JP2004504832A - 増殖分化因子受容体、そのアゴニスト、およびアンタゴニスト、ならびにそれらの使用方法 - Google Patents

増殖分化因子受容体、そのアゴニスト、およびアンタゴニスト、ならびにそれらの使用方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、ＧＤＦ−８（ミオスタチン）受容体を含む実質的に精製された増殖分化因子（ＧＤＦ）受容体と共にその機能的ペプチド部分を提供する。さらに、本発明は、ＧＤＦ受容体またはその機能的ペプチド部分の仮想表示を提供する。本発明はまた、細胞におけるミオスタチンシグナル伝達に影響を及ぼす物質を細胞に接触させることによって、細胞に及ぼすミオスタチンの影響を調節する方法も提供する。さらに、本発明は、被験者の筋細胞または脂肪組織細胞におけるミオスタチンシグナル伝達を調節することによって、被験者における筋または脂肪組織の異常な量の代謝活性の発達を少なくとも部分的に特徴とする病態の重症度を改善する方法を提供する。本発明はまた、ミオスタチンシグナル伝達に影響を及ぼす物質を生物に投与することによって、真核生物における筋組織または脂肪組織の増殖を調節する方法も提供する。

Description

【０００１】
発明の分野
本発明は、一般的に増殖分化因子（ＧＤＦ）受容体に関し、より詳しくはＧＤＦ−８（ミオスタチン）受容体、細胞においてミオスタチンシグナル伝達に影響を及ぼす組成物、および細胞におけるミオスタチンシグナル伝達を調節するためにそのような組成物を用いる方法に関する。
【０００２】
背景となる情報
アメリカにおいて、体重を減らそうと考えている人が消費する時間、労力、およびお金の量は驚異的である。これらの人の多くにとって、目標は単に外見を良くすることではなく、より重要なことは、過体重であることに関連した避けて通れない医学的問題を回避することである。
【０００３】
アメリカでは成人集団の半数以上が過体重であると見なされる。さらに、アメリカでは成人男性の２０〜３０％および成人女性の３０〜４０％が肥満であると見なされ、貧困および少数民族においてその発生率は最も高い。平均脂肪レベルを少なくとも２０％超えていると定義される肥満は、ここ数十年のあいだに発生率が劇的に増加して、小児集団においても主要な問題となりつつある。子供全体の２０％が現在過体重であると見なされ、過去５年のあいだにその数は倍増している。
【０００４】
肥満と、肥満に直接帰因する医学的問題は、世界全体から見ても罹患率および死亡率の主な原因である。肥満は、アテローム性動脈硬化症、高血圧症、心臓発作、ＩＩ型糖尿病、膀胱疾患、および特定の癌を含む様々な病態の発症の主要な危険因子であり、早期死亡に関与する。心疾患は、アメリカにおける死因の第一位であり、ＩＩ型糖尿病は、アメリカにおいて１６００万人に罹患し、疾患による主な死因の一つである。
【０００５】
ＩＩ型糖尿病の８０％以上が肥満の人に起こる。ＩＩ型糖尿病は全ての人種に罹患するが、アメリカインディアン、アフリカ系アメリカ人、およびヒスパニック系住民において特に発生率が高い。特に、年齢４０歳を過ぎた成人にほぼ限って起こっていたＩＩ型糖尿病が、今では小児に起こり、報告された症例は過去５年のあいだにほぼ３倍になった。非インスリン依存型糖尿病とも呼ばれるＩＩ型糖尿病は、循環中のインスリンレベルが正常または上昇している場合であっても、グルコースに反応したインスリン分泌の減少およびインスリンの作用に対する体の耐性を特徴とする。ＩＩ型糖尿病は、多様な異なる組織および臓器の機能に影響を及ぼし、血管疾患、腎不全、網膜症およびニューロパシーを引き起こしうる。
【０００６】
肥満に関連した医学的問題とは対照的に、特定の慢性疾患を有する患者に一般的に起こる重度の体重減少も医学的介入に対する課題となる。カヘキシアと呼ばれるこの体重減少の分子的基礎は十分に理解されていない。しかし、カヘキシアによってそのような疾患の管理が複雑となり、それが患者の予後不良に関連することは明らかである。カヘキシアの作用は、癌およびＡＩＤＳ患者において起こる消耗性症候群において明らかである。
【０００７】
体重の調節に関与する生物学的プロセスを解明するために多くの努力が行われているが、結果は実際の値より誇張されて提供されている。例えば、レプチンの発見は、ヒトにおいて脂肪が蓄積する分子的基礎を理解するための突破口であると認められ、それによって肥満が治癒する見込みがあると見なされた。動物試験は、レプチンが食欲を調節する内部シグナルの伝達に関係することを示しており、レプチンが肥満を有する人を治療するために有用となりうることを示唆している。しかし、肥満を治療するためにレプチンを用いる進捗状況は遅く、これまでのところ、レプチンは当初の予想を満たしていない。
【０００８】
病的な肥満の治療は、現在のところ、腸の一部を除去して、それによって吸収される食物（およびカロリー）量を減少させる手術に限定されている。中等度の肥満の場合、唯一の「治療」は健康な食事を食べて、定期的に運動することであるが、この方法は成功してもせいぜいわずかであることが証明されている。このように、肥満およびカヘキシアのような障害を治療する方法を開発することができるように、筋肉の発達および脂肪の蓄積を含む体重の調節に関係した生物学的要因を特定する必要がある。本発明は、この必要性を満足してさらなる長所を提供する。
【０００９】
発明の概要
本発明は、実質的に精製されたＧＤＦ受容体に関する。本発明のＧＤＦ受容体は、例えば、ミオスタチン受容体、ＧＤＦ−１１受容体、または他のＧＤＦ受容体となりうる。例えば、ミオスタチン受容体は、少なくとも特異的にミオスタチンと相互作用して、同様に、一つまたは数個のさらなる成熟ＧＤＦペプチドとも特異的に相互作用しうる。ＧＤＦ受容体をコードするポリヌクレオチド、ＧＤＦ受容体と特異的に相互作用する抗体等も同様に提供する。
【００１０】
本発明はまた、ＧＤＦによって影響を受けるシグナル伝達に影響を及ぼすことによってＧＤＦの作用を調節する方法にも関する。例として、細胞におけるミオスタチンシグナル伝達に影響を及ぼす作用物質を細胞に接触させることによって、細胞に及ぼすミオスタチンの影響を調節する方法を提供する。一つの態様において、作用物質は、細胞によって発現されたミオスタチン受容体とミオスタチンとの特異的相互作用を変化させ、それによって細胞におけるミオスタチンシグナル伝達を調節する。ミオスタチン受容体はアクチビン受容体ともなりえて、またはミオスタチンシグナル伝達が活性化されるように、成熟ミオスタチンまたはその機能的ペプチド部分が接触することができる他の如何なる受容体ともなりうる。もう一つの態様において、作用物質は、ミオスタチン受容体に結合して、それによって受容体に対するミオスタチン結合を増強する、または受容体に関してミオスタチンと競合する。そのため、作用物質は、ミオスタチンシグナル伝達を増加させることができ、またはミオスタチンシグナル伝達を減少もしくは阻害することができる。さらにもう一つの態様において、作用物質は、細胞内で、細胞におけるミオスタチンシグナル伝達を変化させるように作用する。
【００１１】
ＧＤＦシグナル伝達を調節するために有用な作用物質は、ペプチド、ペプチド模倣体、ポリヌクレオチド、有機低分子、または他の如何なる作用物質ともなりえて、ＧＤＦシグナル伝達のアゴニストまたはＧＤＦシグナル伝達のアンタゴニストとして作用することができる。一つの態様において、ペプチド作用物質は、ミオスタチンとミオスタチン受容体との特異的相互作用を変化させる。そのようなペプチド作用物質は、例えば、ミオスタチンに結合するか、またはそうでなければミオスタチンを隔離して、それによってミオスタチンの受容体との特異的相互作用能に影響を及ぼすペプチドとなりうる。そのような作用物質の例は、変異体ミオスタチン受容体、例えば、ミオスタチンと特異的に相互作用することができるミオスタチン受容体の可溶性細胞外ドメイン；ミオスタチンと特異的に相互作用することができるミオスタチンプロドメイン；およびプロドメインと成熟ミオスタチンとへの蛋白質分解分解に対して抵抗性で、ミオスタチンと特異的に相互作用することができる変異体ミオスタチンポリペプチドであり、それらは細胞におけるミオスタチンシグナル伝達を減少または阻害するミオスタチンシグナル伝達アンタゴニストとして有用である。
【００１２】
もう一つの態様において、ペプチド作用物質は、細胞によって発現されるミオスタチン受容体と特異的に相互作用して、それによってミオスタチンと受容体に関して競合することができる。そのようなペプチド物質の例は、抗ミオスタチン受容体抗体または抗ミオスタチン抗体の抗イディオタイプ抗体である。そのようなペプチド物質は、ミオスタチン受容体と特異的に相互作用して、それによって受容体に関してミオスタチンと競合することができるか否かに関して選択することができるのみならず、ミオスタチンシグナル伝達を活性化しない作用を有することに関してもさらに選択することができる。このように、細胞によって発現されるミオスタチン受容体と特異的に相互作用して、ミオスタチン依存的シグナル伝達を活性化するペプチド物質は、ミオスタチンアゴニストとして、細胞におけるミオスタチンシグナル伝達を増加させるために用いることができ、一方、細胞によって発現されるミオスタチン受容体と特異的に相互作用するがミオスタチンシグナル伝達を活性化しないペプチド作用物質は、ミオスタチンアンタゴニストとして、細胞におけるミオスタチンシグナル伝達を減少または阻害するために用いることができる。
【００１３】
本発明の方法において有用な作用物質は、ポリヌクレオチドとなりうる。一般的に、しかし必ずしもそうではないが、ポリヌクレオチドは細胞に導入され、直接、または転写もしくは翻訳後、またはその双方で機能を発揮する。例えば、ポリヌクレオチド作用物質は、細胞において発現され、ミオスタチン活性を調節するペプチドをコードすることができる。そのような発現されたペプチドは、例えば、可溶性のミオスタチン受容体細胞外ドメインのような変異体ミオスタチン受容体；膜結合ドメインに機能的に会合したミオスタチン受容体細胞外ドメイン；またはプロテインキナーゼ活性を欠損する変異体ミオスタチン受容体となりうる。
【００１４】
ポリヌクレオチド作用物質から発現されたペプチドは、ＧＤＦシグナル伝達経路の細胞内ポリペプチド成分のレベルまたは活性に影響を及ぼすペプチドとなりうる。細胞内ポリペプチドは、例えば、本明細書に開示するように、細胞におけるミオスタチンシグナル伝達に影響を及ぼしうるドミナントネガティブＳｍａｄのようなＳｍａｄポリペプチドとなり得る。このように、ポリヌクレオチド作用物質は、細胞において発現されると、細胞におけるミオスタチンシグナル伝達を減少もしくは阻害するドミナントネガティブＳｍａｄ２、Ｓｍａｄ３、もしくはＳｍａｄ４ポリペプチドをコードしうる；または発現されると、細胞におけるミオスタチンシグナル伝達を減少させるＳｍａｄ６もしくはＳｍａｄ７ポリペプチドをコードしうる。ポリヌクレオチド作用物質はまた、その発現によってミオスタチンシグナル伝達を減少または阻害することができる細胞内ｃ−ｓｋｉポリペプチドをコードしうる。
【００１５】
本発明の方法において有用なポリヌクレオチド作用物質はまた、アンチセンス分子、リボザイム、または三重らせん形成物質となりうる、またはそれらをコードしうる。例えば、ポリヌクレオチドは、細胞におけるミオスタチンシグナル伝達を増加しうるアンチセンスｃ−ｓｋｉヌクレオチド配列；または特定のＳｍａｄアンチセンスヌクレオチド配列に応じて、ミオスタチンシグナル伝達を増加しうる、またはミオスタチンシグナル伝達を減少もしくは阻害しうるアンチセンスＳｍａｄヌクレオチド配列のようなアンチセンスヌクレオチド配列となりうる（またはコードしうる）。
【００１６】
本発明はまた、少なくとも部分的に被験者における異常な量の筋または脂肪組織の発達または代謝活性を特徴とする病的な状態の重症度を改善する方法にも関する。そのような方法は、病態に関連した細胞におけるＧＤＦシグナル伝達を調節すること、例えば、被験者における筋細胞または脂肪組織細胞におけるミオスタチンシグナル伝達を調節することを含む。例えば、カヘキシア、食欲不振、筋ジストロフィー、神経筋疾患のような消耗性障害、ならびに肥満およびＩＩ型糖尿病のような代謝障害を含む様々な病態が、本発明の方法を用いて改善を受ける。
【００１７】
本発明はさらに、ＧＤＦ受容体によって媒介されるシグナル伝達に影響を及ぼす作用物質を生物に投与することによって、真核生物における筋組織または脂肪組織の増殖を調節する方法に関する。一つの態様において、筋組織または脂肪組織の増殖を調節する方法は、ミオスタチンシグナル伝達に影響を及ぼす作用物質を投与することによって行われる。もう一つの態様において、作用物質は、ＧＤＦ−１１シグナル伝達、またはミオスタチンおよびＧＤＦ−１１シグナル伝達に影響を及ぼす。作用物質は、例えば、ミオスタチンとミオスタチン受容体との特異的相互作用を変化させる作用物質、ミオスタチンとミオスタチン受容体との特異的相互作用を減少もしくは阻害する作用物質、または本明細書において開示する他の如何なる作用物質ともなりうる。真核生物は、脊椎動物、例えば、哺乳類、鳥類、もしくは魚類生物となりうる、または無脊椎動物、例えば、エビ、ホタテガイ、ヤリイカ、タコ、マキガイ、もしくはナメクジのような軟体動物となりうる。
【００１８】
本発明はまた、増殖分化因子（ＧＤＦ）受容体と特異的に相互作用する作用物質を同定する方法に関する。本発明のそのようなスクリーニングアッセイ法は、例えば、ＧＤＦ受容体を試験作用物質に接触させる段階、および試験作用物質がＧＤＦ受容体と特異的に相互作用することを決定して、それによってＧＤＦ受容体と特異的に相互作用する作用物質を同定することによって行うことができる。ＧＤＦ受容体は如何なるＧＤＦ受容体ともなりえて、特にミオスタチン受容体となり、作用物質はＧＤＦシグナル伝達を増加させるＧＤＦ受容体アゴニスト、またはＧＤＦシグナル伝達を減少もしくは阻害するＧＤＦ受容体アンタゴニストとなりうる。本発明のそのような方法は、試験作用物質のライブラリ、特に試験作用物質の組み合わせライブラリをスクリーニングするために有用である。
【００１９】
本発明はまた、ＧＤＦ受容体またはＧＤＦ受容体の機能的ペプチド部分の仮想表示、例えばＧＤＦ８受容体またはＧＤＦ−１１受容体の仮想表示を提供する。一つの態様において、仮想表示には、ＧＤＦ受容体と特異的に相互作用する作用物質が含まれる。そのため、本発明はさらに、コンピューターシステムを用いて、増殖分化因子（ＧＤＦ）受容体またはＧＤＦ受容体の機能的ペプチド部分と特異的に相互作用する作用物質を同定する方法を提供する。例えば、方法は、仮想のＧＤＦ受容体またはその機能的ペプチド部分との特異的相互作用能に関して仮想の試験作用物質を調べること；および仮想の試験物質と仮想のＧＤＦ受容体またはその機能的ペプチド部分との特異的相互作用を検出し、それによってＧＤＦ受容体またはその機能的ペプチド部分と特異的に相互作用する作用物質を同定することによって行うことができる。
【００２０】
発明の詳細な説明
本発明は、プロミオスタチンポリペプチドの実質的に精製されたペプチド部分を提供する。これまで増殖分化因子−８（ＧＤＦ−８）と呼ばれていたプロミオスタチンは、アミノ末端プロドメインとＣ末端成熟ミオスタチンペプチド（米国特許第５，８２７，７３３号を参照のこと）とを含む。ミオスタチン活性は、プロミオスタチンからの切断後の成熟ミオスタチンペプチドによって示される。このように、プロミオスタチンは、蛋白質分解によって切断されて活性ミオスタチンを生じる前駆体ポリペプチドである。本明細書に開示するように、ミオスタチンプロドメインは、ミオスタチン活性、ＧＤＦ−１１活性またはその双方を阻害することができる。
【００２１】
本発明はまた、プロＧＤＦ−１１ポリペプチドの実質的に精製されたペプチド部分を提供する。これまで一般的にＧＤＦ−１１と呼ばれてきたプロＧＤＦ−１１は、アミノ末端のプロドメインとＣ末端の成熟ＧＤＦ−１１ペプチドとを含む（参照として本明細書に組み入れられる、国際公開公報第９８／３５０１９号を参照のこと）。ＧＤＦ−１１活性は、プロＧＤＦ−１１からの切断後の成熟ＧＤＦ−１１ペプチドによって示される。このように、プロＧＤＦ−１１は、プロミオスタチンと同様に、蛋白質分解によって切断されて活性なＧＤＦ−１１を生じる前駆体ポリペプチドである。本明細書において開示されるように、ＧＤＦ−１１プロドメインは、ＧＤＦ−１１活性、ミオスタチン活性、またはその双方を阻害することができる。
【００２２】
プロミオスタチンおよびプロＧＤＦ−１１は、トランスフォーミング増殖因子−９（ＴＧＦ−９）スーパーファミリーのメンバーであり、これは様々な細胞タイプにおいて増殖、分化、および他の機能を制御する多機能ポリペプチドからなる。胚発達の際の幅広い分化プロセスに影響を及ぼす構造関連蛋白質のグループを含むＴＧＦ−９スーパーファミリーには、例えば、正常な男性の性的発達にとって必要なミュラー管阻害物質（ＭＩＳ）（ベーリンガー（Ｂｅｈｒｉｎｇｅｒ）ら、Ｎａｔｕｒｅ ３４５：１６７、１９９０）、背腹軸形成および成虫盤の形態形成にとって必要なショウジョウバエのデカペンタプレージック（ＤＰＰ）遺伝子産物（パジェット（Ｐａｄｇｅｔｔ）ら、Ｎａｔｕｒｅ ３２５：８１〜８４、１９８７）、卵の植物極に移動するアフリカツメガエルのＶｇ−１遺伝子産物（ウィークス（Ｗｅｅｋｓ）ら、Ｃｅｌｌ ５１：８６１〜８６７、１９８７）、アフリカツメガエルの胚において中胚葉と前方構造の形成を誘導することができる（トムセン（Ｔｈｏｍｓｅｎ）ら、Ｃｅｌｌ ６３：４８５、１９９０）アクチビン（メイソン（Ｍａｓｏｎ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍ． １３５：９５７〜９６４、１９８６）、ならびにデノボ軟骨および骨形成を誘導することができる（サンパス（Ｓａｍｐａｔｈ）ら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６５：１３１９８、１９９０）骨形態形成蛋白質（ＢＭＰｓ、オステオゲニン、ＯＰ−１）が含まれる。ＴＧＦ−９ファミリーメンバーは、脂肪形成、筋形成、軟骨形成、造血、および上皮細胞分化を含む多様な分化プロセスに影響を及ぼしうる（マッサーグ（Ｍａｓｓａｇｕｅ）、Ｃｅｌｌ ４９：４３７、１９８７；マッサーグ（Ｍａｓｓａｇｕｅ）、Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ６７：７５３〜７９１、１９９８；そのそれぞれが参照として本明細書に組み入れられる）。
【００２３】
ＴＧＦ−９ファミリーメンバーの多くは、他のペプチド増殖因子に対して調節作用（正または負）を有する。特に、ＴＧＦ−９スーパーファミリーの特定のメンバーは、神経系の機能に関連する発現パターンまたは活性を有する。例えば、インヒビンとアクチビンは脳に発現され（ムニエール（Ｍｅｕｎｉｅｒ）ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５：２４７、１９８８；サウチェンコ（Ｓａｗｃｈｅｎｋｏ）ら、Ｎａｔｕｒｅ ３３４：６１５、１９８８）、およびアクチビンは神経細胞生存分子として機能しうる（シューベルト（Ｓｃｈｕｂｅｒｔ）ら、Ｎａｔｕｒｅ ３４４：８６８、１９９０）。もう一つのファミリーメンバーである増殖分化因子−１（ＧＤＦ−１）は、その発現パターンが神経系特異的であり（リー（Ｌｅｅ）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８：４２５０、１９９１）、Ｖｇｒ−１（リオンズ（Ｌｙｏｎｓ）ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６：４５５４、１９８９；ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ）ら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １１１：５３１、１９９１）、ＯＰ−１（オズケイナク（Ｏｚｋａｙｎａｋ）ら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６７：２５２２０、１９９２）、およびＢＭＰ−４（ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ）ら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １１１：５３１、１９９１）のような他のファミリーメンバーも同様に、神経系において発現されている。骨格筋は運動神経の生存を促進する因子または複数の因子を産生すること（ブラウン（Ｂｒｏｗｎ）、Ｔｒｅｎｄｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ７：１０ 、 １９８４）から、筋肉にミオスタチン（ＧＤＦ−８）およびＧＤＦ−１１の発現されることは、ミオスタチンとＧＤＦ−１１とが神経にとって栄養因子となりうることを示唆している。そのため、ミオスタチン、ＧＤＦ−１１または双方の活性を調節する方法は、筋萎縮性側索硬化症もしくは筋ジストロフィーのような神経変性疾患を治療するため、または移植前に細胞もしくは組織を培養において維持するために有用となりうる。
【００２４】
ＴＧＦ−９ファミリーの蛋白質は大きい前駆体蛋白質として合成され、これがその後Ｃ末端からアミノ酸約１１０〜１４０個の塩基性残基の集団で蛋白質分解による切断を受け、それによってプロドメインペプチドとＣ末端成熟ペプチドとが形成される。このファミリーの蛋白質メンバーのＣ末端の成熟ペプチドは、構造的に近縁で、異なるファミリーメンバーは、その相同性の程度に基づいて異なるサブグループに分類することができる。特定のサブグループ内の相同性は、７０％〜９０％のアミノ酸配列同一性の範囲であり、サブグループ間の相同性は、有意に低く、一般的に２０％〜５０％の範囲である。それぞれの場合において、活性な種はＣ末端ペプチド断片のジスルフィド結合二量体であるように思われる。
【００２５】
プロミオスタチンおよびプロＧＤＦ−１１ポリペプチドは、哺乳類、鳥類および魚類において同定されており、ミオスタチンは、脊椎動物および無脊椎動物を含む他の様々な種において活性である。胚の発達のあいだと成体動物において、ミオスタチンは、例えば筋発生系列の細胞によって特異的に発現されている（マクフェロン（ＭｃＰｈｅｒｒｏｎ）ら、Ｎａｔｕｒｅ ３８７：８３〜９０、１９９７、参照として本明細書に組み入れられる）。初期胚形成のあいだ、ミオスタチンは、発達しつつある体節の筋節コンパートメントの細胞によって発現される。胚後期段階および成体動物では、ミオスタチンは骨格筋組織に広く発現されているが、その発現レベルは筋肉によってかなり異なる。ミオスタチン発現はまた、脂肪組織においても検出されるが、筋肉におけるレベルより低い。同様に、ＧＤＦ−１１は、成人胸腺、脾臓、および子宮と共に骨格筋および脂肪組織において発現され、同様に、ＧＤＦ−１１は骨格筋および脂肪組織において発現されると共に成人胸腺、脾臓および子宮に発現され、また様々な発達段階の脳にも発現される。
【００２６】
様々な種からのプロミオスタチンポリペプチドは、実質的な配列同一性を共有し、ヒト、マウス、ラットおよびニワトリの成熟ミオスタチンＣ末端配列のアミノ酸配列は１００％同一である（図１を参照のこと）。プロミオスタチンポリペプチドの例は、本明細書において（図１を参照のこと）ヒトプロミオスタチン（配列番号：２）；マウスプロミオスタチン（配列番号：４）；ラットプロミオスタチン（配列番号：６）；ヒヒプロミオスタチン（配列番号：１０）；ウシプロミオスタチン（配列番号：１２）；ブタプロミオスタチン（配列番号：１４）；ヒツジプロミオスタチン（配列番号：１６）；ニワトリプロミオスタチン（配列番号：８）；七面鳥プロミオスタチン（配列番号：１８）；およびゼブラフィッシュプロミオスタチン（配列番号：２０）である。プロミオスタチンポリペプチドの例も同様に、本明細書においてサケ対立遺伝子１（配列番号：２７、「サケ１」）およびサケ対立遺伝子２（配列番号：２９、「サケ２」、図２を参照のこと）の一部を含むポリペプチドである。これらのプロミオスタチンポリペプチドをコードする核酸分子は、本明細書においてそれぞれ、配列番号：１、３、５、９、１１、１３、１５、７、１７、１９、２６および２８として開示されている（同様に、参照として本明細書に組み入れられる、マクフェロンとリー（ＭｃＰｈｅｒｒｏｎ ａｎｄ Ｌｅｅ）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９４：１２４５７、１９９７も参照のこと）。プロＧＤＦ−１１ポリペプチドの例は、本明細書において配列番号：２４によってコードされるヒトプロＧＤＦ−１１（配列番号：２５）である。
【００２７】
プロミオスタチンポリペプチドにおいて、特にヒトと魚類のような離れている種において広く保存されていることを考慮すると、サケ１およびサケ２の配列の残りを含む如何なる種からのミオスタチンもコードするポリヌクレオチドを得ること、および如何なる種においてもプロミオスタチンまたはミオスタチン発現を同定することはごく普通のことであろう。特に、成熟ミオスタチン配列は、ＴＧＦ−９スーパーファミリーの他のメンバーと有意な相同性を有し、ミオスタチンは、他のファミリーメンバーおよび他の種において高度に保存されている残基のほとんどを含む。さらに、ミオスタチンはＴＧＦ−９およびインヒビン９と同様に、実質的に全てのファミリーメンバーにおいて存在する７個のシステイン残基の他に余分のシステイン残基対を含む。ミオスタチンは、Ｖｇｒ−１（４５％配列同一性）と最も相同性がある。ＴＧＦ−９スーパーファミリーの他のメンバーと同様に、ミオスタチンは、より大きい前駆体プロミオスタチンポリペプチドとして合成され、これが蛋白質分解によって切断されて活性なミオスタチンペプチドとなる。
【００２８】
様々な生物のプロミオスタチンポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、周知の技法および開示された配列との同一性（または相同性）に基づくアルゴリズムを用いて同定することができる。相同性または同一性はしばしば、ジェネティクスコンピューターグループ（ウィスコンシン大学バイオテクノロジーセンター、１７１０、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ａｖｅｎｕｅ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ ５３７０５）の配列解析ソフトウェアパッケージのような配列解析ソフトウェアを用いて測定する。そのようなソフトウェアは、様々な欠失、置換および他の改変に相同性の程度を割付することによって類似の配列をマッチさせる。本明細書において二つまたはそれ以上の核酸またはポリペプチド配列の意味において用いられる「相同性」および「同一性」という用語は、同じである二つもしくはそれ以上の配列もしくは小配列、または何らかの数の配列比較アルゴリズムを用いて、もしくは手動でのアラインメントおよび肉眼的検査によって測定した場合に、比較ウィンドウもしくは指定領域に対して最大の対応が得られるように比較して並置した場合に、同じであるアミノ酸残基またはヌクレオチドを特定の割合で有する二つもしくはそれ以上の配列もしくは小配列を意味する。
【００２９】
配列比較を行う場合、典型的に一つの配列を参照配列として用い、それに対して試験配列を比較する。配列比較アルゴリズムを用いる場合、試験および参照配列をコンピューターに入力して、必要であれば小配列の座標を指定する。配列アルゴリズムプログラムのパラメータを指定する。デフォルトプログラムパラメータを用いることができ、または別のパラメータを指定することができる。次に、配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する試験配列の％配列同一性を計算する。
【００３０】
「比較ウィンドウ」という用語は、本明細書において、その中で二つの配列を最適に並置した後に、配列が隣接位置の同じ数値の参照配列と比較される、例えばアミノ酸またはヌクレオチドの位置の連続する位置、例えば、約２０〜６００位、通常約５０〜約２００位置、より通常、約１００〜約１５０位の数のいずれか１つの区域に対する言及も含まれるように広く用いられる。比較のために配列を並置させる方法は当技術分野で周知である。比較のための配列の最適なアラインメントは、例えば、そのそれぞれが参照として本明細書に組み入れられる、スミスとウォーターマン（Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖ． Ａｐｐｌ． Ｍａｔｈ． ２：４８２、１９８１）の局所相同性アルゴリズム、ニードルマンとビュンシュ（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８：４４３、１９７０）の相同性アラインメントアルゴリズム、パーソンとリップマン（Ｐｅｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５：２４４４、１９８８）の類似性検索法によって行うことができ、これらのアルゴリズムのコンピューターによる実行（ウィスコンシンジェネティクスソフトウェアパッケージ、ジェネティクスコンピューターグループ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）；または手動でのアラインメントおよび肉眼での検分によって行うことができる。相同性または同一性を決定する他のアルゴリズムには、例えば、ＢＬＡＳＴプログラム（国立生物情報センターの基礎局所アラインメント検索ツール）の他に、ＡＬＩＧＮ、ＡＭＡＳ（多重並置配列の解析）、ＡＭＰＳ（蛋白質多重配列アラインメント）、ＡＳＳＥＴ（並置セグメント統計学的評価ツール）、ＢＡＮＤＳ、ＢＥＳＴＳＣＯＲ、ＢＩＯＳＣＡＮ（生物配列比較解析ノード）、ＢＬＩＭＰＳ（ブロックス改善検索）、ＦＡＳＴＡ、インターバルとポインツ、ＢＭＢ、ＣＬＵＳＴＡＬ Ｖ、ＣＬＵＳＴＡＬ Ｗ、ＣＯＮＳＥＮＳＵＳ、ＬＣＯＮＳＥＮＳＵＳ、ＷＣＯＮＳＥＮＳＵＳ、スミス−ウォーターマンアルゴリズム、ＤＡＲＷＩＮ、ラスベガスアルゴリズム、ＦＮＡＴ（強制ヌクレオチドアラインメントツール）、フレームアライン、フレームサーチ、ＤＹＮＡＭＩＣ、ＦＩＬＴＥＲ、ＦＳＡＰ（フリステンスキー配列解析パッケージ）、ＧＡＰ（グローバルアラインメントプログラム）、ＧＥＮＡＬ、ＧＩＢＢＳ、ゲンクエスト、ＩＳＳＣ（感度のよい配列比較）、ＬＡＬＩＧＮ（局所配列アラインメント）、ＬＣＰ（局所コンテントプログラム）、ＭＡＣＡＷ（多重アラインメント構築と解析ワークベンチ）、ＭＡＰ（多重アラインメントプログラム）、ＭＢＬＫＰ、ＭＢＬＫＮ、ＰＩＭＡ（パターン誘導多重配列アラインメント）、ＳＡＧＡ（遺伝子アルゴリズムによる配列アラインメント）、およびＷＨＡＴ−ＩＦが含まれる。そのようなアラインメントプログラムはまた、実質的に同一の配列を有するポリヌクレオチド配列を同定するためにゲノムデータベースをスクリーニングするために用いることができる。
【００３１】
多くのゲノムデータベースを、比較のために利用することができ、例えば、ヒトゲノムの実質的な部分は、ヒトゲノム配列決定プロジェクト（ローチ（Ｊ． Ｒｏａｃｈ）、ｈｔｔｐ：／／ｗｅｂｅｒ．ｕ．Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ．ｅｄｕ／￣ｒｏａｃｈ／ｈｕｍａｎ＿ｇｅｎｏｍｅ＿ｐｒｏｇｒｅｓｓ ２．ｈｔｍｌ）の一部として利用できる。さらに、例えば、Ｍ． ゲニタリウム（Ｍ． ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ）、Ｍ． ジャンナスキイ（Ｍ． ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）、インフルエンザ菌（Ｈ． ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）、酵母菌（Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、およびＤ．メラノガスター（Ｄ． ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）を含む、少なくとも２１個のゲノムが完全に配列決定されている。マウス、線虫（Ｃ． ｅｌｅｇａｎｓ）、およびシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）種のようなモデル生物のゲノムの配列決定は有意に進歩している。いくつかの機能的情報を注釈したゲノム情報を含むいくつかのデータベースは、異なる機構によって維持されており、インターネットによって例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗｔｉｇｒ．ｏｒｇ／ｔｄｂ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｅｔｉｃｓ／ｗｉｓｃ．ｅｄｕ；ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ−ｗｗｗ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／〜ｂａｌｌ；ｈｔｔｐ：／／ｈｉｖ−ｗｅｂ．ｌａｎｌ．ｇｏｖ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ／ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ；ｈｔｔｐ：／／ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ；ｈｔｔｐ：／／Ｐａｓｔｅｕｒ．ｆｒ／ｏｔｈｅｒ／ｂｉｏｌｏｇｙ；およびｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ．にアクセスすることができる。
【００３２】
有用なアルゴリズムの一つの例は、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ ２．０アルゴリズムであり、これはアルトシュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５：３３８９〜３４０２、１９７７；Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３〜４１０、１９９０、そのそれぞれが参照として本明細書に組み入れられる）によって記載されている。ＢＬＡＳＴ解析を行うためのソフトウェアは、国立バイオテクノロジー情報センターを通して一般に利用できる（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）。このアルゴリズムは、これはデータベースにおける同じ長さのワードと並置した場合に、いくつかの陽性評価閾値スコアＴとマッチするかまたは満足する、問い合わせ配列における長さＷの短いワードを同定することによって高スコア配列対（ＨＳＰｓ）をまず同定することを含む。Ｔは隣接ワードスコア閾値（アルトシュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら、上記、１９７７、１９９０）と呼ばれる。これらの初回隣接ワードヒットは、それらを含むより長いＨＳＰｓを発見するための検索を開始するためのシードとなる。それぞれの配列に沿って、累積アラインメントスコアが増加することができる限り、ワードヒットを双方向に伸張する。累積スコアは、ヌクレオチド配列に関してパラメータＭ（マッチする残基対に関する報酬スコア；常に＞０）を用いて計算する。アミノ酸配列の場合、スコアリング行列を用いて累積スコアを計算する。それぞれの方向におけるワードヒットの伸張は、累積アラインメントスコアがその最高到達値から量Ｘ遠ざかる場合；累積スコアがゼロもしくはそれ未満に達する場合；一つもしくはそれ以上の陰性スコア残基アラインメントの蓄積のため；またはいずれかの配列の末端に達した場合に停止する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータ、Ｗ、ＴおよびＸは、アラインメントの感度および速度を左右する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（核酸配列に関して）は、デフォルトとしてワード長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝４および双方の鎖の比較を用いる。アミノ酸配列に関して、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとしてワード長３、および期待値（Ｅ）１０を用い、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリング行列（ヘニコフとヘニコフ（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：１０９１５、１９８９を参照のこと）は、アラインメント（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝４、および双方の鎖の比較を用いる。
【００３３】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、二つの配列間の類似性に関する統計解析も行う（例えば、参照として本明細書に組み入れられる、カーリンとアルトシュル（Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：５８７３、１９９３を参照のこと）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の一つの測定は、最小和確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは二つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間のマッチが偶然に起こる確率の指標を提供する。例えば、核酸は、試験核酸を参照核酸と比較した場合の最小和確率が約０．２未満であれば、より好ましくは約０．０１未満であれば、および最も好ましくは約０．００１未満であれば、核酸は参照配列と類似であると見なされる。
【００３４】
一つの態様において、蛋白質および核酸配列相同性は、基礎局所アラインメント検索ツール（「ＢＬＡＳＴ」）を用いて評価する。特に、特異的ＢＬＡＳＴプログラム５個を用いて以下のタスクを行う：
（１）ＢＬＡＳＴＰおよびＢＬＡＳＴ３は、蛋白質配列データベースに対してアミノ酸問い合わせ配列を比較する；
（２）ＢＬＡＳＴＮは、ヌクレオチド配列データベースに対してヌクレオチド問い合わせ配列を比較する；
（３）ＢＬＡＳＴＸは、蛋白質配列データベースに対する問い合わせヌクレオチド配列（双方の鎖）の６個のフレーム概念的翻訳産物を比較する；
（４）ＴＢＬＡＳＴＮは、全ての６個のリーディングフレーム（双方の鎖）において翻訳されたヌクレオチド配列データベースに対して問い合わせ蛋白質配列を比較する；および
（５）ＴＢＬＡＳＴＸは、ヌクレオチド配列データベースの６個のフレーム翻訳に対するヌクレオチド問い合わせ配列の６個のフレーム翻訳を比較する。
【００３５】
ＢＬＡＳＴプログラムは、これは本明細書において、問い合わせアミノ酸または核酸配列と、好ましくは蛋白質または核酸配列データベースから得られる試験配列との間の「高スコアリングセグメント対（Ｈｉｇｈ−ｓｃｏｒｉｎｇ ｓｅｇｍｅｎｔ ｐａｉｒｓ）」と呼ばれる類似の部分を同定することによって相同な配列を同定する。高スコアリングセグメント対は好ましくは、その多くが当技術分野で既知であるスコアリング行列によって同定される（すなわち並置される）。好ましくは用いたスコアリング行列は、ＢＬＯＳＵＭ６２行列（ゴネット（Ｇｏｎｎｅｔ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：１４４３〜１４４５、１９９２；ヘニコフとヘニコフ（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ）、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ １７：４９〜６１、１９９３、そのそれぞれが参照として本明細書に組み入れられる）である。次に好ましいＰＡＭまたはＰＡＭ２５０行列も同様に用いてもよい（シュワルツとデイホフ（Ｓｃｈｗａｒｔｚ ａｎｄ Ｄａｙｈｏｆｆ）編、「距離の関係を検出するための行列：蛋白質配列と構造のアトラス（Ｍａｔｒｉｃｅｓ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ Ｄｉｓｔａｎｃｅ Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ：Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）」、（ワシントン、国立生物医学研究財団、１９７８））。ＢＬＡＳＴプログラムは、例えば、ｗｗｗ：／／ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖで米国国立図書館を通してアクセスできる。
【００３６】
上記のアルゴリズムで用いたパラメータは、調べる配列の長さおよび相同性の程度に応じて適合させてもよい。いくつかの態様において、パラメータは、ユーザーからの指示がなければアルゴリズムによって用いられるデフォルトパラメータであってもよい。
【００３７】
プロミオスタチンをコードするポリヌクレオチドは、例えば、マウス、ラット、ウシ、ブタ、ヒト、ニワトリ、七面鳥、ゼブラフィッシュ、サケ、魚、他の水棲生物および他の種を含む如何なる生物にも由来しうる。水棲生物の例には、マス、チャー、アユ、コイ、ヨーロッパフナ、キンギョ、ウグイ、シラス、ウナギ、アナゴ、イワシ、トビウオ、スズキ、タイ、パロットバス、フエダイ、サバ、マグロ、マグロ、ハガツオ、ブリ、岩間の魚、カレイ、ソール、ヒラメ、フグ、モンガラカワハギのような魚類；ヤリイカ、イカ、タコのような頭足類；ハマグリ（例えば、ハードシェル、マニラ、ホンビノスガイ、バカガイ、ソフトシェル）のような二枚貝類；コックル、イガイ、タマキビガイ；ホタテガイ（例えば、海、湾、カルー（ｃａｌｌｏｏ））、ホラガイ、マキガイ、ナマコ；アークシェル；カキ（例えば、Ｃ． バージニカ（Ｃ． ｖｉｒｇｉｎｉｃａ）、湾、ニュージーランド、太平洋）；螺旋状のマキガイ、アワビ（例えば、緑、ピンク、赤）のような腹足類に属するもの；およびイセエビ、ロックロブスター（Ｒｏｃｋ）、およびアメリカロブスターを含むがこれらに限定されないロブスター；Ｍ．ローゼンベルギイ（Ｍ． ｒｏｓｅｎｂｅｒｇｉｉ）、Ｐ．スチルロールス（Ｐ． ｓｔｙｌｌｒｏｌｌｓ）、Ｐ．インディクス（Ｐ． ｉｎｄｉｃｕｓ）、Ｐ． ジェポニオウス（Ｐ． ｊｅｐｏｎｉｏｕｓ）、Ｐ． モノドン（Ｐ． ｍｏｎｏｄｏｎ）、Ｐ． バネメル（Ｐ． ｖａｎｎｅｍｅｌ）、Ｍ． エンシス（Ｍ． ｅｎｓｉｓ）、Ｓ． メラント（Ｓ． ｍｅｌａｎｔｈｏ）、Ｎ． ノルベギオウス（Ｎ． ｎｏｒｖｅｇｉｏｕｓ）、冷水エビを含むがこれらに限定されないエビ；ワタリガニ、ルーククラブ、ストーンクラブ、カブトガニ、クイーンクラブ、スノウクラブ、ブラウンクラブ、イチョウガニ、北米産イチョウガニ、マングローブクラブ、ソフトシェルクラブのようなカニ；シャコ、クリール、ランゴスチノ（ｌａｎｇｏｓｔｉｎｏ）；ブルー、マロン、レッドクロウ、レッドスワンプ、ソフトシェル、ホワイトを含むがこれらに限定されないザリガニ／ザリガニのような甲殻類；環形動物；アメリカワニおよびカメのようなは虫類を含むがこれらに限定されない脊索動物；カエルを含む両生類；ならびにウニを含むがこれらに限定されない棘皮動物に属するものが含まれる。
【００３８】
本発明は、プロミオスタチンポリペプチドの実質的に精製されたペプチド部分およびプロＧＤＦ−１１ポリペプチドの実質的に精製されたペプチド部分を提供する。本明細書において用いられるように、「プロＧＤＦ」、例えばプロミオスタチンまたはプロＧＤＦ−１１という用語は、アミノ末端プロドメインとカルボキシ末端の生物活性ＧＤＦペプチドとを含む完全長のポリペプチドを意味する。さらに、プロドメインには、プロドメインのアミノ末端の最初のアミノ酸約１５〜３０個を含むシグナルペプチド（リーダー配列）が含まれる。シグナルペプチドは、完全長のプロＧＤＦポリペプチドから切断することができ、これをさらに、Ａｒｇ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ａｒｇ（配列番号：２１）蛋白質分解切断部位で切断することができる。
【００３９】
本明細書においてアミノ酸残基という用語は、図１および２に示すような完全長のプロＧＤＦポリペプチドに関して参照する（同様に、配列表を参照のこと）。同様に、この用語は、本明細書において「約」特定のアミノ酸残基で始まるまたは終わる特定のペプチドを意味すると認識すべきである。「約」という用語は、それが蛋白質分解切断認識部位で、またはそれに直ちに隣接して、または認識部位から一つもしくは数個のアミノ酸離れて、プロＧＤＦポリペプチドを切断することができると認識されることから、この意味において用いられる。そのため、例えば、配列番号：４のアミノ酸残基約１〜２６３位の配列を有するミオスタチンプロドメインという用語には、シグナルペプチドを含み、アミノ酸残基２５７〜アミノ酸残基２６９位で終わる、好ましくはアミノ酸残基２６０〜アミノ酸残基２６６位で終わるカルボキシ末端を有するプロミオスタチンのアミノ末端ペプチド部分がが含まれる。
【００４０】
同様に、シグナルペプチドはプロＧＤＦポリペプチドのアミノ酸残基約１５〜３０位の如何なる位置で、例えば、残りのプロドメインの機能に影響を及ぼすことなく、残基１５、２０、２５、または３０位で切断することも可能である。このように、一般的に本明細書では簡便のため、アミノ酸残基約２０位で始まるシグナルペプチドが切断されているプロＧＤＦポリペプチドのペプチド部分に言及する。しかし、シグナルペプチドの切断は、プロＧＤＦポリペプチドの最初のアミノ末端アミノ酸約１５〜３０位内の如何なるアミノ酸位置ともなりうると認識されるであろう。そのため、例えば、配列番号：４のアミノ酸残基約２０〜２６３位の配列を有するミオスタチンプロドメインという用語には、シグナルペプチドを含むプロミオスタチンの最初のアミノ酸約１５〜３０個を欠損し、アミノ酸残基２５７位〜アミノ酸残基２６９位で終わる、好ましくはアミノ酸残基２６０〜アミノ酸残基２６６位で終わるカルボキシ末端を有するプロミオスタチンのペプチド部分が含まれるであろう。
【００４１】
一般的に、本明細書においてアミノ酸約１位で始まるプロＧＤＦポリペプチドまたはＧＤＦプロドメインについて言及する。しかし、上記の開示を考慮すると、そのようなプロＧＤＦポリペプチドまたはシグナルペプチドを欠損するＧＤＦプロドメインも同様に、本発明に含まれると認識されるであろう。さらにこの点において、本発明のペプチドにおけるシグナルペプチドの有無は、例えばペプチド、例えばミオスタチンプロドメインが横切る細胞の区画、およびペプチドが細胞から分泌されるか否かを含むペプチドが最終的に局在する細胞の区画に影響を及ぼしうることを認識すべきである。このように、本発明は、プロＧＤＦポリペプチドの実質的に精製されたシグナルペプチド部分をさらに提供する。本明細書に開示するように、そのようなシグナルペプチドは、作用物質、特にペプチド作用物質を、シグナルペプチドが由来する天然に存在するＧＤＦと同じ細胞区画にターゲティングするために用いることができる。
【００４２】
「ペプチド」または「ペプチド部分」という用語は、本明細書において広い意味で、ペプチド結合によって結合された二つまたはそれ以上のアミノ酸を意味するために用いられる。「断片」または「蛋白質分解断片」という用語も同様に、本明細書において、ポリペプチド上の蛋白質分解反応によって産生されうる産物、すなわちポリペプチドにおけるペプチド結合の切断によって産生されペプチドを意味する。「蛋白質分解断片」という用語は、一般的に本明細書において蛋白質分解反応によって生じうるペプチドを意味するが、断片は必ずしも蛋白質分解反応によって生じる必要はなく、下記により詳細に説明するように、蛋白質分解断片と同等の合成ペプチドを生じるために、化学合成法または組換えＤＮＡ技術の方法を用いて産生することができる。プロミオスタチンとＴＧＦ−９スーパーファミリーの他のメンバーとの開示された相同性を考慮すると、本発明のペプチドは、部分的にそれがこのスーパーファミリーのこれまでに開示されたメンバーには存在しないという特徴を有すると認識されるであろう。プロミオスタチンまたはプロＧＤＦ−１１ポリペプチドのペプチド部分がＴＧＦ−９スーパーファミリーのこれまでに開示されたメンバーに存在するか否かは、上記のコンピューターアルゴリズムを用いて容易に決定することができる。
【００４３】
一般的に、本発明のペプチドは、少なくともアミノ酸約６個、通常、アミノ酸約１０個を含む、アミノ酸１５個またはそれ以上を含みうる、特に２０個またはそれ以上を含みうる。「ペプチド」という用語は、本明細書においてその分子を含むアミノ酸の特定の大きさまたは数を示唆するために用いられず、本発明のペプチドはアミノ酸残基数個またはそれ以上までを含みうると認識すべきである。例えば、完全長の成熟Ｃ末端ミオスタチンペプチドは、１００個を超えるアミノ酸を含み、完全長のプロドメインペプチドは２６０個を超えるアミノ酸を含みうる。
【００４４】
本明細書において用いられるように、「実質的に精製された」または「実質的に純粋」もしくは「単離された」という用語は、例えば、ペプチドまたはポリヌクレオチドと呼ばれる分子が、それが天然に会合する蛋白質、核酸、脂質、糖質、または他の材料を比較的含まない形であることを意味する。一般的に、実質的に純粋なペプチド、ポリヌクレオチド、または他の分子は、試料の少なくとも２０％を構成し、一般的に試料の少なくとも約５０％を構成し、通常、飼料の少なくとも約８０％を構成し、および特に試料の約９０％または９５％またはそれ以上を構成する。本発明のペプチドまたはポリヌクレオチドが実質的に純粋であるか否かの決定は、周知の方法を用いて、例えば電気泳動を行って、比較的明確なバンドとして特定の分子を同定することによって、行うことができる。実質的に純粋なポリヌクレオチドは、例えば、ポリヌクレオチドをクローニングすることによって、または化学合成もしくは酵素的合成によって得ることができる。実質的に純粋なペプチドは、例えば、化学合成方法によって、または蛋白質精製方法の後に蛋白質分解を行い、望ましければクロマトグラフィーもしくは電気泳動方法によってさらに精製することによって得ることができる。
