子配列と一致すること を確認した （配列番号： 25および 26) 。 ただし、 配列番号： 25のヒ卜 SENR遺伝 子の配列中 1133番目の塩基は該報告 （EP 0 859 052 A1) では Cと記載されてい るが、 本実施例で決定した配列では Gであった。 いずれの塩基についても翻訳さ れたアミノ酸は同一である。 実施例 2 1 ヒト SENR発現 CH0細胞の作製
実施例 20で作製した形質転換体 E. coli DH5a/pcDM3.1- hSENRを培養後、 Plasmid Midi Kit (キアゲン社） を用いて pcDNA3.卜 hSENRのプラスミド DNAを調 製した。 これを CellPhect Transfection Kit (アマシャムフアルマシアバイオ テク社）を用い添付のプロトコルに従って CHO dhfr—細胞に導入した。 lO tgの DNA 9 I
をリン酸カルシウムとの共沈懸濁液とし、 24時間前に 5 X 105または 1 X 個の CHOdhfr—細胞を播種した 10 cmシャーレに添加した。 10%ゥシ胎児血清を含む MEM ひ培地で 1日間培養した後、 継代し、 選択培地である 0.4 mg/mlの G418 (ギブコ BRL社） および 10%透析ゥシ胎児血清を含む MEM α培地で培養した。 選択培地中で 増殖してくるヒト SENR発現 CH0細胞である形質転換細胞 （CHO/hSENR) のコロニ 一を選択した。 実施例 2 2 合成ヒト SENRリガンドポリペプチド （ヒト urotensin II) の CHO/hSENR細胞株に対するァラキドン酸代謝物遊離促進活性
実施例 15で合成した種々の濃度のヒト SENRリガンドポリぺプチド （ヒ卜 urotensin II) (配列番号： 22) が示すヒト SENR発現 CH0細胞に対するァラキド ン酸代謝物放出活性を以下の方法により測定した。 CHO/hSENR細胞を 24穴プレー トに 5 X 104 cell/wellで播種し、 24時間培養後、 [¾]ァラキドン酸を 0.25 Ci/wellとなるよう添加した。 [¾]ァラキドン酸添加 16時間後、 細胞を 0.05% ゥ シ血清アルブミン （BSA) を含むハンクス試液 （HBSS) で洗浄し、 各 wellに種々 の濃度の合成ヒト SENRリガンドポリペプチドを加えた 0.05% BSA含有 HBSS 500 1を添加した。 37°Cで 30分間インキュベートした後に、 反応液 500 1から 350 ilをシンチレ一夕一に加え、 反応中に遊離された [¾]ァラキドン酸代謝物の量 をシンチレ一シヨンカウン夕一により測定した。 その結果、 ヒト SENRリガンド ポリペプチド （ヒト urotensin 〖I、 配列番号： 22) のペプチドの濃度依存的に ァラキドン酸代謝物の培地中への放出が確認された （図 11) 。 なお、 活性はバ ッファーのみを添加した対照区のァラキドン酸代謝物遊離量に対する百分率で 示した。 また、 同様の活性はブ夕 SENRリガンド （配列番号： 7および 8) および ゥシ SENRリガンド （配列番号： 21) を使用しても確認された。 実施例 23 ゥシ SENRリガンドが誘起する SENR発現 CH0細胞膜画分への GTPrS 結合活性の測定
ゥシ SENRリガンド （配列番号： 21) の ゥシ SENR発現 CH0細胞膜画分に対する [35S] -guanos ine 5'- (了- thio) triphosphateの結合促進活性を以下の方法により 測定した。 最初に膜画分の調製法を記載する。 1 X 108個の CH0/SENR細胞に 10 ml のホモジネートバッファー （10 mM NaHC03, 5 mM EDTA, 0.5 mM PMSF, l g l pepstatin, 4^g/ml E64, 20 g \ leupe tin) を添加し、 ポリトロン (12, 000 rpm、 1分間） を用いて破砕した。 細胞破砕液を遠心 （LOOO g, 15分間） して上 清を得た。 次にこの上清を超遠心分離 （Beckman type 30ローター、 30, 000 rpm, 1時間） し、 得られた沈殿物をラット SENR発現 CH0細胞膜画分とした。
GTPTS結合活性の測定は以下の通りである。 ラット SENR発現 CH0細胞膜画分を 膜希釈緩衝液 （50 mMトリス塩酸緩衝液 （pH 7.4) 、 5 mM MgCl,, 150 mM NaCl 、 M GDP) で希釈して、 タンパク質濃度 30 g/mlのアツセィ用細胞膜画分溶 液をつくった。 アツセィ用膜画分溶液 200 / 1に、 51.5 nM濃度の [35S]- Guanos ine 5'-(r-t io) triphosphate (NEN社） を 2 1と種々の濃度のゥシ SENRリガンド （ 配列番号： 21) を 2 1添加し、 この混合液を 25°Cで一時間保温する。 混合液を フィルター濾過し、 さらにフィルタ一洗浄用バッファー （50 mM卜リス塩酸緩衝 液 （pH 7.4) 、 5 mM MgCl2、 1 mM EDTA, 0. \% BSA) 1.5 mlで 2回洗浄した後、 フィル夕一の放射活性を液体シンチレーションカウン夕一で測定した。 ゥシ SENRリガンドは、 用量依存的に、 膜画分に結合する [35S]- guanosine 5'- (ァ - thio) triphosphate量を増大させた。 また、 同様の活性はブ夕 SENRリガンド （配 列番号： 7および 8) あるいはヒト SENRリガンド （ヒト urotensin 〖1) (配列番 号： 22) を使用しても確認された。 実施例 24 ヒト SENRリガンドが誘起するヒト SENR発現 CH0細胞膜画分への GTP rS結合活性の測定
