WO2000029570A1 - Nouvelle proteine et son utilisation - Google Patents

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WO2000029570A1
WO2000029570A1 PCT/JP1999/006275 JP9906275W WO0029570A1 WO 2000029570 A1 WO2000029570 A1 WO 2000029570A1 JP 9906275 W JP9906275 W JP 9906275W WO 0029570 A1 WO0029570 A1 WO 0029570A1
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Hiroshi Sugino
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Takeda Chemical Industries, Ltd.
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Definitions

  • the present invention relates to a novel protein having a specific amino acid sequence, a PDZ domain and / or a WW domain, and specifically expressed in the brain, a DNA containing a DNA region encoding the protein, and production of the protein. Methods and uses of the protein and DNA. Background art
  • bioactive proteins have a PDZ domain or a WW domain. These domains are relatively recently found protein binding domain modules. Therefore, the distribution, functions, and control mechanisms of proteins having PDZ domains and WW domains in vivo are still unknown.
  • proteins with PDZ domains play an important role in the formation of cell membrane lining structures and cytoskeletal networks, as well as in the formation of intracellular signal transduction networks developed on the surface of cells. It is conceivable that.
  • the nervous system it is indispensable for the assembly of protein clusters at synaptic sites, such as in the formation of complexes such as neurotransmitter receptors and ion channels.
  • a PDZ protein whose expression is regulated by synaptic plasticity has been discovered, and PDZ protein may be involved in plasticity-related changes in synaptic morphology through receptor rearrangement. Building a network It is also considered to be involved in higher-order functions of the brain of living organisms.
  • the PDZ domain shares some common features with known peptide binding domains, but also has distinct features.
  • the PDZ domain is a widely conserved domain from bacteria to higher plants and animals.In many cases, the PDZ domain recognizes a short amino acid sequence at the C-terminus of the target protein, and these target proteins are transmembrane receptors. It is often a body or channel. PDZ domains are often found in the same protein as being repeated about 2 to 6 times, and unlike other domain modules, some form homodimers. These are important features for the PDZ domain to be involved in the formation of protein-bridge networks and microdomains in cell-cell adhesion, such as cell surface structures such as synapses and tight junctions.
  • the WW domain is a domain of about 40 amino acids that is well conserved from yeast to mammals, and recognizes and binds to a relatively short amino acid sequence called a proline-rich PY motif.
  • proteins having a WW domain include ubiquitin protein ligase, dystrophin, and formin-binding protein. These proteins have 1-4 WW domains connected in series. Many proteins with WW domains have domains that are involved in other protein-protein interactions, such as proteinase, ras GAP, and other enzymatically active domains, suggesting that WW domains have a wide variety of biological functions. ing.
  • Activin is a regulator that promotes follicle-stimulating hormone (FSH) secretion from the anterior pituitary gland.
  • FSH follicle-stimulating hormone
  • pituitary secretion of gonadotropin was thought to be mainly regulated by gonad-producing steroid hormones.However, the discovery of activin and inhibin, a contradictory effect, led to the hypothalamus. It is of interest as a new mechanism of hormone secretion in the pituitary and reproductive organs.
  • the present invention specifically relates to a protein having a PDZ domain and / or a WW domain expressed in the brain, a receptor capable of binding to the protein (eg, an activin receptor), and an intracellular signaling molecule (eg, Smad).
  • a protein having a PDZ domain and / or a WW domain expressed in the brain a receptor capable of binding to the protein (eg, an activin receptor), and an intracellular signaling molecule (eg, Smad).
  • an activin-activin receptor system as a means to inhibit cell differentiation in nervous system tissues and to elucidate the detailed molecular mechanism of neurotrophic factor-like activity. It is an object of the present invention to provide an isolation method and a detection method, a DNA containing the novel protein gene, a method for producing a protein encoded by the novel protein gene, and uses of the DNA and the protein. Disclosure of the invention
  • the present inventors have conducted intensive studies to solve the above-mentioned problems, and as a result, a yeast using the intracellular region of the mouse activin IIA-N receptor protein represented by SEQ ID NO: 1 as a bait Using the two-hybrid method, we search for binding proteins from the mouse brain cDNA library, and confirm the binding to activin IIA-N receptor in COS 7 cells. I got Furthermore, when a cDNA clone containing the full length of the gene encoded by this clone was isolated and analyzed, it was found that the gene contained a region encoding five PDZ domains and two WW domains.
  • the protein encoded by this gene is a protein factor having a plurality of protein-protein interaction domains, of which 1) binds to the intracellular region of the activin receptor via the PDZ domain, and As a result, they found that they inhibited the transmission of activin into cells, 2) did not bind to the intracellular domain of receptors for other cytokines, and did not affect their intracellular signal transmission. . In addition, they have found that they bind to activin intracellular signaling molecules via another WW domain and inhibit the transmission of activin into cells.
  • the present inventors extracted po1y (A) + RNA from various mouse organs, and used the DNA shown in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4 as a probe, and When the expression of the novel protein of the present invention was examined by the hybridization method, as shown in Fig. 23, the expression was frequently observed especially in the brain. I found something. This suggests that the activin-activin receptor signaling system to which the novel protein is added is responsible for controlling the proliferation and differentiation of brain cells, We found that it could be applied to treatment and the like. The present inventors have further studied based on these findings, and as a result, have completed the present invention.
  • the protein according to item 1 or 2 which has a PD Z domain and a WW domain, is specifically expressed in the brain, and has a binding ability to an activin receptor or (and) an activin intracellular signaling molecule.
  • the protein according to item 3 wherein the activin intracellular signaling molecule is Smad3. 5.
  • the protein according to item 1 or 2 which has five PDZ domains and two WW domains, is specifically expressed in the brain, and has an ability to bind to an activin receptor and Smad3.
  • a partial peptide of the protein according to paragraph 1 a partial peptide of the protein according to paragraph 2, or a salt thereof,
  • the DNA according to item 7 which has a base sequence represented by SEQ ID NO: 7, a base sequence represented by SEQ ID NO: 8 or a base sequence that hybridizes with the base sequence under high stringency conditions,
  • test solution containing the protein according to item 1, the protein according to item 2, the partial peptide according to item 6, or a salt thereof, and the labeled antibody. 2.
  • the protein according to item 1 the protein according to item 2, the protein according to item 2, wherein the protein according to item 1, the protein according to item 2, the partial peptide according to item 6, or a salt thereof is used.
  • (1) The protein according to item 1, the protein according to item 2, or the partial peptide according to item 6 in the DNA binding region of the transcription factor A host cell having a reporter gene retaining the transcription factor binding region on a promoter, comprising an expression vector obtained by fusing the gene and a fusion library of a gene encoding a test protein and a transcription activation region. To measure the change in the expression level of the repo overnight gene that is increased by the binding of the test protein to the protein described in paragraph 1, the protein described in paragraph 2, or the partial peptide described in paragraph 6. The decision described in paragraph 15 Setting method,
  • the protein according to item 1 the protein according to item 2, characterized in that the protein according to item 1, the protein according to item 2, the partial peptide according to item 6, or a salt thereof is used.
  • the protein according to item 1, the protein according to item 2, the partial peptide according to item 6, or a salt thereof was brought into contact with the protein according to item 17 or a salt thereof.
  • Protein or its salt, activin The protein described in paragraph 1, the protein described in paragraph 2, the partial peptide described in paragraph 6 or a salt thereof, and the cells described in paragraph 17.
  • the protein according to item 1, the protein according to item 2, the protein according to item 2, the partial peptide according to item 6, or a salt thereof and a test compound are introduced into cells expressing the protein or its salt, the activin receptor or the activin intracellular signaling molecule.
  • the protein according to item 1 the protein according to item 2, the partial peptide according to item 6, or a salt thereof in the cell, the protein according to item 17 or a salt thereof, an activin receptor or an activin in a cell
  • protein or a salt thereof of the first item 7, wherein, Akuchibi Screening method for a compound or a salt thereof that inhibits or promotes binding to a protein receptor or activin intracellular signaling molecule
  • a salt thereof when contacted with a membrane fraction of a cell that expresses an activin receptor or an activin intracellular signaling molecule, the labeled protein according to claim 1 or the labeled protein according to claim 2,
  • the labeled protein according to claim 1 wherein the amount of the protein, the partial peptide according to claim 6, or a salt thereof to a membrane fraction of the cell is measured and compared, and the labeled protein according to claim 1 or 2, And the partial pair described in Section 6.
  • Tide or protein or compound or screening-learning method of a compound represented by the formula a salt thereof inhibit or promote binding of Akuchibin receptor or Akuchibin cells the know paper transfer molecules in the salt and wherein the first section 7,
  • the protein according to item 1 When the protein according to item 1, the protein according to item 2 or a salt thereof is introduced into cells expressing the protein or salt thereof, activin receptor or activin intracellular signaling molecule according to item 17.
  • the salt and the test compound are introduced, the cell stimulating activity via the protein or the salt thereof, the activin receptor or the activin intracellular signaling molecule described in Item 17 is measured and compared.
  • the protein according to item 1 the protein according to item 2, the partial peptide according to item 6, or a salt thereof and the protein according to item 17 or a salt thereof, an activin receptor or a protein.
  • 24 A method for screening a compound or a salt thereof that inhibits or promotes binding to a tibin intracellular signal transduction molecule, 24.
  • the method for determining a protein according to item 16 characterized by using a two-hybrid method The method or the screening method according to any one of Items 18 to 23, 25.
  • a medicament comprising the protein according to item 17, the compound according to item 26 or a salt thereof,
  • the medicament according to item 27 which is an agent for preventing or treating Alzheimer's disease, Parkinson's disease, epilepsy or Huntington's chorea.
  • the protein according to item 17, or a salt thereof, or activin receptor which is administered to a mammal with an effective amount of the protein according to item 17, the compound according to item 26, or a salt thereof.
  • the protein is an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5, one or more in an amino acid sequence other than SEQ ID NO: 6 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 (preferably two or more) 1 or 2 or more (preferably 2 or less) in the amino acid sequence other than SEQ ID NO: 6 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 in which the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 has been deleted. Or more than 10 amino acid sequences), or represented by SEQ ID NO.'5. 1 or 2 or more (preferably 2 or more and 10 or less) amino acid sequences in the amino acid sequence other than SEQ ID NO: 6 containing the amino acid sequence in which another amino acid is substituted. 32.
  • a pharmaceutical composition comprising the compound or a salt thereof according to paragraph 33,
  • FIG. 1 shows the entire nucleotide sequence of cDNA encoding the novel protein of the present invention and the amino acid sequence encoded thereby (SEQ ID NO: 5).
  • FIG. 2 shows the entire nucleotide sequence of cDNA encoding the novel protein of the present invention and the amino acid sequence encoded thereby (SEQ ID NO: 5).
  • FIG. 2 is a continuation of FIG.
  • FIG. 3 shows the entire nucleotide sequence of the cDNA encoding the novel protein of the present invention and the amino acid sequence encoded thereby (SEQ ID NO: 5).
  • FIG. 3 is a continuation of FIG.
  • FIG. 4 shows the entire nucleotide sequence of cDNA encoding the novel protein of the present invention and the amino acid sequence encoded thereby (SEQ ID NO: 5).
  • FIG. 4 is a continuation of FIG. FIG.
  • FIG. 5 shows the entire nucleotide sequence of cDNA encoding the novel protein of the present invention and the amino acid sequence encoded thereby (SEQ ID NO: 5).
  • FIG. 5 is a continuation of FIG.
  • FIG. 6 shows the entire nucleotide sequence of cDNA encoding the novel protein of the present invention and the amino acid sequence encoded thereby (SEQ ID NO: 5).
  • FIG. 6 is a continuation of FIG.
  • FIG. 7 shows the entire nucleotide sequence of cDNA encoding the novel protein of the present invention and the amino acid sequence encoded thereby (SEQ ID NO: 5).
  • FIG. 7 is a continuation of FIG. FIG.
  • FIG. 8 shows the entire nucleotide sequence of cDNA encoding the novel protein of the present invention and the amino acid sequence encoded thereby (SEQ ID NO: 5).
  • FIG. 8 is a continuation of FIG.
  • FIG. 9 shows the entire nucleotide sequence of cDNA encoding the novel protein of the present invention and the amino acid sequence encoded thereby (SEQ ID NO: 5).
  • FIG. 9 is a continuation of FIG.
  • FIG. 10 shows the entire nucleotide sequence of cDNA encoding the novel protein of the present invention and the amino acid sequence encoded thereby (SEQ ID NO: 5).
  • FIG. 10 is a continuation of FIG.
  • FIG. 11 shows the entire nucleotide sequence of cDNA encoding the novel protein of the present invention and the amino acid sequence encoded thereby (SEQ ID NO: 5).
  • FIG. 11 is a continuation of FIG.
  • FIG. 12 shows the entire nucleotide sequence of cDNA encoding the novel protein of the present invention and the amino acid sequence encoded thereby (SEQ ID NO: 6).
  • FIG. 13 shows the entire nucleotide sequence of cDNA encoding the novel protein of the present invention and the amino acid sequence encoded thereby (SEQ ID NO: 6).
  • FIG. 13 is a continuation of FIG.
  • FIG. 14 shows the entire nucleotide sequence of cDNA encoding the novel protein of the present invention and the amino acid sequence encoded thereby (SEQ ID NO: 6).
  • FIG. 14 is a continuation of FIG.
  • FIG. 15 shows the entire nucleotide sequence of cDNA encoding the novel protein of the present invention and the amino acid sequence encoded thereby (SEQ ID NO: 6).
  • FIG. 15 is a continuation of FIG.
  • FIG. 16 shows the entire nucleotide sequence of cDNA encoding the novel protein of the present invention and the amino acid sequence encoded thereby (SEQ ID NO: 6).
  • FIG. 16 is a continuation of FIG.
  • FIG. 17 shows the entire nucleotide sequence of cDNA encoding the novel protein of the present invention and the amino acid sequence encoded thereby (SEQ ID NO: 6).
  • FIG. 17 is a continuation of FIG.
  • FIG. 18 shows the entire nucleotide sequence of cDNA encoding the novel protein of the present invention and its nucleotide sequence. This shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 6) to be loaded.
  • FIG. 18 is a continuation of FIG.
  • FIG. 19 shows the entire nucleotide sequence of cDNA encoding the novel protein of the present invention and the amino acid sequence encoded thereby (SEQ ID NO: 6).
  • FIG. 19 is a continuation of FIG.
  • FIG. 20 shows the entire nucleotide sequence of cDNA encoding the novel protein of the present invention and the amino acid sequence encoded thereby (SEQ ID NO: 6).
  • FIG. 20 is a continuation of FIG.
  • FIG. 21 shows the entire nucleotide sequence of cDNA encoding the novel protein of the present invention and the amino acid sequence encoded thereby (SEQ ID NO: 6).
  • FIG. 21 is a continuation of FIG.
  • FIG. 22 shows the entire nucleotide sequence of cDNA encoding the novel protein of the present invention and the amino acid sequence encoded thereby (SEQ ID NO: 6).
  • Figure 22 is a continuation of Figure 21.
  • FIG. 23 shows the results of analysis of expression by Northern hybridization.
  • FIG. 24 shows the results of examining the specific interaction between the novel protein of the present invention and Smad3.
  • ARIP1 on the horizontal axis indicates the novel protein of the present invention.
  • the interaction on the vertical axis indicates the intensity of luciferase activity.
  • Examples of the protein having an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 6 in the present invention include human warm-blooded animals (eg, guinea pig, rat, mouse). , Chickens, egrets, bushes, sheep, sheep, monkeys, monkeys, etc.) [eg, hepatocytes, spleen cells, nerve cells, glial cells, kidney / 3 cells, bone marrow cells, mesangium cells, Langerhans cells, epidermal cells , Epithelial cells, endothelial cells, fibroblasts, fibrocytes, muscle cells, adipocytes, immune cells (eg, macrophages, T cells, B cells, natural killer cells, mast cells, neutrophils, basophils, Acidocytes, monocytes, etc.), megakaryocytes, synovial cells, chondrocytes, bone cells, osteoblasts, osteoclasts, breast cells, or stromal cells,
  • Replacement paper Vesicles, stem cells or cancerous cells, etc.
  • any tissue in which these cells are present eg, brain, various parts of the brain (eg, olfactory bulb, amygdala, basal sphere, hippocampus, thalamus, hypothalamus, cerebrum) Spinal cord, medulla, cerebellum, etc.) spinal cord, pituitary, stomach, fl spleen, kidney, liver, gonad, thyroid, gall bladder, bone marrow, adrenal gland, skin, muscle, lung, gastrointestinal tract (eg, large intestine, small intestine, etc.), Blood vessels, heart, thymus, spleen, submandibular gland, peripheral blood, prostate, testes, ovaries, placenta, uterus, bones, joints, skeletal muscle, etc.] or blood cells or their cell lines (especially brain) Or a synthetic protein.
  • brain various parts of the brain (eg, olfactory bulb, am
  • the protein having an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 6 is approximately 50% of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 6. Above, preferably about 70% or more, more preferably about 90% or more, most preferably about 95% or more amino acid sequence having homology.
  • the protein having an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 6 of the present invention is, for example, a protein represented by the aforementioned SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 6.
  • Substantially the same physiological activity includes, for example, qualitative factors such as receptor affinity, ability to transmit signal information, and specificity of organ expression distribution. Substantially identical indicates that their bioactivity is biologically or physiologically equivalent. Therefore, it is preferable that the activities such as the strength of receptor affinity are the same (for example, about 0.1 to 20 times, and preferably about 0.5 to 2 times). Quantitative factors such as the molecular weight of the protein may differ.
  • the affinity of the receptor can be measured according to a method known per se.
  • the force can be measured according to a screening method described later.
  • the protein of the present invention include, for example, one or more (preferably about 1 to 30 and more preferably 1 to 30) in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 6.
  • amino acid sequences represented by the deleted amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 6 preferably about 1 to 30, more preferably about 1 to 10, more preferably Is an amino acid sequence in which several amino acids have been added or inserted, and one or more (preferably about 1 to 30 and more preferably) in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 6.
  • a so-called mutin such as a protein containing an amino acid sequence in which one to about ten (preferably several) amino acids have been substituted with another amino acid, or an amino acid sequence obtained by combining them, is also included.
  • the protein has a N-terminus (amino terminus) at the left end and a C-terminus (aminopropyl terminus) at the right end according to the convention of peptide notation.
  • the proteins of the present invention including the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 6, usually have a carboxyl group (one COOH) or a carboxylate (one C ⁇ _ ), But the C-terminus may be an amide (one CONH 2 ) or an ester (one COOR).
  • R in the ester e.g., methyl, Echiru, n- propyl Le, C ⁇ 6 alkyl group such as isopropyl or n- butyl, consequent opening pentyl, C 3 _ 8 cycloalkyl group such as cyclohexyl , for example, phenylene Le, C 6 _ 12 Ariru groups such as ⁇ - naphthyl, for example, benzyl, phenethyl, C e- i 2 Ariru such ⁇ - naphthylmethyl - other C physicians 2 alkyl group, as an oral ester A commonly used bivaloyloxymethyl ester or the like is used.
  • the protein of the present invention When the protein of the present invention has a carboxyl group (or carboxylate) at a position other than the C-terminus, the protein of the present invention also includes those in which the carbonyl group is amidated or esterified.
  • the ester in this case, for example, the above-mentioned C-terminal ester and the like are used.
  • the proteins of the present invention what is Amino groups Mechionin residue at the N-terminus is protected with a protecting group (e.g., formyl group, etc. ( ⁇ _ 6 Ashiru group such Asechiru group), cleaved in vivo
  • a protecting group e.g., formyl group, etc. ( ⁇ _ 6 Ashiru group such Asechiru group)
  • the glutamic acid residue at the N-terminus that is formed is a pyridal amine, located on the side chain of an amino acid in the molecule, for example, ⁇ H, COO Compounds in which H, NH 2 , SH, etc. are protected with an appropriate protecting group (for example, formyl group, acetyl group, etc .: 6- acyl group, etc.), or complex such as so-called glycoprotein to which a sugar chain is bound It also includes proteins and the like.
  • a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 6, or the like is used.
  • the protein of the present invention has a PDZ domain or (and) WW domain, preferably 5 PDZ domains or (and) 2 WW domains, and is specifically expressed in the brain.
  • the protein of the present invention binds to an activin receptor isolated as a serine / threonine kinase type receptor via a PDZ domain, and binds to an intracellular signaling molecule of activin via a WW domain.
  • the activin receptor may be any subtype of the activin receptor, but among them, the activin receptor IIA-N is preferably used.
  • intracellular signaling molecules of activin examples include Smads such as Smad1, 2, 3, 4, 5, 6, and 7.
  • Smads such as Smad1, 2, 3, 4, 5, 6, and 7.
  • the protein of the present invention binds particularly strongly to Smad3.
  • the protein of the present invention has five PDZ domains and two WW domains, is specifically expressed in the brain, and has a binding ability to activin receptor or (and) Smad3.
  • the partial peptide of the protein of the present invention is a partial peptide of the above-mentioned protein of the present invention, and is a physiological activity possessed by the protein of the present invention, for example, an activity such as receptor affinity, signal transduction ability, and organ expression. Any material may be used as long as it has specificity of distribution. For example, 100 or more, preferably 250 or more, more preferably 350 or more, more preferably 500 or more, most preferably 800 or more of the constituent amino acid sequences of the protein of the present invention. Peptides having 0 or more amino acid sequences and having receptor affinity, signal transduction ability, and the like are used.
  • the partial peptide of the present invention may have one or more (preferably Preferably, about 1 to 10 amino acids are deleted, and more preferably 1 to 2 or more (preferably about 1 to 20 amino acids, more preferably 1 to 20 amino acids are deleted). About 1 to 10 amino acids, more preferably several amino acids are added, or 1 or 2 or more (preferably about 1 to 10 amino acids, more preferably about several amino acids) in the amino acid sequence. (Preferably about 1 to 5 amino acids) may be substituted with another amino acid.
  • the partial peptide of the present invention usually has a carboxyl group (one COOH) or a carboxylate (one C ⁇ ) at the C-terminus, but has an amide (—CONH 2 ) or It may be an ester (-COOR).
  • the partial peptide of the present invention has an N-terminal methionine residue in which the amino group of the methionine residue is protected by a protecting group, and is formed by cleavage of the N-terminal side in vivo.
  • the partial peptide of the present invention preferably has an ability to bind to an activin receptor or (and) the above-described activin intracellular signaling molecule (particularly, Smad 3).
  • the salt of the protein of the present invention or its partial peptide is preferably a physiologically acceptable acid addition salt.
  • examples of such salts include salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid) or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid) , Tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, and benzenesulfonic acid).
  • inorganic acids eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid
  • organic acids eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid
  • Tartaric acid citric acid, malic acid, oxalic acid
  • benzoic acid methanesulfonic acid, and benzenesul
  • salts with inorganic bases for example, alkali metals such as sodium and potassium, alkaline earth metals such as calcium and magnesium, aluminum or ammonium
  • organic bases for example, trimethylamine, triethylamine, pyridine, picoline, 2,6-lutidine, ethanolamine, diethanolamine, triethanolamine, cyclohexylamine, dicyclohexylamine, N, N 'dibenzylethylenediamine, etc.
  • Salts and the like are also used.
  • the protein of the present invention or a salt thereof can be produced from the above-described human warm-blooded animal cells or tissues by a method known per se or by culturing a transformant containing a DNA encoding the protein described below.
  • the human or mammalian tissues or cells are homogenized, extracted with an acid or the like, and the extract is subjected to chromatography such as reverse phase chromatography or ion exchange chromatography. It can be isolated and purified by a combination of chromatography.
  • resins for protein synthesis can be used.
  • resins include chloromethyl resin, hydroxymethyl resin, benzhydrylamine resin, aminomethyl resin, 4-benzyloxybenzyl alcohol resin, 4-methylbenzhydrylamine resin, PAM resin, and 4-hydroxy resin.
  • amino acids having a suitably protected amino group and side chain functional group are condensed on the resin in accordance with the sequence of the target protein according to various known condensation methods.
  • the protein is cleaved from the resin, and at the same time, various protecting groups are removed.
  • an intramolecular disulfide bond formation reaction is carried out in a highly diluted solution to obtain the target protein, its partial peptide, or an amide thereof. To get.
  • carbodiimides are particularly preferable.
  • carbodiimides include DCC, N, N'-diisopropylcarboimide, N-ethyl-N '-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide, and the like.
  • Activation by these includes racemization inhibitor additives (eg, HOB t, HOO
  • the protected amino acid can be directly added to the resin together with B t) or can be added to the resin after activating the protected amino acid in advance as a symmetric acid anhydride or HOB t ester or HOOB t ester.
  • the solvent used for activating the protected amino acid or condensing with the resin can be appropriately selected from solvents known to be usable for the protein condensation reaction.
  • acid amides such as N, N-dimethylformamide, N, N-dimethylacetamide, N-methylpyrrolidone, halogenated hydrocarbons such as methylene chloride, chloroform, trifluoroethanol, etc.
  • Alcohols sulfoxides such as dimethyl sulfoxide, ethers such as pyridine, dioxane and tetrahydrofuran, nitriles such as acetonitrile and propionitrile, esters such as methyl acetate and ethyl acetate, or an appropriate mixture thereof. Is used.
  • the reaction temperature is appropriately selected from a range known to be usable for a protein bond formation reaction, and is usually appropriately selected from a range of about ⁇ 20 to 50 ° C.
  • the activated amino acid derivative is usually used in a 1.5 to 4-fold excess.
  • Examples of the protecting group for the amino group in the raw material include Z, Boc, tert-pentyloxycarbonyl, isopolnyloxycarbonyl, 4-methoxybenzyloxycarbonyl, CI—Z, Br—Z, and adaman.
  • Tyloxycarbonyl, trifluoroacetyl, phthaloyl, formyl, 2-nitrophenylsulfenyl, diphenylphosphinothioyl, Fmoc and the like are used.
  • the lipoxyl group can be, for example, alkyl esterified (eg, methyl, ethyl, propyl, butyl, tert-butyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl, cyclooctyl, 2-adamantyl, etc.) Or cyclic alkyl esterification), aralkyl esterification, (eg, benzyl ester, 412 trobenzyl ester, 4-methoxybenzyl ester, 4-cyclobenzyl ester, benzhydryl esterification), phenacyl ester Benzyloxycarbonyl hydrazide, tert-butoxycarbyl hydrazide, trityl hydrazide and the like.
  • alkyl esterified eg, methyl, ethyl, propyl, butyl, tert-butyl, cyclopentyl, cyclohex
  • the hydroxyl group of serine can be protected, for example, by esterification or etherification.
  • a group suitable for the esterification for example, a lower alkanol group such as an acetyl group, an aroyl group such as a benzoyl group, a group derived from carbonic acid such as a benzyloxycarbonyl group, an ethoxycarbonyl group and the like are used.
  • the group suitable for etherification include a benzyl group, a tetrahydrobiranyl group, and a tert-butyl group.
  • the protecting group of the phenolic hydroxyl group of tyrosine for example, B z 1, C 1 2 - B z 1, 2- two Torobenjiru, B r _ Z, tert - butyl, etc. Ru is used.
  • imidazole protecting group for histidine for example, Tos, 4-methoxy-2,3,6-trimethylbenzenesulfonyl, DNP, benzyloxymethyl, Bum, Boc, Trt :, Fmoc and the like are used. .
  • Activated carboxyl groups of the raw materials include, for example, the corresponding acid anhydrides, azides, and active esters [alcohols (eg, phenol, 2, 4, 5—trichlorophenol, 2, 4 —Dinitrophenol, cyanomethyl alcohol, paranitrophenol, ester with HONB, N-hydroxysuccinimide, HOBt).
  • active esters eg, phenol, 2, 4, 5—trichlorophenol, 2, 4 —Dinitrophenol, cyanomethyl alcohol, paranitrophenol, ester with HONB, N-hydroxysuccinimide, HOBt.
  • Methods for removing (eliminating) protecting groups include, for example, catalytic reduction in a stream of hydrogen in the presence of a catalyst such as Pd black or Pd—carbon, or hydrogen fluoride anhydride or methanesulfonic acid.
  • a catalyst such as Pd black or Pd—carbon
  • the elimination reaction by the above acid treatment is generally carried out at a temperature of about 120 to 40 ° C.
  • the protection of the functional group which should not be involved in the reaction of the raw materials, the protection group, the elimination of the protective group, and the activation of the functional group involved in the reaction can be appropriately selected from known groups or known means.
  • an amide of a protein or its partial peptide for example, first, amidating and protecting the ⁇ -carboxyl group of the carboxyl-terminal amino acid, a peptide (protein) chain is added to the amino group side of the desired chain.
  • the two proteins (partial peptides) are condensed in a mixed solvent as described above. Details of the condensation reaction are the same as described above.
  • the crude protein (partial peptide) is purified by using various known purification means, and the main fraction is lyophilized to obtain an amide of the desired protein (partial peptide).
  • an ester form of a protein or its partial peptide for example, after condensing the ⁇ -carboxyl group of the carboxyl terminal amino acid with a desired alcohol to form an amino acid ester, the same as the amide form of the protein (partial peptide)
  • an ester form of the desired protein (partial peptide) can be obtained.
  • the partial peptide of the present invention or a salt thereof can be produced according to a peptide synthesis method known per se, or by cleaving the protein of the present invention with an appropriate peptidase.
  • a peptide synthesis method for example, any of a solid phase synthesis method and a liquid phase synthesis method may be used. That is, the partial peptide or amino acid that can constitute the protein of the present invention is condensed with the remaining portion, and the product has a protecting group. In such a case, the desired peptide can be produced by removing the protecting group. Examples of the known condensation method and elimination of the protecting group include the methods described in the following 1 to 5.
  • the protein of the present invention or a partial peptide thereof can be isolated and purified by a combination of ordinary purification methods such as solvent extraction, distillation, column chromatography, liquid chromatography, and recrystallization. it can.
  • the protein or its partial peptide obtained by the above method is a free form, it can be converted into an appropriate salt by a known method. Therefore, it can be converted to a free form.
  • the DNA encoding the protein of the present invention may be any DNA as long as it contains the above-described nucleotide sequence encoding the protein of the present invention.
  • any of genomic DNA, genomic DNA library, the above-described cell-tissue-derived cDNA, the above-described cell-tissue-derived cDNA library isolated by a method known per se, and synthetic DNA May be.
  • the vector used for the library may be any of bacteriophage, plasmid, cosmid, phagemid and the like. Further, using a preparation of a tota 1 RNA fraction or an mRNA fraction from the cells and tissues described above, the reverse Transcriptase Polymerase C It can also be isolated by in Reaction (hereinafter abbreviated as RT-PCR method).
  • Examples of the DNA encoding the protein of the present invention include (1) a DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO: 8, or (2) SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO: 8.
  • Examples of the DNA that can hybridize with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 7 or 8 under high stringency conditions include, for example, the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO: 8 DNA containing a nucleotide sequence having a homology of about 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more.
  • Hybridization can be performed by a method known per se or a method analogous thereto, for example, molecular cloning (Molecular Cloning) 2 nd (J. Sam rooketa 1., Cold Spring Harbor La). b. Press, 1989).
  • molecular cloning Molecular Cloning 2 nd (J. Sam rooketa 1., Cold Spring Harbor La). b. Press, 1989).
  • a commercially available library it can be performed according to the method described in the attached instruction manual. More preferably, it can be performed under high stringency conditions.
  • High stringency conditions include, for example, conditions of about 19 to 40 mM sodium concentration, preferably about 19 to 2 OmM, and a temperature of about 50 to 70 :, preferably about 60 to 65: Show.
  • a sodium concentration of about 19 mM and a temperature of about 65 ° C are most preferable.
  • DNA encoding the protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 6 includes DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO: 8, and the like. Is used.
  • the DNA encoding the partial peptide of the present invention includes the above-described portion of the present invention. Any peptide may be used as long as it contains the nucleotide sequence encoding the peptide.
  • any of genomic DNA, genomic DNA library, cDNA derived from the above-mentioned cell-tissue, cDNA isolated from the above-described cDNA library derived from the cell / tissue by a method known per se, and synthetic DNA may be used. .
  • the DNA encoding the partial peptide of the present invention is, for example, a DNA containing the nucleotide sequence represented by 1SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO: 8, or 2SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO: 8 Having a nucleotide sequence that hybridizes under high stringent conditions to a nucleotide sequence that encodes a protein having the same activity as the protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 6 DNA having a base sequence is used.
  • a synthetic DN having a base sequence encoding a partial distribution sequence of the protein of the present invention is used.
  • the hybridization method is described in, for example, Molecular Cloning (Molecular Cloning) 2nd (J. Sam rooket. A 1., Old Spring Harbour Lab. Press, 1989). It can be performed according to the method described. When a commercially available library is used, it can be performed according to the method described in the attached instruction manual.
  • the nucleotide sequence of DNA can be converted using known kits such as Mutant TM -G (Takara Shuzo Co., Ltd.) and Mutant TM -K (Takara Shuzo Co., Ltd.) using the Guppeddulex method or the Kunke 1 method. Method known per se, such as It can be performed according to a method according to them.
  • the cloned DNA encoding the protein of the present invention can be used as it is depending on the purpose, or can be digested with a restriction enzyme or added with a linker if desired.
  • the DNA may have ATG as a translation initiation codon at its 5 'end and TAA, TGA or TAG as a translation termination codon at its 3' end. These translation initiation codon and translation termination codon can also be added using an appropriate synthetic DNA adapter.
  • the expression vector for the protein of the present invention includes, for example, (a) cutting out a DNA fragment of interest from DNA encoding the protein of the present invention, and (mouth) placing the DNA fragment downstream of a promoter in an appropriate expression vector. It can be manufactured by linking.
  • Escherichia coli-derived plasmids eg, pBR322, pBR325, pUC12, pUC13
  • Bacillus subtilis-derived plasmids eg, pUB110, pTP5, pC) 194
  • yeast-derived plasmids eg, pSH19, pSH15
  • bacteriophages such as phage ⁇
  • animal viruses such as retrovirus, vaccinia virus, baculovirus, etc.
  • the promoter used in the present invention corresponds to the host used for gene expression.
  • Any suitable promoter may be used.
  • SV40-derived promoters when animal cells are used as a host, SV40-derived promoters, retroviral promoters, meta-oral thionine promoters, heat shock promoters, cytomegalovirus promoters, SR ⁇ promoters and the like can be mentioned. Among them, it is preferable to use cytomegalovirus promoter, SR promoter; and the like.
  • the trp promoter Yuichi, lac promoter, rec A promoter, ⁇ ⁇ ⁇ promoter, 1 ⁇ ⁇ promoter, etc.
  • the host is Bacillus, SP 0 1 Promo Yoichi: SP02 Promo Yoichi, pe ⁇ ⁇ promoter, etc.