【００４５】
本発明のペプチドは、プロミオスタチンまたはプロＧＤＦ−１１配列と比較して、ペプチドのアミノ酸配列がそれぞれ、プロミオスタチンまたはプロＧＤＦ−１１ポリペプチド配列の中に含まれることを決定することによって同定することができる。しかし、本発明のペプチドはプロミオスタチンまたはプロＧＤＦ−１１の対応するアミノ酸配列と同一である必要はないと認識すべきである。このように、本発明のペプチドは、プロミオスタチンポリペプチドのアミノ酸配列に対応することができるが、例えば、対応するＬ−アミノ酸の代わりに一つまたはそれ以上のＤ−アミノ酸を含むことによって、または一つもしくはそれ以上のアミノ酸類似体、例えばその反応性側鎖で誘導体化されたもしくはそうでなければ改変されているアミノ酸を含むことによって、天然に存在する配列とは異なりうる。同様に、ペプチドにおける一つまたはそれ以上のペプチド結合を改変することができる。さらに、アミノ末端またはカルボキシ末端またはその双方で反応基を改変することができる。そのようなペプチドは、例えば、プロテアーゼ、酸化剤、または生物環境においてペプチドが遭遇する可能性がある他の反応性材料に対して改善された安定性を有するように改変することができ、したがって、本発明の方法を行うために特に有用となりうる。当然のこととして、ペプチドは、ペプチドが環境において活性である期間が減少するように、生物環境において減少した安定性を有するように改変することができる。
【００４６】
本発明のペプチドの配列はまた、ペプチドに一つまたは少数のアミノ酸の保存的アミノ酸置換を組み込まれることによって、プロミオスタチンまたはプロＧＤＦ−１１ポリペプチドにおける対応する配列と比較して改変することができる。保存的アミノ酸置換には、一つのアミノ酸残基を、比較的同じ化学特徴を有するもう一つのアミノ酸残基に置換すること、例えば、イソロイシン、バリン、ロイシン、またはメチオニンのような一つの疎水性残基をもう一つの残基の代わりに置換すること、または一つの極性残基をもう一つの残基の代わりに置換すること、例えばアルギニンをリジンの代わりに用いること；またはアスパラギン酸の代わりにグルタミン酸を用いること、アスパラギンの代わりにグルタミンを用いること等が含まれる。改変することができるプロミオスタチンポリペプチドの位置の例は、図１を調べると明らかであり、これはプロミオスタチンまたはミオスタチン活性に実質的に影響を及ぼさない、ミオスタチンプロドメインおよび成熟ミオスタチンペプチドにおける様々なアミノ酸の差を示す。
【００４７】
本発明はまた、増殖分化因子（ＧＤＦ）ポリペプチド（プロＧＤＦポリペプチド）、またはその機能的ペプチド部分の実質的に精製された蛋白質分解断片を提供する。プロＧＤＦポリペプチドの蛋白質分解断片の例は、本明細書においてプロミオスタチンポリペプチドの蛋白質分解断片およびプロＧＤＦ−１１ポリペプチドの蛋白質分解断片である。本明細書において開示されるように、プロＧＤＦの蛋白質分解断片と同等であるプロＧＤＦポリペプチドのペプチド部分は、化学的方法または組換えＤＮＡ法によって産生することができる。本開示を考慮すると、他のＧＤＦポリペプチドの蛋白質分解断片は容易に作成して用いることができる。
【００４８】
一般的に、プロＧＤＦポリペプチドの蛋白質分解断片に対応するペプチドの例は、ＧＤＦ受容体と特異的に相互作用して、ＧＤＦシグナル伝達に影響を及ぼすことができるカルボキシ末端（Ｃ末端）成熟ＧＤＦ断片、およびシグナルペプチドを含み得て、本明細書に開示するように、プロＧＤＦポリペプチドまたは成熟ＧＤＦペプチドと特異的に相互作用して、ＧＤＦシグナル伝達を行う能力に影響を及ぼしうるアミノ末端プロドメイン断片である。例えば、プロミオスタチンポリペプチドの蛋白質分解断片には、ミオスタチン受容体と特異的に相互作用して、ミオスタチンシグナル伝達を誘導することができるＣ末端成熟ミオスタチンペプチド、およびミオスタチンと特異的に相互作用して、それによってミオスタチンのミオスタチンシグナル伝達誘導能を減少または阻害することができるアミノ末端プロドメイン断片が含まれる。
【００４９】
プロＧＤＦポリペプチドの蛋白質分解断片、またはその機能的ペプチド断片は、部分的に、ＧＤＦシグナル伝達の刺激または阻害に関連した活性を有する、または影響を及ぼすことを特徴とする。例えば、プロミオスタチンポリペプチドまたはその機能的ペプチド部分は、ミオスタチン受容体結合活性、ミオスタチンシグナル伝達刺激または阻害活性、ミオスタチン結合活性、プロミオスタチン結合活性、またはその組み合わせを有しうる。このように、本明細書においてプロＧＤＦポリペプチドに関連して用いられるように「機能的ペプチド部分」という用語は、その受容体と特異的に相互作用してＧＤＦシグナル伝達を刺激または阻害することができる；成熟ＧＤＦまたはプロＧＤＦと特異的に相互作用することができる；または細胞局在活性を示す、すなわちシグナルペプチドの活性を示すプロＧＤＦポリペプチドのペプチド部分を意味する。完全長の成熟ミオスタチンペプチドの機能的ペプチド部分は、例えば成熟ペプチドの機能的ペプチド部分が、例えばシグナル伝達経路の活性化能を有することなくミオスタチン受容体との特異的相互作用能を有し得ることから、ミオスタチンシグナル伝達の刺激能を含む成熟ミオスタチンと同じ活性を有する必要はないと認識すべきである。ミオスタチンアンタゴニストとして有用となりうるプロＧＤＦポリペプチドのそのような機能的ペプチド部分を同定する方法は、本明細書において開示するか、または当技術分野で既知である。このように、一つの態様において、プロミオスタチンポリペプチドの機能的ペプチド部分は、ミオスタチン受容体と特異的に相互作用して、ミオスタチンシグナル伝達を刺激するためのアゴニストとして、またはミオスタチンシグナル伝達を減少もしくは阻害するためのアンタゴニストとして作用しうる。
【００５０】
もう一つの態様において、プロミオスタチンポリペプチドの機能的ペプチド部分は、プロミオスタチンポリペプチドまたは成熟ミオスタチンペプチドと特異的に相互作用して、それによってミオスタチンシグナル伝達を阻害することができる。プロミオスタチンのそのような機能的ペプチド部分は、例えば、プロミオスタチンポリペプチドの成熟ミオスタチンへの切断を防止することによって、成熟ミオスタチンペプチドとの複合体を形成することによって、または他の何らかのメカニズムによって作用することができる。ペプチドミオスタチン複合体が形成される場合、複合体は、例えばミオスタチンのその受容体との特異的相互作用能を減少もしくは阻害することによって、またはミオスタチンシグナル伝達の誘導能を欠損する形で受容体に結合することによって、ミオスタチンシグナル伝達を遮断することができる。
【００５１】
プロＧＤＦポリペプチドの蛋白質分解断片は、コンセンサスアミノ酸配列Ａｒｇ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ａｒｇ（配列番号：２１）を有する蛋白質分解切断部位でポリペプチドの切断によって産生することができる。そのような蛋白質分解認識部位の例は、配列番号：１（プロミオスタチン）におけるアミノ酸残基２６３〜２６６位、または配列番号：２５のアミノ酸残基２９５〜２９８位（ヒトプロＧＤＦ−１１；同様に図２の相対位置２６７〜２７０位も参照のこと）として示されるＡｒｇ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ（配列番号：２２）配列、および配列番号：２０のアミノ酸残基２６３〜２６６位として示されるＡｒｇ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ａｒｇ（配列番号：２３）配列である。
【００５２】
シグナルペプチドの蛋白質分解切断部位の他に、プロミオスタチンポリペプチドは、例えば、さらに二つの可能性がある蛋白質分解プロセシング部位（Ｌｙｓ−ＡｒｇおよびＡｒｇ−Ａｒｇ）を含む。コンセンサスＡｒｇ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ａｒｇ（配列番号：２１）蛋白質分解切断認識部位（例えば、配列番号：２のアミノ酸残基２６３〜２６６位を参照のこと）内に含まれる後者の蛋白質分解プロセシング部位またはその近傍でプロミオスタチンポリペプチドが切断されると、生物学的に活性なＣ末端成熟ヒトミオスタチン断片が産生される。例示された完全長の成熟ミオスタチンペプチドは、アミノ酸約１０３〜約１０９個を含み、推定分子量は約１２，４００ダルトン（Ｄａ）である。さらに、ミオスタチンは、推定分子量約２３〜３０キロダルトン（ｋＤａ）の二量体を形成することができる。二量体は、ミオスタチンホモダイマー、または例えばＧＤＦ−１１、他のＧＤＦ、もしくはＴＧＦ−９ファミリーメンバーとのヘテロダイマーとなりうる。
【００５３】
本発明の蛋白質分解断片の例は、ＧＤＦプロドメイン、例えば、プロミオスタチンポリペプチドのアミノ酸残基約２０〜２６２位が含まれるミオスタチンプロドメインもしくはその機能的ペプチド部分、またはプロＧＤＦ−１１ポリペプチドのアミノ酸残基約２０〜２９５位が含まれるＧＤＦ−１１プロドメインもしくはその機能的ペプチド部分であり、それらはそれぞれ、それぞれのプロＧＤＦポリペプチドのアミノ酸約１〜２０位を含むシグナルペプチドをさらに含みうる。ミオスタチンプロドメインの例は、配列番号：４および配列番号：６に示すアミノ酸残基約２０〜２６３位であると共に、配列番号：２、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：８、配列番号：１８、配列番号：１４、配列番号：１６、配列番号：２０に示すアミノ酸残基約２０〜２６２位であり、これらは対応するプロミオスタチンポリペプチドの蛋白質分解切断によって産生することができ、化学合成することができ、または蛋白質分解断片をコードする組換えポリヌクレオチドから発現することができる。ミオスタチンプロドメインの機能的ペプチド部分の例は、ミオスタチンまたはプロミオスタチンと特異的に相互作用することができるミオスタチンプロドメインのペプチド部分である。ＧＤＦ−１１プロドメインの例は、配列番号：２５のアミノ酸残基約１〜２０位を含むシグナルペプチドをさらに含みうる配列番号：２５のアミノ酸残基約２０〜２９５位であり、ＧＤＦ−１１プロドメインの機能的ペプチド部分の例は、成熟ＧＤＦ−１１またはプロＧＤＦ−１１ポリペプチドと特異的に相互作用することができるＧＤＦ−１１プロドメインのペプチド部分である。好ましくは、ＧＤＦプロドメインの機能的ペプチド部分は、例えば、ＧＤＦのその受容体との特異的相互作用能を減少もしくは阻害することによって、または不活性複合体として受容体に結合することによって、対応するＧＤＦもしくは関連ＧＤＦのシグナル伝達刺激能を阻害する。一つの態様において、本発明は、プロＧＤＦポリペプチドの機能的断片、特にＧＤＦシグナルペプチド、好ましくはプロミオスタチンもしくはプロＧＤＦ−１１のアミノ末端の最初のアミノ酸約１５〜３０個を含むミオスタチンシグナルペプチドまたはＧＤＦ−１１シグナルペプチドに機能的に結合したＧＤＦプロドメインの機能的断片を提供する。
【００５４】
本明細書において開示するように、ミオスタチンプロドメインまたはＧＤＦ−１１プロドメインは、成熟ミオスタチン、ＧＤＦ−１１、またはその双方と相互作用して、それによって成熟ＧＤＦとその受容体との特異的相互作用能を減少もしくは阻害することができる（実施例７および８を参照のこと）。このように、ミオスタチンプロドメインの機能的ペプチド部分は、例えば、本明細書に提供する方法を用いて、ミオスタチンプロドメインのペプチド部分を調べること、ミオスタチンまたはプロミオスタチンと特異的に相互作用することができ、ミオスタチンのミオスタチン受容体との特異的相互作用能またはミオスタチンシグナル伝達刺激能を減少もしくは阻害することができるプロドメインの機能的ペプチド部分を同定することによって、得ることができる。
【００５５】
ミオスタチンと特異的に相互作用することができるミオスタチンプロドメインの機能的ペプチド部分、またはもう一つのＧＤＦプロドメインの機能的ペプチド部分も同様に、特異的蛋白質−蛋白質相互作用を同定するために有用であることが知られている様々な如何なるアッセイ法も用いて同定することができる。そのようなアッセイ法には、例えばゲル電気泳動、アフィニティクロマトグラフィー、フィールズとソングのツーハイブリッド系（Ｆｉｅｌｄｓ ａｎｄ Ｓｏｎｇ、Ｎａｔｕｒｅ ３４０：２４５〜２４６、１９８９；同様に米国特許第５，２８３，１７３号参照；フェアロン（Ｆｅａｒｏｎ）ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：７９５８〜７９６２、１９９２；チエン（Ｃｈｉｅｎ）ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８：９５７８〜９５８２、１９９１；ヤング（Ｙｏｕｎｇ）、Ｂｉｏｌ． Ｒｅｐｒｏｄ． ５８：３０２〜３１１（１９８９）、そのそれぞれが参照として本明細書に組み入れられる）、逆ツーハイブリッドアッセイ法（レアンナとハニンク（Ｌｅａｎｎａ ａｎｄ Ｈａｎｎｉｎｋ）、Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ． Ｒｅｓ． ２４：３３４１〜３３４７、１９９６、参照として本明細書に組み入れられる）、抑制されたトランス活性化剤系（米国特許第５，８８５，７７９号、参照として本明細書に組み入れられる）、ファージディスプレイ系（ロウマン（Ｌｏｗｍａｎ）、Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｂｉｏｍｏｌ． Ｓｔｒｕｃｔ． ２６：４０１〜４２４、１９９７、参照として本明細書に組み入れられる）、ＧＳＴ／ＨＩＳプルダウンアッセイ法、変異体オペレータ（国際公開公報第９８／０１８７９号、参照として本明細書に組み入れられる）、蛋白質動員系（米国特許第５，７７６，６８９号、参照として本明細書に組み入れられる）等（例えば、マティス（Ｍａｔｈｉｓ）、Ｃｌｉｎ． Ｃｈｅｍ． ４１：１３９〜１４７、１９９５；ラム（Ｌａｍ）、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｒｅｓ． １２：１４５〜１６７、１９９７；フィジッキー（Ｐｈｉｚｉｃｋｙ）ら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｒｅｖ． ５９：９４〜１２３、１９９５、そのそれぞれが参照として本明細書に組み入れられる）の方法が含まれる。
【００５６】
ＧＤＦプロドメインの機能的ペプチド部分はまた、分子モデリングの方法を用いて同定することができる。例えば、成熟ミオスタチンペプチドのアミノ酸配列は、適当なモデリングソフトウェアを有するコンピューターシステムに入力することができ、ミオスタチンの三次元表示（「仮想ミオスタチン」）を得ることができる。プロミオスタチンアミノ酸配列も同様に、モデリングソフトウェアがプロミオスタチン配列の一部、例えば、プロドメインの一部を刺激して、仮想ミオスタチンと特異的に相互作用することができるプロドメインのそれらのペプチド部分を同定することができるように、コンピューターシステムに入力することができる。特異的相互作用の基準値は、そのような相互作用がミオスタチンの活性を阻害することが知られていることから、仮想ミオスタチンおよび完全長のプロミオスタチンプロドメインをモデリングすること、プロドメインによって「接触される」仮想ミオスタチンにおけるアミノ酸残基を同定することによって予め定義することができる。
【００５７】
ツーハイブリッドアッセイ法および分子モデリング法を含むそのような方法もまた用いて、本発明に含まれる他の特異的相互作用分子を同定することができると認識すべきである。このように、ツーハイブリッドアッセイ法のような方法を用いて、例えばアッセイ法の一つの結合成分としてＡｃｔ ＲＩＩＡまたはＡｃｔ ＲＩＩＢ受容体と特異的に相互作用するミオスタチンペプチドまたはそのペプチド部分を用いて、ミオスタチン受容体のようなＧＤＦ受容体を同定することができ、ミオスタチンペプチドと特異的に相互作用するＧＤＦ受容体を同定することができる。同様に、分子モデリングの方法は、成熟ミオスタチンのような成熟ＧＤＦペプチドまたはＧＤＦ受容体と特異的に相互作用して、したがって、ＧＤＦまたはＧＤＦ受容体によって媒介されるシグナル伝達のアゴニストまたはアンタゴニストとして有用となりうる作用物質を同定するために用いることができる。そのような作用物質は例えば、ミオスタチンプロドメインもしくはＧＤＦ−１１プロドメインの機能的ペプチド部分、またはＧＤＦプロドメインの作用を模倣する化学作用物質となりうる。
【００５８】
本明細書に開示の目的にとって有用なモデリング系は、結晶学解析もしくは核磁気共鳴解析によって得られた構造情報、または一次配列情報（例えば、そのそれぞれが参照として本明細書に組み入れられる、ダンブラック（Ｄｕｎｂｒａｃｋ）ら、「学会論評：蛋白質構造の予測に関する技術の重要な評価に関する第二回会議（Ｍｅｅｔｉｎｇ Ｒｅｖｉｅｗ：ｔｈｅ Ｓｅｃｏｎｄ Ｍｅｅｔｉｎｇ ｏｎ ｔｈｅ Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ（ＣＡＳＰ２）」、アシロマー、カリフォルニア州、１９９６年１２月１３〜１６日、Ｆｏｌｄ Ｄｅｓ． ２（２）：Ｒ２７〜４２（１９９７）；フィッシャーとアイゼンバーグ（Ｆｉｓｃｈｅｒ ａｎｄ Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ）、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ． ５：９４７〜５５、１９９６；（同様に米国特許第５，４３６，８５０号も参照のこと）；ヘーベル（Ｈａｖｅｌ）、Ｐｒｏｇ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ５６：４３〜７８、１９９１；リヒタルジ（Ｌｉｃｈｔａｒｇｅ）ら、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２７４：３２５〜３７、１９９７；マツモト（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ）ら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０：１９５２４〜３１、１９９５；サリ（Ｓａｌｉ）ら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６８：９０２３〜３４、１９９３；サリ（Ｓａｌｉ）、Ｍｏｌｅｃ． Ｍｅｄ． Ｔｏｄａｙ １：２７０〜７、１９９５ａ；サリ（Ｓａｌｉ）、Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ６：４３７〜５１、１９９５ｂ；サリ（Ｓａｌｉ）ら、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ２３：３１８〜２６、１９９５ｃ；サリ（Ｓａｌｉ）、Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ． ５：１０２９〜１０３２、１９９８；米国特許第５，９３３，８１９号；米国特許第５，２６５，０３０号を参照のこと）に基づくことができる。
【００５９】
プロミオスタチンポリペプチドまたはＧＤＦ受容体の結晶構造座標を用いて、蛋白質に結合して、その物理的または生理的特性を多様な方法で変化させる化合物を設計することができる。蛋白質の構造座標も同様に、ＧＤＦシグナル伝達のアゴニストまたはアンタゴニストとして作用しうる調節または結合作用物質を開発するために、ポリペプチドに結合する作用物質に関して低分子データベースをコンピューターによってスクリーニングするために用いることができる。そのような作用物質は、標準的な等式（例えば、参照として本明細書に組み入れられる、シーゲル（Ｓｅｇｅｌ）、「酵素速度論（Ｅｎｚｙｍｅ Ｋｉｎｅｔｉｃｓ）」、（ジョンウィリーとサンズ、１９９５）を参照のこと）を用いるコンピューター適合速度論データによって同定することができる。
【００６０】
阻害剤または結合作用物質を設計するために結晶構造データを用いる方法は、当技術分野で既知である。例えば、ＧＤＦ受容体座標を、結合した阻害剤を有する受容体を含む類似の受容体の他の利用可能な座標に重なり合わせると、阻害剤が受容体と相互作用する様式の近似を得ることができる。合理的薬剤設計の実践において用いられるコンピュータープログラムも同様に用いて、例えば、成熟ミオスタチンと共結晶化したミオスタチンプロドメインとのあいだに認められるものと類似の相互作用特徴を再現する化合物を同定することができる。特異的相互作用の特性が詳しく判明すれば、結合活性に影響を及ぼすことなく、溶解度、薬物動態等を変化もしくは改善させるように化合物を改変することができる。
【００６１】
結晶構造情報を用いて作用物質を設計するために必要な活性を行うためのコンピュータープログラムは周知である。そのようなプログラムの例には、バイオバイトマスターファイル、ダーウェントＷＤＩおよびＡＣＩＤのような化学データベースを評価するための情報検索プログラムであるカタリストデータベース（商標）；化合物のモデルを作製して、候補薬剤の構造によって活性の変化を説明するための仮説を作製するカタリスト／ＨＹＰＯ（商標）；相補的極性および疎水性基を同定およびマッチさせることによって、蛋白質の活性部位に分子を適合させるルディ（商標）；およびユーザーが管理するパラメータによって遺伝子アルゴリズムを用いて新しいリガンドを「成長させる」リープフロッグ（商標）が含まれる。
【００６２】
様々な一般的な目的装置をそのようなプログラムと共に用いることができ、または操作を行うためにより専門的な装置を構築することがより都合がよい場合もある。一般的に、態様は、それぞれが少なくとも一つのプロセッサ、少なくとも一つのデータ保存システム（揮発性および非揮発性記憶装置および／または記憶エレメント）、少なくとも一つの入力装置、および少なくとも一つの出力装置を含むプログラム可能なシステム上で実行する一つまたはそれ以上のコンピュータープログラムにおいて実行される。プログラムは本明細書に記載の機能を実行するためにプロセッサ上で行われる。
【００６３】
それぞれのそのようなプログラムは、コンピューターシステムとコミュニケーションを取るために、例えば、機械語、アセンブリ言語、高レベル手続き型言語、またはオブジェクト指向プログラミング言語を含む如何なる所望のコンピューター言語で実行することもできる。いずれにせよ、言語はコンパイラー言語または翻訳言語であってもよい。コンピュータープログラムは、典型的に本明細書に記載の手続きを行うためにコンピューターによって保存媒体または装置を読みとる場合に、コンピューターを形成して操作するために、一般的または専門目的のプログラム可能なコンピューターによって読みとり可能な保存媒体または装置、例えばＲＯＭ、ＣＤ−ＲＯＭ、磁気または光学媒体等に保存される。システムはまた、そのように形成された保存媒体が、本明細書に記載の機能を実行するために特異的な既定の方法でコンピューターを操作させる場合に、コンピューター読みとり可能な保存媒体として実行され、コンピュータープログラムによって形成されると見なしてもよい。
【００６４】
本発明の態様には、システム、例えば、インターネットに基づくシステム、特に、結晶学またはＮＭＲ解析によって得られた座標情報、または本明細書に開示されるアミノ酸もしくはヌクレオチド配列情報を保存および操作するコンピューターシステムが含まれる。本明細書において用いられるように、「コンピューターシステム」という用語は、本明細書において述べた座標または配列を解析するために用いられる、ハードウェア成分、ソフトウェア成分、およびデータ保存成分を意味する。コンピューターシステムは典型的に、配列データを処理、アクセスおよび操作するためのプロセッサが含まれる。プロセッサには、如何なる周知のタイプの中央処理装置、例えばインテル社のペンティウムＩＩまたはペンティウムＩＩＩプロセッサ、またはサン、モトローラ、コンパック、アドバンスドマイクロデバイシズ、もしくはインターナショナルビジネスマシーンズ各社からの類似のプロセッサが含まれうる。
【００６５】
典型的に、コンピューターシステムは、プロセッサと、データを保存するための一つまたはそれ以上の内部データ保存成分、およびデータ保存成分上に保存されたデータを検索するための一つまたはそれ以上のデータ検索装置を含む用途の広いシステムである。当業者は、現在利用できるコンピューターシステムの如何なるものも適していることを容易に認識しうる。
【００６６】
一つの態様において、コンピューターシステムには、メインメモリ、好ましくはＲＡＭとして実行されるメモリに接続したバスに接続したプロセッサ、およびハードドライブまたはその上に記録されたデータを有する他のコンピューター読みとり可能な媒体のような一つまたはそれ以上の内部データ保存装置が含まれる。いくつかの態様において、コンピューターシステムには、内部データ保存装置上に保存されたデータを読みとるための一つまたはそれ以上のデータ検索装置がさらに含まれる。
【００６７】
データ検索装置は、例えば、フロッピーディスクドライブ、コンパクトディスクドライブ、磁気テープドライブ、または遠隔データ保存システム（例えば、インターネットを通して）に接続することができるモデムであってもよい。いくつかの態様において、内部データ保存装置は、制御論理および／またはその上に記録されたデータを含むフロッピーディスク、コンパクトディスク、磁気テープ等のような取り外し可能なコンピューター読みとり可能媒体である。コンピューターシステムは、データ検索装置に一度挿入されたデータ保存成分から制御論理および／またはデータを読み出すための適当なソフトウェアを含むことが都合がよく、またはそれらによってプログラムされてもよい。
【００６８】
コンピューターシステムには、一般的にディスプレイが含まれ、これはコンピューターユーザーに出力を表示するために用いられる。同様に、コンピューターシステムは、コンピューターシステムへの中心アクセスを提供するためのネットワークまたは広い地域ネットワークにおいて他のコンピューターシステムとリンクすることができる。
【００６９】
ミオスタチンまたはＧＤＦ受容体と特異的に相互作用する化学実体を同定することが望ましい場合、分子との特異的相互作用能に関して化学実体または断片をスクリーニングするためにいくつかの方法を用いることができる。このプロセスは、例えば、ミオスタチンとミオスタチンプロドメインとをコンピュータースクリーン上で肉眼的に調べることによって始めてもよい。次に、プロドメインの選択されたペプチド部分、または模倣体として作用しうる化学実体を、ミオスタチンの個々の結合部位において多様な方向に配置、または合体させることができる。合体は、クアンタとシビルのようなソフトウェアを用いて行うことができ、その後、エネルギーの最小限化およびＣＨＡＲＭＭおよびＡＭＢＥＲのような標準的な分子力学による分子動力学を行うことができる。
【００７０】
特殊なコンピュータープログラムは、プロドメインの選択されたペプチド部分、または例えばＧＤＦ受容体アゴニストもしくはアンタゴニストとして有用な化学実体を選択するために特に有用である。そのようなプログラムには、例えば、そのそれぞれが参照として本明細書に組み入れられる、ＧＲＩＤ（グッドフォード（Ｇｏｏｄｆｏｒｄ）、Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ２８：８４９〜８５７、１９８５；オックスフォード大学から入手可能、オックスフォード、イギリス）；ＭＣＳＳ（ミランカーとカープラス（Ｍｉｒａｎｋｅｒ ａｎｄ Ｋａｒｐｌｕｓ）、「タンパク質：構造、機能および遺伝学（ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ： Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ）」 １１：２９〜３４、１９９１、モレキュラーシミュレーションズから入手可能、バーリントン、マサチューセッツ州）；ＡＵＴＯＤＯＣＫ（グッドセルとオルセン（Ｇｏｏｄｓｅｌｌ ａｎｄ Ｏｌｓｅｎ）、「タンパク質：構造、機能および遺伝学（ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ： Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ）」 ８：１９５〜２０２、１９９０、スクリプスリサーチインスチチュートから入手可能、ラホヤ、カリフォルニア州）；ＤＯＣＫ（クンツ（Ｋｕｎｔｚ）ら、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １６１：２６９〜２８８、１９８２、カリフォルニア大学から入手可能、サンフランシスコ、カリフォルニア州）が含まれる。
【００７１】
選択される適したペプチドまたは作用物質を、単一の化合物または結合物質に組み立てることができる。組立は、コンピュータースクリーン上に表示される三次元画像上で、断片の互いの関係を肉眼的に調べることによって行い、その後クアンタまたはシビルのようなソフトウェアを用いて手動でのモデル構築を行うことができる。個々の化学実体または断片をつなぎ合わせる当業者の助けとなる有用なプログラムには、例えば、そのそれぞれが参照として本明細書に組み入れられる、ＣＡＶＥＡＴ（バートレット（Ｂａｒｔｌｅｔｔ）ら、Ｓｐｅｃｉａｌ Ｐｕｂ． Ｒｏｙａｌ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ． ７８：１８２〜１９６、１９８９、カリフォルニア大学から入手可能、バークレー、カリフォルニア州）；ＭＡＣＣＳ−３Ｄのような３Ｄデータベースシステム（ＭＤＬインフォメーションシステムズ、サンレアンドロ、カリフォルニア州；論評に関しては、マーチン（Ｍａｒｔｉｎ）、Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ３５：２１４５〜２１５４、１９９２を参照のこと）；ＨＯＯＫ（モレキュラーシミュレーションズから入手可能、バーリントン、マサチューセッツ州）が含まれる。
【００７２】
そのような特異的に相互作用する作用物質を上記のように一つの断片または化学的実体を一度に段階的に構築または同定する方法の他に、作用物質は、空の活性部位、または選択的に、特異的に相互作用する既知の作用物質いくつかの部分、例えばミオスタチンと特異的に相互作用する完全長のミオスタチンプロドメインを用いて、全体としてまたは新たに設計することができる。そのような方法には、例えば、ＬＵＤＩ（ボーム（Ｂｏｈｍ）、Ｊ． Ｃｏｍｐ． Ａｉｄ． Ｍｏｌｅｃ． Ｄｅｓｉｇｎ ６：６１〜７８、１９９２、バイオシンテクノロジーズ社から入手可能、サンジエゴ、カリフォルニア州）；ＬＥＧＥＮＤ（ニシバタとイタイ（Ｎｉｓｈｉｂａｔａ ａｎｄ Ｉｔａｉ）、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ． ４７：８９８５、１９９１、モレキュラーシミュレーションズ社から入手可能、バーリントン、マサチューセッツ州）；リープフロッグ（トリポスアソシエーツ社から入手可能、セントルイス、ミズーリ州）、およびコーエンら（Ｃｏｈｅｎ、Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ３３：８８３〜８９４、１９９０）およびナビアとムルコ（Ｎａｖｉａ ａｎｄ Ｍｕｒｃｋｏ、Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ． ２：２０２〜２１０、１９９２、そのそれぞれが参照として本明細書に組み入れられる）に記載される方法が含まれる。
【００７３】
特定のコンピューターソフトウェアは、当技術分野において化合物の変形エネルギーおよび静電気的相互作用を評価するために利用できる。そのような用途のために設計されるプログラムの例には、ゴーシアン９２、改訂版Ｃ（フリッシュ、ゴーシアンインク、ピッツバーグ、ペンシルバニア州、１９９２）；ＡＭＢＥＲ、バージョン４．０（コルマン、カリフォルニア大学サンフランシスコ校、１９９４）；ＱＵＡＮＴＡ／ＣＨＡＲＭＭ（モレキュラーシミレーションズインク、バーリントン、マサチューセッツ州、１９９４）；およびインサイトＩＩ／ディスカバー（バイオシステムテクノロジーズインク、サンジエゴ、カリフォルニア州）が含まれる。これらのプログラムは例えば、シリコングラフィックスワークステーション、ＩＲＩＳ ４Ｄ／３５、またはＩＢＭ ＲＩＳＣ／６０００ワークステーションモデル５５０を用いて実行してもよい。その速度および容量が絶えず改変されているその他のハードウェアシステムおよびソフトウェアパッケージは、当業者に既知であろう。
【００７４】
関係する分子、例えば、成熟ミオスタチンのような成熟ＧＤＦペプチドまたはＧＤＦ受容体と特異的に相互作用する作用物質を同定する分子モデリングプロセスは、本明細書に開示されるように実行することができる。第一の段階において、標的分子、例えばミオスタチンの仮想表示を行う。このように、一つの態様において、本発明は、標的分子がプロＧＤＦポリペプチド、例えば、プロミオスタチン；プロＧＤＦポリペプチドのペプチド部分；ＧＤＦ受容体；およびＧＤＦ受容体の関連するドメイン、例えばＧＤＦ結合ドメインから選択される、標的分子の仮想表示を提供する。標的分子の仮想表示は、コンピューターシステムのメモリに表示または維持することができる。プロセスは開始状態で始まり、仮想標的分子を含み、次に、一つまたはそれ以上の仮想試験分子を含むデータベースがコンピューターシステムのメモリに保存される状態に移動する。先に考察したように、メモリは、ＲＡＭまたは内部保存装置を含む如何なるタイプのメモリとなりうる。
【００７５】
次に、プロセスは、第一の仮想試験分子の仮想標的分子との特異的相互作用能が決定される状態に移行して、試験分子の集団の一つとなりうる仮想試験分子を含むデータベースが仮想標的分子および仮想試験分子の相互作用の解析のために開かれて、解析が行われる。特異的相互作用の決定は、コンピューターシステムに維持されたソフトウェアによって、またはコンピューターシステムのメモリに保存されて、必要に応じてアクセスすることができる既定の特異的相互作用と比較することによって行われた計算に基づいて行うことができる。
【００７６】
次に、プロセスは、特異的相互作用が検出される場合、仮想試験分子が表示される、またはコンピューター上の第二のデータベースに保存される状態に移行する。適当であれば、仮想標的分子および第二の仮想試験分子、第三の仮想試験分子、望ましければそれ以降に関してプロセスを繰り返す。
【００７７】
仮想試験分子が仮想標的分子と特異的に相互作用する決定がなされれば、同定された仮想試験分子をデータベースから移動させて、ユーザーに表示することができる。この状態は、表示された名称または構造を有する分子が、入力される束縛内で標的分子と特異的に相互作用することをユーザーに通知する。同定された試験分子の名称がユーザーに表示されれば、プロセスは決定状態に移動し、そこで、より多くの仮想試験分子がデータベースに存在するか、または調べなければならないかを決定する。これ以上の分子がデータベースに存在しない場合、プロセスは最終状態で停止する。しかし、より多くの試験分子がデータベースに存在する場合、プロセスは、特異的結合活性に関して調べることができるように、ポインターがデータベースにおける次の試験分子に移動する。このようにして、新しい分子を、仮想標的分子との特異的相互作用能に関して調べる。
【００７８】
上記のような方法は、請求の本発明に含まれる様々な局面において用いることができる。このように、方法は、ミオスタチンと特異的に相互作用して、ミオスタチンのその受容体との相互作用能を減少もしくは阻害する、またはそうでなければミオスタチンがシグナル伝達を行う能力に影響を及ぼすことができるプロミオスタチンプロドメインのペプチド部分を同定するために用いることができる。同様に、この方法を用いて、ＧＤＦプロドメインの作用を模倣して、それによってミオスタチンまたはＧＤＦ−１１シグナル伝達を減少または阻害する有機低分子を同定することができる。方法はまた、ＧＤＦ受容体、例えばＡｃｔ ＲＩＩＡ、Ａｃｔ ＲＩＩＢまたは他のＧＤＦ受容体と特異的に相互作用する作用物質を同定するために用いることができ、そのような作用物質は細胞におけるＧＤＦシグナル伝達を調節することができるＧＤＦ受容体アゴニストまたはアンタゴニストとして有用である。さらに、方法は、特定のポリペプチドの保存された構造的特徴を同定することによって、これまで不明のプロＧＤＦポリペプチドまたはＧＤＦ受容体を同定する手段を提供する。
【００７９】
ＴＧＦ−９スーパーファミリーの他のメンバーと同様に、活性なＧＤＦペプチドは、前駆体ポリペプチドとして発現され、これが成熟した生物学的に活性な型に切断される。したがって、なおもう一つの態様において、プロＧＤＦポリペプチドの蛋白質分解断片は、成熟ＧＤＦペプチド、または先に考察したように、機能的ペプチド部分がＧＤＦアゴニストまたはアンタゴニストの活性を有しうる成熟ＧＤＦペプチドの機能的ペプチド部分である。蛋白質分解断片は、プロミオスタチンポリペプチドのアミノ酸残基約２６８〜３７４位（図１を参照のこと；同様に、図２も参照のこと）が含まれる成熟Ｃ末端ミオスタチンペプチド、またはプロＧＤＦ−１１ポリペプチドのアミノ酸残基約２９９〜４０７位が含まれる成熟Ｃ末端ＧＤＦ−１１ペプチドとなりうる。完全長の成熟ミオスタチンペプチドの例は、配列番号：４および配列番号：６に記載するようにアミノ酸残基約２６８〜３７５位；配列番号：２、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：８、配列番号：１８、配列番号：１４、配列番号：１６、および配列番号：２０に記載されるアミノ酸残基約２６７〜３７４位；ならびに配列番号：２７のアミノ酸残基約４９〜１５７位および配列番号：２９のアミノ酸残基約２８〜１３６位である。完全長の成熟ＧＤＦ−１１ペプチドの例は、配列番号：２５のアミノ酸残基約２９９〜４０７位である。成熟ＧＤＦペプチドの機能的ペプチド部分の例は、成熟ＧＤＦペプチドの活性に関してアゴニストまたはアンタゴニスト活性を有する成熟ミオスタチンまたは成熟ＧＤＦ−１１のペプチド部分である。好ましくは、成熟ＧＤＦペプチド活性は、その受容体との特異的相互作用能である。
【００８０】
本明細書に開示するように、成熟ミオスタチンペプチド（本明細書において一般的に「ミオスタチン」と呼ぶ）は、細胞表面上に発現されるミオスタチン受容体と特異的に相互作用することによって、ミオスタチンシグナル伝達活性を誘導することができる（実施例７を参照のこと）。このように、ミオスタチンの機能的ペプチド部分は、本明細書に記載される、またはそうでなければ当技術分野で既知の方法を用いて成熟ミオスタチンペプチドのペプチド部分を調べて、ミオスタチン受容体、例えば細胞上に発現されるアクチビンＩＩＡ型受容体（Ａｃｔ ＲＩＩＡ）またはＡｃｔ ＲＩＩＢ受容体と特異的に相互作用するミオスタチンの機能的ペプチド部分を同定することによって得ることができる。
【００８１】
ミオスタチンプロドメインは、ミオスタチンシグナル伝達活性を減少または阻害することができる。一つの態様において、ミオスタチンプロドメインは、ミオスタチンと特異的に相互作用して、それによってミオスタチンペプチドのその受容体との特異的相互作用能を減少または阻害することができる。本明細書に開示するように、前駆体プロミオスタチンも同様に、ミオスタチン受容体との特異的相互作用能を欠損し、したがって、プロミオスタチンが成熟ミオスタチンに切断されることを減少または阻害するプロミオスタチンの変異は、ミオスタチンシグナル伝達を減少または阻害する手段を提供する。したがって、もう一つの態様において、本発明は、活性な成熟ＧＤＦペプチドへの変異体プロＧＤＦの蛋白質分解切断を破壊する一つまたはそれ以上のアミノ酸変異を含む変異体プロＧＤＦポリペプチドを提供する。
【００８２】
本発明の変異体プロＧＤＦポリペプチドは、プロＧＤＦポリペプチドに存在するコンセンサス蛋白質分解切断認識部位Ａｒｇ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ａｒｇ（配列番号：２１）のような蛋白質分解切断部位の切断に影響を及ぼす変異を有しうる。このように、変異は、変異体プロミオスタチンが、例えばミオスタチンプロドメインおよび成熟ミオスタチンペプチドに切断されることができないように、配列番号：２１のアルギニン残基の変異となりうる。しかし、変異はまた、蛋白質分解切断部位以外の部位となりえて、切断部位での蛋白質分解を行うためにプロテアーゼのプロＧＤＦポリペプチド結合能を変化させることができる。本発明の変異体プロＧＤＦポリペプチド、例えば変異体プロミオスタチンまたは変異体プロＧＤＦ−１１は、ミオスタチンまたはＧＤＦ−１１に関してドミナントネガティブ活性を有しうる、したがって、細胞におけるミオスタチンまたはＧＤＦ−１１シグナル伝達を減少または阻害するために有用となりうる。
【００８３】
本発明はまた、先に説明したように、プロミオスタチンポリペプチドもしくは変異体プロミオスタチンのペプチド部分、またはプロＧＤＦ−１１ポリペプチドもしく変異体プロＧＤＦ−１１のペプチド部分をコードする実質的に精製されたポリヌクレオチドを提供する。下記により詳細に説明するように、本発明はまた、細胞に及ぼすミオスタチンの影響を調節するための作用物質として有用なポリヌクレオチドを提供し、ＧＤＦ受容体またはその機能的ペプチド部分をコードするポリヌクレオチドをさらに提供する。そのようなポリヌクレオチドの例を以下の開示に提供する。そのため、以下の開示は、本明細書に開示の本発明の様々な態様に関連していると認識すべきである。
【００８４】
「ポリヌクレオチド」という用語は、本明細書において、ホスホジエステル結合によって互いに連結した二つまたはそれ以上のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドの配列を意味するために用いられる。そのため、「ポリヌクレオチド」という用語には、遺伝子またはその一部となりうるＲＮＡおよびＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ポリデオキシリボ核酸配列等が含まれ、一本鎖または二本鎖と共にＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドとなりうる。さらに、本明細書において用いられる「ポリヌクレオチド」という用語には、細胞から単離することができる天然に存在する核酸分子と共に、例えば、化学合成法またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のような酵素的方法によって調製することができる合成分子が含まれる。様々な態様において、本発明のポリヌクレオチドは、ヌクレオシドもしくはヌクレオチド類似体、ホスホジエステル結合以外の骨格結合（上記を参照）を含みうる。
【００８５】
一般的に、ポリヌクレオチドを含むヌクレオチドは、２’−デオキシリボースに結合したアデニン、シトシン、グアニン、もしくはチミンのような天然に存在するデオキシリボヌクレオチド、またはリボースに結合したアデニン、シトシン、グアニン、もしくはウラシルのようなリボヌクレオチドである。しかし、ポリヌクレオチドはまた、天然に存在しない合成ヌクレオチドまたは改変された天然に存在するヌクレオチドを含む、ヌクレオチド類似体を含みうる。そのようなヌクレオチド類似体は当技術分野で周知であり、そのようなヌクレオチド類似体を含むポリヌクレオチドと同様に市販されている（リン（Ｌｉｎ）ら、Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ． Ｒｅｓ． ２２：５２２０〜５２３４（１９９４）；ジェリネク（Ｊｅｌｌｉｎｅｋ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３４：１１３６３〜１１３７２（１９９５）；パグラティス（Ｐａｇｒａｔｉｓ）ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １５：６８〜７３（１９９７）、そのそれぞれが参照として本明細書に組み入れられる）。
【００８６】
ポリヌクレオチドのヌクレオチドを結合させる共有結合は、一般的にホスホジエステル結合である。しかし、共有結合はまた、チオジエステル結合、ホスホロチオエート結合、ペプチド様結合または合成ポリヌクレオチドを産生するためにヌクレオチドを連結させるために有用であることが当業者に既知である他の如何なる結合も含む多数の他の如何なる結合ともなりうる（例えば、そのそれぞれが参照として本明細書に組み入れられる、タム（Ｔａｍ）ら、Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ． Ｒｅｓ． ２２：９７７〜９８６（１９９４）；エッカーとクルック（Ｅｃｋｅｒ ａｎｄ Ｃｒｏｏｋｅ）、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １３：３５１３６０（１９９５）を参照のこと）。ヌクレオチドまたは類似体を結合させる天然に存在しないヌクレオチド類似体または結合を組み込むことは、改変されたポリヌクレオチドが分解を受けにくくなりうることから、ポリヌクレオチドが、例えば組織培養培地を含むヌクレオチド溶解活性を含みうる環境に曝露される場合、または生きている被験者に投与される場合には特に有用となりうる。
【００８７】
天然に存在するヌクレオチドおよびホスホジエステル結合を含むポリヌクレオチドは、化学合成することができ、または適当なポリヌクレオチドを鋳型として用いて組換えＤＮＡ法を用いて産生することができる。比較すると、ヌクレオチド類似体またはホスホジエステル結合以外の共有結合を含むポリヌクレオチドは、一般的に化学合成されるが、Ｔ７ポリメラーゼのような酵素は特定のタイプのヌクレオチド類似体をポリヌクレオチドに組み込まれることができ、したがって、適当な鋳型から組換えによってそのようなポリヌクレオチドを産生するために用いることができる（ジェリネク（Ｊｅｌｌｉｎｅｋ）ら、上記、１９９５）。
【００８８】
ポリヌクレオチドがペプチド、例えば、プロミオスタチンのペプチド部分、またはペプチド作用物質をコードする場合、コード配列は一般的に、ベクターに含まれ、望ましければ組織特異的プロモーターまたはエンハンサーを含む適当な調節エレメントに機能的に結合される。コードされたペプチドはさらに、例えば、Ｈｉｓ−６タグ等のようなペプチドタグに機能的に結合させることができ、これは標的細胞における作用物質の発現の同定を容易にすることができる。Ｈｉｓ−６のようなポリヒスチジンタグペプチドは、ニッケルイオン、コバルトイオン等のような二価陽イオンを用いて検出することができる。さらなるペプチドタグには、例えば、抗ＦＬＡＧ抗体を用いて検出することができるＦＬＡＧエピトープ（例えば、そのそれぞれが参照として本明細書に組み入れられる、ホップ（Ｈｏｐｐ）ら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１２０４（１９８８）；米国特許第５，０１１，９１２号を参照のこと）；エピトープに対して特異的な抗体を用いて検出することができるｃ−ｍｙｃエピトープ；ストレプトアビジンまたはアビジンを用いて検出することができるビオチン；およびグルタチオンを用いて検出することができるグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼが含まれる。そのようなタグは、例えば、ミオスタチンポリペプチドの蛋白質分解断片に対応する実質的に精製されたペプチドを得ることが望ましい場合には、それらが機能的に結合したペプチドまたはペプチド作用物質の単離を促進することができるというさらなる長所を提供することができる。
【００８９】
本明細書において用いられるように、「機能的に結合」または「機能的に会合」という用語は、二つまたはそれ以上の分子が、それらが単一の単位として作用して、一つもしくは双方の分子またはその組み合わせに帰因する機能を行うように、互いに関連して存在することを意味する。例えば、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、調節エレメントに機能的に結合することができ、この場合、調節エレメントは、それが細胞において通常会合するポリヌクレオチド配列に影響を及ぼす様式と類似のようにポリヌクレオチドにその調節作用を付与する。第一のポリヌクレオチドコード配列も同様に、機能的に結合したコード配列からキメラポリペプチドが発現されることができるように、第二（またはそれ以上）のコード配列に機能的に結合することができる。キメラポリペプチドは、融合ポリペプチドとなりえて、この場合、二つ（またはそれ以上）のコードされたポリペプチドは単一のポリペプチドに翻訳される、すなわちペプチド結合によって共有結合する；または翻訳されると、互いに機能的に会合して安定な複合体を形成しうる二つの別個のペプチドとして翻訳されうる。
【００９０】
キメラポリペプチドは、一般的にそのペプチド成分のそれぞれの特徴のいくつかまたは全てを示す。そのため、キメラポリペプチドは、本明細書において開示されるように、本発明の方法を実施するために特に有用となりうる。例えば、一つの態様において、本発明の方法は細胞におけるミオスタチンシグナル伝達を調節することができる。このように、キメラポリペプチドの一つのペプチド成分が細胞区画局在ドメインをコードして、第二のペプチド成分がドミナントネガティブＳｍａｄポリペプチドをコードする場合、機能的キメラポリペプチドは、細胞区画局在ドメインによって指定される細胞区画に移動して、Ｓｍａｄポリペプチドのドミナントネガティブ活性を示し、それによって、細胞におけるミオスタチンシグナル伝達を調節することができる。