ヒト SENRリガンド （ヒト urotensin II) (配列番号： 22) の ヒト SENR発現 CH0 細胞膜画分に対する S]- guanos ine 5，-（ァ- thio) triphosphateの結合促進活 性を以下の方法により測定した。 最初に膜画分の調製法を記載する。 1 X 108個 の CHO/hSENR細胞に 10 mlのホモジネートバッファ一 （10 mM NaHC03, 5 mM EDTA, 0.5 mM PMSF, 1 g l 卿 statin, 4^g/ml E64, 20 e l leu卿 tin) を添カロ し、 ポリトロン （12, 000 rpm、 1分間） を用いて破砕した。 細胞破砕液を遠心 （ 1, 000 g, 15分間） して上清を得た。 次にこの上清を超遠心分離 （Beckman type 30口一夕一、 30,000 rpra, 1時間） し、 得られた沈殿物をヒト SENR発現 CH0細胞 膜画分とした。
GTPrS結合活性の測定は以下の通りである。 ヒト SENR発現 CH0細胞膜画分を膜 希釈緩衝液 （50 mM卜リス塩酸緩衝液 （ρΗ 7.4) 、 5 mM MgCl2、 150 mM NaCK 1 M GDP) で希釈して、 タンパク質濃度 30;^g/mlのアツセィ用細胞膜画分溶液を つくった。 アツセィ用膜画分溶液 1に、 51.5 nM濃度の [35S] -Guanos ine 5'- (r-thio) triphosphate (ΈΝ社） を 2 1と種々の濃度のヒト SENRリガンド （配 列番号： 22) を 2^1添加し、 この混合液を 25°Cで一時間保温した。 混合液をフ ィルター濾過し、 さらにフィル夕一洗浄用バッファー （50 mMトリス塩酸緩衝液 ( H 7.4) 、 5 mM MgCl,, 1 mM EDTA, 0.1¾ BSA) 1.5 mlで 2回洗浄した後、 フ ィルターの放射活性を液体シンチレーシヨンカウンタ一で測定した。 ヒト SENR リガンドは、 用量依存的に、 膜画分に結合する [35S]-guanosine 5'- (ァ - thio) triphosphate量を増大させた。 また、 同様の活性はブ夕 SENRリガンド （配 列番号： 7および 8) あるいはゥシ SENRリガンド （配列番号： 21) を使用しても 確認された。 実施例 25 ァイソトープ標識ゥシ SENRリガンドの作製
結合阻害実験に使用するためのアイソトープ標識ゥシ SENRリガンドを以下の ようにして作製した。 ゥシ SENRリガンド （配列番号： 21) 5 gを 25 1の 0.4 M 酢酸ナトリウム （pH 5.6) に溶解し、 これに 200 ngのラクトパーォキシダ一ゼ (和光純薬製） を加えた後、 1 mC iの [1251] -ヨウ化ナトリウム （アマシャムファ ルマシアバイオテク社） および 200 ngの過酸化水素 （10 1) を加えた。 室温で 10分間静置した後、 さらに 200 ngの過酸化水素 （10 / 1 ) を加えて 10分間静置し た。 これを TSKge l ODS-80TSカラム （4. 6 mm x 25 cm、 I ソ一） を用いた HPLC によって精製し、 標識ゥシ SENRリガンドを得た。 同様にして、 ブ夕 SENRリ ガンド （配列番号： 7および 8) あるいはヒト SENRリガンド （配列番号： 22) の [125Π標識体を作製した。 実施例 2 6 ァイソトープ標識ゥシ SENRリガンドと CH0/SENR細胞を使用した結 合阻害実験
実施例 25で作製した ['251]標識ゥシ SENRリガンドとラット SENR発現 CH0細胞を 使用した結合阻害実験の方法を以下に示す。 CH0/SENR細胞を 24穴プレートに 5 x 104 ce l l/we 1 1で播種して 48時間培養し、 その後細胞を 0. 05% BSAを含む ΜΕΜ α培 地 0. 5mlで洗った （以下 0. 05% BSAを含む MEM α培地を反応用バッファーと呼ぶ） 。 総結合を調べるために 200 ρΜ [1251]標識ゥシ SENRリガンドを含む反応用バッ ファー、 非特異的結合を調べるために 200 pM 標識ゥシ SENRリガンドと M非ァイソト一プ標識ゥシ SENRリガンドを含む反応用バッファー、 さらに SENR受 容体に対する結合活性を調べる試料と 200 pM [|251]標識ゥシ SENRリガンドを含 む反応用バッファ一、 各 0. 5 mlをそれぞれ細胞に添加し、 室温で 30分間反応さ せた。 細胞を反応用バッファーで洗浄した後、 0. 5 N NaOHを 0. 2 ml添加して細 胞を溶解し、 溶解物の放射活性をガンマカウン夕一により測定した。 特異的結 合は、 総結合から非特異的結合を減じた値である。 被験試料のラット SENR受容 体結合活性は、 総結合から試料を加えた細胞溶解物の放射活性を減じた値の特 異的結合に対する比率で示される。 実施例 2 7 アイソトープ標識ヒト SENRリガンドと CHO/hSENR細胞を使用した 結合阻害実験