  • the pHO5 promoter, PGK promoter, GAP promoter, ADH promoter and the like are preferable.
  • a polyhedrin promoter, a P10 promoter and the like are preferable.
  • the expression vector may contain, in addition to the above, an enhancer, a splicing signal, a poly-A addition signal, a selection marker, an SV40 replication origin (hereinafter sometimes abbreviated as SV40 ori), and the like, if desired.
  • a selection marker include a dihydrofolate reductase (hereinafter sometimes abbreviated as dhfr) gene [methotrexate (MTX) resistance], an ampicillin resistance gene (hereinafter sometimes abbreviated as Amp), neomycin Resistance gene (hereinafter sometimes abbreviated as Neo, G4 18 resistance) and the like.
  • dhfr gene when used as a selection marker using CHO (dhfr-) cells, a transformant containing the target gene can be selected using a thymidine-free medium.
  • a signal sequence suitable for the host can be added to the N-terminal side of the protein of the present invention.
  • the host is a genus Escherichia, the lipophilic phosphatase signal sequence, OmpA signal sequence, etc., and when the host is a Bacillus genus, the amylase signal sequence, subtilisin, signal sequence, etc.
  • the host is an animal cell, for example, the insulin signal sequence, the human interferon signal sequence, the antibody molecule, and the signal. An array etc. can be used respectively.
  • a transformant can be produced using the vector containing the DNA encoding the protein of the present invention thus constructed.
  • Escherichia bacteria for example, Escherichia bacteria, Bacillus bacteria, yeast, insect cells, insects, animal cells, and the like are used.
  • Escherichia coli K12-DH1 Procedures of the National Academy of Sciences of the United States]. Proc. Natl. Ac ad. Sci. USA), 60, 160 (1968)], JM 103 [Nucleic Acids Research, Vol. 9, 309 (1 981), JA 221] [Journalof Mo 1 ecu 1 ar B ioloy)), 120, 517 (1978)), HB 101 [Journal 'ob' Molecular 'biology, 41, 459 (1969)], C 600 [Genetics, 39, 440 (1954)].
  • Bacillus bacteria examples include, for example, Bacillus subtilis MI114 (Gene, Vol. 24, 255 (1983)), 207-221 [Journa 1 of B ioch em istry), 95, 87 (1 984)).
  • yeast examples include Saccharomyces cerevisiae AH22, AH22R—, NA87-11A, DKD—5D, 20B—12, and Schizosaccharomyces bomb (Schizosacchar omy cesp ombe) NCYC 1913, NCYC 2036, Saccharomyces pichia pastoris (S acchar omy cespicjiapastoris) and the like are used.
  • insect cells for example, when the virus is Ac NPV, a cell line derived from a larva of night rob moth (S podopterafrugiperdace 11; S f cell), an MG 1 cell derived from the midgut of T richoplusiani, and Trieh ⁇ ⁇ 1 derived from egg H igh F ive TM cells Usiani, such as M am estrabrassicae derived cells or E sti gm enaacrea derived cells are used.
  • Sf cell include Sf9 cell (ATCC CRL 1711), Sf21 cell (Vaughn, J.L., et al., In vivo, 13, 213) -217, 1977).
  • insects for example, silkworm larvae and the like are used [Maeda et al., Neichia- (Nature), 315, 592 (1985)].
  • animal cells include monkey cells COS-7, Vero, Chinese hamster cells CHO, and DHFR gene-deficient Chinese hamster cells CH
  • mice L cells mouse L cells
  • mouse AtT 20
  • mouse myeloma cells mouse GH3, human FL cells, and the like.
  • a transformant transformed with the expression vector containing the DNA encoding the protein can be obtained.
  • a liquid medium is suitable as a culture medium, and a carbon source necessary for the growth of the transformant is contained therein. , Nitrogen sources, inorganic substances and others.
  • Examples of the carbon source include glucose, dextrin, soluble starch, and sucrose.
  • Examples of the nitrogen source include ammonium salts, nitrates, corn chip lica, peptone, casein, meat extract, soybean meal, potato
  • Examples of the inorganic or organic substance and the inorganic substance such as the extract include calcium chloride, sodium dihydrogen phosphate, and magnesium chloride.
  • yeast extract, vitamins, growth promoting factors and the like may be added.
  • the pH of the medium is preferably about 5 to 8.
  • Examples of a medium for culturing Escherichia bacteria include, for example, M9 medium containing glucose and casamino acid [Miller, Journal of Experiment 'in', Molecular Genetics (Japan). ntsin Molecular Ge netics, 4 3 1-4 3 3, Co Id Spring Spring Laboratory, New York 1 97 2]
  • a drug such as 3 / 3-indolylacrylic acid can be added.
  • culturing is usually performed at about 15 to 43 for about 3 to 24 hours, and if necessary, aeration and stirring can be applied.
  • culturing is usually performed at about 30 to 40 ° C for about 6 to 24 hours, and if necessary, aeration and stirring may be added.
  • the cultivation is usually performed at about 20 to 35 ° C for about 24 to 72 hours, and aeration and stirring are added as necessary.
  • the medium may be G races Insect Medium (G race, TCC, Nature, 195, 788 (1962)). It is possible to use a mixture to which an additive such as 10% serum which has been immobilized is appropriately added.
  • the pH of the medium is adjusted to about 6.2 to 6.4. Culture is usually performed at about 27 ° C for about 3 to 5 days, and aeration and agitation are added as necessary.
  • a MEM medium containing about 5 to 20% fetal bovine serum [Science, 122, 501 (1952)] , DMEM medium [V iro 1 ogy, Vol. 8, 396 (1959)], RPM I 1640 medium [Journal of America, Association of American Medical Association] ric an Medical As sociati on) l 99 vol. 5 19 (1967)], 199 medium [Proceding of the Society for the Biological Medicine] dicine), 73, 1 (1950)].
  • the pH is between about 6 and 8.
  • Culture is usually performed at about 30 ° C to 40 ° C for about 15 to 60 hours, and aeration and agitation are added as necessary.
  • the protein of the present invention can be produced in a culture medium or a transformant.
  • the protein of the present invention can be separated and purified from the above culture by, for example, the following method.
  • the cells or cells When extracting the protein of the present invention from cultured cells or cells, after culturing, the cells or cells are collected by a known method, suspended in an appropriate buffer, and then subjected to sonication, lysozyme and z or freeze-thawing. After the cells or cells are destroyed by the method described above, a method of obtaining a crude extract of the protein by centrifugation or filtration is used as appropriate. Protein denaturants, such as urea and guanidine hydrochloride, and Triton X -A surfactant such as 100 (trade name) may be contained. When the protein is secreted into the culture solution, after completion of the culture, the supernatant is separated from the cells or cells by a method known per se, and the supernatant is collected.
  • Protein denaturants such as urea and guanidine hydrochloride, and Triton X -A surfactant such as 100 (trade name) may be contained.
  • Purification of the protein contained in the thus obtained culture supernatant or extract can be carried out by appropriately combining known separation and purification methods.
  • known separation and purification methods include methods using solubility such as salting out and solvent precipitation, dialysis, ultrafiltration, gel filtration, and SDS-polyacrylamide gel electrophoresis.
  • a method that utilizes a difference in hydrophobicity, such as matography, and a method that uses a difference in isoelectric point, such as isoelectric focusing, are used.
  • the protein thus obtained when it is obtained in a free form, it can be converted to a salt by a method known per se or a method analogous thereto, and conversely, when the protein is obtained in a salt, a method known per se or The salt can be converted to a salt or another salt by an analogous method.
  • the protein produced by the recombinant can be arbitrarily modified or the polypeptide can be partially removed by the action of an appropriate protein-modifying enzyme before or after purification.
  • an appropriate protein-modifying enzyme for example, trypsin, chymotrypsin, arginyl endopeptidase, protein kinase, glycosidase and the like are used.
  • the activity of the thus produced protein of the present invention or a salt thereof can be measured by a binding experiment with a labeled ligand, an enzymimnoassay using a specific antibody, or the like.
  • the antibody against the protein of the present invention, its partial peptide or a salt thereof may be any of a polyclonal antibody and a monoclonal antibody as long as it can recognize the protein of the present invention, its partial peptide or a salt thereof. Is also good.
  • the protein of the present invention can be produced using the protein of the present invention as an antigen according to a method for producing an antibody or antiserum known per se.
  • the protein of the present invention is administered by itself or together with a carrier or a diluent to a site where antibody production is possible by administration to a warm-blooded animal.
  • Complete Freund's adjuvant / incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance antibody production upon administration. Administration is usually performed once every 2 to 6 weeks, for a total of 2 to 10 times.
  • warm-blooded animals to be used include monkeys, rabbits, rabbits, dogs, guinea pigs, mice, rats, sheep, goats, and chickens, and mice and rats are preferably used.
  • a warm-blooded animal immunized with an antigen for example, a mouse with an antibody titer is selected from a mouse, and the spleen or lymph node is collected 2 to 5 days after the final immunization.
  • an antigen for example, a mouse with an antibody titer
  • myeloma cells By fusing the contained antibody-producing cells with myeloma cells, monoclonal antibody-producing hybridomas can be prepared.
  • the antibody titer in the antiserum can be measured, for example, by reacting a labeled protein described below with the antiserum, and then measuring the activity of a labeling agent bound to the antibody.
  • the fusion operation can be performed according to a known method, for example, the method of Kayla and Milstein [Nature, 256, 495 (19775)].
  • the fusion promoter include polyethylene glycol (PEG) and Sendai virus, but preferably PEG is used.
  • PEG polyethylene glycol
  • myeloma cells include NS-1, P3U1, SP2 / 0, and AP-1. P3U1 is preferably used.
  • the preferred ratio between the number of antibody-producing cells (spleen cells) and the number of myeloma cells used is about 1: 1 to 20: 1, and PEG (preferably PEG100 to PEG600) is used. 0) is added at a concentration of about 10 to 80%, and incubation at 20 to 40 ° C, preferably 30 to 37, for 1 to 10 minutes allows efficient cell fusion.
  • an anti-immunoglobin purified by adding a hybridoma culture supernatant to a solid phase (for example, a microplate) on which a protein antigen is adsorbed directly or together with a carrier, and then labeled with a radioactive substance, an enzyme, or the like.
  • a solid phase for example, a microplate
  • an antibody an anti-mouse immunoglobulin antibody is used when the cells used for cell fusion are mice
  • protein A an anti-immune glopurin antibody or protein A
  • Selection of the anti-protein monoclonal antibody can be performed by a method known per se or a method analogous thereto. Usually, it can be performed in a medium for animal cells supplemented with HAT (hypoxanthine, aminopterin, thymidine). As a medium for selection and breeding, any medium may be used as long as it can grow eightybridomas.
  • HAT hyperxanthine, aminopterin, thymidine
  • any medium may be used as long as it can grow eightybridomas.
  • RPMI 1640 medium containing 1 to 20%, preferably 10 to 20% fetal bovine serum, GIT medium containing 1 to 10% fetal bovine serum (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
  • a serum-free medium for hybridoma culture SFM-101, Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.
  • the culturing temperature is usually 20 to 40, preferably about 37 ° C.
  • the culture time is usually 5 days to 3 weeks, preferably 1 week to 2 weeks.
  • the cultivation can usually be performed under 5% carbon dioxide.
  • the antibody titer of the hybridoma culture supernatant can be measured in the same manner as the measurement of the anti-protein antibody titer in the antiserum described above.
  • Separation and purification of anti-protein monoclonal antibodies can be performed by a method known per se, for example, an immunoglobulin separation and purification method [eg, salting out method, alcohol precipitation method, isoelectric point precipitation method, electrophoresis method, ion exchanger (eg, DEAE) )), Ultracentrifugation, gel filtration, specific purification method in which only antibodies are collected using an antigen-bound solid phase or an active adsorbent such as protein A or protein G, and the bonds are dissociated to obtain antibodies. It can be carried out.
  • an immunoglobulin separation and purification method eg, salting out method, alcohol precipitation method, isoelectric point precipitation method, electrophoresis method, ion exchanger (eg, DEAE)
  • Ultracentrifugation gel filtration, specific purification method in which only antibodies are collected using an antigen-bound solid phase or an active adsorbent such as protein A or protein G, and the bonds are dissociated to obtain antibodies
  • the polyclonal antibody of the present invention can be obtained by a method known per se or a method analogous thereto. Therefore, it can be manufactured. For example, a complex of an immunizing antigen (protein antigen) and a carrier protein is formed, a warm blood animal is immunized in the same manner as in the above-described monoclonal antibody production method, and an antibody-containing substance against the protein of the present invention is obtained from the immunized animal. It can be produced by collecting the sample and separating and purifying the antibody.
  • the type of carrier protein and the mixing ratio of carrier and hapten are determined by antibody against hapten immunized by cross-linking with carrier. If efficient, cross-linking can be carried out in any ratio at any ratio.For example, ⁇ ⁇ serum albumin ⁇ ⁇ thyroglobulin, hemocyanin, etc., in a weight ratio of about 0 to 1 for hapten A method of coupling at a rate of 1 to 20, preferably about 1 to 5 is used.
  • various condensing agents can be used for coupling of the hapten and the carrier.
  • daltaraldehyde ⁇ carbodiimide, maleimide active ester, an active ester reagent containing a thiol group or a dithiopyridyl group, or the like is used. .
  • the condensation product is administered to a warm-blooded animal at a site where antibody production is possible or together with a carrier or diluent.
  • Complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance the antibody-producing ability upon administration.
  • the administration is usually performed once every about 2 to 6 weeks, for a total of about 3 to 10 times.
  • the polyclonal antibody can be collected from the blood, ascites, etc., preferably from the blood of a warm-blooded animal immunized by the above method.
  • the measurement of the polyclonal antibody titer in the antiserum can be performed in the same manner as the measurement of the antibody titer in the antiserum described above. Separation and purification of the polyclonal antibody can be performed according to the same method for separation and purification of immunoglobulin as in the above-described separation and purification of the monoclonal antibody.
  • the antisense DNA having a nucleotide sequence substantially complementary to the DNA or mRNA encoding the protein or partial peptide of the present invention includes the protein of the present invention.
  • nucleotide sequence substantially complementary to the nucleotide sequence of DNA or mRNA encoding white matter or a partial peptide or a partial nucleotide sequence thereof, and has an action capable of suppressing the expression of the protein or the partial peptide.
  • Any antisense DNA may be used as long as it has an oligonucleotide or a derivative thereof.
  • the nucleotide sequence substantially complementary to the DNA or mRNA is, for example, about the same as the entire nucleotide sequence or a partial nucleotide sequence of the nucleotide sequence complementary to the DNA or mRNA (that is, the complementary strand of the DNA or mRNA).
  • a base sequence having 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, and still more preferably about 95% or more homology is exemplified.
  • the complementary strand of the nucleotide sequence encoding the N-terminal site of the protein of the present invention for example, the nucleotide sequence near the start codon).
  • An antisense DNA having a homology of about 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, and even more preferably about 95% or more is suitable. These antisense DNAs can be produced using a known DNA synthesizer or the like.
  • a protein of the present invention, a partial peptide thereof, or a salt thereof (hereinafter sometimes abbreviated as the protein of the present invention), a DNA encoding the protein of the present invention or a partial peptide thereof (hereinafter abbreviated as a DNA of the present invention)
  • Antibodies) to the protein of the present invention (hereinafter sometimes abbreviated as the antibody of the present invention) and antisense DNA can be obtained by (1) a method for determining a binding protein to the protein of the present invention, and (2) a recombinant protein.
  • the protein of the present invention is useful as a reagent for searching for or determining a binding protein to the protein of the present invention.
  • the present invention provides a method for determining a binding protein to the protein of the present invention, which comprises screening a binding protein that interacts with the protein of the present invention.
  • the method for determining a binding protein of the present invention comprises, on a host cell expression vector,
  • a vector in which the protein of the present invention is fused to the DNA binding region of the transcription factor and (2) a fusion library of the test protein and the transcription activation region, and the transcription factor binding region is retained on the promoter.
  • a protein or a salt thereof that interacts with a reporter gene is determined by changing the expression level of the reporter gene, which is increased by the binding of two types of proteins, into a host cell having the reporter gene.
  • the method for determining a binding protein of the present invention is characterized by using a two-hybrid method, which detects an interaction between a protein of the present invention and a test protein by converting the interaction into expression of a specific reporter gene.
  • the DNA encoding the protein of the present invention used in the method for determining a binding protein contains an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 6 of the present invention. Any nucleotide may be used as long as it contains a nucleotide sequence encoding a protein or a nucleotide sequence encoding a partial peptide thereof.
  • Genomic DNA of warm-blooded animals eg, humans
  • genomic DNA library of warm-blooded animals eg, humans
  • cDNA from tissues and cells of warm-blooded animals eg, humans
  • warm-blooded It may be DNA isolated from a tissue or cell-derived cDNA library of an animal (eg, a human), a synthetic or semi-synthetic DNA.
  • the vector used for the library is bacteriophage. Page, plasmid, cosmid, phagemid and the like.
  • mRNA can be directly isolated by RT-PCR using the mRNA fraction prepared from tissue 'cells, or a partial base sequence can be chemically synthesized and ligated. It can also be manufactured by having
  • test protein library As a test protein library to be screened, a commercially available cDNA library derived from various organs of various animals (such as MATCHM AKER cDNA produced by C1ontech) is used.
  • pAS2-1 As a vector for expressing a fusion protein of a DNA binding region and a test protein, pAS2-1, pGBT9, pKAD-09, pSD09, pEG202, pBTM116 and the like are used.
  • pGAD424, pACT2 pKT10Gal-VP, pJG4-5, PVP16 and the like are used as a vector for expressing a fusion protein of a transcription factor activation region and a protein.
  • GAL4, LexA, SRF and the like are used as transcription factors.
  • a b-galactosidase gene (LacZ), a histidine gene (HIS3), a luciferase gene, a chloramphenico-l-acetyltransferase gene and the like are used.
  • yeast S accharomyces cerevisiae
  • Escherichia coli As host cells, yeast (S accharomyces cerevisiae), Escherichia coli and the like are used. Among them, CG-1945, Y190, ⁇ 187, HF7c, S FY 526, L40, EGY48, HIS / L 1, A 62 L yeast strain is used.
  • a method of determining a protein that binds to the protein is as follows: a DNA fragment containing a nucleotide sequence encoding the protein and a DNA binding region on a plasmid (eg, pAS2-1) are encoded. A plasmid bound to the same flanking frame as the DNA fragment containing the nucleotide sequence, and a DNA fragment containing the nucleotide sequence encoding the transcription activation region of a transcription factor (eg, GAL4) on plasmid (eg, pACT2).
  • a cDNA library that binds and is expressed in the form of a fusion protein can be prepared, for example, by using Molecular Cloning 2 nd (J. Sam rooket.
  • a 1., Old Spring). Haror La b. Press, 198 9) can be prepared.
  • plasmids for example, Saccharomyces cerevisiae Y190
  • they can be transformed simultaneously, or one of the plasmids can be introduced first. Later the other may be introduced sequentially, for example, Methodsin Enzymo lo gy, Volume 194, 182—187 (1991), Processings Bu The National Academy of Sciences of the US — (Proc. Natl. Acad. Sci. USA) 75, 1929 (1 978), etc. Can be performed according to the method described in (1).
  • the expression can be detected by converting the expression of the reporter gene of the transformant, the amount of reporter enzyme coloring or fluorescent substance produced or the amount of luminescence. More specifically, when the host cell is yeast, expression of the reporter gene (eg, i3-galactosidase activity) can be determined by using the replica plate method or the Fill-Ill method, preferably using the Fill-Il method. It can be detected by white color screening.
  • expression of the reporter gene eg, i3-galactosidase activity
  • the replica plate method or the Fill-Ill method preferably using the Fill-Il method. It can be detected by white color screening.
  • Colonies that have been colored (eg, blue) by the Phil's method are, for example, AP ractical Ap proach (B arte 1, P.L. eta 1., Ox ford Un iversity Press, Ox ford; 153-179, 1993 a)
  • AP ractical Ap proach B arte 1, P.L. eta 1., Ox ford Un iversity Press, Ox ford; 153-179, 1993 a
  • a single colony of a positive clone can be isolated by treatment according to the method described in a.
  • the plasmid DNA is recovered, and the receptor for the protein of the present invention can be determined by determining the nucleotide sequence of the DNA.
  • the binding protein to the protein of the present invention can be determined using a commercially available kit, for example, MATCHMAKER GAL 4 Two—Hybrid Systems (Clontech). The method can be performed according to the method described in the instruction manual.
  • the expression site of the binding protein and the action of the protein of the present invention via the binding protein can be clarified.
  • DNA encoding the protein of the present invention can be used as an agent for preventing or treating diseases mediated by the binding protein.
  • the protein of the present invention since the protein of the present invention exhibits a binding activity to an activin receptor or an activin intracellular signaling molecule, it can be used as an agent for preventing or treating a disease mediated by an activin receptor or an activin intracellular signaling molecule. Can be.
  • the gene of the protein of the present invention since the gene of the protein of the present invention is specifically expressed in the brain, it causes neuronal abnormalities or brain diseases related to the binding protein, activin receptor or intracellular signaling molecule.
  • DNA encoding the protein of the present invention is administered to the patient to express it, or DNA encoding the protein of the present invention is introduced into (mouth) brain cells or the like. After the expression, the effect of the protein of the present invention on the brain cells of the patient can be sufficiently exerted, for example, by transplanting the brain cells into the patient. Therefore, the DNA encoding the protein of the present invention can be used as a safe and low-toxicity agent for preventing or treating diseases mediated by a protein binding protein of the present invention, an activin receptor or an activin intracellular signaling molecule. it can.
  • the DNA of the present invention When the DNA of the present invention is used as the above-mentioned therapeutic agent, it is used alone or after inserting it into an appropriate vector such as a retrovirus vector, an adenovirus vector, an adenovirus associated virus vector, and the like. It can be implemented according to the means. For example, sterile solutions or suspensions in tablets or capsules, capsules, elixirs, microcapsules, etc., as needed, orally, or in water or other pharmaceutically acceptable liquids It can be used parenterally in the form of injections such as liquids.
  • the DNA of the present invention is mixed with physiologically acceptable carriers, flavoring agents, excipients, vehicles, preservatives, stabilizers, binders, and the like in a unit dosage form generally required for the practice of pharmaceutical preparations.
  • physiologically acceptable carriers flavoring agents, excipients, vehicles, preservatives, stabilizers, binders, and the like
  • the amount of the active ingredient in these preparations is such that an appropriate dose in the specified range can be obtained.
  • Additives that can be incorporated into tablets, capsules, etc. include, for example, binders such as gelatin, corn starch, tragacanth, gum arabic, excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, alginic acid, etc.
  • binders such as gelatin, corn starch, tragacanth, gum arabic
  • excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, alginic acid, etc.
  • leavening agents such as magnesium stearate
  • sweeteners such as sucrose, lactose or saccharin
  • flavoring agents such as peppermint, cocoa oil or cherry are used.
  • a liquid carrier such as oils and fats can be further contained in the above type of material.
  • Sterile compositions for injection can be formulated according to normal pharmaceutical practice such as dissolving or suspending the active substance in vehicles such as water for injection, and naturally occurring vegetable oils such as sesame oil, coconut oil and the like.
  • aqueous liquids for injection include physiological saline, isotonic solutions containing bud sugar and other adjuvants (eg, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.).
  • bud sugar and other adjuvants eg, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.
  • alcohol eg, ethanol
  • polyalcohol eg, propylene glycol, polyethylene glycol
  • non-ionic surfactant eg, polysorbate 80 (trade name), HCO-50
  • you may.
  • the oily liquid include sesame oil and soybean oil, which may be used in combination with solubilizers such as benzyl benzoate and benzyl alcohol.
  • buffers eg, phosphate buffer, sodium acetate buffer
  • soothing agents eg, benzalkonium chloride, proforce hydrochloride, etc.
  • stabilizers eg, human serum albumin, polyethylene glycol, etc.
  • storage Agents eg, benzyl alcohol, phenol, etc.
  • antioxidants eg, antioxidants and the like.
  • the prepared injection solution is usually filled into a suitable ampoule.
  • the preparations obtained in this way are safe and low toxic, so they can be used in, for example, It can be administered.
  • the dose of the DNA varies depending on the symptoms and the like, but in the case of oral administration, generally, in an adult (as 6 OK g), about 0.1 to 100 mg, preferably about 1 to 100 mg per day is used.
  • the single dose varies depending on the subject of administration, target organ, symptoms, administration method, etc.
  • it is usually daily for an adult (60 kg).
  • the dose can be administered in terms of 60 kg.
  • the protein of the present invention and its binding protein can be prepared by using the protein of the present invention or a salt thereof, or by constructing an expression system for a recombinant binding protein and using a protein competitive binding assay system using the expression system.
  • a protein competitive binding assay system using the expression system.
  • peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, etc. or salts thereof can be screened.
  • a reporter gene expression system two-hybrid method
  • Compounds eg, peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, etc.
  • salts thereof that inhibit or promote the binding to the binding protein can be screened.
  • Such a compound includes a compound having a cell stimulating activity (eg, an activity of promoting or suppressing proliferation, phosphorylation of an intracellular protein, etc.) via a binding protein (a so-called agonist) and a compound having such a cell stimulating activity.
  • a cell stimulating activity eg, an activity of promoting or suppressing proliferation, phosphorylation of an intracellular protein, etc.
  • a binding protein a so-called agonist
  • antagonists Compounds that do not have this (so-called antagonists) are included.
  • the protein that binds to the protein of the present invention the protein determined in the above (1), the activin receptor, the above-described activin intracellular signaling molecule (particularly, Smad such as Smad3) and the like are used. Hereinafter, these may be abbreviated as a binding protein to the protein of the present invention.
  • the present invention provides
  • the protein binding to the protein of the present invention is a membrane-bound protein (for example, a transmembrane receptor, a channel, etc.), it contains the labeled protein of the present invention or a salt thereof, and a protein binding to the protein of the present invention.
  • the labeled protein of the present invention or a salt thereof and the test compound are used.
  • the amount of the labeled protein of the present invention or a salt thereof bound to the cell or the membrane fraction is measured and compared.
  • the binding protein used in the screening method of the present invention may be any binding protein containing the binding protein or a salt thereof, but is preferably an extract of a warm-blooded animal organ. is there.
  • binding proteins or salts thereof expressed in large amounts using gene recombination techniques are suitable for screening.
  • the above-mentioned method is used.
  • Complementary DNA is used for the DNA fragment encoding the target portion, but is not necessarily limited thereto.
  • a gene fragment or a synthetic DNA may be used.
  • the DNA fragments In order to introduce DNA fragments encoding the binding protein into host animal cells and express them efficiently, the DNA fragments must be expressed by nuclear polyhedrosis virus belonging to baculovirus using insects as a host.
  • NPV polyhedrin promoter
  • Promoter from SV40 Retrovirus Promoter
  • Metamouth Cionine Promoter Human Heat Shock Promoter
  • Cytomegalovirus Promoter SR It is preferably incorporated downstream, such as a promoter.
  • the amount and quality of the expressed binding protein can be examined by a method known per se. For example, the literature CN amb i. P. et al., The Journal of Biological Chemistry, (J. Biol. Chem.), 2667, 1955-55-1955 Page 9, 1992].
  • the protein containing a binding protein or a salt thereof may be a binding protein or a salt thereof purified according to a method known per se, or using a cell containing the protein.
  • the protein is a membrane-bound protein, a membrane fraction of cells containing the protein may be used.
  • the cells When cells containing a binding protein are used in the screening method of the present invention, the cells may be immobilized with daltaraldehyde, formalin, or the like.
  • the solidification can be performed according to a method known per se.
  • the cell containing the binding protein refers to a host cell that has expressed the binding protein.
  • the host cell includes Escherichia coli, Bacillus subtilis, yeast, insect cells, animal cells, and the like.
  • the membrane fraction refers to a fraction abundant in cell membrane obtained by disrupting cells and then obtained by a method known per se.
  • the cells can be disrupted by crushing the cells with a Potter-E1Vehj em-type homogenizer, by crushing with a ⁇ ⁇ ⁇ -ring renderer or polytron (Kine 11 matica), or by ultrasound. Crushing, and crushing by ejecting cells from a thin nozzle while applying pressure with a French press or the like.
  • fractionation by centrifugal force such as fractionation centrifugation or density gradient centrifugation is mainly used.
  • the cell lysate is centrifuged at low speed (500 to 3000 rpm) for a short time (typically about 1 to 10 minutes), and the supernatant is centrifuged at higher speed (15000 to 30000 rpm) for 30 to 2 hours.
  • the resulting precipitate is used as a membrane fraction.
  • the membrane fraction is rich in the expressed binding protein and membrane components such as cell-derived phospholipids and membrane proteins.
  • the amount of bound protein in cells or in the membrane fraction containing the binding protein, from 1 cell per 10 2 to 1 0 8 molecule is preferably 1 0 5 10 7 molecules of virtuous suitable .
  • binding protein fraction is preferably a natural binding protein fraction or a recombinant binding protein fraction having an activity equivalent thereto.
  • equivalent activity means equivalent binding activity to the protein of the present invention.
  • Examples of the labeled protein of the present invention include a labeled protein of the present invention, a labeled protein analog compound of the present invention, and the like.
  • a labeled protein of the present invention a labeled protein of the present invention
  • a labeled protein analog compound of the present invention a labeled protein analog compound of the present invention
  • protein of the present invention such as [ 14 C] or [ 135 S].
  • a binding protein sample by suspending in a buffer suitable for the procedure. Buffers such as phosphate buffer pH 4 to 10 (preferably pH 6 to 8) and Tris-HCl buffer Any buffer may be used as long as it does not inhibit the binding between the protein of the present invention and the protein binding to the protein of the present invention.
  • Buffers such as phosphate buffer pH 4 to 10 (preferably pH 6 to 8) and Tris-HCl buffer Any buffer may be used as long as it does not inhibit the binding between the protein of the present invention and the protein binding to the protein of the present invention.
  • a surfactant such as CHAPS, Tween-80 (trade name) (manufactured by Kao-Atlas), digitonin, or dexcholate can be added to the buffer.
  • a protease inhibitor such as PMS F, leptin, E-64 (manufactured by Peptide Research Institute), and peptide sutin is added to suppress the degradation of the binding protein and the protein of the present invention by the protease. You can also.
  • a fixed amount (500 to 500,000 cpm) of the labeled protein of the present invention is added to 0.01 to 10 ml of the binding protein solution, and simultaneously, 10 to 4 to 1 Coexist with 0–1 Q M test compound.
  • a reaction tube containing a large excess of unlabeled protein of the present invention is also prepared to determine the amount of non-specific binding (NSB).
  • the reaction is carried out at 0 to 50 ° C, preferably 4 to 37 ° C, for 20 minutes to 24 hours, preferably 30 minutes to 3 hours.
  • the reaction solution is filtered through a glass fiber filter paper or the like, washed with an appropriate amount of the same buffer, and the radioactivity remaining on the glass fiber filter paper is measured with a liquid scintillation counter or an air counter.
  • the specific binding amount (B—NS) A test compound having a B) of, for example, 50% or less can be selected as a candidate substance having a competitive inhibitory ability, while a test compound having a specific binding amount (B-NSB) of, for example, 150% or more Can be selected as a candidate compound having a binding promoting ability.
  • a plasmid expressing the gene of the protein of the present invention and a plasmid of the present invention are required.
  • the host cell is yeast
  • a protein obtained by fusing a yeast cell with the protein of the present invention and the DNA binding region of a transcriptional regulator is used.
  • a transformant having introduced therein a plasmid capable of expressing a protein and a plasmid capable of expressing a protein obtained by fusing a binding protein to the protein of the present invention with an activation region of a transcriptional control factor was introduced in the same manner as described above. Make it. Carrying out the screening, the transformant is cultured from 2 to 4 days at 30 ° C on agar medium containing test compound 10- 1 G M 10 one 4.
  • agar medium As the agar medium, SD medium deficient in tritophan leucine / histidine, SD medium deficient in tritophan leucine, and the like are used. Then, in order to detect the expression of the reporter gene as the color of the colony due to the 3-galactosidase activity, detection is performed using a filter method or the like. For detection, place a Whatman # 5 filter or VWR Grade 410 filter moistened with Z-buffer X-al (C ontech) on the filter on which the transformant is attached, and place at 30 ° C for 30 minutes to 8 minutes. After incubation for a period of time, the color of the colonies on the filter is compared with that of the transformant as a control containing no test compound.
  • a filter method or the like For detection, place a Whatman # 5 filter or VWR Grade 410 filter moistened with Z-buffer X-al (C ontech) on the filter on which the transformant is attached, and place at 30 ° C for 30 minutes
  • test compound added to the culture medium of the colony showing a darker color than the control was added as a candidate compound having a binding promoting ability, and was added to the culture medium of the colony showing a lighter color.
  • a test compound can be selected as a candidate compound capable of inhibiting binding.
  • the expression of the reporter gene can be quantified as 3-galactosidase activity by measuring the amount of o-nitrophenol produced by decomposition of the substrate.
  • liquid medium Tritophan / mouth isin-histidine-deficient SD medium, Tritotofan Z-leucine-deficient SD medium and the like are used.
  • OD 600 is 1.0 and so as shaking from 30 3 5 hours incubation from 0.5.
  • a part of the culture solution is centrifuged, and ⁇ -ditrofenilgalactoside solution (Sigma) is added to the Z buffer solution of ⁇ -mercaptoethanol to react.
  • the reaction is carried out at 0 to 50 for 3 minutes to 24 hours, preferably at 30 for 30 minutes to 15 hours, and the absorbance at 42 O nm ( ⁇ D 420 ) of the yellow-colored supernatant is measured.
  • the 3-galactosidase activity is calculated from the obtained absorbance (OD 42 () ) using the following formula and calculating the mirror unit (M i 11 e runit).
  • the addition of the test compound to the medium increased the galactosidase activity value by about 10% or more, preferably about 20% or more, more preferably about 30% or more, and most preferably about 50% or more.
  • the test compound can be selected as a candidate compound capable of promoting the binding between the protein of the present invention and a protein binding to the protein of the present invention.
  • the 3-galactosidase activity value is about 10% or more, preferably about 20% or more, more preferably about 30% or more, and most preferably about 5% or more.
  • the test compound can be selected as a candidate compound capable of inhibiting the binding between the protein of the present invention and the binding protein to the protein of the present invention.
  • DNA encoding a binding protein to the protein of the present invention is required.
  • the DNA encoding the protein binding to the protein of the present invention is preferably DNA containing the DNA or DNA that hybridizes with the DNA under high stringent conditions.
  • Test compounds include, for example, peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, and animal tissue extracts, and these compounds are novel compounds. Or a known compound.