【００９１】
細胞区画ドメインは周知であり、これには例えば細胞質膜局在ドメイン、核局在シグナル、ミトコンドリア膜局在シグナル、小胞体局在シグナル等が含まれる（例えば、そのそれぞれが参照として本明細書に組み入れられる、ハンコック（Ｈａｎｃｏｃｋ）ら、ＥＭＢＯ Ｊ． １０：４０３３〜４０３９、１９９１；バス（Ｂｕｓｓ）ら、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ８：３９６０〜３９６３、１９８８；米国特許第５，７７６，６８９号を参照のこと）。そのようなドメインは、作用物質を細胞における特定の区画にターゲティングする、または細胞から分泌させるために作用物質をターゲティングするために有用となりうる。例えば、Ａｃｔ ＲＩＩＢのようなミオスタチン受容体のキナーゼドメインは、一般的に細胞質膜の内膜に会合する。このように、ドミナントネガティブミオスタチン受容体キナーゼドメイン、例えば、キナーゼ活性を欠損するドミナントネガティブＡｃｔ ＲＩＩＢ受容体を含むキメラポリペプチドは、細胞質膜局在ドメインをさらに含み、それによって、ドミナントネガティブＡｃｔ ＲＩＩＢキナーゼドメインを内側の細胞質膜に局在させることができる。
【００９２】
本明細書に開示するように、プロＧＤＦシグナルペプチドは、細胞局在活性を有する。本明細書において用いられるように、「細胞局在活性」という用語は、シグナルペプチドが、それに機能的に結合したペプチドを一つまたはそれ以上の特異的細胞内区画に転移させることを指示できること、または細胞から分子の分泌を指示できることを意味する。そのため、プロＧＤＦシグナルペプチドは、実質的に同じシグナルペプチドを有する天然に発現されたＧＤＦと同じ細胞内区画への、シグナルペプチドに機能的に結合したペプチドまたは他の作用物質の転移を指示するために特に有用となりうる。さらに、シグナルペプチド、例えばプロミオスタチンの最初のアミノ酸約１５〜３０個を含むプロミオスタチンシグナルペプチドは、シグナルペプチドを含む天然に存在するプロＧＤＦと同じ経路を通して、細胞から機能的に結合した作用物質の分泌を指示することができる。このように、本発明の方法を実施するために特に有用な作用物質には、ＧＤＦシグナルペプチド、好ましくはプロミオスタチンまたはプロＧＤＦ−１１シグナルペプチドに機能的に結合したＧＤＦプロドメインまたはその機能的ペプチド部分が含まれる。
【００９３】
本発明の方法を行うために有用なポリヌクレオチド作用物質を含む本発明のポリヌクレオチドは、標的細胞と直接接触させることができる。例えば、細胞に入ってその機能を発揮するアンチセンス分子、リボザイム、または三重らせん形成物質として有用なオリゴヌクレオチドを、標的細胞に直接接触させることができる。ポリヌクレオチド作用物質はまた、ポリペプチド、例えばミオスタチン受容体（またはミオスタチン）と特異的に相互作用して、それによってミオスタチンとその受容体と特異的相互作用能を変化させることができる。そのようなポリヌクレオチドは、そのようなポリヌクレオチドを作製および同定する方法と共に、本明細書に開示され、またはそうでなければ当技術分野で周知である（例えば、そのそれぞれが参照として本明細書に組み入れられる、Ｏ＝コンネル（Ｏ＝Ｃｏｎｎｅｌｌ）ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９３：５８８３〜５８８７、１９９６；ツエルクとゴールド（Ｔｕｅｒｋ ａｎｄ Ｇｏｌｄ）、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：５０５〜５１０、１９９０；ゴールド（Ｇｏｌｄ）ら、Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ６４：７６３〜７９７、１９９５を参照のこと）。
【００９４】
プロミオスタチンのようなプロＧＤＦポリペプチドのペプチド部分をコードしうる、変異体プロミオスタチンポリペプチドをコードしうる、ＧＤＦ受容体もしくはその機能的ペプチド部分をコードすることができる、または本発明の方法を行うために有用なポリヌクレオチド作用物質となりうる本発明のポリヌクレオチドは、標的細胞へのポリヌクレオチドの導入を含むポリヌクレオチドの操作を促進することができるベクターに含まれうる。ベクターは、ポリヌクレオチドを維持するために有用であるクローニングベクターとなりえて、またはポリヌクレオチドの他にポリヌクレオチドを発現するために有用な、かつポリヌクレオチドがペプチドをコードする場合には、特定の細胞にコードされたペプチドを発現するために有用な調節エレメントを含む発現ベクターとなりうる。発現ベクターは、例えば、コードするポリヌクレオチドの持続的な転写を得るために必要な発現エレメントを含むことができ、または調節エレメントはベクターにクローニングされる前に、ポリヌクレオチドに機能的に結合することができる。
【００９５】
発現ベクター（またはポリヌクレオチド）は、一般的に、コードするポリヌクレオチドの構成的、または望ましければ誘導型、組織特異的もしくは発達段階特異的発現を提供しうるプロモーター配列、ポリ−Ａ認識配列、およびリボソーム認識部位もしくは内部リボソーム流入部位、または組織特異的となりうるエンハンサーのようなその他の調節エレメントを含むまたはコードする。ベクターはまた、望ましければ原核または真核宿主系またはその双方における複製にとって必要なエレメントを含みうる。バクテリオファージ、バキュロウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、セムリキ森林熱ウイルスおよびアデノ随伴ウイルスベクターのようなプラスミドベクターおよびウイルスベクターが含まれるそのようなベクターは、周知であり、販売元から購入することができる（プロメガ社、マディソン、ウィスコンシン州；ストラタジーン社、ラホヤ、カリフォルニア州；ギブコ／ＢＲＬ、ガイサースバーグ、メリーランド州）、または当業者によって構築することができる（例えば、そのそれぞれが参照として本明細書に組み入れられる、Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． １８５巻、ゴエッデル（Ｇｏｅｄｄｅｌ）編（アカデミック出版社、１９９０）；ジョリー（Ｊｏｌｌｙ）、Ｃａｎｃ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． １：５１〜６４、１９９４；フロッテ（Ｆｌｏｔｔｅ）、Ｊ． Ｂｉｏｅｎｅｒｇ． Ｂｉｏｍｅｍｂ． ２５：３７〜４２、１９９３；カーシェンバウム（Ｋｉｒｓｈｅｎｂａｕｍ）ら、Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ９２：３８１〜３８７、１９９３を参照のこと）。
【００９６】
テトラサイクリン（ｔｅｔ）誘導型プロモーターは、本発明のポリヌクレオチド、例えばその中で蛋白質分解プロセシング部位が変位しているミオスタチンのドミナントネガティブ型をコードする、成熟ミオスタチンペプチドと複合体を形成することができるミオスタチンプロドメインをコードする、またはＧＤＦ受容体のドミナントネガティブ型をコードするポリヌクレオチドの発現を促進するために特に有用である。テトラサイクリン、またはテトラサイクリン類似体を、ｔｅｔ誘導型プロモーターに機能的に結合したポリヌクレオチドを含む被験者に投与すると、コードされたペプチドの発現が誘導され、それによってペプチドはその活性を行うことができ、それによってペプチド作用物質はミオスタチンシグナル伝達を減少または阻害することができる。そのような方法は、例えば、成体生物において筋の肥大を誘導するために用いることができる。
【００９７】
ポリヌクレオチドはまた、コードされるペプチドの発現が個体における筋細胞、または培養、例えば臓器培養における細胞の混合集団における筋細胞に限定されるように、組織特異的調節エレメント、例えば筋細胞特異的調節エレメントに機能的に結合することができる。例えば、筋クレアチニンキナーゼプロモーター（スターンバーグ（Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ）ら、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ８：２８９６〜２９０９、１９８８、参照として本明細書に組み入れられる）およびミオシン軽鎖エンハンサー／プロモーター（ドノギュー（Ｄｏｎｏｇｈｕｅ）ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８：５８４７〜５８５１、１９９１、参照として本明細書に組み入れられる）を含む筋細胞特異的調節エレメントは、当技術分野で周知である。
【００９８】
ウイルス発現ベクターは、細胞、特に被験者の細胞にポリヌクレオチドを導入するために特に有用となりうる。ウイルスベクターは、比較的高い効率で宿主細胞に感染できること、および特定の細胞タイプに感染できるという長所を提供する。例えば、ミオスタチンプロドメインまたはその機能的ペプチド部分をコードするポリヌクレオチドを、バキュロウイルスベクターにクローニングして、次にこれを用いて昆虫宿主細胞に感染させて、それによって大量のコードされるプロドメインを産生する手段を提供する。ウイルスベクターはまた、関係する生物の細胞、例えば哺乳類、鳥類、または魚類宿主細胞のような脊椎動物宿主細胞に感染するウイルスに由来しうる。ウイルスベクターは、本発明の方法を行うために有用なポリヌクレオチドを標的細胞に導入するために特に有用となりうる。ウイルスベクターは、特定の宿主系、特に哺乳類系において用いるために開発されており、これには例えば、レトロウイルスベクター、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に基づくベクターのような他のレンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター等が含まれる（そのそれぞれが参照として本明細書に組み入れられる、ミラーとロスマン（Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｒｏｓｍａｎ）、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ７：９８０〜９９０、１９９２；アンダーソン（Ａｎｄｅｒｓｏｎ）ら、Ｎａｔｕｒｅ ３９２：２５〜３０、補則、１９９８；ベルマとソミア（Ｖｅｒｍａ ａｎｄ Ｓｏｍｉａ）、Ｎａｔｕｒｅ ３８９：２３９〜２４２、１９９７；ウィルソン（Ｗｉｌｓｏｎ）、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３３４：１１８５〜１１８７（１９９６）を参照のこと）。
【００９９】
例えば、レトロウイルスを遺伝子移入のために用いる場合、複製コンピテントレトロウイルスは理論的に、レトロウイルスベクターを産生するために用いられるパッケージング細胞株におけるレトロウイルスベクターとウイルス遺伝子配列との組換えにより発達することができる。組換えによって複製コンピテントウイルスの産生が減少または消失しているパッケージング細胞株は、複製コンピテントレトロウイルスが産生される可能性を最小限にするために用いることができる。細胞を感染させるために用いられる全てのレトロウイルスベクター上清を、ＰＣＲおよび逆転写酵素アッセイ法のような標準的なアッセイ法によって複製コンピテントウイルスに関してスクリーニングする。レトロウイルスベクターによって、異種遺伝子を宿主細胞ゲノムに組み込むことが可能となり、これによって、細胞分裂後に遺伝子を娘細胞に伝えることができる。
【０１００】
ベクターに含まれうるポリヌクレオチドは、当技術分野で既知の多様な方法によって細胞に導入することができる（サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、「分子のクローニング：実験マニュアル（ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ）」、コールドスプリングハーバー研究所出版、１９８９）；アウスユベール（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら、「分子生物学の最新プロトコール（ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ）」、ジョンウィリーとサンズ、ボルチモア、メリーランド州（１９８７、１９９５年の補則、そのそれぞれが参照として本明細書に組み入れられる）。そのような方法には、例えば、トランスフェクション、リポフェクション、マイクロインジェクション、電気穿孔、およびウイルスベクターを用いる感染が含まれ；ならびに細胞へのポリヌクレオチドの導入を促進して、ポリヌクレオチドが細胞に導入される前に分解されないように保護することができるリポソーム、微小乳剤等を用いることが含まれうる。特定の方法の選択は、例えばポリヌクレオチドが導入される細胞と共に、細胞が培養において単離されているか、または組織もしくは臓器培養で存在するか、またはインサイチューで存在するかに依存するであろう。
【０１０１】
ウイルスベクターによる感染によってポリヌクレオチドを細胞に導入することは、それがエクスビボまたはインビボで核酸分子を細胞に効率よく導入することができることから特に有用である（例えば、参照として本明細書に組み入れられる、米国特許第５，３９９，３４６号を参照のこと）。その上、ウイルスは非常に特殊化されており、一つまたは少数の特異的細胞タイプにおける感染および増殖能に基づくベクターとして選択することができる。このように、その天然の特異性を用いて、ベクターに含まれる核酸分子を様々な細胞タイプにターゲティングすることができる。そのため、ＨＩＶに基づくベクターを用いて、Ｔ細胞を感染させることができ、アデノウイルスに基づくベクターを用いて、例えば呼吸器上皮細胞を感染させることができ、ヘルペスウイルスに基づくベクターを用いて、神経細胞等を感染させることができる。アデノ随伴ウイルスのようなその他のベクターは、より広い宿主範囲を有し、したがって、様々な細胞タイプに感染させるために用いることができるが、ウイルスまたは非ウイルスベクターも同様に、特異的受容体またはリガンドによって改変して、受容体媒介事象を通して標的特異性を変化させることができる。
【０１０２】
本発明はまた、プロミオスタチンポリペプチドまたは変異体プロミオスタチンポリペプチドのペプチド部分に特異的に結合する抗体も提供する。本発明の特に有用な抗体には、ミオスタチンプロドメインまたはその機能的ペプチド断片に特異的に結合する抗体、およびプロミオスタチンポリペプチドに結合して、プロミオスタチンの成熟ミオスタチンペプチドへの蛋白質分解切断を減少または阻害する抗体が含まれる。さらに、本発明の抗体は、下記に示すように、ＧＤＦ受容体またはその機能的ペプチド部分に特異的に結合する抗体となりうる。本発明の抗体を調製および単離する方法は下記により詳しく記載し、その開示は参照として本明細書に組み入れられる。
【０１０３】
ミオスタチンは、骨格筋全体の適切な調節にとって必須である。野生型のマウスと比較すると、ミオスタチンを欠損するミオスタチンノックアウトマウスは、過形成と肥大の複合により筋の量が２〜３倍増加している。本明細書に開示するように、ミオスタチンノックアウトマウスはまた、少なくとも部分的に全身の骨格筋組織の同化状態の増加により、脂肪の蓄積が劇的に減少している。逆に、ヌードマウスにミオスタチンを過剰発現させると、癌またはＡＩＤＳのような慢性疾患を有するヒト患者において認められるカヘキシア状態と類似の消耗性症候群を誘導した。本明細書にさらに開示するように、ミオスタチン活性は、Ｓｍａｄシグナル伝達経路の特徴を有するシグナル伝達を通して媒介されうる。したがって、本発明は、細胞におけるミオスタチンシグナル伝達に影響を及ぼす作用物質を細胞に接触させることによって、細胞に及ぼすミオスタチンの作用を調節する方法を提供する。
【０１０４】
本明細書において用いられるように、細胞に及ぼすミオスタチンの作用に関連して用いられる「調節する」という用語は、細胞におけるミオスタチンシグナル伝達が増加または減少もしくは阻害されていることを意味する。「増加」および「減少もしくは阻害」という用語は、ミオスタチンの非存在下でのシグナル伝達経路の活性レベル、またはミオスタチンの存在下での正常細胞における活性レベルとなりうるミオスタチンシグナル伝達活性の基準値レベルと比較して用いられる。例えば、ミオスタチンシグナル伝達経路は、ミオスタチンと接触させた筋細胞において特定の活性を示し、筋細胞をミオスタチンプロドメインにさらに接触させると、ミオスタチンシグナル伝達活性は減少または阻害されうる。そのため、ミオスタチンプロドメインは、ミオスタチンシグナル伝達を減少または阻害するために有用な作用物質である。同様に、ＧＤＦ−１１プロドメインのようなもう一つのＧＤＦファミリーメンバーのプロドメイン、またはアクチビンプロドメイン、ＭＩＳプロドメイン等のような他のＴＧＦ−９ファミリーメンバーのプロドメインは、ミオスタチンシグナル伝達を減少させるために有用となりうる。「減少または阻害」という用語は、それらが場合によって、ミオスタチンシグナル伝達のレベルを特定のアッセイ法によって検出されうるレベル以下に減少させうることが認識されているために、本明細書において共に用いられる。そのため、そのようなアッセイ法を用いて、ミオスタチンシグナル伝達の低レベルが阻害されたままであるか、またはシグナル伝達が完全に阻害されるか否かを決定することはできない。
【０１０５】
本明細書において用いられるように、「ミオスタチンシグナル伝達」という用語は、細胞表面上に発現されたミオスタチン受容体とミオスタチンとの特異的相互作用により細胞に起こる一連の事象、一般的に一連の蛋白質−蛋白質相互作用を意味する。そのため、ミオスタチンシグナル伝達は、例えば、ミオスタチンと細胞上のその受容体との特異的相互作用を検出することによって、細胞におけるミオスタチンシグナル伝達経路に関係する一つもしくはそれ以上のポリペプチドの燐酸化を検出することによって、ミオスタチンシグナル伝達によって特異的に誘導される一つもしくはそれ以上の遺伝子の発現を検出することによって、またはミオスタチンシグナル伝達に反応して起こる表現型の変化を検出することによって検出することができる（実施例を参照のこと）。本明細書において開示するように、本発明の方法において有用な作用物質は、ミオスタチンシグナル伝達を刺激するためのアゴニストとして、またはミオスタチンシグナル伝達を減少もしくは阻害するためのアンタゴニストとして作用しうる。
【０１０６】
本発明の方法の例は、本明細書において一般的にミオスタチンに関連して示される。しかし、本発明の方法は、細胞におけるＧＤＦによるシグナル伝達に影響を及ぼす作用物質に細胞を接触させることによって、他のＧＤＦペプチド、例えば、ＧＤＦ−１１が細胞に及ぼす作用を調節することをより広く含みうると認識すべきである。本発明の完全な範囲を実践する方法は、本開示を読むことによって容易に理解され、本発明には例えばＧＤＦ受容体を同定する方法、ＧＤＦとその受容体との特異的相互作用によるシグナル伝達を調節する作用物質を同定する方法等が含まれる。
【０１０７】
ミオスタチンシグナル伝達経路の例は、本明細書において、Ｓｍａｄ経路であり、これは、ミオスタチンがアクチビンＩＩ型受容体の細胞外ドメインと特異的に相互作用すると開始され、細胞においてＳｍａｄ蛋白質を含む細胞内ポリペプチドの相互作用を通して伝達される。一般的に、ミオスタチンシグナル伝達は、Ｓｍａｄポリペプチドのような特異的細胞内ポリペプチドの燐酸化または脱燐酸化に関連している。このように、細胞におけるミオスタチンシグナル伝達は、ミオスタチンの非存在下でのポリペプチドの燐酸化レベルと比較して、ミオスタチンの存在下で一つまたはそれ以上のＳｍａｄポリペプチドの燐酸化レベルの増加を検出することによって検出することができる。本発明の方法は、ミオスタチンシグナル伝達を増加または減少させる手段を提供し、したがって、ミオスタチンシグナル伝達経路に関与するＳｍａｄポリペプチドの燐酸化レベルは、正常レベル以上に増加するか、またはミオスタチンの存在下で予想されるレベル未満に減少するであろう。
【０１０８】
本発明の方法は、例えば、適した条件で標的細胞と、細胞におけるミオスタチンシグナル伝達に影響を及ぼす作用物質とを接触させることによって行うことができる。適した条件は、単離された細胞となりうるまたは組織もしくは臓器の成分となりうる細胞を、適当な培養培地に入れること、または細胞をインサイチューで生物に接触させることによって提供されうる。例えば、細胞を含む培地を、ミオスタチンの細胞上に発現されるミオスタチン受容体との特異的相互作用能に影響を及ぼす作用物質、または細胞におけるミオスタチンシグナル伝達経路に影響を及ぼす作用物質に接触させることができる。一般的に、細胞は被験者における組織または臓器の成分であり、いずれにせよ、細胞を接触させることは被験者に作用物質を投与することを含む。しかし、細胞はまた、培養において操作して、次に培養において維持して、被験者に投与する、またはヒト以外のトランスジェニック動物を作製するために用いることができる。
【０１０９】
本発明の方法において有用な物質は、如何なるタイプの分子、例えば、ポリヌクレオチド、ペプチド、ペプチド模倣体、ビニル様（ｖｉｎｙｌｏｇｏｕｓ）ペプトイド、有機低分子等となりえて、ミオスタチンシグナル伝達に影響を及ぼす様々な如何なる方法でも作用しうる。作用物質は、ミオスタチンまたはアクチビン受容体のようなミオスタチン受容体に結合して、それによってミオスタチンのその受容体との特異的相互作用能を変化させることによって細胞外で作用することができる、または細胞におけるミオスタチンシグナル伝達を変化させるように細胞内で作用することができる。さらに、作用物質は、細胞に及ぼすミオスタチンの作用、例えばミオスタチンのその受容体との特異的相互作用能を模倣または増強して、それによって細胞におけるミオスタチンシグナル伝達を増加させるアゴニストとなりうる；または細胞に及ぼすミオスタチンの作用を減少もしくは阻害して、それによって細胞におけるミオスタチンシグナル伝達を減少もしくは阻害するアンタゴニストとなりうる。
【０１１０】
本明細書において用いられるように、「特異的相互作用」または「特異的に結合する」等の用語は、二つの分子が生理的条件で比較的安定である複合体を形成することを意味する。この用語は本明細書において、例えば、ミオスタチンとミオスタチン受容体との相互作用、ミオスタチンシグナル伝達経路の細胞内成分の相互作用、抗体とその抗原との相互作用、およびミオスタチンプロドメインとミオスタチンとの相互作用を含む様々な相互作用を意味するために用いられる。特異的相互作用は、解離定数が少なくとも約１×１０−６ Ｍ、一般的に少なくとも約１×１０−７ Ｍ、通常少なくとも約１×１０−８ Ｍ、特に少なくとも約１×１０−９ Ｍまたは１×１０−１０ Ｍまたはそれ以上である特徴を有しうる。特異的相互作用は一般的に、例えば、ヒトまたは他の脊椎動物もしくは無脊椎動物のような生きている個体に起こる状態と共に、哺乳類細胞または他の脊椎生物もしくは無脊椎生物からの細胞を維持するために用いられるような細胞培養において起こる条件を含む生理的条件で安定である。さらに、ミオスタチンプロドメインとミオスタチンとの細胞外相互作用のような特異的相互作用は、商業的に価値がある海洋生物の養殖のために用いられるような条件で一般的に安定である。二つの分子が特異的に相互作用するか否かを決定する方法は周知であり、これには例えば、平衡透析、表面プラズモン共鳴等が含まれる。
【０１１１】
ミオスタチンとその受容体との特異的相互作用を変化させる作用物質は、例えば、その細胞受容体と特異的に相互作用できないようにミオスタチンに結合することによって、その受容体との結合に関してミオスタチンと競合することによって、またはそうでなければ、ミオスタチンシグナル伝達を誘導するためにミオスタチンがその受容体と特異的に相互作用する必要条件を迂回することによって作用しうる。ミオスタチン受容体の可溶性の細胞外ドメインのような切断型ミオスタチン受容体は、ミオスタチンに結合して、それによってミオスタチンを分離して、その細胞表面ミオスタチン受容体との特異的相互作用能を減少または阻害することができる作用物質の例である。ミオスタチンプロドメインまたはその機能的ペプチド部分は、ミオスタチンに結合して、それによってミオスタチンの細胞表面ミオスタチン受容体との特異的相互作用能を減少もしくは阻害することができる作用物質のもう一つの例である。そのようなミオスタチンアンタゴニストは、本発明の方法を実践するために、特に細胞におけるミオスタチンシグナル伝達を減少または阻害するために有用である。
【０１１２】
フォリスタチンは、ミオスタチンに結合して、それによってミオスタチンのその受容体との特異的相互作用能を減少または阻害することができる作用物質のもう一つの例である。フォリスタチンは、ミオスタチン（ＧＤＦ−８；米国特許第６，００４，９３７号）およびＧＤＦ−１１（ゲーマー（Ｇａｍｅｒ）ら、Ｄｅｖｅｌ． Ｂｉｏｌ． ２０８：２２２〜２３２、１９９９）を含む様々なＴＧＦ−βファミリーメンバーに結合してその活性を阻害することができ、したがって開示される方法を行うために用いることができる。ミオスタチンの作用を調節するためにフォリスタチンを用いることはこれまでに記述されているが（米国特許第６，００４，９３７号）、フォリスタチンが、ミオスタチンのＡｃｔ ＲＩＩＢのようなミオスタチン受容体との特異的相互作用能を減少または阻害することは、本発明の開示以前に知られていなかった。
【０１１３】
本発明の方法において有用な作用物質はまた、細胞ミオスタチン受容体と相互作用して、それによって受容体に関してミオスタチンと競合することができる。そのような作用物質は、例えば、ミオスタチン結合ドメインの全てまたは一部を含む細胞表面ミオスタチン受容体に特異的に結合して、それによってミオスタチンが受容体と特異的に相互作用できないようにする抗体となりうる。そのような抗ミオスタチン受容体抗体は、ミオスタチンシグナル伝達を活性化せずに受容体に特異的に結合できることに関して選択することができ、それによってミオスタチンシグナル伝達を減少または阻害するためのミオスタチンアンタゴニストとして有用となりうる；または受容体に特異的に結合してミオスタチンシグナル伝達を活性化できることに関して選択して、このようにミオスタチンアゴニストとして作用することができる。抗体は、ミオスタチン受容体もしくは受容体の細胞外ドメインを免疫原として用いて作製することができ、または抗ミオスタチン抗体に対して作製され、ミオスタチンを模倣する抗イディオタイプ抗体となりうる。抗ＧＤＦ受容体抗体は、下記により詳細に考察する。
【０１１４】
本発明の方法において有用な作用物質はまた、プロＧＤＦポリペプチドの活性な成熟ＧＤＦペプチドへの蛋白質分解切断を減少または阻害して、それによってＧＤＦシグナル伝達を減少または阻害する作用物質となりうる。そのような作用物質は、プロテアーゼ阻害剤、特にＡｒｇ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ａｒｇ（配列番号：２１）蛋白質分解認識部位を認識して切断するプロテアーゼの活性を阻害する作用物質となりうる。プロＧＤＦがプロミオスタチンである場合、ミオスタチンにおけるＡｒｇ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ａｒｇ（配列番号：２１）蛋白質分解認識部位に対するプロテアーゼの特異的結合を減少または阻害する抗ミオスタチン抗体を同様に用いて、プロミオスタチンの蛋白質分解を減少または阻害して、それによって産生された成熟ミオスタチンの量を減少させることができる。そのような抗体は、蛋白質分解切断部位に結合することができ、またはプロテアーゼの結合およびプロテアーゼによる切断が減少するもしくは阻害されるように、プロＧＤＦポリペプチド上の他のいくつかの部位に結合することができる。
【０１１５】
さらに、本発明の方法において有用な作用物質は、例えばミオスタチン結合に反応したミオスタチンシグナル伝達活性を欠損する、または構成的ミオスタチンシグナル伝達活性を有する変異体ミオスタチン受容体となりうる。例えば、変異体ミオスタチン受容体は、受容体がキナーゼ活性を欠損するように、そのキナーゼドメインに点突然変異、欠失等を有しうる。そのようなドミナントネガティブ変異体ミオスタチン受容体は、ミオスタチンに特異的に結合することができるという事実にもかかわらず、ミオスタチンシグナル伝達の伝幡能を欠損する。
【０１１６】
本発明の方法において有用な作用物質はまた、ミオスタチンシグナル伝達経路に関係する細胞内ポリペプチドのレベルまたは活性を調節することができる。本明細書に開示するように、ミオスタチンによる筋増殖の調節は、アクチビンＩＩ型受容体によって活性化されるシグナル伝達経路の成分を含みうる（実施例７および９を参照のこと；同様に実施例１４も参照のこと）。ミオスタチンは、培養ＣＯＳ細胞において発現されたアクチビンＩＩＢ型受容体（Ａｃｔ ＲＩＩＢ）と特異的に相互作用する（実施例７）。結合の親和性が低いことは、インビボでのＡｃｔ ＲＩＩＢに対するミオスタチンの結合が、Ｉ型受容体も同様に存在する場合にはＩＩ型受容体に対する親和性も有意に高いＴＧＦ−β（アッチサーノ（Ａｔｔｉｓａｎｏ）ら、Ｃｅｌｌ ７５：６７１〜６８０、１９９３）またはシグナル伝達受容体にリガンドを提示するために他の分子を必要とする他の系（マッサーグ（Ｍａｓｓａｇｕｅ）、上記、１９９８；ワン（Ｗａｎｇ）ら、Ｃｅ ｌｌ ６７：７９５〜８０５、１９９１）と類似の他の要因を含む可能性があることを示している。
【０１１７】
Ａｃｔ ＲＩＩＢとミオスタチンの特異的相互作用は、ミオスタチンシグナル伝達がＳｍａｄシグナル伝達経路の成分を含みうることを示している。このように、Ｓｍａｄシグナル伝達経路は、細胞に及ぼすミオスタチンの効果を調節するための標的を提供し、Ｓｍａｄ経路に影響を及ぼす作用物質は、細胞におけるミオスタチンシグナル伝達を調節するために有用となりうる。
【０１１８】
ＧＤＦシグナル伝達の細胞内ポリペプチド成分のレベルまたは活性を調節するために有用な作用物質には、シグナル伝達活性を増加させることができるアゴニスト、およびシグナル伝達活性を減少または阻害することができるアンタゴニストが含まれる。ミオスタチンに関して、例えば、ミオスタチンシグナル伝達活性を増加することができる作用物質の例は、Ｓｍａｄポリペプチドの脱燐酸化を減少または阻害して、それによってＳｍａｄのシグナル伝達活性を延長させることができるホスファターゼ阻害剤である。ミオスタチンシグナル伝達に及ぼすＳｍａｄ６およびＳｍａｄ７の阻害作用を打ち消すことができるドミナントネガティブＳｍａｄ６またはＳｍａｄ７ポリペプチドは、Ｓｍａｄシグナル伝達を増加させることによってミオスタチンシグナル伝達活性を増加することができる作用物質のさらなる例である。
【０１１９】
ミオスタチンシグナル伝達活性を減少または阻害することができるアンタゴニスト作用物質の例は、Ｃ末端の燐酸化部位が変異しているドミナントネガティブＳｍａｄ２、Ｓｍａｄ３、またはＳｍａｄ４のようなドミナントネガティブＳｍａｄポリペプチドである。Ｓｍａｄ２およびＳｍａｄ３の活性化を阻害するＳｍａｄ６およびＳｍａｄ７のような阻害性のＳｍａｄポリペプチド、およびＳｍａｄポリペプチドに結合してシグナル伝達を阻害するｃ−ｓｋｉポリペプチドは、Ｓｍａｄシグナル伝達を減少させることによってミオスタチンシグナル伝達を減少または阻害するために有用なアンタゴニストのさらなる例である。
【０１２０】
細胞内で作用する作用物質がペプチドである場合、これは細胞に直接接触させることができ、またはペプチド（またはポリペプチド）をコードするポリヌクレオチドを細胞に導入して、ペプチドを細胞において発現させることができる。本発明の方法において有用なペプチドのいくつかは比較的大きく、したがって、細胞膜を容易に通過しない可能性があると認識される。しかし、ペプチドを細胞に導入するために様々な方法が知られている。そのようなペプチドを細胞に導入する方法の選択は、部分的に、ポリペプチドを提供すべき標的細胞の特徴に依存するであろう。例えば、標的細胞、または標的細胞を含むいくつかの細胞タイプが、特定のリガンドに結合すると細胞内にインターナライズされる受容体を発現する場合、ペプチド作用物質は、リガンドと機能的に会合することができる。受容体に結合すると、ペプチドは、受容体媒介エンドサイトーシスによって細胞内に移動する。ペプチド作用物質はまた、リポソームに封入する、または脂質複合体に製剤化することができ、これはペプチドの細胞内への流入を促進することができ、上記のようにさらに受容体（またはリガンド）を発現するように改変することができる。ペプチド作用物質はまた、ペプチドの細胞内への転位を促進するヒト免疫不全ウイルスＴＡＴ蛋白質形質導入ドメインのような蛋白質形質導入ドメインを含むようにペプチドを操作することによっても、細胞に導入することができる（参照として本明細書に組み入れられる、シュワルツ（Ｓｃｈｗａｒｚｅ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８５：１５６９〜１５７２（１９９９）を参照のこと；同様に、デロッシ（Ｄｅｒｏｓｓｉ）ら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１：１８１８８（１９９６）も参照のこと）。
【０１２１】
標的細胞はまた、細胞において発現されることができるペプチド作用物質をコードするポリヌクレオチドに接触させることができる。発現されたペプチド作用物質は変異体ＧＤＦ受容体またはそのペプチド部分となりうる。変異体ＧＤＦ受容体の例には、リガンド（例えば、ミオスタチン）に特異的に結合する能力を有しうるが必ずしもその必要はないドミナントネガティブＡｃｔ ＲＩＩＡまたはＡｃｔ ＲＩＩＢのようなミオスタチン受容体のキナーゼ欠損型；ミオスタチンに結合してそれが細胞のミオスタチン受容体と特異的に相互作用できないように隔離するミオスタチン受容体の可溶性型のような切断型ミオスタチンまたは他のＧＤＦ受容体；Ｃ末端燐酸化部位が変異しているドミナントネガティブＳｍａｄ３のようなＳｍａｄポリペプチドのドミナントネガティブ型（リウ（Ｌｉｕ）ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９４：１０６６９〜１０６７４、１９９７）；Ｓｍａｄ２およびＳｍａｄ３の活性化を阻害するＳｍａｄ７ポリペプチド（ヘルディン（Ｈｅｌｄｉｎ）ら、Ｎａｔｕｒｅ ３９０：４６５〜４７１、１９９７）；またはＳｍａｄポリペプチドに結合して、Ｓｍａｄによるシグナル伝達を阻害することができるｃ−ｓｋｉポリペプチド（ストレーブ（Ｓｕｔｒａｖｅ）ら、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖｅｌ． ４：１４６２〜１４７２、１９９０）が含まれる。
【０１２２】
細胞におけるｃ−ｓｋｉペプチド作用物質の発現は、ミオスタチンシグナル伝達を調節するために特に有用となりうる。ｃ−ｓｋｉを欠損するマウスは、骨格筋量の重度の減少を示す（バーク（Ｂｅｒｋ）ら、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖｅｌ． １１：２０２９〜２０３９、１９９７）のに対し、筋にｃ−ｓｋｉを過剰発現するトランスジェニックマウスは、劇的な筋の肥大を示す（ストレーブ（Ｓｕｔｒａｖｅ）ら、上記、１９９０）。ｃ−ｓｋｉは、ＴＧＦ−βおよびアクチビンＩＩ型受容体のシグナル伝達を媒介するＳｍａｄ２、Ｓｍａｄ３およびＳｍａｄ４を含む特定のＳｍａｄ蛋白質と相互作用してその活性を阻害する（ルオ（Ｌｕｏ）ら、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖｅｌ． １３：２１９６〜１１０６、１９９９；ストロシェイン（Ｓｔｒｏｓｃｈｅｉｎ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８６：７７１〜７７４、１９９９；サン（Ｓｕｎ）ら、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ ４：４９９〜５０９、１９９９ａ；サン（Ｓｕｎ）ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９６：１１２４４２〜１２４４７、１９９９ｂ；アキヨシ（Ａｋｉｙｏｓｈｉ）ら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７４：３５２６９、１９９９）。このように、ミオスタチン活性がＡｃｔ ＲＩＩＢ結合を通して媒介されうる本発明の開示を通して、ミオスタチンの活性またはＳｍａｄ経路を利用する如何なるＧＤＦの活性も、標的細胞におけるｃ−ｓｋｉ発現を増加または減少させることによって調節することができると認識されるであろう。
【０１２３】
本発明の方法において有用な作用物質は、上記のように細胞と接触する、または導入することができるポリヌクレオチドとなりうる。一般的に、しかし必ずしもその必要はないが、ポリヌクレオチドはそれが直接、または転写もしくは翻訳もしくはその双方の後にその機能を発揮する細胞に導入される。例えば、上記のように、ポリヌクレオチドは、細胞において発現され、ミオスタチン活性を調節するペプチド作用物質をコードすることができる。そのような発現されたペプチドは、例えば、活性なミオスタチンに切断することができない変異体プロミオスタチンポリペプチド；または変異体ミオスタチン受容体、例えば、切断型ミオスタチン受容体細胞外ドメイン；膜結合ドメインに機能的に会合するミオスタチン受容体細胞外ドメイン；または蛋白質キナーゼ活性を欠損する変異体ミオスタチン受容体となりうる。ポリペプチドを細胞に導入する方法は、下記に示され、またはそうでなければ当技術分野で既知である。
【０１２４】
本発明の方法において有用なポリヌクレオチドはまた、アンチセンス分子、リボザイム、または三重らせん形成物質となりうる、またはコードしうる。例えば、ポリヌクレオチドは、細胞におけるミオスタチンシグナル伝達を増加させるアゴニストとして作用しうるアンチセンスｃ−ｓｋｉヌクレオチド配列のようなアンチセンスヌクレオチド配列；または特定のＳｍａｄアンチセンスヌクレオチド配列に応じて、ミオスタチンシグナル伝達を増加させるアゴニストとして作用するか、もしくはミオスタチンシグナル伝達を減少または阻害するアンタゴニストとして作用しうるアンチセンスＳｍａｄヌクレオチド配列となりうる（またはコードしうる）。そのようなポリヌクレオチドは、標的細胞に直接接触させることができ、細胞に取り込まれるとそのアンチセンス、リボザイム、または三重らせん形成活性を発揮しうる；または細胞に導入されて、ポリヌクレオチドが発現されると、例えばアンチセンスＲＮＡ分子またはリボザイムを産生して、それがその活性を発揮するポリヌクレオチドによってコードされうる。
【０１２５】
アンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム、または三重らせん形成物質は、ＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列、例えばメッセンジャーＲＮＡとなりうる標的配列、コード配列、イントロン−エキソン接合部位を含むヌクレオチド配列、シャイン−ダルガルノ配列のような調節配列等となりうる標的配列と相補的である。相補性の程度は、ポリヌクレオチド、例えば、アンチセンスポリヌクレオチドが細胞における標的配列と特異的に相互作用することができる程度である。アンチセンスまたは他のポリヌクレオチドの全長に応じて、その標的配列に関するポリヌクレオチドの特異性を失うことなく、標的配列に関して一つまたは数個のミスマッチが容認されうる。このように、例えば、２０ヌクレオチドからなるアンチセンス分子では、容認されるのはあったとしても少数のミスマッチであるのに対し、例えば、細胞ポリペプチドをコードする標的ｍＲＮＡの完全長に対して相補的なアンチセンス分子のハイブリダイゼーション効率には、数個のミスマッチが影響を及ぼさないであろう。認容されうるミスマッチの数は、例えば、ハイブリダイゼーション動態を決定するために周知の式を用いて推定することができ（サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、上記、１９８９を参照のこと）、または本明細書に開示の、もしくはそうでなければ当技術分野で既知の方法を用いて、特に、細胞にアンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム、または三重らせん形成物質が存在することによって、標的配列のレベルまたは細胞における標的配列によってコードされるポリペプチドの発現が減少することを決定することによって、経験的に決定することができる。
【０１２６】
アンチセンス分子、リボザイム、または三重らせん形成物質として有用なポリヌクレオチドは、翻訳を阻害、または核酸分子を切断して、それによって細胞におけるミオスタチンシグナル伝達を調節することができる。例えば、アンチセンス分子は、ｍＲＮＡに結合して細胞において翻訳できない二本鎖分子を形成することができる。少なくとも約１５〜２５ヌクレオチドのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、それらが容易に合成され、標的配列と特異的にハイブリダイズすることができることから、それらが好ましいが、標的細胞に導入したポリヌクレオチドからより長いアンチセンス分子を発現することも可能である。アンチセンス分子として有用な特異的ヌクレオチド配列は、周知の方法、例えば遺伝子歩行法（例えば、参照として本明細書に組み入れられる、セイミヤ（Ｓｅｉｍｉｙａ）ら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２：４６３１〜４６３６（１９９７）を参照のこと）を用いて同定することができる。アンチセンス分子を標的細胞に直接接触させる場合、これは、鉄結合ＥＤＴＡのような化学反応基と機能的に会合することができ、これは、ハイブリダイゼーション部位で標的ＲＮＡを切断する。これに対して、三重らせん形成物質は、転写を停止させることができる（マヘール（Ｍａｈｅｒ）ら、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓ． Ｄｅｖｅｌ． １：２２７（１９９１）；ヘレン（Ｈｅｌｅｎｅ）、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ ６：５６９（１９９１））。このように、三重らせん形成物質は、例えば、Ｓｍａｄ遺伝子調節エレメントの配列を認識して、それによって細胞におけるＳｍａｄポリペプチドの発現を減少または阻害して、それによって標的細胞におけるミオスタチンシグナル伝達を調節するように設計することができる。
【０１２７】
本発明はまた、ミオスタチンのようなＧＤＦの細胞に及ぼす作用を変化させうる作用物質、特にＧＤＦのその細胞受容体との特異的相互作用能を変化させうる作用物質を同定する方法を提供する。そのような作用物質はＧＤＦのその受容体との特異的相互作用能を増加または減少させることによって作用することができ、したがってＧＤＦシグナル伝達をそれぞれ増加または減少させるために有用である。本発明のスクリーニング方法の例は、ミオスタチン受容体、例えばＡｃｔ ＲＩＩＡまたはＡｃｔ ＲＩＩＢのようなアクチビンＩＩ型受容体を用いて本明細書に示される。
【０１２８】
本発明のスクリーニング方法は、例えば、ミオスタチンまたはその機能的ペプチド部分、Ａｃｔ ＲＩＩＡまたはＡｃｔ ＲＩＩＢのようなミオスタチン受容体と、調べる作用物質とを、適した条件で接触させることによって実施することができる。ミオスタチン、受容体および作用物質は、所望の如何なる順序で接触させることもできる。そのため、スクリーニング方法を用いて、そのような作用物質がアゴニストまたはアンタゴニスト活性を有する、受容体に対するミオスタチンの結合を競合的または非競合的に阻害することができる物質、受容体に対するミオスタチンの結合を媒介または増強することができる作用物質、特異的に結合したミオスタチンの受容体からの解離を誘導することができる作用物質、およびそうでなければミオスタチンのシグナル伝達誘導能に影響を及ぼす作用物質を同定することができる。作用物質の作用がミオスタチンまたは他のＧＤＦ受容体に特異的であることを確認するために適当な対照反応を行う。
【０１２９】
本発明のスクリーニング方法を行うための適した条件は、本明細書に開示の方法（実施例７および９を参照のこと）、またはそうでなければ当技術分野で既知の方法を含む、ミオスタチンをその受容体と特異的に相互作用させる如何なる条件ともなりうる。このように、スクリーニングアッセイ法を行うための適した条件は、例えば実質的に精製されたミオスタチン受容体を用いるインビトロ条件；通常ミオスタチン受容体を発現する細胞、例えば脂肪細胞もしくは筋細胞、またはその表面に機能的ミオスタチン受容体を発現するように遺伝子改変されている細胞を利用する細胞培養条件；または臓器において起こるインサイチュー条件となりうる。
【０１３０】
本発明のスクリーニング方法はまた、上記の分子モデリング法を用いても行うことができる。分子モデリング法を利用することは、ＧＤＦ受容体と特異的に相互作用する可能性が最も高い、可能性がある作用物質の組み合わせライブラリのような大きい集団においてそれらの作用物質を同定するための簡便で費用効果の高い手段を提供し、それによって生物アッセイ法を用いてスクリーニングする必要がある可能性がある作用物質の数が減少する。Ａｃｔ ＲＩＩＢのようなＧＤＦ受容体と特異的に相互作用する作用物質が同定されると、選択された作用物質は、本明細書に開示の方法を用いて、細胞に及ぼすミオスタチンのようなＧＤＦの作用の調節能に関して調べることができる。
【０１３１】
試験物質のミオスタチンの作用の調節能は、本明細書に開示の方法（実施例７および９を参照のこと）を用いて、またはそうでなければ当技術分野で既知の方法を用いて検出することができる。「試験作用物質」または「試験分子」という用語は、本明細書において本発明の方法におけるアゴニストまたはアンタゴニスト活性に関して調べられる如何なる作用物質も意味するように広い意味で用いられる。方法は一般的に、本明細書に記載のアゴニストまたはアンタゴニスト作用物質として作用しうる未知分子を同定するためのスクリーニングアッセイ法として用いられるが、方法はまた、実際に特定の活性を有することが知られている作用物質が、例えば、作用物質の活性を標準化するための活性を有することを確認するために用いることができる。
【０１３２】
本発明の方法は、例えば、Ａｃｔ ＲＩＩＢ受容体を発現するように遺伝子改変されている細胞にミオスタチンを接触させること、およびミオスタチンシグナル伝達経路に関係するＳｍａｄポリペプチドの燐酸化を調べることによって、作用物質、例えばドミナントネガティブＡｃｔ ＲＩＩＢの作用を決定することによって行うことができる。望ましければ、細胞は、その発現がミオスタチンシグナル伝達経路に依存する、例えばＳｍａｄ経路の活性化に依存するレポーターヌクレオチド配列を含むようにさらに遺伝子改変することができ、試験作用物質の作用は、作用物質、ミオスタチン、またはその双方の存在下および非存在下でレポーターヌクレオチド配列の発現を比較することによって決定することができる。レポーターヌクレオチド配列の発現は、例えばレポーターヌクレオチド配列のＲＮＡ転写物を検出することによって、またはレポーターヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドを検出することによって検出することができる。ポリペプチドレポーターは、例えば、９−ラクタマーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、アデノシンデアミナーゼ、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、ハイグロマイシン−Ｂホスホトランスフェラーゼ、チミジンキナーゼ、９−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、またはキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼポリペプチド等となることができ、例えば、レポーターポリペプチドによる放射活性、発光、化学発光、蛍光、酵素活性、または特異的結合を検出することによって検出することができる。
【０１３３】