実施例 25と同様にしてヒト SENRリガンド （配列番号： 22) を [1251]標識して作 製した 標識ヒト SENRリガンドとヒト SENR発現 CH0細胞を使用した結合阻害 実験の方法を以下に示す。 CHO/hSENR細胞を 24穴プレートに 5 x 104 ce l l/we l l で播種して 48時間培養し、 その後細胞を 0. 05% BSAを含む MEM α培地 0. 5mlで洗つ た （以下 0. 05% BSAを含む ΜΕΜ α培地を反応用バッファ一と呼ぶ） 。 総結合を調 ベるために 150 ρΜ [1251]標識ヒト SENRリガンドを含む反応用バッファ一、 非特 異的結合を調べるために 150 ρΜ ['251]標識ヒト SENRリガンドと 非アイソト —プ標識ヒト SENRリガンドを含む反応用バッファ一、 さらにヒト SENR受容体に 対する結合活性を調べる試料と 150 M ['251]標識ヒト SENRリガンドを含む反応用 バッファ一、 各 0. 5 mlをそれぞれ細胞に添加し、 室温で 30分間反応させた。 細 胞を反応用バッファ一で洗浄した後、 0. 5 N NaOHを 0. 2 ml添加して細胞を溶解 し、 溶解物の放射活性をガンマカウン夕一により測定した。 特異的結合は、 総 結合から非特異的結合を減じた値である。 被験試料のヒト SENR受容体結合活性 は、 総結合から試料を加えた細胞溶解物の放射活性を減じた値の特異的結合に 対する比率で示される。 実施例 2 8 ァイソト一プ標識ゥシ SENRリガンドと CH0/SENR細胞膜画分を使用 した結合阻害実験
実施例 25で作製した ['251]標識ゥシ SENRリガンドとラッ卜 SENR発現 CH0細胞の 膜画分を使用した結合阻害実験の方法を以下に示す。 実施例 23に記載した、 CH0/SENR細胞から調製した膜画分を膜希釈緩衝液 （50 mMトリス塩酸緩衝液 （pH 7. 4) 、 5 mM MgCl" 0. 1¾ BSA、 5 mM EDTA、 0. 5 mM PMSF、 1 ^ g/ml peps t at in 、 4 t g/ml E64、 20 i g/ml leupept in) で希釈して、 タンパク質濃度 4 ^ g/mlの アツセィ用細胞膜画分溶液をつくった。 アツセィ用膜画分溶液 100 1に、 総結 合を調べるために 200 M [1251]標識ゥシ SENRリガンドを含む膜希釈緩衝液、 非 y b
特異的結合を調べるために 200 pM 標識ゥシ SENRリガンドと 2 M非ァイソ トープ標識ゥシ SENRリガンドを含む膜希釈緩衝液、 さらにラッ卜 SENR受容体に 対する結合活性を調べる試料と 200 pM [1251]標識ゥシ SENRリガンドを含む膜希 釈緩衝液、 各 100 1をそれぞれ添加して室温で 60分間反応させた。 混合液をフ ィル夕一濾過し、 さらにフィルターを膜希釈緩衝液 1. 5 mlで 2回洗浄した後、 フィルターの放射活性をガンマカウン夕一により測定した。 特異的結合は、 総 結合から非特異的結合を減じた値である。 被験試料のラット SENR受容体結合活 性は、 総結合から試料を加えた細胞膜画分の放射活性を減じた値の特異的結合 に対する比率で示される。 図 12に種々の濃度のゥシ SENRリガンドの結合活性を 示した。 実施例 2 9 ァイソトープ標識ヒト SENRリガンドと CHO/hSENR細胞膜画分を使 用した結合阻害実験
実施例 25と同様にしてヒト SENRリガンド （配列番号： 22) を ['251]標識して作 製した ['251]標識ヒト SEN'Rリガンドとヒト SENR発現 CH0細胞の膜画分を使用した 結合阻害実験の方法を以下に示す。 実施例 24に記載した、 CHO/hSENR細胞から調 製した膜画分を膜希釈緩衝液 （50 mMトリス塩酸緩衝液 （pH 7. 4) 、 5 mM MgCl 2 、 0. 1¾ BSA、 5 mM EDTA、 0. 5 mM PMSF、 g/ml peps t at in, 4 M g/ml E64、 20 (i gM l eupept in) で希釈して、 タンパク質濃度 60 ; g/inlのアツセィ用細胞膜 画分溶液をつくった。 アツセィ用膜画分溶液 100 w 1に、 総結合を調べるために 150 pM [1251]標識ヒト SENRリガンドを含む膜希釈緩衝液、 非特異的結合を調べ るために 150 pM [1251]標識ヒト SENRリガンドと 非アイソトープ標識ヒト SENRリガンドを含む膜希釈緩衝液、 さらにヒト SENR受容体に対する結合活性を 調べる試料と 150 pM [1251]標識ヒト SENRリガンドを含む膜希釈緩衝液、 各 100 1をそれぞれ添加して室温で 60分間反応させた。 混合液をフィルター濾過し、 さ らにフィルターを膜希釈緩衝液 1. 5 mlで 2回洗浄した後、 フィル夕一の放射活 性をガンマカウン夕一により測定した。 特異的結合は、 総結合から非特異的結 合を減じた値である。 被験試料のヒト SENR受容体結合活性は、 総結合から試料 を加えた細胞膜画分の放射活性を減じた値の特異的結合に対する比率で示され る。 図 13に種々の濃度のヒト SENRリガンドの結合活性を示した。 実施例 3 0 合成ゥシ SEXRリガンドのラット SENR発現 CH0細胞に対する cAMP合 成抑制活性
