WO2000025825A1 - Composes dds et procede de dosage de ces composes - Google Patents

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WO2000025825A1
WO2000025825A1 PCT/JP1999/006016 JP9906016W WO0025825A1 WO 2000025825 A1 WO2000025825 A1 WO 2000025825A1 JP 9906016 W JP9906016 W JP 9906016W WO 0025825 A1 WO0025825 A1 WO 0025825A1
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gly
carboxy
dds
sugar
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PCT/JP1999/006016
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Hiroshi Susaki
Kazuhiro Inoue
Hiroshi Kuga
Masahiro Ikeda
Yoshinobu Shiose
Hiroshi Korenaga
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Daiichi Pharmaceutical Co., Ltd.
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    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/0006—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar, e.g. colominic acid
    • C08B37/0009—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar, e.g. colominic acid alpha-D-Glucans, e.g. polydextrose, alternan, glycogen; (alpha-1,4)(alpha-1,6)-D-Glucans; (alpha-1,3)(alpha-1,4)-D-Glucans, e.g. isolichenan or nigeran; (alpha-1,4)-D-Glucans; (alpha-1,3)-D-Glucans, e.g. pseudonigeran; Derivatives thereof
    • C08B37/0021—Dextran, i.e. (alpha-1,4)-D-glucan; Derivatives thereof, e.g. Sephadex, i.e. crosslinked dextran

Definitions

  • the present invention relates to a DDS compound (DDS: drug delivery system) in which a carboxy C 1-4 alkyl dextran polyalcohol modified with a sugar compound is bound to a pharmaceutical compound such as an antitumor agent. Further, the present invention relates to a method for measuring a DDS compound in which a polymer carrier and a pharmaceutical compound such as an antitumor agent are bound.
  • DDS drug delivery system
  • Antitumor agents used in the treatment of solid cancers such as lung cancer and gastrointestinal cancer, and blood cancers such as leukemia are systemically administered by intravenous or oral administration routes and then migrate to specific tumor sites It inhibits or suppresses the growth of cancer cells and exerts a therapeutic effect.
  • systemically administered antitumor agents are rapidly taken up from the blood into organs of the liver and retina, or excreted rapidly in the urine, resulting in lower blood levels and migration to tumor sites. May not be enough.
  • ordinary antitumor agents themselves have low selectivity to transfer to tumor sites (tumor selectivity), so that the antitumor agent is distributed evenly throughout various cells and tissues throughout the body, resulting in normal cells and tissues. It also acts as a cytotoxin, causing a very high rate of side effects such as vomiting, fever, and hair loss. Therefore, there is a need to develop a means for efficiently and selectively transferring an antitumor agent to a tumor site.
  • a polysaccharide compound having a carboxyl group is used as a polymer carrier, an antitumor agent is bound to the polymer carrier, and the disappearance of the antitumor agent in blood is delayed.
  • WO094 / 19376 has a carboxyl group.
  • a DDS compound in which a peptide chain (having 1 to 8 amino acids) is bonded to the carboxyl group of a polysaccharide, and to which doxorubicin, daunorubicin, mitomycin C, bleomycin, or the like is further bound via this peptide chain, has been disclosed. I have.
  • Japanese Patent Publication No. 7-84481 discloses a DDS compound in which the above-mentioned antitumor agent is introduced into a carboxymethylated mannoglucan derivative via a Schiff base or acid amide bond.
  • DDS compounds (sometimes referred to as “drug conjugates”) have superior anti-tumor effects compared to using the anti-tumor agent conjugated to the polymer carrier alone, ⁇ It is characterized by reduced side effects.
  • an antitumor agent can be linked to a polymeric carrier such as a polysaccharide compound and a pharmaceutical compound such as an antitumor agent via a 1- to 8-amino acid spacer.
  • a DDS compound capable of site-selectively transferring a pharmaceutical compound such as the above to a target tissue is provided (International Publication W097 / 46260).
  • carboxy C 1-4 alkyl dextran polyalcohol has an excellent nature as a polymer Kiyaria one, carboxy C 1-4 alkyl dextran polyalkoxy - DDS comprising Le as the polymer carrier one Compounds provided (International Publications, above).
  • carboxy C 1-4 alkyl dextran polyalkoxy - DDS comprising Le as the polymer carrier one Compounds provided (International Publications, above).
  • Serdy on polysaccharide-peptide-doxorubicin complex Relationship between blood stability of polysaccharide compound and antitumor effect” on technology for DDS compound using polyalcoholated polysaccharide compound as polymer carrier.
  • a polymer carrier such as a polysaccharide compound
  • a sugar-modified polyglutamic acid derivative Japanese Patent Application Laid-Open No. 5-178986
  • a sugar-modified polylysine derivative Japanese Patent Application Laid-Open No. 5-222187
  • Poly-substituted-L-lysine D-galactovilanos Gluconic acid derivative Japanese Patent Application Laid-Open No. 7-70311
  • sugar-modified poly- ⁇ -substituted-L-glucamic acid derivative Japanese Patent Application Laid-Open No. 7-228688
  • Bonded polysaccharide compounds JP-A-8-85703
  • glucosyl-protein derivatives JP-A-9-118699
  • the blood concentration of the DDS compound itself is accurately measured.
  • the residue content of a drug compound such as an antitumor agent introduced into the DDS compound must be determined. It needs to be measured accurately.
  • the measurement of the blood concentration of a DDS compound and the measurement of the residue content of a drug compound of a DDS compound have been performed based on the fluorescence or UV absorption of the drug compound as an index, rather than the DDS compound.
  • An object of the present invention is to provide a means for enhancing the organ directivity (for example, directivity to the liver, etc.) of a DDS compound containing carboxy c 1-4 alkyldextran polyalcohol as a polymer carrier, and has the above-mentioned features.
  • An object of the present invention is to provide a DDS compound.
  • Another object of the present invention is to provide a polysaccharide compound useful as a raw material for producing a DDS compound having the above characteristics.
  • Still another object of the present invention is to provide a method for measuring a DDS compound in which a polymer carrier and a residue of a pharmaceutical compound are bound via a spacer containing an oligopeptide. More specifically, an object of the present invention is to provide a method for accurately measuring the content of residues of a DDS compound itself or a drug compound such as an antitumor agent introduced into the DDS compound. . More specifically, it is possible to accurately quantify the blood concentration or tissue concentration of the administered DDS compound, or to accurately quantify the residue content of the drug compound introduced into the DDS compound. It is an object of the present invention to provide a method.
  • the present inventors have conducted intensive studies to solve the above problems, and found that using carboxy C 1-4 alkyl dextran polyalcohol modified with a sugar compound as a polymer carrier has extremely high organ directivity. It has been found that DDS compounds can be produced, and in particular, DDS compounds containing carboxy CM alkyldextran polyalcohol conjugated to galactose have excellent liver tropism.
  • the present inventors treated a DDS compound in which a polymer carrier and a residue of a drug compound were bound via a spacer containing an oligonucleotide with a beptidase, and obtained the hydrolyzate obtained. It has been found that by measuring the concentration of the DDS compound, the blood concentration of the DDS compound and the content of the residue of the drug compound introduced into the DDS compound can be accurately and simply quantified. The present invention has been completed based on the above findings.
  • the present invention provides a DDS compound containing residues of the modified carboxy C 1-4 alkyl dextranase down polyalcohols and forming combined pharmaceutical compound to the carboxy C 1-4 alkyl dextran polyalcohol a sugar compound Things.
  • the above-mentioned DDS compound in which a carboxy c 1-4 alkyldextran polyalcohol modified with a sugar compound is bound to a residue of a drug compound via a spacer; carboxy C 1-4 alkyl dextran polyalcohol modified with a sugar compound, a sugar compound and a carboxy C 1-4 alkyl dextran poly; the DDS compound but a single amino acid or base peptide bonded 2 to 8 amino acids was The above DDS compound in which an alcohol is bound via a linker; and a compound in which a carboxy C 1-4 alkyl dextran polyalcohol modified with a sugar compound is classically modified with a sugar compound via a linker. Certain of the above DDS compounds are provided.
  • a carboxy C 1-4 alkyl moiety is produced by binding a residue of a drug compound to a carboxy C 1-4 alkyl dextran polyalcohol in which a part of the carboxyl group is modified with a sugar compound.
  • DDS compounds are provided that can be used.
  • the above DDS compound which can be produced by binding the carboxy C 1-4 alkyl dextran polyalcohol to a residue of a pharmaceutical compound via a spacer; and carboxy C 1-4 Arukirudekisu Trang polyalcohols carboxy C 1-4 alkyl portion of part of the carboxy C 1-4 alkyl prepared by binding the linker one bound to a sugar compound or a saccharide compound to a carboxyl group
  • the DDS compound is provided, which can be produced by binding a residue of a pharmaceutical compound to dextran polyalcohol.
  • a carboxy C 1-4 Arukirudeki stringent run polyalcohol residues of some pharmaceutical compounds to the carboxyl group is linked via a scan Bae one service one carboxy C 1-4 alkyl moiety in the sugar compound
  • a DDS compound that can be produced by the method is provided.
  • the above DDS compound which can be produced by binding the carboxy C 1-4 alkyl dextran polyalcohol and a sugar compound via a linker; and carboxy C 1- 4 alkyl dextran poly Pharmaceutical compounds via a spacer consisting of one amino acid or a peptide consisting of two to eight amino acids bound to one part of the carboxyl group of the carboxy C 1-4 alkyl moiety of alcohol
  • the DDS compound is provided which can be produced by modifying the carboxy C 1-4 alkyl dextran polyalcohol produced by binding the following residue with a sugar compound.
  • the DDS compound wherein the sugar compound is galactose or galactosamine or a derivative thereof; dextran polyalcohol constituting carboxy C 1-4 alkyldextran polyalcohol is substantially completely
  • the above-mentioned DDS compound which is a dextran polyalcohol obtained by treating dextran under conditions that allow polyalcoholization; the above-mentioned DDS compound, wherein the carboxy C 1-4 alkyl dextran polyalcohol is carboxymethyl dextran polyalcohol; galacto Ichisu or galactosamine or a derivative thereof or clustered galactose or galactosamine or degree of substitution derivatives thereof 0.01 per sugar residue of the carboxy (alkyl dextran polyalcohol; 1.0 der The above DDS compound, wherein the pharmaceutical compound is an antitumor agent or an anti-inflammatory agent; the above DDS compound, wherein the pharmaceutical compound is (1S, 9S)-: 1-a
  • the present invention provides a carboxy C 1-4 alkyl dextran polyalcohol modified with a sugar compound; a polymer carrier comprising a carboxy ( 4 alkyl dextran polyalcohol modified with a sugar compound);
  • the present invention provides a carboxy ( 4- alkyldextran polyalcohol modified with a sugar compound for the purpose of the present invention.
  • the present invention provides a sugar compound modified with a sugar compound for producing the DDS compound Use of a carboxy C 1-4 alkyl dextran polyalcohol is provided.
  • the present invention provides that from 2 to 8 amino acids linked to a peptide
  • the polymer carrier and the residue of the pharmaceutical compound are linked via a spacer containing an acid.
  • the present invention provides a method for measuring a DDS compound, the method including a step of measuring a hydrolyzate obtained by treating the DDS compound with a peptidase.
  • the above method used for measuring the concentration of the DDS compound contained in a biological sample the above method used for measuring the content of a residue of a drug compound introduced into the DDS compound
  • the hydrolyzate is a pharmaceutical compound
  • the above-mentioned method wherein the hydrolyzate is a compound in which a part of a spacer is bonded to a residue of the pharmaceutical compound
  • the portion is one amino acid derived from Susa.
  • the above method wherein the polymer carrier is a polymer carrier having a carbonyl group, preferably a polysaccharide derivative; the polymer carrier is a carboxy C 1-4 alkyldextran polyalcohol,
  • the above-mentioned method which is preferably carboxymethyl dextran polyalcohol; dextran polyalcohol constituting carboxy C 1-4 alkyl dextran polyalcohol was obtained by treating dextran under conditions under which substantially complete polyalcoholization was possible.
  • the above method which is dextran polyalcohol; the above method, wherein the high molecular carrier is modified with a sugar compound; and the pharmaceutical compound introduced into the DDS compound is an antitumor agent or an antiinflammatory drug.
  • the above method which is an agent; the spacer is from the N-terminal side-Gly- Gly- Phe- From the tetrapeptide represented by Gly- or the N-terminal side-The above method in which the tetrapeptide represented by Gly-Gly- Gly-Phe- is used; Gly-Gly-Phe-Gly- NH-Y '-CH 2 - 0- CO- or a group N from the distal side represented - Gly- Gly- Gly- Phe- NH-Y , - CH 2 -0- CO Wherein the Y is a p-phenylene group; the above method wherein peptidase is hechymotrypsin or papain; and the pharmaceutical compound is (1S , 9S)
  • the above method comprises -tetralyptide represented by -Gly-Gly-Phe-Gly- from the N-terminal side or tetra-tetrafluoroethylene represented by -Gly-Gly-Gly-Phe- from the N-terminal side.
  • FIG. 1 is a diagram showing blood and ascites concentrations of DDS compounds measured by the method of the present invention (Example 4).
  • FIG. 2 is a diagram showing blood and ascites concentrations of DDS compounds measured by the method of the present invention (Example 5).
  • Fig. 3 DDS compound of the present invention having a polymer carrier modified with a sugar compound
  • FIG. 8 is a view showing an ultraviolet absorption spectrum of (Example 6).
  • Fig. 4 DDS compound of the present invention having a polymer carrier modified with a sugar compound
  • FIG. 14 is a diagram showing a GPC chart of (Example 6).
  • FIG. 5 is a graph showing the accumulation of DDS compounds ((C) and (D)) produced in Example 6 in the liver.
  • FIG. 6 is a view showing an ultraviolet absorption spectrum of the DDS compound of the present invention (Example 6 (D)).
  • FIG. 7 is a view showing an ultraviolet absorption spectrum of the DDS compound of the present invention (Example 7).
  • FIG. 8 is a view showing an ultraviolet absorption spectrum of the DDS compound of the present invention (Example 9).
  • FIG. 9 is a view showing a GPC chart of the DDS compound of the present invention (Example 6 (D)).
  • FIG. 10 is a view showing a GPC chart of a DDS compound (Example 7) of the present invention.
  • FIG. 11 is a view showing a GPC chart of a DDS compound (Example 9) of the present invention.
  • the DDS compound of the present invention comprises a residue of a pharmaceutical compound linked to a modified carboxy C 1-4 Arukirudeki stringent run polyalcohol and the carboxy C 1-4 alkyl dextran polyalkoxy one Le sugar compound I have. More specifically, the DDS compound of the present invention comprises (1) a carboxy C 1-4 alkyl dextran polyalcohol modified with a sugar compound and a residue of a drug compound bound without a spacer. And (2) the case where the carboxy C 1-4 alkyl dextran polyalcohol modified with the sugar compound and the residue of the pharmaceutical compound are bonded via a spacer.
  • Examples of the case where a carboxy C 1-4 alkyl dextran polyalcohol modified with a sugar compound and a residue of a pharmaceutical compound are linked via a spacer include, for example, carboxy C 1-4 alkyl dextran polyalcohol.
  • modification refers to a state in which a sugar compound and a carboxy C1-4 alkyldextran polyalcohol are covalently bonded directly or indirectly via a linker. Should be interpreted in the broadest sense, including in any sense Should not be interpreted restrictively.
  • the residue of the pharmaceutical compound contained in the above-mentioned DDS compound is, for example, the main one of the pharmaceutical compounds used for the treatment and / or prevention of diseases of mammals including humans as pharmaceuticals such as antitumor agents, anti-inflammatory agents, antibacterial agents and the like. Mean partial structure.
  • the use of the pharmaceutical compound is not limited to the above, and as the pharmaceutical compound, it can participate in binding to carboxyl C 1-4 alkyl dextran polyalcohol or spacer 1 or 2 Any substance having the above reactive functional group (for example, amino group, carboxyl group, hydroxyl group, thiol group, ester group, etc.) may be used.
  • the residue of the drug compound may be a carboxyl group of a carboxy C 1-4 alkyl dextran polyalcohol, a reactive functional group present in a spacer (for example, when a peptide spacer is used, its N-terminal amino group or C-terminal carboxyl group or a reactive functional group present in the amino acid constituting the spacer).
  • a prodrug compound also includes a prodrug compound which contains the main structure of a compound which itself has a medicinal action as its partial structure and can regenerate the compound in vivo.
  • the residue of the drug compound is a carboxy C 1-4 alkyl dextran polyalcohol or a bond between the spacer and the residue of the drug compound, wherein the reactive functional group in the drug compound and the carboxy CM alkyl
  • a partial structure derived from a pharmaceutical compound present in a compound after binding, assuming that it is formed by a reaction with a reactive functional group in dextran polyalcohol or spacer (eg, dehydration condensation). is there.
  • D-NH 2 when the pharmaceutical compound is represented by D-NH 2 , D-COOH, D-COOR, D-0H, D-SH, D-C0NH 2 , D-NH-C00R (R is a lower alkyl group, etc.) D-NH- (D-NH-C0-Q, etc.), D-CO- (D-CO-NH-Q, D-CO-OQ, D-C0-SQ, etc.) , D-CO- (D-CO-NH-Q, D-CO-OQ, D-C0-SQ, etc.), D-0- (D-0-C0-Q, DOQ, etc.), DS- (DS -CO-Q, DSQ, etc.), D-CONH- (D-C0-NH-C0-Q, etc.), D-NH-CO- (D-NH-C0-0-Q, D-NH-CO-NH (In the box, the bond between the spacer or the carboxy C 1-4 alkyl dextran polyalcohol and the residue of the drug
  • residue of the pharmaceutical compound examples include doxorubicin, daunorubicin, mitomycin C, bleomycin, cyclocytidine, vincristine, vinplastin, methotrexet, a platinum-based antitumor agent (cisbratin or a derivative thereof), taxol or a derivative thereof.
  • Camptothecin or a derivative thereof (the antitumor agent described in JP-A-6-87746, preferably (1S, 9S) -triamino-9-ethyl-5-fluoro-2,3 described in claim 2) -Dihydro-9-hydroxy-4-methyl-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3,4,: 6,7] indridino [1,2-b] quinoline-10,13 (9H , 15H) _dione, etc.).
  • residues of steroidal anti-inflammatory drugs such as hydrocortisone succinate and prednisolone succinate, or non-steroidal anti-inflammatory drugs such as mefenamic acid, flufenamic acid, diclofenac, ibuprofen and tinolidine are also suitable.
  • a spacer consisting of one amino acid or a peptide-bonded 2 to 8 amino acids as a spacer that binds the residue of a pharmaceutical compound to carboxy C 1-4 alkyl dextran polyalcohol
  • the spacer is a residue of one amino acid (a residue obtained by removing one hydrogen atom and one hydroxyl group from the amino group and carboxyl group of an amino acid, respectively).
  • Preferred spacers are the residues of an oligonucleotide consisting of 2 to 6 amino acids.
  • the type of amino acid constituting the spacer is not particularly limited.
  • an L- or D-amino acid preferably an L-amino acid can be used.
  • Acids, aminoaminobutyric acid and the like may be used.
  • Amino acids other than such amino acids are preferably arranged in the spacer at a position close to the polysaccharide compound.
  • the binding direction when using an oligopeptide spacer is not particularly limited, but generally, the N-terminus of the spacer is acid amide bonded to the carboxyl group of carboxy c 1-4 alkyl dextran polyalcohol. And the C-terminus of the spacer can be bound to the amino group of the pharmaceutical compound.
  • the N-terminus of the spacer is acid amide bonded to the carboxyl group of carboxy c 1-4 alkyl dextran polyalcohol.
  • the C-terminus of the spacer can be bound to the amino group of the pharmaceutical compound.
  • an ⁇ -amino group and a £ -amino group of the lysine residue are acid-amide bonded to a carboxyl group of another amino acid.
  • both ends of the peptide chain are both terminal ends, it becomes possible to bind the carboxy group of the pharmaceutical compound.
  • one or more diamine compound or dicarboxylic acid compound residue (for example, diamine residue such as ethylenediamine ⁇ dicarboxylic acid residue such as succinic acid, etc.) in the spacer is a structural unit. It is also possible to use a spacer having both ends at the both ends and a spacer having both ends at the C end.
  • the amino acid sequence when using a spacer composed of an oligopeptide is not particularly limited.
  • the residue of a dipeptide represented by - ⁇ - ⁇ - (X is a hydrophobic amino acid) Z represents the residue of a hydrophilic amino acid
  • -XZ- represents the hydrophobic amino acid (X) and hydrophilic amino acid (Z) at the N-terminal and C-terminal, respectively.
  • X is a hydrophobic amino acid
  • Z hydrophilic amino acid
  • Z hydrophilic amino acid
  • a spacer containing a peptide residue as a partial peptide sequence can be suitably used.
  • hydrophobic amino acid for example, phenylalanine, tyrosine, leucine and the like
  • hydrophilic amino acid for example, glycine, alanine and the like
  • the donor may have a repeating sequence of such a peptide residue (eg, -X-Z-XZ-, -X-ZXZX-Z-, etc.).
  • the basease is hydrolyzed at a tumor site or an inflammation site which is considered to be rich in beptidase, and , A high concentration of the pharmaceutical compound is released in a short time.
  • the partial structure formed by bonding the spacer containing the dipeptide and the pharmaceutical compound is a preferred partial structure of the DDS compound of the present invention.
  • a residue of a concentration-dependent antitumor agent for example, doxorubicin
  • a peptide consisting of the above-mentioned peptide residue represented by -X-Z- It is preferable to use a spacer or a spacer containing the peptide residue as a partial peptide sequence.
  • antitumor agents include, for example, the antitumor agents described in JP-A-6-87746, preferably the antitumor agents described in claim 2.
  • it is not limited to the above-mentioned space, but is preferably used in view of the mechanism of action of the antitumor agent, characteristics of pharmacokinetics and toxicity, and release of the antitumor agent in the body. It is necessary to select a product. In general, it is preferable to select the above spacer that can release a high concentration of a pharmaceutical compound in a short period of time for a rapidly growing cancer type.
  • oligonucleotides that can be used as spacers are shown in the following table.
  • spacers used as needed for the DS compound are not limited to the following, and selection of whether or not to use spacers, or selection of the type when spacers are used Can of course be adjusted by a person skilled in the art to give an optimal release rate of the pharmaceutical compound (in the table, the peptide sequence is the N-terminal on the left,
  • the residue of the drug compound binds to the C-terminal side.
  • D-Phe indicates a D-phenylalanine residue
  • other amino acids indicate L-amino acids.
  • the magnitude of the release rate was determined based on the degree of efficacy of the DDS compound bound to doxorubicin against the Walker 256 tumor-bearing rat or the concentration of free doxorubicin in the tumor site of the Walker 256 tumor-bearing rat. ).