本発明のスクリーニング方法は、高処理能解析に適合させることができる長所を有し、したがって、ミオスタチンとミオスタチン受容体との特異的相互作用を変化させうる作用物質を含む、細胞に及ぼすミオスタチンの作用を調節することができる作用物質を同定するために、試験作用物質の組み合わせライブラリをスクリーニングするために用いることができる。所望の活性に関して調べることができる分子の組み合わせライブラリを調製する方法は、当技術分野で周知であり、これには例えば、拘束されたペプチドとなりうるペプチドのファージディスプレイライブラリ（例えば、そのそれぞれが参照として本明細書に組み入れられる、米国特許第５，６２２，６９９号；米国特許第５，２０６，３４７号；スコットとスミス（Ｓｃｏｔｔ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ）、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３８６〜３９０、１９９２；マークランド（Ｍａｒｋｌａｎｄ）ら、Ｇｅｎｅ １０９：１３〜１９、１９９１を参照のこと）；ペプチドライブラリ（米国特許第５，２６４，５６３号、参照として本明細書に組み入れられる）；ペプチド模倣体ライブラリ（ブロンデル（Ｂｌｏｎｄｅｌｌｅ）ら、Ｔｒｅｎｄｓ Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ． １４：８３〜９２、１９９５）；核酸ライブラリ（オコンネル（Ｏ＝Ｃｏｎｎｅｌｌ）ら、上記、１９９６；ツエルクとゴールド（Ｔｕｅｒｋ ａｎｄ Ｇｏｌｄ）、上記、１９９０；ゴールド（Ｇｏｌｄ）ら、上記、１９９５、そのそれぞれが参照として本明細書に組み入れられる）；オリゴ糖ライブラリ（ヨーク（Ｙｏｒｋ）ら、Ｃａｒｂ． Ｒｅｓ． ２８５：９９〜１２８、１９９６；リアン（Ｌｉａｎｇ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４：１５２０〜１５２２、１９９６；ディング（Ｄｉｎｇ）ら、Ａｄｖ． Ｅｘｐｔ． Ｍｅｄ． Ｂｉｏｌ． ３７６：２６１〜２６９、１９９５、そのそれぞれが参照として本明細書に組み入れられる）；リポ蛋白質ライブラリ（デクルイフ（ｄｅ Ｋｒｕｉｆ）ら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ３９９：２３２〜２３６、１９９６、参照として本明細書に組み入れられる）；糖蛋白質または糖脂質ライブラリ（カラオグル（Ｋａｒａｏｇｌｕ）ら、Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １３０：５６７〜５７７、１９９５、参照として本明細書に組み入れられる）；または例えば薬剤もしくは他の医薬品を含む化学ライブラリ（ゴードン（Ｇｏｒｄｏｎ）ら、Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ３７：１３８５〜１４０１、１９９４；エッカーとクルック（Ｅｃｋｅｒ ａｎｄ Ｃｒｏｏｋｅ）、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １３：３５１〜３６０、１９９５、そのそれぞれが参照として本明細書に組み入れられる）を作製する方法が含まれる。ポリヌクレオチドは、細胞ポリヌクレオチドを含む細胞標的に対して結合特異性を有する核酸分子は、天然に存在するため、およびそのような特異性を有する合成分子は容易に調製および合成することができるために（例えば、参照として本明細書に組み入れられる、米国特許第５，７５０，３４２号を参照のこと）、ミオスタチンとその受容体との特異的相互作用を調節することができる作用物質として特に有用となりうる。
【０１３４】
本発明の開示を考慮すると、様々な動物モデル系が本発明の方法を実践するために有用な作用物質を同定するための研究ツールとして用いることができると認識される。例えば、トランスジェニックマウスまたは他の実験動物は、本明細書に開示の様々なミオスタチン阻害剤構築物を用いて調製することができ、ヒト以外のトランスジェニック生物は、生物における特定の作用物質の様々なレベルを発現することによって生じた作用を直接決定するために調べることができる。さらに、トランスジェニック生物、例えば、トランスジェニックマウスは、他のマウス、例えば、ｏｂ／ｏｂ、ｄｂ／ｄｂ、または野鼠色の致死的な黄色の変異体マウスと交配させて、肥満、ＩＩ型糖尿病等のような障害を治療または予防するために有用なミオスタチン阻害剤の最適な発現レベルを決定することができる。そのため、本発明は、ヒト以外のトランスジェニック生物、特にミオスタチンシグナルペプチドを含みうるミオスタチンプロドメインをコードするポリヌクレオチド、または変異体プロミオスタチンポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むトランスジェニック生物を提供する。
【０１３５】
トランスジェニック動物を作製するために様々な方法が既知である。一つの方法において、前核段階での胚（「一細胞胚」）を雌性動物から採取して、胚に導入遺伝子をマイクロインジェクションする、この場合、導入遺伝子は得られた成熟動物の胚細胞と体細胞の染色体に組み込まれる。もう一つの方法において、胚性幹細胞を単離して、導入遺伝子を電気穿孔、プラスミドトランスフェクション、またはマイクロインジェクションによって幹細胞に組み込み、次に幹細胞を胚に再度導入して、そこで胚は定着して生殖系列に寄与する。哺乳類種にポリヌクレオチドをマイクロインジェクションする方法は、例えば、参照として本明細書に組み入れられる、米国特許第４，８７３，１９１号に記載されている。さらにもう一つの方法において、胚細胞を、導入遺伝子を含むレトロウイルスに感染させて、それによって胚の生殖細胞は導入遺伝子をその染色体に組み込まれる。
【０１３６】
トランスジェニックにすべき動物が鳥類である場合、鳥類の受精卵は一般的に卵管において最初の２４時間のあいだに細胞分裂を行い、したがって前核に近づくことができないために、受精卵の前核へのマイクロインジェクションは難しい。このように、トランスジェニック鳥種を作製するためにはレトロウイルス感染法が好ましい（参照として本明細書に組み入れられる、米国特許第５，１６２，２１５号を参照のこと）。しかし、鳥類の種にマイクロインジェクションを行う場合、先に産んだ卵の産卵後約２．５時間で、屠殺した雌鶏から胚を得ることができ、導入遺伝子を胚盤の細胞質にマイクロインジェクションして、胚を成熟するまで宿主の殻の中で培養する（ラブ（Ｌｏｖｅ）ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２、１９９４）。トランスジェニックにすべき動物がウシまたはブタである場合、卵が不透明であり、それによって従来の微分干渉位相差顕微鏡によって核を同定することが難しいためにマイクロインジェクションを行うことができない。この問題を克服するために、より見やすくするために卵を最初に遠心して前核を分離することができる。
【０１３７】
本発明のヒト以外のトランスジェニック動物は、ウシ、ブタ、ヒツジ、トリ、または他の動物となりうる。導入遺伝子を様々な発達段階の胚標的細胞に導入して、胚標的細胞の発達段階に応じて異なる方法を用いる。接合体は、マイクロインジェクションの最善の標的である。遺伝子移入のための標的として接合体を用いることは、初回分裂前に、注入したＤＮＡを宿主遺伝子に組み込むことができるという点において大きい長所を有する（ブリンスター（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ）ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８２：４４３８〜４４４２、１９８５）。その結果、ヒト以外のトランスジェニック動物の全ての細胞が導入遺伝子を組み込まれ、このように、生殖細胞の５０％が導入遺伝子を有するために、創始動物の子孫への導入遺伝子の効率よい伝幡に寄与する。
【０１３８】
トランスジェニック動物は、そのそれぞれが生殖に用いられる細胞内で外因性遺伝子材料を含む、二つのキメラ動物を交配することによって作製することができる。得られた子孫の２５％が、外因性遺伝子材料に関してホモ接合であるトランスジェニック動物であり、得られた動物の５０％がヘテロ接合体、かつ残りの２５％が外因性遺伝子材料を欠損し、野生型表現型を有するであろう。
【０１３９】
マイクロインジェクション法において、導入遺伝子を消化して、如何なるベクターＤＮＡも含まないように、例えばゲル電気泳動によって精製する。導入遺伝子は、機能的に会合したプロモーターを含むことができ、これは、転写に関係する細胞蛋白質と相互作用して、構成的発現、組織特異的発現、発達段階特異的発現等を提供する。そのようなプロモーターには、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、モロニー白血病ウイルス（ＭＬＶ）、およびヘルペスウイルスに由来するプロモーターと共に、メタロチオネイン、骨格アクチン、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（ＰＥＰＣＫ）、ホスホグリセレート（ＰＧＫ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、およびチミジンキナーゼ（ＴＫ）をコードする遺伝子由来のプロモーターが含まれる。ラウス肉腫ウイルスＬＴＲのようなウイルスの長末端反復（ＬＴＲｓ）も同様に用いることができる。トランスジェニックにすべき動物がトリである場合、好ましいプロモーターには、ニワトリ９−グロビン遺伝子、ニワトリライソザイム遺伝子、およびトリ白血病ウイルスのプロモーターが含まれる。胚性幹細胞のプラスミドトランスフェクションにおいて有用な構築物は、例えば、転写を刺激するためのエンハンサーエレメント、スプライスアクセプター、終了およびポリアデニル化シグナル、翻訳を行うためのリボソーム結合部位等を含むさらなる調節エレメントを用いるであろう。
【０１４０】
レトロウイルス感染法において、発達段階のヒト以外の胚をインビトロで胚盤胞段階まで培養することができる。この期間に、割球をレトロウイルス感染の標的とすることができる（ヤニク（Ｊａｅｎｉｃｈ）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７３：１２６０〜１２６４、１９７６）。透明帯を除去する酵素処理を行うと、割球の効率的な感染が得られる（ホーガン（Ｈｏｇａｎ）ら、「マウス胚の操作（ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ ）」、コールドスプリングハーバー出版、１９８６）。導入遺伝子を導入するために用いられるウイルスベクター系は典型的に、導入遺伝子を有する複製欠損レトロウイルスである（ヤーナー（Ｊａｈｎｅｒ）ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８２：６９２７〜６９３１、１９８５；ファンデルプッテン（ｖａｎ ｄｅｒ Ｐｕｔｔｅｎ）ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８２：６１４８〜６１５２、１９８５）。トランスフェクションは、ウイルス産生細胞の単層上で割球を培養することによって容易にかつ効率よく得られる（ファンデルプッテン（ｖａｎ ｄｅｒ Ｐｕｔｔｅｎ）ら、上記、１９８５；スチュワート（Ｓｔｅｗａｒｔ）ら、ＥＭＢＯ Ｊ． ６：３８３〜３８８、１９８７）。または感染はより後期の段階で行うことができる。ウイルスまたはウイルス産生細胞を割腔に注入することができる（ヤーナー（Ｊａｈｎｅｒ）ら、Ｎａｔｕｒｅ ２９８：６２３〜６２８、１９８２）。組み込みはヒト以外のトランスジェニック動物において形成される細胞のサブセットに限って起こることから、創始動物はほとんどが導入遺伝子に関してモザイクとなりうる。さらに、創始動物は、ゲノムの異なる位置で導入遺伝子の様々なレトロウイルス挿入を含みえて、これは一般的に子孫において分離されるであろう。さらに、同様に、妊娠中期胚の子宮内レトロウイルス感染によって、効率は低いものの、導入遺伝子を生殖系列に導入することも可能である（ヤーナー（Ｊａｈｎｅｒ）ら、上記、１９８２）。
【０１４１】
胚性幹細胞（ＥＳ）もまた、導入遺伝子を導入するための標的となりうる。ＥＳ細胞は、インビトロで培養して胚に融合させた着床前胚から得られる（エバンス（Ｅｖａｎｓ）ら、Ｎａｔｕｒｅ ２９２：１５４〜１５６、１９８１；ブラッドレー（Ｂｒａｄｌｅｙ）ら、Ｎａｔｕｒｅ ３０９：２５５〜２５８、１９８４；ゴスラー（Ｇｏｓｓｌｅｒ）ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８３：９０６５〜９０６９、１９８６；ロバートソン（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ）ら、Ｎａｔｕｒｅ ３２２：４４５〜４４８、１９８６）。導入遺伝子はＤＮＡトランスフェクションまたはレトロウイルス媒介形質導入によってＥＳ細胞に効率よく導入することができる。そのような形質転換したＥＳ細胞は、その後ヒト以外の動物からの胚盤胞と合わせることができる。その後ＥＳ細胞は胚に定着して、得られたキメラ動物の生殖系列に関与する（ヤニッシュ（Ｊａｅｎｉｓｃｈ）、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１４６８〜１４７４、１９８８）。
【０１４２】
本明細書に開示するように、ミオスタチンは、少なくとも部分的にＳｍａｄシグナル伝達経路を通してその活性を発揮することができ、ミオスタチン発現は様々な病態に関連しうる。そのため、本発明は、肥満およびＩＩ型糖尿病のような代謝疾患を含むミオスタチンに関連した様々な病態を治療するための新規標的を提供する。したがって、本発明は、被験者における筋細胞または脂肪組織細胞におけるミオスタチンシグナル伝達を調節することによって、病態が少なくとも部分的に、筋または脂肪組織の異常な量の発達または代謝活性を特徴とする、被験者における病態の重症度を改善する方法を提供する。
【０１４３】
ミオスタチンは、筋増殖の負の調節物質として機能する（マクフェロン（ＭｃＰｈｅｒｒｏｎ）ら、上記、１９９７）。ミオスタチンノックアウトマウスは、野生型の同腹子より体重が約２５％〜３０％多く、調べたマウスの体重のこのような増加は、もっぱら骨格筋組織重量の劇的な増加が原因であった。ミオスタチンを欠損するマウスでは、骨格筋の重量は、野生型同腹子の対応する筋の約２〜３倍であった。ホモ接合ノックアウトマウスにおけるこの筋重量の増加は、過形成と肥大の複合が原因であった。
【０１４４】
本明細書に開示するように、ヘテロ接合ミオスタチンノックアウトマウスも同様に、骨格筋重量の増加を示したが、ホモ接合変異体マウスにおいて認められた場合より程度は低く、ミオスタチンがインビボで用量依存的に作用することを示している（実施例１を参照のこと）。さらに、動物においてミオスタチンが過剰発現されると、筋の増殖に関して反対の作用を示した。例えば、ミオスタチン発現腫瘍を有するヌードマウスは、筋および脂肪重量の劇的な減少を特徴とする消耗性症候群を発症した（実施例８を参照）。ヌードマウスにおけるこの症候群は、癌またはＡＩＤＳのような慢性疾患を有する患者に起こるカヘキシア状態に類似した。
【０１４５】
ミオスタチン免疫反応材料の血清レベルは、筋の消耗に関して患者の状態と相関している（ゴンザレス−カダビド（Ｇｏｎｚａｌｅｓ−Ｋａｄａｖｉｄ）ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｍｅｄ． ＵＳＡ ９５：１４９３８〜１４９４３、１９９８、参照として本明細書に組み入れられる）。このように、全身体重の減少によって測定したカヘキシアの兆候を示すＡＩＤＳ患者は、ＡＩＤＳを有しない健常な男性、または体重が減少していないＡＩＤＳ患者のいずれかと比較してミオスタチン免疫反応材料の血清レベルがわずかに増加していた。しかし、血清試料において検出されたミオスタチン免疫反応材料が真正の処理ミオスタチンに関して予想されるＳＤＳゲル上での移動度を示さなかったことから、これらの結果の解釈は複雑である。
【０１４６】
本明細書において開示するように、ミオスタチンは、筋重量に影響を及ぼすのみならず、生物の全体的な代謝に影響を及ぼす。例えば、ミオスタチンは脂肪組織において発現され、ミオスタチン欠損マウスは、動物が年をとるにつれて、脂肪蓄積の劇的な減少を示す（実施例ＩＩおよびＩＩＩを参照のこと）。ミオスタチン作用のメカニズムは本明細書において提唱されないが、ミオスタチンの作用は、脂肪組織に及ぼすミオスタチンの直接作用となりうる、または骨格筋組織に及ぼすミオスタチン活性の欠如によって引き起こされる間接的な作用となりうる。メカニズムによらず、ミオスタチン活性の減少に反応して起こる筋組織に及ぼす全体的な同化作用は、脂肪の蓄積が５倍抑制された肥満マウス系統（野鼠致死黄色（Ａｙ）マウス）にミオスタチン変異を導入することによって証明されるように、生物の全体的な代謝を変化させて、脂肪の形でのエネルギーの保存に影響を及ぼす（実施例５を参照のこと）。異常なグルコース代謝も同様に、ミオスタチン変異を含む野鼠マウスにおいて部分的に抑制された。これらの結果は、ミオスタチンを阻害する方法が、肥満およびＩＩ型糖尿病のような代謝疾患を治療または予防するために用いることができることを証明している。
【０１４７】
本発明の方法は、例えば、癌のような慢性疾患（ノートン（Ｎｏｒｔｏｎ）ら、Ｃｒｉｔ． Ｒｅｖ． Ｏｎｃｏｌ． Ｈｅｍａｔｏｌ． ７：２８９〜３２７、１９８７）に関連したカヘキシアと共に、ＩＩ型糖尿病、肥満、および他の代謝障害のような病態を含む様々な病態の重症度を改善するために有用である。本明細書において用いられるように、「病態」という用語は、少なくとも部分的に、筋または脂肪組織の異常な量の発達または代謝活性を特徴とする障害を意味する。そのような病態には、例えば、肥満；肥満に関連した状態、例えば、アテローム性動脈硬化症、高血圧症、および心筋梗塞；筋ジストロフィー、神経筋疾患、カヘキシア、および食欲不振；ならびに一般的に肥満に関連する、しかし必ずしもその必要はないＩＩ型糖尿病のような代謝障害が含まれ、これらは本発明の方法を用いる治療に対して特に感受性がある。
【０１４８】
本明細書において用いられるように、筋または脂肪組織の発達または代謝活性の量に関連して用いられる「異常」という用語は、熟練した医師または他の当業者が正常または理想的であると認識する量の発達または代謝活性と比較して相対的な意味で用いられる。そのような正常または理想的な値は、医師にとって既知であり、対応する集団における健常者において一般的に認められる、または望ましい平均値に基づく。例えば、医師は、肥満が特定の身長および体型の人に関して「理想的な」体重範囲より約２０％上である体重に関連していることを承知しているであろう。しかし、医師は、ボディビルダーが、それ以外は対応する集団における同じ身長および体型の人に関して予想される体重より単に２０％またはそれ以上である体重を有するというだけで必ずしも肥満ではないことを認識するであろう。同様に、当業者は、筋活性が異常に減少したように思われる症状を示す患者が例えば、患者に様々な筋力テストを行って、対応する集団における平均的な健常者について予想される結果と比較することによって、異常な筋発達を有すると同定されうることを承知しているであろう。
【０１４９】
本発明の方法は、少なくとも部分的に、病態の病因に関連した筋または脂肪組織細胞におけるミオスタチンシグナル伝達を調節することによって、筋または脂肪組織における異常な量の発達または代謝活性を特徴とする病態の重症度を改善することができる。本明細書において用いられるように、病態の重症度に関連して用いられる「改善する」という用語は、病態に関連した兆候または症状が弱められることを意味する。モニターすべき兆候または症状は、特定の病態の特徴であり、兆候および疾患をモニターする方法と同様に当業者に周知である。例えば、病態がＩＩ型糖尿病である場合、当業者は被験者におけるグルコースレベル、グルコース排泄速度等をモニターすることができる。病態が肥満またはカヘキシアである場合、医師は単に被験者の体重をモニターするだけでよい。
【０１５０】
被験者に投与すべき作用物質は、標的細胞と作用物質との接触、適当であれば、細胞への流入を促進する条件で投与される。ポリヌクレオチド作用物質の細胞への流入は、例えば、細胞に感染しうるウイルスベクターにポリヌクレオチドを組み込むことによって促進されうる。細胞タイプ特異的ウイルスベクターが利用できない場合、標的細胞上に発現されたリガンドに特異的な受容体（またはリガンド）を発現するようにベクターを改変することができ、またはそのようなリガンド（または受容体）を含むように改変することができるリポソームに封入することができる。ペプチド作用物質は、ペプチドの細胞への転位を促進することができるヒト免疫不全ウイルスＴＡＴ蛋白質形質導入ドメインのような蛋白質形質導入ドメインを含むようにペプチドを操作することを含む、様々な方法によって細胞に導入することができる（シュワルツ（Ｓｃｈｗａｒｚｅ）ら、上記１９９９；デロッシ（Ｄｅｒｏｓｓｉ）ら、上記、１９９６を参照のこと）。
【０１５１】
標的細胞における作用物質の存在は、例えば、作用物質に検出可能な標識を機能的に結合することによって、作用物質、特にペプチド作用物質に特異的な抗体を用いることによって、または作用物質による下流の作用、例えば細胞におけるＳｍａｄポリペプチドの燐酸化の減少を検出することによって、直接同定することができる。作用物質は、参照として本明細書に組み入れられる、当技術分野で周知の方法（ハーマンソン（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ）、「バイオ結合技術（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）」、アカデミック出版、１９９６）を用いて検出できるように標識することができる；同様に、ハーロウとレーン（Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ）、上記、１９８８も参照のこと。例えば、ペプチドまたはポリヌクレオチド作用物質は、放射標識、アルカリホスファターゼのような酵素、ビオチン、蛍光色素等を含む様々な検出可能部分によって標識することができる。作用物質がキットに含まれる場合、作用物質を標識するための試薬も同様にキットに含めることができ、または試薬を個別に販売元から購入することができる。
【０１５２】
本発明の方法において有用な作用物質は、病態の部位に投与することができ、または標的細胞にポリヌクレオチドまたはペプチドを提供する如何なる方法によって投与することもできる。本明細書において用いられるように、「標識細胞」という用語は、作用物質に接触させる筋細胞または脂肪細胞を意味する。生きている被験者に投与する場合、作用物質は一般的に、被験者への投与に適した薬学的組成物として調製される。このように、本発明は、細胞におけるミオスタチンシグナル伝達を調節するために有用な作用物質を薬学的に許容される担体において含む薬学的組成物を提供する。そのため、作用物質は、本明細書に定義される病態を有する被験者を治療するための薬剤として有用である。
【０１５３】
薬学的に許容される担体は当技術分野で周知であり、例えば、水もしくは生理食塩液のような水溶液、またはグリコール、グリセロール、オリーブ油のような油、または注射可能有機エステルのような他の溶媒または媒体が含まれる。薬学的に許容される担体は、例えば、結合体を安定化させる、または結合体の吸収を増加させるように作用する生理的に許容される化合物を含みうる。そのような生理的に許容される化合物には、例えばグルコース、蔗糖、またはデキストランのような糖質、アスコルビン酸またはグルタチオンのような抗酸化剤、キレート化剤、低分子量蛋白質、または他の安定化剤もしくは賦形剤が含まれる。当業者は、生理的に許容される化合物を含む薬学的に許容される担体の選択が、例えば治療物質の物理化学的特徴、ならびに例えば、経口または静脈内のような非経口となりうる組成物の投与経路、および注入、挿管、またはその他の当技術分野で既知のそのような方法に依存することを承知しているであろう。薬学的組成物はまた、診断試薬、栄養物質、毒素、または例えば癌化学療法剤のような治療物質のような二次試薬を含みうる。
【０１５４】
作用物質は、水中油型乳剤、微小乳剤、ミセル、混合ミセル、リポソーム、ミクロスフェアまたは他のポリマーマトリクスのような封入材料に組み込まれることができる（例えば、そのそれぞれが参照として本明細書に組み入れられる、グレゴリアディス（Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ）、「リポソームの技術（ Ｌｉｐｏｓｏｍｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ）」、第１巻（ＣＲＣ出版、ボカレートン、フロリダ州、１９８４）；フラレー（Ｆｒａｌｅｙ）ら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｓｃｉ． ６：７７（１９８１）を参照のこと）。例えば、燐脂質または他の脂質からなるリポソームは、作製および投与が比較的単純である非毒性の生理的に許容される代謝可能な担体である。「ステルス」リポソーム（例えば、そのそれぞれが参照として本明細書に組み入れられる、米国特許第５，８８２，６７９号；第５，３９５，６１９号；および第５，２２５，２１２号を参照のこと）は、本発明の方法を実践するために有用な薬学的組成物を調製するために特に有用なそのような封入材料の例であり、他の「マスクされた」リポソームも同様に用いることができ、そのようなリポソームは治療物質が循環中に残っている時間を延長させる。例えば、陽イオンリポソームも同様に特異的受容体またはリガンドによって改変することができる（モリシタ（Ｍｏｒｉｓｈｉｔａ）ら、Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ９１：２５８０〜２５８５（１９９３）、参照として本明細書に組み入れられる）。さらに、ポリヌクレオチド作用物質は例えば、アデノウイルス−ポリリジンＤＮＡ複合体を用いて細胞に導入することができる（例えば、参照として本明細書に組み入れられる、ミカエル（Ｍｉｃｈａｅｌ）ら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６８：６８６６〜６８６９（１９９３）を参照のこと）。
【０１５５】
ミオスタチンシグナル伝達を変化させる作用物質を含む薬学的組成物の投与経路は、部分的にその分子の化学構造に依存するであろう。例えば、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、経口投与すると消化管において分解され得るために特に有用ではない。しかし、ポリペプチドを化学的に修飾する、例えば内因性プロテアーゼによる分解をあまり受けないようにする、または消化管の中でより吸収可能にする方法は周知である（例えば、ブロンデル（Ｂｌｏｎｄｅｌｌｅ）ら、上記、１９９５；エッカーとクルック（Ｅｃｋｅｒ ａｎｄ Ｃｒｏｏｋ）、上記、１９９５）。さらに、ペプチド作用物質は、Ｄ−アミノ酸を用いて調製することができ、またはペプチドドメインの構造を模倣する有機物質であるペプチド模倣体に基づく、またはビニル様（ｖｉｎｙｌｏｇｏｕｓ）ペプトイドのようなペプトイドに基づく一つまたはそれ以上のドメインを含みうる。
【０１５６】
本明細書において開示される薬学的組成物は、例えば、経口、もしくは静脈内、筋肉内、皮下、眼窩内、嚢内、腹腔内、直腸内、大槽内、のような非経口投与を含む様々な経路によって、または例えば、皮膚パッチもしくは経皮イオントフォレーシスを用いてそれぞれ皮膚を通しての受動吸収または吸収促進によって個体に投与することができる。さらに、薬学的組成物は、注入、挿管、経口、または局所投与によって投与することができ、後者は、例えば、軟膏を直接適用することによって受動的に、または例えば組成物の一つの成分が適当な噴射剤である点鼻スプレーまたは吸入剤を用いて能動的となりうる。薬学的組成物はまた、病態の部位に、例えば静脈内、または腫瘍に血液を供給する血管への動脈内に投与することができる。
【０１５７】
本発明の方法の実践において投与される作用物質の全量は、ボーラスとして、または比較的短時間の注入のいずれかとして単回投与として被験者に投与することができ、または多数回投与を長期間にわたって行う分割治療プロトコールを用いて投与することができる。当業者は、被験者における病態を治療するための薬学的組成物の量は、被験者の年齢および全身健康状態と共に投与経路および投与すべき治療回数を含む多くの要因に依存することを知っているであろう。これらの要因を考慮して、当業者は特定の用量を必要に応じて調節するであろう。一般的に、薬学的組成物の調製および投与経路および投与回数は、フェーズＩおよびフェーズＩＩ臨床試験を用いて最初に決定される。
【０１５８】
薬学的組成物は、錠剤、または溶液もしくは懸濁液のような経口投与のために調製することができる；または腸内、または非経口適用に適した有機もしくは無機担体または賦形剤との混合物を含みうる、例えば錠剤、ペレット、カプセル剤、坐剤、溶液、乳液、懸濁液、または用途に適した他の剤形のための通常の非毒性の薬学的に許容される担体と混合することができる。担体は、上記の他に、グルコース、乳糖、マンノース、アカシアゴム、ゼラチン、マンニトール、デンプンペースト、三ケイ酸マグネシウム、タルク、コーンスターチ、ケラチン、コロイドシリカ、ジャガイモデンプン、尿素、中等度の長さのトリグリセリド、デキストラン、および調製物を製造するために用いるのに適した他の担体を、固体、半固体、または液体型で含みうる。さらに補助剤、安定化剤、濃化剤、または着色剤および香料、例えばトリウロースのような安定化乾燥剤を用いることができる（例えば、米国特許第５，３１４，６９５号を参照のこと）。
【０１５９】
本発明はまた、被験者における筋組織または脂肪組織の増殖を調節する方法を提供する。本明細書に開示するように、Ａｃｔ ＲＩＩＡおよびＡｃｔ ＲＩＩＢのようなＧＤＦ受容体は、筋組織および脂肪組織形成に関係しているミオスタチンのようなＧＤＦの作用を媒介することに関係している。このように、一つの態様において、筋組織または脂肪組織の増殖を調節する方法には、アクチビン受容体、例えばＡｃｔ ＲＩＩＡまたはＡｃｔ ＲＩＩＢのようなＧＤＦ受容体からのシグナル伝達に影響を及ぼすことが含まれる。そのような方法は、組織の細胞を、ドミナントネガティブ活性、構成的活性等を有する変異体ＧＤＦ受容体に接触させること、または細胞にそれらを発現させることによって行うことができる。
【０１６０】
もう一つの態様において、生物における筋組織または脂肪組織の増殖を調節する方法は、ミオスタチンシグナル伝達に影響を及ぼす作用物質を生物に投与することによって行われる。好ましくは、作用物質は、そのいずれかがミオスタチンシグナルペプチドを含みうるミオスタチンプロドメインまたは変異体プロミオスタチンポリペプチドである、またはそれらをコードする。本明細書において用いられるように、「増殖」という用語は、本発明の方法を行っていない対応する生物と比較して本発明の方法を行った生物における筋組織重量または脂肪組織重量について言及する場合に相対的な意味において用いられる。このように、本発明の方法が、ミオスタチンシグナル伝達が減少または阻害されるように行われる場合、ミオスタチンシグナル伝達がそのように影響を受けていない対応する生物の筋重量と比較して、生物における筋組織の増殖によって生物において筋重量が増加すると認識されるであろう。
【０１６１】
本発明の方法は、生物の筋重量を増加させる、または脂肪含有量を減少させる、または双方にとって有用となりうる。例えば、そのような方法を食品源として有用である生物に行う場合、食品の蛋白質含有量は増加して、コレステロールレベルは減少し、食品の質が改善されうる。本発明の方法はまた、生物が環境においてあまり競合できないように、生物、例えば環境にとって有害が生物、における筋組織の増殖を減少させるためにも有用となりうる。このように、本発明の方法は、脊椎生物、例えば、哺乳類、鳥類、もしくは魚類を含む、ミオスタチンを発現する如何なる真核生物についても行うことができ、または無脊椎生物、例えば、軟体動物、棘皮動物、腹足類、もしくは頭状体となりうる。
【０１６２】
作用物質は、本明細書に開示のように、ミオスタチンシグナル伝達を変化させる如何なる作用物質となりうる、かつ従来の如何なる方法で生物に投与することもできる。例えば、治療すべき生物が水槽で養殖される魚、エビ、ホタテガイ等である場合、作用物質は生物が維持される水に加えるか、または特に作用物質が水溶性ペプチドまたは有機低分子である場合には、その飼料に加えることができる。
【０１６３】
本発明の方法において用いられる作用物質がペプチド作用物質、アンチセンス物質等をコードするポリヌクレオチドである場合、ポリヌクレオチドを含むヒト以外の生物の生殖細胞を選択して、作用物質を発現するトランスジェニック生物を作製することができる。好ましくは、ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドによってコードされる作用物質が、ある時点で望ましい期間発現されうるように、誘導型調節エレメントの制御下に置かれる。したがって、本発明は、ヒト以外のトランスジェニック生物と共に、これらの生物によって産生される食品を提供する。そのような食品は、筋組織における増加のために栄養的価値が増加している。ヒト以外のトランスジェニック動物は、ウシ、ブタ、ヒツジ、ニワトリ、七面鳥、および魚を含む脊椎生物、ならびにエビ、イセエビ、カニ、ヤリイカ、カキ、およびアワビのような無脊椎生物を含む本明細書に開示の如何なる種ともなりうる。
【０１６４】
ＴＧＦ−９ファミリーメンバーの調節および細胞表面受容体との特異的相互作用は解明されつつある。このように、ＴＧＦ−９ファミリーメンバーのプロドメインとＴＧＦ−９ファミリーの別のメンバーの成熟領域との同時発現は、細胞内二量体形成に関連して、生物活性ホモダイマーの分泌が起こる（グレイ（Ｇｒａｙ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１３２８、１９９０）。例えば、ＢＭＰ−４成熟領域と共にＢＭＰ−２プロドメインを用いることによって、成熟ＢＭＰ−４の発現は劇的に改善された（ハモンズ（Ｈａｍｍｏｎｄｓ）ら、Ｍｏｌ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． ５：１４９、１９９１）。調べるファミリーメンバーのほとんどに関して、ホモダイマー種は生物活性であるが、インヒビン（リング（Ｌｉｎｇ）ら、Ｎａｔｕｒｅ ３２１：７７９、１９８６）およびＴＧＦ−９（チェイフェツ（Ｃｈｅｉｆｅｔｚ）ら、Ｃｅｌｌ ４８：４０９、１９８７）のような他のファミリーメンバーの場合、ヘテロダイマーも同様に検出されており、それぞれのホモダイマーとは異なる生物学的特性を有するように思われる。
【０１６５】
受容体−リガンド相互作用研究によって、細胞が外部刺激に対してどのように反応するかに関して膨大な量の情報が明らかになり、エリスロポエチン、コロニー刺激因子、およびＰＤＧＦのような治療的に重要な化合物が開発された。このように、ＴＧＦ−９ファミリーメンバーの作用を媒介する受容体を同定するために継続的な努力が行われている。本明細書に開示のように、ミオスタチンは、アクチビンＩＩ型受容体と特異的に相互作用する。この相互作用の同定は、農業およびヒト治療目的にとって、例えば肥満、ＩＩ型糖尿病、およびカヘキシアのような様々な病態を治療するために有用なアンタゴニストおよびアゴニストを同定するための標的を提供する。この特異的相互作用の同定はまた、他のミオスタチン受容体のみならず、他の増殖分化因子の特異的受容体を同定する手段を提供する。したがって、本発明は、ＧＤＦまたは複数のＧＤＦの組み合わせ、例えばミオスタチン、ＧＤＦ−１１もしくはその双方と特異的に相互作用するＧＤＦ受容体を提供する。
【０１６６】
本発明のＧＤＦ受容体の例は、本明細書において、ミオスタチンおよびＧＤＦ−１１と特異的に相互作用するミオスタチン受容体、特にアクチビンＩＩ型受容体である。しかし、ミオスタチンと特異的に相互作用するがＧＤＦ−１１とは相互作用しないミオスタチン受容体も、ＧＤＦ−１１と特異的に相互作用するがミオスタチンとは相互作用しないＧＤＦ−１１受容体等と同様に本発明に含まれる。考察を簡便にするために、本発明の受容体は、本明細書において一般的に「ＧＤＦ受容体」と呼ばれ、その例は、少なくともミオスタチンと特異的に相互作用する受容体であるミオスタチン受容体である。そのため、ミオスタチン受容体とミオスタチンとの特異的に相互作用に関して言及するが、本開示は、ＧＤＦ−１１と少なくとも特異的に相互作用するＧＤＦ−１１受容体を含む如何なるＧＤＦ受容体もより広い意味で含む。
【０１６７】
ＧＤＦ受容体ポリペプチドを発現する組換え型細胞株もまた、受容体に特異的に結合する抗体、受容体をコードする実質的に精製されたポリヌクレオチド、および実質的に精製されたＧＤＦ受容体ポリペプチドと同様に提供される。例えば、本明細書に開示するように、ミオスタチンと細胞のミオスタチン受容体との特異的相互作用を変化させうるミオスタチン受容体のようなＧＤＦ受容体の可溶性の細胞外ドメイン；細胞におけるＧＤＦシグナル伝達を誘導、刺激、またはそうでなければ維持することができるＧＤＦ受容体の構成的に活性な細胞内キナーゼドメイン；またはミオスタチンもしくは他のＧＤＦシグナル伝達の調節能を有するＧＤＦ受容体の他の切断部分を含む、ＧＤＦ受容体のペプチド部分も同様に提供される。
【０１６８】
本発明はまた、ヌクレオチドプローブまたは抗体プローブを用いて発現ライブラリとなりうるゲノムまたはｃＤＮＡライブラリをスクリーニングする方法；例えばミオスタチンまたはその機能的ペプチド部分のようなＧＤＦを用いて、それらに反応性であり、したがって受容体を発現する細胞をスクリーニングする方法；例えば、ＧＤＦペプチドを一つのハイブリッド成分として、かつＧＤＦに対する受容体を発現する細胞から調製したｃＤＮＡライブラリから発現されたペプチドを第二のハイブリッドの成分として用いる上記のようなツーハイブリッドアッセイ法等を含む、ＧＤＦ受容体ポリペプチドを同定する方法も提供する。
【０１６９】
上記のように、ＧＤＦ受容体、例えば、Ａｃｔ ＲＩＩＢのようなミオスタチン受容体と特異的に相互作用する作用物質は、そのような作用物質をスクリーニングするために受容体を用いて同定することができる。逆に、Ａｃｔ ＲＩＩＢ受容体のようにミオスタチン受容体との特異的相互作用能を有すると同定された作用物質を用いて、さらなるミオスタチン受容体または他のＧＤＦ受容体をスクリーニングすることができる。そのような方法は、作用物質のような成分（またはミオスタチンもしくは他のＧＤＦ）と、切断型膜結合受容体または可溶性受容体となりうるＧＤＦ受容体を発現する細胞とを、作用物質（またはＧＤＦ）と受容体とを特異的に相互作用させるために十分な条件でインキュベートすること、受容体に結合した作用物質（またはＧＤＦ）を測定すること、および受容体を単離することを含みうる。上記のような分子モデリング法もまた、ＧＤＦ受容体またはその機能的ペプチド部分を同定するスクリーニング方法として有用となりうる。
【０１７０】
動物の体細胞および生殖細胞に含まれる導入遺伝子によって表現型が付与される、ＧＤＦ受容体の発現を特徴とする表現型を有するヒト以外のトランスジェニック動物も同様に提供される。導入遺伝子は、ＧＤＦ受容体、例えばミオスタチン受容体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。そのようなトランスジェニック動物を作製する方法は、本明細書に開示され、またはそうでなければ当技術分野で既知である。
【０１７１】
本発明は、ＧＤＦ受容体の全てまたはペプチド部分をコードする実質的に精製されたポリヌクレオチドを提供する。ＧＤＦ受容体の例は、本明細書においてアクチビンＩＩ型受容体であるが、アクチビンＩＩ型受容体をコードするポリヌクレオチドは既に記述されている（米国特許第５，８８５，７９４号）。このように、そのようなアクチビンＩＩ型受容体は本発明に含まれないと認識すべきである（マッサーグ（Ｍａｓｓａｇｕｅ）、上記、１９９８；ヘルディン（Ｈｅｌｄｉｎ）ら、上記、１９９７）。同様に、Ａｃｔ ＲＩＢを含むアクチビンＩ型受容体；ＴＧＦ−９ ＲＩおよびＴＧＦ−９ ＲＩＩを含むＴＧＦ−９受容体；ならびにＢＭＰ ＲＩＡ、ＢＭＰ ＲＩＢ、およびＢＭＰ ＲＩＩを含むＢＭＰ受容体が記述され、当技術分野において周知であり（マッサーグ（Ｍａｓｓａｇｕｅ）、上記、１９９８；ヘルディン（Ｈｅｌｄｉｎ）ら、上記、１９９７）、したがって、本発明のＧＤＦ受容体に含まれない。
【０１７２】
本発明のポリヌクレオチドは、ミオスタチン受容体活性、例えば、ミオスタチン結合活性を有するポリペプチドをコードしうる、または変異体ミオスタチン受容体、例えば、変異体がドミナントネガティブミオスタチン受容体として作用しうる、キナーゼドメインに変異を有する変異体ミオスタチン受容体をコードしうる（上記参照）。このように、本発明のポリヌクレオチドは、天然に存在する、合成、または意図的に操作されたポリヌクレオチドとなりうる。例えば、ｍＲＮＡ配列の一部を、交互のＲＮＡスプライシングパターン、またはＲＮＡ転写のために交互のプロモーターを用いることによって変化させることができる。もう一つの例として、ポリヌクレオチドに部位特異的変異誘発を行うことができる。ポリヌクレオチドはまたアンチセンスヌクレオチド配列となりうる。本発明のＧＤＦ受容体ポリヌクレオチドには、遺伝子コードの縮重である配列が含まれる。天然のアミノ酸は２０個存在し、そのほとんどが１個を超えるコドンによって示される。したがって、ポリヌクレオチドによってコードされるＧＤＦ受容体ポリペプチドのアミノ酸配列が機能的に不変である限り、全ての縮重ヌクレオチド配列が本発明に含まれる。同様に、ミオスタチン受容体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列も含まれる。
【０１７３】
本発明のＧＤＦ受容体をコードするポリヌクレオチドのオリゴヌクレオチド部分も同様に、本発明に含まれる。そのようなオリゴヌクレオチドは、一般的に、オリゴヌクレオチドが受容体をコードするポリヌクレオチドと選択的にハイブリダイズするために十分な長さである少なくとも約１５塩基、および長さが少なくとも約１８ヌクレオチドまたは２１ヌクレオチドもしくはそれ以上となりうる。本明細書において用いられるように、「選択的ハイブリダイゼーション」または「選択的にハイブリダイズする」という用語は、中等度にストリンジェント、または関連するヌクレオチド配列を無関係なヌクレオチド配列と区別することができる高ストリンジェントな生理条件でのハイブリダイゼーションを意味する。
【０１７４】
核酸ハイブリダイゼーション反応において、特定のレベルのストリンジェンシーを得るために用いられる条件は、ハイブリダイズする核酸の特性に応じて変化するであろう。例えば、長さ、相補性の程度、ヌクレオチド配列組成（例えば、相対的ＧＣ：ＡＴ含有量）、および核酸のタイプ、すなわちオリゴヌクレオチドまたは標的核酸配列がＤＮＡまたはＲＮＡであるか否かを、ハイブリダイゼーション条件を選択するために考慮することができる。さらなる検討は、核酸の一つが例えばフィルター上に固定されているか否かである。適当なストリンジェンシー条件を選択する方法は、経験的に決定するか、または様々な公式を用いて推定することができ、当技術分野で周知である（例えば、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、上記、１９８９を参照のこと）。
【０１７５】
進行的により高いストリンジェンシー条件の例は以下の通りである：ほぼ室温で２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ（ハイブリダイゼーション条件）；ほぼ室温で０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ（低ストリンジェンシー条件）；約４２℃で０．２×ＳＳＣ／０．１％（中等度のストリンジェンシー条件）；および約６８℃で０．１×ＳＳＣ（高ストリンジェンシー条件）。洗浄は、これらの条件の一つのみ、例えば高ストリンジェンシー条件を用いて行うことができ、またはそれぞれの条件を例えば、記載の段階の一部または全てを上記に記載した順序で、それぞれ１０〜１５分間繰り返すことができる。
【０１７６】
本発明のＧＤＦ受容体コードポリヌクレオチドは、いくつかの方法のいずれにによっても得ることができる。例えば、ポリヌクレオチドは、当技術分野で周知であるように、ハイブリダイゼーションまたはコンピューターに基づく技術を用いて単離することができる。これらの方法には、以下が含まれるがこれらに限定されない：１）相同なヌクレオチド配列を検出するためにゲノムまたはｃＤＮＡライブラリとプローブとのハイブリダイゼーション；２）共有する構造特徴を有するクローニングしたＤＮＡ断片を検出するために発現ライブラリの抗体スクリーニング；３）関係するＤＮＡ配列とアニーリングすることができるプライマーを用いるゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）；４）類似の配列に関する配列データベースのコンピューター検索（上記を参照）；５）サブトラクトＤＮＡライブラリの示差スクリーニング；および６）例えば、ハイブリッドの一つに成熟ＧＤＦペプチドを用いるツーハイブリッドアッセイ法。
【０１７７】
アクチビン受容体がミオスタチンと特異的に相互作用するという本発明の開示を考慮すると、アクチビン受容体をコードする配列、例えば、ミオスタチンに結合する細胞外ドメインをコードする配列に基づいてオリゴヌクレオチドプローブを設計することができ、これを用いて、ミオスタチンに反応する筋細胞または脂肪細胞のような細胞から調製したライブラリをスクリーニングすることができ、このようにミオスタチン受容体をコードするポリヌクレオチドの同定が容易になる。選択したクローンは例えば、発現ベクターにインサートをサブクローニングして、クローニングした配列を発現させた後、発現されたポリペプチドをミオスタチンを用いてスクリーニングすることによってさらにスクリーニングすることができる。
【０１７８】
本発明のポリヌクレオチド、例えば、ミオスタチン受容体をコードするポリヌクレオチドは、哺乳類、鳥類、もしくは魚類種を含む脊椎動物種または無脊椎動物種に由来しうる。核酸ハイブリダイゼーションに依存するスクリーニング技法を用いれば、適当なプローブが利用できる限り、如何なる生物からの如何なる遺伝子配列の単離も可能である。調べる蛋白質をコードする配列の一部に対応するオリゴヌクレオチドプローブは、化学合成することができる。これには、アミノ酸配列の短いオリゴペプチド枝が既知である必要がある。受容体をコードするポリヌクレオチド配列は、遺伝子コードの縮重を考慮に入れて、遺伝子コードから推定することができる。このように、配列が縮重している場合には、混合したさらなる反応を行うことができる。これには、変性二本鎖ＤＮＡの異種混合物が含まれる。そのようなスクリーニングに関して、ハイブリダイゼーションは、好ましくは一本鎖ＤＮＡまたは変性二本鎖ＤＮＡのいずれかについて行われる。ハイブリダイゼーションは、関係するポリペプチドに関連して存在するｍＲＮＡ配列の量が極めて少ない起源に由来するｃＤＮＡの検出において特に有用である。このように、非特異的結合を回避することをねらいとしストリンジェントなハイブリダイゼーション条件を用いることによって、オートラジオグラフィーによる可視化を用いて、混合物において標的ＤＮＡと、標的核酸の完全な相補体であるオリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーションによって特異的ｃＤＮＡクローンを同定することができる（ワラス（Ｗａｌｌａｃｅ）ら、Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ９：８７９、１９８１、参照として本明細書に組み入れられる）。または、サブトラクティブライブラリを用いて、それによって非特異的ｃＤＮＡクローンを除去することができる。
【０１７９】
所望のポリペプチドの完全なアミノ酸配列がわかっていない場合、ＤＮＡ合成の直接合成は可能ではなく、選択される方法はｃＤＮＡ配列の合成である。関係するｃＤＮＡ配列を単離する標準的な技法は、ライブラリが高レベル遺伝子発現を有するドナー細胞に豊富に存在するｍＲＮＡの逆転写に由来する、プラスミドまたはファージにおいて調製したｃＤＮＡライブラリの形成である。ポリメラーゼ連鎖反応技術と組み合わせて用いる場合、まれな発現産物でさえクローニングすることができる。ポリペプチドのアミノ酸配列の有意な部分がわかっている場合、標的ｃＤＮＡに存在すると思われる配列を複製する標識一本鎖もしくは二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡプローブ配列の産生を、一本鎖型に変性されているｃＤＮＡのクローニングしたコピー上で行われるハイブリダイゼーション技法に用いることができる（ジェイ（Ｊａｙ）ら、Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． １１：２３２５、１９８３、参照として本明細書に組み入れられる）。
【０１８０】
ラムダｇｔ１１ライブラリのようなｃＤＮＡ発現ライブラリは、ＧＤＦ受容体に特異的な抗体、例えば抗Ａｃｔ ＲＩＩＢ抗体を用いてＧＤＦ受容体ペプチドに関してスクリーニングすることができる。抗体はポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体となりえて、これを用いてＧＤＦ受容体ｃＤＮＡの存在を示す発現産物を検出することができる。そのような発現ライブラリも同様に、ミオスタチン受容体のミオスタチン結合ドメインの少なくとも一部をコードするクローンを同定するために、ＧＤＦペプチド、例えばミオスタチン、またはその機能的ペプチド部分によってスクリーニングすることができる。
【０１８１】
変異体ＧＤＦ受容体および変異体ＧＤＦ受容体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも同様に本発明に含まれる。ＧＤＦ受容体をコードするポリヌクレオチドにおける変化は、点突然変異、ナンセンス（ＳＴＯＰ）変異、ミスセンス変異、スプライス部位変異またはフレームシフトのような遺伝子内変異となりえて、ヘテロ接合またはホモ接合欠失となりうる、および天然に存在する変異となりうる、または例えば組換えＤＮＡ方法を用いて操作することができる。そのような変化は、ヌクレオチド配列解析、サザンブロット解析、多重ＰＣＲもしくは配列タグ部位（ＳＴＳ）解析のようなＰＣＲに基づく解析、またはインサイチューハイブリダイゼーション解析を含むがこれらに限定されない当業者に既知の標準的な方法を用いて検出することができる。ＧＤＦ受容体ポリペプチドは、標準的なＳＤＳ−ＰＡＧＥ、免疫沈降解析、ウェスタンブロット解析等によって解析することができる。変異体ＧＤＦ受容体の例は、その同源のＧＤＦに対する特異的結合能を有しうるが、キナーゼドメインを欠損する可溶性細胞外ドメイン；構成的キナーゼ活性を示すことができる細胞内ＧＤＦ受容体キナーゼドメイン含む切断型ＧＤＦ受容体；と共に受容体のキナーゼ活性または受容体のリガンド結合能を破壊する点突然変異を含むＧＤＦ受容体等である。そのようなＧＤＦ受容体変異体は、ＧＤＦシグナル伝達を調節するために有用であり、したがって、本発明の様々な方法を実践するために有用である。