  • a kit for screening a compound or a salt thereof that inhibits or promotes the binding of the protein of the present invention to a protein binding to the protein of the present invention includes the protein of the present invention or a salt thereof, a partial peptide thereof or a salt thereof, Cells containing the binding protein to the protein of the present invention, extracted fractions of cells containing the protein binding to the protein of the present invention, or plasmids expressing the protein obtained by fusing the protein of the present invention with the DNA binding region of the transcriptional regulator. It contains a transformant into which a binding protein for the protein of the present invention and a plasmid that allows expression of a protein obtained by fusing the activation region of a transcription control factor are introduced. Examples of the screening kit of the present invention include the following. 1. Screening reagent
  • Plasmid expressing a protein obtained by fusing the protein of the present invention with a DNA binding region of a transcriptional regulator and a plasmid expressing a protein obtained by fusing an activin II A-N receptor protein with an activation region of a transcriptional regulator are provided. Introduced and transformed yeast strain Y190
  • Tributofan / mouth isin histidine-deficient SD medium: yeast nitrogen source (Difco) After sterilizing an aqueous solution in an autoclave, L-isoleucine, L-valine, L-adenine hemisulfate, L-arginine hydrochloride, L-lysine hydrochloride Add the drop solution, sterilized in an autoclave consisting of salt, L-methionine, L-phenylalanine, L-threonine, L-tyrosine, and L-peracyl, and stored in step 4. Further, add 40% dextrose Z stock solution (Sigma) sterilized by filtration in the filter, adjust to 2%, and store in 4 or prepare at the time of use .
  • yeast nitrogen source Difco
  • YPD medium After sterilizing an aqueous solution of yeast extract in Difco peptone with a autoclave, add 40% dextrose filtered and sterilized in the filter overnight, adjust the final concentration to 2%, and store in 4 or It may be prepared at the time of use.
  • Z buffer Na 2 HP_ ⁇ 4 '7H 2 ⁇ , NaH 2 P0 4' comprises H 2 0, KC 1, Mg S_ ⁇ 4 '7H 2 0, adjusted to pH around 7, and sterilized in an autoclave, It may be stored in step 4 or prepared at the time of use.
  • Z-buffer] 3-mercaptoethanol A solution obtained by adding] 3-mercaptoethanol in a ratio of 0.27 to 100 of Z-buffer.
  • ⁇ -Nitrofenil galactoside solution (Sigma) is dissolved in Z buffer and adjusted to a concentration of 4 mg / ml before use.
  • the compound or its salt obtained by using the screening method or the screening kit of the present invention is a protein of the present invention (among others).
  • a compound that inhibits or promotes the binding of the compound hereinafter referred to as a promoting compound).
  • Compounds that inhibit the binding of the protein of the present invention to the protein binding to the protein of the present invention include the following: A compound or a salt thereof (a so-called agonist) which inhibits the binding between the protein of the present invention and the binding protein to the protein of the present invention and has cell stimulating activity itself through the binding protein; The binding inhibits the binding between the protein of the present invention and the binding protein to the protein of the present invention, but does not itself have a cell stimulating activity via the binding protein or a salt thereof (so-called antagonist); (3) Compounds that inhibit the binding between the protein of the present invention and the binding protein to the protein of the present invention without binding to the protein binding to the protein of the present invention (hereinafter abbreviated as inhibitory compounds) or salts thereof are included. It is.
  • the presence or absence of the binding property between the compound obtained by using the screening method or the screening kit of the present invention or a salt thereof and the binding protein to the protein of the present invention should be confirmed according to the above-described method for measuring the binding activity. Can be.
  • the cell stimulating activity via the binding protein can be measured according to a method known per se or a method analogous thereto.
  • Compounds obtained using the screening method or screening kit of the present invention include peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, and the like, and these compounds may be novel compounds. However, a known compound may be used.
  • the composition is particularly useful as a prophylactic / therapeutic agent for neuronal abnormalities or brain diseases related to the binding protein or the activin receptor (eg, Alheimer's disease, Parkinson's disease, epilepsy, Huntington's chorea, etc.).
  • the antagonist or inhibitory compound can suppress the physiological activity of the protein of the present invention, and therefore, is a safe and low toxic pharmaceutical composition for inhibiting the protein activity, particularly the binding protein or activin. It is useful as a prophylactic / therapeutic agent for receptor-related neuronal abnormalities or brain diseases (eg, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, epilepsy, Huntington's chorea, etc.).
  • receptor-related neuronal abnormalities or brain diseases eg, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, epilepsy, Huntington's chorea, etc.
  • the compound or a salt thereof can be carried out in a conventional manner.
  • a physiologically acceptable carrier, flavoring agent, excipient, vehicle, preservative, stabilizer, binder, etc. in a unit dosage form generally required for accepted pharmaceutical practice. It can be manufactured by mixing. The amount of the active ingredient in these preparations is such that an appropriate dose in the specified range can be obtained.
  • additives that can be incorporated into tablets, capsules, etc.
  • binders such as gelatin, corn starch, tragacanth, gum arabic, excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, and alginic acid.
  • a swelling agent such as magnesium stearate, a sweetener such as sucrose, lactose or saccharin, and a flavoring agent such as peppermint, cocoa oil or cherry.
  • a liquid carrier such as oils and fats can be further contained in the above type of material.
  • a sterile composition for injection can be formulated according to a conventional pharmaceutical preparation such as dissolving or suspending an active substance in a vehicle such as water for injection, or a naturally occurring vegetable oil such as sesame oil or coconut oil.
  • aqueous liquids for injection examples include physiological saline, isotonic solutions containing glucose and other adjuvants (eg, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.). such as an alcohol (e.g., ethanol), polyalcohol (e.g., propylene glycol, polyethylene glycol - Le), nonionic surfactant (eg, polysorbate 8 0 TM, HCO- 5 0) such as in combination with Is also good.
  • an alcohol e.g., ethanol
  • polyalcohol e.g., propylene glycol, polyethylene glycol - Le
  • nonionic surfactant eg, polysorbate 8 0 TM, HCO- 5 0
  • oily liquid for example, sesame oil, soybean oil, and the like are used, and may be used in combination with benzyl benzoate, benzyl alcohol, or the like as a solubilizing agent.
  • buffers eg, phosphate buffer, sodium acetate buffer
  • soothing agents eg, benzalkonium chloride, proforce hydrochloride, etc.
  • stabilizers eg, human serum buffer
  • a preservative eg, benzyl alcohol, phenol, etc.
  • an antioxidant etc.
  • the prepared injection solution is usually filled into a suitable ampoule.
  • preparations obtained in this way are safe and low toxic, they can be administered, for example, to mammals (for example, rats, puppies, higgs, bush, puppies, cats, dogs, monkeys, humans, etc.). can do.
  • mammals for example, rats, puppies, higgs, bush, puppies, cats, dogs, monkeys, humans, etc.
  • the dose of the compound or a salt thereof varies depending on the symptoms and the like. However, in the case of oral administration, generally, in an adult (as 6 OKg), the dose is usually about 0.
  • the single dose varies depending on the target of administration, target organ, symptom administration method, etc. For example, in the case of injection, it is usually used in adults (as 6 OKg). , From about 0.0 1 per day
  • About 3 Omg preferably about 0.1 to 2 Omg, more preferably about 0.1 to 2 Omg.
  • the protein antibody of the present invention can specifically recognize the protein or the like of the present invention, it may be used for quantification of the protein or the like of the present invention in a test solution, particularly for quantification by a sandwich immunoassay. Can be.
  • the protein or the like of the present invention can be measured using a monoclonal antibody that recognizes the protein or the like of the present invention (hereinafter, may be referred to as an anti-protein antibody), and can also be detected by tissue staining or the like.
  • an anti-protein antibody a monoclonal antibody that recognizes the protein or the like of the present invention
  • the antibody molecule itself may be used, or the F (ab ') 2 , Fa' or Fab fraction of the antibody molecule may be used.
  • the method for measuring the protein or the like of the present invention using the antibody of the present invention is not particularly limited, and may be an antibody, an antigen or an antibody corresponding to the amount of the antigen in the liquid to be measured (eg, the amount of the protein of the present invention). Any method that detects the amount of the antigen complex by chemical or physical means and calculates it from a standard curve prepared using a standard solution containing a known amount of antigen can be used. Good. For example, it is particularly preferable to use a sandwich method described later in terms of power sensitivity and specificity in which nephrometry, competition method, immunometric method and sandwich method are suitably used.
  • Radioisotope such as a light emitting substance, for example, [1 2 5 I], [1 3 1 I ], [3 H], [1 4 C], etc. as the enzyme, large are preferable specific activity stable, for example iS - galactosidase, beta - glucoside fern Ichize, alkaline phosphatase, Paokishidaze, Malic acid dehydrogenase and the like
  • fluorescent substances include fluorescamine and fluorescein isothiosinate
  • luminescent substances include luminol, luminol derivatives, luciferin and lucigenin.
  • a biotin-avidin system can be used for binding the antibody or antigen to the labeling agent.
  • the insolubilization of the antigen or antibody physical adsorption may be used, or a method using a chemical bond usually used for insolubilizing and immobilizing proteins or enzymes may be used.
  • the carrier include insoluble polysaccharides such as agarose, dextran, and cellulose; synthetic resins such as polystyrene, polyacrylamide, and silicon; and glass.
  • sandwich method a test solution is reacted with an insolubilized anti-protein antibody (primary reaction), and further reacted with a labeled anti-protein antibody (secondary reaction). Then, the activity of the labeling agent on the insolubilized carrier is determined.
  • the amount of the protein of the present invention in the test solution can be quantified.
  • the primary reaction and the secondary reaction may be performed in the reverse order, may be performed simultaneously, or may be performed at staggered times. You may.
  • the labeling agent and the method of insolubilization can be in accordance with those described above.
  • the antibody used for the solid phase antibody or the labeling antibody does not necessarily need to be one kind, and a mixture of two or more kinds of antibodies is used for the purpose of improving measurement sensitivity and the like. May be used.
  • an anti-protein antibody used in the primary reaction and the secondary reaction is preferably an antibody having a different binding site to the protein or the like of the present invention. That is, the antibody used in the primary reaction and the secondary reaction is used in the primary reaction, for example, when the antibody used in the secondary reaction recognizes the C-terminal or N-terminal of the protein or the like of the present invention.
  • the antibody to be used is preferably an antibody that recognizes the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 6.
  • the antibody against the protein or the like of the present invention can be used in a measurement system other than the sandwich method, for example, a competition method, an immunometric method, or a nephrometry.
  • the antigen in the test solution and the labeled antigen are allowed to react competitively with the antibody, and then the labeled antigen from the final reaction is separated from (F) and the labeled antigen (B) bound to the antibody.
  • BZF separation Measure the amount of any of B, F, and label to determine the amount of antigen in the test wave.
  • a soluble antibody is used as an antibody
  • B / F separation is performed using polyethylene glycol
  • a liquid phase method using a second antibody against the antibody a solid phase antibody is used as the first antibody
  • a solid-phase method using a solid-phased antibody as the second antibody is used.
  • the antigen in the test solution and the immobilized antigen are subjected to a competitive reaction with a certain amount of labeled antibody, and then the solid phase and the liquid phase are separated.
  • the antigen is allowed to react with an excess amount of the labeled antibody. After binding the antibody to the solid phase, the solid phase and the liquid phase are separated. Next, the amount of label in either phase is measured to determine the amount of antigen in the test solution.
  • the amount of insoluble sediment generated as a result of the antigen-antibody reaction in a gel or in a solution is measured. Even when the amount of antigen in the test solution is small and only a small amount of sediment is obtained, laser nephrometry utilizing scattering by a laser is preferably used.
  • the measurement system for the protein of the present invention may be constructed by adding ordinary technical considerations of those skilled in the art to the ordinary conditions operating method in each method.
  • the measurement system for the protein of the present invention may be constructed by adding ordinary technical considerations of those skilled in the art to the ordinary conditions operating method in each method.
  • reviews and compendiums for example, Hiroe Irie, edited by “Radio Noatssey” (Kodansha, published in 1974), edited by Hiroshi Irie “Continuing Radio Imnoatssey” (Kodansha, published in 1979), edited by Eiji Ishikawa et al.
  • the protein or the like of the present invention can be quantified with high sensitivity by using an antibody against the protein or the like of the present invention. Further, by quantifying the concentration of the protein or the like of the present invention using an antibody against the protein or the like of the present invention, for example, a disease associated with the protein or the like of the present invention can be diagnosed.
  • the antibody of the present invention can be used for detecting the protein of the present invention or the like present in a subject such as a body fluid or a tissue.
  • preparation of an antibody column used for purifying the protein of the present invention, detection of the protein of the present invention in each fraction at the time of purification, analysis of the behavior of the protein of the present invention, etc. in test cells, etc. Can be used for
  • the DNA of the present invention can be used, for example, in humans or warm-blooded animals (e.g., rats, mice, guinea pigs, egrets, birds, higgies, pigs, pigs, dogs, cats, dogs, (Monkeys, chimpanzees, etc.) can be used to detect gene abnormalities encoding the protein of the present invention or partial peptides thereof, and thus are useful as agents for gene diagnosis, for example, mutation of the DNA or abnormal accumulation or decrease of mRNA. It is.
  • warm-blooded animals e.g., rats, mice, guinea pigs, egrets, birds, higgies, pigs, pigs, dogs, cats, dogs, (Monkeys, chimpanzees, etc.
  • the above-described genetic diagnosis using the DNA of the present invention can be performed, for example, by the well-known Northern hybridization—PCR-SSCP method (Genomics, Vol. 5, pp. 874-879 (1989)), Proceedings of the National Academy of Sciences, Volume 86, Procedings of the National Academy of Sciences, United States, Volume 86 , Pp. 2766-2770 (1989)).
  • Antisense DNA that can complementarily bind to DNA or mRNA encoding the protein or the like of the present invention and suppress transcription or translation of the mRNA suppresses abnormal expression of a gene encoding the protein or the like of the present invention. can do. Obedience
  • the antisense DNA can be used, for example, as an agent for preventing or treating a disease caused by abnormal expression of a gene encoding the protein or the like of the present invention.
  • the antisense DNA is used as the above-mentioned prophylactic / therapeutic agent, it can be produced in the same manner as the above-mentioned drug containing the DNA of the present invention.
  • the antisense DNA is inserted alone or into an appropriate vector such as a retrovirus vector, an adenovirus vector, an adenovirus associated virus vector, and the like, and then administered to humans or warm-blooded animals according to conventional means.
  • an appropriate vector such as a retrovirus vector, an adenovirus vector, an adenovirus associated virus vector, and the like
  • the antisense DNA can be administered as it is or in the form of a formulation together with a physiologically acceptable carrier such as an auxiliary agent for promoting eating, and can be administered with a gene gun or a catheter such as a hydrogel catheter.
  • the antisense DNA can also be used as a diagnostic oligonucleotide probe for examining the presence of the DNA of the present invention in tissues or cells and the state of its expression. (7) Preparation of DNA transgenic animals
  • the present invention has a DNA encoding the exogenous protein of the present invention (hereinafter abbreviated as the exogenous DNA of the present invention) or a mutant DNA thereof (sometimes abbreviated as the exogenous mutant DNA of the present invention).
  • the exogenous DNA of the present invention or a mutant DNA thereof (sometimes abbreviated as the exogenous mutant DNA of the present invention).
  • a non-human mammal is provided.
  • Non-human mammals having the exogenous DNA of the present invention or the mutant DNA thereof include unfertilized eggs, fertilized eggs, germ cells including spermatozoa and their progenitor cells, and the like.
  • the stage of embryonic development in non-human mammal development more preferably at the stage of single cells or fertilized egg cells.
  • by transferring the desired DNA by the calcium phosphate method, electric pulse method, ribofection method, agglutination method, microinjection method, particle gun method, DEAE-dextran method, etc. be able to.
  • the exogenous DNA of the present invention can be transferred to somatic cells, organs of living organisms, tissue cells, and the like, and used for cell culture, tissue culture, and the like.
  • the DNA-transferred animal of the present invention can also be produced by fusing this with the above-mentioned germ cell by a cell fusion method known per se.
  • mice for example, rats, mice, guinea pigs, hams, puppies, higgs, bush, puppies, cats, dogs, etc.
  • rodents that have relatively short ontogeny and biological cycles in terms of the creation of disease animal model systems and are easy to breed, especially mice (for example, pure strains such as C57 BLZ6 and DBA2)
  • mice for example, pure strains such as C57 BLZ6 and DBA2
  • a B6C3Fi line, a BD line, a B6D2Fi line, a BALBZc line, an ICR line, etc., or a rat for example, Wister, SD, etc.
  • mammal in the recombinant vector that can be expressed in mammals, human and the like can be mentioned in addition to the above-mentioned non-human mammals.
  • the exogenous DNA of the present invention refers to a DNA encoding the protein of the present invention once isolated and extracted from a mammal, not the DNA of the present invention originally possessed by a non-human mammal.
  • mutant DNA of the present invention a mutation (for example, mutation) in the base sequence of the original DNA of the present invention, specifically, addition or deletion of a base, DNA with substitution or the like is used, and also includes abnormal DNA.
  • the abnormal DNA means a DNA containing a gene that expresses an abnormal protein of the present invention, such as a DNA containing a gene that expresses a protein that suppresses the function of a normal protein of the present invention. Is used.
  • the exogenous DNA of the present invention may be derived from a mammal that is the same or different from the animal of interest.
  • a promoter capable of expressing the DNA in animal cells can be used. It is generally advantageous to use it as a DNA construct bound downstream in the evening.
  • DNA derived from various mammals eg, egret, dog, cat, guinea pig, hamster, rat, mouse, etc.
  • telomere construct of the present invention eg, vector
  • a target mammal such as a mouse fertilized egg
  • a target mammal such as a mouse fertilized egg
  • Examples of a vector that retains the construct include a plasmid derived from Escherichia coli, a plasmid derived from Bacillus subtilis, a plasmid derived from yeast, a bacteriophage such as ⁇ phage, a retrovirus such as Moroni monoleukemia virus, a vaccinia virus or a baculovirus. Animal viruses are used. Among them, a plasmid derived from Escherichia coli or a plasmid derived from yeast is preferably used.
  • promoters derived from viruses for example, simian virus, cytomegalovirus, Moroni leukemia virus, JC virus, breast cancer virus, poliovirus, etc.
  • mammals of various species human, ⁇ egos, dogs, cats, guinea pigs, hamsters, rats, mice, etc.
  • albumin include albumin, insulin ⁇ , ⁇ robrakin ⁇ ⁇ I, eras yuichi, erythropoietin, endothelin, muscle creatine kinase, glial fibrillary acidic protein, Daryuthion S-transferase, platelet-derived growth factor 3, keratin Kl, K10 and ⁇ 14, collagen type I and type II, cyclic AMP-dependent protein kinase i3 I-subunit, dystrophin, tartaric acid-resistant alkali Pho Sphatase, Atrial natriuretic factor, Endot
  • cytomegalovirus promoter capable of high expression in the whole body.
  • EF-1 ⁇ human polypeptide elongation factor 1 ⁇
  • human and a chicken / 3-actin promoter and the like.
  • the vector preferably has a sequence that terminates the transcription of the mRN of interest in a transgenic mammal of DN ((generally called ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ). Sequences of DNAs derived from various mammals can be used, and preferably, Simian virus SV40, Mines, Mines, etc. is used.
  • the splicing signal of each DNA, the enhancer region, a part of the intron of eukaryotic DNA, etc. are placed 5 'upstream of the promoter region, between the promoter region and the translation region, or translated. It is also possible to connect 3 ′ downstream of the region depending on the purpose.
  • the normal translation region of the protein of the present invention may be a liver, kidney, thyroid cell, fibroblast-derived genome derived from various mammals (eg, egret, dog, cat, guinea pig, hamster, rat, mouse, human, etc.). All or part of genomic DNA from DNA and various commercially available genomic DNA libraries, or complement prepared by known methods from liver, kidney, thyroid cells, and fibroblast-derived RNA
  • an exogenous abnormal DNA can be obtained from the above-described cells or tissues that have developed a disease caused by mutation of the protein of the present invention.
  • a translation region obtained by mutating a translation region of a normal protein obtained from the above cells or tissues by a point mutagenesis method can be produced.
  • the translation region is ligated as a DNA construct that can be expressed in a transgenic animal, downstream of the aforementioned promoter and optionally upstream of a transcription termination site. It can be produced by the usual DNA engineering techniques.
  • Transfer of the exogenous DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in all germ cells and somatic cells of the target mammal.
  • the presence of the exogenous DNA of the present invention in the germinal cells of the produced animal after DNA transfer means that the progeny of the produced animal has the exogenous DNA of the present invention in all of its germ cells and somatic cells. Means to keep. Progeny of such animals that inherit the exogenous DNA of the present invention will have the DNA of the present invention in all of their germinal and somatic cells.
  • the non-human mammal to which the exogenous normal DNA of the present invention has been transferred can be subcultured in a normal breeding environment as a DNA-bearing animal after confirming that it stably retains DNA by mating. .
  • Transfer of the exogenous DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in excess in all germinal and somatic cells of the target mammal.
  • Excessive presence of the exogenous DNA of the present invention in the germinal cells of the produced animal after DNA transfer indicates that all the offspring of the produced animal have the exogenous DNA of the present invention in all of their germ cells and somatic cells.
  • the progeny of this type of animal that inherits the exogenous DNA of the present invention has an excess of the exogenous DNA of the present invention in all of its germinal and somatic cells.
  • the non-human mammal having the normal DNA of the present invention expresses the normal DNA of the present invention at a high level. May develop and can be used as a model animal for the disease state. For example, using the normal DNA-transferred animal of the present invention, the pathological mechanism of hyperactivity of the protein of the present invention and diseases associated with the protein of the present invention will be elucidated, and methods for treating these diseases will be examined. It is possible.
  • the mammal into which the exogenous normal DNA of the present invention has been transferred has an increased symptom of the protein of the present invention, it can be used for a screening test for a therapeutic drug for a disease associated with the protein of the present invention.
  • non-human mammals having the foreign abnormal DNA of the present invention After confirming that the native DNA is stably maintained, the animal can be subcultured in a normal breeding environment as an animal having the DNA. Further, the desired exogenous DNA can be incorporated into the above-mentioned plasmid and used as a raw material.
  • the DNA construct with Promo One Night can be prepared by ordinary genetic engineering techniques. Transfer of the abnormal DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in all germ cells and somatic cells of the target mammal. The presence of the abnormal DNA of the present invention in the germinal cells of the produced animal after the transfer of the DNA means that all the progeny of the produced animal have the abnormal DNA of the present invention in all of its germ cells and somatic cells.
  • the progeny of this type of animal that has inherited DNA has the abnormal DNA of the present invention in all of its germinal and somatic cells.
  • the abnormal DNA of the present invention is highly expressed, and by inhibiting the function of endogenous normal DNA, the function of the protein of the present invention is finally inactivated. It can be a type refractory disease and can be used as a model animal for the disease. For example, using the abnormal DNA transgenic animal of the present invention, it is possible to elucidate the pathological mechanism of the function-inactive refractory of the protein of the present invention and to examine a method for treating this disease.
  • the abnormal DNA highly expressing animal of the present invention is useful for inhibiting the function of the normal protein by the abnormal protein of the present invention in the function-inactive refractory disease of the protein of the present invention. ). Further, since the mammal having transferred the foreign abnormal DNA of the present invention has an increased symptom of the protein of the present invention, it can be used for a therapeutic drug screening test for a functionally inactive refractory disease of the protein of the present invention. .
  • the DNA-transferred animal of the present invention it is possible to examine clinical symptoms of diseases related to the protein of the present invention, including inactive refractory type of the protein of the present invention. More detailed pathological findings in each organ of the relevant disease model can be obtained, which can contribute to the development of new treatment methods and the study and treatment of secondary diseases caused by the disease.
  • a therapeutic agent for a disease associated with the protein of the present invention including a functionally inactive refractory type of the protein of the present invention
  • using the DNA-transferred animal of the present invention It is possible to provide an effective and rapid screening method for the therapeutic agent for the disease by using a method or the like.
  • using the DNA transgenic animal of the present invention or the exogenous DNA expression vector of the present invention it is possible to examine and develop a gene therapy method for a disease associated with the protein of the present invention.
  • bases, amino acids, and the like are represented by abbreviations based on the abbreviations based on IUPAC-I UB Commition on Biochemical Name nc 1 ature or abbreviations commonly used in the art. Yes, examples are given below.
  • amino acids can have optical isomers, the L-form is indicated unless otherwise specified.
  • DNA Deoxylipo nucleic acid c DNA complementary deoxylipo nucleic acid
  • H is histidine P he feniralanin
  • Trt Trityl
  • HONB 1-Hydroxy-5-norbornene-2,3-dical posimid
  • sequence numbers in the sequence listing in the present specification indicate the following sequences.
  • FIG. 1 shows the nucleotide sequence of a DNA fragment encoding the intracellular domain of activin IIA-N receptor protein as a bait plasmid used in the two-hybrid method.
  • the base sequence of a DNA fragment as a probe used in Northern hybridization is shown.
  • the nucleotide sequence of a DNA fragment used as a probe for Northern hybridization is shown.
  • FIG. 1 shows the nucleotide sequence of cDNA encoding a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 of the present invention.
  • coli DH5a / pBSYN3-6 has been deposited with the Ministry of International Trade and Industry at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (NI BH) on December 2, 1998 under the accession number FERM BP-6592. It has been deposited with the Fermentation Research Institute (IF ⁇ ) as the deposit number IFO 16221 from 8th.
  • the EcoRI site and the BamHI site of the DNA binding vector pAS2-1 were cleaved with an appropriate restriction enzyme, treated with alkaline phosphatase, and purified. Thereafter, a DNA fragment encoding the intracellular domain of the activin IIA-N receptor protein represented by SEQ ID NO: 1 was ligated, and the GAL4 DNA-binding domain of interest and the activin IIA-N receptor cell were ligated.
  • a plasmid (pAS-IIA-N) expressing the entire domain as a fusion protein was obtained.
  • GAL4 transcription activation region fusion library plasmid commercially available mouse brain MATCHMAKER cDNA 1ibray (Clontech) was used.
  • the supernatant was discarded and the cells were suspended in 0.5 ml of TE buffer.
  • the resulting cell suspension 100 w1 was spread on a tryptophan-deficient SD medium and cultured at 30 for 4 days to obtain a strain stably retaining the plasmid.
  • the GAL4 transcription activation region fusion library plasmid was also introduced into the yeast strain in the same manner.
  • the resulting transformant (0.2 ml) was spread on a tryptophan Z-leucine Z-histidine-deficient SD medium, cultured at 30 ° C for 8 days, and His + colonies were plated on an agar plate lacking tributofan / mouth isinnohistidine. Streaked.
  • Z buffer 5 m 1 in a petri dish Na 2 HP_ ⁇ 4 '7H 2 ⁇ , N aH 2 P0 4 ⁇ H 2 ⁇ , KC 1, Mg S 0 4 ⁇ 7 H 2 0, pH 7)
  • ZX- gal solution 5-Promote 4-chloro-3-indolyl / 3_D-galactoside in 2% DMF solution
  • a mixture of Z3-mercaptoethanol was added, and the sterilized Petman # 5 film was moistened.
  • the filter was picked up and frozen with liquid nitrogen with the colony face up.
  • the filter was taken out of liquid nitrogen, thawed at room temperature, and then placed on the wetted filter with the colony side up. Close petri dish lid 3 The mixture was kept at 0 for 1 hour, and about 100 positive colonies that turned blue were separated.
  • Each of the obtained positive clones was inoculated into a 3 ml leucine-deficient SD liquid medium and cultured for 2 days. The culture was diluted 10000-fold, spread on a leucine-deficient SD plate, and incubated at 30 ° C. It was kept warm for days. Twenty to thirty colonies were picked with a sterile toothpick and replicated on Tributofan Z-leucine deficient SD plate and leucine deficient SD plate. Here, a colony showing tributophan auxotrophy was selected from the previous positive colonies, and its 3_-galactosidase activity was assayed. Two more colonies showing no activity were selected.
  • the obtained true positive colony was inoculated in 2 ml of YPD liquid medium, and cultured at 30 overnight. The culture is centrifuged at room temperature for 5 seconds, and the supernatant is discarded. Then, 0.2 ml of yeast lysate (2% Triton X—100, 1 SDS, 10 OmM NaC1, 1 OmM Tris—HC 1 (pH 8.0), 1 mM EDTA) was added for suspension. 0.2 ml of phenol black form isoamyl alcohol (25: 24: 1) and glass beads washed with acid were added, and the mixture was stirred with a vortex mixer for 2 minutes.
  • yeast lysate 2% Triton X—100, 1 SDS, 10 OmM NaC1, 1 OmM Tris—HC 1 (pH 8.0), 1 mM EDTA
  • the obtained full length insert of YN3 was labeled with 32 P by a random prime method.
  • mouse brain Lamb dac DNA 1 ibrary (Lamb da ⁇ vector-1: Stratagene) was screened with ordinary plaque hybridization.
  • the full length insert of the obtained clone was screened with ordinary plaque hybridization.
  • the same screening was repeated to obtain a clone thought to have the longest full length insert including the entire coding region of the protein of the present invention.
  • One of the obtained positive phages was subjected to phagemid ((pBluescript) according to the method of Stratagene.
  • ipt SK (1) vector
  • YN3-6 The full-length cDNA (YN3-6) of the protein of the present invention is 5156 bp and has a polypeptide consisting of 116 amino acids represented by SEQ ID NO: 5 [FIG. 1 to FIG. It encoded a polypeptide consisting of 111 amino acids represented by column number: 6 [FIGS. 12 and 22].
  • Plasmid pBSYN3-6 containing full-length cDNA (YN3-6) encoding a polypeptide consisting of the amino acid represented by SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 6 is transformed into Escherichia coli DH5 ⁇ , and a transformant is obtained. : E. coli DH5 aZpBS # 316 was obtained.
  • the DNA fragments represented by SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 in the YN3-6 insert were labeled with digoxigenin using a DIG-PCR probe synthesis kit (Boehringer), Used as a probe.
  • DIG-PCR probe synthesis kit Boehringer
  • brain, liver, spleen, embryo, kidney, heart, testis, ovary, and skeletal muscle were excised from B a 1 b / c mice, and tota 1 RNA was released using TRIZO1 reagent (GI BCO BRL). Extracted. Thereafter, the poly (A) + RNA was purified using PolyATtransactmRNAIso1atioSyStern (Promega).
  • an alkaline phosphatase-labeled anti-digoxigenin antibody (Boehringer) (0.1 M Tris—HC 1 H7.5, 0.15 M NaC 1, 15 OmU / m 1 antibody) and then 0.1 MT ris — Washed three times for 15 minutes using HC I (pH 7.5), 0.15 MNaCl and 0.1% Tween 20.
  • chemiluminescence was performed using Lumi-Phos 530 (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) as a substrate, and was detected by exposure to an X-ray film. As a result, the protein of the present invention was particularly highly expressed in the brain. Was confirmed [Fig. 23].
  • AR IP 1 protein of the present invention
  • DNA constructs for mammals hybrid screening were prepared as follows. That is, a plasmid pBIND was used to express a fusion protein of the GAL4 DNA binding domain and Smad3, and a full-length cDNA encoding human Smad3 was ligated to pBIND and pBIND—Sm ad 3 was created.
  • the plasmid PACT was used to express a fusion protein of the VP16 activation domain and ARIP1.
  • the fragment obtained by PCR was converted to a fragment prepared from the plasmid pBS-ARIP1-short, which had a partial nucleotide sequence of the full-length cDNA encoding ARIP1 (positions 1187 to 4446).
  • the cDNA fragment having the partial base sequence (the 923 to 4446th position) of the full-length cDNA encoding AR IP1 produced by the ligation was subcloned into pACT to produce pACT-AR IP1.
  • the mammalian two-hybrid assay was performed according to the protocol using CheckMateMamian Two-Hybrid System (Promega) as a kit. Plasmids pBIND-Smad3 and pACT-ARIP1, obtained from the above, derived from cytomegalovirus promoter / 3 gal (CMV- ⁇ gal) and GAL4 responsive promoter The reporter plasmid pG51 uc, which induces the luciferase gene under control, was introduced into CHO cells. The strength of the interaction between Smad 3 and AR IP1 in CHO cells was determined by using the activity of luciferase expressed by the luciferase gene as an index.
  • the luciferase activity was measured by a method known per se (Endocrinology (Endocrino 10 gy), 136, 5493-5503 (1995)) as in the case of] 3 galactosidase activity.
  • AR IP1 showed a direct interaction with Smad 3 in mammalian cells, similar to activin receptor IIA [ Figure 24].
  • an antibody against the protein of the present invention and an antisense DNA can be obtained by (1) determining the binding protein to the protein of the present invention, (2) constructing a recombinant protein expression system, and (3) binding assay using the expression system.
  • 4Drug design based on comparison with structurally similar ligand ⁇ Receptor, ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ Probes and PCR primers in gene diagnosis It can be used as a reagent in the preparation and the like, and can be used as a drug for gene therapy and the like.
  • elucidation of the structure and properties of the protein of the present invention will lead to the development of unique drugs acting on these systems.