  • spacers for doxorubicin, it is preferable to use a spacer capable of releasing a high concentration of a pharmaceutical compound in a short time, such as (N-terminal) -Gly-Gly-Phe-Gly-. . table 1
  • the DDS compound of the present invention is characterized in that it has a sugar compound-modified lipoxy ( 4- alkyldextran polyalcohol) as a polymer carrier.
  • the carboxy C 1-4 alkyldextranpolyal in the DDS compound of the present invention is not particularly limited, dextran polyalcohol constituting carboxy C 1-4 alkyl dextran polyalcohol was obtained by treating dextran under conditions under which substantially complete polyalcoholization was possible. Dextran polyalcohol is preferred.
  • the type of dextran used to produce the carboxy C 1-4 alkyl dextran polyalcohol is not particularly limited, and may contain a-D-1,6-linkage in any ratio.
  • dextran having a ratio of hy-D-1, 6-bond of 85% or more, 90% or more, or 95% or more can be used.
  • the molecular weight of dextran is not particularly limited.
  • dextran having a molecular weight of about 1,000 to about 2,000,000, preferably about 3,000 to 800,000 can be used.
  • Carboxy C 1-4 is a C 1-4 alkyl which constitutes the carboxy C 1-4 alkyl group Arukirudekisu Trang polyalcohols, straight chain or branched C 1-4 alkyl chain, for example, methyl, An ethyl group, an n-propyl group, an isopropyl group, an n-butyl group, a sec-butyl group and the like can be used, but a methyl group can be preferably used.
  • dextran polyalcohol in which dextran is substantially completely polyalcoholized.
  • Carboxy C 1-4 alkylation can be carried out, for example, by adding chloroacetic acid, bromoacetic acid, polychloropropionic acid, polymethyl-1-chloropropionic acid,?
  • Halogenated C 1-4 alkyl carboxylic acids such as methyl monochloropropionic acid, monochlorobutyric acid, chlorobutyric acid, and chlorobutyric acid, preferably chloroacetic acid are reacted to form hydroxyl groups. This can be done by partial or complete carboxy c 1-4 alkylation.
  • dextran polyalcohol is dissolved in an inert solvent that does not participate in the reaction (for example, water, N, N-dimethylformamide, dimethylsulfoxide, etc.), and a base (for example, sodium hydroxide / hydrazine hydroxide) is dissolved.
  • an inert solvent for example, water, N, N-dimethylformamide, dimethylsulfoxide, etc.
  • a base for example, sodium hydroxide / hydrazine hydroxide
  • Halogenated C 1-4 alkyl carboxylic acid or a salt thereof is added in the presence of water, and the reaction may be carried out for several minutes to several days under ice-cooling or a temperature range of about 100 ° C.
  • the degree of introduction of the carboxy C 1-4 alkyl group can be easily determined, for example, by appropriately selecting the reaction temperature of the carboxy C 1-4 alkylation and the amounts of the halogenated C 1-4 alkyl carboxylic acid and the base used as the reagent. And such means are well known to those skilled in the art.
  • the degree of carboxy C 1-4 alkylation of the dextran polyalcohol with respect to the sugar residue is not particularly limited, but is, for example, in the range of 0.01 to 2.0, preferably in the range of 0.1 to 1.0.
  • the type of sugar compound that modifies carboxy is not particularly limited, and can be appropriately selected by those skilled in the art according to conditions such as the type of organ to which the DDS compound is directed and the pharmacokinetics. Either a monosaccharide, an oligosaccharide, or a derivative thereof may be used as the saccharide compound.
  • the type of the bond between the saccharide compound and the carboxy C 1-4 alkyl dextran polyalcohol is not particularly limited.
  • the saccharide compound and the carboxy C 1-4 alkyl dextran polyalcohol may be directly bonded by, for example, a 0-glycoside bond or a 0-/?-Glycoside bond, or via an appropriate linker.
  • linker one as used in may. herein they are both bound Te is sugar compound residue and a carboxy C 1-4 Arukirude
  • Introduction amount of the sugar compound to the carboxy C 1-4 alkyl dextrose stringent run polyalcohol (the degree of substitution) is limited Can be appropriately selected depending on various conditions, such as the type of sugar compound, the desired degree of directivity, and the type of pharmaceutical compound. In general, the content of carboxy CH alkyl dextran polyalcohol is 0.01 to 0.01- It is about 1.0.
  • the type of the linker is not particularly limited.
  • These linkers are preferably linked at the 0-terminus or N-terminus, preferably at the 0-terminus, to a sugar compound with a 0-glycoside bond or a 0-?-Glycosidic bond, and the other end is a carboxy C 1-4 alkyldextran.
  • Carboxy C 1-4 alkyl dextran polyalcohol can be modified with a sugar compound by forming an amide bond or an ester bond with a carboxyl group of polyalcohol.
  • the modified class I compound is a compound in which a sugar compound is bound in a tuft form to a carboxyl group of carboxy c 1-4 alkyldextran polyalcohol using a linker suitable for cluster monomodification.
  • the column is described, for example, in Japanese Patent No. 2774417, Japanese Patent No. 2774429, or Biol. Pharm. Bull., 20, pp. 259-266, 1997.
  • the modified class I is characterized by the fact that a plurality of sugar compounds are arranged in a certain space, so that the affinity with the receptor is enhanced and excellent organ directivity can be exhibited.
  • Monosaccharides include hexoses such as glucose, fructose, mannose, galactose, fucose, neuraminic acid, and peronic acid; hexosamines such as galactosamine and glucosamine; ribose, deoxyribose, arabinose, and xylose. Vent etc. can be mentioned.
  • hexoses such as glucose, fructose, mannose, galactose, fucose, neuraminic acid, and peronic acid
  • hexosamines such as galactosamine and glucosamine
  • ribose deoxyribose, arabinose, and xylose. Vent etc.
  • these derivatives for example, N- or 0-acyl derivatives, 0-alkyl derivatives, sulfates, phosphates and the like may be used.
  • monosaccharide derivatives there are N-acetylaminolaminate, N-acetylgalactosamine, N-acetyldarcosamine, mannose-6-phosphate, galactose-3-phosphate, 6-0 -Benzoylglucose, 6-0-carboxymethyl-N-acetylglucosamine, 2-N-benzylglucosamine and the like.
  • oligosaccharide for example, a linear or branched hetero-oligosaccharide or homo-oligosaccharide composed of the above-mentioned monosaccharide or a derivative thereof can be used.
  • sucrose, sialyl Lewis A, sialyl Lewis X, lactose, maltose, Lewis X, sulfated Lewis X and the like can be used.
  • sugar compounds that enhance liver tropism include galactose or galactosamine or a derivative thereof, or an oligosaccharide having galactose or N-acetylgalactosamine on the non-reducing terminal side (eg, lactose). ) Is preferred, and galactose or N-acetylgalactosamine is particularly preferred.
  • the method for producing the DDS compound of the present invention is not particularly limited, but a general production method will be described below. Further, one example thereof is shown specifically and in detail in the examples of the present specification. Those skilled in the art, referring to the production methods described in the following general description and examples, appropriately select production raw materials, reaction reagents, reaction conditions, and the like, and modify or modify the methods as necessary.
  • the DDS compound included in the present invention can be easily produced.
  • carboxy C 1-4 alkyl dextran polyalcohol is modified with a sugar compound according to an appropriate method, and the modified product is reacted with the residue of the pharmaceutical compound or a spacer bound to the pharmaceutical compound. Thereby, the DDS compound of the present invention can be produced.
  • carboxy C 1-4 alkyl dextran polyalcohol is prepared as an aqueous solution in the form of an alkali metal salt such as sodium salt or magnesium salt, and the sugar compound is modified and the pharmaceutical compound (or conjugated to the pharmaceutical compound) is prepared.
  • the reaction with water can be carried out in water or in a water-containing organic solvent.
  • the carboxy 4- alkyldextran polyalcohol modified with carboxy C 1-4 alkyl dextran polyalcohol or sugar compound
  • the carboxy is converted into the form of an organic amine salt, and the subsequent reaction is carried out in an organic solvent substantially free of water.
  • the salt of an organic amine include salts of aliphatic amines such as triethylamine, trimethylamine, and triethanolamine, as well as N-methylbilysine, N-methylbiperidine, and N-methylmorpholine.
  • salts of fat ⁇ or aromatic Amin such as dimethyl ⁇ amino pyridine, tetramethylammonium Niu arm chloride, can be used as quaternary Anmoniumu salts such as chloride Te tiger E chill ammonium Niu beam.
  • carboxy C 1-4 Carboxy modified with alkyl dextran polyalcohol or sugar compound The conversion of the sodium salt of the C 1-4 alkyl dextran polyalcohol to the salt of the organic amine can be carried out using an ion exchange resin or the like.
  • the sodium salt of carboxymethyl dextran polyalcohol or its modified sugar compound was dissolved in water, applied to a column filled with Bio-Rad AG50W-X2 (200-400 mesh, H + type) resin, and eluted with water. Thereafter, an organic amine such as triethylamine can be added and freeze-dried. It is also possible to carry out the conversion in one step by dissolving sodium salt of carboxymethyl dextran polyalcohol or its modified sugar compound in water and passing the solution through a triethylammonium type resin.
  • C 1-4 bond of an alkyl dextran polyalcohol Cal Bokishiru group, or binding a pharmaceutical compound scan Bae one mono- was coupled with a carboxy C 1-4 alkyl dextran polyalcohol carboxyl group is generally The reactive amino group of the pharmaceutical compound itself or a reactive amino group of the drug (such as the N-terminal amino group in peptide drugs) and the carboxyl of the carboxy C 1-4 alkyl dextran polyalcohol What is necessary is just to make an acid amide bond with a group.
  • the bond between the spacer and the carboxy group of the carboxy ( 4- alkyldextran polyalcohol is not limited to the above, and other chemical bonds or one or more spacers may be bonded.
  • an acid anhydride may be formed by the C-terminal carboxyl group of the peptide peptide or the carboxyl group of the pharmaceutical compound and the carboxyl group of the carboxy C 1-4 alkyldextran polyalcohol.
  • a diamine compound such as ethylenediamine may be used as a spacer, and each carboxyl group may be acid-amide-bonded to each amino group of diamine.
  • N-terminal amino group of the base and the carboxyl group of carboxymethyl dextran polyalcohol are When linked by a bond, a conventional dehydration condensing agent used for peptide chain synthesis, for example, N, N, -dicycloalkylcarbodiimide such as N, N, -dicyclohexylcarbodiimide (DCC) Imids, carbodiimide derivatives such as 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDAPC), and triethoxycarbonyl-2-ethoxy-1,2-dihydroxyquinoline (EEDQ)
  • a benzotriazo such as trihydroxybenzotriazole (H0BT) may be used. May be added.
  • the reaction may be performed by an active ester method, an acid halide method, or the like.
  • the solvent is an organic solvent substantially free of water, and is a reactive species (a salt of an organic amine of carboxymethyl dextran polyalcohol modified with a sugar compound and a pharmaceutical compound or Any substance can be used as long as it can dissolve a spacer to which a pharmaceutical compound is bound.
  • a reactive species a salt of an organic amine of carboxymethyl dextran polyalcohol modified with a sugar compound and a pharmaceutical compound or Any substance can be used as long as it can dissolve a spacer to which a pharmaceutical compound is bound.
  • the amount of the residue of the drug compound introduced into the lipoxy C 1-4 alkyl dextran polyalcohol modified with the sugar compound is not particularly limited, but the type of the residue of the drug compound, and the pharmacokinetics, efficacy, Should be selected appropriately from the viewpoint of toxicity and the like. Generally, a range of about 0.1 to 30% by weight, preferably about 2 to 15% by weight can be selected.
  • the amount introduced is, for example, about 1 to 15% by weight, preferably about 4 to 8% by weight.
  • the ratio of the residues of the pharmaceutical compound introduced into the carboxy C 1-4 alkyldextran polyalcohol can be easily determined by, for example, absorbance analysis.
  • the pharmaceutical compound when used as a pharmaceutical compound, is a compound having a lactone ring in an acidic aqueous medium (for example, about pH 3) ( It is known that the equilibrium is biased toward a ring-closed compound, while in a basic aqueous medium (eg, about pHIO), the equilibrium is biased toward a compound having a lactone ring opened (ring-opened product).
  • an acidic aqueous medium for example, about pH 3
  • a basic aqueous medium eg, about pHIO
  • DDS compounds having residues corresponding to such closed and open forms have the same antitumor effect, however, carboxy C 1-4 alkyl dextran polyalcohol modified with sugar compounds and the above-mentioned drugs
  • a ring-opening reactive species is present in a reaction system when reacting with a spacer (for example, an oligopeptide spacer) to which a compound is bonded, a carboxyl group derived from a lactone ring and a spacer are used.
  • Condensation reaction proceeds with an amino group derived from one source, which not only significantly lowers the reaction yield, but also sometimes makes it impossible to obtain a desired uniform DDS compound.
  • Such side reactions are: This can be avoided by using a closed ring as a reactive species in a non-aqueous system where equilibrium is not achieved.
  • the DDS compound of the present invention exerts a desired pharmaceutical activity locally on a tumor site or an inflammatory site depending on the type of the residue of the pharmaceutical compound (for example, the residue of the pharmaceutical compound such as an antitumor agent or an anti-inflammatory agent). It is characterized in that it can be specifically expressed and that the toxicity of the pharmaceutical compound itself can be reduced. Further, the DDS compound of the present invention has excellent vascular permeability.
  • DDS compounds with oligopeptide spacers are readily hydrolyzed by the spacers and released drug The compound migrates into the cell and exerts its drug effect, or the DDS compound is taken into the cell via a receptor that recognizes the sugar of the target cell, and the drug released by the protease exerts its drug effect.
  • carboxy C 1-4 alkyl dextran polyalcohol is lowly recognized as a foreign polymer in vivo, for example, in the liver, spleen, or bone marrow. For this reason, it is characterized by low transferability to these organs, while it is distributed at a high concentration in organs rich in the corresponding sugar receptor, depending on the type of sugar compound.
  • the DDS compound of the present invention having galactose-modified carboxy C 1-4 alkyl dextran polyalcohol has excellent directivity to the liver. Therefore, a DDS compound bound with an antitumor agent as a pharmaceutical compound is useful for treating liver cancer.
  • the medicament containing the DDS compound of the present invention can be usually filled into vials and the like in the form of a lyophilized product, and is provided clinically as a parenteral administration formulation such as a dissolution-type injection or infusion formulation.
  • a parenteral administration formulation such as a dissolution-type injection or infusion formulation.
  • the pharmaceutical form of such a drug is not limited to the above embodiment.
  • additives for preparations available in the art such as a solubilizer, a pH adjuster, and a stabilizer can be used, and the above-mentioned preparations can be prepared as a pharmaceutical composition.
  • the dose of the above drug is not particularly limited, but usually, the dose of the drug compound constituting the residue of the drug compound, the amount of the residue of the drug compound introduced into the DDS compound, the condition of the patient or disease. Decide in consideration of types, etc. Should.
  • parenteral administration is required. is generally one day per body surface area 1 m 2 diary about 0. 1 to 100 mg extent, preferably administered once in a range of about L ⁇ 30 mg, preferably a this repeating administered every 3 to 4 weeks .
  • the present invention provides a method for measuring a DDS compound in which a polymer carrier and a residue of a drug compound are bound via a peptide containing 2 to 8 amino acids bound to a peptide.
  • the present invention provides a method comprising a step of measuring a hydrolyzate obtained by treating the DDS compound with beptidase.
  • the term “measurement” needs to be interpreted in the broadest sense, including measurement performed for the purpose of quantification, qualitativeness, etc., but preferably means quantification.
  • the DDS compound to be subjected to the measurement method of the present invention is a compound in which the polymer carrier and the residue of the drug conjugate are bound via a spacer containing 2 to 8 amino acids linked to a peptide. It should not be construed as limiting in any way. Examples of peptides containing 2 to 8 amino acids with peptide bonds include a peptide consisting of only 2 to 8 amino acids with peptide bonds, and 2 to 8 amino acids with peptide bonds.
  • the phenylene group may have one or more substituents, and is preferably a p-phenylene group).
  • Examples include spacers having a linking group bonded thereto.
  • the measurement method of the present invention can be used, for example, for measuring the concentration of a DDS compound itself contained in a biological sample such as blood or body fluid.
  • the method of the present invention can be used to measure the amount of the residual drug compound introduced into the DDS compound (for example, the weight% of the drug compound residue relative to the total weight of the DDS compound). .
  • the meaning of the residue of the drug compound contained in the DDS compound to be measured by the method of the present invention is the same as that described above, and the drug compound is a bond with spacer.
  • Any compound may be used as long as it has one or more reactive functional groups (for example, an amino group, a carboxyl group, a hydroxyl group, a thiol group, an ester group, etc.) that can participate in the combination.
  • the residue of the pharmaceutical compound may be bound to the N-terminal amino group or C-terminal carboxyl group of the spacer or a reactive functional group present in the amino acid constituting the spacer.
  • residue of the drug compound are as described for the DDS compound in which the carboxy C 1-4 alkyl dextran polyalcohol modified with the sugar compound and the residue of the drug compound are bonded via a spacer.
  • residues of pharmaceutical compounds that can be suitably used.
  • the meaning of the residue of the pharmaceutical compound contained in the DDS compound to be measured in the method of the present invention is to bind to the polymer carrier via a spacer, and a preferred spacer is a peptide bond.
  • a preferred spacer is a peptide bond.
  • -NH-Y '-CH 2 -to the oligonucleotide residue consisting of 2 to 8 amino acids or the oligopeptide consisting of 2 to 8 amino acids bonded to peptide 0-C0- (wherein, Y, represents a ⁇ -phenylene group) is a spacer to which a linking group is bonded, and the type of amino acid constituting the spacer, Sa first binding direction, the amino acid sequence, etc.
  • the polymer carrier constituting the DDS compound for example, in addition to the polysaccharide derivative, a synthetic polymer can be used, etc.
  • the polysaccharide derivative and the synthetic polymer have substantially no toxicity to living organisms
  • any of polysaccharide derivatives and synthetic polymers conventionally used in the production of DDS-conjugated compounds can be used as a polymer carrier.
  • a polysaccharide derivative having a carboxyl group can be preferably used, and a polyalcoholized polysaccharide derivative can be particularly preferably used.
  • Synthetic polymers include, for example, polyethylene glycols, polyglutamic acid, Polyamino acids such as polyaspartic acid or polylysine; or Derivatives of polyvinyl compounds such as N- (2-hydroxypropyl) methacrylamide derivatives can be mentioned.
  • polysaccharide derivative having a carboxyl group for example, a polysaccharide or a derivative obtained by chemically or biologically modifying the polysaccharide can be used, and one having a carboxyl group in the molecule is preferably used. be able to.
  • polysaccharides such as hyaluronic acid, carboxylic acid, alginic acid, chondroitin, heparin, pullulan, dextran, mannan, chitin, inulin, levan, xylan
  • Polysaccharides such as araban, mannoglucan, and chitosan, in which a functional group having a carboxy group is introduced into a part or all of the hydroxyl groups, can be used.
  • those obtained by alkylating a hydroxyl group with carboxy C 1-4 or those obtained by esterifying a hydroxyl group with one carboxyl group of a polybasic acid can be suitably used.
  • those obtained by introducing a functional group having a carboxyl group after polyalcoholizing the above polysaccharide may be used.
  • a DDS compound using carboxy C 1-4 alkyl dextran polyalcohol as a polymer carrier is a particularly suitable measurement object in the method of the present invention.
  • the degree of polyalcoholization of the carboxy C 1-4 alkyl dextran polyalcohol, the type of dextran used for the production, and the production method are determined by comparing the carboxy ( 4 alkyl dextran polyalcohol modified with the sugar compound with the residue of the drug compound). This is the same as that described for the above-mentioned DDS compound bonded via a pen.
  • a DDS compound using a polymer carrier modified with a sugar compound as a polymer carrier is also a suitable object of the measurement method of the present invention.
  • carboxy C 1-4 alkyl dextran polyalcohol modified with a sugar compound can be suitably used as the polymer carrier.
  • the method of modifying the polymer carrier with the sugar compound, the type of the sugar compound, and the like are the same as those described above for the carboxy- 4 alkyl dextran polyalcohol modified with the sugar compound.
  • the object of the measurement method of the present invention is to use a linker suitable for so-called class modification. It may be a DDS compound (so-called modified class) produced by the above method.
  • modified class a linker suitable for so-called class modification.
  • the concept of class modification is similar to that described above for carboxy C 1-4 alkyl dextran polyalcohols modified with sugar compounds.
  • the method of the present invention is characterized in that, when measuring the above-mentioned DDS compound, a hydrolyzate obtained by allowing peptidase to act on the DDS compound is measured.
  • Peptidases that can hydrolyze the oligopeptide portion (oligopeptide portion in which 2 to 8 amino acids are peptide-bonded) included in the DDS compound range are used. Is not particularly limited. For example, subtilisin, hy-chymotrypsin, type IV collagenase, pepsin, sa-molysin, papain, eras yu-ze, and the like can be used.
  • the type of the hydrolyzate is not particularly limited, it is desirable that the hydrolyzate can be detected by ordinary spectroscopic techniques such as an ultraviolet absorption spectrum and a fluorescence spectrum.
  • a hydrolyzate in addition to the pharmaceutical compound itself, a compound in which a part of the spacer remains and binds to the residue of the pharmaceutical compound, for example, one amino acid derived from the spacer , A pharmaceutical compound to which an oligopeptide consisting of 2 to 8 amino acids derived from a spacer is bound, or -NH-Y-CO-, wherein Y is 1 to 8 carbon atoms.
  • a part or all of the reactive functional groups of the pharmaceutical compound may have undergone hydrolysis. By selecting an appropriate peptidase according to the type of the DDS compound, a desired hydrolyzate can be measured.
  • Samples for measurement include biological samples such as blood, lymph, saliva, urine, faeces, and extirpated tissues isolated from animals (including humans) to which the DDS compound has been administered, as well as an aqueous solution of the DDS compound or substantially Solutions of aqueous organic solvents that do not interfere with the enzyme reaction Which can be used.
  • Suitable reaction conditions for various peptidases are known in the art, and those skilled in the art will recognize appropriate reaction conditions depending on the type of peptidase, for example, substrate concentration, pH, buffer, reaction temperature, reaction temperature, etc. Time can be easily selected.
  • the above sample is subjected to pretreatment such as homogenate or deproteination as required, and then beptidase is added to a reaction solution in which the DDS compound is diluted to a desired substrate concentration, and the DDS compound is added. The reaction may be continued until it is completely hydrolyzed.