【０１８２】
ＧＤＦ受容体をコードするポリヌクレオチドは、適した宿主細胞にポリヌクレオチドを導入することによって、インビトロで発現することができる。「宿主細胞」は、特定のベクターを増殖させることができる、および適当であれば、ベクターに含まれるポリヌクレオチドが発現されうる如何なる細胞となりうる。「宿主細胞」という用語には、当初の宿主細胞の如何なる子孫も含まれる。宿主細胞の全ての子孫は、例えば複製の際に起こる変異のために親細胞とは同一でなくてもよいと理解される。しかし、「宿主細胞」という用語が用いられる場合、そのような子孫は含まれる。本発明の導入されたポリヌクレオチドを一過的または安定に含む宿主細胞を得る方法は当技術分野で周知である。
【０１８３】
本発明のＧＤＦ受容体ポリヌクレオチドは、クローニングベクターまたは組換え発現ベクターとなりうるベクターに挿入することができる。「組換え発現ベクター」という用語は、ポリヌクレオチド、特に本発明に関連してＧＤＦ受容体の全てまたはペプチド部分をコードするポリヌクレオチドの挿入または組み込みによって操作されている当技術分野において既知のプラスミド、ウイルス、または他の媒体を意味する。そのような発現ベクターは、宿主の挿入された遺伝子配列の効率よい転写を促進するプロモーター配列を含む。発現ベクターは、一般的に、複製開始点、プロモーターと共に、形質転換細胞の表現型選択を可能にする特異的遺伝子を含む。本発明において用いるのに適したベクターには、細菌における発現のためのＴ７に基づく発現ベクター（ローゼンバーグ（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ）ら、Ｇｅｎｅ ５６：１２５、１９８７）、哺乳類細胞における発現のためのｐＭＳＸＮＤ発現ベクター（リーとナタンス（Ｌｅｅ ａｎｄ Ｎａｔｈａｎｓ）、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６３：３５２１、１９８８）、および昆虫細胞における発現のためのバキュロウイルス由来ベクターが含まれるがこれらに限定されない。ＤＮＡセグメントは、ベクターにおいて、調節エレメント、例えばＴ７プロモーター、メタロチオネインＩプロモーター、ポリヘドリンプロモーター、または望ましければ特に組織特異的プロモーターもしくは誘導型プロモーターのような他のプロモーターとなりうるプロモーターに機能的に結合して存在しうる。
【０１８４】
ＧＤＦ受容体をコードするポリヌクレオチド配列は、原核細胞または真核細胞のいずれかにおいて発現させることができる。宿主には、微生物、酵母、昆虫および哺乳類生物が含まれうる。真核生物配列またはウイルス配列を有するポリヌクレオチドを原核生物において発現させる方法は、宿主において発現および複製することができる生物学的に機能的なウイルスおよびプラスミドＤＮＡベクターと同様に、当技術分野で周知である。本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクターを構築する方法は、例えば、ポリヌクレオチドが特定の細胞タイプまたは特定の条件で選択的に発現されるか否かを含む、転写または翻訳制御シグナルを選択する場合に検討される要因と同様に周知である（例えば、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、上記、１９８９を参照のこと）。
【０１８５】
ＧＤＦ受容体コード配列を発現させるために、組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、またはコスミドＤＮＡ発現ベクターによって形質転換した細菌のような微生物；組換え酵母発現ベクターによって形質転換した酵母細胞；カリフラワーモザイクウイルスもしくはタバコモザイクウイルスのような発現ベクターを感染させた、またはＴｉプラスミドのような組換えプラスミド発現ベクターによって形質転換した植物細胞系；バキュロウイルスのような組換えウイルス発現ベクターを感染させた昆虫細胞；レトロウイルス、アデノウイルス、またはワクシニアウイルスベクターのような組換えウイルス発現ベクターを感染させた動物細胞系；および安定に発現されるように遺伝子操作された形質転換動物細胞系を含むがこれらに限定されない、多様な宿主細胞／発現ベクター系を利用することができる。発現されたＧＤＦ受容体が、例えばグリコシル化によって翻訳後改変される場合、所望の改変を行うことができる宿主細胞／発現ベクター系、例えば、哺乳類宿主細胞／発現ベクター系を選択すると特に有利となりうる。
【０１８６】
用いる宿主細胞／ベクター系に応じて、構成的および誘導型プロモーター、転写エンハンサーエレメント、転写ターミネータ等を含む多くの適した転写および翻訳エレメントを発現ベクターにおいて用いることができる（ビター（Ｂｉｔｔｅｒ）ら、Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． １５３：５１６〜５４４、１９８７）。例えば、細菌系においてクローニングする場合、バクテリオファージΣのｐＬ、ｐｌａｃ、ｐｔｒｐ、ｐｔａｃ（ｐｔｒｐ−ｌａｃハイブリッドプロモーター）等のような誘導型プロモーターを用いることができる。哺乳類細胞系においてクローニングする場合、哺乳類細胞のゲノムに由来するプロモーター、例えばヒトもしくはマウスメタロチオネインプロモーター、または哺乳類ウイルスに由来するプロモーター、例えばレトロウイルスの長末端反復、アデノウイルス後期プロモーター、もしくはワクシニアウイルス７．５ Ｋプロモーターを用いることができる。組換えＤＮＡまたは合成技術によって産生されたプロモーターも同様に、挿入されたＧＤＦ受容体コード配列の転写を提供するために用いることができる。
【０１８７】
酵母細胞において、構成的または誘導型プロモーターを含む多くのベクターを用いることができる（アウスユベール（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら、上記、１９８７、第１３章を参照のこと；グラント（Ｇｒａｎｔ）ら、Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． １５３：５１６〜５４４、１９８７；グローバー（Ｇｌｏｖｅｒ）、「ＤＮＡ のクローニング（ ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ ）」、第ＩＩ巻（ＩＲＬ出版、１９８６）、第３章を参照のこと；ビター（Ｂｉｔｔｅｒ）、Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． １５２：６７３〜６８４、１９８７；同様に、「酵母菌の分子生物学（ Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｙｅａｓｔ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ）」、（ストラサーン（Ｓｔｒａｔｈｅｒｎ）ら編、コールドスプリングハーバー研究所出版 １９８２、第ＩおよびＩＩ巻も参照のこと）。ＡＤＨもしくはＬＥＵ２のような構成的酵母プロモーターまたはＧＡＬのような誘導型プロモーターを用いることができる（ロススタイン（Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ）、「ＤＮＡ のクローニング（ ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ ）」、第ＩＩ巻（上記、１９８６）、第３章）。または、酵母の染色体に外来ＤＮＡ配列の組み込みを促進するベクターを用いることができる。
【０１８８】
真核生物系、特に哺乳類発現系では、発現された哺乳類蛋白質の適切な翻訳後改変を行うことができる。最初の転写物の適切なプロセシング、グリコシル化、燐酸化、および都合よくは、遺伝子産物の細胞質膜挿入のための細胞機構を有する真核細胞を、ＧＤＦ受容体ポリペプチドまたはその機能的ペプチド部分を発現させるための宿主細胞として用いることができる。
【０１８９】
発現を指示するために組換えウイルスまたはウイルスエレメントを利用する哺乳類細胞系を操作することができる。例えば、アデノウイルス発現ベクターを用いる場合、ＧＤＦ受容体コード配列を、アデノウイルス転写／翻訳制御複合体、例えば、後期プロモーターおよび三連リーダー配列にライゲーションすることができる。または、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーターを用いることができる（マケット（Ｍａｃｋｅｔｔ）ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７９：７４１５〜７４１９、１９８２；マケット（Ｍａｃｋｅｔｔ）ら、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ４９：８５７〜８６４、１９８４；パニカリ（Ｐａｎｉｃａｌｉ）ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７９：４９２７〜４９３１、１９８２）。染色体外エレメントとして複製することができるウシ乳頭腫ウイルスベクターは特に有用である（サーバー（Ｓａｒｖｅｒ）ら、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １：４８６、１９８１）。このＤＮＡがマウス細胞に流入した後まもなく、プラスミドは細胞あたり約１００〜２００コピーに複製する。挿入されたｃＤＮＡの転写は、宿主細胞染色体へのプラスミドの組み込みを必要とせず、それによって高レベル発現が得られる。これらのベクターは、プラスミドに、例えばｎｅｏ遺伝子のような選択マーカーを含めることによって安定な発現のために用いることができる。または、レトロウイルスゲノムは、宿主細胞にＧＤＦ受容体遺伝子を導入してその発現を指示することができるベクターとして用いるために改変することができる（コーンとマリガン（Ｃｏｎｅ ａｎｄ Ｍｕｌｌｉｇａｎ）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８１：６３４９〜６３５３、１９８４）。高レベル発現はまた、メタロチオネインＩＩＡプロモーターおよび熱ショックプロモーターを含むがこれらに限定されない誘導型プロモーターを用いても行うことができる。
【０１９０】
組換え蛋白質を高い収率で長期間産生させるためには、安定な発現が好ましい。ウイルスの複製開始点を含む発現ベクターを用いる以外に、宿主細胞をプロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネータ、およびポリアデニル化部位のような適当な発現制御エレメント、ならびに選択マーカーによって制御されるＧＤＦ受容体ｃＤＮＡによって形質転換することができる。組換えプラスミドにおける選択マーカーは、選択に対する抵抗性を付与することができ、それによって細胞はプラスミドをその染色体に安定に組み込まれ、増殖してコロニーを形成することができ、これをクローニングして細胞株に増殖させることができる。例えば、外来ＤＮＡの導入後、操作された細胞を栄養に富む培地において１〜２日間増殖させた後、選択培地に切り替える。単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ウィグラー（Ｗｉｇｌｅｒ）ら、Ｃｅｌｌ １１：２２３、１９７７）、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（スジバルスカとスジバルスキ（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ ａｎｄ Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ４８：２０２６、１９８２）、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ロウイ（Ｌｏｗｙ）ら、Ｃｅｌｌ ２２：８１７、１９８０）遺伝子を含むがこれらに限定されない多くの選択系を用いることができ、これらはそれぞれ、ｔｋ−、ｈｇｐｒｔ−、またはａｐｒｔ−細胞において用いることができる。同様に、抗代謝剤抵抗性を、メソトレキセートに対する抵抗性を付与するｄｈｆｒ（ウィグラー（Ｗｉｇｌｅｒ）ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７７：３５６７、１９８０；オヘール（Ｏ’Ｈａｒｅ）ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７８：１５２７、１９８１）；ミコフェノール酸に対する抵抗性を付与するｇｐｔ（マリガンとベルグ（Ｍｕｌｌｉｇａｎ ａｎｄ Ｂｅｒｇ）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７８：２０７２、１９８１）；アミドグリコシドＧ−４１８に対する抵抗性を付与するｎｅｏ（コルベール−ガラピン（Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎ）ら、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １５０：１、１９８１）；およびハイグロマイシンに対する抵抗性を付与するｈｙｇｒｏ（サンテール（Ｓａｎｔｅｒｒｅ）ら、Ｇｅｎｅ ３０：１４７、１９８４）遺伝子に関して選択するための基礎として用いることができる。細胞にトリプトファンの代わりにインドールを用いさせるｔｒｐＢ；細胞にヒスチジンの代わりにヒスチノールを用いさせるｈｉｓＤ（ハートマンとマリガン（Ｈａｒｔｍａｎ ａｎｄ Ｍｕｌｌｉｇａｎ）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５：８０４７、１９８８）；およびオルニチンデカルボキシラーゼ阻害剤である２−（ジフルオロメチル）−ＤＬ−オルニチン、ＤＦＭＯ（マッコンログ（ＭｃＣｏｎｌｏｇｕｅ）、Ｃｕｒｒ． Ｃｏｍｍ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． （コールドスプリングハーバー研究所出版、１９８７））に対する抵抗性を付与するＯＤＣ（オルニチンデカルボキシラーゼ）を含むさらなる選択遺伝子も同様に記載されている。
【０１９１】
宿主が真核細胞である場合、リン酸カルシウム共沈殿物のようなＤＮＡトランスフェクション法、マイクロインジェクション、電気穿孔、リポソームに封入されたプラスミドの挿入、またはウイルスベクターのような従来の機械的技法を用いることができる。真核細胞も同様に、本発明のＧＤＦ受容体をコードするＤＮＡ配列と、単純ヘルペスチミジンキナーゼ遺伝子のような選択的表現型をコードする第二の外来ＤＮＡ分子とによって同時形質転換することができる。もう一つの方法は、真核細胞を一過的に感染または形質転換して、蛋白質を発現させるために、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、またはウシ乳頭腫ウイルスのような真核細胞ウイルスベクターを用いることである（グルツマン（Ｇｌｕｚｍａｎ）、Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ（コールドスプリングハーバー研究所出版、１９８２））。
【０１９２】
本発明はまた、その細胞がＧＤＦ受容体ポリペプチドを発現して、ＧＤＦ受容体をコードするＤＮＡを含む、安定な組換え型細胞株を提供する。適した細胞タイプには、ＮＩＨ ３Ｔ３細胞（マウス）、Ｃ２Ｃ１２細胞、Ｌ６細胞、およびＰ１９細胞が含まれるがこれらに限定されない。Ｃ２Ｃ１２細胞およびＬ６筋芽細胞は、培養において自然に分化して、特定の増殖条件によって筋管を形成する（ヤッフェとサクセル（Ｙａｆｆｅ ａｎｄ Ｓａｘｅｌ）、Ｎａｔｕｒｅ ２７０：７２５〜７２７、１９７７；ヤッフェ（Ｙａｆｆｅ）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ６１：４７７〜４８３、１９６８）。Ｐ１９は胎児癌細胞株である。そのような細胞は、例えば、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）の細胞株カタログに記載されている。これらの細胞は、周知の方法によって安定に形質転換することができる（例えば、アウスユベール（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら、上記、１９９５、第９．５．１〜９．５．６章を参照のこと）。
【０１９３】
ＧＤＦ受容体は、本明細書に記載する誘導型または構成的調節エレメントを用いて本発明の組換えポリヌクレオチドから発現させることができる。望ましい蛋白質コード配列および機能的に結合したプロモーターを、直線型分子となりうる、または共有結合によって閉環した環状分子となりうる非複製ＤＮＡ（またはＲＮＡ）分子のいずれかとしてレシピエント細胞に導入することができる。所望の分子の発現は、導入された配列の一過的な発現によって起こりうる、またはポリヌクレオチドは、例えば宿主細胞染色体に組み込まれることによって、より永続的な発現を可能にすることによって、細胞において安定に維持することができる。したがって、細胞は、安定または一過的に形質転換した（トランスフェクトした）細胞となりうる。
【０１９４】
用いることができるベクターの例は、宿主細胞染色体に所望の遺伝子配列を組み込まれることができるベクターである。その染色体に導入されたＤＮＡを安定に組み込まれている細胞は、また、発現ベクターを含む宿主細胞の選択を可能にする一つまたはそれ以上のマーカーを導入することによって選択することができる。一般的な酵母の栄養要求マーカーであるｌｅｕ２、またはｕｒａ３のようなマーカーは、宿主において栄養要求性を補うことができ；殺虫剤抵抗性、例えば抗生物質または銅等のような重金属イオンに対する抵抗性を付与することができる。選択マーカー遺伝子は、発現すべきＤＮＡ遺伝子配列に直接連結することができ、または同時トランスフェクションによって同じ細胞に導入することができる。
【０１９５】
導入された配列は、レシピエント宿主において自律的に複製することができるプラスミドまたはウイルスベクターに組み込まれることができる。多様なベクターをこの目的のために用いることができる。特定のプラスミドまたはウイルスベクターを選択するために重要な要因には、ベクターを含むレシピエント細胞を認識してベクターを含まない細胞から選択することができる容易さ、特定の宿主細胞において望ましいベクターのコピー数；ならびに異なる種の宿主間でベクターを「往復させる」ことができるために望ましいか否かが含まれる。
【０１９６】
哺乳類宿主に関して、いくつかのベクター系が発現のために利用できる。一つのクラスのベクターは、動物ウイルス、例えばウシ乳頭腫ウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、またはＳＶ４０ウイルスに由来する自律的に複製する染色体外プラスミドを提供するＤＮＡエレメントを利用する。第二のクラスのベクターには、ワクシニアウイルス発現ベクターが含まれる。第三のクラスのベクターは、宿主染色体に所望の遺伝子配列を組み込まれることに依存する。導入されたＤＮＡをその染色体に安定に組み込んだ細胞はまた、一つまたはそれ以上のマーカー遺伝子（上記のような）を導入することによっても選択することができ、これによって発現ベクターを含む宿主細胞を選択することができる。選択マーカー遺伝子は、発現されるＤＮＡ配列に直接連結することができ、または同時トランスフェクションによって同じ細胞に導入することができる。コードされるｍＲＮＡまたはペプチドの最適な合成を提供するために、例えば、スプライスシグナル、転写プロモーターまたはエンハンサー、および転写または翻訳終了シグナルを含む、さらなるエレメントを含むことができる。適当な調節エレメントを組み込んだｃＤＮＡ発現ベクターは、当技術分野で周知である（例えば、オカヤマ（Ｏｋａｙａｍａ）、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ３：２８０、１９８３を参照のこと）。
【０１９７】
構築物を含むベクターまたはＤＮＡ配列を発現のために調製した後、ＤＮＡ構築物を適当な宿主に導入することができる。ポリヌクレオチドを細胞に導入するために、例えば、プロトプラスト融合、燐酸カルシウム沈殿、および電気穿孔のようなトランスフェクションもしくは形質転換法、または他の従来の技法、例えばベクターがウイルスベクターである場合には感染を含む様々な方法を用いることができる。
【０１９８】
本発明はまた、組換えＧＤＦ受容体を発現する細胞を有するトランスジェニック動物も提供する。そのようなトランスジェニック動物は、脂肪含有量が減少している、筋重量が増加している、またはその双方であるように選択することができ、したがって、筋および蛋白質含有量が高く、脂肪およびコレステロール含有量が低い食品源として有用となりうる。動物は、ＧＤＦ、特にミオスタチンの産生が正常「レベル」に維持されているが、ミオスタチン受容体の産生量が減少しているか、または完全に破壊されて、その結果、ミオスタチンとの結合能が減少し、その結果、脂肪またはコレステロールレベルを増加させることなく、筋組織が正常レベル以上となる動物の細胞が得られるように、その生殖細胞および体細胞の染色体で改変されている。したがって、本発明にはまた、動物によって提供される食品が含まれる。そのような食品は、筋組織の増加のために栄養的価値が増加している。本発明のヒト以外のトランスジェニック動物には、ウシ、ブタ、ヒツジ、およびトリ動物が含まれると共に、他の脊椎動物が含まれ、さらにトランスジェニック無脊椎動物が含まれる。
【０１９９】
本発明はまた、筋重量が増加した動物食品を作製する方法を提供する。そのような方法には、動物の前核胚の生殖細胞の遺伝子構築を改変すること、胚を仮親雌性動物の卵管に埋め込むこと、それによって胚を妊娠満期まで成熟させること、導入遺伝子陽性子孫を同定するために導入遺伝子の存在に関して子孫を調べること、さらなる導入遺伝子陽性子孫を得るために導入遺伝子陽性子孫を交配すること、および食品を得るために子孫を処理することが含まれうる。生殖細胞の改変は、ミオスタチン受容体蛋白質の産生をコードする天然に存在する遺伝子の発現を減少または阻害するように遺伝子組成物を改変させることを含む。例えば、導入遺伝子は、ミオスタチン受容体をコードするポリヌクレオチドに対して特異的であるアンチセンス分子を含みうる、内因性のミオスタチン受容体遺伝子もしくは導入遺伝子において置換もしくは介在する非機能的配列を含みうる；またはミオスタチン受容体アンタゴニスト、例えば、ドミナントネガティブＡｃｔ ＲＩＩＢのようなドミナントネガティブミオスタチン受容体をコードしうる。
【０２００】
本明細書において用いられるように、「動物」という用語は、如何なるトリ、魚、またはヒトを除く哺乳類も意味し、これには、胚または胎児段階を含む如何なる発達段階も含まれる。ブタ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ウサギ等のような家畜動物；マウスのような齧歯類；およびネコおよびイヌのようなペットも「動物」という用語の意味に含まれる。さらに、「生物」という用語は、本明細書において上記の動物が含まれると共に、例えばは虫類および両生類のような他の脊椎動物と共に上記のような無脊椎動物を含む他の真核生物を含むように用いられる。
【０２０１】
本明細書において用いられるように、動物または生物に関連して用いられる「トランスジェニック」という用語は、動物または生物の細胞が、細胞によって安定に維持される外因性のポリヌクレオチド配列を含むように遺伝子操作されていることを意味する。操作は、例えばポリヌクレオチドのマイクロインジェクション、またはポリヌクレオチドを含む組換えウイルスによる感染となりうる。このように、「トランスジェニック」という用語は、本明細書において一つまたはそれ以上の細胞が、細胞の染色体に組み込まれうる、または酵母の人工染色体に操作される場合のように、染色体外で複製するポリヌクレオチドとして維持することができる、組換えポリヌクレオチドを有する細胞（生物）を意味するために用いられる。「トランスジェニック動物」という用語には、また、「生殖系列」トランスジェニック動物が含まれる。生殖系列トランスジェニック動物は、遺伝情報が生殖系列の細胞に取り込まれて組み込まれていて、したがって子孫に情報伝達能を付与するトランスジェニック動物である。そのような子孫が実際にその情報のいくつかまたは全てを有する場合、子孫も同様にトランスジェニック動物であると見なされる。本発明はさらにトランスジェニック生物を含む。
【０２０２】
トランスジェニック生物は、そのゲノムが初期胚もしくは受精卵のインビトロ操作によって改変されている、または特異的遺伝子ノックアウトを誘導するための如何なるトランスジェニック技術によっても改変されている如何なる生物ともなりうる。「遺伝子ノックアウト」という用語は、機能の完全な喪失に至る細胞におけるまたはインビボでの遺伝子の標的化破壊を意味する。トランスジェニック動物における標的遺伝子は、例えば相同的組換えによって、または細胞における遺伝子の機能を破壊する他の如何なる方法によって、非機能的にすべき遺伝子にターゲティングした挿入によって非機能的にされうる。
【０２０３】
本発明の実践において用いられる導入遺伝子は、改変されたＧＤＦ受容体コード配列を含むＤＮＡ配列となりうる。好ましくは、改変ＧＤＦ受容体遺伝子は、胚性幹細胞における相同的ターゲティングによって破壊される遺伝子である。例えば、ＧＤＦ受容体遺伝子の完全な成熟Ｃ末端領域を欠失させることができる（実施例１３を参照のこと）。選択的に、破壊（または欠失）は、もう一つのポリヌクレオチド、例えば非機能的ＧＤＦ受容体配列の挿入または置換を伴うことができる。「ノックアウト」表現型はまた、生物の細胞にアンチセンスＧＤＦ受容体ポリヌクレオチドを導入もしくは発現することによって、または細胞において抗体もしくはドミナントネガティブＧＤＦ受容体を発現することによって、付与することができる。適当であれば、ＧＤＦ受容体活性を有する蛋白質をコードするが、遺伝子コードの縮重のために天然に存在するＧＤＦ遺伝子配列とはヌクレオチド配列が異なるポリヌクレオチドを、本明細書において、切断型、対立遺伝子変種および種間相同体として用いることができる。
【０２０４】
本発明はまた、ＧＤＦ受容体に特異的に結合する抗体、および受容体とＧＤＦとの結合を遮断する抗体を提供する。そのような抗体は、例えば、筋組織に関連した細胞増殖障害のような病態を改善するために有用となりうる。
【０２０５】
ＧＤＦ受容体、特にミオスタチン受容体に特異的に結合するモノクローナル抗体は、骨格筋の発達を増加させうる。請求の方法の好ましい態様において、ＧＤＦ受容体モノクローナル抗体、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドを、筋消耗性疾患、神経筋障害、筋萎縮、加齢等のような病態を有する患者に投与する。ＧＤＦ受容体抗体、特に抗ミオスタチン受容体抗体も同様に、筋ジストロフィー、脊髄損傷、外傷損傷、先天性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、ＡＩＤＳ、またはカヘキシアのような病態を有する患者に投与することができる。
【０２０６】
好ましい態様において、抗ミオスタチン受容体抗体を静脈内、筋肉内、または皮下注射によって筋消耗性疾患または障害を有する患者に投与する；好ましくは、モノクローナル抗体は約０．１ Ｔｇ／ｋｇ〜約１００ ｍｇ／ｋｇの用量範囲で；より好ましくは約１Ｔｇ／ｋｇ〜７５ ｍｇ／ｋｇ；最も好ましくは約１０ ｍｇ／ｋｇ〜５０ ｍｇ／ｋｇの範囲内で投与する。抗体は、例えば、ボーラス注入またはゆっくりとした注入によって投与することができる。３０分〜２時間かけての遅い注入が好ましい。抗ミオスタチン受容体抗体、または他の抗ＧＤＦ受容体抗体は、患者に投与するために適した製剤に調製することができる。そのような製剤は当技術分野で既知である。
【０２０７】
投与レジメは、ミオスタチン受容体蛋白質の作用を改変する様々な要因、例えば、望ましい組織形成量、組織損傷部位、損傷組織の状態、創傷の大きさ、損傷組織のタイプ、患者の年齢、性別、および食事、感染の重症度、投与時間、ならびに他の臨床要因を考慮して主治医によって決定されるであろう。用量は、溶解に用いられるマトリクスのタイプ、および組成物において用いられる抗ミオスタチン受容体抗体のような作用物質のタイプによって変化しうる。一般的に、静脈内、筋肉内、または皮下注射のような全身または注射による投与。投与は一般的に、最小に有効である用量で開始し、陽性作用が認められるまで予め選択した時間経過について用量を増加する。その後、用量の漸増は、現れうる如何なる副作用も考慮に入れて、作用が対応して増加するレベルまでの増加に制限する。筋重量を増加させるために役立ちうるＩＧＦＩ（インスリン様増殖因子Ｉ）、ヒト、ウシ、またはニワトリの成長ホルモンのような他の既知の増殖因子を最終組成物に加えても、用量に影響を及ぼしうる。抗ミオスタチン受容体抗体を投与する態様において、抗体は一般的に、約０．１ Ｔｇ／ｋｇ〜約１００ ｍｇ／ｋｇ；より好ましくは約１０ ｍｇ／ｋｇ〜５０ ｍｇ／ｋｇの用量範囲内で投与される。
【０２０８】
本明細書において用いられるように、「抗体」という用語はその最も広い意味において、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体と共に、そのような抗体の抗原結合断片を含むように用いられる。本発明の方法において有用な抗体、またはその抗原結合断片は、例えば、ＧＤＦ受容体、例えばミオスタチン受容体のエピトープに対する特異的結合活性を有するという特徴を有する。さらに、上記のように、本発明の抗体は、プロミオスタチンポリペプチドのペプチド部分、特にミオスタチンプロドメインまたはその機能的ペプチド部分に特異的に結合する抗体となりうる。ＧＤＦ受容体抗体の調製および特徴を例として示す以下の方法は、ミオスタチンプロドメインに特異的に結合する抗体、プロミオスタチンポリペプチドに特異的に結合して、プロミオスタチンのミオスタチンへの蛋白質分解切断を減少または阻害する抗体等を含む、本発明のさらなる抗体の調製および特徴付けに適用可能であると認識されるであろう。
【０２０９】
抗体に関連して用いる場合の「特異的に結合する」または「特異的結合活性」という用語は、抗体と特定のエピトープとの相互作用が解離定数少なくとも約１×１０−６、一般的に少なくとも約１×１０−７、通常、少なくとも約１×１０−８、および特に少なくとも約１×１０−９または１×１０−１０またはそれ未満を有することを意味する。そのため、ＧＤＦ受容体のエピトープに対する特異的結合活性を保持している抗体のＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、およびＦｖ断片は抗体の定義に含まれる。本発明の目的に関して、例えば、ミオスタチン受容体のエピトープに特異的に反応する抗体は、抗体がＴＧＦ−９またはＢＭＰ受容体と比較してミオスタチン受容体に対して少なくとも２倍大きい結合親和性、一般的に少なくとも５倍大きい結合親和性、および特に少なくとも１０倍大きい結合親和性を有すれば、ＴＧＦ−９受容体またはＢＭＰ受容体と実質的に反応しないと見なされる。
【０２１０】
本明細書において用いられる「抗体」という用語には、天然に存在する抗体と共に、例えば一本鎖抗体、キメラ、双機能、およびヒト化抗体と共にその抗原結合断片を含む天然に存在しない抗体が含まれる。そのような天然に存在しない抗体は、固相ペプチド合成を用いて構築することができ、組換えによって産生することができ、または例えば可変重鎖および可変軽鎖からなる組み合わせライブラリをスクリーニングすることによって得ることができる（参照として本明細書に組み入れられる、ヒューズ（Ｈｕｓｅ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５〜１２８１（１９８９）を参照のこと）。例えばキメラ、ヒト化、ＣＤＲ接合、一本鎖、および双機能抗体を作製するこれらおよび他の方法は、当業者に周知である（ウィンターとハリス（Ｗｉｎｔｅｒ ａｎｄ Ｈａｒｒｉｓ）、Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｔｏｄａｙ １４：２４３〜２４６、１９９３；ワード（Ｗａｒｄ）ら、Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４〜５４６、１９８９；ハーロウとレーン（Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ、「抗体：実験マニュアル（ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ）」、（コールドスプリングハーバー研究所出版、１９８８）；ヒルヤード（Ｈｉｌｙａｒｄ）ら、「蛋白質の操作：実際のアプローチ（ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ ）」、（ＩＲＳ出版、１９９２）；ボラベック（Ｂｏｒｒａｂｅｃｋ）、「抗体の操作（ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ）」、第２版、（オックスフォード大学出版、１９９５）；そのそれぞれが参照として本明細書に組み入れられる）。
【０２１１】
ＧＤＦ受容体に特異的に結合する抗体は、免疫原として受容体を用いて、例えば、ＴＧＦ−９ Ｉ型もしくはＩＩ型受容体、Ａｃｔ ＲＩＢ、Ａｃｔ ＲＩＩＡ、もしくはＡｃｔ ＲＩＩＢのようなアクチビン受容体、またはＢＭＰ ＲＩＩ、ＢＭＰ ＲＩＡ、およびＢＭＰ ＲＩＢのようなＢＭＰ受容体と交叉反応する抗体を除去することによって作製することができる（マッサーグ（Ｍａｓｓａｇｕｅ）、上記１９９８を参照のこと）。本発明の抗体は、ＴＧＦ−９、アクチビン、またはＢＭＰ受容体に存在しないミオスタチン受容体のペプチド部分を用いて作製することができる。同様に、ミオスタチンプロドメインに特異的に結合する抗体は、プロドメインまたはその機能的ペプチド部分を免疫原として用いて作製することができる。そのようなペプチドが非免疫原性である場合、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）もしくはキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）のような担体蛋白質にハプテンをカップリングさせることによって、またはペプチド部分を融合蛋白質として発現させることによって免疫原性にすることができる。様々な他の担体分子およびハプテンを担体分子にカップリングさせる方法は、当技術分野で周知である（例えば、ハーロウとレーン（Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ）、上記、１９８８を参照のこと）。
【０２１２】
望ましければ、本発明の方法において有用な抗体または他の作用物質を組み込まれるキットを調製することができる。そのようなキットは、作用物質の他に、作用物質を被験者に投与するために溶解されうる薬学的組成物を含みうる。キットはまた、抗体を検出するための試薬、ＧＤＦ受容体に対する抗体の特異的結合を検出する試薬を含みうる。抗体を標識する、またはそうでなければ同定するために有用なそのような検出可能試薬は、本明細書に記述され、当技術分野で既知である。
【０２１３】
例えば、ウサギ、ヤギ、マウスまたは他の哺乳類においてポリクローナル抗体を作製する方法は、当技術分野で周知である（例えば、そのそれぞれが参照として本明細書に組み入れられる、グリーン（Ｇｒｅｅｎ）ら、「ポリクローナル抗血清の作製（Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｓｅｒａ）」、「免疫化学プロトコール（ Ｉ ｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ）」、マンソン（Ｍａｎｓｏｎ）編、ヒュマナ出版、１９９２年、１〜５頁；コリガン（Ｃｏｌｉｇａｎ）ら、「ウサギ、ラット、マウスおよびハムスターにおけるポリクローナル抗血清の作製（Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｓｅｒａ ｉｎ Ｒａｂｂｉｔｓ， Ｒａｔｓ， Ｍｉｃｅ ａｎｄ Ｈａｍｓｔｅｒｓ）」、Ｃｕｒｒ． Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９２）、２．４．１章を参照のこと）。さらに、モノクローナル抗体は、当技術分野で周知で日常的な方法を用いて得ることができる（ハーロウとレーン（Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ）、上記、１９８８）。例えば、ミオスタチン受容体またはそのエピトープ断片によって免疫したマウスからの脾細胞を、ＳＰ／０２骨髄腫細胞のような適当な骨髄腫細胞株に融合させてハイブリドーマ細胞を産生する。クローニングしたハイブリドーマ細胞株は、適当な特異性を有するモノクローナル抗体を分泌するクローンを同定するために標識抗原を用いてスクリーニングすることができ、所望の特異性および親和性を有する抗体を発現するハイブリドーマを単離して、これを連続的な抗体原として利用することができる。抗体は、ミオスタチン受容体と特異的に結合できないことに関してさらにスクリーニングすることができる。そのような抗体は、例えば、臨床で用いるための標準キットを調製するために有用である。例えば、一本鎖抗ミオスタチン受容体抗体を発現する組換えファージも同様に、標準キットを調製するために用いることができる抗体を提供する。
【０２１４】
モノクローナル抗体を調製する方法は周知である（例えば、参照として本明細書に組み入れられる、コーラーとミルスタイン（Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）、Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５、１９７５を参照のこと；同様に、コリガン（Ｃｏｌｉｇａｎ）ら、上記、１９９２、２．５．１〜２．６．７章を参照のこと；ハーロウとレーン（Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ）、上記、１９８８も参照のこと）。簡単に説明すると、モノクローナル抗体は、抗原を含む組成物をマウスに注射すること、血清試料を採取して抗体産生の存在を確認すること、Ｂリンパ球を得るために脾臓を切除すること、Ｂリンパ球を骨髄腫細胞と融合してハイブリドーマを産生すること、ハイブリドーマをクローニングすること、抗原に対して抗体を産生する陽性クローンを選択すること、およびハイブリドーマ培養から抗体を単離することによって得ることができる。
【０２１５】
モノクローナル抗体は、例えば、プロテイン−Ａセファロースによるアフィニティクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、およびイオン交換クロマトグラフィー（コリガン（Ｃｏｌｉｇａｎ）ら、上記、１９９２、２．７．１〜２．７．１２章および２．９．１〜２．９．３章を参照のこと；同様に、参照として本明細書に組み入れられる、バーンズ（Ｂａｒｎｅｓ）ら、「免疫グロブリンＧの精製（Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇ（ＩｇＧ）」、Ｍｅｔｈ． Ｍｏｌｅｃ． Ｂｉｏｌ． １０：７９〜１０４（ヒュマナ出版、１９９２）を参照のこと）を含む、十分に確立された多様な技術によってハイブリドーマ培養から単離および精製することができる。モノクローナル抗体をインビトロおよびインビボで増幅させる方法は、当業者に周知である。インビトロでの増幅は、選択的に、仔ウシ胎児血清のような哺乳類の血清、または微量元素および正常マウス腹腔滲出細胞、脾細胞、骨髄マクロファージのような増殖維持補助剤を補充したダルベッコ改変イーグル培地またはＲＰＭＩ １６４０培地のような適した培養培地において行うことができる。インビトロでの産生は、比較的純粋な抗体調製物を提供し、所望の抗体の大量を産生するために規模を拡大することができる。大規模ハイブリドーマ培養は、エアリフトリアクターにおいて均一な浮遊培養によって、連続攪拌リアクターにおいて、または固定もしくは捕獲細胞培養において行うことができる。インビボでの増幅は、抗体産生腫瘍の増殖を引き起こすために、親細胞と組織適合性の哺乳類、例えば同系マウスに細胞クローンを注入することによって行うことができる。選択的に、注射前に動物を炭化水素、特にプリスタン（テトラメチルペンタデカン）のような油によってプライミングする。１〜３週間後、所望のモノクローナル抗体を動物の体液から回収する。
【０２１６】
本明細書に開示の抗体の治療応用も同様に、本発明の一部である。例えば、本発明の抗体はまた、ヒト以下の霊長類抗体に由来しうる。ヒヒにおいて治療的に有用な抗体を作製する一般的な技術は、例えば、参照として本明細書に組み入れられる、ゴールデンバーグ（Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ）ら、国際公開公報第９１／１１４６５号（１９９１）；およびロスマンら（Ｌｏｓｍａｎ、Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ ４６：３１０、１９９０）に認められうる。
【０２１７】
治療的に有用な抗ＧＤＦ受容体抗体も同様に、「ヒト化」モノクローナル抗体に由来しうる。ヒト化モノクローナル抗体は、マウス免疫グロブリンの重鎖および軽鎖可変領域からのマウス相補性決定領域をヒト可変ドメインに移して、その後マウス相対物のフレームワーク領域においてヒト残基を置換することによって産生される。ヒト化モノクローナル抗体に由来する抗体成分を用いれば、マウス定常領域の免疫原性に関連した起こりうる問題が回避される。マウス免疫グロブリン可変ドメインをクローニングする一般技術は既知である（例えば、その全文が参照として本明細書に組み入れられる、オーランディ（Ｏｒｌａｎｄｉ）ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６：３８３３、１９８９を参照のこと）。ヒト化モノクローナル抗体を産生する技術も同様に既知である（例えば、そのそれぞれが参照として本明細書に組み入れられる、ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ）ら、Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２、１９８６；リークマン（Ｒｉｅｃｈｍａｎ）ら、Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３、１９８８；フェルホーイエン（Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４、１９８８；カーター（Ｃａｒｔｅｒ）ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：４２８５、１９９２；サンデュ（Ｓａｎｄｈｕ）、Ｃｒｉｔ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １２：４３７、１９９２；シンガー（Ｓｉｎｇｅｒ）ら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５０：２８４４、１９９３を参照のこと）。
【０２１８】
本発明の抗体はまた、組み合わせ免疫グロブリンライブラリから単離されたヒト抗体断片に由来しうる（例えば、そのそれぞれが参照として本明細書に組み入れられる、バルバス（Ｂａｒｂａｓ）ら、「方法：免疫学の方法の手引き（ ＭＥＴＨＯＤＳ ： Ａ Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ）」 ２：１１９、１９９１；ウィンター（Ｗｉｎｔｅｒ）ら、Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １２：４３３、１９９４を参照のこと）。ヒト免疫グロブリンファージライブラリを産生するために有用なクローニングおよび発現ベクターは、例えば、ストラタジーンクローニングシステムズ社（ラホヤ、カリフォルニア州）から得ることができる。
【０２１９】
本発明の抗体はまた、ヒトモノクローナル抗体に由来しうる。そのような抗体は、抗原チャレンジに反応して特異的ヒト抗体を産生するように「操作」されているトランスジェニックマウスから得られる。この技術において、ヒト重鎖および軽鎖座のエレメントを、内因性重鎖および軽鎖座の標的化破壊を含む胚性幹細胞株に由来するマウスの系統に導入する。トランスジェニックマウスは、ヒト抗原に対して特異的なヒト抗体を合成することができ、このマウスを用いてヒト抗体分泌ハイブリドーマを産生することができる。トランスジェニックマウスからヒト抗体を得る方法は、例えば、そのそれぞれが参照として本明細書に組み入れられる、グリーンら（Ｇｒｅｅｎ、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ． ７：１３、１９９４）；ロンバーグら（Ｌｏｎｂｅｒｇ、Ｎａｔｕｒｅ ３６８：８５６、１９９４）；およびテイラーら（Ｔａｙｌｏｒ、Ｉｎｔ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ６：５７９、１９９４）に記載されている。
【０２２０】
本発明の抗体断片は、抗体の蛋白質分解加水分解によって、または断片をコードするＤＮＡを大腸菌において発現させることによって調製することができる。抗体断片は、従来の方法によって抗体全体のペプシンまたはパパイン消化によって得ることができる。例えば、抗体断片は、Ｆ（ａｂ’）２と呼ばれる５Ｓ断片を提供するためにペプシンによる抗体の酵素的切断によって産生することができる。この断片は、チオール還元剤、および選択的に、ジスルフィド結合の切断によって生じるスルフヒドリル基の遮断基を用いてさらに切断することができ、３．５Ｓ Ｆａｂ’一価断片を生じる。または、ペプシンを用いる酵素的切断は、二つの一価Ｆａｂ’断片とＦｃ断片を直接生じる（例えば、そのそれぞれが参照として本明細書に組み入れられる、ゴールデンバーグ（Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ）、米国特許第４，０３６，９４５号、および米国特許第４，３３１，６４７号ならびにその中に含まれる参考文献；ニソノフ（Ｎｉｓｏｎｈｏｆｆ）ら、Ａｒｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． ８９：２３０、１９６０；ポーター（Ｐｏｒｔｅｒ）、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． ７３：１１９、１９５９；エーデルマン（Ｅｄｅｌｍａｎ）ら、Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． １：４２２（アカデミック出版、１９６７）を参照のこと；同様にコリガンら（Ｃｏｌｉｇａｎ）、上記、１９９２、第２．８．１〜２．８．１０および第２．１０．１〜２．１０．４章も参照のこと）。
【０２２１】
一価軽鎖／重鎖断片を形成するために、重鎖の分離、断片のさらなる切断、または他の酵素的、化学的もしくは遺伝的技術のような抗体を切断する他の方法も同様に、断片が無傷の抗体によって認識される抗原に特異的に結合する限り、用いることができる。例えば、ＦＶ断片は、ＶＨとＶＬ鎖との会合を含む。この会合は非共有結合となりうる（インバー（Ｉｎｂａｒ）ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ６９：２６５９、１９７２）。または、可変鎖は、分子間ジスルフィド結合によって連結することができ、またはグルタルアルデヒドのような化学物質によってクロスリンクすることができる（サンデュ（Ｓａｎｄｈｕ）、上記、１９９２）。好ましくは、ＦＶ断片は、ペプチドリンカーによって結合したＶＨおよびＶＬ鎖を含む。これらの一本鎖抗原結合蛋白質（ｓＦｖ）は、オリゴヌクレオチドによって結合したＶＨおよびＶＬドメインをコードするＤＮＡ配列を含む構造遺伝子を構築することによって調製される。構造遺伝子は、発現ベクターに挿入して、これをその後大腸菌のような宿主細胞に導入する。組換え型宿主細胞は、二つのＶドメインを架橋するリンカーペプチドによって一つのポリペプチド鎖を合成する。ｓＦｖを作製する方法は、例えば、そのそれぞれが参照として本明細書に組み入れられる、ホイットロウら（Ｗｈｉｔｌｏｗ、「方法：免疫学の方法の手引き（ Ｍｅｔｈｏｄｓ ： Ａ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ）」 ２：９７、１９９１）；バードら（Ｂｉｒｄ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３〜４２６、１９８８）；ラドナーら（Ｌａｄｎｅｒ、米国特許第４，９４６，７７８号）；パックら（Ｐａｃｋ、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １１：１２７１〜１２７７、１９９３）に記述されている；同様に、サンデュ（Ｓａｎｄｈｕ）、上記、１９９２も参照のこと。
【０２２２】
