CN105699661A - Smad6在肝癌诊断治疗中的应用 - Google Patents

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Abstract

SMAD6在肝癌诊断治疗中的应用。本发明公开了一种SMAD6在制备肝癌诊断试剂中的应用。本发明还公开了SMAD6转录本2型在制备治疗肝癌药品中的应用。本发明证明了SMAD6可以作为肝癌的诊断标志物和治疗靶标，通过检测SMAD6的表达水平可以对肝癌进行早期诊断，通过诱导SMAD6的表达而由此发挥SMAD6的生物学活性及其调控的TGF-β超家族信号传导作为药物作用机理可以辅助临床手术治疗提高肝癌病人的治愈率，改善病人的生活质量。

Description

SMAD6在肝癌诊断治疗中的应用
技术领域
本发明涉及生物制药领域，尤其涉及一种SMAD6作为肝癌诊断标志物和治疗靶标在肝癌诊断治疗中的应用。
背景技术
肝癌是死亡率仅次于胃癌、食道癌的第三大常见恶性肿瘤，中国每年死于肝癌约11万人，占全世界肝癌死亡人数的45％。早期肝癌多无症状或仅有轻微症状，大约80％的肝癌病人一经发现就就已到晚期，这些患者生存期大多在半年之内，对人类的生存健康构成了极大的威胁。
目前，肝癌的早期诊断主要依靠血清甲胎蛋白(AFP)检测结合超声显像对高危人群的监测。另外，电子计算机X线体层摄影(CT)可显示直径1.0cm以上的肿瘤，对早期诊断有一定帮助。临床上对肝癌的治疗仍以手术切除为首选，早期切除是提高生存率的关键。但由于根治切除仍有相当高的复发率，故术后宜定期随访观察以监察复发。找到及早诊断肝癌的有效方法，根据标志物的表达水平分析病人的预后情况，据此对病人在外科手术的基础上进行针对靶标分子进行辅助治疗显得尤为重要。
到目前为止，很多生物标志物都不能很好的用来作为临床诊断标识，仅有助于辅助诊断，或判别肿瘤的预后及化疗疗效。目前临床常用的的生物诊断标志物是甲胎蛋白(AFP)，由胎儿的肝脏、卵黃囊等处所分泌，一般由抽血检验血中浓度，正常值应小于20ng/ml。AFP诊断肝癌的准确率仅有60％～80％；存在假阳性和假阴性的情况。在许多情況或疾病会使AFP值升高，例如：怀孕、非恶性疾病－神经管缺陷、畸胎瘤、急性肝炎、慢性活动性肝炎、肝炎愈合时，以及其他恶性疾病，如生殖細胞瘤等。相反，极小的肝脏肿瘤，AFP可表达过低或延迟；肿瘤太大，分泌的AFP超过检测最大范围，也可出现假阴性现象。
综上所述，AFP的血中浓度检验值，只能作为辅助诊断或追踪病情、评估化疗效果之参考，无法以此来当作早期诊断肝癌的绝对工具。新的研究表明某些致癌基因激活、抑癌基因(TSG)失活等，与肝癌的发生和发展有关。寻找这些差异性表达的蛋白，以此作为诊断肿瘤的标志物，将是手术治疗的积极有效的辅助手段。TSG参与调节细胞生长、分化，其功能失活导致细胞表型异常。根据Knudson's二拷贝TSG失活假说，TSG失活的主要机制包括基因突变、基因启动子CpG岛甲基化和杂合性丢失，从而难以控制细胞恶变。如果发现肿瘤组织中某TSG基因其启动子CpG岛高度甲基化，导致基因沉寂或表达的缺陷，造成其信号传导途径的异常。这不仅可以用来作为早期诊断肿瘤的辅助工具；同时可以结合开发特异性的封闭/激活抗体(药物)，定向的调节肿瘤组织靶基因活性及其相关信号传递通路，结合临床手术治疗达到更有效的治疗肿瘤。
SMAD6是SMADs(smaandmadhomologue)胞浆蛋白家族中的抑制型蛋白。目前尚未发现关于SMAD6在制备肝癌诊断试剂中的应用以及在制备治疗肝癌药品中的应用的相关报道。
发明内容
本发明目的是提供了一种新的肝癌诊断标志物和肝癌治疗靶标用于肝癌诊断治疗中。
为实现上述目的，本发明公开了SMAD6在制备肝癌诊断试剂中的应用。
本发明还公开了SMAD6转录本2型在制备治疗肝癌药品中的应用。
SMAD6基因有两个转录本，即1型(V1)和2型(V2)，分别由两个启动子控制。TGF-β超家族成员包括TGF-β成员和骨形成蛋白(BMPs)等。SMADs直接参与TGF-β超家族成员的细胞内信号传导。TGF-β通过上调抑制型SMADs蛋白，如SMAD6、SMAD7介导细胞凋亡。抑制型SMADs蛋白反过来通过激活BMPs的信号转导，从而反向抑制TGF-β的活性，调节细胞外基质(ECM)的合成与降解，发挥抗纤维化作用。