  • the method for measuring the hydrolyzate is not particularly limited.However, when quantifying the DDS compound or the amount of the introduced pharmaceutical compound, depending on the nature of the hydrolyzate, ultraviolet absorption spectrum measurement, fluorescence spectrum measurement, etc. It is desirable to use ordinary spectroscopic methods alone or in combination. Further, the measurement may be performed by appropriately combining separation operations such as high performance liquid chromatography. By creating a calibration curve in the measurement system in advance, it is possible to perform quantification with high accuracy. It should be noted that, in the examples of the present specification, typical examples of the method of the present invention are specifically and in detail described. Therefore, those skilled in the art will be able to use the above general description and the specific description of the examples. The method of the present invention can be easily carried out by appropriately modifying or modifying them as necessary. Example
  • Carboxymethyl dextran polyalcohol which is a high molecular carrier (hereinafter sometimes abbreviated as CM-Dex-PA or CM dextran polyalcohol), and an antitumor agent (described in claim 2 of JP-A-6-87746) (1S, 9S) -Triamino-9-ethyl-5-fluoro-2,3-dihydro-9-hydroxy-4-methyl-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3,, 4 ,: 6,7] indridino [1,2-b] quinoline-10,13 (9H, 15H) -dione: Abbreviated as DX-8951 in the examples.
  • a DDS compound (Compound 1) was produced according to the method described in Example 15 of International Publication W097 / 46260. CM-Dex-PA having an average molecular weight of 228 K and a degree of carboxymethylation (degree of substitution of carboxymethyl group per constituent sugar residue) of 0.4 was used.
  • the DDS compound 10-1 prepared to 400 ⁇ g / ml in distilled water was added to 180/1 Britton Robinson buffer (pH 6.0), and the polychymotrypsin solution was further adjusted to 10 mg / ml in distilled water. Was added 10/1.
  • 200 JUL of 0.5 N HC1 solution containing 50% acetonitrile was added, and the released hydrolyzate (glycine derived from sugar was DX-8951
  • the compound described in Example 50 of International Publication W097 / 46260, hereinafter abbreviated as G-DX-8951) was quantified by HPLC.
  • a DDS compound (compound 2) in which CM-Dex-PA and DX-8951 are bound via a spacer represented by -Gly-Gly-Gly-Phe-NH- (C3 ⁇ 4) 4 -CO- It was manufactured as follows. 5—Aminopen Penic acid (1.0 g), P-toluenesulfonic acid (1.95 g) and benzyl alcohol (5 ml) in toluene (50 ml) at 140 ° C using Dean-Stark to produce water The reaction was carried out for 5 hours while removing. The reaction solution was concentrated, and ether was added to the obtained residue to solidify. The obtained solid was filtered, washed with ether and dried to obtain 2.9 g of tosyl acid salt of 5-aminopentyl benzyl ester.
  • Boc-Gly-Gly-Gly-Phe-OH (575 mg), HOSu (182 mg), and DCC (326 mg) were dissolved in DMF (20 ml) and stirred for 30 minutes.
  • DMF 20 ml
  • Boc-Gly-Gly-Gly-Phe-NH- (CH 2 ) 4 -COOBzl (Bzl represents a benzyl group).
  • Boc-Gly-Gly-Gly- Dissolve Phe-NH- (CH 2 ) 4 -C00Bzl (380 mg) in 50% aqueous methanol (20 ml), add 5% Pd-C (50% aqueous) (300 mg), and stir for 1 ⁇ under normal pressure of hydrogen did.
  • the catalyst in the reaction solution was removed by filtration and concentrated to dryness to obtain 330 mg of Boc-Gly-Gly-Gly-Phe-NH- (C NH) 4 -C00H.
  • Boc-Gly-Gly-Gly-Gly- Phe-NH- (CH 2) dissolved 4 -C00H and (150 mg) DCC and (70 mg) HOSu a (40 mg) in DMF, and stirred for 30 minutes.
  • a solution of DX-8951 (160 mg) and triethylamine (0.040 ml) dissolved in DMF was added, and the mixture was stirred at room temperature for 1 hour.
  • Reaction liquid was diluted with ultrapure water, low molecules were removed using an ultrafiltration membrane (50K), freeze-dried, the resulting powder was dissolved in 3M saline, added dropwise to ethanol, and the precipitated solid was centrifuged. Separated by separation. The supernatant was removed, the solid was dissolved in water again, and low molecular weight was removed with an ultrafiltration membrane (50K).
  • the hydrolyzate in the enzyme reaction solution was quantified by a calibration curve prepared using a solution containing 2 nmol / ml of the bound DX-8951 (FG-DX-8951).
  • subtilisin A and spike-chymotrypsin released 100% of G-DX-8951 from compound 1 under the above conditions.
  • thermolysin released FG-DX-8951 by 100 °.
  • Meth A cells (lxlO 6 cells / mouse) subcultured and maintained intraperitoneally were transplanted intraperitoneally into BALB / c (c>) mice. After intraperitoneal administration at 2.5 mg / kg (equivalent to DX-8951), blood was collected from the heart over time (2, 4, 8, 24, and 48 hours), left for 10 minutes, and then 12,000. A serum was obtained by centrifugation at 10 rpm for 10 minutes, and the cancerous ascites was collected at that time.
  • thermolysin solution adjusted to 2 mg / ml using 0.1 M Tris-HCl pH 8.5 / 0.1 M CaCl 2 was added to 25 jul of the supernatant, and reacted at 50 ° C for 1 hour.
  • 250 ⁇ l of 0.5 N HC1 containing 50% acetonitrile was added, and 20 ⁇ l of the solution was subjected to HPLC analysis using a Symmetry C18 (4.6 ⁇ 100 thigh) as a column.
  • the solution (1: 2) was eluted with a 0.1 M AcONa (pH 5) solution containing 41%, and the hydrolyzate was detected by fluorescence spectrum measurement (Ex. 375 nm, Em.
  • Meth A cells (lx10 6 cels / mouse) maintained in the intraperitoneal cavity were transplanted intraperitoneally into BALB / c () mice, and 5 days later, compound 1 (DX-8951 content: 6.6%) was transferred. They were intravenously administered at 10 and 2.5 mg / kg (DX-8951 equivalent) (3 animals per group). After administration, blood was collected from the heart over time (5 minutes, 30 minutes, 2, 4, 8, 24, and 48 hours), allowed to stand for 10 minutes, and then centrifuged at 12,000 rpm for 10 minutes to obtain serum. . In addition, the cancerous ascites at that time was collected.
  • a DDS compound having a polymer carrier modified with a sugar compound was produced as follows. In the following scheme, one or two structural units having a carboxymethyl group introduced as a structural unit of a sugar chain are exemplarily described, but the carboxymethyl dextran polyalcohol portion of the DDS compound described in the Examples is It should be understood that the above structural units are not constituted by repetition.
  • the degree of carboxymethylation of carboxymethyl dextran polyalcohol was 0.1 N after converting sodium salt of carboxymethyl dextran polyalcohol to free acid form. It was determined by dissolving in sodium hydroxide aqueous solution and titrating with 0.1N hydrochloric acid.
  • the amount (% by weight) of the drug introduced was determined by absorbance analysis (around 362 dishes) using the characteristic absorption of the drug. Further, the gel filtration method was performed under the following conditions (column: TSK gel G4000 PW X, eluent: 0.1 M NaC flow rate: 0.8 ml / min, column temperature: 40.C).
  • the obtained residue was purified by column chromatography (hexane: ethyl acetate 2: 1) using silica gel to obtain 3.3 g of a chloro form.
  • the obtained chlorinated product (3.3 g) and NaN 3 (2.0 g) were stirred in DMF (15 ml) at 60 ° C. for 2 days.
  • the solvent was distilled off, the residue was dissolved in a mixed solution of ethyl acetate and water, the organic layer was washed with water, dried over magnesium sulfate, magnesium sulfate was filtered off, and the solvent was distilled off to obtain 2.8 g of an azide form.
  • the obtained azide compound (1.5 g) was dissolved in methanol (30 ml), a 28% MeONa-containing methanol solution was added until the solution pH reached 10, and the mixture was stirred for 1 hour.
  • Dowex in reaction solution 50WX8 (H +) was added until the solution became neutral, the resin was filtered off, and the solvent was distilled off.
  • the obtained residue was dissolved in a mixture of methanol (50 ml) and water (10 ml), 5% Pd-C (50% water-containing) (2.0 g) was added, and the mixture was stirred for 1 hour under a normal pressure of hydrogen.
  • the catalyst was removed by filtration, and the solvent was distilled off, thereby obtaining 1.2 g of Compound 2-2.
  • the pH was adjusted to 7.5 using an 8 M aqueous sodium hydroxide solution under ice cooling.
  • the above process was performed twice, the resulting two aqueous solutions were combined into one, and the residual solution was removed by ultrafiltration using a Biomax-3 membrane (Millipore) to remove the low molecular fraction. Obtained.
  • This residual solution was passed through a Biomax-30 membrane.
  • the passed solution was desalted by an ultrafiltration method using a Biomax-3 membrane, and then lyophilized to obtain purified dextran polyalcohol (12.0 g).
  • the molecular weight (gel filtration, pullulan standard) of this material was 9K.
  • the purified dextran polyalcohol (9.4 g) was added to an aqueous solution obtained by dissolving sodium hydroxide (39.3 g) in water (282 ml), and dissolved at room temperature. Monochloroacetic acid (56.4 g) was added to this solution under ice cooling to dissolve it, and then reacted at room temperature for 20 hours. After the pH of the reaction solution was adjusted to 8 with acetic acid, the low-molecular fraction was removed by an ultrafiltration method using a Biomax-5 membrane. The residual solution was freeze-dried to obtain carboxymethyl (hereinafter abbreviated as CM) dextran polyalcohol sodium salt (12 g).
  • CM carboxymethyl
  • CM dextran polyalcohol 4.0 g was added to an aqueous solution obtained by dissolving sodium hydroxide (17 g) in water (120 ml), and dissolved at room temperature.
  • Monochloroacetic acid 24 g was added to this solution under ice cooling to dissolve it, and then reacted at room temperature for 20 hours.
  • CM dextran polyalcohol sodium salt (4.0 g).
  • the molecular weight (gel filtration, pullulan standard) of this substance was 14K, and the degree of CM per sugar residue was 0.7 from alkali titration.
  • the obtained sodium salt of CM dextran polyalcohol (1.0 g) was dissolved in water (100 ml), and a solution of the compound 2-2 of Example 1 (800 mg) in methanol (100 ml) was added.
  • water-soluble carbodiimide hydrochloride (240 mg) was added three times every two hours, and the mixture was stirred for a total of six hours.
  • the solvent in the reaction solution was distilled off, the obtained oil was dissolved in water, and desalted by ultrafiltration using Biomax-3.
  • the obtained aqueous solution was freeze-dried to obtain 1.1 g of the title compound.
  • the galactose content in the compound As a result of quantification by the enol-sulfuric acid method, the ratio was 1.0 per 10 sugar residues.
  • the sodium salt of galactose-modified CM dextran polyalcohol (1.0 g) obtained in (B) above was dissolved in water (30 ml), and trifluoroacetic acid of Gly-Gly-Phe-Gly-DX-8951 was dissolved.
  • a methanol solution (40 ml) of the salt (150 mg) and trihydroxybenzotriazole (35 mg) was added.
  • the pH of the solution was adjusted to 7.0, water-soluble carbodiimide hydrochloride (35 mg) was added three times every two hours, and the mixture was stirred for one minute.
  • the solvent in the reaction solution was distilled off, and the obtained residue was dissolved in 3M aqueous sodium chloride solution (20 ml), added dropwise to ethanol (100 ml), and the deposited precipitate was centrifuged (3500 rpm, 8 minutes) Collected by This precipitate was dissolved in water and desalted by ultrafiltration using a Biomax-3 membrane. The residual solution that did not pass through the membrane was filtered through a Millipore filter (0.22 ⁇ m), and then lyophilized to obtain 900 m of the title compound.
  • the galactose-modified DDS compound obtained in the above (C) and the DDS compound of the above (D) as a control were dissolved in distilled water for injection so that the concentration converted to DX-8951 was 0.5 mg / ml. Prepared. These DDS compound aqueous solutions were administered to C57BL / 6 mice in a group of 5 mice per tail vein. The dose was 5 mg / kg in terms of DX-8951. After administration, livers were collected over time (0.5, 1, 2, 4 and 24 hours) and the amount of these DDS compounds was determined. Water was added 5 times the weight of the obtained liver, and homogenized.
  • the solution was centrifuged at 3000 rpm for 10 minutes, and the supernatant was centrifuged at 15,000 rpm for 15 minutes.
  • To 50.1 of the obtained supernatant was added 450 ⁇ l of a poly-chymotrypsin solution adjusted to 2 mg / ml with Br-ton-Robinson Buffer (B.R.B) at pH 6, and reacted at 40 ° C for 2 hours.
  • B.R.B Br-ton-Robinson Buffer
  • add 500 ⁇ l of 0.5N HCl solution containing 50% acetonitrile centrifuge at 12,000 rpm for 5 minutes, and analyze 20 201 of the supernatant by HPLC to quantify the released G-DX8951.
  • the amount of DDS compound was determined.
  • the aqueous solution of each DDS compound used for the administration was adjusted to 50, 10, and 2 g / ml with distilled water, and each of them was enzymatically treated with the above method to quantify G-DX8951. was used as the calibration curve.
  • aqueous solution (5000 ml) of sodium periodate (165.0 g) was added to 0.1 g of a 0.1 M acetate buffer (pH 5.5) (5000 ml) of dextran T500 (Pharmacia, molecular weight 500K) (50 g).
  • ethylene glycol (35.0 ml) was added and the mixture was stirred overnight.
  • pH of the reaction solution was adjusted to 6.5 using an 8M aqueous sodium hydroxide solution under ice-cooling, a solution of sodium borohydride (70 g) suspended in water (2000 ml) was added. After dissolution, the mixture was stirred at room temperature overnight.
  • the mixture was cooled on ice, adjusted to pH 5.5 with acetic acid, and stirred at 4 ° C for 1 hour.
  • the pH was adjusted to 7.5 using an 8 M aqueous sodium hydroxide solution under ice cooling.
  • the obtained aqueous solution was subjected to ultrafiltration using a Biomax-50 membrane to remove a low molecular weight fraction to obtain a residual solution.
  • This residual solution was passed through an ultrafiltration membrane (1000K, manufactured by Filtron).
  • the passed solution was desalted by an ultrafiltration method using a Biomax-50 membrane, and then freeze-dried to obtain dextran polyalcohol (21.1 g).
  • the molecular weight (gel filtration, pullulan standard) of this material was 128K.
  • the dextran polyalcohol (5 g) obtained above was added to an aqueous solution obtained by dissolving sodium hydroxide (13.84 g) in water (150 ml), and dissolved at room temperature. To this solution was added sodium salt of monochloroacetic acid (61.6 g) under ice-cooling, and the mixture was reacted at room temperature overnight. After adjusting the pH of the reaction solution to 8.5, a low-molecular fraction was removed by ultrafiltration using a Biomax-50 membrane. The high molecular fraction was freeze-dried to obtain sodium salt of CM dextran polyalcohol (6.2 g).
  • the molecular weight (gel filtration, pullulan standard) of this substance was 428K, and the degree of conversion to CM per sugar residue was 0.9 from alkali titration.
  • the obtained sodium salt of CM dextran polyalcohol (500 mg) was dissolved in water (50 ml), and a solution of compound 2-2 (400 mg) of Example 1 in methanol (20 ml) was added to trihydroxybenzotriazole. (160 mg) in methanol (20 ml) was added. Further, water-soluble carbodiimide hydrochloride (120 mg) was added three times every two hours, followed by stirring for a total of six hours. The solvent in the reaction solution was distilled off, and the obtained oil was dissolved in water.
  • the low molecular fraction was removed by an ultrafiltration method using a Biomax-50 membrane.
  • the residual solution was lyophilized to obtain 600 mg of the desired product.
  • the galactose content in this compound was determined by the phenol-sulfuric acid method, and as a result, the ratio was 1.7 per 10 sugar residues.
  • the obtained sodium salt of galactose-modified CM dextran polyalcohol (200 mg) was dissolved in water (3 ml), and a methanol solution of trifluoroacetic acid salt of Gly-Gly-Phe-Gly-DX-8951 (27 mg) ( 3 ml) and a solution of trihydroxybenzotriazole (7 mg) in methanol (3 ml) were added.
  • the pH of the solution was adjusted to 7.0, water-soluble carbodiimide hydrochloride (7 mg) was added three times every 2 hours, and the mixture was stirred for 1 minute.
  • the solvent in the reaction solution was distilled off, and the obtained residue was dissolved in a 3M aqueous sodium chloride solution (10 ml), added dropwise to ethanol (100 ml), and the deposited precipitate was collected by centrifugation (3500 rpm). This precipitate was dissolved in water and desalted by an ultrafiltration method using a Biomax-50 membrane.
  • the residual solution that did not pass through the membrane was filtered through a Millipore filter (0.22 m), and then lyophilized to obtain 180 mg of the title compound.
  • N-acetylgalactosamine-modified CM dextran polyalcohol 200 mg was dissolved in water (10 ml), and the Gly-Gly-Phe-Gly-DX-8951 trif citrate acetate (30 mg) was dissolved in methanol. (10 ml) and a solution of 1-hydroxybenzotriazole (30 mg) in methanol (10 ml) were added. After adjusting the pH of the solution to 7.0, water-soluble carbodiimide hydrochloride (10 mg) was added three times every two hours. After stirring for 2 hours, the pH was brought to 8.5. The low molecular fraction was removed from the reaction solution by an ultrafiltration method using a Biomax-50 membrane.
  • DX-8951 for the calibration curve, the content of DX-8951 in the above DDS compound was calculated to be 4.0%. On the other hand, when the DX-8951 content was calculated from the UV absorption of the above DDS compound using DX-8951 as a calibration curve, it was calculated to be 3.3%.
  • Example 11 CM-Dex-PA- Gly -Gly- Gly-Phe-NH-Y, the measurement of the DX-8951 content in the -CH 2 -0- CO-DX- 8951
  • Example 12 Measurement of DX-8951 content in CM-Dex-PA-Gly-Gly-Phe-Gly-NH- (C3 ⁇ 4) 4 -C0-DX-8951
  • DX-8951 content was calculated from the UV absorption of the above DDS compound using DX-8951 as a calibration curve, it was calculated to be 3.1%.
  • Example 13 Determination of DXR content in CM-Dex-PA-Gly-Gly-Phe-Gly-DXR (DXR: doxorubicin)
  • Example 15 Synthesis of CM-Dex-PA-Gly-Gly-Phe-Gly-NH- (CH 2 ) 4 -C0-DX-8951
  • Boc- Gly- Gly- Phe- Gly-NH- ( CH 2) 4 - COOBzl dissolved in (560 mg) was 503 ⁇ 4 aqueous methanol (60 ml), 5% Pd- C (50% water content) of (1.5 g) was added The mixture was stirred under normal pressure of hydrogen for 1 ⁇ . Filtration of the catalyst in the reaction solution was concentrated to dryness, Boc-Gly- Gly- Phe- Gly- NH- (CH 2) 4 - C00H was obtained 300 m.
  • Boc-Gly-Gly-Phe-Gly-NH- (CH 2 ) 4 -C00H (300 mg), DCC (138 mg) and HOSu (77 mg) were dissolved in DMF and stirred for 30 minutes.
  • a solution of DX-8951 (317 mg) and triethylamine (0.078 ml) dissolved in DMF was added thereto, and the mixture was stirred at room temperature for 1 hour.
  • the reaction mixture was concentrated, and the obtained residue was purified by column chromatography (C3 ⁇ 4Cl 2 : MeOH 2 10: 1) to give Boc-Gly-Gly-Ply-Phe-Gly-NH- (CH 2 ) 4 -C0- DX-8951 was obtained 400 m.
  • the DDS compound of the present invention using a carboxy c 1-4 alkyl dextran polyalcohol modified with a sugar compound as a high molecular weight carrier is extremely high in organ directivity and is useful as a drug capable of exhibiting an excellent therapeutic effect. Further, the method for measuring a DDS compound of the present invention can accurately and easily quantify the blood concentration of a DDS compound and the content of a residue of a drug compound introduced into the DDS compound. It can be used as a very useful method for clinical application.