抗体断片のもう一つの形は、単一の相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするペプチドである。ＣＤＲペプチド（「最小認識単位」）は、関係する抗体のＣＤＲをコードする遺伝子を構築することによって得ることができる。そのような遺伝子は、例えば、抗体産生細胞のＲＮＡから可変領域を合成するためにポリメラーゼ連鎖反応を用いて調製される（例えば、参照として本明細書に組み入れられる、ラリック（Ｌａｒｒｉｃｋ）ら、「方法：免疫学の方法の手引き（ Ｍｅｔｈｏｄｓ ： Ａ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ）」 ２：１０６、１９９１を参照のこと）。
【０２２３】
本発明はまた、ＧＤＦ受容体ポリペプチドを同定する方法も提供する。そのような方法は、例えば、ＧＤＦポリペプチドを含む成分と、完全長の受容体または切断型受容体を発現する細胞を、ＧＤＦを受容体に結合させるために十分な条件でインキュベートすること、ＧＤＦポリペプチドと受容体との結合を測定すること、および受容体を単離することによって行うことができる。ＧＤＦは、既知のＧＤＦｓ（例えば、ＧＤＦ−１〜１６）の如何なるものともなりうるが、好ましくはＧＤＦ−８（ミオスタチン）またはＧＤＦ−１１である。受容体を単離する方法は、下記の実施例においてより詳細に説明する。したがって、本発明はまた、実質的に精製されたＧＤＦ受容体のみならず、天然に存在するＧＤＦ受容体より少ないアミノ酸残基を有するＧＤＦ受容体のペプチドおよびペプチド誘導体を提供する。そのようなペプチドおよびペプチド誘導体は、筋消耗性症候群の研究およびより有効な治療の開発において、研究および診断ツールとして有用である。
【０２２４】
本発明はさらにＧＤＦ受容体変種を提供する。本明細書において用いられるように、「ＧＤＦ受容体変種」という用語はＧＤＦ受容体の構造の少なくとも一部を刺激する分子を意味する。ＧＤＦ受容体変種は、ＧＤＦ結合を減少または阻害して、それによって本明細書に開示の病態を改善するために有用となりうる。ＧＤＦ受容体変種の例には、ＧＤＦ受容体の可溶性細胞外ドメインのような切断型ＧＤＦ受容体、キナーゼ活性を欠損するドミナントネガティブＡｃｔ ＲＩＩＢ受容体のようなドミナントネガティブＧＤＦ受容体、またはその他の切断型もしくは変異体ＧＤＦ受容体が含まれるがこれらに限定されない。
【０２２５】
本発明は、天然に存在するＧＤＦ受容体のペプチドおよびペプチド誘導体のみならず、変異体ＧＤＦ受容体およびＧＤＦ、例えばミオスタチンに特異的に結合するＧＤＦ受容体の化学合成された誘導体を含むＧＤＦ受容体変種にも関する。例えば、ＧＤＦ受容体のアミノ酸配列の変化が本発明において考慮される。ＧＤＦ受容体は、蛋白質をコードするＤＮＡを変化させることによって変化させることができる。好ましくは、同じまたは類似の特性を有するアミノ酸を用いて、保存的アミノ酸変化のみを行う。例となるアミノ酸置換には、アラニンからセリンへの変化；アルギニンからリジン；アスパラギンからグルタミンまたはヒスチジン；アスパラギン酸からグルタミン酸；システインからセリン；グルタミンからアスパラギン；グルタミン酸からアスパラギン酸；グリシンからプロリン；ヒスチジンからアスパラギンまたはグルタミン；イソロイシンからロイシンまたはバリン；ロイシンからバリンまたはイソロイシン；リジンからアルギニン、グルタミン、またはグルタミン酸；メチオニンからロイシンまたはイソロイシン；フェニルアラニンからチロシン、ロイシン、またはメチオニン；セリンからトレオニン；トレオニンからセリン；トリプトファンからチロシン；チロシンからトリプトファンまたはフェニルアラニン；バリンからイソロイシンまたはロイシンへの変化が含まれる。
【０２２６】
本発明にとって有用な変種は、そのそれぞれのＧＤＦｓに対して特異的結合能を保持しているＧＤＦ受容体の類似体、相同体、変異蛋白質および模倣体を含む。もう一つの態様において、変種がＧＤＦと特異的に相互作用するか否かによらず、ドミナントネガティブ活性を有する変種ＧＤＦ受容体も同様に考慮される。ＧＤＦ受容体のペプチドは、これらの能力を有するＧＤＦ受容体のアミノ酸配列の一部を意味する。変種は、化学修飾によって、蛋白質分解酵素の消化によって、またはその組み合わせによってＧＤＦ受容体自身から直接産生することができる。さらに、アミノ酸残基から直接ポリペプチドを合成する方法と共に遺伝子操作技術を用いることができる。
【０２２７】
ペプチドは、αアミノ基のｔ−ＢＯＣまたはＦＭＯＣ保護のような一般的に用いられる方法によって合成することができる。いずれの方法も、それによってペプチドのＣ末端から開始してアミノ酸一個ずつがそれぞれの段階で付加される、段階的合成を含む（コリガン（Ｃｏｌｉｇａｎ）ら、「免疫学の最新プロトコール（ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ）」、（ウィリーインターサイエンス社、１９９１）、第９章、参照として本明細書に組み入れられる）。本発明のペプチドはまた、０．１〜１．０ ｍＭｏｌアミン／ｇポリマーを含むコポリ（スチレン−ジビニルベンゼン）を用いて、周知の固相ペプチド合成法（そのそれぞれが参照として本明細書に組み入れられる、メリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ）、Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． ８５：２１４９、１９６２；スチュワートとヤング（Ｓｔｅｗａｒｔ ａｎｄ Ｙｏｕｎｇ）、「固相ペプチド合成（ Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ）」、（フリーマン、サンフランシスコ、１９６９）、２７〜６２頁を参照のこと）によって合成することができる。化学合成が終了すると、ペプチドを、液体ＨＦ−１０％アニソールによる０℃で約１／４〜１時間の処置によって脱保護してポリマーから切断することができる。試薬を蒸発させた後、１％酢酸溶液によってペプチドをポリマーから抽出して、次にこれを凍結乾燥すると粗材料が得られる。これは通常、５％酢酸を溶媒として用いるセファデックスＧ−１５上でのゲル濾過のような技術によって精製することができる。カラムの適当な画分を凍結乾燥すると、均一なペプチドまたはペプチド誘導体が得られ、これをアミノ酸解析、薄層クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、紫外線吸収分光法、モル旋光度、溶解度のような標準的な技術によって特徴を調べ、固相エドマン分解によって定量することができる。
【０２２８】
ＧＤＦ受容体の結合および機能を模倣する（「模倣体」）非ペプチド化合物は、サラゴビら（Ｓａｒａｇｏｖｉ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５３：７９２〜９５、１９９１、参照として本明細書に組み入れられる）によって概要されるアプローチによって産生することができる。模倣体は、蛋白質二次構造のエレメントを模倣する分子である（ジョンソンら（Ｊｏｈｎｓｏｎ）、「ペプチドターン模倣体（Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｔｕｒｎ Ｍｉｍｅｔｉｃｓ）」、バイオテクノロジーと薬学（ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｙ ）、（ペズット（Ｐｅｚｚｕｔｏ）ら編、チャプマンとホール（Ｃｈａｐｍａｎ ａｎｄ Ｈｏｌｌ）、ニューヨーク、１９９３、参照として本明細書に組み入れられる）。ペプチド模倣体を用いる背後の基礎となる原理は、蛋白質のペプチド骨格が、主に、分子相互作用を促進する方向にアミノ酸側鎖を向けるように存在するという点である。本発明の目的に関して、適当な模倣体は、ＧＤＦ受容体の同等物であると見なされうる。
【０２２９】
より長いペプチドは、ペプチドを互いに連結する「本来の化学」ライゲーション技術によって産生することができる（ダウソン（Ｄａｗｓｏｎ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６６：７７６、１９９４、参照として本明細書に組み入れられる）。変種は、ゲノムまたはｃＤＮＡクローニング法を用いる組換え技法によって作製することができる。部位特異的および領域特異的変異誘発技術を用いることができる（アウスユベール（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら、上記、１９８９および１９９０〜１９９３補則、第１巻、第８章を参照のこと；「蛋白質の操作（ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ）」、（オクセンダーとフォックス（Ｏｘｅｎｄｅｒ ａｎｄ Ｆｏｘ）編、Ａ．リスインク、１９８７）。さらに、リンカースキャンおよびＰＣＲ媒介技術を変異誘発のために用いることができる（エールリッヒ（Ｅｒｌｉｃｈ）、「ＰＣＲ 技術（ ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ）」、（ストックトン出版、１９８９）；アウスユベール（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら、上記、１９８９〜１９９３）。上記の技術のいずれかと共に用いられる蛋白質の配列決定、構造およびモデリングアプローチは、上記に引用される参考文献に開示される。
【０２３０】
本発明はまた、ＧＤＦのその受容体に対する特異的結合を遮断するＧＤＦ受容体結合作用物質を提供する。そのような作用物質は例えば、上記の筋消耗性障害の研究における研究および診断ツールとして有用であり、本明細書に開示の方法、例えば、分子モデリング法を用いて同定することができる。さらに、ＧＤＦ受容体結合作用物質を含む薬学的組成物は、有効な治療物質となりうる。本発明の意味において、「ＧＤＦ受容体結合作用物質」という句は、ＧＤＦ受容体、例えばＧＤＦ−１〜ＧＤＦ−１６の天然に存在するリガンド、ＧＤＦ受容体の合成リガンド、または天然もしくは合成リガンドの適当な誘導体を指す。リガンドの決定および単離は、当技術分野で周知である（ラーナー（Ｌｅｒｎｅｒ）、Ｔｒｅｎｄｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． １７：１４２〜１４６、１９９４、参照として本明細書に組み入れられる）。
【０２３１】
なおもう一つの態様において、本発明は、ＧＤＦ受容体とＧＤＦとの結合を妨害するＧＤＦ受容体結合作用物質に関する。そのような結合作用物質は、競合的阻害、非競合的阻害、または不競合的阻害によって妨害することができる。ＧＤＦ受容体と一つまたはそれ以上のＧＤＦとの正常な結合の妨害によって、有用な薬理作用を得ることができる。
【０２３２】
本発明はまた、ＧＤＦ受容体に結合する組成物を同定する方法を提供する。方法には、組成物を含む成分とＧＤＦ受容体とを、成分を特異的に相互作用させるために十分な条件でインキュベートする段階、およびＧＤＦ受容体に対する組成物の結合を測定する段階を含む。ＧＤＦ受容体に結合する組成物には、上記のように、ペプチド、ペプチド模倣体、ポリペプチド、化学化合物および生物作用物質が含まれる。インキュベートする段階には、試験組成物とＧＤＦ受容体との接触を可能にして、インビボで起こるような特異的相互作用に適した条件を提供する条件に反応物質を曝露する段階が含まれる。接触は、溶液または固相となりうる。試験リガンド／組成物は、選択的に、上記のように複数の組成物をスクリーニングするための組み合わせライブラリとなりうる。本発明の方法において同定された組成物はさらに、ＰＣＲ、オリゴマー制限（サイキ（Ｓａｉｋｉ）ら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３：１００８〜１０１２、１９８５、参照として本明細書に組み入れられる）、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）プローブ解析（コナー（Ｃｏｎｎｅｒ）ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８０：２７８、１９８３、参照として本明細書に組み入れられる）、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ法（ＯＬＡｓ）（ランドグレン（Ｌａｎｄｇｒｅｎ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：１０７７、１９８８、参照として本明細書に組み入れられる）等（参照として本明細書に組み入れられる、ランドグレン（Ｌａｎｄｇｒｅｎ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：２２９〜２３７、１９８８を参照のこと）のような特異的ＤＮＡ配列を検出するために通常適用される如何なる方法によって、溶液または固相支持体に結合させた後に、評価、検出、クローニング、配列決定等を行うことができる。
【０２３３】
組成物が受容体蛋白質と機能的に複合体を形成することができるか否かを決定するために、外因性の遺伝子によってコードされる蛋白質の蛋白質レベルの変化をモニターすることによって、または本明細書に開示の他の方法によって、外因性遺伝子の誘導をモニターすることができる。外因性遺伝子の転写を誘導することができる組成物が同定されれば、この組成物は、最初の試料試験組成物をコードする核酸によってコードされる受容体蛋白質に特異的に結合することができると結論される。
【０２３４】
外因性の遺伝子の発現は、機能的アッセイ法または例えば蛋白質産物のアッセイ法によってモニターすることができる。したがって、外因性遺伝子は、外因性遺伝子の発現が検出されうるためにアッセイ可能な／測定可能な発現産物を提供する遺伝子である。そのような外因性の遺伝子には、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子、アルカリホスファターゼ遺伝子、９−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ遺伝子、緑色蛍光蛋白質遺伝子、グアニンキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、およびネオマイシンホスホトランスフェラーゼのような抗生物質耐性遺伝子（上記参照）のようなレポーター遺伝子が含まれるがこれらに限定されない。
【０２３５】
外因性の遺伝子の発現は、組成物とＧＤＦ受容体との特異的相互背用を示し；このように、組成物の結合または遮断を同定して単離することができる。本発明の組成物は、例えば、抽出、沈殿、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、ゲル濾過等を含む、一般的に用いられる既知の蛋白質精製技術を用いることによって、培養培地または細胞から抽出および精製することができる。組成物は、カラムマトリクスに結合した改変された受容体蛋白質細胞外ドメインを用いるアフィニティクロマトグラフィー、またはヘパリンクロマトグラフィーによって単離することができる。
【０２３６】
同様に、上記のようにＧＤＦ受容体に結合する化学化合物を同定する組み合わせ化学法も本発明のスクリーニング方法に含まれる。このように、スクリーニング法はまた、望ましければ、物理的（例えば、立体的）ではなく、機能的にアンタゴニストまたはアゴニストとして作用する変種、結合もしくは遮断剤等を同定するためにも有用である。
【０２３７】
以下の実施例は本発明を説明するのであって、制限すると解釈されない。
【０２３８】
実施例１
ミオスタチンは用量依存的に作用する
本実施例は、筋増殖の阻害におけるミオスタチンの活性がインビボでミオスタチン発現レベルに依存することを示す。
【０２３９】
ミオスタチンは、骨格筋重量の負の調節物質である（マクフェロン（ＭｃＰｈｅｒｒｏｎ）ら、上記、１９９７；マクフェロンとリー（ＭｃＰｈｅｒｒｏｎ ａｎｄ Ｌｅｅ）、上記、１９９７）。ミオスタチン遺伝子の欠失に関してホモ接合であるミオスタチンノックアウトマウスは、全身体重の２５〜３０％増加を示した。ホモ接合ノックアウトマウスを調べると、筋重量の増加は、全身の骨格筋重量の約１００〜２００％増加が原因であることが判明した。
【０２４０】
ミオスタチン変異に関してヘテロ接合であるマウスも同様に全身体重が増加した。しかし、ヘテロ接合体の増加重量は、ホモ接合体の重量より小さく、調べた多数の中で一つの年齢と性別の群に有意差を認めたに過ぎなかった。ヘテロ接合マウスが野生型マウスとホモ接合ミオスタチンノックアウトマウスとのあいだの中間の表現型を有するか否かを調べるために、筋重量の解析をヘテロ接合マウスにも行った。ヘテロ接合マウスから採取した個々の筋の重量は、野生型マウスより約２５〜５０％多かった。これらの結果は、ミオスタチン遺伝子の欠失に関してヘテロ接合であるマウスは、野生型とホモ接合ミオスタチンノックアウトマウスの中間の表現型を有することを証明し、ミオスタチンがインビボで用量依存的な作用を生じることを証明している。
【０２４１】
これらの結果は、ミオスタチン活性の操作が、筋消耗性疾患およびミオスタチン活性に関連した他の代謝障害を治療するために有用となりうることを示している。さらに、ミオスタチンの用量依存的作用は、ミオスタチン活性の完全な阻害を得なくとも治療効果が得られ、それによって、例えば、特定のレベルの活性が被験者において望ましくない作用を生じる場合には、ミオスタチン活性の調節が可能となることを示している。
【０２４２】
実施例２
ミオスタチンの作用はノックアウトマウスの年齢と共に減少する
本実施例は、野生型マウスとホモ接合ミオスタチンノックアウトマウスのあいだの体重の差の減少が、変異体マウスの筋重量の減少に関連していることを証明する。
【０２４３】
ミオスタチンノックアウトマウスは５ヶ月齢で野生型マウスより体重が約２５〜３０％多かった（マクフェロン（ＭｃＰｈｅｒｒｏｎ）ら、上記、１９９７）。しかし、総体重の差は、動物が年をとるにつれて、有意に小さくなるかまたは完全に消失した。この作用が、例えば筋の変性のために、または野生型マウスによる比較的大きい体重増加のために、ノックアウトマウスの体重が相対的に失われたことによるか否かを調べるために、筋重量の詳細な解析を年齢の関数として行った。
【０２４４】
２ヶ月から１７ヶ月のあいだに調べた全ての年齢において、胸筋の重量は野生型同腹子よりホモ接合変異体マウスにおいて有意に重かった。最も劇的な差は、５ヶ月で認められ、その時点で胸筋の重量は変異体マウスにおいて約２００％大きかった。胸筋の重量は月齢が高くなるとわずかに減少したが、変異体マウスにおけるこの筋の重量は野生型マウスの２倍以上のままであった。上腕三頭筋、四頭筋、ひ腹筋および足底筋、ならびに前脛骨筋を含む、調べた他の筋の全てにおいて同じ基礎的な傾向を認めた。類似の傾向を雄性および雌性マウスの双方において認めた。これらの結果は、加齢と共に認められた変異体と野生型マウスのあいだの総体重の差の減少が、変異体マウスにおける筋重量のわずかな減少によることを証明している。
【０２４５】
実施例３
ミオスタチンは用量依存的に脂肪の蓄積に影響を及ぼす
本実施例は、ミオスタチンノックアウトマウスが脂肪を蓄積させることができないこと、および脂肪蓄積の減少がインビボでのミオスタチン発現レベルに関連していることを証明する。
【０２４６】
実施例２において示されたミオスタチン変異体における筋重量の減少は、野生型動物が最終的に変異体マウスと同じ体重になったという知見を十分には説明できないことから、野生型および変異体マウスにおける脂肪の蓄積量を調べた。雄性マウスの鼠径部、精巣上体、および後腹膜の脂肪体を調べた。２ヶ月齢では野生型および変異体マウスのあいだにこれらの脂肪体のいずれの重量にも差を認めなかった。５〜６ヶ月齢までに、野生型およびヘテロ接合ノックアウトマウスはいずれも広範囲の脂肪体重量を示し、平均すると、脂肪体重量は動物が９〜１０ヶ月齢に達するまでに約３倍〜５倍増加した。これらの動物において認められた広範囲の脂肪体重量のために、動物によっては、他よりかなり大きい増加を示した（１０倍まで）。
【０２４７】
野生型およびヘテロ接合ノックアウトマウスとは対照的に、ミオスタチンホモ接合変異体マウスの脂肪体重量は、比較的狭い範囲に存在し、２ヶ月齢と９〜１０ヶ月齢のマウスでは実質的に同じであった。このように、野生型マウスにおける加齢に伴って起こる脂肪蓄積の増加は、ホモ接合ミオスタチンノックアウトマウスでは認められなかった。ホモ接合変異体マウスにおいて、年齢の関数として、脂肪蓄積にこのような差が認められたことは、筋重量のわずかな減少と共に、野生型マウスが最終的に変異体と同じ総体重となるという知見を十分に説明した。
【０２４８】
ヘテロ接合ノックアウトマウスの脂肪体重量の平均値は、９〜１０ヶ月齢で野生型マウスとホモ接合変異体マウスの中間であった。この差は、これらおよび野生型マウスにおける脂肪体重量が広範囲であったために統計学的に有意ではなかったが、これらの結果は、それにもかかわらず、ミオスタチンが筋増殖に及ぼすその作用と同様に、脂肪の蓄積に対して用量依存的な作用を有することを示している。
【０２４９】
実施例４
代謝に及ぼすミオスタチンの影響
本実施例は、血清インスリンとグルコースレベルが代謝活性と共にミオスタチン発現レベルによって影響を受けることを証明する。
【０２５０】
ミオスタチン変異体マウスにおける骨格筋肥大と脂肪蓄積の欠損が、全身代謝に及ぼす作用によるか否かを決定するために、変異体マウスの代謝プロフィールを調べた。血清トリグリセリドおよび血清コレステロールレベルは、野生型対照マウスと比較してミオスタチン変異体マウスでは有意に低かった（表１）。血清インスリンレベルはまた、ミオスタチン変異体マウスにおいて低いように思われた。しかし、食後および絶食時のグルコースレベルはいずれもホモ接合変異体マウスと野生型マウスにおいて区別できず（表１）、いずれの群のマウスも耐糖能試験において正常な反応を示した。結果は、ホモ接合ミオスタチンノックアウトマウスが、その血清インスリンレベルが野生型動物より低い場合であっても、血清グルコースの正常レベルを維持することができることを証明している。
【０２５１】
【表１】血清パラメータ
Figure 2004504832
＋／＋は野生型マウスを示す；−／−はホモ接合ノックアウトマウスを示す。
【０２５２】
代謝速度の差が、変異体マウスにおける脂肪蓄積の欠如を説明することができるか否かを決定するために、野生型および変異体マウスの酸素消費速度を熱量計を用いて比較した。変異体マウスは、野生型対照マウスより低い基礎代謝速度および低い総代謝速度を示した。これらの結果は、ミオスタチン変異体マウスにおける脂肪蓄積の欠損が、代謝活性の速度がより速いためではないことを示している。
【０２５３】
実施例５
ミオスタチンは遺伝的肥満マウスにおける脂肪蓄積に影響を及ぼす
本実施例は、ミオスタチン発現の欠如が、肥満の遺伝子モデルであるマウスにおいて脂肪の蓄積を抑制することを証明する。
【０２５４】
ミオスタチン活性の喪失は、正常マウスのみならず肥満マウスにおいても脂肪の蓄積を抑制しうるか否かを決定するために、肥満の遺伝子モデルである（エン（Ｙｅｎ）ら、ＦＡＳＥＢ Ｊ． ８：４７９〜４８８、１９９４）野鼠致死黄色（Ａｙ）マウスにおけるミオスタチンの変異の影響を調べた。致死黄色変異とミオスタチン変異とに関して二重にヘテロ接合であるマウスを作製して、これらの二重ヘテロ接合マウスの交配によって得られた子孫を調べた。
【０２５５】
Ａｙ／ａ、ミオスタチン−／−二重変異体マウスの全身体重は、Ａｙ／ａミオスタチン＋／＋マウスと比較して劇的に減少した（約９ｇ）。全身体重のこのような減少は、Ａｙ／ａミオスタチン、−／−二重変異体が、Ａｙ／ａミオスタチン＋／＋マウスより約２〜３倍多い骨格筋を有することを考慮すると、さらにより劇的であった。二重変異体は、Ａｙ／ａミオスタチン＋／＋マウスより筋肉が約１０ ｇ多く、したがって、組織の残りにおける総重量の減少は約１９ ｇであった。
【０２５６】
全身体重の減少は、全体的な脂肪含有量の減少が原因であった。表２に示すように、傍子宮および後腹膜脂肪体の重量は、Ａｙ／ａミオスタチン＋／＋マウスと比較すると、Ａｙ／ａ、ミオスタチン−／−二重変異体では５倍〜６倍減少した。これらの結果は、ミオスタチン変異の存在が肥満における脂肪の蓄積を劇的に抑制することを示している。
【０２５７】
ミオスタチン変異の存在はまた、グルコース代謝に劇的な影響を及ぼした。ミオスタチン変異を欠損する野鼠致死マウスは、大いに異常な耐糖能試験結果を示し、血清グルコースレベルはしばしば４５０〜６００ ｍｇ／ｄｌに達し、４時間のあいだに基準値レベルにごくゆっくりと回復する。雌性野鼠致死マウスは雄性マウスより影響を受けにくく、雌性マウスによっては、先に記述したようにこの試験においてほぼ通常に反応した（エン（Ｙｅｎ）ら、上記、１９９４を参照のこと）。対照的に、Ａｙ／ａミオスタチン−／−マウスはわずかに異常な耐糖能試験を示したが、これらの動物のいずれもＡｙ／ａミオスタチン＋／＋マウスにおいて認められた肉眼的な異常を示さなかった。
【０２５８】
これらの結果は、ミオスタチン変異が少なくとも部分的に野鼠致死マウスにおいて異常な糖代謝の発達を抑制することを示している。重要なことは、ミオスタチン変異に関してヘテロ接合であるマウスは、ミオスタチン＋／＋およびミオスタチン−／−マウスと比較して中間の反応を示し、このようにミオスタチンの用量依存的な作用を確認した。
【０２５９】
実施例６
組換えミオスタチンの精製
本実施例は、組換えミオスタチンを調製および単離する方法を提供する。
【０２６０】
ミオスタチンの生物活性を解明するために、大量のミオスタチン蛋白質をバイオアッセイ法のために精製した。高レベルのミオスタチン蛋白質を産生する安定なチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株は、メソトレキセート選択スキームを用いてジヒドロ葉酸レダクターゼカセットと共にミオスタチン発現カセットを同時増幅することによって作製した（マクフェロン（ＭｃＰｈｅｒｒｏｎ）ら、上記、１９９７）。ミオスタチンは、ヒドロキシアパタイト、レンチルレクチンセファロース、ＤＥＡＥアガロース、ヘパリンセファロースでの連続分画によって、最も産生量の多い株の条件培地から精製した。銀染色解析によって、これらの四つのカラムクロマトグラフィー段階の後に得られた精製蛋白質（「ヘパリン溶出液」と呼ぶ）は、分子量およそ３５キロダルトン（ｋＤａ）と１２ ｋＤａの二つの分子種からなることが判明した。
【０２６１】
精製蛋白質調製物は、二つのミオスタチンプロドメインペプチドと成熟Ｃ末端ミオスタチンペプチドのジスルフィド結合二量体との複合体を表すための様々な基準によって決定した。第一に、プロミオスタチン配列の特異的部分に対して作製された抗体を用いるウェスタンブロット解析によって、プロドメインとして３５ ｋＤａのバンド、および成熟Ｃ末端ペプチドとして１２ ｋＤａのバンドが同定された。第二に、非還元条件で、成熟Ｃ末端ペプチドに対して作製した抗体と反応する種は、ジスルフィド結合二量体と一致する電気泳動移動度を示した。第三に、プロドメイン対成熟Ｃ末端ペプチドのモル比は約１：１であった。第四に、プロドメインと成熟Ｃ末端ペプチドは、四つのカラムクロマトグラフィー段階を通して同時に精製された。最後に、Ｃ末端領域は、コンセンサスＮ結合グリコシル化シグナルを含まないが、成熟Ｃ末端ペプチドはレンチルレクチンカラムに結合し、このことは、成熟Ｃ末端ペプチドが、可能性があるＮ結合グリコシル化部位を含むプロドメインペプチドとのその相互作用によってカラムに結合したことを示している。
【０２６２】
これらの結果は、遺伝子改変ＣＨＯ細胞によって産生されたミオスタチンが、蛋白質分解によって処理された形で分泌され、得られたプロドメインと成熟Ｃ末端領域とが非共有結合によって会合して、ＴＧＦ−βに関する記述と類似のように、二つのプロドメインペプチドとＣ末端蛋白質分解断片のジスルフィド結合二量体とを含む複合体を形成する。ＴＧＦ−９複合体において、Ｃ末端二量体は、不活性な潜在型として存在し（ミヤゾノ（Ｍｉｙａｚｏｎｏ）ら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６３：６４０７〜６４１５、１９８８）、活性種は、酸、カオトロピック剤、反応性酸素種、もしくはプラスミンによる処理によって、またはトロンボスピンジンおよびインテグリンＩｖβ６を含む他の蛋白質との相互作用によって、この潜在型複合体から放出されうる（ローレンス（Ｌａｗｒｅｎｃｅ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍ． １３３：１０２６〜１０３４、１９８５；リオンズ（Ｌｙｏｎｓ）ら、Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １０６：１６５９〜１６６５、１９８８；シュルツ−チェリーとマーフィー−ウルリッチ（Ｓｃｈｕｌｔｚ−Ｃｈｅｒｒｙ ａｎｄ Ｍｕｒｐｈｙ−Ｕｌｌｒｉｃｈ）、Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １２２：９２３〜９３２、１９９３；バルセロス−ホフとディクス（Ｂａｒｃｅｌｌｏｓ−Ｈｏｆｆ ａｎｄ Ｄｉｘ）、Ｍｏｌ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． １０：１０７７〜１０８３、１９９６；ミュンガー（Ｍｕｎｇｅｒ）ら、Ｃｅｌｌ ９６：３１９〜３２８、１９９９）。さらに、精製プロドメインペプチド（潜在関連ペプチドまたはＬＡＰとしても知られる）をＴＧＦ−９複合体に加えると、インビトロおよびインビボで精製Ｃ末端二量体の生物活性を阻害する（ジェントリーとナッシュ（Ｇｅｎｔｒｙ ａｎｄ Ｎａｓｈ）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２９：６８５１〜６８５７、１９９０；ボッティンガー（Ｂｏｔｔｉｎｇｅｒ）ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９３：５８７７〜５８８２、１９９６）。
【０２６３】
プロドメインと成熟Ｃ末端ペプチドの複合体からなるヘパリン溶出液は、ＨＰＬＣ Ｃ４逆相カラムを用いて精製した。Ｃ末端二量体は、プロドメインより速くＨＰＬＣカラムより早期に溶出し、このように、プロドメインを含まないＣ末端二量体を単離することができる。ほとんどプロドメインを含む画分も同様に得られたが、これらの画分は少量のＣ末端二量体を含んだ。蛋白質のいくつかは、高分子量複合体として存在した。高分子量複合体の特性は不明であるが、還元剤の存在下または非存在下でのウェスタンブロット解析に基づくと、これらの複合体は、少なくとも一つのプロドメインペプチドと一つまたはそれ以上のジスルフィド結合によって結合した一つのＣ末端成熟ミオスタチンペプチドとを含みうる。実際に、プロペプチド（ＨＰＬＣ画分３５〜３７）に関して濃縮したＨＰＬＣ画分に存在する成熟Ｃ末端ペプチドのほとんどがこれらの高分子量複合体に存在した。これらの高分子量複合体はおそらく、遺伝子改変されたＣＨＯ細胞によって分泌された不適切に折り畳まれた蛋白質を表す。
【０２６４】
実施例７
ミオスタチンはアクチビン受容体と特異的に相互作用する
本実施例は、ミオスタチンが培養細胞上で発現されたアクチビンＩＩ型受容体に特異的に結合すること、およびこの特異的結合がミオスタチンプロドメインによって阻害されることを証明する。
【０２６５】
いくつかのＴＧＦ−βファミリーメンバーの受容体が同定されており、ほとんどが膜を１回貫通するセリン／トレオニンキナーゼである（マッサーグとワイス−ガルシア（Ｍａｓｓａｇｕｅ ａｎｄ Ｗｅｉｓ−Ｇａｒｃｉａ）、Ｃａｎｃｅｒ Ｓｕｒｖｅｙｓ ２７：４１〜６４、１９９６）。例えば、アクチビンＩＩ型受容体（Ａｃｔ ＲＩＩＡおよび／またはＡｃｔ ＲＩＩＢ）は、ＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバーに結合することが知られている。Ａｃｔ ＲＩＩＢ受容体を欠損するマウスの表現型は、前／後軸パターン形成の欠損およびＧＤＦ−１１ノックアウトマウスにおいて認められたものと類似の腎異常を示した（マクフェロン（ＭｃＰｈｅｒｒｏｎ）ら、Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ． ２２：２６０〜２６４、１９９９；オウとリ（Ｏｈ ａｎｄ Ｌｉ）、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖｅｌ． １１：１８１２〜１８２６、１９９７）。ＧＤＦ−１１とミオスタチン（ＧＤＦ−８）のアミノ酸配列は、成熟Ｃ末端領域において９０％同一であることから、ミオスタチンがアクチビンＩＩ型受容体と特異的に相互作用するか否かを調べた。
【０２６６】
ミオスタチンは、放射性ヨウ素化によって標識し、Ａｃｔ ＲＩＩＢ発現構築物によってトランスフェクトしたＣＯＳ細胞を用いて結合試験を行った。ミオスタチンはトランスフェクトしたＣＯＳ細胞と特異的に相互作用した。ミオスタチン結合は、過剰量の非標識ミオスタチンによって用量依存的に競合され、空のベクターをトランスフェクトした対照ＣＯＳ細胞では有意に低かった。ＢＭＰ ＲＩＩまたはＴＧＦ−β ＲＩＩ発現構築物をトランスフェクトした細胞では有意な結合は起こらなかった。Ａｃｔ ＲＩＩＢトランスフェクト細胞に対するミオスタチンの結合は飽和的であり、結合親和性はスキャッチャード解析によって決定すると約５ｎＭであった。
【０２６７】
受容体結合アッセイ法をまた用いて、この系において、ミオスタチンプロドメインが、成熟Ｃ末端二量体のＡｃｔ ＲＩＩＢとの特異的相互作用能を阻害するか否かを調べた。精製プロドメインペプチドを加えると、Ａｃｔ ＲＩＩＢトランスフェクトＣＯＳ細胞に対するＣ末端二量体の結合能は用量依存的に遮断された。これらの結果は、ミオスタチンプロドメインがミオスタチンの天然の阻害剤であることを示している。
【０２６８】
実施例８
ミオスタチンレベルの増加は体重減少を誘導する
本実施例は、ミオスタチンレベルの上昇がインビボでの実質的な体重減少につながりうることを証明する。
【０２６９】
一組の実験において、ミオスタチンを発現するＣＨＯ細胞をヌードマウスに注入した。ミオスタチン発現ＣＨＯ細胞腫瘍を有するヌードマウスは、細胞の注入後約１２〜１６日のあいだに重度の衰弱を示した。この消耗性症候群は、類似の選択プロセスを受けたがミオスタチンを発現しなかった多様な如何なる対照ＣＨＯ株も注射したヌードマウスでは認められなかった。さらに、ＣＨＯ細胞をトランスフェクトするために用いた構築物におけるミオスタチンコード配列は、メタロチオネインプロモーターの制御下であり、ミオスタチン発現腫瘍を有するマウスが硫酸亜鉛を含む水によって維持されている場合には、消耗性症候群は悪化した。ウェスタンブロット解析によって、ミオスタチン発現ＣＨＯ細胞を有するヌードマウスの血清中にミオスタチン蛋白質が高レベルで存在することが明らかとなった。これらの結果は、消耗性症候群がヌードマウスにおいてミオスタチンレベルの上昇に反応して誘導されることを示しており、下記に示すように、この結果は、精製ミオスタチンを注射したマウスにおいて類似の作用を認めることによって確認された。
【０２７０】
ミオスタチン発現ＣＨＯ細胞を有するヌードマウスにおいて認められた劇的な体重減少は、主に脂肪と筋重量の不均衡な喪失が原因であった。白色脂肪体の重量（嚢内の白色脂肪、子宮内脂肪、および後腹膜脂肪）は、対照ＣＨＯ細胞腫瘍を有するマウスと比較して９０％以上減少した。筋重量も同様に大きく減少し、個々の筋は１６日までにミオスタチン発現マウスでは対照マウスの場合の約半分の重量となった。筋重量のこのような喪失は、繊維の大きさおよび蛋白質含有量がこれに対応して減少することによって反映された。
【０２７１】
ミオスタチン発現ＣＨＯ細胞腫瘍を有するマウスはまた、低血糖となった。しかし、１６日間の試験中に調べた各期間で全てのマウスが等量の試料を消費したために、体重減少と低血糖症は食物消費量の差によるものではなかった。これらの結果は、ミオスタチン過剰発現が、癌またはＡＩＤＳのような慢性疾患を有する患者において起こるカヘキシア消耗性症候群と類似の劇的な体重減少を誘導することを示している。
【０２７２】
低用量のミオスタチンを用いてより慢性的な投与を行うと、脂肪重量の変化を認めた。例えば、ミオスタチン蛋白質１μｇを１日２回７日間注射すると、異なる多くの白色脂肪体（嚢内白色、子宮内、および後腹膜脂肪体）の重量の約５０％減少が起こったが、褐色脂肪（嚢内褐色）には有意な作用を認めなかった。これらの結果は、ミオスタチンが、インビボで体重減少と、極端な例では消耗性症候群を誘導しうることを確認する。
【０２７３】
実施例９
アクチビン受容体に対するミオスタチン結合の特徴付け
本実施例は、アクチビン受容体に対するミオスタチンの結合と、インビボでミオスタチンによって生じた生物作用との関係の特徴を調べる方法を記述する。
【０２７４】
Ａｃｔ ＲＩＩＡまたはＡｃｔ ＲＩＩＢノックアウトマウスを用いて、Ａｃｔ ＲＩＩＡまたはＡｃｔ ＲＩＩＢがインビボでミオスタチンの受容体であることを確認することができる。これらのマウスの詳細な筋の解析を行えば、アクチビン受容体のノックアウトが筋繊維の数またはサイズの変化に関連するか否かを決定することができる。Ａｃｔ ＲＩＩＡ／Ａｃｔ ＲＩＩＢ二重ホモ接合変異体は、胚形成のあいだに早期に死亡することから（ソング（Ｓｏｎｇ）ら、Ｄｅｖｅｌ． Ｂｉｏｌ． ２１３：１５７〜１６９、１９９９）、様々なホモ接合体／ヘテロ接合体の組み合わせのみを調べることができる。しかし、双方の遺伝子が筋組織に限って「欠失」され、それによって二重ホモ接合ノックアウトマウスを生後に検査することができる、組織特異的または条件的ノックアウトマウスを作製することができる。
【０２７５】
脂肪細胞の数またはこれらの脂肪細胞による脂質の蓄積がノックアウトマウスにおいて変化しているか否かを決定するために、脂肪組織に及ぼす作用をマウスの加齢に関して調べることができる。脂肪細胞の数および大きさは、コラゲナーゼ処置組織から細胞浮遊液を調製することによって決定される（ロドベル（Ｒｏｄｂｅｌｌ）、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２３９：３７５〜３８０、１９６４；ハーシュとガリアン（Ｈｉｒｓｃｈ ａｎｄ Ｇａｌｌｉａｎ）、Ｊ． Ｌｉｐｉｄ． Ｒｅｓ． ９：１１０〜１１９、１９６８）。動物における総脂質含有量は、乾燥死体の重量と脂質抽出後の残留乾燥死体重量とを測定することによって決定される（フォルチ（Ｆｏｌｃｈ）ら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２２６：４９７〜５０９、１９５７）。
【０２７６】
食後および絶食時グルコースおよびインスリン、トリグリセリド、コレステロールおよびレプチンを含む多様な血清パラメータも同様、調べることができる。上記のように、血清トリグリセリドおよび血清インスリンは、ミオスタチン変異体動物において減少している。アクチビン受容体ノックアウトマウスが外からのグルコース負荷に対して反応できるか否かは、耐糖能試験を用いて調べることができる。先に開示したように、グルコース負荷に対する反応は、５ヶ月齢で野生型マウスとミオスタチン変異体マウスにおいて同一であった。この知見は、マウスが年をとるにつれてマウスにおけるこれらのパラメータを測定することによって拡大することができる。血清中のインスリンレベルはまた、耐糖能試験のあいだの様々な時間に測定することができる。
【０２７７】
基礎代謝速度はまた、熱量計（コロンバスインストルメンツ社）を用いてモニターすることができる。先に開示したように、ミオスタチン変異体マウスは、３ヶ月齢でその野生型相対物より低い代謝速度を示す。この解析は、より年老いたマウスに拡大することができ、呼吸商も同様にこれらの動物において測定することができる。正常な熱発生を維持できるか否かは、４℃に置いた場合に体温を維持できるか否かと共に、基礎体温を測定することによって決定することができる。褐色脂肪重量と、褐色脂肪、白色脂肪、筋、およびその他の組織におけるＵＣＰ１、ＵＣＰ２、およびＵＣＰ３の発現レベルも同様に調べることができる（シュラウエン（Ｓｃｈｒａｕｗｅｎ）ら、１９９９）。
【０２７８】
体重の増加と比較した食物摂取量をモニターすることができ、飼料効率を計算することができる。さらに、高脂肪食を与えた動物の体重増加をモニターすることができる。高脂肪食によって維持した野生型マウスは急速に脂肪を蓄積するが、本明細書に開示した結果は、アクチビン受容体変異体動物が比較的痩身のままであることを示している。
【０２７９】
これらの研究の結果は、特に、その全体的な代謝速度に関するミオスタチンマウスの作用のより完全なプロフィールを提供して、それによってミオスタチンノックアウトマウスが脂肪の蓄積を抑制できることが、脂肪の形で保存するためにほとんどエネルギーが利用されないようにエネルギー利用がシフトする筋肉におけるミオスタチン変異の同化作用であるか否かに関する洞察を与える。例えば、脂肪蓄積の減少は、熱発生速度の増加が原因となりうる。これらの結果は、肥満およびＩＩ型糖尿病の異なる遺伝子モデルの意味においてミオスタチン活性の効果を比較するための基準値を提供するであろう。
【０２８０】
実施例１０
肥満および ＩＩ 型糖尿病の遺伝子モデルにおけるミオスタチンの作用の特徴付け
本実施例は、肥満またはＩＩ型糖尿病の治療におけるミオスタチンの作用を決定する方法を記述する。
【０２８１】
野生型マウスと比較してミオスタチン変異体マウスにおける総脂肪蓄積の劇的な減少は、ミオスタチン活性が肥満またはＩＩ型糖尿病を治療または予防するように操作することができる。ミオスタチン変異の作用は、例えば、「肥満」マウス（ｏｂ／ｏｂ）、「糖尿病」マウス（ｄｂ／ｄｂ）および野鼠致死黄色（Ａｙ）変異体系統を含むこれらの代謝疾患に関するいくつかの十分に特徴付けのなされたマウスモデルの意味において調べることができる。これらの系統のそれぞれは、上記の実質的にあらゆるパラメータおよび試験に関して異常である（例えば、エン（Ｙｅｎ）ら、上記、フリードマンとハラース（Ｆｒｉｅｄｍａｎ ａｎｄ Ｈａｌａａｓ）、Ｎａｔｕｒｅ ３９５：７６３〜７７０、１９９８を参照のこと）。ミオスタチン変異がこれらの他の変異を有するマウスにおいてこれらの異常の発症を遅らせるまたは抑制することができるか否かは、二重変異体を構築して、二重変異体動物に、ｏｂ／ｏｂ、ｄｂ／ｄｂ、または野鼠致死黄色変異のみを有する適当な対照同腹子と共に様々な試験を行うことによって調べることができる。
【０２８２】
先に開示したように、Ａｙマウスにおけるミオスタチン変異は、ミオスタチン変異体Ａｙマウスにおける脂肪蓄積の約５倍抑制、および耐糖能試験によって評価すると異常なグルコース代謝の発症の部分的抑制に関連した。これらの結果は、様々な年齢でのさらなる動物を含めるように拡大することができ、ｏｂ／ｏｂおよびｄｂ／ｄｂ変異体について類似の試験を行うことができる。これらの変異はいずれも劣性であるために、ミオスタチン変異とｏｂまたはｄｂ変異のいずれかに関して二重にホモ接合であるマウスを作製することができる。これらの遺伝子モデル系におけるミオスタチン機能の部分的喪失の影響を調べるために、ｏｂまたはｄｂ変異に関してホモ接合であるマウス、およびミオスタチン変異に関してヘテロ接合であるマウスも同様に調べる。ミオスタチンおよびｏｂ変異に関して二重にヘテロ接合であるマウスは作製されており、これらの二重ヘテロ接合マウスの交配から得られた子孫を、特に脂肪蓄積とグルコース代謝に関して調べることができる。肥満変異体におけるこれらの異常のいずれかまたは双方の部分的抑制は、ミオスタチンが肥満およびＩＩ型糖尿病の治療の標的となることを示すことができる。
【０２８３】
実施例１１
ミオスタチン活性に影響を及ぼしうるドミナントネガティブポリペプチドを発現するトランスジェニックマウスの特徴付け
本実施例は、ミオスタチン発現またはミオスタチンシグナル伝達を阻害しうるドミナントネガティブポリペプチドを発現することによって生後にミオスタチンの作用の特徴を調べる方法を記述する。
【０２８４】
ミオスタチン阻害剤
生後にミオスタチン活性を調節することを用いて、筋繊維数（過形成）および筋繊維の大きさ（肥大）に及ぼすミオスタチンの作用を調べることができる。ミオスタチン遺伝子が動物の一生の間で一定期間欠失している条件付ミオスタチンノックアウトマウスをこれらの試験に用いることができる。ｃｒｅレコンビナーゼと組み合わせたｔｅｔ調節物質は、そのようなマウスを作製するためのシステムを提供する。この系において、ｃｒｅの発現は、ドキシサイクリンの投与によって誘導される。
【０２８５】
ミオスタチン活性が動物の一生の間の一定期間減少または阻害されうるように、誘導型プロモーターからミオスタチンの阻害剤を発現するトランスジェニックマウスも同様に作製することができる。テトラサイクリン調節物質は、ミオスタチン発現がドキシサイクリンによって誘導されているそのようなトランスジェニックマウスを作製するために有用である。
【０２８６】
ハイブリッド逆ｔｅｔ−トランスアクチベータ（ＶＰ１６の活性化ドメインと変異体逆ｔｅｔリプレッサーとの融合蛋白質）とハイブリッドｔｅｔ−トランスリプレッサー（哺乳類Ｋｏｘ１のＫＲＡＢリプレッサードメインと本来のｔｅｔリプレッサーとの融合蛋白質）の同時発現を利用するｔｅｔ系の改変は、トランスジェニックマウスを作製するために特に有用となりうる（ロッシ（Ｒｏｓｓｉ）ら、Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ． ２０：３８９〜３９３、１９９８；フォースター（Ｆｏｒｓｔｅｒ）ら、Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２７：７０８〜７１０、１９９９）。この系において、ハイブリッド逆ｔｅｔ−トランスアクチベータは、ｔｅｔオペレータ配列に結合して、テトラサイクリンの存在下に限って転写を活性化する；ハイブリッドｔｅｔ−トランスリプレッサーは、ｔｅｔオペレータ配列に結合してテトラサイクリンの非存在下に限って転写を抑制する。これらの二つの融合蛋白質を同時発現させることによって、標的プロモーターの基礎活性は、テトラサイクリンの非存在下ではｔｅｔ−トランスリプレッサーによって沈黙化し、テトラサイクリンを投与すると、逆ｔｅｔ−トランスアクチベータによって活性化される。
【０２８７】
二つのタイプのトランスジェニック系統を作製することができる。第一のタイプにおいて、導入遺伝子は、筋特異的プロモーター、例えば筋クレアチニンキナーゼプロモーター（スターンバーグ（Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ）ら、上記、１９８８）またはミオシン軽鎖エンハンサー／プロモーター（ドノギュー（Ｄｏｎｏｇｈｕｅ）ら、上記、１９９１）の制御下でミオスタチン阻害剤ポリペプチドをコードする。個々のトランスジェニック系統を、骨格筋におけるｔｅｔ調節物質の特異的発現に関してスクリーニングして、認められた如何なる作用も例えば組み込み部位特異的作用によるものではないことを確認するために、二つのプロモーターのそれぞれに関していくつかの独立した系統を選択して調べる。ミオシン軽鎖プロモーター／エンハンサーの制御下で二つのｔｅｔ調節物質を含む構築物が構築されており、これを前核注入のために用いることができる。第二のタイプの系統において、導入遺伝子はさらにｔｅｔオペレータ配列を含む最小のＣＭＶプロモーターの制御下でミオスタチン阻害剤ポリペプチドを含む。
【０２８８】
ミオスタチン阻害剤は、本明細書に開示のように、ミオスタチン活性を阻害しうるミオスタチンのドミナントネガティブ型またはミオスタチンプロドメインとなりうる。ＴＧＦ−βファミリーメンバーのドミナントネガティブ型が記述されており（例えば、ロペス（Ｌｏｐｅｚ）ら、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １２：１６７４〜１６７９、１９９２；ウィットブロットとローザ（Ｗｉｔｔｂｒｏｄｔ ａｎｄ Ｒｏｓａ）、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖｅｌ． ８：１４４８〜１４６２、１９９４）、これは例えば、変異体蛋白質分解切断部位を含み、それによって蛋白質が生物学的に活性な種に処理されないように防止する。内因性の野生型遺伝子を細胞において同時発現させると、変異体蛋白質は、野生型蛋白質と非機能的ヘテロダイマーを形成し、このように、ドミナントネガティブとして作用する。プロミオスタチン切断部位に変異を含む変異体ミオスタチンポリペプチドが構築されており、２９３細胞において様々な比で変異体を野生型ミオスタチンと共に同時発現させることによって、ドミナントネガティブ作用に関して調べることができる。構築物を一過的にトランスフェクトした２９３細胞からの条件培地をウェスタンブロット解析によって調べて、成熟Ｃ末端二量体の形成を変異体が遮断するか否かを調べることができる。
【０２８９】
ミオスタチンプロドメインのみをコードする発現構築物を利用することができる。先に開示したように、プロドメインは成熟Ｃ末端二量体と堅固な複合体を形成して、培養において受容体を発現する細胞において、成熟Ｃ末端ミオスタチン二量体のＡｃｔ ＲＩＩＢとの結合能を遮断する。ＴＧＦ−βと同様に、ミオスタチンプロドメインはまた、インビボで不活性な潜在的複合体において成熟Ｃ末端二量体を維持することができる。
【０２９０】
これらのトランスジェニック動物を、ｔｅｔ調節物質を発現する動物と交配させて、ｔｅｔ調節物質と阻害剤標的構築物の双方を含む二重トランスジェニック系統を作製することができる。これらの二重トランスジェニック系統を、異なる成分が全て適切に発現されている系統に関してスクリーニングすることができる。飲料水にドキシサイクリンを投与する前後での、それぞれの系統における代表的なマウスの様々な筋および対照組織から得たＲＮＡを用いるノザンブロット解析を用いて、そのようなトランスジェニック系統を同定ことができる。ドキシサイクリンの非存在下では如何なる組織にも導入遺伝子も発現せず、ドキシサイクリンの存在下で筋肉に限って導入遺伝子を発現するトランスジェニック系統を選択する。