Description

明 細 書 新規蛋白質およびその用途 ， 技術分野
本発明は、 特定のアミノ酸配列を有し、 P D Z ドメインまたは （および） W Wドメインを有し、脳に特異的に発現する新規蛋白質、 該蛋白質をコードする D N A領域を含有する D N A、該蛋白質の製造方法および該蛋白質ならびに D N Aの用途に関する。 背景技術
従来、 多数の生理活性物質が単離 ·同定され、 その機能が解明されつつある。 そのなかには、種々の臓器あるいは細胞で多様な活性を示すものもあることが 知られている。 種々の臓器あるいは細胞における多様な生理活性は、 通常、 該 生理活性物質が結合する受容体を介して具現化しているが、その受容体に結合 する生理活性物質の組み合わせがすべての臓器 ·細胞において同一なのか、 あ るいは各臓器 ·細胞に特異的なのかは、 解明されていない例が多い。
生理活性蛋白質の中には P D Z ドメインや WWドメインを持つものがある。 これらドメインは比較的最近見いだされた蛋白質結合ドメインモジュールで ある。 そのため、 P D Zドメインや WWドメインを持つ蛋白質の生体内での分 布、 機能、 制御機構などはまだ多くが不明である。
P D Zドメインを持つ蛋白質は、 その蛋白質結合の機能を介して、細胞膜の 裏打ち構造や細胞骨格のネットワーク形成、さらに細胞内表層に発達した細胞 内シグナル伝達のネットワーク形成などに重要な役割を担っていると考えら れる。神経系においては、 神経伝達物質受容体やイオンチャンネルなどの複合 体形成に係わるなど、シナプス部位の蛋白質クラスターのアセンブリ一に欠か せない。 また、 最近、 シナプス可塑性に伴い発現が調節される P D Z蛋白質が 見出され、 P D Z蛋白質が受容体の再配置などを通じて可塑性に伴うシナプス の形態変化に係わっている可能性があり、発生段階の神経ネットワークの構築 や生体の脳の高次機能にも関与していると考えられる。 P D Zドメインは既知 のペプチド結合ドメインとの共通点もあるが、明らかな特徴的な点も有してい る。
P D Zドメインは細菌から高等植物、動物にまで広く保存されたドメインで あり、 多くの場合、 P D Z ドメインが認識するのは標的蛋白質の C末端の短い アミノ酸配列で、これらの標的蛋白質は膜貫通型受容体やチャンネルであるこ とが多い。 P D Zドメインは同一蛋白質中に 2から 6回程度繰り返された形で 見いだされることが多く、 また、 ほかのドメインモジュールとは異なり、 その いくつかはホモダイマーを形成する。 これらは、 P D Zドメインがシナプスな どの細胞表面構造やタイ トジャンクションなど、細胞間接着における蛋白質架 橋ネッ卜ワークやマイクロドメインの形成などに係わるための重要な特徴で ある。
一方、 WWドメインも酵母から哺乳類までよく保存された約 4 0アミノ酸か ら成るドメインであり、プロリンに富む P Yモチーフと呼ばれる比較的短いァ ミノ酸配列を認識して結合する。 WWドメインを持つ蛋白質としては、 ュビキ チン蛋白質リガ一ゼ、 ジストロフィン、 ホルミン結合蛋白質などがある。 こう した蛋白質には、 1〜 4個の WWドメインが直列に連なつた形で存在している。 WWドメインをもつ蛋白質は他の蛋白質間相互作用にかかわるドメインゃプ ロティフォス夕一ゼ、 r a s G A Pなどの酵素活性ドメインを持つものが多く、 WWドメインが非常に多岐にわたる生体機能を持つことを示唆している。
ァクチビンは、 脳下垂体前葉からの卵胞刺激ホルモン （F S H) の分泌を促 進する調節因子である。従来、脳下垂体からの性腺刺激ホルモンの分泌調節は、 生殖腺で生産されるステロイドホルモンが主であると考えられていたが、ァク チビンおよびこれと相反する作用をもつインヒビンの発見により視床下部一 脳下垂体一生殖器官系の新しいホルモン分泌調節機構として関心を集めてい る。 ァクチビンの生理活性の解析が進むにつれて、 この系は、 F S H分泌調節 以外に血球系や生殖器官の細胞の分化誘導あるいは阻害活性、神経細胞生存維 持活性などの多様な生理活性を有することが解つたが、その詳細な機構につい ては未だ解明されていない点が多レ ^。 本発明は、 特に脳で発現する PDZドメインまたは（および） WWドメイン を持つ蛋白質および該蛋白質に対する結合能を有する受容体（例えば、 ァクチ ビン受容体） および細胞内情報伝達分子 （例えば、 Sma d) の生理活性の解 明、並びにァクチビンーァクチビン受容体系の神経系組織での細胞分化阻害お よび神経栄養因子様活性の詳細な分子機構等を解明する手段として、新規な該 蛋白質の単離法ならびに検出法、 該新規蛋白質遺伝子を含む DNA、該新規蛋 白質遺伝子がコードする蛋白質の製造法、および該 DNAならびに該蛋白質の 用途を提供することを目的とする。 発明の開示
本発明者らは、 上記課題を解決するために、 鋭意研究を行った結果、 配列番 号： 1で表されるマウスァクチビン I I A— N受容体蛋白質の細胞内領域をべ イト （b a i t) とした酵母ッ一ハイブリツド （two— hy b r i d) 法を 用い、 マウス脳 cDN Aライブラリ一より結合蛋白質の探索を行い、 COS 7 細胞内でもァクチピン I I A— N受容体との結合が確認できる c DN Aクロ —ンを得た。 さらに、 このクローンがコードする遺伝子の全長を含む c DNA クローンを単離し解析したところ、 5個の PDZドメインと 2個の WWドメイ ンをコ一ドする領域を含む遺伝子であることを見いだした。この遺伝子にコ一 ドされる該蛋白質は、複数の蛋白質一蛋白質相互作用ドメインを持つ蛋白質因 子であり、 そのうちの PDZドメインを介して、 1) ァクチビン受容体の細胞 内領域と結合し、その結果、 ァクチビンの細胞内への情報伝達を阻害すること、 2)他のサイトカイン類の受容体の細胞内領域とは結合せず、それらの細胞内 情報伝達には影響を及ぼさないことを見いだした。 また、 もう一つの WWドメ ィンを介してァクチビン細胞内情報伝達分子と結合して、ァクチビンの細胞内 への情報伝達を阻害することを見いだした。
さらに、 本発明者らは、 マウスの各種臓器から p o 1 y (A) +RNAを抽 出し、 配列番号： 2、 配列番号： 3または配列番号： 4に示す DNAをプロ一 ブとして用い、ノーザンハイブリダィゼーシヨン法にて本発明の新規蛋白質の 発現を調べたところ、 図 2 3に示すように、 特に脳でその発現が多く見られる ことを見いだした。 このことから、 該新規蛋白質を加えたァクチビンーァクチ ビン受容体情報伝達系は、 脳細胞の増殖 ·分化の制御を司っていることが示唆 され、 脳 ·神経系疾患の診断、 治療等への応用できることを見いだした。 本発明者らは、 これらの知見に基づいて、 さらに検討を重ねた結果、 本発明 を完成するに至った。
すなわち、 本発明は、
1. 配列番号： 5で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミ ノ酸配列を有する蛋白質またはその塩、
2. 配列番号： 6で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミ ノ酸配列を有する蛋白質またはその塩、
3. PD Zドメインおよび WWドメインを有し、 脳に特異的に発現し、 ァクチ ビン受容体または（および） ァクチビン細胞内情報伝達分子に対する結合能を 有する第 1項または第 2項記載の蛋白質、
4. ァクチビン細胞内情報伝達分子が Sm a d 3である第 3項記載の蛋白質。 5. 5つの PDZドメインおよび 2つの WWドメインを有し、 脳に特異的に発 現し、ァクチビン受容体および Sm a d 3に対する結合能を有する第 1項また は第 2項記載の蛋白質、
6. 第 1項記載の蛋白質の部分ペプチド、 第 2項記載の蛋白質の部分ペプチド またはその塩、
7.第 1項記載の蛋白質または第 2項記載の蛋白質をコードする塩基配列を有 する DNAを含有する組換え DNA、
8. 配列番号： 7で表される塩基配列、 配列番号： 8で表される塩基配列また はそれらとハイストリンジェントな条件下でハイブリダィズする塩基配列を 有する第 7項記載の DNA、
9.第 6項記載の部分ペプチドをコ一ドする塩基配列を有する DN Aを含有す る組換え DNA、
10. 第 7項記載の DNAを含有する組換えベクター、
1 1. 第 10項記載の組換えベクターを保持する形質転換体、
12. 第 1 1項記載の形質転換体を培養し、 第 1項記載の蛋白質または第 2項 記載の蛋白質を生成 ·蓄積せしめ、 これを採取することを特徴とする第 1項記 載の蛋白質、 第 2項記載の蛋白質またはその塩の製造方法、
1 3 . 第 1項記載の蛋白質、 第 2項記載の蛋白質、 第 6項記載の部分ペプチド またはその塩に対する抗体、
1 4 . 第 1 3項記載の抗体に対して、 第 1項記載の蛋白質、 第 2項記載の蛋白 質、第 6項記載の部分べプチドまたはその塩を含有する被検液および標識化さ れた第 1項記載の蛋白質、 第 2項記載の蛋白質、第 6項記載の部分ペプチドま たはその塩を競合的に反応させることを特徴とする第 1項記載の蛋白質、第 2 項記載の蛋白質、 第 6項記載の部分べプチドまたはその塩の定量方法、
1 5 . 第 1項記載の蛋白質、 第 2項記載の蛋白質、 第 6項記載の部分ペプチド またはその塩を用いることを特徴とする、第 1項記載の蛋白質、第 2項記載の 蛋白質、第 6項記載の部分ペプチドまたはその塩と結合する蛋白質の決定方法、 1 6 . ①転写因子の D N A結合領域に第 1項記載の蛋白質、第 2項記載の蛋白 質または第 6項記載の部分ペプチドを融合させた発現ベクターと②被検蛋白 質をコードする遺伝子と転写活性化領域との融合ライブラリーとを、該転写因 子結合領域をプロモーター上に保持しているレポーター遺伝子を持つ宿主細 胞に導入し、第 1項記載の蛋白質、 第 2項記載の蛋白質または第 6項記載の部 分ペプチドと被検蛋白質との結合により上昇するレポ一夕一遺伝子の発現量 の変化を測定することを特徴とする第 1 5項記載の決定方法、
1 7 . 第 1 5項記載の方法により得られる、 第 1項記載の蛋白質、 第 2項記載 の蛋白質、第 6項記載の部分ペプチドまたはその塩と結合する蛋白質またはそ の塩、
1 8 . 第 1項記載の蛋白質、 第 2項記載の蛋白質、 第 6項記載の部分ペプチド またはその塩を用いることを特徴とする、第 1項記載の蛋白質、第 2項記載の 蛋白質、第 6項記載の部分ペプチドまたはその塩と、第 1 7項記載の蛋白質も しくはその塩、ァクチビン受容体またはァクチビン細胞内情報伝達分子との結 合を阻害または促進する化合物またはその塩のスクリーニング方法、
1 9 . 標識した第 1項記載の蛋白質、 第 2項記載の蛋白質、 第 6項記載の部分 ペプチドまたはその塩をァクチビン受容体またはァクチビン細胞内情報伝達 分子に接触させた場合と、標識した第 1項記載の蛋白質、第 2項記載の蛋白質、 第 6項記載の部分べプチドまたはその塩および試験化合物をァクチビン受容 体またはァクチビン細胞内情報伝達分子に接触させた場合における、標識した 第 1項記載の蛋白質、第 2項記載の蛋白質、 第 6項記載の部分ペプチドまたは その塩のァクチビン受容体またはァクチビン細胞内情報伝達分子に対する結 合量を測定し、 比較することを特徴とする第 1項記載の蛋白質、第 2項記載の 蛋白質、第 6項記載の部分ペプチドまたはその塩とァクチビン受容体またはァ クチビン細胞内情報伝達分子との結合を阻害または促進する化合物またはそ の塩のスクリーニング方法、
2 0 . 標識した第 1項記載の蛋白質、 第 2項記載の蛋白質、 第 6項記載の部分 ペプチドまたはその塩を第 1 7項記載の蛋白質またはその塩に接触させた場 合と、標識した第 1項記載の蛋白質、 第 2項記載の蛋白質またはその塩および 試験化合物を第 1 7項記載の蛋白質またはその塩に接触させた場合における、 標識した第 1項記載の蛋白質、第 2項記載の蛋白質、第 6項記載の部分べプチ ドまたはその塩の第 1 7項記載の蛋白質またはその塩に対する結合量を測定 し、 比較することを特徴とする第 1項記載の蛋白質、 第 2項記載の蛋白質、 第 6項記載の部分べプチドまたはその塩と第 1 7項記載の蛋白質またはその塩 との結合を阻害または促進する化合物またはその塩のスクリーニング方法、 2 1 . 第 1 7項記載の蛋白質もしくはその塩、 ァクチビン受容体またはァクチ ビン細胞内情報伝達分子を発現した細胞に第 1項記載の蛋白質、第 2項記載の 蛋白質、第 6項記載の部分ペプチドまたはその塩を導入した場合と、第 1 7項 記載の蛋白質もしくはその塩、ァクチビン受容体またはァクチビン細胞内情報 伝達分子を発現した細胞に第 1項記載の蛋白質、 第 2項記載の蛋白質、第 6項 記載の部分ペプチドまたはその塩および試験化合物を導入した場合における、 第 1項記載の蛋白質、第 2項記載の蛋白質、第 6項記載の部分ペプチドまたは その塩の該細胞内における第 1 7項記載の蛋白質もしくはその塩、ァクチビン 受容体またはァクチビン細胞内情報伝達分子に対する結合量を測定し、比較す ることを特徴とする第 1項記載の蛋白質、第 2項記載の蛋白質、第 6項記載の 部分ペプチドまたはその塩と第 1 7項記載の蛋白質もしくはその塩、ァクチビ ン受容体またはァクチビン細胞内情報伝達分子との結合を阻害または促進す る化合物またはその塩のスクリーニング方法、
2 2 . 標識した第 1項記載の蛋白質、 第 2項記載の蛋白質、 第 6項記載の部分 ペプチドまたはその塩を第 1 7項記載の蛋白質もしくはその塩、ァクチビン受 容体またはァクチビン細胞内情報伝達分子を発現した細胞の膜画分に接触さ せた場合と、 標識した第 1項記載の蛋白質、 第 2項記載の蛋白質、 第 6項記載 の部分ペプチドまたはその塩および試験化合物を第 1 7項記載の蛋白質もし くはその塩、ァクチビン受容体またはァクチビン細胞内情報伝達分子を発現し た細胞の膜画分に接触させた場合における、標識した第 1項記載の蛋白質、第 2項記載の蛋白質、第 6項記載の部分べプチドまたはその塩の該細胞の膜画分 に対する結合量を測定し、比較することを特徴とする標識した第 1項記載の蛋 白質、第 2項記載の蛋白質、第 6項記載の部分ペプチドまたはその塩と第 1 7 項記載の蛋白質もしくはその塩、ァクチビン受容体またはァクチビン細胞内情 報伝達分子との結合を阻害または促進する化合物またはその塩のスクリー二 ング方法、
2 3 . 第 1 7項記載の蛋白質もしくはその塩、 ァクチビン受容体またはァクチ ビン細胞内情報伝達分子を発現した細胞に第 1項記載の蛋白質、第 2項記載の 蛋白質またはその塩を導入した場合と、第 1 7項記載の蛋白質もしくはその塩、 ァクチビン受容体またはァクチビン細胞内情報伝達分子を発現した細胞に第 1項記載の蛋白質、第 2項記載の蛋白質、第 6項記載の部分ペプチドまたはそ の塩および試験化合物を導入した場合における、第 1 7項記載の蛋白質もしく はその塩、ァクチビン受容体またはァクチビン細胞内情報伝達分子を介した細 胞刺激活性を測定し、 比較することを特徴とする第 1項記載の蛋白質、第 2項 記載の蛋白質、第 6項記載の部分ペプチドまたはその塩と第 1 7項記載の蛋白 質もしくはその塩、ァクチビン受容体またはァクチビン細胞内情報伝達分子と の結合を阻害または促進する化合物またはその塩のスクリーニング方法、 2 4 . ツー ハイブリッド（ t w o — h y b r i d )法を用いることを特徴とす る第 1 6項記載の蛋白質の決定方法または第 1 8項〜第 2 3項のいずれかに 記載のスクリーニング方法、 2 5 . 第 1項記載の蛋白質、 第 2項記載の蛋白質、 第 6項記載の部分ペプチド またはその塩を含有することを特徴とする、 第 1項記載の蛋白質、 第 2項記載 の蛋白質、 第 6項記載の部分ペプチドまたはその塩と、 第 1 7項記載の蛋白質 もしくはその塩、ァクチビン受容体またはァクチビン細胞内情報伝達分子との 結合を阻害または促進する化合物またはその塩のスクリーニング用キット、 2 6 .第 1 8項〜第 2 3項のいずれかに記載のスクリーニング方法または第 2 5項記載のスクリーニング用キットを用いて得られる、第 1項記載の蛋白質、 第 2項記載の蛋白質、 第 6項記載の部分ペプチドまたはその塩と、 第 1 7項記 載の蛋白質もしくはその塩、ァクチビン受容体またはァクチビン細胞内情報伝 達分子との結合を阻害または促進する化合物またはその塩、
2 7 . 第 1 7項記載の蛋白質、 第 2 6項記載の化合物またはその塩を含有して なる医薬、
2 8 . アルツハイマー病、 パーキンソン病、 てんかん症またはハンチントン舞 踏症の予防 ·治療剤である第 2 7項記載の医薬、
2 9 . 哺乳動物に対して第 1 7項記載の蛋白質、 第 2 6項記載の化合物または その塩を有効量投与することを特徴とする第 1 7項記載の蛋白質もしくはそ の塩、ァクチビン受容体またはァクチビン細胞内情報伝達分子に関連した神経 細胞異常または脳疾患の予防 ·治療方法、 および
3 0 . 第 1 7項記載の蛋白質もしくはその塩、 ァクチビン受容体またはァクチ ビン細胞内情報伝達分子に関連した神経細胞異常または脳疾患の予防 ·治療剤 を製造するための第 1 7項記載の蛋白質、第 2 6項記載の化合物またはその塩 の使用を提供する。
さらに、 本発明は、
3 1 . 蛋白質が、 配列番号： 5で表されるアミノ酸配列、 配列番号： 5で表さ れるアミノ酸配列中における配列番号： 6以外のアミノ酸配列中の 1または 2 個以上 （好ましくは、 2個以上 1 0個以下） のアミノ酸配列が欠失したァミノ 酸配列、 配列番号： 5で表されるアミノ酸配列における配列番号： 6以外のァ ミノ酸配列中に 1または 2個以上 （好ましくは、 2個以上 1 0個以下） のアミ ノ酸配列が付加または挿入されたアミノ酸配列、 あるいは配列番号.' 5で表さ れるアミノ酸配列における配列番号： 6以外のアミノ酸配列中の 1または 2個 以上 （好ましくは、 2個以上 1 0個以下） のアミノ酸配列が他のアミノ酸と置 換されたアミノ酸配列を含有する第 1項記載の蛋白質およびそれらの塩、 32. 酵母を用いる第 24項記載のツーハイプリッド法、
33.第 1 9項〜第 23項のいずれかに記載のスクリーニング方法により得ら れる化合物またはその塩、
34.第 33項記載の化合物またはその塩を含有することを特徴とする医薬組 成物、
35.外来性の第 7項記載の DN Aまたはその変異 DN Aを有する非ヒト哺乳 動物、
36. 非ヒト哺乳動物がげつ歯類動物である第 3 5項記載の非ヒト哺乳動物、 37.げっ歯類動物がマウスまたはラットである第 3 5項記載の非ヒ卜哺乳動 物、 および
38. 外来性の第 7項記載の DNAまたはその変異 DNAを含有し、哺乳動物 において発現しうる組換えべクタ一を提供する。 図面の簡単な説明
図 1は本発明の新規蛋白質をコードする c DN Aの全塩基配列とそれにコー ドされるアミノ酸配列 （配列番号： 5) を示す。
図 2は本発明の新規蛋白質をコードする c DN Aの全塩基配列とそれにコ一 ドされるアミノ酸配列 （配列番号： 5) を示す。 図 2は図 1の続きである。 図 3は本発明の新規蛋白質をコードする c DNAの全塩基配列とそれにコー ドされるアミノ酸配列 （配列番号： 5) を示す。 図 3は図 2の続きである。 図 4は本発明の新規蛋白質をコードする c DN Aの全塩基配列とそれにコ一 ドされるアミノ酸配列 （配列番号： 5) を示す。 図 4は図 3の続きである。 図 5は本発明の新規蛋白質をコードする c DN Aの全塩基配列とそれにコー ドされるアミノ酸配列 （配列番号： 5) を示す。 図 5は図 4の続きである。 図 6は本発明の新規蛋白質をコードする c DNAの全塩基配列とそれにコ一 ドされるアミノ酸配列 （配列番号： 5) を示す。 図 6は図 5の続きである。 図 7は本発明の新規蛋白質をコードする c DNAの全塩基配列とそれにコー ドされるアミノ酸配列 （配列番号： 5) を示す。 図 7は図 6の続きである。 図 8は本発明の新規蛋白質をコードする c DNAの全塩基配列とそれにコー ドされるアミノ酸配列 （配列番号： 5) を示す。 図 8は図 7の続きである。 図 9は本発明の新規蛋白質をコードする c DN Aの全塩基配列とそれにコー ドされるアミノ酸配列 （配列番号： 5) を示す。 図 9は図 8の続きである。 図 1 0は本発明の新規蛋白質をコードする c DNAの全塩基配列とそれにコ ードされるアミノ酸配列 （配列番号： 5) を示す。 図 1 0は図 9の続きである。 図 1 1は本発明の新規蛋白質をコードする c DNAの全塩基配列とそれにコ ードされるアミノ酸配列 （配列番号： 5) を示す。 図 1 1は図 1 0の続きであ る。
図 1 2は本発明の新規蛋白質をコ一ドする c DN Aの全塩基配列とそれにコ —ドされるアミノ酸配列 （配列番号： 6) を示す。
図 1 3は本発明の新規蛋白質をコードする c DNAの全塩基配列とそれにコ —ドされるアミノ酸配列 （配列番号： 6) を示す。 図 1 3は図 1 2の続きであ る。
図 1 4は本発明の新規蛋白質をコードする c DNAの全塩基配列とそれにコ —ドされるアミノ酸配列 （配列番号： 6) を示す。 図 1 4は図 1 3の続きであ る。
図 1 5は本発明の新規蛋白質をコードする c DN Aの全塩基配列とそれにコ —ドされるアミノ酸配列 （配列番号： 6) を示す。 図 1 5は図 1 4の続きであ る。
図 1 6は本発明の新規蛋白質をコードする c DNAの全塩基配列とそれにコ —ドされるアミノ酸配列 （配列番号： 6) を示す。 図 1 6は図 1 5の続きであ る。
図 1 7は本発明の新規蛋白質をコードする c DN Aの全塩基配列とそれにコ ードされるアミノ酸配列 （配列番号： 6) を示す。 図 1 7は図 1 6の続きであ る。
図 1 8は本発明の新規蛋白質をコードする c DN Aの全塩基配列とそれにコ ードされるアミノ酸配列 （配列番号： 6 ) を示す。 図 1 8は図 1 7の続きであ る。
図 1 9は本発明の新規蛋白質をコードする c D N Aの全塩基配列とそれにコ —ドされるアミノ酸配列 （配列番号： 6 ) を示す。 図 1 9は図 1 8の続きであ る。
図 2 0は本発明の新規蛋白質をコードする c D N Aの全塩基配列とそれにコ —ドされるアミノ酸配列 （配列番号： 6 ) を示す。 図 2 0は図 1 9の続きであ る。
図 2 1は本発明の新規蛋白質をコードする c D N Aの全塩基配列とそれにコ ードされるアミノ酸配列 （配列番号： 6 ) を示す。 図 2 1は図 2 0の続きであ る。
図 2 2は本発明の新規蛋白質をコードする c D N Aの全塩基配列とそれにコ —ドされるアミノ酸配列 （配列番号： 6 ) を示す。 図 2 2は図 2 1の続きであ る。
図 2 3はノーザンハイブリダィゼ一シヨンによる発現の解析結果を示す。
図 2 4は本発明の新規蛋白質と S m a d 3との特異的相互作用を調べた結果 を示す。横軸の A R I P 1は本発明の新規蛋白質を示す。縦軸の相互作用はル シフェラ一ゼ活性の強さを示す。 発明を実施するための最良の形態
本発明の配列番号： 5または配列番号： 6で表されるアミノ酸配列と実質的 に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質としては、例えば、ヒトゃ温血動物（例 えば、 モルモット、 ラッ卜、 マウス、 ニヮトリ、 ゥサギ、 ブ夕、 ヒッジ、 ゥシ、 サルなど） の細胞 [例えば、 肝細胞、 脾細胞、 神経細胞、 グリア細胞、 塍臓 /3 細胞、 骨髄細胞、 メザンギゥム細胞、 ランゲルハンス細胞、 表皮細胞、 上皮細 胞、 内皮細胞、 繊維芽細胞、 繊維細胞、 筋細胞、 脂肪細胞、 免疫細胞 （例えば、 マクロファージ、 T細胞、 B細胞、 ナチュラルキラー細胞、 肥満細胞、 好中球、 好塩基球、 好酸球、 単球など） 、 巨核球、 滑膜細胞、 軟骨細胞、 骨細胞、 骨芽 細胞、 破骨細胞、 乳腺細胞、 もしくは間質細胞、 またはこれらの細胞の前駆細
差替え用紙 （規貝 IJ26) 胞、 幹細胞もしくはガン化細胞など] もしくはそれらの細胞が存在するあらゆ る組識 [例えば、 脳、 脳の各部位 （例えば、 嗅球、 扁桃核、 大脳基底球、 海馬、 視床、 視床下部、 大脳皮質、 延髄、 小脳など） 脊髄、 下垂体、 胃、 fl萃臓、 腎臓、 肝臓、 生殖腺、 甲状腺、 胆のう、 骨髄、 副腎、 皮膚、 筋肉、 肺、 消化管 （例え ば、 大腸、 小腸など） 、 血管、 心臓、 胸腺、 脾臓、 顎下腺、 末梢血、 前立腺、 睾丸、 卵巣、 胎盤、 子宮、 骨、 関節、 骨格筋など] または血球系の細胞もしく はその培養細胞株など （特に脳） に由来する蛋白質であってもよく、 合成蛋白 質であってもよい。
配列番号： 5または配列番号： 6で表されるアミノ酸配列と実質的に同一の アミノ酸配列を含有する蛋白質とは、 配列番号： 5または配列番号： 6で表さ れるアミノ酸配列と約 5 0 %以上、 好ましくは約 7 0 %以上、 より好ましくは 約 9 0 %以上、最も好ましくは約 9 5 %以上の相同性を有するアミノ酸配列な どが挙げられる。
本発明の配列番号： 5または配列番号： 6で表されるアミノ酸配列と実質的 に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質とは、 例えば、 前記の配列番号： 5ま たは配列番号： 6で表されるァミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有 し、 配列番号： 5または配列番号： 6で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白 質と実質的に同一の生理活性を有する蛋白質などが好ましい。
実質的に同一の生理活性としては、 例えば、 受容体親和性、 シグナル情報伝 達能、 臓器発現分布の特異性などの質的要素が挙げられる。実質的に同一とは、 それらの生理活性が生物学的または生理学的に同質であることを示す。したが つて、 受容体親和性の強さなどの活性が同等 （例えば、 約 0 . 1〜2 0倍、 好 ましくは約 0 . 5〜2倍） であることが好ましいが、 これらの活性の強弱.、 蛋 白質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
例えば、 受容体親和性の測定は、 自体公知の方法に準じて行うことができる 力 例えば、 後述するスクリーニング方法に従って測定することができる。 また、 本発明の蛋白質としては、 例えば、 配列番号： 5または配列番号： 6 で表されるアミノ酸配列中の 1または 2個以上（好ましくは、 1から 3 0個程 度、 より好ましくは 1から 1 0偭程度、 さらに好ましくは数個） のアミノ酸が 欠失したアミノ酸配列、 配列番号： 5または配列番号： 6で表わされるァミノ 酸配列に 1または 2個以上 （好ましくは、 1から 3 0個程度、 より好ましくは 1から 1 0個程度、 さらに好ましくは数個） のアミノ酸が付加または挿入され たアミノ酸配列、 配列番号： 5または配列番号： 6で表わされるアミノ酸配列 中の 1または 2個以上 （好ましくは、 1から 3 0個程度、 より好ましくは 1か ら 1 0個程度、 さらに好ましくは数個） のアミノ酸が他のアミノ酸で置換され たアミノ酸配列、またはそれらを組み合わせたアミノ酸配列を含有する蛋白質 などのいわゆるムティンも含まれる。
本明細書における蛋白質は、 ペプチド表記の慣例に従って左端が N末端（ァ ミノ末端） 、 右端が C末端 （力ルポキシル末端） である。 配列番号： 5または 配列番号： 6で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質をはじめとする、 本発 明の蛋白質は、 C末端が通常カルボキシル基 （一 COOH) またはカルボキシ レート （一 C〇〇_) であるが、 C末端がアミ ド （一 CONH2) またはエス テル （一 COOR) であってもよい。
ここでエステルにおける Rとしては、 例えば、 メチル、 ェチル、 n—プロピ ル、 イソプロピルもしくは n—ブチルなどの C ^ 6アルキル基、 例えば、 シク 口ペンチル、 シクロへキシルなどの C3_8シクロアルキル基、 例えば、 フエ二 ル、 α—ナフチルなどの C6_12ァリール基、 例えば、 ベンジル、 フエネチル、 α—ナフチルメチルなどの C e— i 2ァリール— Cい 2アルキル基のほか、 経口 用エステルとして汎用されるビバロイルォキシメチルエステルなどが用いら れる。
本発明の蛋白質が C末端以外にカルボキシル基 （またはカルボキシレート） を有している場合、力ルポキシル基がアミド化またはエステル化されているも のも本発明の蛋白質に含まれる。 この場合のエステルとしては、 例えば、 上記 した C末端のエステルなどが用いられる。
さらに、 本発明の蛋白質には、 N末端のメチォニン残基のァミノ基が保護基 (例えば、 ホルミル基、 ァセチル基などの（^_6ァシル基など） で保護されて いるもの、生体内で切断されて生成する N末端のグルタミン酸残基がピロダル 夕ミン化したもの、 分子内のアミノ酸の側鎖上にある、 例えば、 〇H、 COO H、 NH2、 SHなどが適当な保護基 （例えば、 ホルミル基、 ァセチル基など の（：ぃ 6ァシル基など） で保護されているもの、 あるいは糖鎖が結合したいわ ゆる糖蛋白質などの複合蛋白質なども含まれる。
本発明の蛋白質の具体例としては、 配列番号： 5または配列番号： 6で表さ れるアミノ酸配列を含有する蛋白質などが用いられる。
本発明の蛋白質は、 PD Z ドメインまたは （および） WWドメイン、 好まし くは、 5つの PD Z ドメインまたは （および） 2つの WWドメインを有し、 脳 に特異的に発現している。 そして、 本発明の蛋白質は、 PDZ ドメインを介し てセリン スレオニンキナーゼ型受容体として単離されたァクチビン受容体 に結合し、 また、 WWドメインを介してァクチビンの細胞内情報伝達分子と結 合する。
ァクチビン受容体は、ァクチビン受容体の何れのサブタイプであってもよい が、 なかでもァクチビン受容体 I I A— Nなどが好ましく用いられる。
ァクチビンの細胞内情報伝達分子としては、 例えば、 Sma d l , 2， 3， 4， 5， 6， 7などの Sma dが挙げられるが、 本発明の蛋白質は、 特に Sm a d 3と強く結合する。
本発明の蛋白質としては、 特に、 5つの PD Zドメインおよび 2つの WWド メインを有し、 脳に特異的に発現し、 ァクチビン受容体または （および） Sm a d 3に対して結合能を有する蛋白質が好ましく用いられる。 本発明の蛋白質の部分ペプチドとしては、前記した本発明の蛋白質の部分べ プチドであって、 本発明の蛋白質が有する生理活性、 例えば、 受容体親和性、 シグナル情報伝達能などの活性、臓器発現分布の特異性などを有するものであ ればいずれのものでもよい。 例えば、 本発明の蛋白質の構成アミノ酸配列のう ち 1 0 0個以上、 好ましくは 2 5 0個以上、 さらに好ましくは 3 5 0個以上、 より好ましくは 5 0 0個以上、最も好ましくは 8 0 0個以上のアミノ酸配列を 有し、 受容体親和性、 シグナル情報伝達能などを有するペプチドなどが用いら れる。
また、本発明の部分ペプチドは、そのアミノ酸配列中の 1または 2個以上（好 ましくは 1から 1 0個程度、 さらに好ましくは数個） のアミノ酸が欠失し、 ま たは、 そのアミノ酸配列に 1または 2個以上 （好ましくは、 1から 2 0個程度、 より好ましくは 1から 1 0個程度、 さらに好ましくは数個） のアミノ酸が付加 し、 または、 そのアミノ酸配列中の 1または 2個以上 （好ましくは、 1から 1 0個程度、 より好ましくは数個程度、 さらに好ましくは 1から 5個程度） のァ ミノ酸が他のアミノ酸で置換されていてもよい。
また、 本発明の部分ペプチドは C末端が通常カルボキシル基 （一 C O O H) またはカルボキシレート （一 C〇〇 ） であるが、 前記した本発明の蛋白質の ごとく、 C末端がアミド （― C O N H 2 ) またはエステル （― C O O R ) であ つてもよい。
さらに、 本発明の部分ペプチドには、 前記した本発明の蛋白質と同様に、 N 末端のメチォニン残基のァミノ基が保護基で保護されているもの、 N端側が生 体内で切断されて生成したグル夕ミル基がピ口グルタミン化したもの、分子内 のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護基で保護されているもの、あるいは 糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチドなどの複合ペプチドなども含まれる。
本発明の部分ペプチドは、 好ましくは、 ァクチビン受容体または （および） 前述したァクチビン細胞内情報伝達分子 （特に、 S m a d 3 ) に対する結合能 を有している。
本発明の蛋白質またはその部分ペプチドの塩としては、とりわけ生理学的に 許容される酸付加塩が好ましい。 この様な塩としては、 例えば無機酸 （例えば、 塩酸、 リン酸、 臭化水素酸、 硫酸） との塩、 あるいは有機酸 （例えば、 酢酸、 ギ酸、 プロピオン酸、 フマル酸、 マレイン酸、 コハク酸、 酒石酸、 クェン酸、 リンゴ酸、 シユウ酸、 安息香酸、 メタンスルホン酸、 ベンゼンスルホン酸） と の塩などが用いられる。 また、 無機塩基 （例えば、 ナトリウム、 カリウムなど のアルカリ金属、 カルシウム、 マグネシウムなどのアルカリ土類金属、 アルミ ニゥムまたはアンモニゥムなど） との塩、 有機塩基 （例えば、 トリメチルアミ ン、 トリェチルァミン、 ピリジン、 ピコリン、 2， 6—ルチジン、 エタノール ァミン、 ジエタノールァミン、 トリエタノールァミン、 シクロへキシルァミン、 ジシクロへキシルァミン、 N， N ' ージベンジルエチレンジァミンなど） との 塩なども用いられる。 本発明の蛋白質またはその塩は、前述したヒトゃ温血動物の細胞または組織 から自体公知の方法によっても製造することもできるし、後述する該蛋白質を コードする D N Aを含有する形質転換体を培養することによつても製造する ことができる。 また、 後述のペプチド合成法に準じて製造することもできる。 ヒトゃ哺乳動物の組織または細胞から製造する場合、ヒトゃ哺乳動物の組織 または細胞をホモジナイズした後、 酸などで抽出を行い、 該抽出液を逆相クロ マトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを 組合せることにより単離精製することができる。
本発明の蛋白質、その部分ペプチドもしくはそれらの塩またはそれらのアミ ド体の合成には、 通常市販の蛋白質合成用樹脂を用いることができる。 そのよ うな樹脂としては、 例えば、 クロロメチル樹脂、 ヒドロキシメチル樹脂、 ベン ズヒドリルァミン樹脂、 アミノメチル樹脂、 4—ベンジルォキシベンジルアル コール樹脂、 4—メチルベンズヒドリルァミン樹脂、 P A M樹脂、 4ーヒドロ キシメチルフエニルァセトアミドメチル樹脂、 ポリアクリルアミド樹脂、 4一 ( 2 ' , 4， ージメトキシフエ二ルヒドロキシメチル） フエノキシ樹脂、 4一 ( 2 ' , 4 ' —ジメ卜キシフエニル一 F m o cアミノエチル） フエノキシ樹脂 などを挙げることができる。 このような樹脂を用い、 ひ—ァミノ基と側鎖官能 基を適当に保護したアミノ酸を、 目的とする蛋白質の配列通りに、 自体公知の 各種縮合方法に従い、 樹脂上で縮合させる。 反応の最後に樹脂から蛋白質を切 り出すと同時に各種保護基を除去し、さらに高希釈溶液中で分子内ジスルフィ ド結合形成反応を実施し、 目的の蛋白質、 その部分ペプチドまたはそれらのァ ミド体を取得する。
上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、蛋白質合成に使用できる各種活性 化試薬を用いることができるが、 特に、 カルポジイミド類がよい。 カルボジィ ミド類としては、 D C C、 N， N' ージイソプロピルカルポジイミド、 N—ェ チル— N' — （3—ジメチルァミノプロピル） カルポジイミ ドなどが用いられ る。 これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤 （例えば、 H O B t、 H O O B t ) とともに保護アミノ酸を直接樹脂に添加するか、 または、 対称酸無水物 または H O B tエステルあるいは H O O B tエステルとしてあらかじめ保護 アミノ酸の活性化を行った後に樹脂に添加することができる。