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Description

明 細 書
D D S化合物及びその測定方法 技術分野
本発明は、 糖化合物で修飾されたカルボキシ C1-4アルキルデキス卜ランポリア ルコールと抗腫瘍剤などの医薬化合物とを結合させた D D S化合物 ( D D S ： ド ラッグ ·デリバリ 'システム） に関するものである。 また、 本発明は、 高分子キ ャリア一と抗腫瘍剤などの医薬化合物とを結合させた D D S化合物の測定方法に 関するものである。 背景技術
肺癌や消化器癌などの固形癌や白血病などの血液癌の治療に際して用いられる 抗腫瘍剤は、静脈内投与や経口投与などの投与経路により全身的に投与された後、 特定の腫瘍部位に移行して癌細胞の増殖を阻害ないし抑制することにより治療効 果を発揮する。 しかしながら、 全身投与された抗腫瘍剤は、 血中から肝臓 ·網内 系臓器に速やかに取り込まれたり、 あるいは速やかに尿中排泄されるために、 血 中濃度が低下して腫瘍部位への移行が十分でない場合がある。 また、 通常の抗腫 瘍剤自体では腫瘍部位への移行選択性 （腫瘍選択性） が低いために、 抗腫瘍剤が 全身の様々な細胞や組織に満遍なく分布してしまい、 正常な細胞や組織に対して も細胞毒として作用するので、 嘔吐、 発熱、 あるいは脱毛などの副作用を極めて 高率に発生させるという問題がある。 従って、 抗腫瘍剤を効率的かつ選択的に腫 瘍部位に移行させる手段の開発が求められている。
このような手段の一つとして、 カルボキシル基を有する多糖化合物を高分子キ ャリァ一として用い、 該高分子キヤリァーに対して抗腫瘍剤を結合させて抗腫瘍 剤の血中における消失を遅延させるとともに、 癌組織への指向性を高める方法が 提案されている。 例えば、 国際公開 W094/19376 号には、 カルボキシル基を有す る多糖のカルボキシル基にぺプチド鎖 （アミノ酸数 1から 8 )が結合されており、 さらにこのペプチド鎖を介してドキソルビシン、 ダウノルビシン、 マイ トマイシ ン C、又はブレオマイシンなどを結合した D D S化合物が開示されている。また、 特公平 7-84481号公報には、 カルボキシメチル化されたマンノグルカン誘導体に シッフ塩基や酸アミ ド結合を介して上記の抗腫瘍剤を導入した D D S化合物が開 示されている。
これらの D D S化合物（「薬物複合体」 と呼ばれる場合もある） は、 高分子キヤ リア一に結合された抗腫瘍剤を単独で用いた場合に比べてより優れた抗腫瘍効果 を有するとともに、 毒性 ·副作用が軽減されていることを特徴としている。 本発 明者らは、 多糖化合物などの高分子キヤリア一と抗腫瘍剤などの医薬化合物とを 1から 8個のアミノ酸からなるスぺ一サ一を介して結合させることにより、 抗腫 瘍剤などの医薬化合物を目的組織に対して部位選択的に移行させることができる D D S化合物を提供している （国際公開 W097/46260号）。 また、 カルボキシ C1-4 アルキルデキストランポリアルコールが高分子キヤリァ一として極めて優れた性 質を有していることを見出し、 カルボキシ C1-4アルキルデキストランポリアルコ —ルを高分子キヤリア一として含む D D S化合物を提供した （上記国際公開)。 その他、 ポリアルコール化多糖化合物を高分子キヤリア一として用いた D D S 化合物に関する技術については、 「多糖—ペプチド—ドキソルビシン複合体に関 する研究 ·多糖化合物の血中安定性と抗腫瘍効果の関係」 （第 10回日本 D D S学 会講演要旨集， 279, 1994)；「多糖一べプチド—ドキソルビシン複合体に関する研 究 ·体内動態と抗腫瘍効果」 （第 9回日本薬物動態学会年会講演要旨集， 292, 1994)；第 19回研究開発動向セミナー （医薬品機構主催） 要旨集， D-9, 1995；及 び 「多糖キャリアーによる腫瘍への薬物送達に関する研究」 （第 12回コロイ ド - 界面技術シンポジウム， 日本化学会， 講演要旨集， 51 , 1995 )などの報告がある。 多糖化合物などの高分子キヤリァ一の臓器指向性を高める方法として、例えば、 糖修飾ポリグル夕ミン酸誘導体 （特開平 5-178986号公報)、 糖修飾ポリリジン誘 導体 （特開平 5- 222187号公報）、 ポリ 置換- L-リジンの D-ガラクトビラノシ ル-グルコン酸誘導体（特閧平 7-70311号公報)、糖修飾ポリ- ω-置換- L-グル夕ミ ン酸誘導体 （特開平 7-228688号公報)、 リンカ一を介して糖化合物を結合させた 多糖化合物 （特開平 8-85703 号公報）、 及びグルコシル -蛋白誘導体 （特開平 9 - 118699号公報） などが知られている。 しかしながら、 従来、 カルボキシ C1-47 ルキルデキストランポリアルコールを高分子キヤリア一として利用した D D S化 合物の臓器指向性を高める方法は報告されていない。
一方、 高分子キヤリア一と医薬化合物の残基とがオリゴぺプチドを含むスぺー サーを介して結合した D D S化合物を臨床で使用する場合には、 D D S化合物自 体の血中濃度を正確に測定することが必要であり、 また、 適正な投与量を決定し たり、 製品のロット差を検定するためには、 D D S化合物中に導入された抗腫瘍 剤などの医薬化合物の残基の含有量を正確に測定する必要がある。 従来、 D D S 化合物の血中濃度の測定や D D S化合物の医薬化合物の残基の含有量測定は、 医 薬化合物の発する蛍光や U V吸収を指標にして、 D D S化合物より医薬化合物ま たはこれにスぺ一サ一の一部が結合した化合物を切り離すことなく、 D D S化合 物自体を直接測定することにより行われている。 また、 D D S化合物自体の NM R測定による方法や、 D D S化合物を酸処理して生じる分解物を測定する方法も 提案されている。
しかしながら、 医薬化合物が酸に対して不安定である場合には、 酸処理等によ る分解物の定量法を利用することはできず、 N M R測定による定量は精度が低い という問題がある。 また、 D D S化合物に存在する医薬化合物の残基の U V吸収 は、 高分子キャリア一やペプチドスぺーサ一から受ける影響により、 医薬化合物 自体に比べて極大波長がシフトしたりモル吸光係数が変化している場合があるた め、 D D S化合物中に導入された医薬化合物の残基の含有量を正確に測定するこ とは一般に困難である。 さらに、 生体に投与された組織中の D D S化合物を NM R測定による方法や U V吸収により定量することは極めて困難である。 発明の開示
本発明の課題は、 カルボキシ c1-4アルキルデキストランポリアルコールを高分 子キヤリァ一として含む D D S化合物の臓器指向性 (例えば肝臓への指向性など） を高める手段を提供し、上記の特徴を有する D D S化合物を提供することにある。 本発明の別の課題は、 上記の特徴を有する D D S化合物の製造用原料として有 用な多糖化合物を提供することにある。
本発明のさらに別の課題は、 高分子キヤリァ一と医薬化合物の残基とがォリゴ ぺプチドを含むスぺ一サーを介して結合した D D S化合物の測定方法を提供する ことにある。 より具体的には、 本発明の課題は、 D D S化合物自体、 又は D D S 化合物中に導入された抗腫瘍剤などの医薬化合物の残基の含有量を正確に測定す る方法を提供することにある。 さらに具体的には、 投与された D D S化合物の血 中濃度や組織内濃度を正確に定量することができ、 あるいは D D S化合物に導入 された医薬化合物の残基の含有量を正確に定量可能な測定方法を提供することが 本発明の課題である。
本発明者らは上記の課題を解決すベく鋭意研究を行つたところ、 糖化合物で修 飾したカルボキシ C1-4アルキルデキストランポリアルコールを高分子キヤリア一 として用いると、 極めて臓器指向性の高い D D S化合物を製造することができ、 特にガラクトースを結合させたカルボキシ CMアルキルデキストランポリアルコ —ルを含む D D S化合物は優れた肝臓指向性を有していることを見出した。
また、 本発明者らは、 高分子キャリアーと医薬化合物の残基とがオリゴぺプチ ドを含むスぺ一サ一を介して結合した D D S化合物をべプチダーゼで処理し、 得 られた加水分解物を測定することによって、 D D S化合物の血中濃度や D D S化 合物に導入された医薬化合物の残基の含有量を正確に、 かつ簡便に定量すること ができることを見出した。本発明は上記の知見を基にして完成されたものである。 すなわち本発明は、 糖化合物で修飾されたカルボキシ C1-4アルキルデキストラ ンポリアルコールと該カルボキシ C1-4アルキルデキストランポリアルコールに結 合した医薬化合物の残基とを含む D D S化合物を提供するものである。 この発明の好ましい態様によれば、 糖化合物で修飾されたカルボキシ c1-4アル キルデキストランポリアルコールと医薬化合物の残基とがスぺーサーを介して結 合した上記 D D S化合物；スぺーサ一が 1個のアミノ酸又はべプチド結合した 2 から 8個のアミノ酸である上記 D D S化合物；糖化合物で修飾されたカルボキシ C1-4アルキルデキストランポリアルコールが、糖化合物とカルボキシ C1-4アルキル デキストランポリアルコールとがリンカーを介して結合したものである上記 D D S化合物；及び、 糖化合物で修飾されたカルボキシ C1-4アルキルデキストランポ リアルコールがリンカーを介して糖化合物によりクラス夕一修飾されたものであ る上記 D D S化合物が提供される。
また、 本発明により、 カルボキシ C1-4アルキル部分の一部のカルボキシル基が 糖化合物で修飾されたカルボキシ C1-4アルキルデキストランポリアルコールに対 して医薬化合物の残基を結合させることにより製造することができる D D S化合 物が提供される。
この発明の好ましい態様によれば、 該カルボキシ C1-4アルキルデキストランポ リアルコールと医薬化合物の残基とをスぺ一サーを介して結合させることにより 製造することができる上記 D D S化合物；及び、 カルボキシ C1-4アルキルデキス トランポリアルコールのカルボキシ C1-4アルキル部分の一部のカルボキシル基に 糖化合物又は糖化合物に結合したリンカ一を結合させることにより製造された該 カルボキシ C1-4アルキルデキストランポリアルコールに対して医薬化合物の残基 を結合させることにより製造することができる上記 D D S化合物が提供される。 さらに、 本発明により、 カルボキシ C1-4アルキル部分の一部のカルボキシル基 に医薬化合物の残基がスぺ一サ一を介して結合したカルボキシ C1-4アルキルデキ ストランポリアルコールを糖化合物で修飾することにより製造することができる D D S化合物が提供される。
この発明の好ましい態様によれば、 該カルボキシ C1-4アルキルデキストランポ リアルコールと糖化合物とをリンカ一を介して結合させることにより製造するこ とができる上記 D D S化合物；及び、 カルボキシ C1-4アルキルデキストランポリ アルコールのカルボキシ C1-4アルキル部分の一部のカルボキシル基に 1個のアミ ノ酸からなるスぺーサ一又はぺプチド結合した 2から 8個のアミノ酸からなるス ぺ一サーを介して医薬化合物の残基を結合させることにより製造された該カルボ キシ C1-4アルキルデキストランポリアルコールを糖化合物で修飾することにより 製造することができる上記 D D S化合物が提供される。
本発明のさらに好ましい態様によれば、 糖化合物がガラクトース若しくはガラ クトサミン又はそれらの誘導体である上記 D D S化合物；カルボキシ C1-4アルキ ルデキストランポリアルコールを構成するデキストランポリアルコールが、 実質 的に完全にポリアルコール化可能な条件下でデキストランを処理して得られたデ キストランポリアルコールである上記 D D S化合物；カルボキシ C1-4アルキルデ キストランポリアルコールがカルボキシメチルデキストランポリアルコールであ る上記 D D S化合物；ガラクト一ス若しくはガラクトサミン又はそれらの誘導体、 あるいはクラスター化されたガラクトース若しくはガラクトサミン又はそれらの 誘導体の置換度がカルボキシ （ 4アルキルデキストランポリアルコールの糖残基 あたり 0.01〜； 1.0である上記 D D S化合物；医薬化合物が抗腫瘍剤又は抗炎症剤 である上記 D D S化合物；医薬化合物が（1S，9S)-:1-アミノ- 9-ェチル - 5-フルォロ -2， 3-ジヒドロ- 9-ハイ ドロキシ -4-メチル -1H，12H-ベンゾ [de]ピラノ [3，，4， :6, 7] インドリジノ [ 1，2- b]キノリン -10, 13( 9H, 15H)-ジオンである上記 D D S化合物； 及び肝臓癌治療剤である上記 D D S化合物が提供される。
別の観点からは、 糖化合物で修飾されたカルボキシ C1-4アルキルデキストラン ポリアルコール；糖化合物で修飾されたカルボキシ （ 4アルキルデキストランポ リアルコールからなる高分子キャリアー；及び上記 D D S化合物の製造に使用す るための、 糖化合物で修飾されたカルボキシ （ 4アルキルデキストランポリアル コールが本発明により提供される。 また、 別の観点からは、 上記 D D S化合物の 製造のための、 糖化合物で修飾されたカルボキシ C1-4アルキルデキストランポリ アルコールの使用が提供される。
さらに別の観点からは、 本発明により、 ペプチド結合した 2から 8個のアミノ 酸を含むスぺ一サ一を介して高分子キヤリア一と医薬化合物の残基とが結合した
D D S化合物の測定方法であって、 該 D D S化合物をぺプチダーゼで処理するこ とにより得られる加水分解物を測定する工程を含む方法が本発明により提供され る。
この発明の好ましい態様によれば、 生体試料中に含まれる該 D D S化合物の濃 度測定に用いる上記方法；該 D D S化合物に導入された医薬化合物の残基の含有 量を測定するために用いる上記方法；該加水分解物が医薬化合物である上記方 法；該加水分解物が医薬化合物の残基にスぺーサ一の一部が結合した化合物であ る上記方法；及び、 スぺーサ一の一部がスぺーサ一由来の 1個のアミノ酸である 上記方法が提供される。
上記発明のさらに好ましい態様によれば、 該高分子キャリア一が力ルボキシル 基を有する高分子キヤリァー、 好ましくは多糖誘導体である上記方法；該高分子 キャリア一がカルボキシ C1-4アルキルデキストランポリアルコール、 好ましくは カルボキシメチルデキストランポリアルコールである上記方法；カルボキシ C1-4 アルキルデキストランポリアルコールを構成するデキストランポリアルコールが、 実質的に完全にポリアルコール化可能な条件下でデキストランを処理して得られ たデキストランポリアルコールであることを特徴とする上記方法；該高分子キヤ リァ一が糖化合物で修飾されたものである上記方法；該 D D S化合物中に導入さ れた医薬化合物が抗腫瘍剤又は抗炎症剤である上記方法；スぺ一サ一が N末端側 から - Gly- Gly- Phe- Gly-で表されるテ ト ラべプチ ド又は N末端側から - Gly-Gly- Gly-Phe-で表されるテトラべプチドである上記方法；スぺ一サ一が N末 端側から -Gly-Gly-Phe-Gly-NH-Y' -CH2 - 0- CO-で表される基又は N末端側から - Gly- Gly- Gly- Phe- NH-Y，- CH2-0- CO-で表される基 （式中、 Y，は p—フエ二レン基 を示す） である上記方法；ぺプチダ一ゼがひ—キモトリプシン又はパパィンであ る上記方法；及び、 医薬化合物が （1S, 9S)- 1-ァミノ- 9-ェチル - 5-フルォロ- 2，3- ジヒドロ- 9-ハイ ドロキシ -4-メチル - 1H，12H-ベンゾ [de]ピラノ [3，，4，：6，7]ィン ドリジノ [1，2- b]キノリン- 10, 13( 9H, 15H)-ジオンである上記方法が提供される。 上記発明の特に好ましい態様では、上記方法は N末端側から- Gly- Gly- Phe- Gly- で表されるテトラべプチド又は N末端側から- Gly- Gly- Gly- Phe-で表されるテト ラぺプチド含むスぺ一サ一を介してカルボキシ C1-4アルキルデキストランポリア ルコールと（1S，9S)- ァミノ- 9-ェチル - 5-フルォ口- 2，3-ジヒドロ- 9-ハイ ドロキ シ- 4-メチル -1H，12H-ベンゾ [de]ピラノ [3，，4，：6, 7]ィンドリジノ [1,2-b]キノリ ン -10，13(9H,15H)-ジオンとが結合した DD S化合物の測定に用いることができ、 ベプチダ一ゼとしてひ一キモトリブシンを用い、 加水分解物として （lS，9S)-9- ェチル -5-フルォロ- 1-グリシルァミノ- 2，3-ジヒドロ- 9-ハイ ドロキシ- 4-メチル -1H,12H-ぺンゾ [de]ピラ ノ [3，，4， :6,7]イ ン ド リ ジノ [1,2- b]キノ リ ン - 10，13(9H，15H)-ジオンを測定することにより、上記 D D S化合物又は上記 D D S 化合物に導入された上記抗腫瘍剤の含有量を定量することができる。 図面の簡単な説明
第 1図 本発明の方法 （例 4) で測定した DDS化合物の血中及び腹水中濃度を 示した図である。
第 2図 本発明の方法 （例 5) で測定した DDS化合物の血中及び腹水中濃度を 示した図である。
第 3図 糖化合物で修飾された高分子キヤリア一を有する本発明の DDS化合物
(例 6) の紫外線吸収スぺクトルを示す図である。
第 4図 糖化合物で修飾された高分子キヤリァーを有する本発明の D D S化合物
(例 6) の GPCチャートを示す図である。
第 5図 例 6で製造した DDS化合物 （（C)及び (D)) の肝臓への集積性を示す図 である。
第 6図 本発明の DD S化合物（例 6(D))の紫外線吸収スぺクトルを示す図であ る。
第 7図 本発明の DD S化合物 (例 7)の紫外線吸収スぺクトルを示す図である。 第 8図 本発明の DD S化合物（例 9)の紫外線吸収スぺクトルを示す図である。 第 9図 本発明の D D S化合物 （例 6 (D) ) の GPCチャートを示す図である。
第 10図 本発明の D D S化合物 （例 7 ) の GPCチャートを示す図である。
第 11図 本発明の D D S化合物 （例 9 ) の GPCチャートを示す図である。 発明を実施するための最良の形態
本発明の D D S化合物は、 糖化合物で修飾されたカルボキシ C1-4アルキルデキ ストランポリアルコールと該カルボキシ C1-4アルキルデキストランポリアルコ一 ルに結合した医薬化合物の残基とを含むことを特徴としている。より具体的には、 本発明の D D S化合物は、 （1 ) 糖化合物で修飾されたカルボキシ C1-4アルキルデ キストランポリアルコールと医薬化合物の残基とがスぺーサーを介さずに結合し ている場合；及び (2) 糖化合物で修飾されたカルボキシ C1-4アルキルデキストラ ンポリアルコールと医薬化合物の残基とがスぺーサーを介して結合している場合 のいずれをも包含する。
糖化合物で修飾されたカルボキシ C1-4アルキルデキストランポリアルコールと 医薬化合物の残基とがスぺーサーを介して結合している場合の例としては、 例え ば、 カルボキシ C1-4アルキルデキストランポリアルコールと医薬化合物の残基と が 1個のアミノ酸からなるスぺ一サ一で結合している場合、 又はカルボキシ C1-4 アルキルデキストランポリアルコールと医薬化合物の残基とがべプチド結合した 2から 8個のアミノ酸からなるスぺーサ一を介して結合している場合や、 ぺプチ ド結合した 2から 8個のアミノ酸からなるオリゴペプチドに- NH-Y- CO- [式中、 Y は炭素数 1から 8個のアルキレン基又は- C6H4- CH2-0- (- C6H4 -はフエ二レン基を示 し、 該フエ二レン基は 1又は 2個以上の置換基を有していてもよく、 好ましくは p—フエ二レン基である）で表される基を示す]で表される連結基が結合したスぺ —サ一を介して結合している場合などを挙げることができる。 本明細書において 用いられる 「修飾」 という用語は、 糖化合物とカルボキシ C1-4アルキルデキスト ランポリアルコールとが直接的に、 又はリンカ一を介して間接的に共有結合によ つて結合した状態を含めて最も広義に解釈すべきであり、 いかなる意味において も限定的に解釈してはならない。
上記の D D S化合物に含まれる医薬化合物の残基は、 例えば、 抗腫瘍剤、 抗炎 症剤、 抗菌剤などの医薬としてヒトを含む哺乳類の病気の治療及び/又は予防に 用いられる医薬化合物の主要な部分構造を意味している。 もっとも、 該医薬化合 物の用途は上記のものに限定されることはなく、 医薬化合物としては、 カルボキ シ C1-4アルキルデキストランポリアルコール又はスぺーサ一との結合に関与でき る 1又は 2以上の反応性官能基 （例えば、 アミノ基、 カルボキシル基、 水酸基、 チオール基、 エステル基など） を有するものであればいかなるものを用いてもよ い。 医薬化合物の残基は、 カルボキシ C1-4アルキルデキストランポリアルコール のカルボキシル基、 スぺーサ一に存在する反応性官能基 （例えば、 ペプチドスぺ —サーを用いる場合には、 その N末端アミノ基若しくは C末端カルボキシル基、 又はスぺ一サ一を構成するアミノ酸に存在する反応性官能基） に結合していても よい。 また、 本明細書において医薬化合物という場合には、 それ自体が医薬作用 を有する化合物の主要構造をその部分構造として含み生体内で該化合物を再生す ることができるプロドラッグ化合物も含まれる。
上記発明において、 医薬化合物の残基とは、 カルボキシ C1-4アルキルデキスト ランポリアルコール又はスぺ一サーと医薬化合物の残基との結合が、 医薬化合物 中の反応性官能基とカルボキシ CMアルキルデキストランポリアルコール又はス ぺーサ—中の反応性官能基との反応 （例えば脱水縮合など） により形成されたと 仮定した場合において、 結合後の化合物中に存在する医薬化合物に由来する部分 構造のことである。 例えば、 医薬化合物が D- NH2, D-COOH, D-COOR, D - 0H， D-SH, D-C0NH2, D-NH-C00R (R は低級アルキル基等）で表される場合、 医薬化合物の残基 はそれそれ D-NH- (D-NH-C0-Qなど）， D-CO- (D-CO-NH-Q, D-CO-O-Q, D-C0-S-Qな ど）， D- CO- (D-CO-NH-Q, D-CO-O-Q, D-C0-S-Q など）， D- 0- (D-0-C0-Q, D-O-Q な ど）， D-S- (D-S-CO-Q, D-S-Q など）， D-CONH- (D-C0-NH-C0-Q など）， D-NH-CO- (D-NH-C0-0-Q, D- NH- CO- NH- Qなど） で表される （カツコ内はスぺ一サ一又はカル ボキシ C1-4アルキルデキストランポリアルコールと医薬化合物の残基との結合を 示し、 Q はスぺーサー及びカルボキシ C1-4アルキルデキストランポリアルコール からそれそれ反応性官能基及びカルボキシル基を除いた残りの部分構造を示す）。 もっとも、 スぺーサ一又はカルボキシ C1-4アルキルデキストランポリアルコール と医薬化合物の残基との結合の種類は上記のものに限定されることはない。