我们发现SMAD6在肝癌组织中比配对的正常肝组织中的表达水平明显降低，在肝癌细胞系相对于原代肝细胞系中的表达水平明显降低。因此调节SMAD6在肝脏中的表达有可能将通过作用于不同TGF-β超家族成员，来发挥抗肝脏纤维化及抗肝癌细胞演进的双重作用。
肝癌组织SMAD6两个转录本蛋白在癌组织中表达均下调，而只有转录本2型的启动子CpG岛甲基化程度显著增高。进一步表明SMAD6转录本2型的启动子甲基化具有维持基因组稳定、抑制癌变、调节细胞分化和衰老的功能。因此在研发肝癌分子靶向药品时，通过作用于SMAD6转录本2，来诱导SMAD6的活性及表达，从而调节其参与的TGF-β超家族成员的细胞内信号传导、发挥其抑制细胞恶变的作用将是一个新的治疗靶点。
SMAD6的低水平表达能够诱导肝癌发生发展，SMAD6的高表达水平跟病人预后生存情况有密切的关系，因此SMAD6可以用来作为临床诊断肝癌及临床手术治疗疗效评估的标准之一。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明首次发现，SMAD6可以作为肝癌的诊断标志物和治疗靶标，通过检测SMAD6的表达水平可以对肝癌进行早期诊断，通过诱导SMAD6的表达而由此发挥SMAD6的生物学活性及其调控的TGF-β超家族信号传导作为药物作用机理可以辅助临床手术治疗提高肝癌病人的治愈率，改善病人的生活质量。
以下将结合附图对本发明的构思、产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。
附图说明
图1是Illumina的基于液相杂交捕获的亚硫酸氢盐修饰结合直接测序法(LHC-BS)分析SMAD6两种转录本启动子区甲基化程度；
图2是结合亚硫酸氢钠处理和酶解分析法及亚硫酸氢盐测序肝癌中的SMAD6基因启动子高甲基化状态与其RNA表达水平关系；
图3是SMAD6基因座上启动子区域的差异甲基化区域(DMR)及其调控的基因表达的假设；
图4是SMAD6转录本2型蛋白mRNA在2个肝原代细胞系及12个肝癌细胞系中的表达；
图5是SMAD6转录本1型及2型基因mRNA在45对人肝癌及其相对应的癌旁组织中的表达；
图6是SMAD6转录本2型的体外细胞增殖实验结果分析图；
图7是SMAD6转录本2型的体内成瘤实验结果分析图；
图8是SMAD6基因转录本2型表达与肝癌肝切除术后患者的生存率关系。
具体实施方式
实施例1
基于Illumina的液相杂交捕获的亚硫酸氢盐修饰结合直接测序法(theliquidhybridizationcapture-basedbisulfitesequencing(LHC-BS)approach)，建立全基因甲基化谱。对8对肝癌及癌旁组织进行分析，其中每个样本分析1.86百万个CpG位点(启动子区)，如图1所示。通过对差异甲基化位点的筛选及分析，对显著高甲基化的基因进一步验证，SMAD6转录本2型启动子区甲基化程度高于转录本1型，SMAD6转录本2型由此成为候选基因。LHC-BS分析SMAD6两种转录本启动子区甲基化程度，显示了SMAD6基因启动子上的前5个外显子区域及两个转录本转录起始区域(TSSs)并标出了差异甲基化区域(DMR)，差异甲基化区域是靠近SMAD6的转录起始区域，其CPGs甲基化程度在肝癌组织中高于其在癌旁组织。
实施例2
结合亚硫酸氢钠处理和酶解分析法及亚硫酸氢盐测序(IlluminaMiSeq-BSP)肝癌中的SMAD6基因启动子高甲基化状态与其RNA表达水平关系，如图2所示，联合分析甲基化水平和其表达谱。如图中四对病例所示，左边纵轴是甲基化水平，右边纵轴是表达谱，SMAD6在肝癌组织的高甲基化水平与其低表达向对应。以四对肝癌及癌旁组织举例说明SMAD6甲基化水平与基因表达负相关。
实施例3
SMAD6基因座上启动子区域的差异甲基化区域(DMR)及其调控的基因表达：如图3所示，SMAD6基因有两个转录本，转录本1型(V1)和转录本2型(V2)。成熟的V1mRNA2,886bp,成熟的V2mRNA1,293bp。我们所发现的DMR在位点于66,998,700…67,000,300bp(图1)是靠近SMAD6V2的转录起始区域，进一步通过功能验证，发现肝癌组织的V1及V2表达均受到影响，由此可预见此基因可通过调控该DMR上的CPGs甲基化程度来同时调控SMAD6V1和V2基因转录水平。
实施例4：Real-timePCR