実施例 で合成したゥシ SENRリガンド （配列番号： 21 ) が示すラッ卜 SENR発 現 CH0細胞に対する cAMP合成抑制活性を以下に示す方法で測定した。 CH0/SENR細 胞を 24穴プレートに 5 X 104 ce l l/we l lで播種し、 48時間培養した。 細胞を 0. 2 mM 3—イソブチル—メチルキサンチンと 0. 05% BSAと 20 mM HEPESを含むハンクス バッファー (pH 7· 4)で洗浄した （以下、 0. 2 mM 3—イソプチルーメチルキサン チンと 0. 05¾ BSAと 20 mM HEPESを含むハンクスバッファー（ρΗ 7. 4)を、 反応用 バッファ一と呼ぶ） 。 その後 0. 5 mlの反応用バッファーを加えて 30分間培養器 で保温した。 反応用バッファーを除き、 新たに 0. 25 mlの反応用バッファ一を細 胞に加えた後、 種々の量のゥシ SENRリガンドと 2 μ Μフオルスコリンを含む 0. 25 mlの反応用バッファーを細胞に加え、 37°Cで 24分間反応させた。 100 1の 20%過 塩素酸を加えて反応を停止させ、 次に氷上で 1時間置くことにより細胞内 cAMP を抽出した。 抽出液中の cAMP量は、 cAMP E IAキット （アマシャムフアルマシア バイオテク） を用いて測定した。 その結果、 ゥシ SENRリガンドは 0. 3 nMの濃度 で明らかに細胞内 cAMP量を低下させ、 さらにペプチド濃度を増やすと容量依存 的に細胞内 cAMP量は減少した。 また、 同様の活性はブ夕 SENRリガンド①および ② （配列番号： 7および 8) あるいはヒト SENRリガンド （ヒト uro tens i n I I) ( 配列番号： 22) を使用しても確認された。 実施例 3 1 合成ヒト SEXRリガンドのヒト SENR発現 CH0細胞に対する cAMP合成 抑制活性
実施例 15で合成したヒト SENRリガンド （ヒト urotensin II) (配列番号： 22 ) が示すヒト SENR発現 CH0細胞に対する cAMP合成抑制活性を以下に示す方法で測 定した。 CHO/hSENR細胞を 24穴プレートに 5 X 104 cell/wellで播種し、 48時間培 養した。 細胞を 0.2 m 3—イソプチルーメチルキサンチンと 0.05% BSAと 20 mM HEPESを含むハンクスバッファ一（pH 7.4)で洗浄した （以下、 0.2 mM 3—イソ ブチル—メチルキサンチンと 0.05% BSAと 20 mM HEPESを含むハンクスバッファ 一（pH 7.4)を、 反応用バッファーと呼ぶ） 。 その後 0.5 mlの反応用バッファー を加えて 30分間培養器で保温した。 反応用バッファーを除き、 新たに 0.25 mlの 反応用バッファ一を細胞に加えた後、 種々の量のヒト SENRリガンドと 2 フォ ルスコリンを含む 0.25 mlの反応用バッファ一を細胞に加え、 37°Cで 24分間反応 させた。 100/^1の 20%過塩素酸を加えて反応を停止させ、 次に氷上で 1時間置く ことにより細胞内 cAMPを抽出した。 抽出液中の cAMP量は、 cAMP EIAキット （ァ マシャムフアルマシアバイオテク） を用いて測定した。 その結果、 ヒト SENRリ ガンドは 0.3 nMの濃度で明らかに細胞内 cAMP量を低下させ、 さらにペプチド濃 度を増やすと容量依存的に細胞内 cAMP量は減少した。 また、 同様の活性はブ夕 SENRリガンド①および② （配列番号： 7および 8) あるいはゥシ SENRリガンド （ 配列番号： 21) を使用しても確認された。 実施例 32 PCR法によるゥシ SENRリガンド前駆体タンパク質の部分配列の決 定
ゥシゲノム DNA (クロンテック社）を铸型に、 配列番号： 10および配列番号： 1 1で表されるプライマーを用いて PCR反応を行なった。 反応液の組成は、 合成 プライマーは配列番号： 10で表されるプライマーが 5 Μ、 配列番号： 1 1で 表されるプライマ一力 1 Μ、铸型 DNA50ng、 0.2 mM dNTPs, 2.5mMMgClr Am liTaq Gold DNA polymeraseひ、。一キンエルマ一社） 0.4 1および 10倍濃縮の A即 1 iTaq Gold buffer 1/10量で総反応液量は 40 1とした。 増幅のためのサイクルは、 サ 一マルサイクラ一 （パーキンエルマ一社） を用い、 95°Cで 9分保温した後、 94 • 15秒、 60°C · 20秒、 π。に · 20秒のサイクルを 4回、 94°C · 15秒、 52.5°C · 20秒 、 72°C · 20秒のサイクルを 6回、 94°C · 20秒、 52.5°C · 20秒、 1T · 20秒のサイ クルを 6回、 94°C · 20秒、 50°C · 20秒、 72°C · 20秒のサイクルを 8回、 94°C · 15 秒、 48°C · 20秒、 72°C · 20秒のサイクルを 30回繰り返した後、 72°Cで 7分保温し た。 得られた反応液 2 1を T0P0 TA cloning kit (インビトロジェン社）を用い てプラスミドベクタ一 per 2.1へサブクローニングし、 大腸菌 TOP10へ導入した 。 生じた形質転換体から QIA Prep8 mini prep (キアゲン社）を用いてプラスミ ド DNAを精製した。 塩基配列決定のための反応は DyeDeoxy Terminator Cycle Sequence Kit (パーキンエルマ一社） を用いて行ない、 蛍光式自動シーケンサ 一を用いて解読した。 その結果、 PCR産物として、 ブ夕 SENRリガンド前駆体の配 列と類似することからゥシ SENRリガンド前駆体の一部をコ一ドすると考えられ る配列番号： 20が得られた。 実施例 33 ゥシ全脳 cDNAの調製