保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、蛋白質縮 合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。例えば、 N , N—ジメチルホルムアミド、 N， N—ジメチルァセトアミド、 N—メチル ピロリ ドンなどの酸アミ ド類、 塩化メチレン、 クロ口ホルムなどのハロゲン化 炭化水素類、 トリフルォロエタノールなどのアルコール類、 ジメチルスルホキ シドなどのスルホキシド類、 ピリジン、 ジォキサン、 テトラヒドロフランなど のエーテル類、 ァセトニトリル、 プロピオ二トリルなどの二トリル類、 酢酸メ チル、酢酸ェチルなどのエステル類あるいはこれらの適宜の混合物などが用い られる。反応温度は蛋白質結合形成反応に使用され得ることが知られている範 囲から適宜選択され、通常約— 2 0 から 5 0 °Cの範囲から適宜選択される。 活性化されたアミノ酸誘導体は通常 1 . 5から 4倍過剰で用いられる。 ニンヒ ドリン反応を用いたテストの結果、縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行 うことなく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を行うことができる。反 応を繰り返しても十分な縮合が得られないときには、無水酢酸またはァセチル イミダゾ一ルを用いて未反応アミノ酸をァセチル化することができる。
原料のァミノ基の保護基としては、 例えば、 Z、 B o c、 t e r t 一ペンチ ルォキシカルボニル、 イソポルニルォキシカルボニル、 4ーメトキシベンジル ォキシカルボニル、 C I— Z、 B r— Z、 ァダマンチルォキシカルボニル、 ト リフルォロアセチル、 フタロイル、 ホルミル、 2—ニトロフエニルスルフエ二 ル、 ジフエニルホスフイノチオイル、 F m o cなどが用いられる。
力ルポキシル基は、 例えば、 アルキルエステル化 （例えば、 メチル、 ェチル、 プロピル、 ブチル、 t e r t—ブチル、 シクロペンチル、 シクロへキシル、 シ クロへプチル、 シクロォクチル、 2—ァダマンチルなどの直鎖状、 分枝状もし くは環状アルキルエステル化） 、 ァラルキルエステル化、 （例えば、 ベンジル エステル、 4一二トロべンジルエステル、 4ーメトキシベンジルエステル、 4 —クロ口べンジルエステル、 ベンズヒドリルエステル化） 、 フエナシルエステ ル化、 ベンジルォキシカルポニルヒドラジド化、 t e r t —ブトキシカルボ二 ルヒドラジド化、 トリチルヒドラジド化などによつて保護することができる。 セリンの水酸基は、 例えば、 エステル化またはエーテル化によって保護する ことができる。 このエステル化に適する基としては、 例えば、 ァセチル基など の低級アルカノィル基、 ベンゾィル基などのァロイル基、 ベンジルォキシカル ポニル基、エトキシカルボニル基などの炭酸から誘導される基などが用いられ る。 また、 エーテル化に適する基としては、 例えば、 ベンジル基、 テトラヒド ロビラニル基、 t e r t —ブチル基などである。
チロシンのフエノール性水酸基の保護基としては、 例えば、 B z 1、 C 1 2 — B z 1、 2—二トロベンジル、 B r _ Z、 t e r t —ブチルなどが用いられ る。
ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、 例えば、 T o s、 4—メトキ シ— 2， 3， 6 —トリメチルベンゼンスルホニル、 D N P、 ベンジルォキシメ チル、 B u m、 B o c、 T r t：、 F m o cなどが用いられる。
原料のカルボキシル基の活性化されたものとしては、 例えば、 対応する酸無 水物、 アジド、 活性エステル [アルコール （例えば、 ペン夕クロ口フエノール、 2， 4， 5 —トリクロ口フエノール、 2 , 4—ジニトロフエノール、 シァノメ チルアルコール、 パラニトロフエノール、 H O N B、 N—ヒドロキシスクシミ ド、 H O B t ) とのエステル] などが用いられる。 原料のァミノ基の活性化さ れたものとしては、 例えば、 対応するリン酸アミドが用いられる。
保護基の除去 （脱離） 方法としては、 例えば、 P d黒あるいは P d —炭素な どの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、 また、 無水フッ化水素、 メ タンスルホン酸、 トリフルォロメタンスルホン酸、 トリフルォロ酢酸あるいは これらの混合液などによる酸処理や、 ジイソプロピルェチルァミン、 トリェチ ルァミン、 ピぺリジン、 ピぺラジンなどによる塩基処理、 また、 液体アンモニ ァ中ナトリゥムによる還元なども用いられる。上記酸処理による脱離反応は、 一般に約一 2 0 °Cから 4 0 °Cの温度で行われるが、 酸処理においては、 例えば、 ァニソ一ル、 フエノール、 チオアニソール、 メタクレゾール、 パラクレゾ一ル、 ド、 1， 4—ブタンジチオール、 1， 2 —エタンジチオール などのようなカチオン補足剤の添加が有効である。 また、 ヒスチジンのイミダ ゾール保護基として用いられる 2 , 4 —ジニトロフエニル基はチォフエノール 処理により除去され、 トリブトファンのインドール保護基として用いられるホ ルミル基は上記 1 , 2 —エタンジチオール、 1， 4—ブタンジチオールなどの 存在下の酸処理による脱保護以外に、 希水酸化ナトリウム溶液、 希アンモニア などによるアルカリ処理によっても除去される。
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護ならびに保護基、およびその保 護基の脱離、反応に関与する官能基の活性化などは公知の基または公知の手段 から適宜選択しうる。
蛋白質またはその部分ペプチドのアミド体を得る別の方法としては、例えば、 まず、カルボキシル末端アミノ酸の α —カルボキシル基をアミド化して保護し た後、 アミノ基側にペプチド （蛋白質） 鎖を所望の鎖長まで延ばした後、 該ぺ プチド鎖の Ν末端のひ—アミノ基の保護基のみを除いた蛋白質 （部分べプチ ド）と C末端のカルボキシル基の保護基のみを除去した蛋白質（部分ペプチド） とを製造し、 この両蛋白質 （部分ペプチド） を上記したような混合溶媒中で縮 合させる。縮合反応の詳細については上記と同様である。縮合により得られた 保護蛋白質を精製した後、 上記方法によりすベての保護基を除去し、 所望の粗 蛋白質 （部分ペプチド） を得ることができる。 この粗蛋白質 （部分ペプチド） は既知の各種精製手段を駆使して精製し、主要画分を凍結乾燥することで所望 の蛋白質 （部分ペプチド） のアミド体を得ることができる。
蛋白質またはその部分ペプチドのエステル体を得るには、 例えば、 カルボキ シル末端アミノ酸の α—カルボキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミ ノ酸エステルとした後、 蛋白質 （部分ペプチド） のアミド体と同様にして、 所 望の蛋白質 （部分ペプチド） のエステル体を得ることができる。
本発明の部分ペプチドまたはそれらの塩は、自体公知のペプチドの合成法に 従って、あるいは本発明の蛋白質を適当なぺプチダーゼで切断することによつ て製造することができる。 ペプチドの合成法としては、 例えば、 固相合成法、 液相合成法のいずれによってもよい。 すなわち、 本発明の蛋白質を構成し得る 部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有 する場合は保護基を脱離することにより目的のぺプチドを製造することがで きる。 公知の縮合方法や保護基の脱離としては、 例えば、 以下の①から⑤に記 載された方法が挙げられる。
① M. B o d a n s z k yおよび M. A. O n d e t t i、 ぺプチド シンセ シス
(P e p t i d e S y n t h e s i s ， I n t e r s c i e n c e P u b l i s h e r s , N ew Yo r k ( 1 9 6 6年）
② S c h r o e d e rおよび L u e b k e、 ザ ぺプチド （T h e P e p t i d e ) , A c a d em i c P r e s s , N ew Yo r k ( 1 9 6 5年） ③泉屋信夫他、 ペプチド合成の基礎と実験、 丸善 （株） （ 1 9 7 5年）
④矢島治明および榊原俊平、 生化学実験講座 1、 タンパク質の化学 IV、 2 0 5、 ( 1 9 7 7年）
⑤矢島治明監修、 続医薬品の開発 第 1 4巻 ペプチド合成 広川書店
また、 反応後は通常の精製法、 例えば、 溶媒抽出、 蒸留、 カラムクロマトグ ラフィ一、 液体クロマトグラフィー、 再結晶などを組合せて本発明の蛋白質ま たはその部分べプチドを単離精製することができる。上記方法で得られる該蛋 白質またはその部分べプチドが遊離体である場合は、公知の方法によって適当 な塩に変換することができるし、 逆に塩で得られた場合は、 公知の方法によつ て遊離体に変換することができる。 本発明の蛋白質をコードする DNAとしては、前述した本発明の蛋白質をコ 一ドする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。また、 ゲノム DNA、 ゲノム DNAライブラリー、 前記した細胞 ·組織由来の c DN A、 前記した細胞 ·組織由来の c D N Aライブラリ一より自体公知の方法によ り単離されたもの、 合成 DNAのいずれでもよい。
ライブラリ一に使用するベクターは、 バクテリオファージ、 プラスミド、 コ スミド、 ファージミドなどいずれであってもよい。 また、 前記した細胞 ·組織 より t o t a 1 RNA画分または mRNA画分を調製したものを用いて、直接 R e v e r s e T r a n s c r i p t a s e P o l yme r a s e C h a i n Re a c t i on (以下、 R T— P C R法と略称する） によって単離す ることもできる。
本発明の蛋白質をコードする DNAとしては、 例えば、 ①配列番号： 7また は配列番号： 8で表される塩基配列を含有する DNA、 または②配列番号： 7 または配列番号： 8で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下で八 イブリダィズする塩基配列を有し、 配列番号： 5または配列番号： 6で表され るアミノ酸配列を有する蛋白質と同質の生理活性、 例えば、 受容体親和性、 シ グナル情報伝達能などの活性、臓器発現分布の特異性などを有する蛋白質をコ ―ドする DNAであればいずれのものでもよい。
配列番号： 7または配列番号： 8で表される塩基配列とハイストリンジェン 卜な条件下でハイブリダィズできる DN Aとしては、 例えば、 配列番号： 7ま たは配列番号： 8で表される塩基配列と約 70%以上、 好ましくは約 80%以 上、 さらに好ましくは約 90 %以上、 最も好ましくは約 95 %以上の相同性を 有する塩基配列を含有する D N Aなどが用いられる。
ハイブリダィゼーシヨンは、 自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、例 えば、 モレキュラー · クローニング （Mo l e c u l a r C l on i ng) 2 nd (J. S amb r o o k e t a 1. , Co l d S p r i n g H a r b o r L a b. P r e s s, 1 989 ) に記載の方法などに従って行うこと ができる。 また、 市販のライブラリ一を使用する場合、 添付の使用説明書に記 載の方法に従って行うことができる。 より好ましくは、 ハイストリンジェント な条件に従って行うことができる。
ハイストリンジェン卜な条件とは、 例えば、 ナトリウム濃度が約 19から 4 0mM、 好ましくは約 1 9から 2 OmMで、 温度が約 50から 70 ：、 好まし くは約 60から 65 :の条件を示す。 特に、 ナトリウム濃度が約 19mMで、 温度が約 65°Cの場合が最も好ましい。
より具体的には、 配列番号： 5または配列番号： 6のアミノ酸配列を含有す る蛋白質をコードする DNAとしては、 配列番号： 7または配列番号： 8で表 される塩基配列を有する DN Aなどが用いられる。
本発明の部分ペプチドをコードする DNAとしては、前述した本発明の部分 ぺプチドをコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであつ てもよい。 また、 ゲノム DNA、 ゲノム DNAライブラリー、 前記した細胞 - 組織由来の c D N A、 前記した細胞 ·組織由来の cDNAライブラリーより自 体公知の方法により単離されたもの、 合成 DN Aのいずれでもよい。
本発明の部分ペプチドをコードする DNAとしては、例えば、①配列番号： 7または配列番号： 8で表される塩基配列を含有する DNA、 または②配列番 号： 7または配列番号： 8で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件 下でハイブリダィズする塩基配列を有し、 配列番号： 5または配列番号： 6で 表されるアミノ酸配列を有する蛋白質と同質の活性を有する蛋白質をコード する D N Aの部分塩基配列を有する D N Aなどが用いられる。
ハイプリダイゼ一ションの方法およびハイストリンジェントな条件は前記 と同様のものが用いられる。
本発明の蛋白質またはその部分べプチド（以下、本発明の蛋白質と略記する） をコ一ドする DNAのクローニングの手段としては、本発明の蛋白質の部分配 列をコードする塩基配列を有する合成 DN Aプライマーを用いて P C R法に よって増幅するか、 または適当なベクタ一に組み込んだ DNA、 また、 ゲノム DNA、 ゲノム DNAライブラリー、 前記した細胞 ·組織由来の c DNA、 前 記した細胞 ·組織由来の c DN Aライブラリーより自体公知の方法により単離 されたものを本発明の蛋白質の一部あるいは全領域をコードする DN A断片 もしくは合成 DNAを用いて標識したものとのハイブリダィゼーションによ つて単離することができる。 ハイブリダィゼ一シヨンの方法は、 例えば、 モレ キュラー クローニング（Mo l e c u l a r C l on i ng) 2 n d ( J. S amb r o o k e t . a 1. , C o l d S p r i n g Ha r b o r L a b. P r e s s, 1989) に記載の方法などに従って行うことができる。 ま た、市販のライブラリーを使用する場合、 添付の使用説明書に記載の方法に従 つて行うことができる。
DN Aの塩基配列の変換は、 公知のキット、 例えば、 Mu t a n t TM— G (宝酒造 （株） ） 、 Mu t a n t™-K (宝酒造 （株） ） などを用いて、 G u p p e d d u l e x法や K u n k e 1法などの自体公知の方法あるいは それらに準じる方法に従って行うことができる。
クローン化された本発明の蛋白質をコードする DN Aは目的によりそのま ま、 または所望により制限酵素で消化したり、 リンカ一を付加したりして使用 することができる。 該 DNAはその 5 ' 末端側に翻訳開始コドンとしての AT Gを有し、 また 3 ' 末端側には翻訳終止コドンとしての TAA、 TGAまたは TAGを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは適当 な合成 DN Aアダプターを用いて付加することもできる。
本発明の蛋白質の発現ベクターは、 例えば、 （ィ） 本発明の蛋白質をコード する DNAから目的とする DNA断片を切り出し、 （口） 該 DNA断片を適当 な発現べクタ一中のプロモーターの下流に連結することにより製造すること ができる。
ベクタ一としては、 大腸菌由来のプラスミド （例、 p BR 322, p BR 3 2 5， pUC 1 2, pUC 1 3) 、 枯草菌由来のプラスミド （例、 pUB 1 1 0， p TP 5, p C 1 94) 、 酵母由来プラスミド （例、 p SH 1 9, p SH 1 5) 、 λファージなどのバクテリオファージ、 レトロウイルス， ワクシニア ウィルス、 バキュロウィルスなどの動物ウィルスなどの他、 pA l— 1 1、 XT 1、 pR cZCMV、 p R c/R S V, p c D N A I ZN e oなどが用い られる。
本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対 応
して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、 動物細胞を 宿主として用いる場合は、 SV40由来のプロモーター、 レトロウイルスのプ 口モーター、 メタ口チォネインプロモーター、 ヒートショックプロモーター、 サイトメガロウィルスプロモーター、 S R αプロモータ一などが挙げられる。 これらのうち、 サイトメガロウィルスプロモー夕一、 SR o;プロモーターなど を用いるのが好ましい。宿主がェシエリヒア属菌である場合は、 t r pプロモ —夕一、 l a cプロモーター、 r e c Aプロモータ一、 λ Ρ^プロモータ一、 1 ρ ρプロモータなどが、 宿主がバチルス属菌である場合は、 S P 0 1プロモ 一夕一： S P 02プロモー夕一、 p e η Ρプロモーターなど、 宿主が酵母であ る場合は、 pHO 5プロモーター、 PGKプロモーター、 GAPプロモーター、 ADHプロモーターなどが好ましい。 宿主が昆虫細胞である場合には、 ポリへ ドリンプロモーター、 P 1 0プロモーターなどが好ましい。
発現べクタ一には、 以上の他に、 所望によりェンハンサー、 スプライシング シグナル、 ポリ A付加シグナル、 選択マ一カー、 SV40複製オリジン （以下、 S V40 o r iと略称する場合がある）などを含有しているものを用いること ができる。 選択マ一カーとしては、 例えば、 ジヒドロ葉酸還元酵素 （以下、 d h f rと略称する場合がある） 遺伝子 [メソトレキセート （MTX) 耐性] 、 アンピシリン耐性遺伝子 （以下、 Amp と略称する場合がある） 、 ネオマイ シン耐性遺伝子 （以下、 Ne oと略称する場合がある、 G4 1 8耐性） などが 挙げられる。 特に、 CHO (d h f r -) 細胞を用いて d h f r遺伝子を選択 マ一カーとして使用する場合、目的遺伝子を含有する形質転換体をチミジンを 含まない培地によっても選択することができる。
また、 必要に応じて、 宿主に合ったシグナル配列を、 本発明の蛋白質の N末 端側に付加することもできる。宿主がェシエリヒア属菌である場合は、 アル力 リフォスファターゼ ·シグナル配列、 OmpA ·シグナル配列などが、 宿主が バチルス属菌である場合は、 ひ一アミラーゼ ·シグナル配列、 サブチリシン · シグナル配列などが、 宿主が酵母である場合は、 メイティングファクター α · シグナル配列、 インベルターゼ*シグナル配列など、 宿主が動物細胞である場 合には、 例えばインシュリン ·シグナル配列、 ひ—インターフェロン ·シグナ ル配列、 抗体分子 · シグナル配列などがそれぞれ利用できる。
このようにして構築された本発明の蛋白質をコードする DN Αを含有する ベクターを用いて、 形質転換体を製造することができる。
宿主としては、 例えば、 ェシエリヒア属菌、 バチルス属菌、 酵母、 昆虫細胞、 昆虫、 動物細胞などが用いられる。
ェシエリヒア属菌の具体例としては、 ェシエリヒア 'コリ （E s c h e r i c h i a c o l i ) K 1 2 - DH 1 〔プロシージングズ ·ォブ ·ザ ·ナショ ナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェンシィズ ·ォブ .ザ ·ユーエスェ一 （P r o c. Na t l . Ac a d. S c i. USA) , 60巻， 1 60 (1 968) 〕 ， J M 103 〔ヌクイレックァシッズ ' リサーチ， （Nu c l e i c Ac i d s R e s e a r c h) , 9巻， 309 ( 1 98 1 ) , J A 22 1 〔ジャーナ ル ·ォブ ·モレキュラー ·バイオロジー （J o u r n a l o f Mo 1 e c u 1 a r B i o l o y) ) , 1 20巻， 5 17 ( 1978) ) , HB 101 〔ジャーナル 'ォブ 'モレキュラー 'バイオロジー， 41巻， 459 ( 196 9) 〕 ， C 600 〔ジエネティックス （G e n e t i c s ) ， 39巻， 440 ( 1954) 〕 などが用いられる。
バチルス属菌としては、例えば、 バチルス ·サチルス （B a c i l l u s S u b t i l i s) M I 1 14 〔ジーン， 24巻， 255 (1 983) 〕 ， 20 7— 221 〔ジャーナル ·ォブ ·バイオケミストリ一（ J o u r n a 1 o f B i o c h em i s t r y) , 95巻. 87 ( 1 984) ) などが用いられる。 酵母としては、 例えば、 サッカロマイセス セレピシェ （S a c c h a r o my c e s c e r e v i s i a e) AH 22， AH 22R— , NA 87 - 1 1 A， DKD— 5D， 20 B— 12、 シゾサッカロマイセス ボンべ （S c h i z o s a c c h a r omy c e s p omb e) NCYC 1913, NCYC 2036、 サッカロマイセス ピキア パストリス （S a c c h a r omy c e s p i c j i a p a s t o r i s ) などが'用いられる。
昆虫細胞としては、 例えば、 ウィルスが Ac NPVの場合は、 夜盗蛾の幼虫 由来株化細胞（S p o d o p t e r a f r u g i p e r d a c e 1 1 ； S f 細胞） 、 T r i c h o p l u s i a n iの中腸由来の MG 1細胞、 T r i e h ο ρ 1 u s i a n iの卵由来の H i g h F i v e TM細胞、 M am e s t r a b r a s s i c a e由来の細胞または E s t i gm e n a a c r e a 由来の細胞などが用いられる。 ウィルスが BmNP Vの場合は、 蚕由来株化細 胞 （B omb y x mo r i N細胞； BmN細胞） などが用いられる。 該 S f 細胞としては、 例えば、 S f 9細胞 （ATCC CRL 17 1 1) 、 S f 21 細胞 （以上、 Vau gh n, J . L. ら、 イン · ヴィポ （ i n v i v o) , 13, 2 1 3 - 217, 1977 ) などが用いられる。
昆虫としては、 例えば、 カイコの幼虫などが用いられる 〔前田ら、 ネィチヤ - (Na t u r e) , 3 1 5巻， 592 (1985) 〕 。 動物細胞としては、 例えば、 サル細胞 COS— 7， V e r o, チャイニーズ ハムスター細胞 CHO， DHF R遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞 CH
0 (d h f r— CHO細胞） ， マウス L細胞， マウス A t T— 2 0， マウス ミエローマ細胞， ラット GH 3， ヒト F L細胞などが用いられる。
ェシエリヒア属菌を形質転換するには、 例えば、 プロシージングズ ·ォブ · ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェンシィズ ·ォブ ·ザ ·ユーエスェ — (P r o c. N a t l . A c a d. S c i . U S A)， 6 9巻， 2 1 1 0 ( 1 9 7 2) やジーン (G e n e) , 1 7巻， 1 0 7 ( 1 9 8 2) などに記載の方 法に従って行うことができる。
バチルス属菌を形質転換するには、 例えば、 モレキュラー ·アンド ·ジエネ ラ
リレ ·ジェネティックス (Mo 1 e c u 1 a r &G e n e r a 1 G e n e t i c s ) 1 6 8巻， 1 1 1 ( 1 9 7 9) などに記載の方法に従って行うことがで さる。
酵母を形質転換するには、 例えば、 メッソズ ·イン ·ェンザィモロジ一 （M e t h o d s i n E n z ymo l o y) , 1 94卷， 1 8 2— 1 8 7 ( 1 9 9 1) 、 プロシージングズ ·ォブ ·ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サ イエンシィズ ·ォブ ·ザ ·ュ一エスェ一 （P r o c. a t l . Ac a d. S c i . USA) 7 5巻， 1 9 2 9 ( 1 9 7 8) などに記載の方法に従って行う ことができる。
昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、例えば、バイオノテクノロジー（B
1 o/T e c h n o l o g y) , 6， 4 7 - 5 5 ( 1 9 8 8) などに記載の方 法に従って行うことができる。
動物細胞を形質転換するには、 例えば、 細胞工学別冊 8 新 細胞工学実験 プロトコ一ル. 2 6 3— 2 6 7 ( 1 9 9 5) (秀潤社発行） 、 ヴィロロジ一 （V i r o l o g y) , 5 2巻， 4 5 6 ( 1 9 7 3) に記載の方法に従って行うこ とができる。
このようにして、蛋白質をコードする DN Aを含有する発現ベクターで形質 転換された形質転換体を得ることができる。 宿主がェシエリヒア属菌、 バチルス属菌である形質転換体を培養する際、 培 養に使用される培地としては液体培地が適当であり、その中には該形質転換体 の生育に必要な炭素源、 窒素源、 無機物その他が含有せしめられる。 炭素源と しては、 例えば、 グルコース、 デキストリン、 可溶性澱粉、 ショ糖など、 窒素 源としては、 例えば、 アンモニゥム塩類、 硝酸塩類、 コーンスチープ · リカ一、 ペプトン、 カゼイン、 肉エキス、 大豆粕、 バレイショ抽出液などの無機または 有機物質、 無機物としては、 例えば、 塩化カルシウム、 リン酸二水素ナトリウ ム、 塩化マグネシウムなどが挙げられる。 また、 酵母抽出物、 ビタミン類、 生 長促進因子などを添加してもよい。 培地の pHは約 5から 8が望ましい。
ェシエリヒア属菌を培養する際の培地としては、 例えば、 グルコース、 カザ ミノ酸を含む M 9培地 〔ミラー （M i l l e r) , ジャーナル ·ォブ ·ェクス ペリメンッ 'イン 'モレキュラー ·ジエネティックス （J o u r n a l o f E x p e r i me n t s i n Mo l e c u l a r Ge n e t i c s , 4 3 1 - 4 3 3, C o I d S p r i n g H a r o r L a b o r a t o r y, N ew Yo r k 1 9 7 2〕 が好ましい。 ここに必要によりプロモ一夕一を効 率よく働かせるために、 例えば、 3 /3-インドリルアクリル酸のような薬剤を 加えることができる。
宿主がェシェリヒア属菌の場合、培養は通常約 1 5から 4 3 で約 3から 2 4時間行い、 必要により、 通気や撹拌を加えることもできる。
宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約 3 0から 4 0 °Cで約 6から 24時 間行い、 必要により、 通気や撹拌を加えることもできる。
宿主が酵母である形質転換体を培養する際、 培地としては、 例えば、 バーク ホールダー （B u r k h o l d e r) 最小培地 〔； B o s t i a n， K. L . ら、 プロシ一ジングズ ·ォブ ·ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェンシィ ズ 'ォブ ·ザ，ユーエスェ一 （P r o c. N a t l . A c a d. S c i . US A) , 7 7巻， 4 5 0 5 ( 1 9 8 0) 〕 や 0. 5 %カザミノ酸を含有する S D 培地 〔B i t t e r , G. A. らプロシージングズ ·ォブ ·ザ ·ナショナル · ァカテミー 'ォブ♦サイェンシィズ ·ォブ ·ザ ·ユーエスェ一 （P r o c. N a t 1. Ac a d. S c i . USA) , 8 1巻， 5 3 3 0 ( 1 9 84) 〕 が挙 げられる。培地の pHは約 5から 8に調整するのが好ましい。 培養は通常約 2 0 から 35°Cで約 24から 72時間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。 宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する際、培地としては、 G r a c e s I n s e c t Me d i um (G r a c e, T. C. C.，ネイチ ヤー （Na t u r e) , 1 95巻， 788 ( 1 962) ) に非動化した 10 % ゥシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。培地の p Hは約 6. 2から 6. 4に調整するのが好ましい。 培養は通常約 27 °Cで約 3から 5日間 行い、 必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、 培地としては、 例えば、 約 5から 20 %の胎児牛血清を含む MEM培地 〔サイエンス （S c i e n c e) , 122巻， 50 1 ( 1 952) ) , DMEM培地 〔ヴィロロジ一 （V i r o 1 o g y) , 8巻. 396 (1 959) 〕 ， RPM I 1640培地 〔ジャ一ナ ル ·ォブ ·ザ ·アメリカン ·メディカル ·ァソシエーション （J ou r n a l o f t h e Ame r i c an Me d i c a l As s o c i a t i on) l 99卷. 5 19 (1967) 〕 ， 199培地 〔プロシージング ·ォブ ·ザ ·ソ サイエティ ·フォ一 ·ザ ·バイオロジカル ·メディスン （P r o c e e d i n g o f t h e S o c i e t y f o r t h e B i o l o g i c a l Me d i c i n e) , 73巻， 1 (1 950) 〕 などが用いられる。 pHは約 6か ら 8であるのが好ましい。培養は通常約 30°Cから 40°Cで約 15から 60時 間行い、 必要に応じて通気や撹拌を加える。
以上のようにして、本発明の蛋白質を培養培地中あるいは形質転換体中に生 成せしめることができる。
上記培養物から本発明の蛋白質を分離精製するには、 例えば、 下記の方法に より行うことができる。
本発明の蛋白質を培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、培養後、 公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、 これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、 リゾチームおよび zまたは凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊し たのち、遠心分離やろ過により蛋白質の粗抽出液を得る方法などが適宜用いら れる。緩衝液の中に尿素や塩酸グァニジンなどの蛋白質変性剤や、 トリ トン X - 1 0 0 (商品名） などの界面活性剤が含まれていてもよい。 培養液中に蛋白 質が分泌される場合には、 培養終了後、 それ自体公知の方法で菌体あるいは細 胞と上清とを分離し、 上清を集める。
このようにして得られた培養上清、あるいは抽出液中に含まれる蛋白質の精 製は、 自体公知の分離，精製法を適切に組み合わせて行なうことができる。 こ れらの公知の分離、精製法としては、塩析ゃ溶媒沈澱法などの溶解度を利用す る方法、 透析法、 限外ろ過法、 ゲルろ過法、 および S D S —ポリアクリルアミ ドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロ マトグラフィ一などの荷電の差を利用する方法、ァフィ二ティーク口マトダラ フィ一などの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体ク口マトグラフィ一 などの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用 する方法などが用いられる。
かくして得られる蛋白質が遊離体で得られた場合には、自体公知の方法ある いはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、逆に塩で得られた場 合には自体公知の方法あるいはそれに準じる方法により、遊^!体または他の塩 に変換することができる。
なお、組換え体が産生する蛋白質を、精製前または精製後に適当な蛋白修飾 酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり、 ポリペプチドを部分的 に除去することもできる。 蛋白修飾酵素としては、 例えばトリプシン、 キモト リプシン、 アルギニルエンドべプチダーゼ、 プロテインキナ一ゼ、 グリコシダ ーゼなどが用いられる。
かくして生成する本発明の蛋白質またはその塩の活性は、標識したリガンド との結合実験および特異抗体を用いたェンザィムィムノアッセィなどにより 測定することができる。 本発明の蛋白質、その部分ペプチドまたはそれらの塩に対する抗体は、 本発 明の蛋白質、その部分ペプチドまたはそれらの塩を認識し得る抗体であれば、 ポリクロ一ナル抗体、 モノクローナル抗体の何れであってもよい。
本発明の蛋白質、 その部分ペプチドまたはそれらの塩 （以下、 本発明の蛋白 質と略記する） に対する抗体は、 本発明の蛋白質を抗原として用い、 自体公知 の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。
[モノクローナル抗体の作製]
(a) モノクローナル抗体産生細胞の作製
本発明の蛋白質は、温血動物に対して投与することにより抗体産生が可能な 部位にそれ自体あるいは担体、 希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体 産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントゃ不完全フロイントアジュ バントを投与してもよい。 投与は通常 2から 6週毎に 1回づつ、 計 2から 1 0 回程度行われる。 用いられる温血動物としては、 例えば、 サル、 ゥサギ、 ィヌ、 モルモット、 マウス、 ラット、 ヒッジ、 ャギ、 ニヮトリなどが挙げられるが、 マウスおよびラッ卜が好ましく用いられる。
モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、抗原を免疫された温血動物、 例えば、マウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の 2から 5日後 に脾臓またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄腫細胞 と融合させることにより、モノクローナル抗体産生ハイプリ ドーマを調製する ことができる。 抗血清中の抗体価の測定は、 例えば、 後記の標識化蛋白質と抗 血清とを反応させた後、抗体に結合した標識剤の活性を測定することにより行 うことができる。 融合操作は既知の方法、 例えば、 ケーラ一とミルスタインの 方法 [ネイチヤー （N a t u r e) , 2 5 6, 4 9 5 ( 1 9 7 5) ] に従い実 施できる。 融合促進剤としては、 例えば、 ポリエチレングリコール （P EG) やセンダイウィルスなどが挙げられるが、 好ましくは P EGが用いられる。 骨髄腫細胞としては、 例えば、 NS— 1、 P 3U 1、 S P 2/0、 AP— l などが挙げられるが、 P 3 U 1が好ましく用いられる。用いられる抗体産生細 胞 （脾臓細胞） 数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は 1 ： 1から 2 0 ： 1程度 であり、 P EG (好ましくは P EG 1 0 0 0から P EG 6 0 0 0) が 1 0から 8 0 %程度の濃度で添加され、 2 0から 4 0°C、 好ましくは 3 0から 3 7 で 1から 1 0分間インキュベートすることにより効率よく細胞融合を実施でき る。