医薬化合物の残基としては、 例えば、 ドキソルビシン、 ダウノルビシン、 マイ トマイシン C、 ブレオマイシン、 シクロシチジン、 ビンクリスチン、 ビンプラス チン、 メ ト トレキセ一ト、 白金系抗腫瘍剤 （シスブラチン若しくはその誘導体)、 タキソール若しくはその誘導体、 カンプトテシン若しくはその誘導体 （特開平 6-87746 号公報に記載された抗腫瘍剤、 好ましくは請求項 2に記載された ( 1S, 9S)-卜ァミノ- 9-ェチル -5-フルォロ- 2, 3-ジヒドロ- 9-ハイ ドロキシ -4-メ チル- 1H，12H-ベンゾ [de]ピラノ [3，，4，：6，7] イン ドリジノ [ 1，2- b] キノ リン - 10，13( 9H，15H)_ジオン等）などの抗腫瘍剤の残基を好適に用いることができる。 また、 例えば、 コハク酸ヒドロコルチゾン、 コハク酸プレドニゾロンなどのステ ロイ ド系抗炎症剤、 又はメフエナム酸、 フルフエナム酸、 ジクロフエナク、 イブ プロフェン、 チノリジンなどの非ステロイ ド系抗炎症薬の残基も好適である。 医薬化合物の残基とカルボキシ C1-4アルキルデキストランポリアルコールとを 結合するスぺ一サ一として、 1個のアミノ酸からなるスぺーサ一又はべプチド結 合した 2から 8個のアミノ酸からなるスぺ一サ一を用いる場合には、 該スベーサ 一は、 1個のアミノ酸の残基 （アミノ酸のアミノ基及びカルボキシル基からそれ それ 1個の水素原子及び 1個の水酸基を除いた残基を意味する）、又はべプチド結 合した 2ないし 8個のアミノ酸からなるオリゴぺプチドの残基 （N末端のァミノ 基及び C末端のカルボキシル基からそれそれ 1個の水素原子及び 1個の水酸基を 除いた残基を意味する） の形態を有している。
好ましいスぺーサ一は 2から 6個のアミノ酸からなるオリゴぺプチドの残基で ある。 スぺ一サ一を構成するアミノ酸の種類は特に限定されないが、 例えば、 L- 又は D-アミノ酸、好ましくは L-アミノ酸を用いることができ、 ひ一アミノ酸のほ か、 ?ーァラニン、 £—アミノカプロン酸、ァ一ァミノ酪酸などを用いてもよい。 このようなひ—アミノ酸以外のアミノ酸は、 スぺーサ一中で多糖化合物に近接し た位置に配置されることが好ましい。
例えばオリゴペプチドスぺーサ一を用いる場合の結合方向は特に限定されない が、 一般的には、 カルボキシ c1-4アルキルデキストランポリアルコールのカルボ キシル基にスぺーサ一の N末端を酸アミ ド結合によって結合し、 医薬化合物のァ ミノ基にスぺーサ一の C末端を結合することできる。 また、 例えば、 ペプチドス ぺ一ザの構成単位としてリジン残基を含めておき、 リジン残基の α—アミノ基及 び £—アミノ基をそれそれ他のアミノ酸のカルボキシル基と酸アミ ド結合させる と、 ペプチドスぺ一サ一の両末端が Ν末端になるので、 医薬化合物のカルボキシ ル基を結合することが可能になる。 さらに、 スぺーサ一中に 1個又は 2個以上の ジアミン化合物またはジ力ルボン酸化合物の残基 （例えばエチレンジァミンなど のジァミンの残基ゃコハク酸などのジカルボン酸の残基など） を構成単位として 含めておき、 それそれ両末端が Ν末端のスぺーサ一及び両末端が C末端のスぺー サーを利用してもよい。
オリゴぺプチドからなるスぺ一サーを用いる場合のアミノ酸配列は特に限定さ れないが、 例えば、 スぺーサ一が -Χ-Ζ-で表されるジペプチドの残基 （X は疏 7 性アミノ酸の残基を示し、 Zは親水性アミノ酸の残基を示し、 - X-Z-は疎水性アミ ノ酸 (X)と親水性アミノ酸（Z) とがそれそれ N末端側及び C末端側となってぺプ チド結合したジぺプチドの N末端のアミノ基及び C末端のカルボキシル基からそ れそれ 1個の水素原子及び 1個の水酸基を除いた残基を意味する） であるか、 又 は該ジぺプチドの残基を部分べプチド配列として含むスぺ一サーを好適に用いる ことができる。疎水性アミノ酸としては、例えば、 フエ二ルァラニン、チロシン、 ロイシンなどを用いることができ、親水性アミノ酸としては、例えば、グリシン、 ァラニンなどを用いることができる。 スぺ一サ一がこのようなジぺプチド残基の 繰り返し配列 (例えば- X- Z- X-Z -， - X- Z-X-Z-X- Z-など） を有していてもよい。 このようなジぺプチド構造を含むスぺーサーを用いると、 スベーサ一がべプチ ダーゼが豊富であると考えられる腫瘍部位や炎症部位で加水分解され、 当該部位 において短時間に高濃度の医薬化合物が遊離する。 従って、 上記ジペプチドを含 むスぺーサーと医薬化合物とが結合して形成される部分構造は、 本発明の D D S 化合物の好ましい部分構造である。 医薬化合物の残基として、 濃度に依存型の抗 腫瘍剤（例えば、 ドキソルビシンなど） の残基を用いる場合には、 - X- Z-で示され る上記のジぺプチド残基からなるスぺーサ一又は該ジぺプチド残基を部分べプチ ド配列として含むスぺーサーを用いることが好ましい。
また、 医薬化合物の残基として、 一定の濃度以上で作用時間の持続を必要とす る時間依存型の抗腫瘍剤を用いる場合にも、 上記のスぺ一サ一を用いることによ つて高い抗腫瘍効果を達成できる場合がある。 このような抗腫瘍剤として、 例え ば、 特開平 6-87746号公報に記載された抗腫瘍剤、 好ましくは請求項 2に記載さ れた抗腫瘍剤が挙げられる。 一般的には、 上記のスぺ一サ一に限定されることな く、 抗腫瘍剤の作用機構、 体内動態や毒性発現の特徴、 体内での抗腫瘍剤の遊離 性などの観点から好ましいスぺーサ一を選択する必要がある。 なお、 一般的に、 増殖の速い癌種に対しては、 短時間に高濃度の医薬化合物を遊離することができ る上記のスぺーサ一を選択することが好ましい。
スぺーサ一として利用可能なオリゴぺプチドの具体例を以下の表に示すが、 D
D S化合物に必要に応じて用いられるスぺーサ一は以下のものに限定されること はなく、 スぺーサーを利用すべきか否かの選択、 あるいはスぺーサーを用いる場 合にその種類の選択は、 医薬化合物の至適な遊離速度を与えるように当業者が適 宜なしうることはいうまでもない （表中、 ペプチド配列は左側が N末端であり、
C末端側に医薬化合物の残基が結合する。 D-Pheは D-フエ二ルァラニン残基を示 し、 その他のアミノ酸は L-アミノ酸を示す。 なお、 遊離速度の大小はドキソルビ シンを結合した D D S化合物の Walker 256担癌ラッ卜に対する薬効の発現程度、 または Walker 256担癌ラットの腫瘍部位における遊離ドキソルビシン濃度によつ て判定した。）。 これらのスぺーサ一のうち、 ドキソルビシンに対しては （N 末 端）- Gly- Gly- Phe- Gly-等の短時間に高濃度の医薬化合物を遊離することができる スベーサーを用いることが好ましい。 表 1
(a) 遊離速度が大きいスぺーサー -Leu-Gly-
-Tyr-Gly-
-Phe-Gly-
-Gly-Phe-Gly-
-Gly-Gly-Phe-Gly-
-Gly-Phe-Gly-Gly-
-Phe-Gly-Gly-Gly-
-Phe-Phe-Gly-Gly-
-Gly-Gly-Gly-Phe-Gly-
(b) 遊離速度が比較的大きいスぺーサ一 -Gly-Gly-Phe-Phe- -Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-
(c) 遊離速度が比較的小さいスぺーサー -Phe-Phe-
-Ala-Gly- -Pro-Gly- -Gly-Gly-Gly-Phe-
(d) 遊離速度が小さいスぺーサー -Gly-
-D-Phe-Gly-
-Gly-Phe-
-Ser-Gly-
-Gly-Gly-
-Gly-Gly-Gly-
-Gly-Gly-Gly-Gly- 本発明の D D S化合物は、 高分子キャリア一として、 糖化合物で修飾された力 ルポキシ （ 4アルキルデキストランポリアルコールを有することを特徴としてい る。 本発明の D D S化合物におけるカルボキシ C1-4アルキルデキストランポリア ルコールのポリアルコール化度は特に限定されないが、 カルボキシ C1-4アルキル デキストランポリアルコールを構成するデキストランポリアルコールが、 実質的 に完全にポリアルコール化可能な条件下においてデキストランを処理して得られ たデキストランポリアルコールであることが好ましい。
カルボキシ C1-4アルキルデキストランポリアルコールを製造するために用いる デキストランの種類は特に限定されず、 a -D- 1 , 6-結合を任意の割合で含んでいて もよい。 例えば、 ひ- D-1 , 6-結合の割合が 85%以上、 90% 以上、 又は 95% 以上の デキストランなどを用いることができる。 デキストランの分子量は特に限定され ないが、 例えば 1，000程度から 2, 000，000程度のもの、 好ましくは 3 , 000程度 から 800, 000程度のものを用いることができる。 カルボキシ C1-4アルキルデキス トランポリアルコールのカルボキシ C1-4アルキル基を構成する C1-4アルキルとし ては、 直鎖又は分枝鎖の C1-4アルキル、 具体的にはメチル基、 ェチル基、 n-プロ ピル基、 イソプロビル基、 n-ブチル基、 sec-プチル基などを用いることができる が、 好ましくはメチル基を用いることができる。
出発原料としてデキストランを用いる場合には、 デキストランに大過剰の過ョ ゥ素酸ナトリゥムと水素化ホウ素ナトリゥムとを順次作用させてデキストランを 実質的に完全にポリアルコール化したデキストランポリアルコールを製造するこ とができる。 もっとも、 デキストランのポリアルコール化の方法は上記のものに 限定されることはなく、 当業者に利用可能なものであればいかなる方法を採用し てもよい。 カルボキシ C1-4アルキル化は、 例えば、 デキストランポリアルコール の水酸基に対してクロル酢酸、 ブロム酢酸、 ひ—クロルプロピオン酸、 ひ—メチ ル一ひ一クロルプロピオン酸、 ?—クロルプロピオン酸、 ひ一メチル一 一クロ ルプロピオン酸、 ひ一クロル酪酸、 クロル酪酸、 ァ—クロル酪酸などのハロ ゲン化 C1-4アルキルカルボン酸、 好ましくはクロル酢酸を反応させて水酸基を部 分的又は完全にカルボキシ c1-4アルキル化することにより行うことができる。
例えば、デキストランポリアルコールを反応に関与しない不活性溶媒 (例えば、 水、 N，N -ジメチルホルムアミ ド、 ジメチルスルホキシド等） に溶解し、 塩基 （例 えば、 水酸化ナトリウムゃ水酸化力リゥム等） の存在下にハロゲン化 C1-4アルキ ルカルボン酸またはその塩を添加し、 氷冷下ないし 100 °C程度の温度範囲で数分 ないし数日間反応させればよい。 カルボキシ C1-4アルキル基の導入の程度は、 例 えば、 カルボキシ C1-4アルキル化の反応温度や試薬として用いるハロゲン化 C1-4 アルキルカルボン酸及び塩基の量を適宜選択することにより容易に調節可能であ り、 そのような手段は当業者に周知である。 デキストランポリアルコールの糖残 基に対するカルボキシ C1-4アルキル化の程度は特に限定されないが、例えば、 0. 01 〜2. 0の範囲、 好ましくは 0. 1〜1 . 0の範囲である。
カルボキシ（^4アルキルデキストランポリアルコールを修飾する糖化合物の種 類は特に限定されず、 D D S化合物が指向すべき臓器の種類や体内動態などの条 件に応じて当業者が適宜選択可能である。 糖化合物としては単糖類若しくはォリ ゴ糖類、 又はそれらの誘導体のいずれを用いてもよい。 また、 糖化合物とカルボ キシ C1-4アルキルデキストランポリアルコールとの結合の種類は特に限定されな い。 糖化合物とカルボキシ C1-4アルキルデキストランポリアルコールとが、 例え ば、 0-ひ-グリコシド結合又は 0- /? -グリコシド結合などにより直接結合していて もよく、 あるいは適宜のリンカ一を介して両者が結合していてもよい。 本明細書 において用いられる 「リンカ一」 という用語は、 糖化合物残基とカルボキシ C1-4 アルキルデキストランポリアルコールとの結合に用いられるいかなるものも包含 するように、 最も広義に解釈する必要がある。 カルボキシ C1-4アルキルデキスト ランポリアルコールに対する糖化合物の導入量 （置換度） は特に限定されず、 糖 化合物の種類、 所望の指向性の程度、 医薬化合物の種類など種々の条件によって 適宜選択可能であるが、 一般的には、 カルボキシ CHアルキルデキストランポリ アルコールの糖残基あたり 0. 01 -1 . 0程度である。
リンカ一を用いる場合、 リンカ一の種類は特に限定されないが、 例えば、 - 0 - (CH2)n- NH- ( ま 1から 16の整数）又は-（0- CH2CH - NH- ( mは 1から 10の整 数） で表されるリンカ一を利用することが好ましい。 これらのリンカ一の 0末端 又は N末端、好ましくは 0末端を糖化合物に 0-ひ-グリコシド結合又は 0- ? -グリ コシド結合で結合し、 他端をカルボキシ C1-4アルキルデキストランポリアルコー ルのカルボキシル基とアミ ド結合又はエステル結合させることにより、 カルボキ シ C1-4アルキルデキストランポリアルコールを糖化合物で修飾することが可能で あ 。
また、 いわゆるクラスター修飾に適するリンカ一を用いることにより、 クラス 夕一修飾体を製造することもできる。 クラス夕一修飾体は、 カルボキシ c1-4アル キルデキストランポリアルコールのカルボキシル基に対してクラスタ一修飾に適 するリンカーを用いて糖化合物を房状に結合させた化合物であり、 その具体的手 段は、例えば、特許第 2774417号明細書、特許第 2774429号明細書、又は Biol . Pharm. Bull. , 20， pp.259- 266， 1997 などに記載されている。 クラス夕一修飾体は複数 個の糖化合物を一定の空間内に配置するために、レセプ夕一との親和性が高まり、 優れた臓器指向性を発揮できるという特徴がある。 本発明の D D S化合物におけ るクラスター修飾の一例を下記に示す （下記の構造式では、 クラスター修飾され たカルボキシ C1-4アルキルデキストランポリアルコール分子の部分構造を示して あり、 医薬化合物の残基は省略してある）。 もっとも、 本発明の D D S化合物に利 用可能なクラス夕一修飾方法は下記の具体例に限定されることはなく、 当業者が 適宜の手段を選択できることは言うまでもない。
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単糖類としては、 グルコース、 フルクト一ス、 マンノース、 ガラクト一ス、 フ コース、 ノィラミン酸、 ゥロン酸などのへキソース；ガラクトサミン、 グルコサ ミンなどのへキソサミン； リボース、 デォキシリボース、 ァラビノース、 キシロ ースなどのベント一スなどを挙げることができる。 これらの誘導体として、 例え ば、 N-又は 0-ァシル誘導体、 0-アルキル誘導体、 硫酸エステル、 リン酸エステル などを用いてもよい。 単糖類の誘導体として、 より具体的には、 N-ァセチルノィ ラミン酸、 N-ァセチルガラクトサミン、 N-ァセチルダルコサミン、 マンノース - 6 - リン酸、 ガラクト一ス- 3-リン酸、 6-0-ベンゾィルグルコース、 6-0-カルボキシメ チル -N-ァセチルグルコサミン、 2-N-ベンジルグルコサミンなどを挙げることがで きる。 オリゴ糖類としては、 例えば、 上記の単糖類又はそれらの誘導体から構成 される直鎖状又は分枝鎖状のへテロオリゴ糖又はホモオリゴ糖を用いることがで きる。より具体的には、 シユークロ一ス、 シァリルルイス A、 シァリルルイス X、 ラクトース、マルト一ス、ルイス X、硫酸化ルイス Xなどを用いることができる。 これらのうち、 肝臓指向性を高める糖化合物としては、 ガラクト一ス若しくはガ ラクトサミン又はその誘導体、あるいはガラクト一ス又は N-ァセチルガラクトサ ミンを非還元末端側に有するオリゴ糖 （例えばラクト一ス） が好ましく、 特にガ ラクト一ス又は N-ァセチルガラクトサミンが好ましい。
本発明の D D S化合物の製造方法は特に限定されないが、 以下に一般的な製造 方法を示す。 また、 その一例を本明細書の実施例に具体的かつ詳細に示した。 当 業者は、 下記の一般的説明及び実施例に記載された製造方法を参照しつつ、 製造 原料、 反応試薬、 及び反応条件などを適宜選択し、 必要に応じてそれらの方法に 修飾や改変を加えることにより、 本発明に包含される D D S化合物を容易に製造 することが可能である。 一般的には、 カルボキシ C1-4アルキルデキストランポリ アルコールを適宜の方法に従つて糖化合物で修飾し、 該修飾体を医薬化合物の残 基又は医薬化合物に結合したスぺ一サ一と反応させることにより、 本発明の D D S化合物を製造することができる。 通常は、 カルボキシ C1-4アルキルデキストラ ンポリアルコールをナトリゥム塩又は力リゥム塩などのアル力リ金属塩の形態の 水溶液として調製し、 糖化合物の修飾及び医薬化合物 （又は医薬化合物に結合し たスぺ一サ一） との反応を水中、 又は含水有機溶媒中で行うことができる。
あるいは、 カルボキシ C1-4アルキルデキストランポリアルコール又は糖化合物 で修飾されたカルボキシ （ 4アルキルデキストランポリアルコールを有機アミン 塩の形態に変換し、 その後の反応を実質的に水を含まない有機溶媒中で行うこと も可能である。 有機ァミンの塩としては、 例えば、 トリェチルァミン、 トリメチ ルァミン、 トリエタノールァミンなどの脂肪族ァミン類の塩のほか、 N-メチルビ 口リジン、 N-メチルビペリジン、 N-メチルモルホリン、 ジメチルァミノピリジン などの脂璟式又は芳香族ァミン類の塩、 塩化テトラメチルアンモニゥム、 塩化テ トラェチルアンモニゥムなどの四級アンモニゥム塩などを用いることができる。 カルボキシ C1-4アルキルデキストランポリアルコール又は糖化合物で修飾された カルボキシ C1-4アルキルデキストランポリアルコールのナトリゥム塩から有機ァ ミンの塩への変換は、 イオン交換樹脂などを用いて行うことができる。 例えば、 カルボキシメチルデキストランポリアルコール又はその糖化合物修飾体のナトリ ゥム塩を水に溶解し、 Bio- Rad AG50W-X2 ( 200-400 メッシュ、 H+型） 樹脂を充填 したカラムに付して水で溶出した後、 トリエチルァミンなどの有機アミンを添加 して凍結乾燥することができる。 また、 カルボキシメチルデキストランポリアル コール又はその糖化合物修飾体のナトリゥム塩を水に溶解し、 トリエチルアンモ ニゥム型の樹脂を通過させることによって一工程で変換を行うことも可能である 医薬化合物自体とカルボキシ C1-4アルキルデキストランポリアルコールのカル ボキシル基との結合、 又は医薬化合物を結合させたスぺ一サ一とカルボキシ C1-4 アルキルデキストランポリアルコールのカルボキシル基との結合は、一般的には、 医薬化合物自体が有する反応性アミノ基又はスぺ一サ一の反応性アミノ基 （ぺプ チドスぺ一サ一では N末端アミノ基など） とカルボキシ C1-4アルキルデキストラ ンポリアルコールのカルボキシル基とを、酸アミ ド結合させればよい。もっとも、 スぺーサ一とカルボキシ （ 4アルキルデキストランポリアルコールのカルボキシ ル基との結合は上記のものに限定されることはなく、 他の化学結合や 1又は 2以 上のスぺ一サ一を利用した結合であってもよい。 例えば、 ペプチドスぺ一サ一の C末端カルボキシル基又は医薬化合物のカルボキシル基とカルボキシ C1-4アルキ ルデキストランポリアルコールのカルボキシル基とにより酸無水物を形成させて もよく、 また、 エチレンジァミン等のジァミン化合物をスぺ一サ一として用いて それぞれのカルボキシル基をジアミンの各ァミノ基に酸アミ ド結合させてもよい 医薬化合物自体が有する反応性アミノ基又はべプチドスべ一サ一の N末端アミ ノ基とカルボキシメチルデキストランポリアルコールのカルボキシル基とを酸ァ ミ ド結合により結合させる場合には、 ペプチド鎖の合成に用いる通常の脱水縮合 剤、 例えば、 N，N，- ジシクロへキシルカルボジイミ ド（DCC ) のような N，N，-ジシ クロアルキルカルボジイミ ド類、 1-ェチル -3- ( 3-ジメチルァミノプロピル） カル ポジイミ ド（EDAPC) 等のカルボジィミ ド誘導体、 卜エトキシカルボニル- 2- エト キシ- 1 , 2-ジヒドロキシキノリン （EEDQ )などを用いることができる。この場合、 必要に応じて 卜ヒドロキシベンゾトリアゾール（H0BT )のようなべンゾトリアゾ ール誘導体を加えてもよい。 また、 活性エステル法や酸ハライ ド法などにより反 応を行ってもよい。
反応を非水系で行う場合の溶媒としては、 実質的に水を含まない有機溶媒であ つて、 反応種 （糖化合物で修飾されたカルボキシメチルデキストランポリアルコ ールの有機ァミンの塩及び医薬化合物又は医薬化合物を結合させたスぺーサ一な ど） を溶解することができるものならばいかなるものを用いてもよい。 例えば、
Ν, Ν-ジメチルホルムアミ ド、 ジメチルスルホキシド、 ァセトアミ ド、 Ν-メチルビ ロリ ドン、 スルホランなどを用いることが好適である。 糖化合物で修飾された力 ルポキシ C1-4アルキルデキストランポリアルコールに導入される医薬化合物の残 基の量は特に限定されないが、 医薬化合物の残基の種類、 並びに D D S化合物の 体内動態、 薬効、 及び毒性などの観点から適宜選択すべきである。 一般的には、 0. 1 〜30重量％、 好ましくは 2〜15重量％程度の範囲を選択することができる。 医薬化合物として特開平 6-87746号公報の請求項 2に記載された抗腫瘍剤を用い る場合の導入量は、 例えば 1〜15 重量％、 好ましくは 4〜8 重量％程度である。 カルボキシ C1-4アルキルデキストランポリアルコールに導入された医薬化合物の 残基の割合は、例えば、吸光度分析などにより容易に決定することが可能である。 例えば、 医薬化合物として特開平 6-87746号公報の請求項 2に記載された抗腫 瘍剤を用いる場合、 この医薬化合物は、 酸性水性媒体中 （例えば pH3程度） では ラクトン環を形成した化合物 （閉環体） に平衡が偏り、 一方、 塩基性水性媒体中 (例えば pHIO程度）ではラクトン環が開環した化合物（開環体） に平衡が偏るこ とが知られている。 このような閉環体及び開環体に対応する残基を導入した D D S化合物は同等の抗腫瘍効果を有しているが、 糖化合物で修飾されたカルボキシ C1-4アルキルデキストランポリアルコールと上記医薬化合物を結合させたスぺー サ一 （例えばオリゴペプチドスぺ一サー） とを反応させる場合に開環型の反応種 が反応系に存在すると、 ラク トン環に由来するカルボキシル基とスぺ一サ一由来 のァミノ基との間で縮合反応が進行し、 著しく反応収率が低下するだけでなく、 目的とする均一な D D S化合物が得られない場合がある。 このような副反応は、 平衡が達成されない非水系において反応種として閉環体を用いることにより回避 することができる。