ゥシ全脳 poly (A)+RNA (クロンテック社） 1.0 xgから、 ThennoScr ipt逆転写 酵素（ギブコ BRL社）を用い、 マニュアルにしたがって ol igo (dT)プライマーを 用いて 60°Cで逆転写を行ない、 cDNAを作成した。この cDNAについて Marathon cDNA amplification kit (クロンテック社）のマニュアルに従って第二ストランドの 合成およびァダブター配列の付加を行なつた。 実施例 34 5'-RACE法によるゥシ SENRリガンド前駆体タンパク質をコードする 遺伝子の 5'側の配列の取得
実施例 33で得た 2本鎖 cDNA調製液の 4 ng mRNA相当分を铸型にし、 Marathon cDNA amplification kit (クロンテック社）に付属のアダプタ一プライマ一 API WO 00/32627 〗 Q Q PCT/JP99/06649
および配列番号： 31で表されるプライマ一を用いて PCRを行なった。 反応液の 組成は、 合成プライマ一は配列番号： 3 1で表されるプライマーが 0.5//M、 API が 0.2 M、 0.2 mM dNTPs、 2.5 mM MgCl" Am liTaq Gold DNA polymerase (パー キンエルマ一社） 0.2w 1および 10倍濃縮の AmpliTaq Gold buffer 1/10量で総 反応液量は 20 /1とした。 増幅のためのサイクルは、 サーマルサイクラ一 （パー キンエルマ一社） を用い、 95°Cで 9分保温した後、 95°C · 10秒、 68°C .1分のサ イクルを 40回繰り返した。 この反応液の 0.04 1相当分を铸型にし、 アダプター プライマー APIを AP2、 配列番号： 3 1で表されるプライマーを配列番号： 32 で表されるプライマ一に置き換えて PCRを行なった。 反応液の組成は、 合成ブラ イマ一は配列番号： 32で表されるプライマ一が 0.5 M、 AP2が 0.2 M、 0.2 mM dNTPs、 2.5mMMgCl2, AmpliTaq Gold DNA polymerase (パーキンエルマ一社) 0.2 lおよび 10倍濃縮の AmpliTaq Gold buffer 1/10量で総反応液量は 20 1とした 。 増幅のためのサイクルは、 サ一マルサイクラ一 （パーキンエルマ一社） を用 レ 、 95 · 9分保温した後、 95°C · 10秒、 66 · 1分のサイクルを 40回繰り返し た後、 72*C · 10分保温した。 PCR反応液を 3.5¾ Nusieve GTG Agarose (宝酒造） を用いて電気泳動してェチジゥムブ口マイドによる染色によって検出される 420 bp付近のバンドから GeneClean Spin kit (バイオ 101社） によって DNAを抽 出し、 T0P0 TA cloning kit (インビトロジェン社） を用いてプラスミド per 2.1 にサブクロ一ニングを行なって大腸菌 TOP010へ導入した。 生じた形質転換体か ら QIA prep8 mini prep kit (キアゲン社） を用いてプラスミド DNAを精製した 。 塩基配列決定のための反応は DyeDeoxy Terminator Cycle Sequence kit (パ 一キンエルマ一社） を用いて行ない、 蛍光式自動シーケンサーを用いて解読し たところ、 配列番号： 33に示す配列が得られた。 実施例 35 3'-RACE法によるゥシ SENRリガンド前駆体タンパク質をコードする 遺伝子の 3'側の配列の取得 WO 00/32627 } Q j PCT/JP99/06649
実施例 3 3で得た 2本鎖 cDNA調製液の 4 ng mRNA相当分を铸型にし、 Marathon cDNA a即 lification kit (クロンテック社）に付属のアダプタ一プライマ一 API および配列番号： 34で表されるプライマ一を用いて PCRを行なった。 反応液の 組成は、 合成プライマーは配列番号： 34で表されるプライマーが 0.2/ M、 API 力 .2 M、 0.2 mM dNTPs, 2.5 mM MgCl2、 AmpliTaq Gold DNA polymerase ひ、。一 キンエルマ一社） 0· 2 μ 1および 10倍濃縮の AmpliTaq Gold buffer 1/10量で総 反応液量は 20 とした。 増幅のためのサイクルは、 サーマルサイクラ一 （パ一 キンエルマ一社） を用い、 95 で 9分保温した後、 95 : · 10秒、 68°C · 1分のサ イクルを 40回繰り返した。 この反応液の 0. 相当分を铸型にし、 アダプタ一 プライマー APIを AP2、 配列番号： 34で表されるプライマーを配列番号： 3 5 で表されるプライマーに置き換えて PCRを行なった。 反応液の組成は、 合成ブラ イマ一は配列番号： 3 5で表されるプライマーが 0. 