【０２９１】
選択したトランスジェニック動物にドキシサイクリンを投与して、筋重量に及ぼす作用を調べる。ドキシサイクリンは、胚形成のあいだに阻害剤の発現を誘導するために、妊娠した母親動物に投与することができる。トランスジェニック動物発達の際のミオスタチン活性を阻害する作用を、ミオスタチンノックアウトマウスにおいて認められた作用と比較することができる。ｔｅｔ調節物質の発現を駆動するためのプロモーターは、ミオスタチンが最初に発現される時期より発達の後期に誘導されうることから、トランスジェニックマウスにおける筋重量に及ぼす作用を、ミオスタチンノックアウトマスにおいて起こる作用と比較することができる。
【０２９２】
ミオスタチン活性を生後に阻害する作用は、出生後の様々な時間に二重トランスジェニックマウスにドキシサイクリンを投与することによって調べることができる。ドキシサイクリン処置は、例えば、３週齢で開始することができ、筋重量の差がミオスタチンノックアウトマウス対野生型マウスにおいて最高に達する月例である５ヶ月齢で、動物を解析することができる。動物は、筋重量に及ぼす阻害剤の作用に関して調べる。同様に、繊維の数および繊維の大きさに及ぼす作用を決定するために、筋肉を組織学的に調べることができる。さらに、トランスジェニックマウスにおける様々な筋の繊維型の解析を行って、Ｉ型またはＩＩ型繊維に対する選択的作用が存在するか否かを調べることができる。
【０２９３】
ドキシサイクリンは、ミオスタチン阻害剤の作用の特徴を調べるために、異なる用量で、かつ異なる時期に投与することができる。二重トランスジェニックマウスも同様に、ドキシサイクリンによって慢性的に維持することができ、その脂肪体重量および上記の他の関連する代謝パラメータに及ぼす作用を調べることができる。これらの研究の結果は、ミオスタチン活性を生後に調節すると、筋重量を増加させて、脂肪蓄積を減少させうることを確認し、このように、ミオスタチンのターゲティングが、臨床において多様な筋消耗および代謝疾患の治療にとって有用となりうることを示している。
【０２９４】
ミオスタチン
ミオスタチン導入遺伝子を含むトランスジェニックマウスも同様に調べて、ミオスタチンの発現時に生じた作用を、ミオスタチン発現ＣＨＯ細胞を含むヌードマウスにおいて認められた作用と比較することができる。上記と同様に、ミオスタチンは、条件（ｔｅｔ）および組織特異的調節エレメントの制御下に置くことができ、ヌードマウスにおいて認められたものと類似の消耗性症候群が起こるか否かを決定するために、トランスジェニックマウスにおけるミオスタチンの発現を調べることができる。ミオスタチン導入遺伝子は、例えば、導入遺伝子が内因性のミオスタチン遺伝子と区別できるように、ＳＶ４０に由来するプロセシングシグナルを含みうる。
【０２９５】
ドキシサイクリンの投与後様々な時間にミオスタチントランスジェニックマウスから血清試料を単離して、血清中のミオスタチン導入遺伝子産物のレベルを決定することができる。動物が有意な体重減少を示すか否かを決定するために、動物の全身体重を経時的にモニターする。さらに、個々の筋および脂肪体を単離および重量を測定して、筋繊維の数、大きさ、およびタイプを選択した筋試料において決定する。
【０２９６】
ミオスタチン導入遺伝子の発現レベルは、動物に投与したドキシサイクリンの用量を変化させることによって変化させることができる。導入遺伝子発現は、例えば、筋肉における導入遺伝子ＲＮＡレベルのノザンブロット解析または血清中のミオスタチン蛋白質レベルを用いてモニターすることができる。特定のレベルのミオスタチン導入遺伝子発現が同定されれば、ミオスタチンによって誘導される消耗の程度を相関させることが可能となる。トランスジェニック系統はまた、ミオスタチンノックアウトマウスと交配させて、ミオスタチンの唯一の起源が導入遺伝子からの発現であるマウスを作製することができる。発達の様々な時期でのミオスタチンの発現を調べて、繊維の数、繊維の大きさ、および繊維のタイプに及ぼすミオスタチンの作用を決定することができる。ミオスタチンの発現を正確かつ迅速に制御できるマウスが利用できれば、ミオスタチンシグナル伝達経路の特徴をさらに調べるための、かつミオスタチンシグナル伝達を調節するためにおそらく有用となりうる様々な作用物質の作用を調べるために強力なツールとなる。
【０２９７】
ミオスタチンシグナル伝達のエフェクター
骨格筋において特異的に発現されるＴＧＦ−９シグナル伝達経路の成分を含みうる、ミオスタチンシグナル伝達経路のいずれかのドミナントネガティブ型を含むトランスジェニックマウスを作製することができる。本明細書において開示するように、アクチビンＩＩ型受容体によって誘導される経路を通してシグナル伝達を媒介するＳｍａｄ蛋白質は、ミオスタチンシグナル伝達に関係しうる。
【０２９８】
Ａｃｔ ＲＩＩＢは、ミオスタチンに非常に近縁であるＧＤＦ−１１に結合することができ（マクフェロン（ＭｃＰｈｅｒｒｏｎ）ら、上記、１９９７；ゲーマー（Ｇａｍｅｒ）ら、上記、１９９９；ナカシマ（Ｎａｋａｓｈｉｍａ）ら、Ｍｅｃｈ． Ｄｅｖｅｌ． ８０：１８５〜１８９、１９９９）、およびＳｍａｄ２、Ｓｍａｄ３、およびＳｍａｄ４に結合して阻害することができるｃ−ｓｋｉの発現は、筋肉の増殖に劇的に影響を及ぼしうる（ストラーブ（Ｓｕｔｒａｖｅ）ら、上記、１９９０；バーク（Ｂｅｒｋ）ら、上記、１９９７；同様に、ルオ（Ｌｕｏ）ら、上記、１９９９；ストロシェイン（Ｓｔｒｏｓｃｈｅｉｎ）ら、上記、１９９９；サン（Ｓｕｎ）ら、上記、１９９９ａおよびｂ；アキヨシ（Ａｋｉｙｏｓｈｉ）ら、上記、１９９９）。本明細書に開示するように、ミオスタチンは、Ａｃｔ ＲＩＩＢと特異的に相互作用して、したがって、インビボでアクチビンＩＩ型受容体に結合して、Ｓｍａｄシグナル伝達経路を活性化することによって、少なくとも部分的にその生物作用を発揮することができる。
【０２９９】
筋増殖の調節におけるＳｍａｄシグナル伝達経路の役割は、Ａｃｔ ＲＩＩＢ／Ｓｍａｄシグナル伝達経路における特定の点で遮断される、または遮断されうるトランスジェニックマウス系統を用いて調べることができる。筋クレアチニンキナーゼプロモーター、またはミオシン軽鎖エンハンサー／プロモーターを用いて、Ｓｍａｄシグナル伝達経路の様々な阻害剤の発現を促進することができる。
【０３００】
この系において有用な阻害剤には、例えば、フォリスタチン；ドミナントネガティブＡｃｔ ＲＩＩＢ受容体；Ｓｍａｄ３のようなドミナントネガティブＳｍａｄポリペプチド；ｃ−ｓｋｉ；またはＳｍａｄ７のような阻害性Ｓｍａｄポリペプチドが含まれうる。フォリスタチンは、ＧＤＦ−１１を含む特定のＴＧＦ−βファミリーメンバーに結合してその活性を阻害することができる（ゲーマー（Ｇａｍｅｒ）ら、上記、１９９９）。アクチビンＩＩ型受容体のドミナントネガティブ型は、切断型ＧＤＦ受容体を発現させることによって、例えば細胞外ドメイン、特にＡｃｔ ＲＩＩＢ細胞外ドメインの可溶性型を発現させることによって、またはキナーゼドメインを欠損するもしくは変異体受容体がキナーゼ活性を欠損するような変異を含む切断型Ａｃｔ ＲＩＩＢ受容体を発現させることによって、得ることができる。Ｓｍａｄ７は、アクチビン、ＴＧＦ−β、およびＢＭＰによって誘導されるシグナル伝達経路を阻害することができる阻害性Ｓｍａｄとして機能する。例えば、Ｓｍａｄ３のドミナントネガティブ型は、Ｓｍａｄ３のＣ末端燐酸化部位を変異させて、それによってＳｍａｄ３機能を遮断することによって構築することができる（リウ（Ｌｉｕ）ら、上記、１９９７）。ｃ−ｓｋｉ過剰発現は、トランスジェニックマウスにおける筋の肥大に関連している（ストラーブ（Ｓｕｔｒａｖｅ）ら、上記、１９９０）。
【０３０１】
トランスジェニックマウスを作製して、それぞれの創始動物系統において導入遺伝子が適切に筋特異的に発現されているか否かを調べることができる。選択したマウスを、全身体重、個々の筋重量、ならびに筋繊維の大きさ、数、およびタイプに関して調べる。筋重量に及ぼす明確な作用を示すそれらの系統を、脂肪蓄積および上記の他の関連する代謝パラメータに関してさらに調べることができる。アクチビン受容体／Ｓｍａｄシグナル伝達経路における特定の段階をターゲティングするためにこれらの異なる作用物質を用いることは、異なる作用物質のシグナル伝達が異なる段階で重なり合うために特に情報に富む。例えば、フォリスタチンは、アクチビンおよびＧＤＦ−１１に結合してそれらの活性を阻害するが、ＴＧＦ−βには結合せず、ドミナントネガティブＳｍａｄ３は、アクチビンとＴＧＦ−β受容体の双方を通してのシグナル伝達を遮断することができる。Ｓｍａｄ７は、ＢＭＰ受容体を通してのシグナル伝達も阻害するために、さらにより多面発現性を有しうる。本研究によって、ミオスタチン活性を調節するための特異的標的を同定することができ、それによってミオスタチンシグナル伝達を調節する、したがってミオスタチン活性を調節する医薬品または他の作用物質を開発するための様々な戦略を提供することができる。
【０３０２】
特に、本明細書に記載のトランスジェニック系統を用いて、肥満またはＩＩ型糖尿病の発症に及ぼすミオスタチン機能またはＳｍａｄシグナル伝達経路を生後に遮断する影響を調べることができる。例えば、阻害性導入遺伝子をｏｂ／ｏｂ、ｄｂ／ｄｂ、およびＡｙ変異体マウスに交配させることができる。ドキシサイクリンの非存在下では、阻害性導入遺伝子は発現されず、したがって動物は親の変異体マウスのそれぞれと区別できない。ドキシサイクリンの非存在下では、阻害剤が発現されて、ミオスタチン活性を遮断することができる。これらの変異体動物において、代謝異常の発症に対するミオスタチン活性を阻害する影響を調べることができる。
【０３０３】
阻害剤の発現は、作用を最大限にするために、初期週齢、例えば３週齢で誘導することができる。さらに、ミオスタチン活性は、代謝異常が非可逆的になるほど重症となる前に遮断することができる。動物をドキシサイクリンによって維持して、脂肪の蓄積およびグルコース代謝に関連する試験を含む上記の試験を用いて、様々な週齢で評価することができる。一つまたはそれ以上の試験結果がｏｂ／ｏｂ、ｄｂ／ｄｂ、およびＡｙ変異体動物において異常となる如何なる週齢の遅延も同定することができる。肥満またはＩＩ型糖尿病の何らかの兆候を示すより週齢の高い動物を用いて類似の研究を行うことができ、脂肪重量およびグルコース代謝を含む様々なパラメータに及ぼすミオスタチン活性阻害の影響を調べることができる。これらの試験の結果は、肥満またはＩＩ型糖尿病を予防または治療するための努力において操作することができる特異的標的をさらに同定することができる。
【０３０４】
実施例１２
カヘキシアの誘導に及ぼすミオスタチン作用の特徴付け
本実施例は、カヘキシアの発症および進行におけるミオスタチンシグナル伝達の役割を調べる方法について記述する。
【０３０５】
アクチビン受容体およびＳｍａｄ経路は、正常な個体におけるミオスタチン活性の調節に関係するシグナル伝達経路の少なくとも一部を構成することができ、したがって、ミオスタチンの過剰レベルによって個体において起こりうる作用の媒介に関与しうる。本明細書において開示するように、例えば、カヘキシアは、少なくとも部分的に異常に高いレベルのミオスタチンによって媒介されうる。そのため、Ｓｍａｄ経路を通してシグナル伝達を操作する方法は、筋消耗全般および特にカヘキシアを治療する薬剤を開発するための新しい戦略を提供しうる。
【０３０６】
カヘキシアにおけるＳｍａｄシグナル伝達経路の役割は、例えば、インターロイキン−６（ＩＬ−６；ブラック（Ｂｌａｃｋ）ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． １２８：２６５７〜２６５９、１９９１、参照として本明細書に組み入れられる）、腫瘍壊死因子−Ｉ（ＴＮＦ−Ｉ；オリフ（Ｏｌｉｆｆ）ら、Ｃｅｌｌ ５０：５５５〜５６３、１９８７、参照として本明細書に組み入れられる）、または特定の腫瘍細胞によって誘導されうるカヘキシアに対する上記の様々なトランスジェニック系統の感受性を調べることによって調べることができる。ＩＬ−６およびＴＮＦ−Ｉの場合、阻害剤導入遺伝子をヌードマウスバックグラウンドにおいて交配させた後、ＩＬ−６またはＴＮＦ−Ｉを産生するＣＨＯ細胞を動物にチャレンジすることができ、これらがこのように過剰発現されるとヌードマウスにおいて消耗が誘導される。ＩＬ−６またはＴＮＦ−Ｉを過剰発現するＣＨＯ細胞は、ミオスタチン過剰産生細胞の作製に関して先に記述した方法を用いて調製することができる。例えば、ＴＮＦ−Ｉ ｃＤＮＡをｐＭＳＸＮＤ発現ベクターにクローニングした後（リーとナタンス（Ｌｅｅ ａｎｄ Ｎａｔｈａｎｓ）、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６３：３５２１〜３５２７、１９８８）、発現構築物の増幅されたコピーを有する細胞をメソトレキセートの増加濃度において段階的に選択することができる。
【０３０７】
マウスにおいてカヘキシアを誘導しうるルイス肺癌細胞（マッチス（Ｍａｔｔｈｙｓ）ら、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ ２７：１８２〜１８７、１９９１、参照として本明細書に組み入れられる）または結腸 ２６腺癌細胞（タナカ（Ｔａｎａｋａ）ら、Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５０：２２９０〜２２９５、１９９０、参照として本明細書に組み入れられる）のような腫瘍細胞も同様に、これらの試験に用いることができる。これらの細胞株は、マウスにおいて腫瘍として増殖させると重度の衰弱を引き起こす。このように、これらの腫瘍の影響を本明細書に記載の様々なトランスジェニックマウスにおいて調べることができる。様々な腫瘍細胞が特定の遺伝的背景において増殖することが認識されている。例えば、ルイス肺癌細胞は、通常Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて増殖するが、結腸 ２６癌細胞は、通常ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて増殖する。このように、導入遺伝子をこれらまたは他の遺伝的バックグラウンドと戻し交配させると、腫瘍細胞の増殖が可能となる。
【０３０８】
全身体重、個々の筋重量、筋繊維の大きさおよび数、飼料摂取量ならびにグルコースレベルを含む血清パラメータを含む様々なパラメータをモニターすることができる。さらに、ミオスタチン発現の増加がカヘキシアに関連していることを確認するために、血清ミオスタチンレベルおよび筋肉におけるミオスタチンＲＮＡレベルを調べることができる。これらの試験の結果から、ミオスタチンの作用が、これらの実験モデルにおいてカヘキシア誘導作用物質の下流に存在することを確認することができる。結果はまた、Ｓｍａｄシグナル伝達経路がこれらのモデルにおけるカヘキシア発症にとって必須であることを確認し、Ｓｍａｄシグナル伝達を調節することによってカヘキシアの治療において治療利益が選られうることを証明することができる。
【０３０９】
実施例１３
増殖分化因子 −８ （ ＧＤＦ−８ ）および ＧＤＦ−１１ 受容体の同定と特徴付け
本実施例は、ＧＤＦ−８（ミオスタチン）とＧＤＦ−１１の細胞表面受容体を同定して特徴を調べる方法を記述する。
【０３１０】
精製ＧＤＦ−８およびＧＤＦ−１１蛋白質は主に、生物活性のアッセイ法のために用いられる。ＧＤＦ−８およびＧＤＦ−１１の作用に関して可能性がある標的細胞を同定するために、それらの受容体を発現する細胞を検索する。この目的のため、精製蛋白質をクロラミンＴ法を用いて放射標識するが、この方法は、受容体結合試験のためにＴＧＦ−β（チェイフェツ（Ｃｈｅｉｆｅｔｚ）ら、上記、１９８７）、アクチビン（スギノ（Ｓｕｇｉｎｏ）ら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６３：１５２４９〜１５２５２、１９８８）、およびＢＭＰ（パラルカー（Ｐａｒａｌｋａｒ）ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８：３３９７〜３４０１、１９９１）のようなこのスーパーファミリーの他のメンバーを標識するために首尾よく用いられている。ＧＤＦ−８およびＧＤＦ−１１の成熟プロセシング型はそれぞれ多数のチロシン残基を含む。これらの蛋白質の受容体を同定するために異なる二つのアプローチが行われる。
【０３１１】
一つのアプローチは、受容体の数、親和性、および分布を決定するであろう。培養において増殖させた全細胞、胚もしくは成体組織からの凍結切片、または組織もしくは培養細胞から調節した総膜調製物のいずれかを標識蛋白質と共にインキュベートして、結合した蛋白質の量または分布を決定する。細胞株または膜を含む実験に関して、結合量は、数回洗浄後も培養皿上の細胞に結合した放射活性の量、または膜の場合には遠心後に膜に沈降している、もしくは膜と共にフィルター上に残っている放射活性の量を測定することによって決定されるであろう。細胞数がより限られている初代培養を含む実験では、結合部位は、写真乳剤をその上に重ねることによって直接可視化されるであろう。凍結切片を含む実験では、リガンド結合部位は、高解像度β−マックスハイパーフィルムにこれらの切片を露出することによって可視化されるであろう；より詳しい位置が必要である場合は、切片を写真乳剤に浸す。これらの全ての実験に関して、特異的結合は、競合物質として過剰量の非標的蛋白質を加えることによって決定されるであろう（例えば、リーとナタンス（Ｌｅｅ ａｎｄ Ｎａｔｈａｎｓ）、上記、１９８８を参照のこと）。
【０３１２】
第二のアプローチは、受容体の特徴を生化学的に調べることであろう。膜調製物または可能性がある培養標的細胞を標識リガンドと共にインキュベートして、受容体／リガンド複合体を、ＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバーを含む多様なリガンドの受容体を同定するために一般的に用いられている（マッサーグとライク（Ｍａｓｓａｇｕｅ ａｎｄ Ｌｉｋｅ）、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６０：２６３６〜２６４５、１９８５）スベリン酸ジスクシニミジルを用いて共有結合によってクロスリンクする。クロスリンクした複合体をＳＤＳポリアクリルアミドゲル上での電気泳動によって分離して、過剰量の非標識蛋白質の非存在下で標識されるが、存在下では標識されないバンドを調べる。推定の受容体の分子量は、リガンドの分子量を差し引くことによって推定されるであろう。これらの実験が取り組む重要な疑問は、ＧＤＦ−８およびＧＤＦ−１１シグナルが、ＴＧＦ−βスーパーファミリーの他の多くのメンバーと同様にＩ型およびＩＩ型受容体を通してシグナルを伝達するか否かである（マッサーグとワイス−ガルシア（Ｍａｓｓａｇｕｅ ａｎｄ Ｗｅｉｓ−Ｇａｒｃｉａ）、上記、１９９６）。
【０３１３】
これらの分子の受容体を検出する方法が得られれば、結合親和性および特異性を決定するためにより詳しい解析を行う。スキャッチャード解析を用いて、結合部位の数と解離定数を決定する。ＧＤＦ−８とＧＤＦ−１１との交叉競合解析を行うことによって、それらが同じ受容体に結合できるか否かおよびその相対的親和性を決定することが可能となるであろう。これらの試験は、同じまたは異なる受容体を通して分子がシグナルを伝達するか否かに関する示唆を与えるであろう。特異性を決定するために、他のＴＧＦ−βファミリーメンバーを用いる競合試験を行う。これらのリガンドのいくつかは市販されており、他のいくつかは、ジェネティクスインスチチュートインクから入手可能である。
【０３１４】
これらの実験に関して、多様な胚および成体組織ならびに細胞株を調べる。骨格筋におけるＧＤＦ−８の特異的発現およびＧＤＦ−８ノックアウトマウスの表現型に基づいて、最初の研究は、膜調製物および凍結切片を用いた受容体研究のために胚および成体筋組織に集中して行った。さらに、妊娠の様々な日齢の胚から、または記述のように成体筋からの筋衛星細胞から筋芽細胞を単離して培養する（ビバレリとコッス（Ｖｉｖａｒｅｌｌｉ ａｎｄ Ｃｏｓｓｕ）、Ｄｅｖｅｌ． Ｂｉｏｌ． １１７：３１９〜３２５、１９８６；コッス（Ｃｏｓｓｕ）ら、Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆ． ９：３５７〜３６８、１９８０）。培養における様々な日数後にこれらの初代細胞に対する結合試験を行って、オートラジオグラフィーによって結合部位の位置を特定すると、結合部位が筋ミオスタチンのような様々な筋原性マーカー（ビバレリ（Ｖｉｖａｒｅｌｌｉ）ら、Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １０７：２１９１〜２１９７、１９８８）と共に局在して、結合を、多数の徐核筋管の形成のような細胞の分化状態と相関させることができる。初代細胞を用いることの他に、受容体を調べるために細胞株を利用する。特に、まず、三つの細胞株Ｃ２Ｃ１２、Ｌ６、およびＰ１９を中心に実験を行う。Ｃ２Ｃ１２およびＬ６筋芽細胞は、培養において自発的に分化して、特定の増殖条件に応じて筋管を形成する（ヤッフェとサクセル（Ｙａｆｆｅ ａｎｄ Ｓａｘｅｌ）、上記、１９９７；ヤッフェ（Ｙａｆｆｅ）、上記、１９６８）。Ｐ１９胎児癌細胞は、ＤＭＳＯの存在下で骨格筋細胞を含む様々な細胞タイプに分化誘導することができる（ルドニッキとマクバーネイ（Ｒｕｄｎｉｃｋｉ ａｎｄ ＭｃＢｕｒｎｅｙ）、「奇形癌と胚性幹細胞：実際のアプローチ（ Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ａｎｄ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ ）」ロバートソン（Ｅ．Ｊ． Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ）、ＩＲＬ出版、ケンブリッジ、１９８７）。受容体結合試験は、これらの細胞株において様々な増殖条件および様々な分化段階で行われるであろう。初回試験は筋細胞を中心に行うが、ＧＤＦ−８およびＧＤＦ−１１受容体の有無に関して他の組織および細胞タイプを調べる。
【０３１５】
組換えヒトＧＤＦ−８（ｒｈＧＤＦ−８）ホモダイマーをこれらの結合試験において用いる。ｒｈＧＤＦ−８は、ＣＨＯ細胞を用いて発現させて、純度約９０％まで精製した。ｒｈＧＤＦ−８の予想分子量は２５ ｋＤａ〜２７ ｋＤａであり、還元されると、１２ ｋＤａ単量体に還元された。受容体リガンド結合アッセイ法においてＩ−１２５標識ＧＤＦ−８を用いると、二つの筋芽細胞株、Ｌ６およびＧ−８がＧＤＦ−８に結合した。非標識ＧＤＦ−８が標識リガンドの結合を有効に競合したことから、結合は特異的であった。解離定数（Ｋｄ）は３７０ ｐＭであり、Ｌ６筋芽細胞は多数の細胞表面結合蛋白質（受容体５，０００個／細胞）を有する。ＧＤＦ−１１（ＢＭＰ−１１）は、ＧＤＦ−８に対して非常に相同的（＞９０％）である。受容体結合試験によって、ＧＤＦ−８およびＧＤＦ−１１がＬ６筋芽細胞上で同じ結合蛋白質に結合することが判明した。ＧＤＦ−８が既知のＴＧＦ−９受容体に結合したか否かを決定することが重要である。ＴＧＦ−９はＧＤＦ−８の結合と競合せず、このことは、ＧＤＦ−８受容体がＴＧＦ−９受容体とは区別されることを示している。ＧＤＦ−８受容体は、ＧＤＦ−８に結合しない四つの筋芽細胞株Ｃ２Ｃ１２、Ｇ７、ＭＬＢ１３ＭＹＣ ｃ１４、およびＢＣ３Ｈ１を含む全ての筋芽細胞株上で発現されなかった。
【０３１６】
ＧＤＦ−８およびＧＤＦ−１１の受容体をコードする遺伝子または複数の遺伝子を得ることができる。最初の段階は、ＧＤＦ−８およびＧＤＦ−１１がその生物作用を発揮する作用機序を理解することに向けられるが、その受容体をコードする遺伝子をクローニングすることが重要である。上記の実験から、ＧＤＦ−８およびＧＤＦ−１１が同じ受容体または異なる受容体に結合するかはより明確であろう。同様に、これらの受容体の組織および細胞タイプ分布に関してかなりの情報が存在する。この情報を用いて、二つの異なるアプローチを用いて受容体遺伝子をクローニングする。
【０３１７】
第一のアプローチは、発現クローニング戦略を用いることであろう。実際に、これは、最初のアクチビンおよびＴＧＦ−β受容体をクローニングするために、マシューズとベール（Ｍａｔｈｅｗｓ ａｎｄ Ｖａｌｅ、Ｃｅｌｌ ６５：９７３〜９８２、１９９１）およびリンら（Ｌｉｎ、Ｃｅｌｌ ６８：７７５〜７８５、１９９２）によって最初に用いられた戦略であった。高親和性結合部位を最も高い相対数で発現する組織または細胞タイプからポリＡ−選択ＲＮＡを得て、これを用いて、ＣＭＶプロモーターとＳＶ４０複製開始点とを含む哺乳類の発現ベクターｐｃＤＮＡ−１においてｃＤＮＡライブラリを調製する。ライブラリを播種して、それぞれのプレートからの細胞をブロスにプールして凍結する。ＤＮＡを調製するために、それぞれのプールから少量を増殖させる。それぞれの個々のプールをチャンバースライドガラスにおいてＣＯＳ細胞に一過的にトランスフェクトして、トランスフェクトした細胞をヨウ素化ＧＤＦ−８またはＧＤＦ−１１と共にインキュベートする。未結合の蛋白質を洗浄して除去した後、リガンド結合部位をオートラジオグラフィーによって可視化する。陽性プールが同定されれば、そのプールからの細胞を低密度で再度播種して、プロセスを繰り返す。次に、陽性プールを播種して、個々のコロニーをグリッドに採取して、記述のように再度解析する（ウォン（Ｗｏｎｇ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２８：８１０〜８１５、１９８５）。
【０３１８】
最初に、コロニー１，５００個の大きさのプールをスクリーニングする。この複雑度の混合物において陽性クローンを確実に同定できるように、ＴＧＦ−βおよびクローニングしたＩＩ型受容体とを用いる対照実験を行う。ＴＧＦ−βＩＩ型受容体のコード配列をｐｃＤＮＡ−１ベクターにクローニングして、この構築物によって形質転換した細菌を、われわれのライブラリからの細菌と、１：１５００を含む様々な比で混合する。次に、この混合物から調製したＤＮＡをＣＯＳ細胞にトランスフェクトして、ヨウ素化ＴＧＦ−βと共にインキュベートして、オートラジオグラフィーによって可視化する。陽性シグナルが１：１５００の比で認められれば、クローン１５００個のプールをスクリーニングする。そうでなければ、技法が対照実験において陽性シグナルを同定するために十分に感度がよい比に対応する、より小さい大きさのプールを用いる。
【０３１９】
同定されているＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバーのほとんどの受容体が膜貫通セリン／トレオニンキナーゼファミリーに属するという事実（マッサーグとワイス−ガルシア（Ｍａｓｓａｇｕｅ ａｎｄ Ｗｅｉｓ−Ｇａｒｃｉａ）、上記、１９９６）を利用して、ＧＤＦ−８およびＧＤＦ−１１受容体をクローニングするために試行される第二の同様の戦略を用いる。これらの受容体の細胞質ドメインは配列が近縁であるために、縮重ＰＣＲプローブを用いてＧＤＦ−８およびＧＤＦ−１１の結合部位を含む組織において発現されるこの受容体ファミリーのメンバーをクローニングする。実際に、これはこの受容体ファミリーのメンバーのほとんどを同定するために用いられているアプローチである。一般的戦略は、既知の受容体の保存領域に対応する縮重プライマーを設計して、これらのプライマーを、適当なＲＮＡ試料（骨格筋であることが多い）から調製したｃＤＮＡ上でのＰＣＲに用いること、ＰＣＲ産物をサブクローニングすること、および最後に個々のサブクローンを配列決定することである。配列が同定されれば、それらを、さらなる解析から二個ずつのクローンを除去するためのハイブリダイゼーションプローブとして用いる。次に、同定された受容体を精製ＧＤＦ−８およびＧＤＦ−１１との結合能に関して調べる。このスクリーニングは、少量のＰＣＲ産物を生じるに過ぎないため、適当な組織から調製したｃＤＮＡライブラリからのそれぞれの受容体について完全長のｃＤＮＡクローンを得て、これをｐｃＤＮＡ−１ベクターに挿入して、ＣＯＳ細胞にトランスフェクトして、トランスフェクトした細胞をヨウ素化ＧＤＦ−８またはＧＤＦ−１１の結合能に関してアッセイする。理想的には、このスクリーニングにおいて同定されたあらゆる受容体をこれらのリガンドの結合能に関して調べる。しかし、同定された受容体の数は多く、完全長のｃＤＮＡの全てを単離してそれらを調べることはかなりの努力を必要としうる。同定される受容体のほぼ特定のいくつかは既知の受容体に反応するため、これらに関して、他の研究者からの完全長のｃＤＮＡクローンを得るか、または公表された配列に基づくＰＣＲによってコード配列を増幅するほうが簡単であろう。新規配列に関しては、組織分布をノザンブロット解析によって決定して、その発現パターンが、先に決定したＧＤＦ−８および／またはＧＤＦ−１１結合部位の分布に最も密接に類似する受容体に最も高い優先順位がつけられるであろう。
【０３２０】
特に、これらの受容体は二つのクラス、Ｉ型およびＩＩ型に分類され、これらは配列に基づいて区別することができ、いずれも完全な活性にとって必要であることが知られている。特定のリガンドはＩＩ型受容体の非存在下ではＩ型受容体に結合することができないが、他のリガンドは双方の受容体型に結合することができる（マッサーグとワイス−ガルシア（Ｍａｓｓａｇｕｅ ａｎｄ Ｗｅｉｓ−Ｇａｒｃｉａ）、上記、１９９６）。先に概要したクロスリンク実験は、Ｉ型およびＩＩ型受容体の双方がＧＤＦ−８およびＧＤＦ−１１のシグナル伝達にも関係しているか否かに関して何らかの示唆を示すはずである。もしそうであれば、ＧＤＦ−８およびＧＤＦ−１１がどのようにしてそのシグナルを伝達するかを完全に理解するために、これらの受容体サブタイプの双方をクローニングすることが重要であろう。Ｉ型受容体がＩＩ型受容体の非存在下でＧＤＦ−８およびＧＤＦ−１１と相互作用することができるか否かを予想することはできないために、（複数の）ＩＩ型受容体をまずクローニングする。少なくとも一つのＩＩ型受容体がこれらのリガンドに関して同定された後に限って、ＧＤＦ−８およびＧＤＦ−１１のＩ型受容体を同定する試みを行う。一般的な戦略は、ＰＣＲスクリーニングにおいて同定されたＩ型受容体のそれぞれをＩＩ型受容体と共に同時トランスフェクトして、その後クロスリンクによってトランスフェクトした細胞をアッセイすることであろう。Ｉ型受容体がＧＤＦ−８またはＧＤＦ−１１に関する受容体複合体の一部である場合、一つがＩ型受容体に対応し、もう一つがＩＩ型受容体に対応する二つのクロスリンクした受容体種が、トランスフェクトした細胞において検出されるはずである。
【０３２１】
ＧＤＦ−８およびＧＤＦ−１１受容体の検索はさらに、ＴＧＦ−βスーパーファミリーの少なくとも一つのメンバー、すなわちＧＤＮＦがＧＰＩ結合成分（ＧＤＮＦＲ−α）と受容体チロシンキナーゼ（ｃ−ｒｅｔ：トルップ（Ｔｒｕｐｐ）ら、Ｎａｔｕｒｅ ３８１：７８５〜７８９、１９９６；ダーベック（Ｄｕｒｂｅｃ）ら、Ｎａｔｕｒｅ ３８１：７８９〜７９３、１９９６；トレアノール（Ｔｒｅａｎｏｒ）ら、Ｎａｔｕｒｅ ３８２：８０〜８３、１９９６；ジング（Ｊｉｎｇ）ら、Ｃｅｌｌ ８５：１１１３〜１１２４、１９９６）とを含む完全に異なる型の受容体複合体を通してシグナル伝達を行うことができるという事実によってさらに複雑となる。ＧＤＮＦは、ＴＧＦ−βスーパーファミリーの最も遠縁のメンバーであるが、他のＴＧＦ−βファミリーメンバーも同様に、類似の受容体系を通してシグナルを伝達することができる可能性は十分にある。ＧＤＦ−８およびＧＤＦ−１１が類似の受容体複合体を通してシグナル伝達を行えば、発現スクリーニングアプローチは、この複合体の少なくともＧＰＩ結合成分（実際、ＧＤＮＦＲ−αは発現スクリーニングアプローチを用いて同定された）を同定することができるはずである。ＧＤＮＦの場合、ＧＤＮＦ欠損およびｃ−ｒｅｔ欠損マウスが類似の表現型であることは、ＧＤＮＦの可能性がある受容体としてｃ−ｒｅｔを示唆した。
【０３２２】
実施例１４
ＧＤＦ−１１ ノックアウトマウスの作製と特徴付け
いくつかの局面におけるＧＤＦ−１１ノックアウトマウスの表現型は、アクチビンＩＩＢ型受容体（Ａｃｔ ＲＩＩＢ）を含むＴＧＦ−９スーパーファミリーのいくつかのメンバーの受容体の欠失を有するマウスの表現型に類似する。ＧＤＦ−１１の生物機能を決定するために、ＧＤＦ−１１遺伝子を胚性幹細胞において相同的ターゲティングによって破壊した。
【０３２３】
マウス１２９ ＳｖＪゲノムライブラリを、ストラタジーン社（ラホヤ、カリフォルニア州）によって提供された説明書に従ってラムダＦＩＸＩＩにおいて調製した。ＧＤＦ−１１遺伝子の構造は、制限マッピングおよびライブラリから単離されたファージクローンの部分的配列決定によって推定した。ターゲティング構築物を調製するためのベクターは、フィリップ・ソリアーノ（Ｐｈｉｌｉｐ Ｓｏｒｉａｎｏ）およびカーク・トーマス（Ｋｉｒｋ Ｔｈｏｍａｓ）両氏から寄贈された。得られたマウスがＧＤＦ−１１機能に関して無効であることを確認するために、完全な成熟Ｃ末端領域を欠失させて、ｎｅｏカセットに置換した。Ｒ１ ＥＳ細胞にターゲティング構築物をトランスフェクトしてガンシクロビル（２ ＴＭ）およびＧ４１８（２５０ Ｔｇ／ｍｌ）によって選択し、サザンブロット解析によって解析した。
【０３２４】
ＧＤＦ−１１遺伝子の相同的ターゲティングは、ガンシクロビル／Ｇ４１８二重耐性ＥＳ細胞クローン１５５例中８例において認められた。いくつかのターゲティングクローンをＣ５７ＢＬ／６Ｊ胚盤胞に注入した後、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊおよび１２９／ＳｖＪ雌性動物の双方と交配させた場合にヘテロ接合の子を生じる一つのＥＳクローンからキメラを得た。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ１２９／ＳｖＪハイブリッドＦ１ヘテロ接合体を交配すると、野生型４９例（３４％）、ヘテロ接合体９４例（６６％）を生じ、ホモ接合変異体の成体子孫を認めなかった。同様に、１２９／ＳｖＪバックグラウンドでは成体のホモ接合無効動物を認めなかった（野生型３２例（３６％）およびヘテロ接合変異体動物５６例（６４％））。
【０３２５】
ホモ接合変異体が何週齢で死ぬかを決定するために、ヘテロ接合の雄性動物と交配させたヘテロ接合雌性動物から様々な妊娠齢で単離した胚の同腹子の遺伝子型を調べた。調べた全ての胚段階において、ホモ接合変異体の胚はほぼ予測頻度２５％で存在した。ハイブリッド新生児マウスでは、異なる遺伝子型も同様に予想されるメンデルの法則１：２：１で示された（＋／＋ ３４例（２８％）、＋／− ６１例（５０％）、および−／− ２８例（２３％））。ホモ接合変異体マウスは生存して生まれ、呼吸して哺乳することができた。しかし、ホモ接合変異体は全て出生後２４時間以内に死亡した。正確な死因は不明であるが、致死はホモ接合変異体の腎臓が重度の形成不全であるかまたは全く存在しなかったという事実に関連する可能性がある。
【０３２６】
ホモ接合変異体動物は、尾が極端に短いかまたはないことから容易に区別できた。これらのホモ接合変異体動物における尾の欠損の特徴をさらに調べるために、その骨格を調べて尾椎骨の破壊の程度を決定した。しかし、後期胚および新生児マウスの野生型と変異体骨格調製物とを比較したところ、動物の尾の領域のみならず、他の多くの領域においても差があることが判明した。差が認められたほぼあらゆる症例において、異常は、特定の体節がより前方の体節の典型である形態を示すように思われる脊椎体節のホメオティック変形を表すように思われた。これらの変形は、頚部領域から尾部領域に及ぶ軸骨格全体において明白であった。軸骨格において認められた欠損を除き、尾骨および脚骨のような骨格の残りは正常であるように思われた。
【０３２７】
変異体新生児動物における脊椎骨の前方変形は胸部領域では最も容易に明らかであり、ここでは胸部（Ｔ）体節の数が劇的に増加した。調べた野生型マウスは全て、その関連する肋骨の対それぞれについて胸椎１３個の典型的なパターンを示した。対照的にホモ接合変異体マウスは、胸椎の数の顕著な増加を示した。調べたホモ接合変異体は全て肋骨対が４〜５個余分に存在し、全体で１７〜１８個となったが、これらの動物の３分の１以上において、第１８肋骨が発育不全であるように思われた。したがって、腰椎（Ｌ）体節Ｌ１〜Ｌ４またはＬ５に通常対応する体節は、変異体動物の胸部体節において変形しているように思われた。
【０３２８】
その上、一つの胸椎がもう一つの胸椎の特徴である形態を有する胸部領域内の変形もまた明らかであった。例えば、野生型マウスにおいて、最初の肋骨７対は胸骨に結合し、残りの６対は結合していないかまたは遊離である。ホモ接合変異体では、結合および遊離の肋骨対の数の増加を認め、それぞれ１０〜１１および７〜８となった。したがって、胸部体節Ｔ８、Ｔ９、Ｔ１０および場合によっては野生型動物において全て遊離の肋骨を有するＴ１１でさえも、変異体動物では、より前方の胸部体節の典型である特徴、すなわち胸骨に結合した肋骨の存在を有するように変形した。この知見と一致して、野生型動物のＴ１０において通常認められる移行性の棘状の突起および移行性の関節状の突起は、ホモ接合変異体ではそのかわりにＴ１３に認められた。胸部領域内でのさらなる変化も同様に特定の変異体動物において認めた。例えば、野生型動物では、Ｔ１に由来する肋骨は通常、胸骨の上端に触れている。しかし、ハイブリッド２３例中２例および１２９／ＳｖＪホモ接合変異体マウス３例中２例では、Ｔ２はＴ１の形態と類似の形態を有するように変形しているように思われた；すなわちこれらの動物において、Ｔ２に由来する肋骨は、胸骨の上端に触れるように伸張した。これらの症例において、Ｔ１に由来する肋骨は、第二の対の肋骨に融合するように思われた。最後に、ホモ接合変異体８２％において、Ｔ２に通常存在する長い棘状の突起がＴ３の位置にシフトした。特定の他のホモ接合変異体では、脊椎胸骨肋骨対の非対称の融合を他の胸椎レベルで認めた。
【０３２９】
前方変形は胸部領域に限ったことではなかった。われわれが認めた最も前方への変形は、第６頚椎レベル（Ｃ６）であった。野生型マウスにおいて、Ｃ６は、腹側に二つの前結節が存在することによって容易に同定できる。いくつかのホモ接合変異体マウスでは、これらの二つの前結節の一つはＣ６に存在したが、もう一方はその代わりにＣ７位に存在した。したがって、これらのマウスでは、Ｃ７はＣ６と類似の形態を有するように部分的に変形しているように思われた。他の一つのホモ接合変異体は、Ｃ７では前結節が２個あるが、完全なＣ７からＣ６への変化の場合にはＣ６上に１個であり、部分的なＣ６からＣ５の変化では存在しなかった。
【０３３０】
軸骨格の変形も同様に、腰の領域にも伸張した。野生型動物は通常、腰椎６個のみを有するが、ホモ接合変異体は８〜９個を有した。変異体における腰椎少なくとも６個は、４〜５腰椎体節が胸部体節に変形していることを上記のデータが示唆しているために、仙椎と尾椎を通常生じる体節に由来するに違いない。したがって、ホモ接合変異体マウスは、野生型マウスに通常存在する仙骨前椎２６個と比較すると、全体で仙骨前椎３３〜３４個を有した。最も一般的な仙骨前椎パターンは、野生型マウスのＣ７／Ｔ１３／Ｌ６と比較して、Ｃ７／Ｔ１８／Ｌ８およびＣ７／Ｔ１８／Ｌ９であった。変異体動物にさらに仙骨前椎が存在することは、前肢と比較して後肢の位置が７〜８体節後方にずれているために、骨格の詳細な試験がなくとも明白であった。
【０３３１】
仙椎および尾椎はホモ接合変異体マウスにおいて影響を受けたが、それぞれの形質転換の正確な特性は容易に同定可能ではなかった。野生型マウスにおいて、仙骨体節Ｓ１およびＳ２は典型的に、Ｓ３およびＳ４と比較して広い横突起を有する。変異体では、同定可能なＳ１またはＳ２脊椎は存在しないように思われた。その代わりに、変異体動物は、Ｓ３と類似の形態を有するように思われるいくつかの椎骨を有した。さらに、四つ全ての仙椎の横突起は通常、互いに融合しているが、新生児ではしばしば最初の三つの椎骨の融合のみを認める。しかし、ホモ接合変異体では、仙椎の横突起はたいてい融合していなかった。最尾部の領域では、全ての変異体動物は、軟骨の広範囲の融合を伴う重度の変形脊椎を有した。融合が重度であるために、尾部領域における椎骨の総数を計数することは難しかったが、いくつかの動物において１５個までの横突起を計数した。野生型新生児動物においてもＳ４を尾椎と区別する形態学的基準が確立されていないために、これらが変異体における仙椎または尾椎を表すか否かは決定できなかった。それらが何であるかによらず、この領域における椎骨の総数は通常の約３０という数から有意に減少していた。したがって、変異体は、野生型マウスより有意に多くの胸椎および腰椎を有したが、体節の総数は尾が切断されているために変異体では減少していた。
【０３３２】
ヘテロ接合マウスはまた、軸骨格に異常を示したが、表現型はホモ接合マウスよりかなり軽度であった。ヘテロ接合マウスにおける最も明白な異常は、会合する肋骨椎を有するさらなる胸部体節の存在であった。この変形は、調べたあらゆるヘテロ接合動物に存在し、あらゆる場合において、さらなる肋骨対が胸骨に結合していた。したがって、会合する肋骨が通常胸骨に触れていないＴ８は、より前方の胸椎の特徴である形態に変形しているように思われ、Ｌ１は後部胸椎の特徴である形態に変形しているように思われた。前方変化を示す他の異常も同様に、ヘテロ接合マウスにおいて多様な程度に認められた。これらには、Ｔ２の特徴である長い棘状の突起のＴ３への一体節シフト、関節状および棘状突起のＴ１０からＴ１１へのシフト、前結節のＣ６からＣ７へのシフト、およびＴ２に会合する肋骨が胸骨の上端に触れるＴ２からＴ１への変形が含まれた。
【０３３３】
ＧＤＦ−１１変異体マウスにおいて認められた軸パターン形成における異常の基礎を理解するために、様々な発達段階で単離した変異体の胚を調べ、野生型の胚と比較した。肉眼的な形態の観察によって、妊娠９．５日までに単離したホモ接合変異体胚は、対応する野生型胚と容易に区別できなかった。特に、所定の発達週齢で存在する体節数は、変異体と野生型の胚で同一であり、体節形成速度は変異体において変化していないことを示唆した。１０．５日から１１．５日までに ｐ．ｃ．変異体の胚は、後肢が７〜８体節後方にずれることによって野生型胚と容易に区別することができた。尾の発達の異常も同様に、この段階で容易に明らかであった。併せて考慮すると、これらのデータは、変異体の骨格において認められた異常が、例えば、体節形成速度の増強によって、さらなる体節が挿入されるよりむしろ体節そのものが真に変形していることを表すことを示唆した。
【０３３４】
ホメオボックス含有遺伝子の発現が変化すれば、ショウジョウバエおよび脊椎動物において変形を引き起こすことが知られている。Ｈｏｘ遺伝子（脊椎動物ホメオボックス含有遺伝子）の発現パターンがＧＤＦ−１１無効変異体において変化しているか否かを調べるために、代表的な三つのＨｏｘ遺伝子、Ｈｏｘｃ−６、Ｈｏｘｃ−８、およびＨｏｘｃ−１１の発現パターンを１２．５日のｐ．ｃ．野生型、ヘテロ接合およびホモ接合変異体胚において全組織インサイチューハイブリダイゼーションによって決定した。野生型の胚におけるＨｏｘｃ−６の発現パターンは、胸部体節Ｔ１〜Ｔ８に対応する前椎骨８〜１５に及んだ。しかし、ホモ接合変異体において、Ｈｏｘｃ−６発現パターンは後方にシフトして、前椎骨９〜１８（Ｔ２〜Ｔ１１）に及んだ。類似のシフトをＨｏｘｃ−８プローブについて認めた。野生型胚において、Ｈｏｘｃ−８は前椎骨１３〜１８（Ｔ６〜Ｔ１１）において発現されたが、ホモ接合変異体胚では、Ｈｏｘｃ−８は、前椎骨１４〜２２（Ｔ７〜Ｔ１５）において発現された。最後に、Ｈｏｘｃ−１１発現も同様に、発現の前方境界が野生型の胚における前椎骨２８から変異体胚における前椎骨３６へとシフトしたという点において同様に後方にシフトした。（変異体胚では後肢の位置も同様に後方にシフトしたために、野生型および変異体におけるＨｏｘｃ−１１発現パターンは後肢と比較して類似であるように思われた）。これらのデータは変異体動物において認められた骨格の異常がホメオティック変形を表すさらなる証拠を提供する。
【０３３５】
ＧＤＦ−１１マウスの表現型は、ＧＤＦ−１１が、軸パターン形成の全体的な調節物質として胚形成の初期に作用することを示唆した。ＧＤＦ−１１がその作用を発揮するメカニズムを調べ始めるために、初期マウス胚におけるＧＤＦ−１１の発現パターンを、全組織インサイチューハイブリダイゼーションによって調べた。これらの段階において、ＧＤＦ−１１発現の主な部位は、内胚葉細胞が産生される既知の部位と正確に相関した。ＧＤＦ−１１の発現は、原条領域において８．２５〜８．５日のｐ．ｃ．（８〜１０体節）で最初に検出されたが、これは移入細胞が発達しつつある胚の中胚葉を形成する部位である。発現は、８．７５日のｐ．ｃ．では原条において維持されたが、尾芽が新規中胚葉細胞源として原条を置換して、ＧＤＦ−１１の発現が尾芽にシフトする９．５日のｐ．ｃ．では維持されなかった。したがって、これらの初期段階において、ＧＤＦ−１１は、新しい中胚葉細胞が発生して、おそらくその位置同一性を獲得する発達途中の胚の領域において合成されるように思われる。
【０３３６】
いくつかの局面におけるＧＤＦ−１１ノックアウトマウスの表現型は、ＴＧＦ−９スーパーファミリーのいくつかのメンバーの受容体、アクチビンＩＩＢ型受容体（Ａｃｔ ＲＩＩＢ）の欠失を有するマウスの表現型に類似した。ＧＤＦ−１１ノックアウトマウスの場合と同様に、Ａｃｔ ＲＩＩＢノックアウトマウスは余分の肋骨対を有し、腎欠陥スペクトルは、腎形成不全から腎臓が全く存在しないことまで及んだ。これらのマウスにおける表現型が類似していることは、Ａｃｔ ＲＩＩＢがＧＤＦ−１１の受容体となりうる可能性を生じる。しかし、ＧＤＦ−１１ノックアウトマウスの表現型がＡｃｔ ＲＩＩＢマウスの表現型より重度であることから、Ａｃｔ ＲＩＩＢはＧＤＦ−１１の唯一の受容体ではあり得ない。例えば、ＧＤＦ−１１ノックアウト動物は、４〜５個の余分の肋骨対を有し、軸骨格全体を通してホメオティック変形を示すのに対し、Ａｃｔ ＲＩＩＢノックアウト動物は、余分の肋骨対を３個有するに過ぎず、他の軸レベルで変形を示さない。さらに、データは、ＧＤＦ−１１ノックアウトマウスにおける腎欠陥がＡｃｔ ＲＩＩＢノックアウトマウスより重度であることを示している。Ａｃｔ ＲＩＩＢノックアウトマウスは、肺の異性のような左右軸形成の欠陥およびＧＤＦ−１１ノックアウトマウスでは認められなかった一連の心欠陥を示す。Ａｃｔ ＲＩＩＢは、アクチビンおよび特定のＢＭＰｓに結合することができるが、これらのリガンドに関して作製されたノックアウトマウスのいずれも左右軸形成の欠陥を示さなかった。
【０３３７】
ＧＤＦ−１１が中胚葉細胞に直接作用して位置同一性を確立するのであれば、本明細書に示したデータは、ＧＤＦ−１１作用の短期またはモルフォゲンモデルと一致するであろう。すなわち、ＧＤＦ−１１は、これらの細胞がＧＤＦ−１１発現部位で産生されることから、中胚葉前駆体に作用してＨｏｘ遺伝子の発現パターンを確立することができる、または胚の後方末端で産生されたＧＤＦ−１１が拡散してモルフォゲン勾配を形成することができる。ＧＤＦ−１１の作用のメカニズムがどのようなものであれ、全体的な前方／後方パターン形成がＧＤＦ−１１ノックアウト動物において起こるという事実は、ＧＤＦ−１１が前／後特定化の唯一の調節物質ではないことを示唆している。それにもかかわらず、ＧＤＦ−１１が軸パターン形成の全体的な調節物質として重要な役割を有すること、およびこの分子に関するさらなる研究によって、前／後軸に沿って位置同一性が脊椎動物胚においてどのように確立されるかに関する重要な新しい洞察が得られることは明白である。
【０３３８】
類似の表現型がＧＤＦ−８ノックアウト動物において予想される。例えば、ＧＤＦ−８ノックアウト動物は、野生型と比較した場合に多数の肋骨、腎欠陥および解剖学的差を有することが予想される。
【０３３９】
本発明は、上記の実施例を参照して記述してきたが、改変および変更も本発明の精神および範囲内に含まれると理解される。したがって、本発明は以下の請求の範囲によってのみ制限される。
【図面の簡単な説明】
【図１】マウスプロミオスタチン（配列番号：４）；ラットプロミオスタチン（配列番号：６）；ヒトプロミオスタチン（配列番号：２）；ヒヒプロミオスタチン（配列番号：１０）；ウシプロミオスタチン（配列番号：１２）；ブタプロミオスタチン（配列番号：１４）；ヒツジプロミオスタチン（配列番号：１６）；ニワトリプロミオスタチン（配列番号：８）；七面鳥プロミオスタチン（配列番号：１８）；およびゼブラフィッシュプロミオスタチン（配列番号：２０）のアミノ酸配列を示す。アミノ酸は、ヒトプロミオスタチン（配列番号：２）に対して番号をつける。破線は、相同性を最大にするために導入したギャップを示す。配列における黄体が同一の残基に影をつけて示す。
【図２】マウスプロミオスタチン（配列番号：４）とゼブラフィッシュのプロミオスタチン（配列番号：２０）のアミノ酸配列、ならびにサケ対立遺伝子１プロミオスタチン（配列番号：２７、「サケ１」）およびサケ対立遺伝子２プロミオスタチン（配列番号：２９、「サケ２」）のアミノ酸配列の一部を示す。ヒトプロミオスタチンに対するアミノ酸の位置をそれぞれの列の左側に示す（図１と比較；サケ１の最初のアミノ酸はヒトプロミオスタチン２１８位に対応する；サケ２の最初のアミノ酸はヒトプロミオスタチン２３９位に対応する）。破線は相同性を最大にするために導入したギャップを示す。ギャップを含む相対的アミノ酸の位置は、それぞれの列の上に沿って示す。配列における同一の残基に影をつけて示す。

Claims (95)

  1. 増殖分化因子（ＧＤＦ）受容体ポリペプチドまたは受容体ポリペプチドの機能的ペプチド部分をコードする実質的に純粋なポリヌクレオチド。
  2. ＧＤＦ−８受容体およびＧＤＦ−１１受容体からなる群より選択されるＧＤＦ受容体をコードする、請求項１記載のポリヌクレオチド。
  3. オリゴヌクレオチドの長さが少なくとも１５ヌクレオチドである、ＧＤＦ受容体をコードする、ポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド。