抗蛋白質抗体産生ハイプリ ドーマのスクリーニングには種々の方法が使用 できるが、例えば、蛋白質抗原を直接あるいは担体とともに吸着させた固相（例 えば、 マイクロプレート） にハイプリ ド一マ培養上清を添加し、 次に放射性物 質や酵素などで標識した抗免疫グロプリン抗体（細胞融合に用いられる細胞が マウスの場合、 抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる） またはプロテイン Aを加え、 固相に結合した抗蛋白質モノクローナル抗体を検出する方法、 抗免 疫グロプリン抗体またはプロティン Aを吸着させた固相にハイプリ ドーマ培 養上清を添加し、 放射性物質や酵素などで標識した該蛋白質を加え、 固相に結 合した抗蛋白質モノクローナル抗体を検出する方法などが挙げられる。
抗蛋白質モノクローナル抗体の選別は、自体公知あるいはそれに準じる方法 に従って行うことができる。 通常 H A T (ヒポキサンチン、 アミノプテリン、 チミジン） を添加した動物細胞用培地で行うことができる。選別および育種用 培地としては、八イブリ ドーマが生育できるものならばどのような培地を用い てもよい。 例えば、 1から 2 0 %、 好ましくは 1 0から 2 0 %の牛胎児血清を 含む R P M I 1 6 4 0培地、 1から 1 0 %の牛胎児血清を含む G I T培地（和 光純薬工業 （株） ) あるいはハイプリ ドーマ培養用無血清培地 （S F M— 1 0 1、 日水製薬 （株） ） などを用いることができる。 培養温度は、 通常 2 0から 4 0で、 好ましくは約 3 7 °Cである。 培養時間は、 通常 5日から 3週間、 好ま しくは 1週間から 2週間である。 培養は、 通常 5 %炭酸ガス下で行うことがで きる。 ハイプリ ドーマ培養上清の抗体価は、 上記の抗血清中の抗蛋白質抗体価 の測定と同様にして測定できる。
( b ) モノクローナル抗体の精製
抗蛋白質モノクローナル抗体の分離精製は、 自体公知の方法、 例えば、 免疫 グロブリンの分離精製法 [例えば、 塩析法、 アルコール沈殿法、 等電点沈殿法、 電気泳動法、 イオン交換体 （例えば、 D E A E ) による吸脱着法、 超遠心法、 ゲルろ過法、抗原結合固相あるいはプロティン Aあるいはプロテイン Gなどの 活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製 法] に従って行うことができる。
[ポリクローナル抗体の作製]
本発明のポリクロ一ナル抗体は、それ自体公知あるいはそれに準じる方法に 従って製造することができる。 例えば、 免疫抗原 （蛋白質抗原） とキャリアー 蛋白質との複合体を作り、上記のモノクローナル抗体の製造法と同様に温血動 物に免疫を行い、該免疫動物から本発明の蛋白質に対する抗体含有物を採取し て、 抗体の分離精製を行うことにより製造できる。
温血動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキヤリァー蛋白質との複 合体に関し、キヤリァ一蛋白質の種類およびキヤリァ一とハプテンとの混合比 は、キヤリア一に架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率よくできれ ば、 どのようなものをどのような比率で架橋させてもよいが、 例えば、 ゥシ血 清アルブミンゃゥシサイログロブリン、へモシァニンなどを重量比でハプテン 1に対し、 約 0 . 1から 2 0、 好ましくは約 1から 5の割合でカップルさせる 方法が用いられる。
また、 ハプテンとキヤリア一のカツプリングには、 種々の縮合剤を用いるこ とができるが、 ダルタルアルデヒドゃカルポジイミド、 マレイミド活性エステ ル、 チオール基、 ジチォピリジル基を含有する活性エステル試薬などが用いら れる。
縮合生成物は、 温血動物に対して、 抗体産生が可能な部位にそれ自体あるい は担体、 希釈剤とともに投与される。 投与に際して抗体産生能を高めるため、 完全フロイントアジュバントゃ不完全フロイントアジュバントを投与しても よい。 投与は、 通常約 2から 6週毎に 1回づつ、 計約 3から 1 0回程度行われ る。
ポリクロ一ナル抗体は、 上記の方法で免疫された温血動物の血液、腹水など、 好ましくは血液から採取することができる。
抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、上記の抗血清中の抗体価の測定 と同様にして測定できる。 ポリクロ一ナル抗体の分離精製は、 上記のモノクロ ーナル抗体の分離精製と同様の免疫グロプリンの分離精製法に従って行うこ とができる。 本発明の蛋白質または部分べプチドをコードする D N Aまたは m R N Aに 実質的に相補的な塩基配列を有するアンチセンス D N Aとしては、本発明の蛋 白質または部分べプチドをコードする DNAまたは mRNAの塩基配列また はその一部の塩基配列に実質的に相補的な塩基配列を有し、該蛋白質または部 分べプチドの発現を抑制し得る作用を有するオリゴヌクレオチドまたはその 誘導体であれば、 いずれのアンチセンス DN Aであってもよい。
該 DNAまたは mRNAに実質的に相補的な塩基配列とは、 例えば、 該 DN Aまたは mRNAに相補的な塩基配列 （すなわち、 該 DNAまたは mRNAの 相補鎖） の全塩基配列または部分塩基配列と約 70 %以上、 好ましくは約 8 0%以上、 より好ましくは約 90 %以上、 さらに好ましくは約 95%以上の相 同性を有する塩基配列などが挙げられる。 特に、 本発明の DNAまたは mRN Aの相補鎖の全塩基配列のうち、本発明の蛋白質などの N末端部位をコードす る部分の塩基配列 （例えば、 開始コドン付近の塩基配列など） の相補鎖と約 7 0%以上、 好ましくは約 80%以上、 より好ましくは約 90%以上、 さらに好 ましくは約 95 %以上の相同性を有するアンチセンス DNAが好適である。こ れらのアンチセンス DN Aは、公知の DN A合成装置などを用いて製造するこ とができる。 本発明の蛋白質、 その部分ペプチドまたはそれらの塩 （以下、 本発明の蛋白 質と略記する場合がある） 、 本発明の蛋白質またはその部分ペプチドをコード する DNA (以下、 本発明の DNAと略記する場合がある） 、 本発明の蛋白質 に対する抗体 （以下、 本発明の抗体と略記する場合がある） およびアンチセン ス DNAは、①本発明の蛋白質に対する結合蛋白質の決定方法、②組換え型蛋 白質の発現系の構築、③ two— hy b r i d法を用いたアツセィ系の開発と 医薬品侯補化合物のスクリーニング、 ④構造的に類似したリガンド ·レセプ夕 一との比較に基づいたドラッグデザィンの実施、⑤遺伝子診断におけるプロ一 ブ、 PCRプライマーの作成等における試薬として用いることができ、 また、 ⑥遺伝子治療等の薬物として用いることができる。
特に、 two— hyb r i d法を用いた本発明の蛋白質に対する結合蛋白質 の取得、 さらに、 本発明の蛋白質とァクチビン受容体、 取得した他の受容体ま たはァクチビン細胞内情報伝達分子を用いた結合アツセィ系によって、ヒ卜な どの温血動物に特異的な情報伝達系の促進薬または阻害薬をスクリーニング することができ、該促進薬または阻害薬を各種疾病の予防 ·治療剤などとして 使用することができ、 以下により具体的に説明する。 ( 1 ) 本発明の蛋白質に対する結合蛋白質の決定方法
本発明の蛋白質は、本発明の蛋白質に対する結合蛋白質を探索し、 または決 定するための試薬として有用である。
すなわち、本発明は、本発明の蛋白質と相互作用する結合蛋白質をスクリ一 ニングすることを特徴とする本発明の蛋白質に対する結合蛋白質の決定方法 を提供する。
具体的には、本発明の結合蛋白質の決定方法は、宿主細胞発現ベクター上に、
①転写因子の D N A結合領域に本発明の蛋白質を融合させたベクターと②被 験蛋白質と転写活性化領域との融合ライブラリ一とを、該転写因子結合領域を プロモー夕一上に保持しているレポーター遺伝子を持つ宿主細胞に導入し、 2 種の蛋白の結合により上昇するレポーター遺伝子の発現量の変化により、該蛋 白質と相互作用する蛋白質またはその塩を決定する方法である。
本発明の結合蛋白質決定方法においては、本発明の蛋白質と被験蛋白質との 相互作用を特定のレポーター遺伝子の発現に変換することにより検出する t w o - h y b r i d法を用いることを特徴とする。
本発明の結合蛋白質決定方法の具体的な説明を以下にする。
まず、結合蛋白質決定方法に用いる本発明の蛋白質をコードする D N Aとし ては、 本発明の配列番号： 5または配列番号： 6で表されるアミノ酸配列と実 質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質をコードする塩基配列またはそ の部分ペプチドをコードする塩基配列を含有するものであればいかなるもの であってもよい。また、温血動物（例、 ヒトなど）のゲノム D N A、温血動物（例、 ヒトなど） のゲノム D N Aライブラリー、 温血動物（例、 ヒトなど） の組織 · 細胞由来の c D N A、 温血動物（例、 ヒトなど） の組織 ·細胞由来の c D N A ライブラリ一より自体公知の方法により単離された D N A、合成または半合成 D N Aのいずれでもよい。ライブラリーに使用するべクタ一はバクテリオファ ージ、 プラスミド、 コスミド、 ファージミドなどのいずれであってもよい。 一 方、 組織'細胞より mRN A画分を調製したものを用いて直接 RT— P CR法 によって単離することもでき、 あるいは、 部分的な塩基配列をそれぞれ化学的 に合成し、 それらを連結させることによって製造することもできる。
スクリーニングする被験蛋白質ライブラリ一としては、 市販の各種動物の 種々臓器由来の c DNAライブラリー（C 1 o n t e c h社製 MATCHM AKER c DNAなど） などが用いられる。
DNA結合領域と被験蛋白質の融合蛋白質を発現させるベクタ一としては、 p AS 2 - 1 , pGBT9、 pKAD— 09、 p SD09、 p EG 202, p BTM1 16などが用いられる。
転写因子の活性化領域と蛋白質の融合蛋白質を発現させるベクターとして は、 pGAD424、 pACT 2 pKT l O Ga l - VP、 p J G4 - 5、 P VP 16などが用いられる。
転写因子としては、 GAL4、 L e xA、 SRFなどが用いられる。
レポ一夕一遺伝子としては、 b—ガラクトシダーゼ遺伝子 （L a c Z) 、 ヒ スチジン遺伝子 （H I S 3) 、 ルシフェラ一ゼ遺伝子、 クロラムフエニコ一ル ァセチル転移酵素遺伝子などが用いられる。
宿主細胞としては、 酵母 （S a c c h a r omy c e s c e r e v i s i a e) 、 大腸菌などが用いられ、 その中でも CG— 1 945、 Y 190、 Υ 1 87、 HF 7 c、 S FY 526, L40、 EGY48、 H I S/L 1 , 62 L 酵母株などが用いられる。
具体的には、 該蛋白質に結合する蛋白質の決定方法は、 まず該蛋白質をコー ドする塩基配列を含む DN A断片とプラスミ ド （例えば、 pAS 2— 1) 上の DN A結合領域をコードする塩基配列を含む DN A断片と同じ続き枠に結合 したプラスミド、 およびプラスミ ド （例えば、 pACT 2) 上の転写因子 （例 えば、 GAL4) の転写活性化領域をコードする塩基配列を含む DNA断片と 結合し、 融合蛋白質の形で発現される c DNAライブラリーを、 例えば、 モレ キユラ一 クロ一ニング（Mo l e c u l a r C l on i n g) 2 nd ( J. S amb r o o k e t . a 1. , C o l d S p r i n g Ha r o r L a b. P r e s s , 1 98 9) に記載の方法などに従って作成することができる。 上記の 2種のプラスミドを宿主細胞 （例えば、 サッカロミマイセス セレビ シェ Y 1 90) に導入するには、 これらで同時に形質転換してもよいし、 ま たは一方のプラスミドを先に導入した後に他方を逐次導入してもよく、例えば、 メッソズ 'イン 'ェンサイモ口ジー (Me t h o d s i n En z ymo l o gy) , 1 94巻， 1 82— 1 8 7 ( 1 99 1 ) 、 プロシ一ジングズ ·ォブ · ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェンシィズ ·ォブ ·ザ ·ユーエスェ — (P r o c. Na t l. Ac a d. S c i. USA) 75巻， 1 92 9 (1 978) などに記載の方法に従って行うことができる。
形質転換体のレポーター遺伝子の発現、 レポーター酵素の発色物質、 蛍光物 質の生成量あるいは発光量等に変換して検出できる。 より具体的には、 宿主細 胞が酵母の場合、 レポーター遺伝子の発現 （例えば、 i3—ガラクトシダーゼ活 性） は、 レプリカプレート法またはフィル夕一法を、 好ましくはフィル夕一法 を用いて青 Z白の呈色スクリーニングにより検出することができる。
フィル夕一法で呈色 （例えば、 青色） したコロニーは、 例えば、 ァ 'プラク チカル ·アプローチ （A P r a c t i c a l Ap p r o a c h) (B a r t e 1 , P. L . e t a 1. ， Ox f o r d Un i v e r s i t y P r e s s, Ox f o r d ; 1 5 3 - 1 79, 1 993 a) などに記載の方法に従い処 理されることにより、ポジティブクローンの単一コロニーを分離することがで さる。
分離した単一の形質転換体より、 例えば、 ジーン （Ge n e) ， 57巻， 2 67 ( 1 987) 、 バイオ 'テクニクス （B i o Te c h n i q u e s) , 14巻， 552 ( 1 9 93) などに記載の方法に従い、 プラスミド DNAを回 収し、 その DN Αの塩基配列の決定により、 本発明の蛋白質に対する受容体を 決定することができる。
また、 市販のキット、 例えば、 MATCHMAKER GAL 4 Two— H y b r i d S y s t ems (C l o n t e c h社製） などを使用しても本発 明の蛋白質に対する結合蛋白質を決定することができ、 その場合は、 添付の使 用説明書に記載の方法に従って行うことができる。 ( 2 ) 本発明の蛋白質欠乏症の予防，治療剤
上記 （1 ) の方法において、 本発明の蛋白質に対する結合蛋白質が明らかに なれば、該結合蛋白質の発現部位および該結合蛋白質を介した本発明の蛋白質 が有する作用などを明らかにすることができる。 これらの知見を基に、 本発明 の蛋白質をコードする D N Aは、 該結合蛋白質を介した疾患の予防 ·治療剤と して使用することができる。 また、 本発明の蛋白質はァクチビン受容体または ァクチビン細胞内情報伝達分子への結合活性を示すことより、ァクチビン受容 体またはァクチビン細胞内情報伝達分子を介した疾患の予防'治療剤として使 用することができる。
例えば、 本発明の蛋白質の遺伝子が脳内に特異的に発現することから、 該結 合蛋白質、ァクチビン受容体またはァクチビン細胞内情報伝達分子に関連した 神経細胞異常または脳疾患などを発症している患者がいる場合に （ィ） 本発明 の蛋白質をコードする D N Aを該患者に投与し発現させることによって、ある いは（口）脳細胞などに本発明の蛋白質をコ一ドする D N Aを揷入し発現させ た後に、 該脳細胞を該患者に移植することなどによって、 該患者の脳細胞にお ける本発明の蛋白質の作用を充分に発揮させることができる。従って、 本発明 の蛋白質をコードする D N Aは、安全で低毒性な本発明の蛋白質の結合蛋白質、 ァクチビン受容体またはァクチビン細胞内情報伝達分子を介した疾患の予 防 ·治療剤として使用することができる。
本発明の D N Aを上記治療剤として使用する場合は、該 D N Aを単独あるい はレトロウイルスベクター、 アデノウイルスベクター、 アデノウイルスァソシ エーテツドウィルスベクタ一などの適当なベクタ一に挿入した後、常套手段に 従って実施することができる。 例えば、 必要に応じて糖衣を施した錠剤、 カブ セル剤、 エリキシル剤、 マイクロカプセル剤などとして経口的に、 あるいは水 もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤な どの注射剤の形で非経口的に使用できる。 例えば、 本発明の D N Aを生理学的 に認められる担体、 香味剤、 賦形剤、 べヒクル、 防腐剤、 安定剤、 結合剤など とともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和するこ とによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示され た範囲の適当な容量が得られるようにするものである。
錠剤、 カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、 例えばゼラ チン、 コーンスターチ、 トラガント、 アラビアゴムのような結合剤、 結晶性セ ルロースのような賦形剤、 コーンスターチ、 ゼラチン、 アルギン酸などのよう な膨化剤、 ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、 ショ糖、 乳糖またはサ ッカリンのような甘味剤、 ペパーミント、 ァカモノ油またはチェリーのような 香味剤などが用いられる。 調剤単位形態がカプセルである場合には、 前記タイ プの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のため の無菌組成物は注射用水のようなべヒクル中の活性物質、 胡麻油、 椰子油など のような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施 にしたがって処方するとができる。 注射用の水性液としては生理食塩水、 ブド ゥ糖やその他の補助薬を含む等張液 （例えば、 D—ソルビトール、 D—マンニ トール、 塩化ナトリウムなど） などがあげられ、 適当な溶解補助剤、 例えば、 アルコール （例えば、 エタノール） 、 ポリアルコール （例えば、 プロピレング リコール、 ポリエチレングリコール） 、 非イオン性界面活性剤 （例えば、 ポリ ソルベート 8 0 (商品名） 、 H C O— 5 0 ) などと併用してもよい。 油性液と してはゴマ油、 大豆油などがあげられ、 溶解補助剤として安息香酸ベンジル、 ベンジルアルコールなどと併用してもよい。
また、 緩衝剤 （例えば、 リン酸塩緩衝液、 酢酸ナトリウム緩衝液） 、 無痛化 剤 （例えば、 塩化ベンザルコニゥム、 塩酸プロ力インなど） 、 安定剤 （例えば、 ヒト血清アルブミン、 ポリエチレングリコールなど） 、 保存剤 （例えば、 ベン ジルアルコール、 フエノールなど） 、 酸化防止剤などと配合してもよい。 調整 された注射液は通常、 適当なアンプルに充填される。 このようにして得られる 製剤は安全で低毒性であるので、 例えば温血哺乳動物 （例えば、 ラット、 ゥサ ギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サル、 ヒトなど） に対して投与するこ とができる。 該 D N Aの投与量は、 症状などにより差異はあるが、 経口投与の 場合、 一般的に成人 （6 O K gとして） においては、 一日につき約 0 . 1から 1 0 0 m g、 好ましくは約 1 . 0から 5 0 m g、 より好ましくは約 1 . 0から 20mgである。 非経口的に投与する場合は、 その 1回投与量は投与対象、 対 象臓器、 症状、 投与方法などによっても異なるが、 例えば注射剤の形では通常 成人 （60 Kgとして） においては、 一日につき約 0. 0 1から 3 Omg程度、 好ましくは約 0. 1から 2 Omg程度、 より好ましくは 0. 1から 1 Omg程 度を静脈注射により投与するのが好都合である。 他の動物の場合も、 60Kg 当たりに換算した量を投与することができる。
(3)本発明の蛋白質とその結合蛋白質との結合を阻害あるいは促進する化合 物のスクリーニング方法
本発明の蛋白質またはその塩を用いるか、または組換え型結合蛋白質の発現 系を構築し、該発現系を用いた蛋白質競合的結合アツセィ系を用いることによ つて本発明の蛋白質とその結合蛋白質との結合を阻害あるいは促進する化合 物 （例えば、 ペプチド、 蛋白質、 非ペプチド性化合物、 合成化合物、 発酵生産 物など） またはその塩をスクリーニングすることができる。 さらに、 本発明の 蛋白質をコードする DNAを導入した形質転換体での 2種の蛋白質の相互作 用によるレポーター遺伝子の発現系 （two— hy b r i d法） を用いること によっても、本発明の蛋白質とその結合蛋白質との結合を阻害あるいは促進す る化合物 （例えば、 ペプチド、 蛋白質、 非ペプチド性化合物、 合成化合物、 発 酵生産物など） またはその塩をスクリーニングすることができる。
このような化合物には、 結合蛋白質を介して細胞刺激活性 （例えば、 増殖促 進、 細胞内蛋白質のリン酸化などを促進あるいは抑制する活性など） を有する 化合物 （いわゆるァゴニスト） と該細胞刺激活性を有しない化合物 （いわゆる アンタゴニスト） などが含まれる。
本発明の蛋白質に結合する蛋白質としては、 上記 （1) で決定された蛋白質、 ァクチビン受容体、 前述したァクチビン細胞内情報伝達分子 （特に、 Smad 3などの Sm a d) などが用いられる。 以下、 これらを本発明の蛋白質に対す る結合蛋白質と略記する場合がある。
すなわち、 本発明は、
1) ( i ) 本発明の蛋白質に対する結合蛋白質に、 本発明の蛋白質またはその 塩を接触させた場合と （i i ) 本発明の蛋白質に対する結合蛋白質に、 本発明の 蛋白質またはその塩および試験化合物を接触させた場合との比較を行なうこ と、 または、
2 ) ( i ) 本発明の蛋白質および本発明の蛋白質に対する結合蛋白質をコード する D N Aを導入した形質転換体と （i i )試験化合物を接触させた場合の該形 質転換体との比較を行なうことを特徴とする本発明の蛋白質と本発明の蛋白 質に対する結合蛋白質との結合を阻害あるいは促進する化合物またはその塩 のスクリーニング方法を提供する。
本発明のスクリーニング方法においては、
1 ) ( i ) 本発明の蛋白質に対する結合蛋白質に、 本発明の蛋白質またはその 塩を接触させた場合と （i i ) 本発明の蛋白質に対する結合蛋白質に、 本発明の 蛋白質またはその塩および試験化合物を接触させた場合における、例えば、本 発明の蛋白質の結合蛋白質に対する、 該蛋白質またはその塩の結合量、細胞刺 激活性などを測定して比較すること、 または、
2 ) ( i )本発明の蛋白質および本発明の蛋白質に対する結合蛋白質をコード する D N Aを導入した形質転換体と （i i )試験化合物を接触させた該形質転換 体における、例えば、 呈色度などによるレポ一夕一遺伝子の発現の程度を比較 することを特徴とする。
より具体的には、 本発明は、
①標識した本発明の蛋白質またはその塩を、本発明の蛋白質に対する結合蛋白 質に接触させた場合と、標識した本発明の蛋白質またはその塩および試験化合 物を本発明の蛋白質に対する結合蛋白質に接触させた場合における、標識した 本発明の蛋白質またはその塩の該結合蛋白質に対する結合量を測定し、比較す ることを特徴とする本発明の蛋白質またはその塩と該結合蛋白質との結合を 阻害あるいは促進する化合物またはその塩のスクリーニング方法、
②本発明の蛋白質に対する結合蛋白質が膜結合型の蛋白質（例えば、膜貫通型 受容体、 チャンネル等） の場合、 標識した本発明の蛋白質またはその塩を、 本 発明の蛋白質に対する結合蛋白質を含有する細胞または該細胞の膜画分に接 触させた場合と、標識した本発明の蛋白質またはその塩および試験化合物を本 発明の蛋白質に対する結合蛋白質を含有する細胞または該細胞の膜画分に接 触させた場合における、標識した本発明の蛋白質またはその塩の該細胞または 該膜画分に対する結合量を測定し、比較することを特徴とする本発明の蛋白質 またはその塩と該結合蛋白質との結合を阻害あるいは促進する化合物または その塩のスクリーニング方法、
③標識した本発明の蛋白質またはその塩を、本発明の蛋白質に対する結合蛋白 質をコ一ドする D N Aを含有する形質転換体を培養することによって細胞内 に発現した結合蛋白質に接触させた場合と、標識した本発明の蛋白質またはそ の塩および試験化合物を本発明の蛋白質に対する結合蛋白質をコードする D N Aを含有する形質転換体を培養することによって細胞内に発現した結合蛋 白質に接触させた場合における、標識した本発明の蛋白質またはその塩の該結 合蛋白質に対する結合量を測定し、比較することを特徴とする本発明の蛋白質 またはその塩と該結合蛋白質との結合を阻害あるいは促進する化合物または その塩のスクリーニング方法、 および
④本発明の蛋白質の遺伝子を発現せしめるプラスミドと本発明の蛋白質に対 する結合蛋白質の遺伝子を発現せしめるプラスミドとを導入された宿主細胞 と、 該宿主細胞を試験化合物に接触させた場合における、該宿主細胞内での本 発明の蛋白質および本発明の蛋白質に対する結合蛋白質の相互作用により発 現が制御されている遺伝子群の発現、 あるいは生理学的反応 （例えば、 該結合 蛋白質がァクチビン受容体の場合、 F S Hの分泌等） を比較することを特徴と する本発明の蛋白質またはその塩と該結合蛋白質との結合を阻害あるいは促 進する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
本発明のスクリーニング方法の具体的な説明を以下にする。
まず、本発明のスクリーニング方法に用いる結合蛋白質としては、 該結合蛋 白質またはそれらの塩を含有するものであれば何れのものであってもよいが、 温血動物の臓器の抽出物が好適である。 しかし、特にヒ卜由来の臓器は入手が 極めて困難なことから、 スクリーニングに用いられるものとしては、遺伝子組 換技術を用いて大量発現させた結合蛋白質またはその塩が適している。
結合蛋白質を製造するには、 前述の方法が用いられるが、 例えば、 該蛋白質 をコ一ドする DNAを哺乳動物細胞や昆虫細胞で発現することにより行うこ とができる。目的部分をコードする DNA断片には相補 DNAが用いられるが、 必ずしもこれに制約されるものではなく、例えば、遺伝子断片や合成 DN Aを 用いてもよい。該結合蛋白質をコ一ドする DN A断片を宿主動物細胞に導入し、 それらを効率よく発現させるためには、該 DNA断片を昆虫を宿主とするバキ ュロウィルスに属する核多角体病ウィルス （n u c l e a r p o l y h e d r o s i s v i r u s ; NPV) のポリヘドリンプロモーター、 S V40由 来のプロモー夕一、 レトロウイルスのプロモー夕一、 メタ口チォネインプロモ 一夕一、 ヒト ·ヒートショックプロモー夕一、 サイトメガロウィルスプロモ一 夕一、 S Rひプロモタ一などの下流に組み込むのが好ましい。発現した結合蛋 白質の量と質の検査はそれ自体公知の方法で行うことができる。例えば、 文献 CN amb i . P. ら、 ザ ·ジャーナル ·ォブ ·バイオロジカル ·ケミストリ 一 （J . B i o l . C h em. ) , 2 6 7巻， 1 9 5 5 5〜 1 9 5 5 9頁， 1 9 9 2年〕 に記載の方法に従って行うことができる。
したがって、本発明のスクリーニング方法において、結合蛋白質またはその 塩を含有するものとしては、それ自体公知の方法に従って精製した結合蛋白質 またはその塩であってもよいし、 該蛋白質を含有する細胞を用いてもよく、 ま た該蛋白質が膜結合蛋白質の場合、それを含有する細胞の膜画分を用いてもよ い。
本発明のスクリーニング方法において、結合蛋白質を含有する細胞を用いる 場合、 該細胞をダルタルアルデヒド、 ホルマリンなどで固定化してもよい。 固 定化方法はそれ自体公知の方法に従って行うことができる。
結合蛋白質を含有する細胞としては、結合蛋白質を発現した宿主細胞をいう 力 該宿主細胞としては、 大腸菌、 枯草菌、 酵母、 昆虫細胞、 動物細胞などが 挙げられる。
膜画分としては、細胞を破砕した後、 それ自体公知の方法で得られる細胞膜 が多く含まれる画分のことをいう。細胞の破砕方法としては、 P o t t e r— E 1 V e h j em型ホモジナイザ一で細胞を押し潰す方法、ヮ一リングプレン ダ一やポリトロン （K i n e 1 1 m a t i c a社製） のよる破砕、 超音波によ る破砕、フレンチプレスなどで加圧しながら細胞を細いノズルから噴出させる ことによる破砕などが挙げられる。細胞膜の分画には、 分画遠心分離法や密度 勾配遠心分離法などの遠心力による分画法が主として用いられる。 例えば、 細 胞破砕液を低速 （500から 3000 r pm) で短時間 （通常、 約 1から 10 分） 遠心し、 上清をさらに高速 （15000から 30000 r pm) で通常 3 0分から 2時間遠心し、 得られる沈澱を膜画分とする。 該膜画分中には、 発現 した結合蛋白質と細胞由来のリン脂質や膜蛋白質などの膜成分が多く含まれ る。
該結合蛋白質を含有する細胞や膜画分中の結合蛋白質の量は、 1細胞当たり 102から 1 08分子であるのが好ましく、 1 05から 107分子であるのが好 適である。 なお、 発現量が多いほど細胞抽出物あるいは膜画分当たりの本発明 の蛋白質との結合活性 （比活性） が高くなり、 高感度なスクリーニング系の構 築が可能になるばかりでなく、同一口ッ卜で大量の試料を測定できるようにな る。
本発明の蛋白質と本発明の蛋白質に対する結合蛋白質との結合を阻害する 化合物をスクリーニングする前記の①〜③を実施するためには、適当な結合蛋 白質画分と、 標識した本発明の蛋白質が必要である。 該結合蛋白質画分として は、 天然型の結合蛋白質画分か、 またはそれと同等の活性を有する組換え型結 合蛋白質画分などが望ましい。 ここで、 同等の活性とは、 本発明の蛋白質に対 する同等の結合活性などを示す。
標識した本発明の蛋白質としては、 標識した本発明の蛋白質、 標識した本発 明の蛋白質アナログ化合物などが用いられる。 例えば 〔3H〕 、 〔1251〕 、
〔14C〕 、 〔135S〕 など標識された本発明の蛋白質などを利用することがで さる。
具体的には、本発明の蛋白質と本発明の蛋白質に対する結合蛋白質との結合 を阻害する化合物のスクリーニングを行うには、 まず、 該結合蛋白質を含有す る細胞または細胞の膜画分を、スクリーニングに適したバッファ一に懸濁する ことにより結合蛋白質標品を調製する。 バッファ一には、 pH4から 10 (望 ましくは PH6から 8) のリン酸バッファ一、 トリス一塩酸バッファ一などの 本発明の蛋白質と本発明の蛋白質に対する結合蛋白質との結合を阻害しない バッファーであればいずれでもよい。 また、 非特異的結合を低減させる目的で、 CHAP S、 Twe e n— 8 0 (商品名） （花王—アトラス社製） 、 ジギトニ ン、デォキシコレートなどの界面活性剤をバッファーに加えることもできる。 さらに、プロテア一ゼによる結合蛋白質や本発明の蛋白質の分解を抑える目的 で PMS F、 ロイぺプチン、 E— 6 4 (ペプチド研究所製） 、 ぺプス夕チンな どのプロテア一ゼ阻害剤を添加することもできる。 0. 0 1から 1 0m lの該 結合蛋白質溶液に、 一定量 （5 0 0 0から 5 0 0 0 0 0 c pm) の標識した本 発明の蛋白質を添加し、 同時に 1 0— 4から 1 0— 1 QMの試験化合物を共存さ せる。 非特異的結合量 （NS B) を知るために大過剰の未標識の本発明の蛋白 質を加えた反応チューブも用意する。 反応は 0から 5 0°C、 望ましくは 4から 3 7 °Cで 2 0分から 24時間、 望ましくは 3 0分から 3時間行う。 反応後、 ガ ラス繊維濾紙等で濾過し、 適量の同バッファーで洗浄した後、 ガラス繊維濾紙 に残存する放射活性を液体シンチレーシヨンカウンターまたはァーカウンタ 一で計測する。 拮抗する物質がない場合のカウント （B 0) から非特異的結合 量 （NS B) を引いたカウント （B 0— NS B) を 1 0 0 %とした時、 特異的 結合量（B— NS B) が例えば 5 0 %以下になる試験化合物を拮抗阻害能力の ある候補物質として選択することができ、 一方、 特異的結合量 （B— NS B) が例えば 1 5 0 %以上になる試験化合物を結合促進能力のある候補化合物と して選択することができる。
本発明の蛋白質と本発明の蛋白質に対する結合蛋白質との結合を阻害ある いは促進する化合物スクリーニングする前記の④の方法を実施するためには、 本発明の蛋白質の遺伝子を発現せしめるプラスミドと本発明の蛋白質に対す る結合蛋白質の遺伝子を発現せしめるプラスミ ドとを導入された宿主細胞内 での、本発明の蛋白質および本発明の蛋白質に対する結合蛋白質の相互作用に より発現が制御されている遺伝子群の発現、 あるいは生理学的反応（例えば、 該結合蛋白質がァクチビン受容体の場合、 F SHの分泌等） を公知の方法を用 いて測定することができる。 具体的には、 宿主細胞が酵母の場合、 まず、 酵母 細胞に本発明の蛋白質と転写制御因子の DN A結合領域とを融合させた蛋白 質を発現せしめるプラスミ ドと本発明の蛋白質に対する結合蛋白質と転写制 御因子の活性化領域とを融合させた蛋白質を発現せしめるプラスミ ドとを導 入した形質転換体を前述と同様の方法にて作製する。スクリーニングを行なう にあたっては、この形質転換体を 10一4から 10— 1 GMの試験化合物を含む寒 天培地上で 30°Cで 2から 4日間培養する。 寒天培地としては、 トリブトファ ン ロイシン/ヒスチジン欠損 SD培地、 トリブトフアン ロイシン欠損 SD 培地などが用いられる。 その後、 レポーター遺伝子の発現を) 3—ガラクトシダ ーゼ活性によるコロニーの呈色として検出するために、フィルタ一法などを用 いて検出する。 検出は、 形質転換体が付着したフィルタ一上に、 Z緩衝液 X - a l (C 1 o n t e c h社） で湿らせたワットマン # 5フィルターまたは VWRグレード 410フィルタ一を置き、 30°Cで 30分から 8時間保温した 後、 フィルター上のコロニーの呈色を、 試験化合物を含まないコントロールと しての形質転換体との呈色の度合いを比較する。 この時、 コントロールと比し て、より濃い呈色を示すコロニーの培養培地に加えた試験化合物を結合促進能 力のある候補化合物として、 また、 より薄い呈色を示すコロニーの培養培地に 加えた試験化合物を結合阻害能力のある候補化合物として選択することがで きる。 また、 レポーター遺伝子の発現を 3—ガラクトシダーゼ活性として、 基 質の分解により生成する o—二トロフエノ一ル量を測定することにより定量 することもできる。 まず、 形質転換体を 1 0一4から 10— 1 QMの試験化合物を 含む液体培地上で 30 で 8から 24時間振盪培養する。液体培地としては、 トリブトフアン/口イシン ヒスチジン欠損 SD培地、 トリブトフアン Zロイ シン欠損 SD培地などが用いられる。 好ましくは一夜培養した後、 培養液の一 部を YPD培地に植菌し、 OD 600が 0. 5から 1. 0となるように 30 で 3から 5時間振盪培養する。その培養液の一部を遠心した残渣の Z緩衝液ノ β —メルカプトエタノール混合物中に ο—二トロフエ二ルガラクトシド溶液（S i gma社） を加え反応させる。 反応は、 0から 50でで、 3分から 24時間、 望ましくは、 30 で、 30分から 1 5時間行い、 黄色に着色した上清の 42 O nmの吸光度 （〇D 420) を測定する。 3—ガラクトシダーゼ活性は、 得ら れた吸光度 （OD42()) より以下の計算式を用いて、 ミラー単位 （M i 1 1 e r u n i t ) として算出する。