实验材料：新鲜肝癌组织样本，人正常肝细胞系QSG7701,HL7702,以及肝癌细胞系ALEX,HepG2,Hep3B,Huh7,HLE,HLF,Sk-Hep1,Smmc7721,BEL-7402,MHCC-97L,MHCC-97H,和HCC-LM3均来自同济医院肝脏外科转化医学中心细胞－标本库。
实验步骤：
1，利用Trizol总RNA提取试剂抽提RNA(Invitrogen,CAUSA)。通过组织冰冻碾磨，细胞裂解等手段，抽提组织和细胞中的RNA。运用FastQuantRTKitwithgDNAEraser(TIANGENBIOTECH,中国北京)试剂盒反转录RNA合成cDNA，进一步通过TaqmanUniversalMasterMixⅡwithUNG实时定量RT-PCR技术(ABIStepOneRealTimePCRSystem,AppliedBiosystems)，检测组织，细胞水平上TRIM59基因的表达水平。SMAD6转录本1(货号：AJI1MXF)和SMAD6转录本1(货号：AJMSG5R)TaqMan探针由AppliedBiosystems设计，在ABI7900HT定量PCR上实时定量检测PCR结果。
2，用2-ΔΔCT方法以内参GAPDH的表达水平标准化SMAD6转录本1和转录本2基因的表达水平。其在肝细胞系和肝癌细胞系的结果如图4所示，通过对人正常肝细胞系QSG7701,HL7702,以及肝癌细胞系ALEX,HepG2,Hep3B,Huh7,HLE,HLF,Sk-Hep1,Smmc7721,BEL-7402,MHCC-97L,MHCC-97H和HCC-LM3的分析，发现SMAD6V2在肝癌细胞系的的表达均较肝正常细胞系低，其中，Smmc7721肝癌细胞中SMAD6V2的表达最低。其在肝癌组织的结果如图5所示，SMAD6V1及V2在肝癌组织的的表达均较其对应的癌旁组织低。
因此，通过RT-PCR发现，肝癌细胞中SMAD6转录本1和转录本2的mRNA水平显著降低。
实施例5:细胞增殖实验
实验材料：
细胞增殖检测试剂盒CellTiter96AQueous(MTS)(Promega，G358A)Matrigel(BD，货号：356234)。
通过实施例4中的RT-PCR基因水平检测，筛选出低表达SMAD6转录本2(V2)的两肝癌细胞株HLE/Smmc7721cell，对选取的细胞系HLE/Smmc7721cell细胞分别进行过表达实验检测SMAD6V2对抑制肝癌细胞的增殖、克隆形成以及体内肿瘤所产生的抑制作用。
细胞系的建立方法：
(1)过表达慢病毒构建：将SMAD6cDNA克隆构建到慢病毒表达载体P-LX304(Addgene)上，利用HEK293T慢病毒包装系统，包装成慢病毒用于后续细胞实验。另外我们选用空载体病毒表达载体质粒作对照，同样利用HEK293T包装系统包装病毒用于后续对照实验。
SMAD6V2:参考NCBIcDNA序列(NM_001142861.2)
注：HEK293T三质粒包装系统：将目的质粒与病毒包装辅助质粒pCMV-dR8.2，pCMV-VSV-G(Addgene)。按照3∶2∶1的量混合，利用磷酸钙共沉淀法转染预处理(转染前一小时加入含有终浓度25uM氯喹)低代数HEK293T，转染24小时更换含有1％Penicillin/streptomycin(Gibco15140-122)，1％SodiumPyruvate(Gibco113600-70)，1％SodiumButyrate(100xsolution，0.5M，sigma，19364)不含血清的超级培养液(Lonza12-725F)。等到48小时后收集细胞上清液，0.45μm滤膜(Millipore)过滤除掉细胞碎片，4℃22000rpm高速离心2小时分离上清用PBS溶解病毒沉淀，获取病毒液用于后续细胞转染。
取PBS缓冲液(pH＝7.4)用于制备Non-transfected细胞系。
(2)将HLE和Smmc7721cell培养于RPMI1640(Gibco，c22400500Bt)完全培养基中(添加1％Penicillin/streptomycin，Gibco15140-122，1％L-Glutamine，Gibco25030-081)，待HLE和Smmc7721cell贴壁率达到80％时更换新鲜培养液，按照MOI＝1∶20分别添加步骤1中得到的过表达SMAD6V2、过表达SMAD6V2的对照Vector慢病毒，按照添加干扰病毒的体积等量添加相同体积的PBS(pH＝7.4)到Non-transfected实验组中，混合摇匀，最后按照终浓度为8ug/ml加入辅助转染试剂polybrene(millipore，TR-1003-G)混合摇匀。转染72小时后，观测荧光表达情况，此时添加针对表达载体所需抗生素puromycin(购自前尘生物，geneoperation，ISY1130-025MG)，终浓度为5ug/ml。