本発明の D D S化合物は、 医薬化合物の残基の種類 （例えば、 抗腫瘍剤または 抗炎症剤などの医薬化合物の残基） に応じて、 所望の医薬活性を腫瘍部位や炎症 部位などの局所において特異的に発現させることができ、 かつ、 医薬化合物自体 の有する毒性を低減できるという特徴を有する。 また、 本発明の D D S化合物は 優れた血管透過性を有している。 腫瘍部位や炎症部位ではプロテア一ゼ （ぺプチ ダ一ゼ） が発現されているため、 オリゴペプチドからなるスぺーサ一を有する D D S化合物はスぺーサ一部分で容易に加水分解され、 遊離した医薬化合物が細胞 内に移行して薬効を発揮するか、 または標的細胞の糖を認識するレセプ夕一を介 して D D S化合物が細胞内に取り込まれ、 プロテアーゼにより遊離した薬物が薬 効を発揮する。
また、 カルボキシ C1-4アルキルデキストランポリアルコールは生体内、 例えば 肝臓、脾臓、又は骨髄などで異物高分子として認識される程度が低い。このため、 これらの臓器への移行性が低く、 一方、 糖化合物の種類に応じて対応の糖レセプ 夕一が豊富な臓器には高濃度で分布するという特徴がある。 例えば、 ガラクトー スで修飾されたカルボキシ C1-4アルキルデキストランポリアルコールを有する本 発明の D D S化合物は、 肝臓に対して優れた指向性を有している。 従って、 医薬 化合物として抗腫瘍剤を結合した D D S化合物は、 肝臓癌の治療に有用である。 本発明の D D S化合物を含む医薬は、 通常、 凍結乾燥品などの形態でバイアル 等に充填することができ、 用時溶解型の注射用または点滴用製剤等の非経口投与 用製剤として臨床に提供されるが、 このような医薬の製剤形態は上記態様に限定 されることはない。 上記製剤の製造には、 例えば、 溶解補助剤、 pH調節剤、 安定 化剤など当業界で利用可能な製剤用添加物を用いることができ、 上記製剤は医薬 組成物として調製することができる。 上記医薬の投与量は特に限定されないが、 通常は、 医薬化合物の残基を構成する医薬化合物の投与量、 D D S化合物中に導 入された医薬化合物の残基の量、 患者の状態や疾患の種類などを勘案して決定す べきである。 例えば、 特開平 6- 87746号公報の請求項 2に記載された抗腫瘍剤の 残基が約 6重量％ 程度の割合で導入された D D S化合物を投与する場合には、非 経口投与の場合には、 一般に一日あたり体表面積 1 m2 にっき約 0. 1〜100 mg程 度、 好ましくは約 l〜30 mgの範囲で一回投与し、 3〜4週毎に投与を繰り返すこ とが好ましい。
別の観点からは、 本発明により、 ペプチド結合した 2から 8個のアミノ酸を含 むスぺ一サ一を介して高分子キヤリア一と医薬化合物の残基とが結合した D D S 化合物の測定方法であって、 該 D D S化合物をべプチダ一ゼで処理することによ り得られる加水分解物を測定する工程を含む方法が本発明により提供される。 本明細書において用いられる 「測定」 という用語は、 定量、 定性などを目的と して行われる測定を含めて、 最も広義に解釈する必要があるが、 好ましくは定量 を意味している。 本発明の測定方法の対象となる D D S化合物は、 ペプチド結合 した 2から 8個のアミノ酸を含むスぺーサーを介して高分子キヤリア一と医薬ィ匕 合物の残基とが結合した化合物であり、 いかなる意味においても限定的に解釈し てはならない。 ぺプチド結合した 2から 8個のアミノ酸を含むスぺ一サ一として は、 ペプチド結合した 2から 8個のアミノ酸のみからなるスぺ一ザのほか、 ぺプ チド結合した 2から 8個のアミノ酸からなるオリゴぺプチドに- NH-Y- CO- [式中、 Y は炭素数 1から 8個のアルキレン基又は- C6H4- CH2- 0- (- C6H4-はフエ二レン基を 示し、 該フエ二レン基は 1又は 2個以上の置換基を有していてもよく、 好ましく は p—フエ二レン基である） で表される基を示す] で表される連結基が結合した スぺーサ—などを挙げることができる。 本発明の測定方法は、 例えば、 血液や体 液などの生体試料に含まれる D D S化合物自体の濃度を測定するために用いるこ とができる。 また、 本発明の方法は、 D D S化合物に導入された医薬化合物の残 基の導入量 （例えば、 D D S化合物全重量に対する医薬化合物の残基の重量％な ど） を測定するために用いることができる。
本発明の方法の測定対象である D D S化合物に含まれる医薬化合物の残基の意 味は上記に説明したものと同義であり、 医薬化合物としては、 スぺーサ一との結 合に関与できる 1又は 2以上の反応性官能基 （例えば、 アミノ基、 カルボキシル 基、 水酸基、 チォ一ル基、 エステル基など） を有するものであればいかなるもの を用いてもよい。 医薬化合物の残基は、 スぺーサ一の N末端アミノ基若しくは C 末端カルボキシル基、 又はスぺーサ一を構成するアミノ酸に存在する反応性官能 基に結合していてもよい。
医薬化合物の残基の具体例は、 糖化合物で修飾されたカルボキシ C1-4アルキル デキストランポリアルコールと医薬化合物の残基とがスぺーサーを介して結合し た上記 D D S化合物について説明したとおりであり、 好適に用いることができる 医薬化合物の残基も同様である。
本発明の方法の測定対象である D D S化合物に含まれる医薬化合物の残基の意 味はスぺ一サ一を介して高分子キヤリァ一と結合するが、好ましいスぺーサ一は、 ぺプチド結合した 2から 8個のアミノ酸からなるオリゴぺプチドの残基、 又はべ プチ ド結合した 2 か ら 8個のア ミ ノ酸からなるオ リ ゴぺプチ ドに -NH-Y' -CH2-0-C0- (式中、 Y， は ρ—フエ二レン基を示す） で表される連結基が結 合したスぺーサ一であり、 スぺ一サーを構成するアミノ酸の種類、 スぺーサ一の 結合方向、 アミノ酸配列、 具体例などは、 糖化合物で修飾されたカルボキシ （ 4 アルキルデキストランポリアルコールと医薬化合物の残基とがォリゴぺプチドス ぺーサ一を介して結合した上記 D D S化合物について説明したものと同様である c 本発明の方法の測定対象である D D S化合物を構成する高分子キヤリア一とし ては、 例えば、 多糖誘導体のほか、 合成高分子などを用いることができる。 多糖 誘導体及び合成高分子としては、 生体に対して実質的に毒性を示さず、 薬物担体 として作用できるものであればいかなるものを用いてもよい。 例えば、 D D Sィ匕 合物の製造に従来より用いられている多糖誘導体及び合成高分子はいずれも高分 子キャリア一として利用可能である。 例えば、 カルボキシル基を有する多糖誘導 体を好適に使用でき、 ポリアルコール化多糖誘導体は特に好適に使用できる。 ま た、 合成高分子としては、 例えば、 ポリエチレングリコール類；ポリグルタミン 酸、 ポリアスパラギン酸、 若しくはポリ リジンなどのポリアミノ酸類； または N- ( 2-ヒドロキシプロピル）メ夕クリルアミ ド誘導体などのポリビニル化合物の誘 導体を挙げることができる。
より具体的には、 カルボキシル基を有する多糖誘導体としては、 例えば、 多糖 類又はそれらを化学的若しくは生物学的に修飾した誘導体を用いることができ、 好ましくは分子中にカルボキシル基を有するものを用いることができる。 分子中 にカルボキシル基を有する高分子キャリアーの例としては、 ヒアルロン酸、 ぺク チン酸、アルギン酸、コンドロイチン、へパリンなどの多糖類のほか、 プルラン、 デキストラン、 マンナン、 キチン、 ィヌリン、 レバン、 キシラン、 ァラバン、 マ ンノグルカン、 キトサンなどの多糖の一部又は全部の水酸基に対してカルボキシ ル基を有する官能基を導入したものなどを用いることができる。 例えば、 水酸基 をカルボキシ C1-4アルキル化したものや、 水酸基に多塩基酸の一のカルボキシル 基をエステル結合させたものなどを好適に用いることができる。 また、 上記の多 糖類をポリアルコール化した後に、 カルボキシル基を有する官能基を導入したも のを用いてもよい。
カルボキシ C1-4アルキルデキストランポリアルコールを高分子キヤリァ一とし て用いた D D S化合物は本発明の方法の特に好適な測定対象である。 カルボキシ C1-4アルキルデキストランポリアルコールのポリアルコール化度、 製造に用いる デキストランの種類、及び製造方法などは、糖化合物で修飾されたカルボキシ（ 4 アルキルデキストランポリアルコールと医薬化合物の残基とがスぺ一サ一を介し て結合した上記 D D S化合物について説明したものと同様である。
また、 高分子キヤリア一として糖化合物で修飾された高分子キヤリア一を用い た D D S化合物も本発明の測定方法の好適な対象である。 例えば、 糖化合物で修 飾されたカルボキシ C1-4アルキルデキストランポリアルコールなどを高分子キヤ リァ一として好適に用いることができる。 高分子キヤリァーを糖化合物で修飾す る方法や糖化合物の種類などは、 糖化合物で修飾された上記のカルボキシ -4ァ ルキルデキストランポリアルコールについて説明したものと同様である。
本発明の測定方法の対象は、 いわゆるクラス夕一修飾に適するリンカ一を用い て製造された D D S化合物 （いわゆるクラス夕一修飾体） であってもよい。 クラ ス夕一修飾の概念は、 糖化合物で修飾された上記のカルボキシ C1-4アルキルデキ ストランポリアルコールについて説明したものと同様である。
本発明の方法は、 上記の D D S化合物を測定するにあたり、 D D S化合物にぺ プチダ一ゼを作用させて得られる加水分解物を測定することを特徴としている。 ぺプチダーゼとしては、 D D S化合物のスぺ一サ一に含まれるオリゴぺプチド部 分 （2から 8個のアミノ酸がペプチド結合したオリゴペプチド部分） を加水分解 することができるものであれば、 その種類は特に限定されない。 例えば、 スブチ リシン、 ひ-キモトリプシン、タイプ IVコラゲナ一ゼ、ペプシン、サ一モリシン、 パパイン、 エラス夕一ゼなどを用いることができるが、 これらのうち、 ひ-キモト リブシン又はパパィンが好ましい。
加水分解物の種類は特に限定されないが、 紫外線吸収スペクトル、 蛍光スぺク トルなどの通常の分光学的手法により検出可能であることが望ましい。 通常は、 加水分解物として、 医薬化合物自体のほか、 スぺーサ一の一部が残存して医薬化 合物の残基に結合している化合物、 例えばスぺ一サー由来の 1個のアミノ酸が結 合した医薬化合物、 スぺーサ一由来の 2から 8個のアミノ酸からなるオリゴぺプ チドが結合した医薬化合物、 又は- NH- Y- CO- [式中、 Yは炭素数 1から 8個のアル キレン基又は- C6H4- CH2-0- (- C6H4-はフエ二レン基を示し、 該フエ二レン基は 1又 は 2個以上の置換基を有していてもよく、 好ましくは p—フエ二レン基である） で表される基を示す] で表される連結基を介してスぺ一サ一由来の 1個のアミノ 酸若しくは上記ォリゴぺプチドが結合した医薬化合物などを測定することができ る。 また、 上記の加水分解物においては、 医薬化合物の反応性官能基の一部又は 全部が加水分解を受けていてもよい。 D D S化合物の種類に応じて適宜のぺプチ ダーゼを選択することにより、 所望の加水分解物を測定することが可能になる。 測定のための試料としては、 D D S化合物を投与した動物 （ヒトを含む） から 分離された血液、 リンパ液、 唾液、 尿、 糞、 摘出組織などの生体試料のほか、 D D S化合物の水溶液、 又は実質的に酵素反応を阻害しない水性有機溶媒の溶液な どを用いることができる。 各種のぺプチダーゼについて好適な反応条件が当業界 で知られており、 当業者は、 ぺプチダーゼの種類に応じて適宜の反応条件、 例え ば、 基質濃度、 p H、 緩衝液、 反応温度、 反応時間などを容易に選択することが できる。 通常は、 上記の試料を必要に応じてホモジュネートや脱蛋白質などの前 処理に付した後、 D D S化合物が所望の基質濃度となるように希釈した反応液に ベプチダ一ゼを添加し、 D D S化合物が完全に加水分解されるまで反応を継続す ればよい。
加水分解物を測定する方法は特に限定されないが、 D D S化合物の定量、 又は 医薬化合物の導入量の定量を行う場合には、 加水分解物の性質に応じて、 紫外線 吸収スペクトル測定、 蛍光スペクトル測定など、 通常の分光学的手法を単独で又 は複数組み合わせて用いることが望ましい。 また、 高速液体クロマトグラフィー などの分離操作を適宜組み合わせて測定を行ってもよい。 予め測定系において検 量線を作成することにより、 精度よく定量を行うことが可能になる。 なお、 本明 細書の実施例には、 本発明の方法の代表例が具体的かつ詳細に説明されているの で、 当業者は、 上記の一般的説明及び実施例の具体的説明に基づいて、 必要に応 じてそれらに適宜の改変ないし修飾を加えることにより、 本発明の方法を容易に 実施できる。 実施例
以下、 本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、 本発明の範囲は下記 の実施例に限定されることはない。
例 1
高分子キヤリア一であるカルボキシメチルデキストランポリアルコール （以下 CM-Dex-PA又は CMデキストランポリアルコールなどの略号を用いる場合がある） と抗腫瘍剤 (特開平 6- 87746号公報の請求項 2に記載された（1S，9S )-卜アミノ- 9 - ェチル -5-フルォロ- 2, 3-ジヒドロ- 9-ハイ ドロキシ- 4-メチル - 1H，12H-ベンゾ [de] ピラノ[3，，4，：6, 7]ィンドリジノ [ 1 , 2-b]キノリン- 10, 13( 9H，15H )-ジオン：以下、 実施例において DX- 8951 と略す。） とが、 -Gly-Gly-Phe-Gly- (オリゴペプチドは N 末端側からの配列として示す。 以下、 同様である） からで表されるテトラぺプ チドスべ一サ一を介して結合した D D S化合物（化合物 1 )を、 国際公開 W097/46260号の実施例 15に記載の方法に準じて製造した。 CM- Dex- PAとしては、 平均分子量 228K、 カルボキシメチル化度 （構成糖残基あたりのカルボキシメチル 基の置換度） 0.4のものを用いた。
蒸留水にて 400 ^g/mlに調製した上記 D D S化合物 10〃1を 180 / 1の Britton Robinson 緩衝液 （pH6.0) に添加し、 さらに蒸留水で 10mg/ml に調製した ひ- キモトリプシン溶液を 10 / 1添加した。 反応液を 40°Cで 2時間ィンキュベート した後、 50% のァセトニトリルを含有した 0.5 N HC1 溶液を 200 JUL \ 加え、 遊 離した加水分解物 （スぺ一サ一由来のグリシンが DX-8951のァミノ基にぺプチド 結合した化合物：国際公開 W097/46260 号の実施例 50 に記載の化合物、 以下、 G - DX- 8951と略す) を HPLCにて定量した。 HPLC測定は、 Symmetry C18 (4.6 x 100 誦 ； 3.5 , Watars社） カラムを用い、 有機溶媒 （メタノール：ァセトニトリ ル =1 : 2) を 36. 5%含有する 0. 1M酢酸ナトリウム（pH5.0)にて溶出を行い、 蛍光 スぺクトル測定 （Ex.375 nm及び Em.445 nm) により加水分解物を検出した。 こ の結果、 上記 DDS化合物の DX- 8951 含有量は 5. 7% であった。 一方、 DX- 8951の UV吸収 （366 nm)を指標とし、 分光光度計を用いて上記 DDS化合物の DX-8951含 有量を算出したところ 4.9% であった。
例 2
Η,Ν
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Figure imgf000031_0002
CM-Dex- PAと DX-8951とが- Gly- Gly- Gly- Phe-NH-(C¾)4- CO-で表されるスぺ一サ 一を介して結合した DDS化合物 （化合物 2) を下記のようにして製造した。 5 —ァミノペン夕ノイツクアシッド（1.0 g)と P-トルエンスルホン酸（1.95 g)とべ ンジルアルコール（5ml)をトルエン（50ml)中、 140°Cで Dean- Starkを用いて、 生 成する水を除去しながら 5時間反応させた。 反応液を濃縮し、 得られた残さにェ —テルを加えて固化した。得られた固体を濾過し、エーテルで洗浄して乾燥させ、 5—ァミノペン夕ノィヅクァシヅドベンジルエステルのトシル酸塩を 2.9g得た。
Boc-Gly-Gly-Gly-Phe-OH (575 mg), HOSu ( 182 mg)、 及び DCC (326 mg)を DMF (20 ml)に溶解し、 30分間攪拌した。 この溶液に 5-ァミノペン夕ノイツクアシッドべ ンジルエステルのトシル酸塩 （500 mg)とトリエチルァミン （0.184 ml)を DMF (10ml)に溶かした溶液を加え、 室温で 3日間攪拌した。 反応液を濃縮し、 残査を カラムクロマトグラフィー （CH2Cl2:Me0H=20:l)で精製し、 Boc- Gly- Gly- Gly- Phe - NH- (CH2)4- COOBzlを 380 mg得た （Bzlはベンジル基を示す）。 Boc-Gly-Gly-Gly- Phe-NH- (CH2)4-C00Bzl (380 mg)を 50%含水メタノール （20ml)に溶かし、 5% Pd-C (50% 含水）（300 mg)を加え、 水素常圧下、 1晚撹拌した。 反応液中の触媒を濾去 し、 濃縮乾固し、 Boc- Gly- Gly-Gly- Phe- NH- (C¾)4- C00Hを 330 mg得た。
Boc-Gly-Gly-Gly-Phe-NH-( CH2 )4-C00H (150 mg) と DCC (70 mg) と HOSu (40 mg) を DMFに溶かし、 30分撹拌した。 この溶液に、 DX-8951 (160 mg) とトリエチル ァミン （0.040 ml) を DMFに溶かした溶液を加え、 室温で 1晚撹拌した。 反応液 を濃縮し、 得られた残査をカラムクロマトグラフィー （CH2Cl2:MeOH=20:l) で精 製して、 Boc-Gly-Gly-Gly-Phe-NH-(CH2)4-C0-DX-8951 を 110 m 得た。 Boc-Gly- Gly-Gly-Phe-NH- ( CH2 )4-C0-DX-8951 (110 mg) を TFA (2 ml) に溶かし、 1時間反 応させた後、 反応液を濃縮し、 得られた残査にエーテルを加え固化させた。 上澄 みを除去し、 固体を乾燥し、 H- Gly- Gly- Gly- Phe-NH- (C¾)4- C0-DX- 8951のトリフ ルォロ酢酸塩を lOOmg得た。
Ή-NMR (DMS0-d6):0- 8.45-8.55 (m,2H), 8.28- 8.35(m,2H), 7.95-8.10 (br,2H), 7.79 (d，lH，J=10.7Hz), 7.70-7.75 (m,lH), 7.32 (s，lH), 7.20-7.30 (m,5H)， 7.15-7.25 (m，4H)， 6.50-6.60 (br,lH), 5.50-5.60 (m，lH)， 5.40-5.50 (m，2H), 5.18 (s,2H), 4.50-4.60 (m，lH), 3.55-3.95 (m，7H)， 3.00-3.25 (m，5H), 2.75-2.85 (m,lH)， 2.50 (s，3H), 2.15-2.25 (m,4H), 1.86-2.00 (m,2H), 1.55-1.65(m,2H), 1.45- 1.55(m，2H)， 0.88 (t,3H, J=7.35Hz) 特開平 8-144421号公報の実施例 13に記載の方法に準じて製造した平均分子量 337K、 カルボキシメチル化度（構成糖残基あたりのカルボキシメチル基の置換度） 0.4 の CM-Dex- PA(350mg) を 水 （10ml) に 溶解 し た 。 こ の 溶液 に 、 H-Gly-Gly-Gly-Phe-NH-(CH2)4-C0-DX-8951のトリフルォロ酢酸塩 （50 mg) をメタ ノール （10ml)に溶かした溶液を加え、 さらに、 H0Bt(7mg)をメタノール （5ml) に溶かした溶液を加えた。 反応液の pHを 7.0に調整して水溶性カルボジィミ ド (lOmg)を加え、 14 時間撹拌した。 さらに、 水溶性カルポジイミ ド（10mg)を加え、 2 時間撹拌後に、 水溶性カルボジィミ ド（10mg)を加え、 2時間撹拌した。 反応液 を超純水で希釈し、 限外ろ過膜 （50K)を用いて低分子を除去し、 凍結乾燥し、 得 られた粉体を 3M食塩水に溶かし、エタノールに滴下し、析出した固体を遠心分離 によって分離した。上澄みを除去し、固体を再度水に溶解し、限外濾過膜 （ 50K )で 低分子を除去した後、 0.22 mのフィルターを通して凍結乾燥し、 目的物を 280mg 得た。
蒸留水にて 2.63 mg/ml に調製した上記 D D S化合物の溶液 10 /1 に Britton Robinson 緩衝液 （pH 6) にて 2 mg/ml に調製した ひ-キモトリブシン溶液、 又 は Tris- HC1 (pH 9) にて 2 mg/ml に調製したサブチリシン A溶液を 490〃1添加 した。 この反応液を 40°C で 2時間インキュベートした後、 50% のァセトニトリ ルを含有した 0.5 N HC1 溶液を 500 z l 加え、 遊離した加水分解物 [N¾-(C¾)4- C0-DX- 8951]を HPLCにて定量した。 HPLC測定は、 Sy腿 etry C18 (4.6 xlOO醒 ； 3.5 m, Watars 社） カラムを用い、 有機溶媒 （メタノール：ァセト 二トリル =1 : 2) を 32%含有する 0.1% トリフルォロ酢酸溶液で溶出を行い、 蛍 光スぺクトル測定 （Ex.375 nm 及び Em.445 ran) により加水分解物を検出した。 この結果、 NH2- ( CH2 )4-C0- DX-8951は約 4.8分に溶出された。 NH2- ( CH2 )4-C0-DX-8951 を検量線に用いて上記 D D S化合物中の DX- 8951含有量を算出したところ 3.2%と 算出された。 一方、 DX- 8951 を検量線として上記 DD S化合物の UV吸収から DX - 8951含有量を算出した場合には 2.9%と算出された。 例 3