2 M、 AP2が 0. 2 M、 0. 2 mM dNTPs、 2.5mMMgCl2, Am l iTaq Gold DNA polymerase (パーキンエルマ一社) 0.2 1および 10倍濃縮の AmpliTaq Gold buffer 1/10量で総反応液量は 20μ 1とした 。 増幅のためのサイクルは、 サ一マルサイクラ一 （パーキンエルマ一社） を用 レ 95°C · 9分保温した後、 95°C · 10秒、 66°C · 1分のサイクルを 40回繰り返し た後、 72°C · 10分保温した。 PCR反応液を 3.5¾ Nusieve GTG Agarose (宝酒造） を用いて電気泳動してェチジゥムブロマイドによる染色によって検出される 300 bp付近のバンドから GeneClean Spin kit (バイオ 1(H社） によって DNAを抽 出し、 TOPO TA cloning kit (インビトロジェン社） を用いてプラスミド per 2.1 にサブクロ一ニングを行なって大腸菌 TOP010へ導入した。 生じた形質転換体か ら QIA prep8 mini prep kit (キアゲン社） を用いてプラスミド DNAを精製した 塩基配列決定のための反応は DyeDeoxy Terminator Cycle Sequence kit (パ 一キンエルマ一社） を用いて行ない、 蛍光式自動シーケンサーを用いて解読し たところ、 配列番号： 36に示す配列が得られた。 WO 00/32627 { Q ^ PCT/JP99/06649
実施例 36 ゥシ SEXRリガンド前駆体タンパク質をコ一ドする遺伝子の全長配 列の取得
実施例 34および実施例 35に述べたようにして RACE法を用いて得られた 5'末 端側および 3'末端側の配列情報から予想されるゥシ SENRリガンド前駆体夕ンパ ク質をコードする CDXAの全長を含む配列を得るため、 実施例 33で得られた二 本鎖 cDNA調製液の 4 ng mRM相当分を铸型とし、 配列番号： 37および配列番号 ： 38で表されるプライマーを用いて PCRを行なった。 反応液の組成は、 プライ マ一濃度をともに 0.5 とし、 0.2 mM dNTPs, 2.5 mM MgCl2、 AmpliTaq Gold DNA polymerase (パ一キンエルマ一社） 0. 1および 10倍濃縮の AmpliTaq Gold buffer 1/10量で総反応液量は 20 1とした。 増幅のためのサイクルは、 サーマ ルサイクラ一 （パーキンエルマ一社） を用い、 95°Cで 9分保温した後、 95°C · 10 秒、 62°C · 20秒、 72で · 1分のサイクルを 40回繰り返した後、 72 :で 10分保温し た。 PCR反応液を 3.5% Nusieve GTG Agarose (宝酒造） を用いて電気泳動してェ チジゥムブロマイドによる染色によって検出される 490 bp付近のバンドから GeneClean Spin kit (バイオ 101社） によって DNAを抽出し、 T0P0 TA cloning ki t (インビトロジェン社） を用いてプラスミド per 2.1にサブクローニングを行な つて大腸菌 TOP010へ導入した。 生じた形質転換体から QIA prep8 mini prep kit (キアゲン社） を用いてプラスミド DNAを精製した。 塩基配列決定のための反応 は DyeDeoxy Terminator Cycle Sequence kit (パーキンエルマ一社） を用いて 行ない、 蛍光式自動シーケンサ一を用いて解読したところ、 配列番号： 30に 示す配列が得られた。 この配列にはゥシ SENRリガンド前駆体の全長が含まれて いたのでこの plasmidで大腸菌 TOP10を形質転換して Escherichia coli T0P10/pCR-buroを得た。 配列番号： 30から翻訳されるゥシ SENRリガンド前駆 体タンパク質のアミノ酸配列を配列番号： 29に示す。 また、 ゥシ SENRリガン ド前駆体タンパク質のアミノ酸配列から予想されるゥシ SENRリガンドのアミノ 酸配列を配列番号： 21に、 それをコ一ドする DNAの塩基配列を配列番号： 28 にそれぞれ示す。 また、 ゥシ SENRリガンド前駆体タンパク質の全塩基配列およ びアミノ酸配列を図 14に示す。 実施例 37 SENRリガンドポリぺプチドに対する抗体の作製
ブ夕、 ゥシおよびヒト SENRリガンドポリペプチドと C末端側の構造 （Cys - Phe-Trp-Lys-Ty r-Cys-Va 1 ) がー致する ハゼ ( long- jawed mudsucker, Gillichthys inirabilis) ゥロテンシン Π (配列番号： 39) を抗原として SENRリ ガンドポリペプチドの C末側を認識する抗体を作製した。 1 nigのハゼゥ口テンシ ン Πペプチドと 4 mgの BTG (bovine thyroglobul in)を、 30 mgの ECDI (1- ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide 同仁化学）により結合させ、 ハゼゥ口テンシン Π—キャリアタンパク複合体を作製した。 ハゼゥ口テンシン Π—キャリアタンパク複合体を 0.15 M NaCl水溶液に対して透析した後、 透析内 液とフロイン卜の完全アジュバントを混ぜ、 これを抗原として 1頭当たりハゼゥ 口テンシン II20 g相当を Balb/cマウス （雌、 6〜8週令） に初回免役した。 初回 免疫から 3週間後、 複合体とフロイン卜の不完全アジュバントを混ぜ、 これを抗 原として 2回目の免疫をした。 抗体価が上昇するまで、 2週間おきに複合体とフ 口イン卜の不完全アジュバント混合物を免疫した。