(3)低密度接种细胞：将步骤(2)中得到的细胞100个接种到6孔板的一个孔中，仍然培养在含有抗生素(puromycin)(5ug/ml)的RPMI1640完全培养基中，待到细胞长出克隆，在显微镜下观察具有荧光的细胞集落，在6孔板的盖子上用记号笔标记位置，于超净台中按照标记滴加少量(能够覆盖细胞集落即可)0.25％胰酶(Gibco，25200-072)，置于细胞培养箱中消化，细胞消化来之后用200ul移液枪吸出细胞单独培养，一直1ug/mi抗生素维持三周，之后抗生素浓度减半(2ug/ml)维持两个月，由此得来HLE/Smmc7721cell对应的过表达细胞系，HLE-SMAD6V2、Smmc7721－SMAD6V2；Vector细胞系，即用来进行后续体内体外实验。
实验步骤：
1、体外细胞增殖实验：
取HLE/Smmc7721以及对应建立的过表达细胞系，用完全培养基(Gibico，RPMI1640)配成细胞悬液，取6孔板，分别加入上述的细胞系，每孔500个细胞，每组设3个复孔，14天后，终止培养，弃除固定液，加适量姬姆萨应用液(1份姬姆萨原液+9份PBS)染色30min，流水洗去染色液，空气中干燥。运用AlphaInnotechImagingsystem(AlphatronAsiaPteLtd,新加坡)计数细胞克隆(直径大于100um定义为一个克隆)。选择两个肝癌细胞系HLE和Smmc7721过表达SMAD6V2。如图6所示，未经TGF-β(#1)预处理的HLE和Smmc7721细胞过表达V2后可以细胞的增值速率减慢，HLE的细胞克隆数由40/孔减少到30/孔，Smmc7721的细胞克隆数由60/孔减少到40/孔。经过TGF-β(5ng/ml)(#2)预处理24小时后，尤其在Smmc7721细胞系中，发现TGF-β可联合增强SMAD6V2对癌细胞的抑制作用，细胞克隆数由40/孔减少到35/孔(*p<0.05)。
2、体内成瘤实验：
将Smmc7721或HLE以及相应的过表达细胞系细胞悬浮于不含血清的基本培养基(Gibico，RPMI1640)中，将50ul基本培养基含有1,000,000个肿瘤细胞的悬浮液与等体积的基质胶(BD，货号356234)混合均匀，然后注射入裸鼠的皮下，注入量为100ul/只，形成皮下移植瘤，然后用此移植瘤组织再接种于裸鼠肝内，建立肝原位移植瘤模型(间接肝原位移植瘤模型)。4周后每十天取小鼠肝脏，测量肿瘤的大小，计算的方法是V＝a^2*b(其中V是体积，a是最短边的长度，b是最长边的长度)。通过间接肝原位移植瘤模型验证SMAD6转录本2型(V2)对瘤体大小的影响：同图7，选择两个肝癌细胞系HLE和Smmc7721过表达SMAD6V2。如图7中B所示，7721或HLE高表达SMAD6V2可以减小肝癌瘤体大小，提高小鼠存活率(如图7中B所示)。特别是植入Smmc7721瘤的小鼠组，高表达SMAD6V2后60天的生存率由25％增长为60％(*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001)。
实施例6
如图8所示，208例肝癌患者肝切除术后随访60个月。分别以SMAD6V2的中位数为标准，高于中位数为高表达组，低于中位数为低表达组。采用Kaplan-Meier法进行生存分析并作生存曲线，经Log-rank检验显示肿瘤组织内SMAD6V2高表达与低表达患者间生存率有显著差异(P＝0.007)，SMAD6高表达组和低表达组患者的5年累积生存率分别为70％及30％。SMAD6V2高表达的肝癌病人，术后肿瘤浸润、转移少，5年生存率高，预后优于低表达的病人。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

Claims (2)

1.SMAD6在制备肝癌诊断试剂中的应用。
2.SMAD6转录本2型在制备治疗肝癌药品中的应用。
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