試験化合物を培地に添加することにより、 —ガラクトシダーゼ活性値が約 1 0 %以上、 好ましくは約 2 0 %以上、 より好ましくは約 3 0 %以上、 最も好 ましくは約 5 0 %以上増加した場合、該試験化合物を本発明の蛋白質と本発明 の蛋白質に対する結合蛋白質との結合を促進する能力のある候補化合物とし て選択することができる。 一方、 試験化合物を培地に添加することにより、 3 —ガラクトシダ一ゼ活性値が約 1 0 %以上、好ましくは約 2 0 %以上、 より好 ましくは約 3 0 %以上、最も好ましくは約 5 0 %以上低下した場合、該試験化 合物を本発明の蛋白質と本発明の蛋白質に対する結合蛋白質との結合を阻害 する能力のある候補化合物として選択することができる。
レポーター遺伝子の発現活性を測定してスクリーニングを行なうには、本発 明の蛋白質に対する結合蛋白質をコードする D N Aが必要である。本発明の蛋 白質に対する結合蛋白質をコードする D N Aとしては、該 D N Aを含有する D N Aまたはそれらとハイストリンジェン卜な条件下でハイブリダィズする D N Aなどが望ましい。
試験化合物としては、 例えば、 ペプチド、 タンパク、 非ペプチド性化合物、 合成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液などが挙 げられ、 これら化合物は新規な化合物であってもよいし、 公知の化合物であつ てもよい。
本発明の蛋白質と本発明の蛋白質に対する結合蛋白質との結合を阻害ある いは促進する化合物またはその塩のスクリーニング用キットは、本発明の蛋白 質またはその塩、その部分ペプチドまたはその塩、本発明の蛋白質に対する結 合蛋白質を含有する細胞、本発明の蛋白質に対する結合蛋白質を含有する細胞 の抽出画分、あるいは本発明の蛋白質と転写制御因子の D N A結合領域を融合 させた蛋白質を発現せしめるプラスミドと本発明の蛋白質に対する結合蛋白 質と転写制御因子の活性化領域を融合させた蛋白質を発現せしめるプラスミ ドとを導入した形質転換体を含有するものである。 本発明のスクリーニング用キッ卜の例としては、 次のものが挙げられる。 1. スクリーニング用試薬
①形質転換体
本発明の蛋白質と転写制御因子の DN A結合領域を融合した蛋白質を発現 せしめるプラスミ ドとァクチビン II A— N受容体蛋白質と転写制御因子の活 性化領域を融合した蛋白質を発現せしめるプラスミドとを導入し、形質転換し た酵母 Y 1 90株
②液体培養培地
トリブトファン/口イシン ヒスチジン欠損 SD培地：酵母窒素源（D i f c o社） 水溶液をオートクレーブで滅菌後、 L—イソロイシン、 L—バリン、 L—アデニンへミ硫酸塩、 L—アルギニン塩酸塩、 L—リジン塩酸塩、 Lーメ チォニン、 L—フエ二ルァラニン、 L—スレオニン、 L—チロシン、 L—ゥラ シルよりなるオートクレープで滅菌し 4 で保存したドロップァゥト溶液を 加える。 さらに、 フィル夕一で濾過滅菌した 40 %デキストロ一ス Zストツク 溶液 （S i gma社） を加え、 2%になるように調整し、 4でで保存するか、 あるいは用時調製してもよい。
YPD培地： D i f c o ペプトンに酵母抽出物の水溶液をォ一トクレーブ で滅菌後、フィル夕一で濾過滅菌した 40%デキストロ一スを加え最終濃度を 2 %に調整し、 4 で保存するか、 あるいは用時調製してもよい。
③緩衝液
Z緩衝液： Na2HP〇4 ' 7H2〇、 NaH2P04 ' H20、 KC 1、 Mg S〇4 ' 7H20を含み、 pHを 7付近に調整後、 オートクレーブで滅菌し、 4でで保存するか、 あるいは用時調製してもよい。
Z緩衝液 ]3—メルカプトエタノール： Z緩衝液 1 00に対して ]3—メルカ プトエタノールを 0. 2 7の割合で加えたもの。
④ i3—ガラクトシダ一ゼの基質
ο—二トロフエ二ルガラクトシド溶液（S i gma社） を Z緩衝液に溶解し、 4mg/m 1の濃度に調整したもので用時調製する。
⑤反応停止液
4 で保存した 1M 炭酸ナトリウム溶液を用いるか、 あるいは用時調製し てもよい。
2. 測定法
① 1 0— 3から 1 0— 1 GMの試験化合物溶液を 5 x 1加えた l m 1のトリプトフ ァン ロイシン欠損 S D培地で酵母形質転換体を 3 0 °Cで一夜振盪培養する。 ②培養液 0. 4m lを 1. 6m 1の YPD培地中に加え、 006。。が0. 5か ら 1. 0となるように 3 O :で 3から 5時間振盪培養する。
③ 0. 3m 1の培養液を 1 4 0 0 0 r pmで 3 0秒間遠心し、 残渣を 0. 3m 1の Z緩衝液に懸濁し、 再度遠心後、 沈殿を 0. lm 1の Z緩衝液に懸濁する。
④液体窒素にて一旦凍結後、 3 7°Cで 3 0秒から 1分間かけて溶解する。 0. 7 m 1の Z緩衝液 Z 3—メルカプトエタノール混液と 0. 1 6m lの o—二ト 口フエ二ルガラクトシド溶液を加え、 3 0°Cで溶液が黄色になるまで保温し、 この後 0. 4m 1の 1 M 炭酸ナトリウム溶液を加える。
⑤ 1 40 0 0 r pmで 1 0分間遠心し、その上清の 4 2 0 nmにおける吸光度 を測定し、 —ガラクトシダーゼ活性をミラー単位（M i l l e r u n i t ) として次の式 〔数 1〕 で求める。
〔数 1〕
/3—ガラクトシダーゼ活性 = 1 0 0 0 XOD 420/ ( t X VXOD 600) 〇D 42 0 ： 42 0 nmにおける吸光度
t ：反応時間 （分）
V：反応に用いた、 形質転換体の Z緩衝液の懸濁液量 X希釈倍率 本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得ら れる化合物またはその塩は、 本発明の蛋白質 （なかでも 5つの PD Zドメイン または （および） 2つの WWドメインを有し、 特に脳で発現し、 ァクチビン受 容体または （および） ァクチビン細胞内情報伝達分子と結合する蛋白質） と本 発明の蛋白質に対する結合蛋白質との結合を阻害する化合物または促進する 化合物 （以下、 促進化合物） である。
本発明の蛋白質と本発明の蛋白質に対する結合蛋白質との結合を阻害する 化合物には、①本発明の蛋白質に対する結合蛋白に結合することによって、 本 発明の蛋白質と本発明の蛋白質に対する結合蛋白との結合を阻害し、それ自体 が結合蛋白質を介して細胞刺激活性を有する化合物またはその塩（いわゆるァ ゴニスト） 、 ②本発明の蛋白質に対する結合蛋白に結合することによって、 本 発明の蛋白質と本発明の蛋白質に対する結合蛋白との結合を阻害するが、それ 自体は結合蛋白質を介した細胞刺激活性を有しない化合物またはその塩（いわ ゆるアンタゴニス卜）、③本発明の蛋白質に対する結合蛋白に結合することな く、本発明の蛋白質と本発明の蛋白質に対する結合蛋白との結合を阻害する化 合物 （以下、 阻害化合物と略記） またはその塩などが含まれる。
本発明のスクリ一ニング方法またはスクリ一ニング用キットを用いて得ら れる化合物またはその塩と本発明の蛋白質に対する結合蛋白質との結合性の 有無は、 上記した結合活性の測定法に従って確認することができる。
結合蛋白質を介した細胞刺激活性は、それ自体公知の方法あるいはそれに準 じる方法に従って測定することができる。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得ら れる化合物としては、 ペプチド、 タンパク、 非ペプチド性化合物、 合成化合物、 発酵生産物などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であつてもよいし、 公知の化合物であってもよい。
該ァゴニストおよび促進化合物は、本発明の蛋白質が有する生理活性と同様 の作用を有するか、あるいはその生理活性を増強する作用を有しているので、 該蛋白質活性に応じて安全で低毒性な医薬組成物、特に該結合蛋白質またはァ クチビン受容体に関連した神経細胞異常または脳疾患（例えば、 アルッハイマ —病、 パーキンソン病、 てんかん症、 ハンチントン舞踏症など） の予防 ·治療 薬として有用である。
逆に、該アン夕ゴニストまたは阻害化合物は、 本発明の蛋白質が有する生理 活性を抑制することができるので、該蛋白質活性を抑制する安全で低毒性な医 薬組成物、特に該結合蛋白質またはァクチビン受容体に関連した神経細胞異常 または脳疾患 （例えば、 アルツハイマー病、 パーキンソン病、 てんかん症、 ハ ンチントン舞踏症など） の予防 ·治療薬として有用である。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得ら れる化合物またはその塩を上述の医薬組成物として使用する場合、常套手段に 従って実施することができる。 例えば、 必要に応じて糖衣を施した錠剤、 カブ セル剤、 エリキシル剤、 マイクロカプセル剤などとして経口的に、 あるいは水 もしくは、 それ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、 または懸濁液剤 などの注射剤の形で非経口的に使用できる。 例えば、 該化合物またはその塩を 生理学的に認められる担体、 香味剤、 賦形剤、 べヒクル、 防腐剤、 安定剤、 結 合剤などとともに一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混 和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は 指示された範囲の適当な容量が得られるようにするものである。
錠剤、 カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、 例えばゼラ チン、 コーンスターチ、 卜ラガン卜、 アラビアゴムのような結合剤、 結晶性セ ルロースのような賦形剤、 コーンスターチ、 ゼラチン、 アルギン酸などのよう な膨化剤、 ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、 ショ糖、 乳糖またはサ ッカリンのような甘味剤、 ペパーミント、 ァカモノ油またはチェリーのような 香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、 前記タイ プの材科にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のため の無菌組成物は注射用水のようなべヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油など のような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施 にしたがって処方するとができる。
注射用の水性液としては、 例えば、 生理食塩水、 ブドウ糖やその他の補助薬 を含む等張液 （例えば、 D—ソルビトール、 D—マンニトール、 塩化ナトリウ ムなど） などが用いられ、 適当な溶解補助剤、 例えば、 アルコール （例、 エタ ノール） 、 ポリアルコール （例、 プロピレングリコール、 ポリエチレングリコ —ル） 、 非イオン性界面活性剤 （例、 ポリソルベート 8 0 TM、 H C O— 5 0 ) などと併用してもよい。
油性液としては、 例えば、 ゴマ油、 大豆油などが用いられ、 溶解補助剤とし て安息香酸ベンジル、 ベンジルアルコールなどと併用してもよい。 また、 緩衝 剤 （例えば、 リン酸塩緩衝液、 酢酸ナトリウム緩衝液） 、 無痛化剤 （例えば、 塩化ベンザルコニゥム、 塩酸プロ力インなど） 、 安定剤 （例えば、 ヒト血清ァ ルブミン、 ポリエチレングリコールなど） 、 保存剤 （例えば、 ベンジルアルコ ール、 フエノールなど） 、 酸化防止剤などと配合してもよい。 調整された注射 液は通常、 適当なアンプルに充填される。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、哺乳動物 (例えば、 ラット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サル、 ヒトな ど） に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、症状などにより差異はあるが、経口投与 の場合、 一般的に成人 （6 OKgとして） においては、 通常、 一日につき約 0.
1から 1 00 m g、 好ましくは約 1. 0から 50 m g、 より好ましくは約 1. 0から 2 Omgである。非経口的に投与する場合は、その 1回投与量は投与対 象、 対象臓器、 症状投与方法などによっても異なるが、 例えば、 注射剤の形で は通常成人 （6 OKgとして） においては、 通常、 一日につき約 0. 0 1から
3 Omg程度、 好ましくは約 0. 1から 2 Omg程度、 より好ましくは約 0.
1から 1 Omg程度を静脈注射により投与するのが好都合である。ヒト以外の 動物の場合も、 6 OKg当たりに換算した時に同等となるような量を投与する ことができる。
(4) 本発明の蛋白質、 その部分ペプチドまたはそれらの塩の定量
本発明の蛋白質抗体は、本発明の蛋白質等を特異的に認識することができる ので、被検液中の本発明の蛋白質等の定量、特にサンドィツチ免疫測定法によ る定量などに使用することができる。
すなわち、 本発明は、
( i )本発明の蛋白質等に反応する抗体と、 被検液および標識化された本発明 の蛋白質等とを競合的に反応させ、該抗体に結合した標識化された本発明の蛋 白質等の割合を測定することを特徴とする被検液中の本発明の蛋白質等の定 量法、
(ii)被検液と担体上に不溶化した本発明の抗体および標識化された本発明の 抗体とを同時あるいは連続的に反応させたのち、不溶化担体上の標識剤の活性 を測定することを特徴とする被検液中の本発明の蛋白質等の定量法において、 一方の抗体が本発明の蛋白質等の N端部あるいは C端部を認識する抗体で、他 方の抗体が配列番号： 5または配列番号： 6のアミノ酸配列に反応する抗体で あることを特徴とする被検液中の本発明の蛋白質等の定量法を提供する。
本発明の蛋白質等を認識するモノクローナル抗体（以下、 抗蛋白質抗体と称 する場合がある） を用いて本発明の蛋白質等の測定を行なえるほか、 組織染色 等による検出を行なうこともできる。 これらの目的には、 抗体分子そのものを 用いてもよく、 また、 抗体分子の F ( a b ') 2、 F a ' あるいは F a b画分 を用いてもよい。
本発明の抗体を用いる本発明の蛋白質等の測定法は、特に制限されるべきも のではなく、 被測定液中の抗原量 （例えば本発明の蛋白質量） に対応した抗体、 抗原もしくは抗体 -抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、 これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測 定法であれば、 いずれの測定法を用いてもよい。 例えば、 ネフロメトリー、 競 合法、 ィムノメトリック法およびサンドィツチ法が好適に用いられる力 感度、 特異性の点で、 後述するサンドイッチ法を用いるのが特に好ましい。
標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、 放射性同位元素、 酵 素、 蛍光物質、 発光物質などが挙げられる. 放射性同位元素としては、 例えば 〔1 2 5 I〕 、 〔1 3 1 I〕 、 〔3 H〕 、 〔1 4 C〕 などが、 上記酵素としては、 安 定で比活性の大きなものが好ましく、 例えば iS -ガラクトシダーゼ、 β -グルコ シダ一ゼ、 アルカリフォスファターゼ、 パーォキシダーゼ、 リンゴ酸脱水素酵 素等が、 蛍光物質としては、 フルォレスカミン、 フルォレツセンイソチオシァ ネートなどが発光物質としては、 ルミノール、 ルミノール誘導体、 ルシフェリ ン、 ルシゲニンなどがそれぞれ挙げられる。 さらに、 抗体あるいは抗原と標識 剤との結合にピオチン一アビジン系を用いることもできる。
抗原あるいは抗体の不溶化に当っては、 物理吸着を用いてもよく、 また通常 蛋白質あるいは酵素等を不溶化、固定化するのに用いられる化学結合を用いる 方法でもよい。 担体としては、 ァガロース、 デキストラン、 セルロースなどの 不溶性多糖類、 ポリスチレン、 ポリアクリルアミド、 シリコン等の合成樹脂、 あるいはガラス等が挙げられる。 サンドィツチ法においては不溶化した抗蛋白質抗体に被検液を反応させ（1 次反応） 、 さらに標識化した抗蛋白質抗体を反応させ （2次反応） たのち、 不 溶化担体上の標識剤の活性を測定することにより被検液中の本発明の蛋白質 量を定量することができる. 1次反応と 2次反応は逆の順序に行っても、 また、 同時に行なってもよいし時間をずらして行なってもよい。標識化剤および不溶 化の方法は前記のそれらに準じることができる。 また、サンドィツチ法による 免疫測定法において、固相用抗体あるいは標識用抗体に用いられる抗体は必ず しも 1種類である必要はなく、測定感度を向上させる等の目的で 2種類以上の 抗体の混合物を用いてもよい。
本発明のサンドィツチ法による本発明の蛋白質等の測定法においては 1次 反応と 2次反応に用いられる抗蛋白質抗体は本発明の蛋白質等の結合する部 位が相異なる抗体が好ましく用いられる。即ち、 1次反応および 2次反応に用 いられる抗体は、 例えば、 2次反応で用いられる抗体が、 本発明の蛋白質等の C端部あるいは N端部を認識する場合、 1次反応で用いられる抗体は、好まし くは配列番号： 5または配列番号： 6で表されるアミノ酸配列を認識する抗体 が用いられる。
本発明の蛋白質等に対する抗体をサンドィツチ法以外の測定システム、例え ば、 競合法、ィムノメトリック法あるいはネフロメトリ一などに用いることが できる。
競合法では、被検液中の抗原と標識抗原とを抗体に対して競合的に反応させ たのち、 末反応の標識抗原と （F ) と抗体と結合した標識抗原 （B ) とを分離 し （B Z F分離） 、 B、 Fいずれかの標識量を測定し、 被検波中の抗原量を定 量する。 本反応法には、 抗体として可溶性抗体を用い、 B / F分離をポリェチ レングリコール、 前記抗体に対する第 2抗体などを用いる液相法、 および、 第 1抗体として固相化抗体を用いるか、 あるいは、 第 1抗体は可溶性のものを用 い第 2抗体として固相化抗体を用いる固相化法とが用いられる。
ィムノメトリック法では、被検液中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識化 抗体に対して競合反応させた後固相と液相を分離するか、 あるいは、被検液中 の抗原と過剰量の標識化抗体とを反応させ、次に固相化抗原を加え未反応の標 識化抗体を固相に結合させたのち、 固相と液相を分離する。 次に、 いずれかの 相の標識量を測定し被検液中の抗原量を定量する。
また、 ネフロメトリ一では、 ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果生 じた不溶性の沈降物の量を測定する。被検液中の抗原量が僅かであり、 少量の 沈降物しか得られない場合にもレーザ一の散乱を利用するレーザーネフロメ トリーなどが好適に用いられる。
これら個々の免疫学的測定法を本発明の測定方法に適用するにあたっては、 特別の条件、操作等の設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の 条件操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて本発明の蛋白質等の測定系 を構築すればよい。 これらの一般的な技術手段の詳細については、 総説、 成書 などを参照することができる〔例えば、入江寛編「ラジオィムノアツセィ」 （講 談社、 昭和 49年発行） 、 入江寛編 「続ラジオィムノアツセィ」 （講談社、 昭 和 54年発行） 、 石川栄治ら編 「酵素免疫測定法」 （医学書院、 昭和 53年発 行） 、 石川栄治ら編 「酵素免疫測定法」 （第 2版） （医学書院、 昭和 57年発 行） 、 石川栄治ら縞 「酵素免疫測定法」 （第 3版） （医学書院、 昭和 62年発 行) 「Me t h od s i n En z ymo l o gy」 Vo l . 70 (I mm u no c h em i c a 1 Te c hn i q u e s (P a r t A) 、 同書 V o 1. 73 (1 mm un o c h em i c a 1 Te c hn i qu e s (P a r t B))、 同書 V o 1. 74 (1 mm u n o c h em i c a 1 Te c hn i q u e s (P a r t C) ) 、 同書 V o 1. 84 ( I mmu n o c h em i c a l Te c h n i qu e s (S e l e c t e d I mmu n o a s s ay s (P a r t D))、 同書 V o 1. 92 (1 mmu n o c h em i c a 1 Te c hn i qu e s (M o n o c 1 o n a 1 An t i b o d i e s a n d Ge n e r a l I mm un o a s s ay Me t h o d s (P a r t E) )、 同書 Vo 1. 12 1 ( I mmu n o c h em i c a l Te c hn i qu e s (Hy b r i d oma T e c h n o l o g y a n d Mo n o c l o n a l An t i b o d i e s (P a r t I) ) (以上、 アカデミックプレス社発行） など参照〕 。
以上のように、本発明の蛋白質等に対する抗体を用いることによって本発明 の蛋白質等を感度良く定量することができる。 さらには、本発明の蛋白質等に対する抗体を用いて本発明の蛋白質等の濃度 を定量することによって、例えば、本発明の蛋白質等が関与する疾病の診断を 行うことができる。
また、 本発明の抗体は、体液や組織などの被験体中に存在する本発明の蛋白 質等を検出するために使用することができる。 また、本発明の蛋白質等を精製 するために使用する抗体カラムの作製、精製時の各画分中の本発明の蛋白質等 の検出、被験細胞内における本発明の蛋白質等の挙動の分析などのために使用 することができる。
(5) 遺伝子診断剤
本発明の DN Aは、 例えば、 プローブとして使用することにより、 ヒトまた は温血動物 （例えば、 ラット、 マウス、 モルモット、 ゥサギ、 トリ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ゥマ、 ネコ、 ィヌ、 サル、 チンパンジーなど） における本発明の 蛋白質またはその部分ペプチドをコードする遺伝子異常を検出することがで きるので、例えば、該 DNAの突然変異あるいは mRNAの異常蓄積あるいは 異常減少などの遺伝子診断剤として有用である。
本発明の DN Aを用いる上記の遺伝子診断は、 例えば、 自体公知のノーザン ハイブリダイゼーションゃ PCR— S SCP法（ゲノミックス （Ge n omi c s) , 第 5巻， 874〜 879頁（1 989年） 、 プロシージングズ ·ォブ · ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェンシィズ.ォブ.ュ一エスエー（P r o c e e d i ng s o f t h e Na t i on a l Ac a d emy o f S c i e n c e s o f t h e Un i t e d S t a t e s o f Am e r i c a) ， 第 86巻， 2766〜 2770頁 （1 989年） ） などにより実施 することができる。
(6) アンチセンス DNAを含有する DNA
本発明の蛋白質等をコードする DNAまたは mRNAに相補的に結合し、該 mRNAの転写あるいは翻訳を抑制することができるアンチセンス DN Aは、 本発明の蛋白質等をコードする遺伝子の異常発現を抑制することができる。従 つて、 該アンチセンス DNAは、 例えば、 本発明の蛋白質等をコードする遺伝 子の異常発現に起因する疾病の予防 ·治療剤として使用することができる。 該アンチセンス DN Aを上記の予防 ·治療剤として使用する場合、 前記した 本発明の DN Aを含有する医薬と同様にして製造することができる。例えば、 該アンチセンス DNAを単独あるいはレトロウィルスベクタ一、アデノウィル スベクタ一、アデノウイルスァソシェ一テツドウィルスベクターなどの適当な ベクタ一に挿入した後、常套手段に従ってヒトまたは温血動物に投与すること ができる。 該アンチセンス DNAは、 そのままで、 あるいは摂食促進のために 補助剤などの生理学的に認められる担体とともに製剤化し、遺伝子銃やハイド 口ゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与できる。
さらに、 該アンチセンス DNAは、 組織や細胞における本発明の DNAの存 在やその発現状況を調べるための診断用オリゴヌクレオチドプローブとして 使用することもできる。 (7) DN A転移動物の作製
本発明は、 外来性の本発明の蛋白質をコードする DNA (以下、 本発明の外 来性 DNAと略記する） またはその変異 DNA (本発明の外来性変異 DNAと 略記する場合がある） を有する非ヒト哺乳動物を提供する。
すなわち、 本発明は、
( i )本発明の外来性 DNAまたはその変異 DNAを有する非ヒト哺乳動物、
(ii) 非ヒト哺乳動物がげつ歯類動物である第 （ i ) 記載の非ヒト哺乳動物、
(iii) げっ歯類動物がマウスである第 （ii) 記載の非ヒ卜哺乳動物、
(iv) げっ歯類動物がラットである第 （ii) 記載の非ヒト哺乳動物、 および (V)本発明の外来性 DNAまたはその変異 DNAを含有し、 哺乳動物におい て発現しうる組換えべクタ一を提供するものである。
本発明の外来性 DN Aまたはその変異 DN Aを有する非ヒト哺乳動物（以下、 本発明の DNA転移動物と略記する） は、 未受精卵、 受精卵、 精子およびその 始原細胞を含む胚芽細胞などに対して、 好ましくは、 非ヒト哺乳動物の発生に おける胚発生の段階（さらに好ましくは、 単細胞または受精卵細胞の段階でか つ一般に 8細胞期以前） に、 リン酸カルシウム法、 電気パルス法、 リボフェク シヨン法、 凝集法、 マイクロインジェクション法、 パーティクルガン法、 DE AE—デキストラン法などにより目的とする DN Aを転移することによって 作出することができる。 また、 該 DNA転移方法により、 体細胞、 生体の臓器、 組織細胞などに目的とする本発明の外来性 DNAを転移し、細胞培養、 組織培 養などに利用することもでき、 さらに、 これら細胞を上述の胚芽細胞と自体公 知の細胞融合法により融合させることにより本発明の D N A転移動物を作出 することもできる。
非ヒト哺乳動物としては、 例えば、 ラッ卜、 マウス、 モルモット、 ハムス夕 一、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ネコ、 ィヌなどが用いられる。 なかでも、 病体動物モデル系の作成の面から個体発生および生物サイクルが比較的短く、 また、 繁殖が容易なげつ歯動物、 とりわけマウス （例えば、 純系として、 C 5 7 BLZ6系統、 DBA 2系統など、 交雑系として、 B 6 C 3 Fi系統、 BD 系統、 B 6D 2 Fi系統、 BALBZc系統、 I CR系統など） またはラ ット （例えば、 Wi s t e r， SDなど） などが好ましい。
哺乳動物において発現しうる組換えベクターにおける 「哺乳動物」 としては、 上記の非ヒト哺乳動物の他にヒトなどが挙げられる。
本発明の外来性 DNAとは、非ヒト哺乳動物が本来有している本発明の DN Aではなく、 いったん哺乳動物から単離 ·抽出された本発明の蛋白質をコード する DNAをいう。
本発明の変異 DN Aとしては、元の本発明の DN Aの塩基配列に変異（例え ば、 突然変異など） が生じたもの、 具体的には、 塩基の付加、 欠損、 他の塩基 への置換などが生じた DNAなどが用いられ、 また、 異常 DNAも含まれる。 該異常 DN Aとしては、異常な本発明の蛋白質を発現させる遺伝子を含有す る DNAを意味し、例えば、正常な本発明の蛋白質の機能を抑制する蛋白質を 発現させる遺伝子を含有する DN Aなどが用いられる。
本発明の外来性 DN Aは、対象とする動物と同種あるいは異種のどちらの哺 乳動物由来のものであってもよい。本発明の蛋白質をコ一ドする DN Aを対象 動物に転移させるにあたっては、該 DN Aを動物細胞で発現させうるプロモー 夕一の下流に結合した DN Aコンストラクトとして用いるのが一般に有利で ある。 例えば、 本発明の DNAを転移させる場合、 これと相同性が高い本発明 の DNAを有する各種哺乳動物 （例えば、 ゥサギ、 ィヌ、 ネコ、 モルモット、 ハムスター、 ラット、 マウスなど） 由来の DNAを発現させうる各種プロモー 夕一の下流に、 本発明の DNAを結合した DNAコンストラクト （例えば、 ベ クタ一など） を対象哺乳動物の受精卵、 例えば、 マウス受精卵へマイクロイン ジェクシヨンすることによって本発明の DN Aを高発現する DN A転移哺乳 動物を作出することができる。
該コンストラクトを保持するべクタ一としては、大腸菌由来のプラスミド、 枯草菌由来のプラスミド、 酵母由来のプラスミド、 λファージなどのバクテリ オファージ、 モロニ一白血病ウィルスなどのレトロウイルス、 ワクシニアウイ ルスまたはバキュロウィルスなどの動物ウィルスなどが用.いられる。なかでも、 大腸菌由来のプラスミドまたは酵母由来のプラスミドなどが好ましく用いら れる。
上記 DNA発現調節を行うプロモーターとしては、 例えば、 ウィルス （例え ば、 シミアヌィルス、 サイトメガロウィルス、 モロニ一白血病ウィルス、 J C ウィルス、 乳癌ウィルス、 ポリオウイルスなど） に由来するプロモーター、 各 種哺乳動物 （ヒト、 ゥサギ、 ィヌ、 ネコ、 モルモット、 ハムスター、 ラット、 マウスなど） 由来のものとしては、 アルブミン、 インスリン Π、 ゥロブラキン 〖I、 エラス夕一ゼ、 エリスロポエチン、 エンドセリン、 筋クレアチンキナーゼ、 グリア線維性酸性蛋白質、 ダル夕チオン S—トランスフェラーゼ、血小板由来 成長因子 3、 ケラチン K l、 K 1 0および Κ 14、 コラーゲン I型および II 型、 サイクリック AMP依存蛋白質キナ一ゼ i3 Iサブュニット、 ジストロフィ ン、 酒石酸抵抗性アルカリフォスファタ一ゼ、 心房ナトリウム利尿性因子、 内 皮レセプ夕一チロシンキナーゼ （一般に T i e 2と略される） 、 ナトリウム力 リウムアデノシン 3リン酸酸化酵素 （Na， K— ATP a s e) 、 ニューロフ イラメント軽鎖、 メタ口チォネイン Iおよび IIA、 メタ口プロティナ一ゼ 1組 織インヒビ夕一、 MHCクラス I抗原 （H— 2 L) 、 H— r a s、 レニン、 ド —パミン) 3—水酸化酵素、 甲状腺ペルォキシダーゼ、 ポリペプチド鎖延長因子 1 a (EF— 1 α) 、 β了クチン、 αおよび i3ミオシン重鎖、 ミオシン軽鎖 1 および 2、 ミエリン基礎蛋白質、 チォグロブリン、 Thy— 1、 免疫グロプリ ン、 H鎖可変部 （VNP) 、 血清アミロイド Pコンポーネント、 ミオグロビン、 卜ロボニン C、 平滑筋 αァクチン、 プレブ口エンケフアリン Α、 バソプレシン などのプロモーターなどが用いられるが、好ましくは全身で高発現することが 可能なサイ卜メガロウィルスプロモ一夕一、ヒトポリペプチド鎖延長因子 1 α (EF- 1 α) のプロモーター、 ヒ卜およびニヮトリ /3ァクチンプロモーター などを用いることができる。
上記べクタ一は、 DN Α転移哺乳動物において目的とする mRN Αの転写を 終結する配列 （一般に夕一ミネ一夕一と呼ばれる） を有していることが好まし く、 例えば、 ウィルス由来および各種哺乳動物由来の各 DNAの配列を用いる ことができ、 好ましくは、 シミアンウィルスの SV40夕一ミネ一夕一などが 用いられる。
その他、目的 DN Aをさらに高発現させる目的で各 DN Aのスプライシング シグナル、 ェンハンサー領域、 真核 DNAのイントロンの一部などをプロモー ター領域の 5' 上流、 プロモー夕一領域と翻訳領域間あるいは翻訳領域の 3 ' 下流に連結することも目的により可能である。
正常な本発明の蛋白質の翻訳領域は、 各種哺乳動物 （例えば、 ゥサギ、 ィヌ、 ネコ、 モルモット、 ハムスター、 ラット、 マウス、 ヒトなど） 由来の肝臓、 腎 臓、 甲状腺細胞、線維芽細胞由来ゲノム DNAおよび市販の各種ゲノム DNA ライブラリーよりゲノム DNAのすベてあるいは一部として、 または肝臓、 腎 臓、 甲状腺細胞、線維芽細胞由来 RN Aより公知の方法により調製された相補
DNAを原料として、 自体公知の方法で取得することができる。 また、 外来性 の異常 DN Aは、本発明の蛋白質の変異を起因とする疾病を発症した上記の細 胞または組織より得ることができる。 また、 上記の細胞または組織より得られ た正常な蛋白質の翻訳領域を点突然変異誘発法により変異した翻訳領域を作 製することができる。
該翻訳領域は転移動物において発現しうる DNAコンストラクトとして、前 記のプロモーターの下流および所望により転写終結部位の上流に連結させる 通常の DN A工学的手法により作製することができる。
受精卵細胞段階における本発明の外来性 DN Aの転移は、対象哺乳動物の胚 芽細胞および体細胞のすべてに存在するように確保される。 DNA転移後の作 出動物の胚芽細胞において、 本発明の外来性 DN Aが存在することは、 作出動 物の後代がすべて、その胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外来性 DN Aを保持することを意味する。本発明の外来性 DN Aを受け継いだこの種の動 物の子孫はその胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の DN Aを有する。 本発明の外来性正常 DNAを転移させた非ヒト哺乳動物は、交配により DN Aを安定に保持することを確認して、該 DN A保有動物として通常の飼育環境 で継代飼育することができる。
受精卵細胞段階における本発明の外来性 DN Aの転移は、対象哺乳動物の胚 芽細胞および体細胞のすべてに過剰に存在するように確保される。 DNA転移 後の作出動物の胚芽細胞において本発明の外来性 DN Aが過剰に存在するこ とは、作出動物の子孫がすべてその胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の 外来性 DN Aを過剰に有することを意味する。本発明の外来性 DN Aを受け継 いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外 来性 DN Aを過剰に有する。導入 DN Aを相同染色体の両方に持つホモザィゴ 一ト動物を取得し、この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が該 D N Aを過剰に有するように繁殖継代することができる。
本発明の正常 DNAを有する非ヒト哺乳動物は、本発明の正常 DNAが高発 現させられており、内在性の正常 D N Aの機能を促進することにより最終的に 本発明の蛋白質の機能亢進症を発症することがあり、その病態モデル動物とし て利用することができる。 例えば、 本発明の正常 DN A転移動物を用いて、 本 発明の蛋白質の機能亢進症や、本発明の蛋白質が関連する疾患の病態機序の解 明およびこれらの疾患の治療方法の検討を行うことが可能である。
また、本発明の外来性正常 DNAを転移させた哺乳動物は、本発明の蛋白質 の増加症状を有することから、本発明の蛋白質に関連する疾患に対する治療薬 のスクリーニング試験にも利用可能である。
一方、本発明の外来性異常 DNAを有する非ヒト哺乳動物は、交配により外 来性 DN Aを安定に保持することを確認して該 DN A保有動物として通常の 飼育環境で継代飼育することができる。 さらに、 目的とする外来性 DNAを前 述のプラスミドに組み込んで原料として用いることができる。プロモ一夕一と の DNAコンストラクトは、通常の遺伝子工学的手法によって作製することが できる。受精卵細胞段階における本発明の異常 DNAの転移は、対象哺乳動物 の胚芽細胞および体細胞のすべてに存在するように確保される。 DN A転移後 の作出動物の胚芽細胞において本発明の異常 DN Aが存在することは、作出動 物の子孫がすべてその胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の異常 DN A を有することを意味する。 DN Aを受け継いだこの種の動物の子孫は、その胚 芽細胞および体細胞のすべてに本発明の異常 DNAを有する。導入 DNAを相 同染色体の両方に持つホモザィゴート動物を取得し、この雌雄の動物を交配す ることによりすべての子孫が該 DN Aを有するように繁殖継代することがで さる。