  4. ベクターに含まれる、請求項１記載のポリヌクレオチド。
  5. 請求項１記載のポリヌクレオチドを含む、組換え型宿主細胞。
  6. ポリヌクレオチドによってコードされるＧＤＦ受容体またはその機能的ペプチド部分が発現される、請求項５記載の組換え型宿主細胞。
  7. 実質的に純粋な増殖分化因子（ＧＤＦ）受容体またはその機能的ペプチド部分。
  8. ＧＤＦ−８受容体およびＧＤＦ受容体からなる群より選択される、請求項７記載のＧＤＦ受容体。
  9. ドミナントネガティブＧＤＦ受容体活性を有する、請求項７記載のＧＤＦ受容体またはその機能的ペプチド部分。
  10. 請求項７記載のＧＤＦ受容体またはその機能的ペプチド部分に特異的に結合する抗体。
  11. ＧＤＦ受容体またはＧＤＦ受容体のその機能的ペプチド部分の仮想表示。
  12. ＧＤＦ受容体がＧＤＦ−８受容体およびＧＤＦ−１１受容体からなる群より選択される、請求項１１記載の仮想表示。
  13. ＧＤＦ受容体と特異的に相互作用する作用物質をさらに含む、請求項１１記載の仮想表示。
  14. 細胞においてミオスタチンシグナル伝達に影響を及ぼす作用物質を細胞に接触させることを含む、細胞に及ぼすミオスタチンの作用を調節する方法。
  15. 作用物質が、細胞によって発現されるミオスタチン受容体とミオスタチンとの特異的相互作用を変化させる、請求項１４記載の方法。
  16. ミオスタチン受容体がアクチビン受容体である、請求項１５記載の方法。
  17. アクチビン受容体がアクチビンＩＩＢ型受容体である、請求項１６記載の方法。
  18. 作用物質がペプチドを含む、請求項１４記載の方法。
  19. ペプチドが、ミオスタチンと特異的に相互作用することができるミオスタチン受容体の細胞外ドメインを含み、それによって、細胞におけるミオスタチンシグナル伝達を減少または阻害する、請求項１８記載の方法。
  20. ペプチドが増殖分化因子（ＧＤＦ）プロドメインまたはその機能的ペプチド部分を含み、およびプロドメインまたはその機能的ペプチド部分がミオスタチンと特異的に相互作用して、それによって細胞におけるミオスタチンシグナル伝達を減少または阻害することができる、請求項１８記載の方法。
  21. ＧＤＦプロドメインがミオスタチンプロドメインである、請求項２０記載の方法。
  22. ミオスタチンプロドメインが、配列番号：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、および２０からなる群より選択されるプロミオスタチンポリペプチドのアミノ酸残基約２０〜２６２個、またはミオスタチンプロドメインの機能的ペプチド部分を含む、請求項２１記載の方法。
  23. ミオスタチンプロドメインが、以下からなる群より選択されるアミノ酸配列：
    配列番号：４に記載のアミノ酸残基約２０〜２６３個；
    配列番号：２に記載のアミノ酸残基約２０〜２６２個；
    配列番号：１０に記載のアミノ酸残基約２０〜２６２個；
    配列番号：１２に記載のアミノ酸残基約２０〜２６２個；
    配列番号：８に記載のアミノ酸残基約２０〜２６２個；
    配列番号：６に記載のアミノ酸残基約２０〜２６３個；
    配列番号：１８に記載のアミノ酸残基約２０〜２６２個；
    配列番号：１４に記載のアミノ酸残基約２０〜２６２個；
    配列番号：１６に記載のアミノ酸残基約２０〜２６２個；
    配列番号：２０に記載のアミノ酸残基約２０〜２６２個；
    および
    その機能的ペプチド部分、を含む、請求項２２記載の方法。
  24. ミオスタチンプロドメインがミオスタチンシグナルペプチドをさらに含む、請求項２１記載の方法。
  25. ペプチドが、アミノ酸配列：
    Ａｒｇ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ａｒｇ（配列番号：２１）
    を含む蛋白質分解切断部位での蛋白質分解切断に対して抵抗性である変異体プロミオスタチンポリペプチドである、請求項１８記載の方法。
  26. 変異体ミオスタチンポリペプチドがアミノ酸配列：
    Ａｒｇ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ａｒｇ（配列番号：２１）
    において変異を含む、請求項２５記載の方法。
  27. ペプチドが細胞によって発現されるミオスタチン受容体と特異的に相互作用するが、ミオスタチンシグナル伝達を活性化しない、請求項１８記載の方法。
  28. ペプチドが抗ミオスタチン受容体抗体である、請求項２７記載の方法。
  29. ペプチドが抗ミオスタチン抗体の抗イディオタイプ抗体である、請求項２７記載の方法。
  30. ペプチドが細胞によって発現されるミオスタチン受容体と特異的に相互作用して、ミオスタチンシグナル伝達を活性化する、請求項１８記載の方法。
  31. ペプチドが抗ミオスタチン受容体抗体である、請求項３０記載の方法。
  32. ペプチドが変異体ミオスタチン受容体である、請求項１８記載の方法。
  33. 作用物質がフォリスタチンである、請求項１５記載の方法。
  34. 作用物質がポリヌクレオチドであって、接触する段階が細胞にポリヌクレオチドを導入する段階を含む、請求項１４記載の方法。
  35. ポリヌクレオチドが、細胞において発現可能なペプチドをコードする、請求項３４記載の方法。
  36. ポリヌクレオチドが変異体ミオスタチン受容体をコードする請求項３４記載の方法。
  37. 変異体ミオスタチン受容体が、ミオスタチンシグナル伝達を活性化しないという条件でミオスタチンに結合するミオスタチン受容体細胞外ドメインを含む、請求項３６記載の方法。
  38. 変異体ミオスタチン受容体が、ミオスタチン受容体細胞外ドメインに機能的に会合した膜接着ドメインを含む、請求項３６記載の方法。
  39. 膜接着ドメインが、ミオスタチン受容体膜貫通ドメインの少なくとも膜接着部分を含む、請求項３８記載の方法。
  40. 変異体ミオスタチン受容体が蛋白質キナーゼ活性を欠損する、請求項３６記載の方法。
  41. ペプチドがミオスタチンシグナル伝達経路において細胞内ポリペプチドのレベルまたは活性に影響を及ぼす、請求項３５記載の方法。
  42. 細胞内ポリペプチドがＳｍａｄポリペプチドである、請求項４１記載の方法。
  43. ペプチドがドミナントネガティブＳｍａｄポリペプチドである、請求項４２記載の方法。
  44. ＳｍａｄポリペプチドがＳｍａｄ２、Ｓｍａｄ３、およびＳｍａｄ４からなる群より選択され、細胞におけるミオスタチンシグナル伝達を減少または阻害することを含み、ドミナントネガティブＳｍａｄポリペプチドが燐酸化部位を欠損する、請求項４３記載の方法。
  45. 細胞におけるミオスタチンシグナル伝達を増加させることを含み、ドミナントネガティブＳｍａｄポリペプチドがＳｍａｄ６およびＳｍａｄ７からなる群より選択される、請求項４３記載の方法。
  46. ミオスタチンシグナル伝達を減少または阻害することを含み、細胞内ポリペプチドがｃ−ｓｋｉポリペプチドである、請求項４１記載の方法。
  47. ポリヌクレオチドがアンチセンスヌクレオチド配列であるか、またはアンチセンスヌクレオチド配列をコードする、請求項３５記載の方法。
  48. ミオスタチンシグナル伝達を増加させることを含み、アンチセンスヌクレオチド配列がアンチセンスｃ−ｓｋｉヌクレオチド配列である、請求項４７記載の方法。
  49. アンチセンスヌクレオチド配列が、アンチセンスＳｍａｄヌクレオチド配列である、請求項４７記載の方法。
  50. 被験者における筋細胞または脂肪組織細胞におけるミオスタチンシグナル伝達を調節することを含み、被験者における筋または脂肪組織の異常な量の発達または代謝活性を少なくとも部分的に特徴とする病態の重症度を改善する方法。
  51. 筋細胞におけるミオスタチンシグナル伝達を減少または阻害することを含み、病態が消耗性障害である、請求項４９記載の方法。
  52. 消耗性障害がカヘキシアおよび食欲不振からなる群より選択される、請求項５０記載の方法。
  53. 消耗性障害が、筋ジストロフィーおよび神経筋疾患からなる群より選択される筋消耗性障害である、請求項５０記載の方法。
  54. 病態が代謝障害である、請求項４９記載の方法。
  55. 代謝障害が肥満およびＩＩ型糖尿病からなる群より選択される、請求項５３記載の方法。
  56. 筋細胞におけるミオスタチンシグナル伝達を減少または阻害することを含む、請求項５４記載の方法。
  57. 脂肪組織細胞におけるミオスタチンシグナル伝達の増加を含む、請求項５４記載の方法。
  58. 生物において増殖分化因子（ＧＤＦ）受容体によるシグナル伝達に影響を及ぼす作用物質を生物に投与することを含む、真核生物における筋組織または脂肪組織の増殖を調節する方法。
  59. 作用物質が変異体ＧＤＦ受容体である、請求項５７記載の方法。
  60. 変異体ＧＤＦ受容体がドミナントネガティブＧＤＦ受容体である、請求項５８記載の方法。
  61. 作用物質が、ＧＤＦ受容体によって媒介されるシグナル伝達経路において細胞内ポリペプチドのレベルまたは活性に影響を及ぼす、請求項５７記載の方法。
  62. ＧＤＦ受容体がミオスタチン受容体である、請求項５７記載の方法。
  63. 作用物質がミオスタチンシグナル伝達に影響を及ぼし、それによって生物における筋組織または脂肪組織の増殖を調節する、請求項６１記載の方法。
  64. 作用物質が、ミオスタチン受容体とミオスタチンとの特異的相互作用を変化させ、それによってミオスタチンシグナル伝達に影響を及ぼす、請求項６２記載の方法。
  65. 作用物質が、ミオスタチン受容体とミオスタチンとの特異的相互作用を減少または阻害して、それによって生物の増殖を増加させる、請求項６２記載の方法。
  66. 作用物質がポリヌクレオチドであり、投与する段階が生物の細胞にポリヌクレオチドを導入することを含む、請求項６１記載の方法。
  67. ポリヌクレオチドが、細胞において発現可能なペプチドをコードする、請求項６５記載の方法。
  68. ペプチドが変異体ミオスタチン受容体である、請求項６６記載の方法。
  69. 生物において筋組織の増殖を増加させること、脂肪組織の増殖を減少させること、またはその双方を含み、変異体ミオスタチン受容体が、ミオスタチンに結合することができるがミオスタチンシグナル伝達を活性化しないミオスタチン受容体細胞外ドメインを含む、請求項６７記載の方法。
  70. ペプチドがミオスタチンシグナル伝達経路における細胞内ポリペプチドのレベルまたは活性に影響を及ぼす、請求項６６記載の方法。
  71. 細胞内ポリペプチドがＳｍａｄポリペプチドである、請求項６９記載の方法。
  72. ＳｍａｄポリペプチドがＳｍａｄ２、Ｓｍａｄ３、およびＳｍａｄ４からなる群より選択され、生物において筋組織の増殖を増加させること、脂肪組織の増殖を減少させること、またはその双方を含み、ペプチドがドミナントネガティブＳｍａｄポリペプチドである、請求項７０記載の方法。
  73. ＳｍａｄポリペプチドがＳｍａｄ６およびＳｍａｄ７からなる群より選択され、生物において筋組織の増殖を減少させること、脂肪組織の増殖を増加させること、またはその双方を含み、ペプチドがドミナントネガティブＳｍａｄポリペプチドである、請求項７０記載の方法。
  74. 生物において筋組織の増殖を増加させること、脂肪組織の増殖を減少させること、またはその双方を含み、細胞内ポリペプチドがｃ−ｓｋｉポリペプチドである、請求項６９記載の方法。
  75. 真核生物が脊椎生物である、請求項５７記載の方法。
  76. 脊椎生物がウシ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ネコ、マウス、および魚類生物からなる群より選択される、請求項７４記載の方法。
  77. 真核生物が無脊椎生物である、請求項５７記載の方法。
  78. 無脊椎生物が軟体動物である、請求項７６記載の方法。
  79. ミオスタチンとミオスタチン受容体との特異的相互作用を減少または阻害して、それによって軟体動物の増殖を増加させる作用物質を軟体動物に投与することを含む、請求項７７記載の方法。
  80. 軟体動物がエビ、ホタテ貝、ヤリイカ、タコ、およびマキガイからなる群より選択される、請求項７７記載の方法。
  81. ミオスタチンシグナル伝達を増加させ、それによって軟体動物における筋組織の増殖を減少させる作用物質を軟体動物に投与することを含む、請求項７７記載の方法。
  82. 軟体動物がナメクジである、請求項８０記載の方法。
  83. 以下を含む、増殖分化因子（ＧＤＦ）受容体と特異的に相互作用する作用物質を同定する方法：
    ａ）ＧＤＦ受容体を試験作用物質と接触させる段階、および
    ｂ）作用物質がＧＤＦ受容体と特異的に相互作用するか否かを決定して、それによってＧＤＦ受容体と特異的に相互作用する作用物質を同定する段階。
  84. ＧＤＦ受容体がミオスタチン受容体である、請求項８２記載の方法。
  85. 作用物質がミオスタチンシグナル伝達を増加させるミオスタチン受容体アゴニストである、請求項８３記載の方法。
  86. ミオスタチン受容体アゴニストがミオスタチンの機能的ペプチド部分である、請求項８４記載の方法。
  87. ミオスタチン受容体アゴニストが抗体である、請求項８４記載の方法。
  88. 作用物質が、ミオスタチンシグナル伝達を減少または阻害するミオスタチン受容体アンタゴニストである、請求項８３記載の方法。
  89. ミオスタチン受容体アンタゴニストが変異体プロミオスタチンポリペプチドである、請求項８７記載の方法。
  90. 試験作用物質が試験作用物質の組み合わせライブラリを含む、請求項８２記載の方法。
  91. 試験作用物質の組み合わせライブラリにおける試験作用物質がペプチド、ポリヌクレオチド、ペプチド模倣体、有機低分子、およびその組み合わせからなる群より選択される、請求項８９記載の方法。
  92. 以下を含む、増殖分化因子（ＧＤＦ）受容体を同定する方法：
    ａ）ＧＤＦがＧＤＦの受容体と特異的に相互作用するために適した条件で、ＧＤＦまたはその機能的ペプチド部分と、ＧＤＦ受容体を含むことが疑われる試料とを接触させる段階；および
    ｂ）試料中のＧＤＦとＧＤＦ受容体との特異的相互作用を検出して、それによってＧＤＦ受容体を同定する段階。
  93. ＧＤＦがミオスタチンである、請求項９１記載の方法。
  94. 試料が筋細胞試料である、請求項９１記載の方法。
  95. 以下を含む、増殖分化因子（ＧＤＦ）受容体またはＧＤＦ受容体の機能的ペプチド部分と特異的に相互作用する作用物質を同定する方法：
    ａ）コンピューターシステムにおいて、仮想ＧＤＦ受容体またはその機能的ペプチド部分との特異的相互作用能に関して仮想試験物質を調べる段階；および
    ｂ）仮想ＧＤＦ受容体またはその機能的ペプチド部分と仮想試験物質との特異的相互作用を検出して、それによってＧＤＦ受容体またはその機能的ペプチド部分と特異的に相互作用する作用物質を同定する段階。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2007306885A (ja) * 2006-05-22 2007-11-29 Mitsubishi Chemicals Corp 新規非ヒト動物
JP2008506787A (ja) * 2004-07-29 2008-03-06 シェーリング−プラウ・リミテッド 動物においてミオスタチン活性を調節または阻害して赤身組織の成長増加を導くａｌｋ５インヒビターの使用
JP2012525128A (ja) * 2009-04-27 2012-10-22 ノバルティス アーゲー 筋肉増殖を増加させるための組成物および方法
JP2017132796A (ja) * 2012-11-06 2017-08-03 スカラー ロック インコーポレイテッドＳｃｈｏｌａｒ Ｒｏｃｋ，Ｉｎｃ． 細胞シグナル伝達を変調するための組成物及び方法

Families Citing this family (87)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7566768B1 (en) 1995-10-26 2009-07-28 The Johns Hopkins University School Of Medicine Promyostatin peptides and methods of using same
US7393682B1 (en) * 1993-03-19 2008-07-01 The Johns Hopkins University School Of Medicine Polynucleotides encoding promyostatin polypeptides
CA2157577C (en) * 1993-03-19 2009-11-17 Se-Jin Lee Growth differentiation factor-8
US6891082B2 (en) * 1997-08-01 2005-05-10 The Johns Hopkins University School Of Medicine Transgenic non-human animals expressing a truncated activintype II receptor
TWI329129B (en) * 2001-02-08 2010-08-21 Wyeth Corp Modified and stabilized gdf propeptides and uses thereof
US7320789B2 (en) 2001-09-26 2008-01-22 Wyeth Antibody inhibitors of GDF-8 and uses thereof
CA2476654A1 (en) * 2002-02-21 2003-09-04 Wyeth Follistatin domain containing proteins
MXPA04008150A (es) * 2002-02-21 2005-06-17 Wyeth Corp Gasp1: una proteina que contiene dominio de folistatina.
US7193069B2 (en) 2002-03-22 2007-03-20 Research Association For Biotechnology Full-length cDNA
EP1578928B1 (en) * 2002-09-16 2010-03-17 The Johns Hopkins University Metalloprotease activation of myostatin, and methods of modulating myostatin activity
AR047392A1 (es) 2002-10-22 2006-01-18 Wyeth Corp Neutralizacion de anticuerpos contra gdf 8 y su uso para tales fines
US20040223966A1 (en) * 2002-10-25 2004-11-11 Wolfman Neil M. ActRIIB fusion polypeptides and uses therefor
CA2510893C (en) 2002-12-20 2012-07-10 Amgen, Inc. Binding agents which inhibit myostatin
MXPA05012965A (es) 2003-06-02 2006-03-09 Wyeth Corp Uso de inhibidores de miostatina (gdf8) en conjuncion con corticoesteroides para el tratamiento de desordenes neuromusculares y composiciones farmaceuticas para ello.
JP2007535912A (ja) * 2003-12-31 2007-12-13 シェーリング−プラウ・リミテッド 中和エピトープベースの増殖増強性ワクチン
JP4688483B2 (ja) 2004-04-15 2011-05-25 株式会社テクノネットワーク四国 フォリスタチン変異体ポリペプチド
AU2005247508A1 (en) 2004-05-27 2005-12-08 Acceleron Pharma Inc. Cerberus/coco derivatives and uses thereof
US9045553B2 (en) 2004-05-27 2015-06-02 Acceleron Pharma, Inc. Cerberus/Coco derivatives and uses thereof
DK2332977T3 (en) 2004-07-23 2016-02-29 Acceleron Pharma Inc ActRII receptor polypeptides
EP1778275A2 (en) * 2004-08-12 2007-05-02 Wyeth Combination therapy for diabetes, obesity, and cardiovascular diseases using gdf-8 inhibitors
JP5335239B2 (ja) 2004-09-30 2013-11-06 マイオスティン・セラピューティクス・プロプライエタリー・リミテッド ミオスタチンアイソフォーム
JP2008000003A (ja) * 2004-10-01 2008-01-10 Oncorex Inc Ｐｉｍ−１活性／蛋白阻害医薬品
US7432079B2 (en) * 2004-12-30 2008-10-07 Schering-Plough Animal Health Corporation Plant virus coat fusion proteins with GDF8 epitopes and vaccines thereof
US20060240488A1 (en) * 2005-03-23 2006-10-26 Nowak John A Detection of an immune response to GDF-8 modulating agents
CN100393320C (zh) * 2005-06-24 2008-06-11 奥林格斯技术有限公司 治疗肌肉萎缩的寡核苷酸药物
GB2441581B (en) * 2005-06-24 2011-01-19 Roderic M K Dale Compositions and methods for the treatment of muscle wasting
WO2008005002A1 (en) * 2006-06-30 2008-01-10 Oligos Ets. Inc. Compositions and methods for the treatment of muscle wasting
CN101277976B (zh) * 2005-10-06 2012-04-11 伊莱利利公司 抗肌抑制素抗体
UA92504C2 (en) 2005-10-12 2010-11-10 Эли Лилли Энд Компани Anti-myostatin monoclonal antibody
US8067562B2 (en) 2005-11-01 2011-11-29 Amgen Inc. Isolated nucleic acid molecule comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:1
US8128933B2 (en) 2005-11-23 2012-03-06 Acceleron Pharma, Inc. Method of promoting bone growth by an anti-activin B antibody
CA2631013C (en) 2005-11-23 2019-06-11 Acceleron Pharma Inc. Activin-actriia antagonists and uses for promoting bone growth
AU2006321906C1 (en) * 2005-12-06 2014-01-16 Amgen Inc. Uses of myostatin antagonists
US8097596B2 (en) * 2006-06-30 2012-01-17 Lakewood-Amedex, Inc. Compositions and methods for the treatment of muscle wasting
WO2008005019A1 (en) * 2006-07-07 2008-01-10 Dale Roderic M K Compositions and methods for the treatment of muscle wasting
US8309068B2 (en) 2006-08-03 2012-11-13 Myostin Therapeutics Pty Ltd. Isolated polypeptides and methods of improving muscle strength
MX2009002470A (es) * 2006-09-05 2009-03-20 Lilly Co Eli Anticuerpos anti-miostatina.
AU2007332819A1 (en) 2006-12-08 2008-06-19 Acceleron Pharma Inc. Uses of cerberus, coco and derivatives thereof
US8895016B2 (en) 2006-12-18 2014-11-25 Acceleron Pharma, Inc. Antagonists of activin-actriia and uses for increasing red blood cell levels
US20100028332A1 (en) * 2006-12-18 2010-02-04 Acceleron Pharma Inc. Antagonists of actriib and uses for increasing red blood cell levels
WO2008076437A2 (en) * 2006-12-18 2008-06-26 Acceleron Pharma Inc. Activin-actrii antagonists and uses for increasing red blood cell levels
ES2415666T3 (es) * 2007-02-01 2013-07-26 Acceleron Pharma, Inc. Composiciones farmacéuticas que comprenden antagonistas de Activina-ActRIIa para uso en la prevención o el tratamiento de metástasis de cáncer de mama o pérdida ósea relacionada con el cáncer de mama
TW201627320A (zh) * 2007-02-02 2016-08-01 艾瑟勒朗法瑪公司 衍生自ＡｃｔＲＩＩＢ的變體與其用途
CN101687016B (zh) 2007-02-09 2014-12-31 阿塞勒隆制药公司 活化素-actriia拮抗剂和促进癌症患者骨骼生长的用途
WO2013106175A1 (en) 2011-12-19 2013-07-18 Amgen Inc. Variant activin receptor polypeptides, alone or in combination with chemotherapy, and uses thereof
TWI573802B (zh) 2007-03-06 2017-03-11 安美基公司 變異之活動素受體多肽及其用途
US8501678B2 (en) 2007-03-06 2013-08-06 Atara Biotherapeutics, Inc. Variant activin receptor polypeptides and uses thereof
US7960343B2 (en) 2007-09-18 2011-06-14 Acceleron Pharma Inc. Activin-ActRIIa antagonists and uses for decreasing or inhibiting FSH secretion
PE20091163A1 (es) 2007-11-01 2009-08-09 Wyeth Corp Anticuerpos para gdf8
NZ590327A (en) * 2008-06-26 2013-12-20 Acceleron Pharma Inc Methods for dosing an activin-actriia antagonist and monitoring of treated patients
US8216997B2 (en) * 2008-08-14 2012-07-10 Acceleron Pharma, Inc. Methods for increasing red blood cell levels and treating anemia using a combination of GDF traps and erythropoietin receptor activators
DK3750552T5 (da) * 2008-08-14 2024-08-26 Acceleron Pharma Inc Gdf-fælder
SG171813A1 (en) 2008-11-26 2011-07-28 Amgen Inc Variants of activin iib receptor polypeptides and uses thereof
US8138142B2 (en) * 2009-01-13 2012-03-20 Acceleron Pharma Inc. Methods for increasing adiponectin in a patient in need thereof
WO2010144452A1 (en) 2009-06-08 2010-12-16 Acceleron Pharma Inc. Methods for increasing thermogenic adipocytes
KR20180026795A (ko) 2009-06-12 2018-03-13 악셀레론 파마 인코포레이티드 절두된 ＡｃｔＲＩＩＢ-ＦＣ 융합 단백질
CA2779472C (en) * 2009-11-03 2021-03-16 Acceleron Pharma Inc. The use of a composition comprising an activin type iib receptor polypeptide in the treatment of fatty liver disease
AU2010322011B2 (en) 2009-11-17 2016-03-31 Acceleron Pharma Inc. ActRIIB proteins and variants and uses therefore relating to utrophin induction for muscular dystrophy therapy
CA2817008A1 (en) 2010-11-08 2012-05-18 Acceleron Pharma Inc. Actriia binding agents and uses thereof
CA2870547A1 (en) * 2012-04-18 2013-10-24 Nogra Pharma Limited Methods of treating diabetes and/or promoting survival of pancreatic islets after transplantation
RU2678117C2 (ru) 2012-11-02 2019-01-23 Селджин Корпорейшн Антагонисты активина-actrii и их применение для лечения нарушений костной ткани и других нарушений
EP2951205B1 (en) 2013-02-01 2021-08-11 Santa Maria Biotherapeutics, Inc. Anti-activin-a compounds for the treatment of ovarian cancer
US10092627B2 (en) 2013-04-08 2018-10-09 President And Fellows Of Harvard College Methods and compositions for rejuvenating skeletal muscle stem cells
AU2014262843B2 (en) * 2013-05-06 2017-06-22 Scholar Rock, Inc. Compositions and methods for growth factor modulation
EP3007719B1 (en) 2013-06-11 2021-03-17 President and Fellows of Harvard College Methods and compositions for increasing neurogenesis and angiogenesis
US20160287667A1 (en) * 2013-11-08 2016-10-06 President And Fellows Of Harvard College Methods and compositions for rejuvenating neuromuscular junctions
US10010498B2 (en) 2014-06-04 2018-07-03 Acceleron Pharma Inc. Methods for treatment of amyotrophic lateral sclerosis with follistatin fusion proteins
KR20210119546A (ko) 2014-06-04 2021-10-05 악셀레론 파마 인코포레이티드 폴리스타틴 폴리펩티드를 이용한 장애의 치료방법 및 치료를 위한 조성물
MX2016016531A (es) 2014-06-13 2017-04-25 Acceleron Pharma Inc Metodos y composiciones para el tratamiento de las ulceras.
MA41052A (fr) 2014-10-09 2017-08-15 Celgene Corp Traitement d'une maladie cardiovasculaire à l'aide de pièges de ligands d'actrii
AU2015342936B2 (en) 2014-11-06 2020-10-08 Scholar Rock, Inc. Anti-pro/latent-Myostatin antibodies and uses thereof
HUE062189T2 (hu) 2014-12-03 2023-09-28 Celgene Corp Aktivin-ACTRII-antagonisták és alkalmazások mielodiszpláziás szindróma kezelésére
AU2016238254B2 (en) 2015-03-26 2022-05-05 Acceleron Pharma Inc. Follistatin-related fusion proteins and uses thereof
BR112017022658A2 (pt) 2015-04-22 2018-07-17 Alivegen Usa Inc proteína isolada, molécula de ácido nucleico isolada, vetor recombinante, célula hospedeira, método de produção de uma proteína actriib híbrida, composição farmacêutica, métodos de tratamentos de distúrbios relacionados à miostatina ou relacionados à ativina a, de doença de desgaste dos músculos, de doença cardiovascular, de distúrbios metabólicos, de células cancerígenas, de doença renal, de doença inflamatória/autoimune, de uma doença de fibrose, de anemia, da dor, da condição de envelhecimento, de distúrbios ósseos, de um desgaste dos músculos ou distúrbio metabólico ou fibrótico ou inflamatório ou relacionado à ativina em indivíduos, e, método de indução do crescimento das células-tronco para o reparo de tecido ou regeneração do órgão em um indivíduo
IL258121B2 (en) 2015-09-15 2024-01-01 Scholar Rock Inc Antipro/latent myostatin antibodies and their uses
EP3949979A1 (en) 2016-01-06 2022-02-09 President and Fellows of Harvard College Treatment with gdf11 prevents weight gain, improves glucose tolerance and reduces hepatosteatosis
CN115814077A (zh) 2016-01-08 2023-03-21 供石公司 抗-原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素抗体及其使用方法
KR20230152153A (ko) 2016-03-10 2023-11-02 악셀레론 파마 인코포레이티드 액티빈 타입 2 수용체 결합 단백질 및 이의 용도
CN105699661A (zh) * 2016-03-14 2016-06-22 陈倩 Smad6在肝癌诊断治疗中的应用
KR20230169484A (ko) 2016-06-13 2023-12-15 스칼러 락, 인크. 미오스타틴 억제제의 용도 및 조합 요법
RS64159B1 (sr) 2017-01-06 2023-05-31 Scholar Rock Inc Tretiranje metaboličkih bolesti inhibiranjem aktivacije miostatina
CN107267637B (zh) * 2017-07-25 2021-08-24 华南农业大学 一种鸡肌间脂肪宽度相关的分子标记及其应用
CN109540818A (zh) * 2018-12-21 2019-03-29 云南农业大学 一种基于钙、磷血液生化标记选育武定鸡的方法
CN109754858B (zh) * 2019-01-11 2021-09-21 余鹏 甲氨蝶呤给药方案确定装置、存储介质及设备
WO2021044287A1 (en) 2019-09-03 2021-03-11 Novartis Ag Treatment of liver disease or disorder comprising actrii receptor antagonists
US20230241171A1 (en) 2020-07-10 2023-08-03 Institut Pasteur Use of gdf11 to diagnose and treat anxiety and depression
CN113223607B (zh) * 2021-05-28 2023-10-20 北京化工大学 采用smiles算法随机批量生成肝素类似物结构坐标的方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998052038A1 (en) * 1997-05-16 1998-11-19 The Procter & Gamble Company The use of a bone morphogenetic protein (bmp) receptor complex for screening
WO2000029570A1 (fr) * 1998-11-13 2000-05-25 Takeda Chemical Industries, Ltd. Nouvelle proteine et son utilisation
WO2000043781A2 (en) * 1999-01-21 2000-07-27 Metamorphix, Inc. Growth differentiation factor inhibitors and uses therefor

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5314695A (en) 1990-11-13 1994-05-24 Corvas International, Inc. Tissue factor based prothrombin time reagent
US5885794A (en) 1991-05-10 1999-03-23 The Salk Institute For Biological Studies Recombinant production of vertebrate activin receptor polypeptides and identification of receptor DNAs in the activin/TGF-β superfamily
CA2157577C (en) 1993-03-19 2009-11-17 Se-Jin Lee Growth differentiation factor-8
US6465239B1 (en) * 1993-03-19 2002-10-15 The John Hopkins University School Of Medicine Growth differentiation factor-8 nucleic acid and polypeptides from aquatic species and non-human transgenic aquatic species
US5994618A (en) 1997-02-05 1999-11-30 Johns Hopkins University School Of Medicine Growth differentiation factor-8 transgenic mice
US5734039A (en) 1994-09-15 1998-03-31 Thomas Jefferson University Antisense oligonucleotides targeting cooperating oncogenes
AU6274298A (en) 1997-02-05 1998-08-25 Johns Hopkins University School Of Medicine, The Growth differentiation factor-8
WO1999006559A1 (en) 1997-08-01 1999-02-11 The Johns Hopkins University School Of Medicine Methods to identify growth differentiation factor (gdf) receptors
US6891082B2 (en) * 1997-08-01 2005-05-10 The Johns Hopkins University School Of Medicine Transgenic non-human animals expressing a truncated activintype II receptor
WO1999040181A1 (en) * 1998-02-05 1999-08-12 The Johns Hopkins University School Of Medicine Growth differentiation factor-8
US6004937A (en) 1998-03-09 1999-12-21 Genetics Institute, Inc. Use of follistatin to modulate growth and differentiation factor 8 [GDF-8] and bone morphogenic protein 11 [BMP-11]
EP1075272B1 (en) * 1998-05-06 2009-07-15 Metamorphix, Inc. Methods for treating diabetes by inhibiting gdf-8
WO2001053350A1 (en) * 2000-01-18 2001-07-26 Agresearch Limited Myostatin and mimetics thereof

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998052038A1 (en) * 1997-05-16 1998-11-19 The Procter & Gamble Company The use of a bone morphogenetic protein (bmp) receptor complex for screening
WO2000029570A1 (fr) * 1998-11-13 2000-05-25 Takeda Chemical Industries, Ltd. Nouvelle proteine et son utilisation
WO2000043781A2 (en) * 1999-01-21 2000-07-27 Metamorphix, Inc. Growth differentiation factor inhibitors and uses therefor

Non-Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JPN6011019432; Ｂｌｏｏｄ Ｖｏｌ．８３，　Ｎｏ．８, 1994, ｐ．２１６３-２１７０ *
JPN6011019435; Ｊ．　Ｃｌｉｎ．　Ｉｎｖｅｓｔ． Ｖｏｌ．１０２，　Ｎｏ．２, 1998, ｐ．２９４-３０１ *
JPN6012050311; Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ． Ｖｏｌ．２７３，　Ｎｏ．４０, 1998, ｐ．２５６２８-２５６３６ *
JPN6012050312; 第２１回　日本分子生物学会年会プログラム・講演要旨集 , 1998, 第５３９頁、３Ｐ-４７４ *
JPN6012050314; 第２２回　日本分子生物学会年会プログラム・講演要旨集 , 1999, 第４１３頁、１Ｐ-０８４４ *
JPN6012050317; Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ． Ｖｏｌ．２７５，　Ｎｏ．８, 200002, ｐ．５４８５-５４９２ *
JPN6012050319; Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ． Ｖｏｌ．１４，　Ｎｏ．６, 1996, ｐ．３８１０-３８２１ *
JPN6012050320; Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ． Ｖｏｌ．１６，　Ｎｏ．３, 1996, ｐ．１０６６-１０７３ *
JPN6012050323; ＧＥＮＥＳ　＆　ＤＥＶＥＬＯＰＭＥＮＴ Ｖｏｌ．１１, 1997, ｐ．１８１２-１８２６ *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008506787A (ja) * 2004-07-29 2008-03-06 シェーリング−プラウ・リミテッド 動物においてミオスタチン活性を調節または阻害して赤身組織の成長増加を導くａｌｋ５インヒビターの使用
JP2007306885A (ja) * 2006-05-22 2007-11-29 Mitsubishi Chemicals Corp 新規非ヒト動物
JP2012525128A (ja) * 2009-04-27 2012-10-22 ノバルティス アーゲー 筋肉増殖を増加させるための組成物および方法
JP2014158480A (ja) * 2009-04-27 2014-09-04 Novartis Ag 筋肉増殖を増加させるための組成物および方法
JP2017014207A (ja) * 2009-04-27 2017-01-19 ノバルティス アーゲー 筋肉増殖を増加させるための組成物および方法
JP2017132796A (ja) * 2012-11-06 2017-08-03 スカラー ロック インコーポレイテッドＳｃｈｏｌａｒ Ｒｏｃｋ，Ｉｎｃ． 細胞シグナル伝達を変調するための組成物及び方法

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