抗体価の測定は、 ビォチン化ハゼゥ口テンシン Πペプチドを利用した酵素免 疫測定法で行なった。 ピオチン化ハゼゥ口テンシン Πペプチド （[N-biotiny卜 Ala'j-urotensin II) は、 NHS-biot in (N - hydroxysuccinimidobiot in)とノ、ゼゥ 口テンシン Πペプチドの反応物を HPLC分取することで得た。 得られた Ν末端ラベ 端配列分析において Ν末が検出できないことにより確定した。 酵素免疫測定法は 以下の通り。 抗マウス IgGヒッジ IgG画分溶液をコートした 96穴ィムノプレート をブロックエース （大日本製薬） でブロックした後、 段階希釈した免疫マウス 血清とピオチン化ハゼゥ口テンシン Πペプチドをゥエル内で 4°Cにて 16時間反 WO 00/32627 } Q 4 PCT/JP99脳 49
応させた。 次にゥエルを洗浄後、 パーォキシダーゼ標識ストレプトアビジンを ゥエル内で室温にて 4時間反応させた。 最後にゥエルを洗浄後、 パ一ォキシダー ゼ基質をゥエルに加え、 基質の発色を 96穴マルチフォトメーターで測定した。 基質の発色が認められたゥエルに添加した血清を抗体価が上昇していると判断 した。 ここで検出される抗体は N末端ラベル体のピオチン化ハゼゥ口テンシン Π と結合することからこのペプチドの C末端側の構造を認識するものと考えられ る。 こうした血清に含まれる抗体がブ夕、 ゥシおよびヒト SENRリガンドポリべ プチドを認識していることは、 上記の酵素免疫測定法においてこれらのぺプチ ドをゥェルに添加することによってビォチン化ハゼゥ口テンシン Πペプチドと 抗体との結合が阻害され、 その結果、 発色が阻害されることによって確認した
(配列表フリーテキスト）
配列番号： 7
配列に関する他の情報：第 6番目および第 1 1番目の 2つの Cys残基は分子内ジ スルフィ ド結合を形成している。
配列番号： 8
配列に関する他の情報：第 6番目および第 1 1番目の 2つの Cys残基は分子内ジ スルフィド結合を形成している。
配列番号： 2 1
配列に関する他の情報：第 6番目および第 1 1番目の 2つの Cys残基は分子内ジ スルフィ ド結合を形成している。
配列番号： 2 2
配列に関する他の情報：第 5番目および第 1 0番目の 2つの Cys残基は分子内ジ スルフィド結合を形成している。
配列番号： 3 9 WO 00/32627 , n 「 PCT/JP99/06649
1 U D
配列に関する他の情報：第 5番目および第 1 1番目の 2つの Cys残基は分子内ジ スルフィ ド結合を形成している。 産業上の利用可能性
本発明のポリペプチドをコードする D N Aまたは本発明のポリペプチドは、 ①本発明のポリぺプチドの有する生理作用の探索、 ②合成オリゴヌクレオチド プローブあるいは P C Rのプライマーの作成、 ③ S E N Rのリガンドゃ前駆体 タンパク質をコードする D NAの入手、 ④組換え型レセプ夕一タンパク質の発 現系を用いたレセプ夕一結合ァッセィ系の開発と医薬品候補化合物のスクリ一 ニング、 ⑤抗体および抗血清の入手、 ⑥ D N A、 R NA、 抗体または抗血清を 用いた診断薬の開発、 ⑦中枢神経機能調節剤、 循環機能調節剤、 心臓機能調節 剤、 腎臓機能調節剤、 泌尿器機能調節剤、 感覚器官機能調節剤などの医薬の開 発、 ⑧遺伝子治療等に用いることができる。

Claims

WO 00/32627 , Λ α PCT/JP99/06649
1 U ο
請求 の 範 囲
I. 配列番号： 7で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミ ノ酸配列を含有するポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルま たはその塩。
2. 実質的に同一のアミノ酸配列が配列番号： 8または配列番号： 2 1で表さ れるァミノ酸配列である請求項 1記載のポリペプチドもしくはそのアミドもし くはそのエステルまたはその塩。
3. 請求項 1記載のポリぺプチドの前駆体夕ンパク質またはその塩。
4. 配列番号： 1 8または配列番号： 1 9で表されるアミノ酸配列と同一もし くは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する請求項 3記載の前駆体タンパク質 またはその塩。
5. 請求項 1記載のポリペプチドをコードする塩基配列を有する D Ν Αを含有 する DNA。
6. 配列番号： 27または配列番号： 28で表される塩基配列を有する請求項 5記載の DNA。
7. 請求項 3記載の前駆体タンパク質をコードする塩基配列を有する DN Aを 含有する DNA。
8. 配列番号： 15、 配列番号： 16または配列番号： 1 7で表される塩基配 列を有する請求項 7記載の D N A。
9. 請求項 5または請求項 7記載の DN Aを含有する組換えべクタ一。