①サブチリシン A (0.1 M Tris-HCl pH 9.0) ②ひ-キモト リブシン （0.1 M Tris-HCl pH 8.0)、 ③サ一モリシン（0.1 M Tris-HCl/1 mM CaCl2 pH 9.0)を用い て、 例 1で製造した DD S化合物 （化合物 1) の DX-8951含有量を測定した。 各 酵素用の緩衝液 180〃 1に 400〃g/mlに調製した化合物 1を 10〃1添加した（最 終濃度： 20〃g/ml)。 この混合物に各緩衝液で 100mg/mlに調製した各酵素を 10 〃1添加した後 （最終濃度： 5mg/ml)、 40°Cで 3時間反応させた。 反応後、 50%ァ セトニトリルを含有する 0.5 N HC1 溶液を 200 /1 添加し、 その 10 1 を HPLC で分析した。 SymmetryC18 (4.6x250 mm) カラムを用い、 有機溶媒 （ァセトニト リル：メタノール =2:1) を 31% 含有する 0.1 M AcONa緩衝液 pH 5.0 で溶出し た。 蛍光スぺクトル測定 （Ex.375 nm及び Em. 445 nm) により加水分解物を測定 し、 G-DX-8951、 DX- 8951、 及び化合物 1のスぺ一サー由来のフエ二ルァラニン- グリシンが結合した DX- 8951 (FG-DX- 8951)をそれそれ 2 nmol/ml 含有する溶液 を用いて作成した検量線により酵素反応溶液中の加水分解物を定量した。 この結 果、サブチリシン Aとひ-キモトリブシンは上記条件によりそれそれ化合物 1から G-DX-8951を 100%遊離した。また、サーモリシンは FG-DX- 8951を 100°遊離した。 例 4
腹腔内にて継代維持した Meth A細胞 （lxlO6 cells/mouse) を BALB/c(c >)マ ウスに腹腔内移植し、 5 日後に化合物 1 (DX- 8951含有量： 5.25 を 10及び 2.5 mg/kg (DX-8951 換算量） で腹腔内投与した。 投与後、 経時的 （2、 4、 8、 24、 及 び 48 時間） に心採血し、 10 分放置した後、 12，000 rpmで 10分間遠心分離して 血清を得た。さらに、 その時の癌性腹水を採取した。血清及び癌性腹水 25 j lに 80% メタノール水を 100 j l 添加した後、 12,000 rpmで 5分間遠心分離し、 そ の上清の 25 jul に 0.1 M Tris-HCl pH 8.5/0.1 M CaCl2 を用いて 2 mg/ml に 調製したサーモリシン溶液を 225 1添加し、 50°C で 1時間反応した。その後、 50% ァセトニトリル含有 0.5 N HC1 を 250 μ.1添加し、 その 20 μ.\ を HPLC分 析した。 カラムとして Symmetry C18 (4.6x100腿） を用い、 メタノールとァセ トニトリルの混液 （1： 2) を 41%含む 0.1 M AcONa (pH 5) 溶液にて溶出し、 蛍 光スぺクトル測定 （Ex.375 nm、 Em.445 nm) により加水分解物を検出した。 その 結果、 10 mg/kg投与では、 腹水中の化合物 1の濃度は時間の経過とともに減少し たが、 血中濃度は投与後次第に上昇して 24 時間で最大値となり、 その後、 腹水 濃度とほぼ同程度に推移した （図 1 )。 2.5 mg/kg投与時の腹水及び血中濃度の推 移は 10 mg/k の場合と同様であった。 例 5
腹腔内にて継代維持した Meth A細胞 （l x lO6 cel ls/mouse ) を BALB/c ( ）マ ウスに腹腔内移植し、 5 日後に化合物 1 (DX-8951含有量： 6.6%) を 10及び 2.5 mg/kg (DX- 8951換算量）で静脈内投与した （ 1群 3匹）。 投与後、 経時的 （5分、 30分、 2、 4、 8、 24、 及び 48時間）に心採血し、 10分放置した後、 12, 000 rpm、 10分間遠心分離して血清を得た。 さらに、 その時の癌性腹水を採取した。 血清及 び癌性腹水 25〃1 に Britton Robinson Buffer (pH 6) を用いて mg/ml に調 製したひ-キモトリブシン溶液を 225 / 1添加し、 40°C で 2時間反応した。 その 後、 50% ァセトニトリル含有 0.5 N HC1 を 250 〃1 添加し、 12， 000 rpm、 5 分 間遠心分離し、 その上清の 10 〃1 を HPLC 分析した。 HPLC 分析で得られた G - DX-8951濃度、 及び用いた化合物 1の DX- 8951含有量から推定される化合物 1 の濃度を算出した。 HPLC分析は例 4の条件に従って行った。 この結果、 10 mg/kg 投与時には、 血中の化合物 1濃度は時間の経過とともに減少した。 腹水での化合 物 1の濃度は投与後次第に上昇し、 48時間で血中濃度とほぼ同程度になった （図 2 )o 2.5 mg/kg投与時における化合物 1の腹水中及び血中の濃度推移は、 10 mg/kg の場合と同様であった。 例 6
糖化合物で修飾された高分子キヤリア一を有する D D S化合物を以下のように して製造した。 下記のスキームにおいて、 糖鎖の構成単位としてカルボキシメチ ル基が導入された 1個又は 2個の構成単位を例示的に記載したが、 実施例に記載 した D D S化合物のカルボキシメチルデキストランポリアルコール部分は、 上記 構成単位の繰り返しによって構成されるものではないことを理解すべきである。 また、カルボキシメチルデキストランポリアルコールのカルボキシメチル化度（構 成糖残基あたりのカルボキシメチル基の置換度） は、 カルボキシメチルデキス卜 ランポリアルコールのナトリゥム塩を遊離酸型に変換した後、 0.1N水酸化ナトリ ゥム水溶液に溶解して 0.1N 塩酸で滴定することにより求めた。 カルボキシメチ ルデキス トランポリアルコールのナト リウム塩の水溶液を Bio-Rad AG50W-X 2(H+) カラムに付して通過液を凍結乾燥して試料として用いた。 この試料を所定 過剰量の 0.1N 水酸化ナトリウム水溶液に溶解し、 フエノールフタレンを指示薬 として 0.1N 塩酸で滴定した。 試料の採取量を s(mg)、 0. 1N 水酸化ナトリウム 水溶液の所定過剰量を a(ml )、 0.1N 塩酸の滴定量を b(ml )とし、 カルボキシメ チル化度を 13.4(a-b)/[s- 5.8(a- b) ]の式により求めた。また、薬物の導入量（重 量％) は、 薬物の特性吸収を利用した吸光度分析 （362皿付近） から求めた。 さ らに、 ゲル濾過法は次の条件に従って行った （カラム ： TSK gel G4000 PWXい 溶 離液： 0.1M NaC 流速： 0.8 ml/minヽ カラム温度： 40。C)。
(A)化合物 2 _ 2の合成
Figure imgf000036_0001
化合物 2— 1 (5.0 g)と 2- [2- (2-クロ口エトキシ）エトキシ]エタノール（3.75 ml )をジクロロメタン（75 ml )に溶かし、 3フッ化ホウ素ェ一テル錯体 (7.7 g)を加 え、 5時間撹拌した。 反応液をジクロロメタン（100 ml )で希釈し、 有機層を水、 飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、 食塩水で洗い、 硫酸マグネシウムで乾燥し、 硫 酸マグネシウムを濾去した後、 溶媒を留去し、 得られた残渣をシリカゲルを用い るカラムクロマトグラフィ一（へキサン：酢酸ェチル 2 : 1 )で精製し、 クロル体を 3.3g得た。 得られたクロル体（3.3 g)と NaN3(2.0 g)を DMF( 15 ml )中で 60°Cで 2 日間撹拌した。 溶媒を留去し、 酢酸ェチルと水の混合液に溶かし、 有機層を水洗 し、 硫酸マグネシウムで乾燥し、 硫酸マグネシウムを濾去し、 溶媒を留去し、 ァ ジド体を 2.8g得た。
得られたアジド体（1.5 g)をメタノール（30 ml )に溶かし、 溶液の pHが 10にな るまで、 28% MeONa含有メ夕ノール溶液を加え、 1時間撹拌した。 反応液に Dowex 50WX8(H+)を溶液の液性が中性になるまで加え、 樹脂を濾去し、 溶媒を留去した。 得られた残渣をメタノール（50 ml)と水（10 ml)の混合液に溶かし、 5%Pd- C(50%含 水）（2.0 g)を加え、 水素常圧下 1晚撹拌した。 触媒を濾去し、 溶媒を留去し、 化 合物 2— 2を 1.2 g得た。
Ή-NMR (DMS0-d6): 54.20-4.30 (lH，br)， 4.00-4.10 (lH,br)， 3.80-3.85 (lH，br)， 3.50-3.75 (14H,m)， 2.75-2.90 (2H，m)
(B)ガラクトース修飾 CMデキストランポリアルコールの合成
Figure imgf000037_0001
Figure imgf000037_0002
デキストラン 4(フナコシ社製、 平均分子量 4000-6000)(20 g)の 0.1M酢酸緩衝 液 (pH5.5)(2000 ml)に、 過ョゥ素酸ナトリウム（66.0 g)の水溶液 (2000 ml)を加え た。 遮光して 4 °Cで 10日間撹拌後、 エチレングリコール（14.0 ml)を加え、 一晩 撹拌した。 反応液を氷冷下で 8M水酸化ナトリゥム水溶液を用いて pHを 7.5に調 整した後、 水素化ホウ素ナトリウム（28 g)を加えた。 溶解後、 室温で一晩撹拌し た。氷冷して、 酢酸で PH5.5に調整し、 4 °Cで 1時間撹拌した。氷冷下で 8M水酸 化ナトリゥム水溶液を用いて pHを 7.5に調整した。以上の行程を 2回行い、得ら れた 2つの水溶液を 1つにまとめ、バイオマックス- 3膜（ミリポア社製）を用いた 限外濾過法による低分子画分の除去を行ない残留溶液を得た。 この残留溶液をバ ィォマックス- 30膜を通過させた。通過した溶液をバイォマックス - 3膜を用いた 限外濾過法により脱塩した後、 凍結乾燥して精製デキストランポリアルコール ( 12.0 g)を得た。 この物質の分子量（ゲル濾過、 プルラン標準）は、 9Kであった。 水酸化ナトリウム（39. 3 g)を水 (282 ml )に溶かして得られる水溶液に上記の精 製デキストランポリアルコール（9.4 g)を加え、 室温で溶解させた。 この溶液に氷 冷下でモノクロル酢酸（56.4 g)を加えて溶解させた後室温で 20時間反応させた。 この反応液を酢酸で pHを 8に調整した後、 バイオマックス- 5膜を用いた限外濾 過法による低分子画分の除去を行なった。残留溶液を凍結乾燥して、カルボキシメ チル （以下、 CMと略す） デキストランポリアルコールのナトリウム塩（12 g)を得 た。 得られた CMデキストランポリアルコールのナトリウム塩 (4.0 g)を、 水酸化 ナトリウム（17 g)を水（120 ml )に溶かして得られる水溶液に加え、 室温で溶解さ せた。 この溶液に氷冷下でモノクロル酢酸（ 24 g )を加えて溶解させた後室温で 20 時間反応させた。
この反応液を酢酸で pHを 8に調整した後、 バイオマックス- 5膜を用いた限外 濾過法による低分子画分の除去を行なった。 残留溶液を凍結乾燥して、 CM デキス トランポリアルコールのナトリウム塩 (4.0 g)を得た。 この物質の分子量（ゲル濾 過、 プルラン標準）は、 14Kであり、 糖残基あたりの CM化度はアルカリ滴定から 0.7であった。 得られた CMデキストランポリアルコールのナトリウム塩（1.0 g) を水（100 ml )に溶解し、 実施例 1の化合物 2— 2 ( 800 mg)のメタノール（100 ml ) 溶液を加えた。 さらに、 水溶性カルボジィミ ド塩酸塩 (240 mg)を 2時間おきに 3 回添加し、 計 6時間撹拌した。 反応液中の溶媒を留去し、 得られた油状物を水に 溶解し、バイオマックス- 3を用いた限外濾過法により脱塩した。得られた水溶液 を凍結乾燥し、 標記化合物を 1. 1 g得た。 本化合物中のガラクトース含有量をフ ェノール-硫酸法により定量した結果、 糖 10残基当たり、 1.0の割合であった。
(C)ガラクト一ス修飾 CMデキストランポリアルコール- Gly- Gly- Phe- Gly- DX- 8951 の合成
Figure imgf000039_0001
上記 (B)で得られたガラクト一ス修飾 CMデキストランポリアルコ—ルのナトリ ゥム塩（1.0 g)を水（30 ml )に溶かし、 Gly-Gly-Phe-Gly-DX-8951 のトリフルォロ 酢酸塩 （150 mg)と 卜ヒドロキシベンゾトリアゾ一ル（35 mg)のメタノール溶液 (40 ml )を加えた。 溶液の pHを 7.0 とし、 水溶性カルボジィミ ド塩酸塩（35 mg) を 2時間ごとに、 3回加えた後、 1晚撹拌した。 反応液中の溶媒を留去し、 得ら れた残渣を 3M塩化ナトリゥム水溶液 (20 ml )に溶かし、 エタノール（100 ml )に滴 下し、 析出した沈殿を遠心分離（3500 rpm, 8 分）により集めた。 この沈殿を水に 溶かし、 バイオマックス- 3膜を用いた限外濾過法により脱塩した。膜を透過しな い残留溶液をミリポアフィルター（0.22〃m)で濾過した後、凍結乾燥して標記化合 物を 900m 得た。 本化合物を 0. 1M塩化ナトリウム水溶液に溶解後、 GPC (カラム： 東ソ一 TSK Gel PW-4000XL, 溶媒： O. lMNaCl 水溶液、 流速： 0.8ml/min)で分析した 結果、 及び本化合物の紫外線吸収スペクトル (pH9.0、 0.1M トリス緩衝液中）をそ れそれ図 3及び図 4に示す。 本化合物中の DX - 8951含有量を 30%ァセトニトリル を含む 0.1 M トリス緩衝液 （pH 10.0) 中での 366 nmにおける吸光度に基づいて 定量したところ、 4.9% (W/W)であった,
(D)CMデキス -ル- Gly- Gly-Phe-Gly- DX- 8951の合成
Figure imgf000040_0001
上記 (B)で得られた CMデキストランポリアルコールのナトリゥム塩 (2. Og)を水 に溶解し、 Dowex- 50WX8(Et3NH+)を通し、 CMデキストランポリアルコ一ルのトリエ チルアンモニゥム塩（1.9 g)を得た。 得られた CMデキストランポリアルコールの トリエチルアンモニゥム塩（1.9 g)を 50%N，N-ジメチルホルムアミ ドを含む水溶液 に溶解し、 この溶液に、 トリェチルァミン（0.1121111)と 6^-6 -?]16-6^-0 -8951 のトリフルォロ酢酸塩 （350mg)を含む Ν,Ν-ジメチルホルムアミ ド（10ml)溶液、 卜ェトキシカルボニル- 2-ェトキシ- 1,2-ジヒドロキシキノリン（1.9 g)を順次加 え、 室温で一晩撹拌しながら反応させた。 反応液中の溶媒を留去し、 得られた残 渣を 3M塩化ナトリウム水溶液（20 ml)に溶かし、 エタノール（100 ml)に滴下し、 析出した沈殿を遠心分離（3500 rpm)により集めた。 この沈殿を水に溶かし、 バイ ォマックス- 3膜を用いた限外濾過法により脱塩した。膜を透過しない残留溶液を ミリポアフィルター（0.22 m)で濾過した後、 凍結乾燥して標記化合物を 1.4g 得た。本化合物を 0.1M塩化ナトリウム水溶液に溶解後、 GPC (カラム：東ソー TSK Ge 1 PW-4000XL, 溶媒： O.lMNaCl 水溶液、 流速： 0.8ml/min)で分析した結果、 及び本化 合物の紫外線吸収スペクトル（pH9.0、 0.1M トリス緩衝液中）をそれそれ図 6及び 図 9に示す。 本化合物中の DX-8951含量を 30%ァセトニトリルを含む 0.1 M トリ ス緩衝液 （pH 10.0) 中での 366 nmにおける吸光度に基づいて定量したところ、 5.2¾ (W/W)であった。
(E)DDS化合物の測定
上記 (C)で得られたガラクトース修飾 DD S化合物および対照として上記 (D)の DD S化合物を注射用蒸留水にて溶解し、 DX- 8951 に換算した濃度が 0.5 mg/ml となるように調製した。これらの DDS化合物水溶液を C57BL/6マウスに一群 5 匹として尾静脈内に投与した。 投与量は DX- 8951 換算で 5 mg/kg とした。 投与 後、 経時的 （0.5， 1, 2, 4および 24 時間） に肝臓を採取し、 これらの DD S化 合物量を求めた。 得られた肝臓の重量に対し水を 5倍量添加し、 ホモジナイズし た。 その溶液を 3000 rpm、 10分間遠心分離し、 さらに、 上清を 15,000 rpm、 15 分間遠心分離した。 得られた上清の 50〃1に、 pH6の Br ton-Robinson Buffer (B.R.B)により 2 mg/mlに調製した ひ-キモトリブシン溶液 450 μ.1を添加し、 40 °C で 2時間反応した。 その後、 50%ァセトニトリル含有 0.5NHC1溶液を 500 μ.\ 添加し、 12， 000 rpm、 5 分間遠心分離し、 その上清の 20 〃1 を HPLC 分析 し、 遊離した G-DX8951 を定量することで DD S化合物量を求めた。 この時、 投 与に用いた各 DD S化合物水溶液を、 蒸留水により 50、 10、 2 g/mlに調製し、 それそれ 50 1 を上述の方法により酵素処理して G- DX8951を定量したものを検 量線とした。
HPLC 分析条件
カラム： Symmetry C18 (4.6 100mm)
流速： 1.0 ml/min
カラム温度： 40°C
検出波長 （蛍光）： Ex.375 nm、 Em.445 nm
溶出液：メタノール：ァセトニトリル = 1 ： 2 (29%) 0.1¾ TFA (71%) 結果を図 5に示す。 上記のガラクトース修飾 DD S化合物は、 対象の DD S化合 物 （上記 (D)) に比べて高い肝臓集積性を示した。 例 7 ：ガラクト一ス修飾 CMデキストランポリアルコール- Gly-Gly-Phe-Gly- DX-8951の合成
デキストラン T500(フアルマシア社製、 分子量 500K) ( 50 g)の 0. 1M酢酸緩衝液 (pH5.5 ) ( 5000 ml )に、 過ヨウ素酸ナトリウム（165.0 g)の水溶液（5000 ml )を加え た。 遮光して 4 °Cで 10日間撹拌した後、 エチレングリコール（35. 0 ml )を加え、 一晩撹拌した。 反応液を氷冷下で 8M水酸化ナトリゥム水溶液を用いて pHを 6.5 に調整した後、 水素化ホウ素ナトリゥム（70 g)を水 (2000 ml )に懸濁させた液を加 えた。 溶解後、 室温で一晩撹拌した。 氷冷して、 酢酸で PH5.5に調整し、 4 °Cで 1時間撹拌した。 氷冷下で 8M水酸化ナトリゥム水溶液を用いて pHを 7.5に調整 した。 得られた水溶液をバイオマックス- 50 膜を用いた限外濾過法による低分子 画分の除去を行ない残留溶液を得た。 この残留溶液を限外濾過膜 ( 1000K、 フィル トロン社製）を通過させた。通過した溶液をバイオマックス- 50膜を用いた限外濾 過法により脱塩した後、 凍結乾燥してデキストランポリアルコール（21. 1 g)を得 た。 この物質の分子量（ゲル濾過、 プルラン標準）は、 128Kであった。
水酸化ナトリゥム（13.84 g)を水（150 ml )に溶かして得られる水溶液に上記で得 たデキストランポリアルコール（5 g)を加え、 室温で溶解させた。 この溶液に氷冷 下でモノクロル酢酸のナトリゥム塩 (61.6 g)を加えて溶解させた後室温で一晩反 応させた。 この反応液の pHを 8.5に調整した後、 バイオマックス- 50膜を用いた 限外濾過法による低分子画分の除去を行なった。 高分子画分を凍結乾燥して、 CM デキストランポリアルコールのナトリウム塩（6.2 g)を得た。 この物質の分子量 (ゲル濾過、 プルラン標準）は、 428Kであり、 糖残基あたりの CM化度はアルカリ 滴定から 0. 9であった。得られた CMデキストランポリアルコ―ルのナトリウム塩 (500 mg)を水（50 ml )に溶解し、実施例 1の化合物 2— 2 (400 mg)のメタノール（20 ml )溶液と卜ヒドロキシベンゾトリアゾール（160 mg)のメタノール（20 ml )溶液を 加えた。 さらに、 水溶性カルポジイミ ド塩酸塩（120 mg)を 2時間おきに 3回添加 し、計 6時間撹拌した。反応液中の溶媒を留去し、得られた油状物を水に溶解し、 バイオマックス- 50膜を用いた限外濾過法による低分子画分の除去を行なった。 残留溶液を凍結乾燥し、 目的物を 600 mg得た。本化合物中のガラクト一ス含量を フエノ一ル-硫酸法により定量した結果、糖 10残基当たり、 1.7の割合であった。 得られたガラクト一ス修飾 CM デキストランポリアルコールのナトリゥム塩 (200 mg)を水（3 ml)に溶かし、 Gly-Gly-Phe-Gly-DX-8951 のトリフルォロ酢酸塩 (27 mg)のメタノール溶液（3 ml)と卜ヒドロキシベンゾトリアゾ一ル（7mg)のメタ ノール溶液 (3ml)を加えた。 溶液の pHを 7.0とし、 水溶性カルボジィミ ド塩酸塩 (7mg)を 2時間ごとに、 3回加えた後、 1晚撹拌した。反応液中の溶媒を留去し、 得られた残渣を 3M塩化ナトリゥム水溶液（10 ml)に溶かし、 エタノール（100 ml) に滴下し、 析出した沈殿を遠心分離（3500 rpm)により集めた。 この沈殿を水に溶 かし、 バイオマックス- 50 膜を用いた限外濾過法により脱塩した。 膜を透過しな い残留溶液をミリポアフィルター（0.22 m)で濾過した後、 凍結乾燥して標記化 合物を 180 mg得た。 本化合物を 0.1M塩化ナトリゥム水溶液に溶解後、 GPC (カラ ム：東ソー TSK Gel PW-4000XL, 溶媒： O.lMNaCl 水溶液、 流速： 0.8 ml/min)で分析 した結果、 及び本化合物の紫外線吸収スペクトル (pH9.0、 0.1M トリス緩衝液中） をそれそれ図 7及び図 10に示す。本化合物中の DX- 8951含量を 30%ァセトニトリ ルを含む 0.1 M トリス緩衝液 （pH 10.0) 中での 366 nmにおける吸光度に基づい て定量したところ、 3.7% (W/W)であった。 例 8 ： 2- [2- (2-アミノエトキシ）エトキシ]ェチル - 5-D- 2-ァミノ- 2-デォキシガ ラクトースの合成