本発明の異常 DNAを有する非ヒト哺乳動物は、本発明の異常 DNAが高発 現させられており、内在性の正常 DNAの機能を阻害することにより最終的に 本発明の蛋白質の機能不活性型不応症となることがあり、その病態モデル動物 として利用することができる。例えば、本発明の異常 DN A転移動物を用いて、 本発明の蛋白質の機能不活性型不応症の病態機序の解明およびこの疾患の治 療方法の検討を行うことが可能である。
また、 具体的な利用可能性としては、 本発明の異常 DN A高発現動物は、 本 発明の蛋白質の機能不活性型不応症における本発明の異常蛋白質による正常 蛋白質の機能阻害 （d om i n a n t n e g a t i v e作用） を解明するモ デルとなる。 また、 本発明の外来異常 DNAを転移させた哺乳動物は、 本発明 の蛋白質の増加症状を有することから、本発明の蛋白質の機能不活性型不応症 に対する治療薬スクリーニング試験にも利用可能である。
また、上記 2種類の本発明の D N A転移動物のその他の利用可能性として、 例えば、
①組織培養のための細胞源としての使用、
②本発明の DN A転移哺乳動物の組織中の mRN Aを直接分析するか、発現し た蛋白質組織を分析することによる、本発明の蛋白質により特異的に発現ある いは活性化する蛋白質との関連性についての解析、
③上記①記載の細胞を用いることによる細胞の機能を高めるあるいは抑制す るような薬剤のスクリーニング、 および
④本発明の変異蛋白質を単離精製およびその抗体作製などが考えられる。
さらに、本発明の DNA転移動物を用いて、本発明の蛋白質の機能不活性型 不応症を含む、本発明の蛋白質に関連する疾患の臨床症状を調べることができ、 また、本発明の蛋白質に関連する疾患モデルの各臓器におけるより詳細な病理 学的所見が得られ、 新しい治療方法の開発、 さらには、 該疾患による二次的疾 患の研究および治療に貢献することができる。
また、 本発明の DNA転移動物から各臓器を取り出し、 細切後、 トリプシン などの蛋白質分解酵素により、遊離した DNA転移細胞の取得、その培養また はその培養細胞の系統化を行うことが可能である。 さらに、本発明の蛋白質産 生細胞の特定化、分化あるいは増殖との関連性、 またはそれらにおけるシグナ ル伝達機構を調べ、それらの異常を調べることなどができ、本発明の蛋白質お よびその作用解明のための有効な研究材料となる。
さらに、本発明の DNA転移動物を用いて、本発明の蛋白質の機能不活性型 不応症を含む、本発明の蛋白質に関連する疾患の治療薬の開発を行うために、 上述の検査法および定量法などを用いて、有効で迅速な該疾患治療薬のスクリ 一ニング法を提供することが可能となる。 また、本発明の DN A転移動物また は本発明の外来性 DN A発現ベクターを用いて、本発明の蛋白質が関連する疾 患の遺伝子治療法を検討、 開発することが可能である。 本明細書および図面において、塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、 I UP AC - I UB Comm i s i on on B i o c h em i c a l N ome n c 1 a t u r eによる略号あるいは当該分野における慣用略号に基 づくものであり、その例を下記する。 またアミノ酸に関し光学異性体があり得 る場合は、 特に明示しなければ L体を示すものとする。
DNA ：デォキシリポ核酸 c DNA 相補的デォキシリポ核酸
A アデニン
T チミン
G グァニン
C シ卜シン
RNA リボ核酸
mRNA メッセンジャーリポ核酸 d ATP デォキシアデノシン三りン酸 dTTP デォキシチミジン三リン酸 d GTP デォキシグアノシン三リン酸 d CTP デォキシシチジン三リン酸 ATP アデノシン三リン酸
EDTA エチレンジァミン四酢酸 SDS ドデシル硫酸ナトリウム E I A ェンザィムィムノアッセィ G 1 y グリシン
A 1 a ァラニン
V a 1 バリン
L e u
I 1 e イソロイシン
S e r セリン
Th r スレオニン
C y s システィン
Me t メチォニン
G 1 u グルタミン酸
As p ァスパラギン酸
L y s リジン
A r g アルギニン
H i s ヒスチジン P h e フエ二ルァラニン
Ty r チロシン
T r p トリプトファン
P r o プロリン
A s n ァスパラギン
G 1 n グルタミン
p G 1 ピログルタミン酸
Me メチル基
E t ェチル基
B u ブチル基
P h フエニル基
TC チアゾリジン 4 (R) —カルボキサミド基
また、本明細書中で繁用される置換基、 保護基および試薬を下記の記号で表 記する。
To s ： p—トルエンスルホニル
CHO ：ホルミル
B z 1 ：ベンジル
C 12B z 1 ： 2, 6—ジクロロべンジル
Bom ：ベンジルォキシメチル
Z ：ベンジルォキシカルボニル
C 1— Z ： 2—クロ口べンジルォキシカルボニル
B r -Z ： 2—ブロモベンジルォキシカルボニル
B o c : t—ブトキシカルボニル
DNP ：ジニトロフエノール
T r t ： トリチル
Bum ： t—ブトキシメチル
Fmo c ： N— 9—フルォレニルメトキシカルボニル
HOB t ： 1—ヒドロキシベンズトリアゾ一ル
HOOB t : 3, 4—ジヒドロ一 3—ヒドロキシー 4ーォキソ一 1 , 2, 3—べンゾトリアジン
HONB ： 1 —ヒドロキシー 5—ノルボルネンー 2， 3—ジカル ポジイミ ド
DC C ： N, N' ージシクロへキシルカルポジイミド
本願明細書の配列表の配列番号は、 以下の配列を示す。
〔配列番号： 1〕
t wo - h y b r i d法に用いる b a i tプラスミ ドとしてのァクチビン IIA— N受容体蛋白質の細胞内ドメインをコードする DN Aフラグメントの 塩基配列を示す。
〔配列番号： 2〕
ノーザンハイプリダイゼーシヨンに用いるプローブとしての DNA断片の 塩基配列を示す。
〔配列番号： 3〕
ノーザンハイプリダイゼ一シヨンに用いるプローブとしての DN A断片の 塩基配列を示す。
〔配列番号： 4〕
ノーザンハイプリダイゼ一ションに用いるプローブとしての DNA断片の 塩基配列を示す。
〔配列番号： 5〕
本発明の蛋白質のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 6〕
本発明の蛋白質のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 7〕
本発明の配列番号： 5で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードする c DNAの塩基配列を示す。
〔配列番号： 8〕
本発明の配列番号： 6で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードする c DN Aの塩基配列を示す。
後述の実施例 1で得られた形質転換体ェシャリヒア コリ （Escherichia coli) DH5 a/pBSYN3— 6は、 平成 10年 12月 2日から通商産業省 工業技術院生命工学工業技術研究所（N I BH) に寄託番号 FERM BP— 6592として、平成 10年 1 1月 1 8日から財団法人 '発酵研究所（ I F〇） に寄託番号 I FO 1622 1として寄託されている。
以下に、 実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、 本発明はそれ に限定されるものではない。 なお、 酵母を用いた t wo_hy b r i d法の操 作法は市販のキット （C 1 on t e c h社製） に添付の説明書に記載されてい る方法に、 また、 大腸菌を用いての遺伝子操作法は、 モレキュラー ·クロー二 ング（Mo l e c u l a r c l on i n g) に記載されている方法に従った。 実施例 1 本発明の蛋白質をコ一ドする c DNAのクローニング
(1) two— hyb r i d法によるァクチビン Π A— N受容体蛋白質と相互 作用する蛋白質のスクリーニング
以下の、 c DNAライブラリーからァクチビン II A— N受容体蛋白質と相互 作用する蛋白質のスクリーニングには、 キットとして MATCHMAKER1" MTwo— Hy b r i d S y s t em 2 (C a t. No. K 1604 - 1 ： C 1 o n t e c h社） を用いた。
上記方法に従い、 DNA結合用ベクター p AS 2— 1の E c o R I部位と B amH I部位を適切な制限酵素で切断し、 アルカリフォスファタ一ゼ処理 した後精製した。 その後、 配列番号： 1で表されるァクチビン IIA— N受容体 蛋白質の細胞内ドメインをコードする DN Aフラグメントをライゲ一シヨン し、 目的とする GAL4 DNA結合ドメインとァクチビン IIA— N受容体細 胞内ドメイン全体を融合蛋白質として発現するプラスミ ド （pAS—IIA— N) を得た。 GAL4転写活性化領域融合ライブラリープラスミドとしては、 巿販のマゥス脳MATCHMAKER c DNA 1 i b r a r y (C l on t e c h社） を用いた。
酵母菌株 Y 1 90の単一コロニー （直径 2から 3mm) を 20m 1のトリプ トフアン欠損 SD培地に植菌し、 1 8時間 30°Cで振盪培養した。 この培養液 の 10m lを 300m lの YPD培地に OD 600 =0. 2から 0. 3なるよう に植え、 30°Cで 3時間振盪培養した。 培養液を滅菌した遠心管に移し、 10 00 X gで 5分間室温で遠心した。 上清を捨て、 細胞を 25 m 1の滅菌水に懸 濁し、 再度、 1000 X gで 5分間室温で遠心した。 上清を捨て、 細胞を 1. 5 m 1の TE緩衝液 （0. O lM T r i s— HC I， 1 mM EDTA， pH 7. 5) /0. 1M酢酸リチウム溶液 （pH 7. 5) の混合液に懸濁して次 の形質転換に用いた。
先に作製した 10 gのプラスミド （P AS— IIA— N) と 2 mgの二シン 精巣キャリアー DNA (C 1 o n t e c h社） に上記で作製した細胞懸濁液 1 m 1を加え、 よく混合した。 さらに、 6m lの PEG (40 %P EG 400 0) ZTE緩衝液/ ^O. 1 M酢酸リチウム溶液の混合液を加え、 ボルテックス ミキサーで混合した。 30°C、 200 r pmで 30分間振盪後、 700 1の DMSO (最終濃度 10%) を加えて穏やかに攪拌した。 その後、 時々振りな がら、 42でで 1 5分間加熱し、 容器を氷冷後、 100 O Xgで 5分間遠心し た。 上清を捨て、 細胞を 0. 5m 1の TE緩衝液に懸濁した。 得られた細胞懸 濁液 100 w 1をトリプトファン欠損 SD培地上にスプレツドし、 30 で 4 日間培養し、 前記プラスミドを安定に保持する株を得た。 続いて、 GAL4転 写活性化領域融合ライブラリープラスミ ドも同様の方法にて前記酵母株に導 入した。得られた形質転換体 0. 2 m 1をトリプトフアン Zロイシン Zヒスチ ジン欠損 SD培地上にまき、 30°Cで 8日間培養した後、 H i s +コロニーを トリブトファン/口イシンノヒスチジン欠損寒天プレート上にストリークし た。
シャーレに 5m 1の Z緩衝液 （Na2HP〇4 ' 7H2〇， N aH2P04 · H 2〇， KC 1 , Mg S 04 · 7 H20, pH 7) ZX— g a l溶液 （5—プロ モー 4一クロロー 3インドリル一 /3_D—ガラクトシドの 2%DMF溶液） Z 3—メルカプトエタノール混合液を入れ、滅菌したヮットマン# 5フィル夕一 を湿らせた。別のフィルタ一を前記形質転換体コロニーがある寒天プレート上 に置いた後、 このフィル夕一を取り上げ、 コロニー面を上にして液体窒素で凍 結させた。 液体窒素中からフィルターを取り出し、 室温で融解した後、 先の湿 らせたフィルタ一上にコロニー面を上にして置いた。シャーレの蓋を閉めて 3 0でで 1時間保温し、青くなつた約 1 00個のポジティブコロニ一を分離した。 得られたそれぞれのポジティブクローンを 3 m 1のロイシン欠損 SD液体培 地に植え、 2日間培養した後、 この培養液を 1 0000倍に希釈し、 ロイシン 欠損 SDプレートにまき、 30°Cで 3日間保温した。 20から 30個のコロニ 一を滅菌した楊枝で拾い、 トリブトファン Zロイシン欠損 SDプレートとロイ シン欠損 SDプレートにレプリカした。 ここで、 先のポジティブコロニーより 卜リブトファン栄養要求性を示すコロニーを選択し、その 3 _ガラクトシダー ゼ活性の検定を行い、 さらに活性を示さない 2個のコロニーを選択した。
得られた真のポジティブコロニ一を 2m 1の YPD液体培地に植え、 30で で一夜培養した。 培養液を 5秒間室温で遠心し、 上清を捨てた後、 0. 2m l の酵母溶解液 （2 %トリ トン X— 100， 1 SDS, 10 OmM N a C 1 , 1 OmM T r i s— HC 1 (pH 8. 0) 、 1 mM EDTA) を加え、 懸 濁させた。 0.2m lのフエノール クロ口ホルム イソアミルアルコール（2 5 : 24 : 1) と酸で洗ったガラスビーズを加え、 2分間ボルテックスミキサ —で攪拌した。 14000 r pmで 5分間室温で遠心した後、 分離した上清に 1Z10量の 3M 酢酸ナトリウム溶液 （pH 5. 2) と 2. 5倍量のエタノ —ルを加えた。 得られた沈殿物を 70 %エタノールで洗浄した後、 20 1の 滅菌水に溶解した。このうちの 1 n 1を大腸菌 HB 10 1株にエレクトロポレ —シヨン法により導入した後、通常のミニプレップ法でプラスミド DNAを精 製し、 目的とする cDNA (YN 3) を得た。
さらに、 YN 3の塩基配列の全コード領域を含む完全長 c DN Aを得るため に、 得られた YN3のインサート全長を、 ランダムプライム法により32 Pで 標識した。 この標識された YN 3をプローブとして用い、 マウス脳 L amb d a c DNA 1 i b r a r y (L amb d a ΖΑΡΠベクタ一： S t r a t a g e n e社）を通常のプラークハイブリダイゼ一シヨンでスクリーニング した。 得られたクローンのインサート全長をさらにプローブとして用い、 同様 のスクリーニングを繰り返し、本発明の蛋白質の全コード領域を含む最長のィ ンサ一ト全長を持つと考えられるものを得た。得られた陽性ファージの一つを、 S t r a t a g e n e社の方法に従い、 ファージミド （ （pB l u e s c r i p t SK) (一） ベクター） に変換し、 その塩基配列を決定した。 本発明 の蛋白質の全長 c DNA (YN 3 - 6) は 5 1 56 b pで、 配列番号： 5で表 される 1 1 6 1個のアミノ酸からなるポリペプチド [図 1〜図 1 1] または配 列番号： 6で表される 1 1 1 2個のアミノ酸からなるポリペプチド [図 1 2お よび図 22] をコードしていた。
配列番号： 5または配列番号： 6で表されるアミノ酸からなるポリペプチド をコードする全長 c DN A (YN 3 - 6) を含むプラスミド pB SYN3— 6 を大腸菌 DH5 αに形質転換し、 形質転換体：大腸菌 DH 5 aZpBS ΥΝ3 一 6を得た。
実施例 2 マウスの各種臓器由来 p o 1 y (A) +RNAを用いたノーザンハ イブリダイゼーシヨン法による発現の検出
YN 3— 6のインサート内の、配列番号： 2、配列番号： 3および配列番号： 4で表される DNA断片を、 D I G— P CR プローブ合成キット （B o e h r i n g e r社） を用いジゴキシゲニンで標識し、 プローブとして用いた。 また、 B a 1 b/cマウスより脳、 肝臓、 脾臓、 胚、 腎臓、 心臓、 精巣、 卵 巣、 骨格筋を摘出し、 TR I z o 1試薬 （G I BCO BRL社） により t o t a 1 RN Aを抽出した。 その後、 P o l yAT t r a c t mRNA I s o 1 a t i o n S y s t ern (P r ome g a社） を用いて、 p o l y (A) + RNAを精製した。
各 p o l y (A) +RNAを 1 gづっ用い、 ホルマリンゲル法により 1 % ァガロースゲル電気泳動を行い、 ブロッティング装置（Ame r s h am— P h a r ma c i a社） を用いたバキュームブロッティング法により、 Hy b o n d N (Ame r s h am— Ph a rma c i a社） にブロットした。 これ を先に作製したプローブ DNAの各 5 n g/m 1を含むハイブリダィゼ一シ ョン緩衝液（5 XS S C, 0. 1 %N- 1 a u r o y l s a r c o s i n e, 0. 02 % S D S, 0. 5 %b l o c k i n g r e a g e n t (B o e h r i n g e r社） ， 1 00 // g/m 1サケ精巣 DNA) にて、 65 で一夜保温 した。 その後、 0. 1 X S S Cおよび 0. 1 %SDSを用い、 65 ：、 20分 で 3回洗浄した。 さらに、 アルカリホスファターゼ標識抗ジゴキシゲニン抗体 (B o e h r i n g e r社）を含む溶液（0. lM T r i s— HC 1 H 7. 5， 0. 1 5M N a C 1 , 1 5 OmU/m 1抗体） 中で保持した後、 0. 1 M T r i s— HC I (pH 7. 5) 、 0. 1 5 M N a C 1および 0. 1 % Twe e n 20を用い、 1 5分で 3回洗浄した。 最後に、 L um i— P h o s 530 (和光純薬工業社製） を基質とした化学発光を行い、 X線フィルム に露光して検出した結果、本発明の蛋白質が特に脳で多く発現していることが 確認された [図 23] 。
実施例 3 AR I P 1と Sma d 3との相互作用
GAL 4 DNA結合ドメインに融合した全長 Sma d 3 DNAおよび V P 16活性化ドメインに融合した本発明蛋白質 （AR I P 1) を形質導入した CHO細胞において、哺乳動物ツーハイブリッドシステムでの Sma d 3との AR I P 1と特異的相互作用を調べた。
哺乳動物ッ一八イブリッドスクリーニングのための DNAコンストラクト を以下の通り作製した。すなわち、 GAL4 DN A結合ドメインと Sma d 3との融合蛋白質の発現にはプラスミド p B I NDを用い、ヒト Sma d 3を コ一ドする全長 c DNAを p B I NDにライゲーションし pB I ND— Sm a d 3を作成した。 また、 VP 16活性化ドメインと AR I P 1との融合蛋白 質の発現にはプラスミド PACTを用いた。 P CRにより得られたフラグメン トを、 AR I P 1をコ一ドする全長 c DN Aの部分塩基配列 （ 1 187から 4 446番目）を持つプラスミド p B S -AR I P 1 - s h o r tから調製した フラグメントにライゲーションすることにより作製した AR I P 1をコード する全長 c DNAの部分塩基配列 （923から 4446番目） を有する c DN Aフラグメントを pACTにサブクローニングし、 pACT— AR I P 1を作 製した。
哺乳動物ツーハイブリッドアッセィには、キットとして Ch e c kMa t e M a mm a 1 i a n Two—Hy b r i d S y s t em (プロメガ社）を 用い、 そのプロトコ一ルに従い実施した。 上記で得られたプラスミド p B I N D- Sma d 3および p ACT— AR I P 1、サイトメガロウィルスプロモー ター由来 /3 g a l (CMV- ^ g a l )ならびに GAL 4応答プロモーターの 制御下でルシフェラーゼ遺伝子を誘導するレポータープラスミド pG5 1 u cを CHO細胞に導入した。 CHO細胞中での Sma d 3と AR I P 1との相 互作用の強さはルシフェラ一ゼ遺伝子により発現するルシフェラ一ゼの活性 を指標とした。そのルシフエラ一ゼ活性を ]3ガラクトシダーゼ活性と同様に自 体公知の方法（エンドクリノロジー（E n d o c r i n o 1 0 g y) , 1 36, 5493 - 5503 ( 1 995) ) で測定した結果、 本発明蛋白質 （AR I P 1) は、 哺乳動物細胞においてァクチビン受容体 IIAと同様に、 Smad 3と の直接的な相互作用を示した [図 24] 。 産業上の利用可能性
本発明の蛋白質、 その部分ペプチドまたはそれらの塩（以下、 本発明の蛋白 質と略記する場合がある） 、本発明の蛋白質またはその部分ペプチドをコード する DNA (以下、 本発明の DNAと略記する場合がある） 、 本発明の蛋白質 に対する抗体およびアンチセンス DN Aは、①本発明の蛋白質に対する結合蛋 白質の決定、②組換え型蛋白質の発現系の構築、③発現系を用いた結合アツセ ィ系および two— hy b r i d法を用いたアツセィ系の開発と医薬品侯補 化合物のスクリーニング、④構造的に類似したリガンド♦レセプターとの比較 に基づいたドラッグデザインの実施、⑤遺伝子診断におけるプローブ、 PCR プライマーの作成等における試薬として用いることができ、 また、⑥遺伝子治 療等の薬物として用いることができる。 特に、 本発明の蛋白質の構造 ·性質の 解明は、 これらの系に作用するユニークな医薬品の開発につながる。

Claims

請求の範囲
I . 配列番号： 5で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミ ノ酸配列を有する蛋白質またはその塩。
2. 配列番号： 6で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミ ノ酸配列を有する蛋白質またはその塩。
3. PDZドメインおよび WWドメインを有し、 脳に特異的に発現し、 ァクチ ビン受容体または（および） ァクチビン細胞内情報伝達分子に対する結合能を 有する請求項 1項または請求項 2記載の蛋白質。
4.ァクチビン細胞内情報伝達分子が Sm a d 3である請求項 3記載の蛋白質。
5. 5つの PDZドメインおよび 2つの WWドメインを有し、 脳に特異的に発 現し、ァクチビン受容体および Sm a d 3に対する結合能を有する請求項 1ま たは請求項 2記載の蛋白質。
6. 請求項 1記載の蛋白質の部分ペプチド、 請求項 2記載の蛋白質の部分ぺプ チドまたはその塩。
7.請求項 1記載の蛋白質または請求項 2記載の蛋白質をコードする塩基配列 を有する DNAを含有する組換え DNA。
8. 配列番号： 7で表される塩基配列、 配列番号： 8で表される塩基配列また はそれらとハイス卜リンジェントな条件下でハイブリダィズする塩基配列を 有する請求項 7記載の DNA。
9.請求項 6記載の部分べプチドをコ一ドする塩基配列を有する D N Aを含有 する組換え DNA。
10. 請求項 7記載の DNAを含有する組換えベクター。
I I. 請求項 10記載の組換えベクターを保持する形質転換体。
12. 請求項 1 1記載の形質転換体を培養し、 請求項 1記載の蛋白質または請 求項 2記載の蛋白質を生成 *蓄積せしめ、 これを採取することを特徴とする請 求項 1記載の蛋白質、 請求項 2記載の蛋白質またはその塩の製造方法。
13. 請求項 1記載の蛋白質、 請求項 2記載の蛋白質、 請求項 6記載の部分べ プチドまたはその塩に対する抗体。
1 4 . 請求項 1 3記載の抗体に対して、 請求項 1記載の蛋白質、 請求項 2記載 の蛋白質、請求項 6記載の部分ペプチドまたはその塩を含有する被検液および 標識化された請求項 1記載の蛋白質、 請求項 2記載の蛋白質、 請求項 6記載の 部分べプチドまたはその塩を競合的に反応させることを特徴とする請求項 1 記載の蛋白質、 請求項 2記載の蛋白質、 請求項 6記載の部分ペプチドまたはそ の塩の定量方法。
1 5 . 請求項 1記載の蛋白質、 請求項 2記載の蛋白質、 請求項 6記載の部分べ プチドまたはその塩を用いることを特徴とする、 請求項 1記載の蛋白質、 請求 項 2記載の蛋白質、請求項 6記載の部分べプチドまたはその塩と結合する蛋白 質の決定方法。
1 6 . ①転写因子の D N A結合領域に請求項 1記載の蛋白質、 請求項 2記載の 蛋白質または請求項 6記載の部分べプチドを融合させた発現ベクターと②被 検蛋白質をコードする遺伝子と転写活性化領域との融合ライブラリーとを、該 転写因子結合領域をプロモーター上に保持しているレポ一夕一遺伝子を持つ 宿主細胞に導入し、 請求項 1記載の蛋白質、 請求項 2記載の蛋白質または請求 項 6記載の部分ペプチドと被検蛋白質との結合により上昇するレポ一ター遺 伝子の発現量の変化を測定することを特徴とする請求項 1 5記載の決定方法。
1 7 . 請求項 1 5記載の方法により得られる、 請求項 1記載の蛋白質、 請求項 2記載の蛋白質、請求項 6記載の部分べプチドまたはその塩と結合する蛋白質 またはその塩。
1 8 . 請求項 1記載の蛋白質、 請求項 2記載の蛋白質、 請求項 6記載の部分べ プチドまたはその塩を用いることを特徴とする、 請求項 1記載の蛋白質、 請求 項 2記載の蛋白質、 請求項 6記載の部分ペプチドまたはその塩と、 請求項 1 7 記載の蛋白質もしくはその塩、ァクチビン受容体またはァクチビン細胞内情報 伝達分子との結合を阻害または促進する化合物またはその塩のスクリ一ニン グ方法。
1 9 . 標識した請求項 1記載の蛋白質、 請求項 2記載の蛋白質、 請求項 6記載 の部分ペプチドまたはその塩をァクチビン受容体またはァクチビン細胞内情 報伝達分子に接触させた場合と、 標識した請求項 1記載の蛋白質、 請求項 2記 載の蛋白質、請求項 6記載の部分ペプチドまたはその塩および試験化合物をァ クチビン受容体またはァクチビン細胞内情報伝達分子に接触させた場合にお ける、 標識した請求項 1記載の蛋白質、 請求項 2記載の蛋白質、 請求項 6記載 の部分ペプチドまたはその塩のァクチビン受容体またはァクチビン細胞内情 報伝達分子に対する結合量を測定し、比較することを特徴とする請求項 1記載 の蛋白質、 請求項 2記載の蛋白質、 請求項 6記載の部分ペプチドまたはその塩 とァクチビン受容体またはァクチビン細胞内情報伝達分子との結合を阻害ま たは促進する化合物またはその塩のスクリーニング方法。
2 0 . 標識した請求項 1記載の蛋白質、 請求項 2記載の蛋白質、 請求項 6記載 の部分ペプチドまたはその塩を請求項 1 7記載の蛋白質またはその塩に接触 させた場合と、 標識した請求項 1記載の蛋白質、 請求項 2記載の蛋白質または その塩および試験化合物を請求項 1 7記載の蛋白質またはその塩に接触させ た場合における、 標識した請求項 1記載の蛋白質、 請求項 2記載の蛋白質、 請 求項 6記載の部分べプチドまたはその塩の請求項 1 7記載の蛋白質またはそ の塩に対する結合量を測定し、比較することを特徴とする請求項 1記載の蛋白 質、 請求項 2記載の蛋白質、 請求項 6記載の部分ペプチドまたはその塩と請求 項 1 7記載の蛋白質またはその塩との結合を阻害または促進する化合物また はその塩のスクリーニング方法。
2 1 . 請求項 1 7記載の蛋白質もしくはその塩、 ァクチビン受容体またはァク チビン細胞内情報伝達分子を発現した細胞に請求項 1記載の蛋白質、請求項 2 記載の蛋白質、請求項 6記載の部分ペプチドまたはその塩を導入した場合と、 請求項 1 7記載の蛋白質もしくはその塩、ァクチビン受容体またはァクチビン 細胞内情報伝達分子を発現した細胞に請求項 1記載の蛋白質、請求項 2記載の 蛋白質、請求項 6記載の部分ペプチドまたはその塩および試験化合物を導入し た場合における、 請求項 1記載の蛋白質、 請求項 2記載の蛋白質、 請求項 6記 載の部分べプチドまたはその塩の該細胞内における請求項 1 7記載の蛋白質 もしくはその塩、ァクチビン受容体またはァクチビン細胞内情報伝達分子に対 する結合量を測定し、 比較することを特徴とする請求項 1記載の蛋白質、 請求 項 2記載の蛋白質、請求項 6記載の部分べプチドまたはその塩と請求項 1 7記 載の蛋白質もしくはその塩、ァクチビン受容体またはァクチビン細胞内情報伝 達分子との結合を阻害または促進する化合物またはその塩のスクリーニング 方法。
2 2 . 標識した請求項 1記載の蛋白質、 請求項 2記載の蛋白質、 請求項 6記載 の部分ペプチドまたはその塩を請求項 1 7記載の蛋白質もしくはその塩、ァク チビン受容体またはァクチビン細胞内情報伝達分子を発現した細胞の膜画分 に接触させた場合と、 標識した請求項 1記載の蛋白質、 請求項 2記載の蛋白質、 請求項 6記載の部分ペプチドまたはその塩および試験化合物を請求項 1 7記 載の蛋白質もしくはその塩、ァクチビン受容体またはァクチビン細胞内情報伝 達分子を発現した細胞の膜画分に接触させた場合における、標識した請求項 1 記載の蛋白質、 請求項 2記載の蛋白質、 請求項 6記載の部分ペプチドまたはそ の塩の該細胞の膜画分に対する結合量を測定し、比較することを特徴とする標 識した請求項 1記載の蛋白質、 請求項 2記載の蛋白質、 請求項 6記載の部分べ プチドまたはその塩と請求項 1 7記載の蛋白質もしくはその塩、ァクチビン受 容体またはァクチビン細胞内情報伝達分子との結合を阻害または促進する化 合物またはその塩のスクリ一ニング方法。
2 3 . 請求項 1 7記載の蛋白質もしくはその塩、 ァクチビン受容体またはァク チビン細胞内情報伝達分子を発現した細胞に請求項 1記載の蛋白質、請求項 2 記載の蛋白質またはその塩を導入した場合と、請求項 1 7記載の蛋白質もしく はその塩、ァクチビン受容体またはァクチビン細胞内情報伝達分子を発現した 細胞に請求項 1記載の蛋白質、 請求項 2記載の蛋白質、 請求項 6記載の部分べ プチドまたはその塩および試験化合物を導入した場合における、請求項 1 7記 載の蛋白質もしくはその塩、ァクチビン受容体またはァクチビン細胞内情報伝 達分子を介した細胞刺激活性を測定し、比較することを特徴とする請求項 1記 載の蛋白質、 請求項 2記載の蛋白質、 請求項 6記載の部分ペプチドまたはその 塩と請求項 1 7記載の蛋白質もしくはその塩、ァクチビン受容体またはァクチ ビン細胞内情報伝達分子との結合を阻害または促進する化合物またはその塩 のスクリーニング方法。
2 4 . ツー ハイブリッド（ t w o— h y b r i d )法を用いることを特徴とす る請求項 1 6記載の蛋白質の決定方法または請求項 1 8〜請求項 2 3のいず れかに記載のスクリーニング方法。
2 5 . 請求項 1記載の蛋白質、 請求項 2記載の蛋白質、 請求項 6記載の部分べ プチドまたはその塩を含有することを特徴とする、 請求項 1記載の蛋白質、 請 求項 2記載の蛋白質、 請求項 6記載の部分ペプチドまたはその塩と、 請求項 1 7記載の蛋白質もしくはその塩、ァクチビン受容体またはァクチビン細胞内情 報伝達分子との結合を阻害または促進する化合物またはその塩のスクリー二 ング用キッ卜。
2 6 .請求項 1 8〜請求項 2 3のいずれかに記載のスクリーニング方法または 請求項 2 5記載のスクリーニング用キットを用いて得られる、請求項 1記載の 蛋白質、 請求項 2記載の蛋白質、 請求項 6記載の部分ペプチドまたはその塩と、 請求項 1 7記載の蛋白質もしくはその塩、ァクチビン受容体またはァクチビン 細胞内情報伝達分子との結合を阻害または促進する化合物またはその塩。
2 7 . 請求項 1 7記載の蛋白質、 請求項 2 6記載の化合物またはその塩を含有 してなる医薬。
2 8 . アルツハイマー病、 パーキンソン病、 てんかん症またはハンチントン舞 踏症の予防，治療剤である請求項 2 7記載の医薬。
2 9 . 哺乳動物に対して請求項 1 7記載の蛋白質、 請求項 2 6記載の化合物ま たはその塩を有効量投与することを特徴とする請求項 1 7記載の蛋白質もし くはその塩、ァクチビン受容体またはァクチビン細胞内情報伝達分子に関連し た神経細胞異常または脳疾患の予防 ·治療方法。
3 0 . 請求項 1 7記載の蛋白質もしくはその塩、 ァクチビン受容体またはァク チビン細胞内情報伝達分子に関連した神経細胞異常または脳疾患の予防 '治療 剤を製造するための請求項 1 7記載の蛋白質、請求項 2 6記載の化合物または その塩の使用。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2004504832A (ja) * 2000-07-27 2004-02-19 ザ　ジョーンズ　ホプキンス　ユニバーシティー　スクール　オブ　メディシン 増殖分化因子受容体、そのアゴニスト、およびアンタゴニスト、ならびにそれらの使用方法

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6891082B2 (en) 1997-08-01 2005-05-10 The Johns Hopkins University School Of Medicine Transgenic non-human animals expressing a truncated activintype II receptor

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1994006456A1 (en) * 1992-09-16 1994-03-31 Genentech, Inc. Protection against liver damage by hgf
EP0771873A2 (en) * 1995-10-27 1997-05-07 Takeda Chemical Industries, Ltd. Neuronal cell-specific receptor protein

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1994006456A1 (en) * 1992-09-16 1994-03-31 Genentech, Inc. Protection against liver damage by hgf
EP0771873A2 (en) * 1995-10-27 1997-05-07 Takeda Chemical Industries, Ltd. Neuronal cell-specific receptor protein

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
FUNABA M. ET AL.: "Immunolocalization of type I or type II activin receptors in the rat brain", JOURNAL OF NEUROENDOCRINOLOGY,, vol. 9, no. 2, 1997, pages 105 - 111, XP002925255 *
See also references of EP1132472A4 *
SHOJI H. ET AL.: "Identification of a novel type II activin receptor, type IIA-N, induced during the neural differentiation of murine P19 emboryonal carcinoma cells", BIOCHEMICAL BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS,, vol. 246, no. 2, May 1998 (1998-05-01), pages 320 - 324, XP002925253 *
SUGINO H. ET AL.: "Activin: diversity of functions and signal transduction", SEIKAGAKU,, vol. 68, no. 8, 1996, pages 1405 - 1428, XP002925254 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2004504832A (ja) * 2000-07-27 2004-02-19 ザ　ジョーンズ　ホプキンス　ユニバーシティー　スクール　オブ　メディシン 増殖分化因子受容体、そのアゴニスト、およびアンタゴニスト、ならびにそれらの使用方法

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