10. 請求項 9記載の組換えベクターで形質転換された形質転換体。
I I. 請求項 10記載の形質転換体を培養し、 請求項 1記載のポリペプチドま たは請求項 3記載の前駆体タンパク質を生成、 蓄積せしめ、 これを採取するこ とを特徴とする請求項 1記載のポリペプチドもしくはそのアミドもしくはその エステルまたはその塩、 または請求項 3記載の前駆体タンパク質もしくはその 塩の製造法。 WO 00/32627 { g ? PCT/JP99/06649
1 2 . 請求項 1記載のポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステル またはその塩、 または請求項 3記載の前駆体タンパク質もしくはその塩に対す る抗体。
1 3 . 請求項 1記載のポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステル またはその塩、 または請求項 3記載の前駆体タンパク質もしくはその塩を含有 してなる医薬。
1 4. 請求項 5または請求項 7記載の D N Aを含有してなる医薬。
1 5 . 中枢機能調節剤、 循環機能調節剤、 心臓機能調節剤、 腎臓機能調節剤、 泌尿器機能調節剤または感覚器官機能調節剤である請求項 1 3または請求項 1 4記載の医薬。
1 6 . 請求項 1記載のポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステル またはその塩または請求項 3記載の前駆体タンパク質もしくはその塩を用いる ことを特徴とする S E N Rと請求項 1記載のポリペプチドもしくはそのアミド もしくはそのエステルまたはその塩、 または請求項 3記載の前駆体タンパク質 もしくはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング 方法。
1 7 . 請求項 1記載のポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステル またはその塩、 または請求項 3記載の前駆体夕ンパク質もしくはその塩を含有 してなる S E N Rと請求項 1記載のポリペプチドもしくはそのアミドもしくは そのエステルまたはその塩、 または請求項 3記載の前駆体タンパク質もしくは その塩との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング用キット
1 8 . 配列番号： 2 2で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドもしく はそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を用いることを特徴とする S E N Rと配列番号： 2 2で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドもし くはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩との結合性を変化させる化 1 U o
合物またはその塩のスクリーニング方法。
1 9 . 配列番号： 2 2で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドもしく はそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を含有してなる S E N Rと配 列番号： 2 2で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドもしくはそのァ ミドもしくはそのエステルまたはその塩との結合性を変化させる化合物または その塩のスクリーニング用キット。
2 0 . 請求項 1 6もしくは請求項 1 8記載のスクリーニング方法または請求項 1 7もしくは請求項 1 9記載のスクリーニング用キッ卜を用いて得られる、 ① S E N Rと請求項 1記載のポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエス テルまたはその塩、 または請求項 3記載の前駆体夕ンパク質もしくはその塩、 または② S E N Rと配列番号： 2 2で表されるアミノ酸配列を含有するポリべ プチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩との結合性を変 化させる化合物またはその塩。
2 1 . 請求項 2 0記載の化合物またはその塩を含有することを特徴とする高血 圧症の予防 ·治療薬。
2 2 . 請求項 1 2記載の抗体を用いることを特徴とする請求項 1記載のポリべ プチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩、 または請求項 3記載のタンパク質もしくはその塩の定量方法。
2 3 . 請求項 1 2記載の抗体を含有することを特徴とする請求項 1記載のポリ ペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩、 または請求 項 3記載の前駆体夕ンパク質もしくはその塩の機能が関与する疾患の診断剤。
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