特開平 5-202085号公報に記載の方法により合成した 2- [2-(2-アジドエトキシ） ェトキシ]ェチル - D- 2-ァセチルァミノ- 2-デォキシ- 3，4，6-トリァセチルガラ クト一ス （2.64 g)をメタノール（10 ml)に溶解した溶液を氷冷した。 この溶液に ナトリウムメ トキシドの 28 メタノール溶液（0.64 ml)を加え、 そのまま氷冷下で 5時間撹拌した。 反応液に酢酸（0.186 ml)を加えた後、 減圧乾固した。 残渣をシ リカゲルカラムクロマトグラフィ一（溶出液：ジクロロメタン：メタノール =9:1溶 液） で精製して 2- [2-(2-アジドエトキシ）エトキシ]ェチル D- 2-ァミノ- 2 -デ ォキシガラクト一ス （1.98 g)を得た。
Ή -腿 (CD30D)5: 4.44 (d， 1H, J=8.8Hz)， 3.94-3.98 (m，lH)， 3.92 (dd, 1H， J二 8·8, 10·7Ηζ)， 3.83 (d，lH，J=2.9Hz), 3.62-3.79 (m,llH)， 3.58 (dd， 1H， J=3,4, 10·7Ηζ)， 3.49 (dd，lH，J二 5.9, 6.3Hz), 3.39 (t,2H，J=4.9Hz), 1,99 (s，3H). 上記の 2- [2-(2-アジドエトキシ）エトキシ]ェチル - ?-D- 2-ァミノ- 2-デォキシ ガラクト一ス （640 mg)をェ夕ノ一ル（10 ml)に溶解した溶液にリンドラ一触媒 (430 mg)を加え、常圧水素下 1.5時間接触還元した。さらに、 リンドラ一触媒 (215 mg)を加え、 常圧水素下 3·5時間接触還元した。触媒を濾去した後、 濾液を減圧乾 固して 2- [2- (2-アミノエトキシ）エトキシ]ェチル - 3-D- 2-ァミノ- 2-デォキシガ ラクト一ス （601 mg)を得た。
Ή -腿 (CD30D)(5: 4.32 (d， 1H， J=7.5Hz)， 3.80-3.91 (m，2H), 3.30-3.75 (m，14H)， 2,73 (t，2H，J=6.5Hz), 1.98 (s，3H). 例 9 ： N-ァセチルガラクトサミン修飾 CMデキストランポリアルコール- Gly-Gly - Phe-Gly-DX-8951の合成
Figure imgf000044_0002
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例 7で得られた CM デキストランポリアルコールのナトリウム塩（375 mg)を水 (10ml)に溶解し、 例 8で得られた 2- [2- (2-アミノエトキシ）エトキシ]ェチル - ? -D-2-ァミノ- 2-デォキシガラクトース （300 mg)をメタノール（10 ml) に溶解し た溶液と卜ヒドロキシベンゾトリアゾール（120 mg)をメタノール（10 ml) に溶解 した溶液を加えた。 溶液の pHを 7.0にした後、 水溶性カルポジイミ ド塩酸塩 (90 mg)を 2時間おきに 3回添加した。一晩撹拌した後、反応液からバイオマックス - 50 膜を用いた限外濾過法により低分子画分を除去した。 膜を通過しない残留溶液を 凍結乾燥し、 N-ァセチルガラクトサミン修飾 CMデキストランポリアルコール (443 mg)を得た。 本化合物の N-ァセチルガラクトサミン含量をエルソン—モルガン法 で定量した結果、 糖 10残基あたり 1.6の割合であった。
得られた N-ァセチルガラクトサミン修飾 CMデキストランポリアルコール （200 mg)を水 （10 ml)に溶解し、 Gly-Gly- Phe- Gly- DX- 8951のトリフ口才口酢酸塩 (30 mg)をメタノール（10ml)に溶解した溶液、 1—ヒドロキシベンゾトリアゾール（30 mg)をメタノール（10 ml) に溶解した溶液を加えた。 溶液の pHを 7.0にした後、 水溶性カルポジイミ ド塩酸塩（10mg)を 2時間おきに 3回添加した。 2時間撹拌し た後、 pHを 8.5にした。 反応液からバイオマックス- 50膜を用いた限外濾過法に より低分子画分を除去した。膜を通過しない残留溶液をミリポアフィル夕一（0.22 /m)で濾過した後、 凍結乾燥し、 標記化合物 (203 mg)を得た。 本化合物を 0.1M塩 化ナトリゥム水溶液に溶解後、 GPC (カラム ：東ソ一 TSKGelPW- 6000XL、 溶媒： 20%ァセトニトリル含有 0.1M酢酸緩衝液 (ρΗ5·0)、 流速： 0.8ml/min) で分析した 結果、 及び本化合物の紫外線吸収スぺク トル（0.1M トリス緩衝液 (pH 10.0)：ァセ トニトリル = 7:3中， 0.16 mg/ ml)をそれそれ図 8および図 11に示す。 本化合物 の医薬化合物の残基の含量を 0.1 M トリス緩衝液 （pH 10.0)：ァセトニトリル = 7:3 中での 366 nmにおける吸光度に基づいて定量したところ 4.6% (W/W)であつ た。 例 10： CM-Dex-PA-Gly-Gly-Phe-Gly-NH-Y' -CH2-0-C0-DX-8951中の DX-8951含有量 の測定
蒸留水にて l mg/mlに調製した CM- Dex- PA- Gly-Gly- Phe- Gly-NH- Y， - CH2- 0-C0 - DX-8951 (ΥΊま p—フエ二レン基を示す） の溶液 5〃1に Britton Robinson緩衝液
(pH 6 ) にて 2 mg/ml に調製したパパイン溶液を 95 1添加した。 この反応液を 40°Cで 4時間ィンキュベ一トした後、 50%のァセトニトリルを含有した 0.5 N HC1 溶液を 100〃1加え、 遊離した加水分解物 [DX- 8951]を HPLCにて定量した。 HPLC 測定は、 Symmetry C18 (4.6 x 100 画； 3.5〃m， Waters 社）カラムを用い、 有機溶 媒 （メタノール：ァセトニトリル = 1 ： 2 ) が 12分間に 20%から 70%となる 0. 1% トリフルォロ酢酸溶液で溶出を行い、 蛍光スぺク トル測定 （Ex.375nm および Em.445nm) により加水分解物を検出した。 この結果、 DX-8951は約 5.7分に溶出 された。 DX- 8951を検量線に用いて上記 DDS化合物中の DX-8951含有量を算出し たところ、 4.0%と算出された。 一方、 DX-8951 を検量線として上記 DDS化合物の UV吸収から DX- 8951含有量を算出した場合には 3.3%と算出された。 例 11 : CM-Dex-PA- Gly-Gly- Gly-Phe-NH-Y， -CH2-0- CO-DX- 8951中の DX-8951含有量 の測定
蒸留水にて l mg/mlに調製した CM- Dex- PA- Gly- Gly- Gly- Phe- NH- Y， - CH2- 0- C0- DX-8951の溶液 5 1に Britton Robinson緩衝液 （pH 6 ) にて 1 mg/mlに調製し たひ-キモトリブシン溶液を 95 1添加した。 この反応液を 40°Cで 4時間ィンキ ュペートした後、 50%のァセトニトリルを含有した 0.5 N HC1溶液を 100 / 1加え、 遊離した加水分解物 [DX- 8951]を HPLCにて定量した。 HPLC測定は、 Symmetry C18 (4.6 x 100 翻； 3.5〃m， Waters社）カラムを用い、 有機溶媒 （メタノール：ァセト 二トリル = 1 ： 2 ) 力 s 12分間に 20%から 70%となる 0. 1%トリフルォロ酢酸溶液で 溶出を行い、 蛍光スぺクトル測定（Ex.375nmおよび Em.445nm) により加水分解物 を検出した。 この結果、 DX- 8951は約 5.7分に溶出された。 DX- 8951を検量線に用 いて上記 DDS化合物中の DX-8951含有量を算出したところ、 2.5%と算出された。 一方、 DX- 8951を検量線として上記 DDS化合物の UV吸収から DX-8951含有量を算 出した場合には 1.7 と算出された。
例 12 ： CM-Dex-PA-Gly-Gly-Phe-Gly-NH-(C¾ )4-C0-DX-8951中の DX- 8951含有量の 測定
蒸留水にて 100〃g/mlに調製した CM- Dex- PA- Gly- Gly- Phe-Gly-NlHCHJrCO- DX-SgSlの溶液 5〃1に Britton Robinson緩衝液 （pH 6 ) にて 2 mg/mlに調製し たパパイン溶液を 95〃1添加した。この反応液を 40°Cで 4時間ィンキュペートし た後、 50%のァセトニトリルを含有した 0.5 N HC1溶液を 100〃1加え、 遊離した 加水分解物 [NH2-(CH2 )4- CO- DX-8951 ]を HPLCにて定量した。 HPLC測定は、 Symmetry C18 (4.6x100 腿; 3.5〃m, Waters 社）カラムを用い、 有機溶媒 （メタノール：ァ セトニトリル = 1 : 2 )を 32%含有する 0. 1%トリフルォロ酢酸溶液で溶出を行い、 蛍光スペクトル測定 （Ex.375nmおよび Em.445nm) により加水分解物を検出した。 この結果、 DX- 8951は約 5.3分に溶出された。 N¾- (C¾)4- C0-DX- 8951を検量線に 用いて上記 DDS化合物中の DX- 8951含有量を算出したところ、 3. 0%と算出された。 一方、 DX-8951を検量線として上記 DDS化合物の UV吸収から DX- 8951含有量を算 出した場合には 3.1%と算出された。 例 13 ： CM - Dex-PA- Gly-Gly-Phe- Gly-DXR (DXR:ドキソルビシン） 中の DXR含有量 の測定
蒸留水にて 1 mg/mlに調製した DDS化合物の溶液 10 / 1に Britton Robinson緩 衝液 （pH 6 ) にて 2 mg/mlに調製したパパイン溶液を 190〃1添加した。 この反応 液を 40°Cで 2時間インキュベートした後、 ァセトニトリルを 200〃1加え、 遊離 した加水分解物 [DXR]を HPLCにて定量した。 HPLC測定は、 Symmetry RP 18 (4.6 x 100 醒; 3. 5〃m, Waters社）カラムを用い、 有機溶媒 （メタノール：ァセトニトリ ル = 1 ： 2 ) を 34%含有する 0. 1%トリフルォロ酢酸溶液で溶出を行い、 蛍光スぺ クトル測定（Ex.480nmおよび Em. 590nm)により加水分解物を検出した。この結果、 DXRは約 3.8分に溶出された。 DXRを検量線に用いて上記 DDS化合物中の DXR含 有量を算出したところ、 5.3%と算出された。 一方、 DXR を検量線として上記 DDS 化合物の UV吸収から DXR含有量を算出した場合には 4.3%と算出された。 例 14： CMデキストランポリアルコール- Gly- Gly-Phe-Gly-DXRの合成
W097/46260の実施例 24に記載の方法に準じて製造した平均分子量 274K、 力ル ボキシメチル化度 （構成糖残基あたりのカルボキシメチル基の置換度） 0.4 の力 ルポキシメチルデキストランポリアルコールのナトリゥム塩（30 mg)を 50%メタノ ールを含有する 0.05 M コリジン- HC1 緩衝液（2 ml )に溶解させた。 この溶液に W097/46260の実施例 43に記載の方法に準じて合成した Gly- Gly-Phe- Gly-DXRの 塩酸塩 (4 mg)を含むメタノール溶液 (400〃1 )、 1-ェチル -3- (3-ジメチルアミノブ 口ピル）カルポジイミ ド塩酸塩 (2.4 mg)を含むメタノール溶液（240 1 )を加え、 2 時間撹拌した。 これに 3 M食塩水 30 mlを加え、 バイオマックス- 50K膜を用いた 限外濾過法により脱塩した。膜を通過しない残留溶液をミリポアフィルター (0.22 /m)で濾過した後、 凍結乾燥して表記化合物 (25 mg)を得た。本化合物の医薬化合 物の残基の含量は、 PBS(pH7.4)中での 480 nmにおける吸光度に基づいて定量した ところ、 4.3 W/W)であった。 例 15： CM-Dex-PA-Gly-Gly-Phe-Gly-NH-(CH2)4-C0-DX-8951の合成
Boc-Gly- Gly-Phe- Gly-0H(575mg)、 HOSu ( 182mg)と DCC (326mg)を DMF (20ml ) に溶解し、 30分間攪拌した。 ここに、 5-ァミノペン夕ノイツクアシッドベンジル エステルのトシル酸塩（500 mg)とトリエチルァミン（0.184 ml )を DMF ( 10 ml )に 溶かした溶液を加え、 室温で 3日間攪拌した。 反応液を濃縮し、 残査をカラムク 口マトグラフィ（CH2Cl2 :MeOH=20 : l )で精製し、 Boc- Gly- Gly- Phe- Gly- NH- (CH2)4- COOBzlを 560 mg得た。 Boc- Gly- Gly- Phe- Gly-NH- (CH2)4- COOBzl ( 560 mg)を 50¾ 含水メタノール (60 ml )に溶かし、 5%Pd- C(50%含水）（1.5 g)を加え、 水素常圧下、 1晚撹拌した。反応液中の触媒を濾去し、 濃縮乾固し、 Boc-Gly- Gly- Phe- Gly- NH- (CH2)4- C00Hを 300 m 得た。 Boc-Gly-Gly-Phe-Gly-NH-(CH2)4-C00H (300 mg)と DCC (138 mg)と HOSu (77 mg) を DMF に溶かし、 30 分撹拌した。 ここに、 DX-8951(317mg)とトリエチルァミン ( 0.078ml )を DMFに溶かした溶液を加え、 室温で 1晚撹拌した。 反応液を濃縮し、 得られた残査をカラムクロマトグラフィ一（C¾Cl2:MeOH二 10:1)で精製して、 Boc-Gly-Gly-Phe-Gly-NH-(CH2)4-C0-DX-8951を 400 m 得た。
Boc-G ly-Gly-Phe-Gly-NH- ( C¾ )4-C0-DX-8951 ( 300m ) ¾ TFA(2ml)に溶かし、 1時 間反応させた後、 反応液を濃縮した。 得られた残査にエーテルを加え固化させ、 上澄みを除去し、 固体を乾燥して H-Gly- Gly-Phe- Gly- NH- (C¾)4-C0- DX- 8951のト リフルォロ酢酸塩を 250mg得た。
Ή-NMR (DMS0-d6):d 8.45-8.55 (m,2H), 8.28-8.35(m,2H), 7.95-8.10 (br,2H), 7.79 (d,lH,J=10.7Hz), 7.70-7.75 (m,lH)， 7.32 (s，lH), 7.20-7.30 (m,5H), 7.15-7.25 (m,4H), 6.50-6.60 (br,lH)， 5.50-5.60 (m，lH), 5.40-5.50 (m，2H), 5.18 (s，2H)， 4.50-4.60 (m，lH)， 3.55-3.95 (m，7H), 3.00-3.25 (m，5H)， 2.75-2.85 (m，lH), 2.50 (s,3H), 2.15-2.25 (m,4H)， 1.86-2.00 (m,2H), 1.55-1.65(m，2H), 1.45-1.55(m,2H), 0.88 (t,3H, J=7.35Hz)
W097/46260の実施例 24に記載の方法に準じて製造した平均分子量 337K、 カル ボキシメチル化度 （構成糖残基あたりのカルボキシメチル基の置換度） 0.4 の力 ルボキシメチルデキストランポリアルコールのトリエチルアンモニゥム塩（200 mg)を DMF(lOml)に溶かした。 ここに、 H-Gly-Gly-Phe-Gly-NH-(CH2)4-C0-DX-8951 のトリフルォロ酢酸塩（30mg)、 トリエチルァミン（10 /1)を含むメタノール（4ml) 溶液を加え、 さらに、 1-エトキシカルボニル- 2-エトキシ -1，2-ジヒドロキシキノ リン（200 mg)を含むメタノール（3ml)溶液を加え、遮光下、室温で 1晚撹袢した。 反応液を 3M食塩水で希釈し、 限外濾過膜 (50K)で低分子を除去し、 0.22〃111のフ ィル夕一を通し、 凍結乾燥して目的物を 178 mg得た。 産業上の利用可能性
糖化合物で修飾したカルボキシ c1-4アルキルデキストランポリアルコールを高 分子キヤリア一として用いた本発明の D D S化合物は、極めて臓器指向性が高く、 優れた治療効果を発揮できる医薬として有用である。 また、 本発明の D D S化合 物の測定方法は、 D D S化合物の血中濃度や D D S化合物に導入された医薬化合 物の残基の含有量を正確かつ簡便に定量することができるので、 D D S化合物の 臨床への適用に際して極めて有用な方法として利用できる。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . 糖化合物で修飾されたカルボキシ c1-4アルキルデキストランポリアルコール と該カルボキシ C1-4アルキルデキストランポリアルコールに結合した医薬化合物 の残基とを含む D D S化合物。
2 . 糖化合物で修飾されたカルボキシ C1-4アルキルデキストランポリアルコール と医薬化合物の残基とがスぺ一サーを介して結合した請求の範囲第 1項に記載の D D S化合物。
3 . スぺ一サ一が 1個のアミノ酸又はペプチド結合した 2から 8個のアミノ酸で ある請求の範囲第 2項に記載の D D S化合物。
4 . 糖化合物で修飾されたカルボキシ C1-4アルキルデキストランポリアルコール が、 糖化合物とカルボキシ C1-4アルキルデキストランポリアルコールとがリンカ —を介して結合したものである請求の範囲第 1項ないし第 3項のいずれか 1項に 記載の D D S化合物。
5 . 糖化合物で修飾されたカルボキシ C1-4アルキルデキストランポリアルコール がリンカーを介して糖化合物によりクラス夕一修飾されたものである請求の範囲 第 4項に記載の D D S化合物。
6 . カルボキシ（ 4アルキル部分の一部のカルボキシル基が糖化合物で修飾され たカルボキシ（ 4アルキルデキストランポリアルコールに対して医薬化合物の残 基を結合させることにより製造することができる D D S化合物。
7 . 該カルボキシ CMアルキルデキストランポリアルコールと医薬化合物の残基 とをスぺーサ一を介して結合させることにより製造することができる請求の範囲 第 6項に記載の D D S化合物。
8 . カルボキシ C1-4アルキルデキストランポリアルコールのカルボキシ C1 -4アル キル部分の一部のカルボキシル基に糖化合物又は糖化合物に結合したリンカーを 結合させることにより製造された該カルボキシ C1 -4アルキルデキストランポリァ ルコ一ルに対して医薬化合物の残基を結合させることにより製造することができ る請求の範囲第 6項又は第 7項に記載の D D S化合物。
9 . カルボキシ C1-4アルキル部分の一部のカルボキシル基に医薬化合物の残基が スぺ—サ—を介して結合したカルボキシ C1-4アルキルデキストランポリアルコー ルを糖化合物で修飾することにより製造することができる D D S化合物。
1 0 . 該カルボキシ Cwアルキルデキストランポリアルコールと糖化合物とをリ ンカーを介して結合させることにより製造することができる請求の範囲第 9項に 記載の D D S化合物。
1 1 . カルボキシ C1-4アルキルデキストランポリアルコールのカルボキシ C1-4ァ ルキル部分の一部のカルボキシル基に 1個のアミノ酸からなるスぺーサ一又はべ プチド結合した 2から 8個のアミノ酸からなるスぺ一サ一を介して医薬化合物の 残基を結合させることにより製造された該カルボキシ C1-4アルキルデキストラン ポリアルコールを糖化合物で修飾することにより製造することができる請求の範 囲第 9項又は第 10項に記載の D D S化合物。
1 2 . 糖化合物がガラクトース若しくはガラクトサミン又はそれらの誘導体であ る請求の範囲第 1項ないし第 11項のいずれか 1項に記載の D D S化合物。
1 3 . 糖化合物が N—ァセチルガラクトサミンである請求の範囲第 1項ないし第 12項のいずれか 1項に記載の D D S化合物。
1 4 . ガラクト一ス若しくはガラクトサミン又はそれらの誘導体、 あるいはクラ ス夕一化されたガラクトース若しくはガラクトサミン又はそれらの誘導体の置換 度がカルボキシ C1-4アルキルデキストランポリアルコールの糖残基あたり 0.01~ 1.0である請求の範囲第 12項に記載の D D S化合物。
1 5 . カルボキシ C1-4アルキルデキストランポリアルコールを構成するデキスト ランポリアルコールが、 実質的に完全にポリアルコール化可能な条件下でデキス トランを処理して得られたデキストランポリアルコールである請求の範囲第 1項 ないし第 14項のいずれか 1項に記載の D D S化合物。
1 6 . カルボキシ C1-4アルキルデキストランポリアルコールがカルボキシメチル デキストランポリアルコールである請求の範囲第 1項ないし第 15 項のいずれか 1項に記載の DDS化合物。
17. 医薬化合物が抗腫瘍剤又は抗炎症剤である請求の範囲第 1項ないし第 16 項のいずれか 1項に記載の DD S化合物。
18. 医薬化合物が抗腫瘍剤である請求の範囲第 17項に記載の DDS化合物。
19. 医薬化合物が（1S,9S)-:1-ァミノ- 9-ェチル -5-フルォロ- 2, 3-ジヒドロ- 9 -ノ、 ィ ドロキシ- 4-メチル - 1H，12H-ベンゾ [de]ピラノ [3，，4，：6，7]ィ ン ドリジノ [l，2-b]キノリン- 10,13(9H，15H)-ジオンである請求の範囲第 1項ないし第 18項 のいずれか 1項に記載の D D S化合物。
20. 肝臓癌治療剤である請求の範囲第 19項に記載の DD S化合物。
2 1.請求の範囲第 1項ないし第 20項のいずれか 1項に記載の DD S化合物の製 造に使用するための糖化合物で修飾されたカルボキシ C1-4アルキルデキストラン ポリアルコール。
22. 糖化合物で修飾されたカルボキシ （ 4アルキルデキストランポリアルコ一 ル。
23. 糖化合物で修飾されたカルボキシ C1-4アルキルデキストランポリアルコー ルからなる高分子キヤリア一。
24. ベプチド結合した 2から 8個のアミノ酸を含むスぺ一サ一を介して高分子 キャリアーと医薬化合物の残基とが結合した D D S化合物の測定方法であって、 該 D D S化合物をぺプチダ一ゼで処理することにより得られる加水分解物を測定 する工程を含む方法。
25.生体試料中に含まれる該 DD S化合物の濃度測定に用いる請求の範囲第 24 項に記載の方法。
26. 該 DD S化合物に導入された医薬化合物の残基の含有量を測定するために 用いる請求の範囲第 24項に記載の方法。
27. 該加水分解物が医薬化合物である請求の範囲第 24項ないし第 26項のいず れか 1項に記載の方法。
28. 該加水分解物が医薬化合物の残基にスぺーサ一の一部が結合した化合物で ある請求の範囲第 24項ないし第 26項のいずれか 1項に記載の方法。
2 9 . スぺーサ一の一部がスぺーサ一由来の 1個のアミノ酸である請求の範囲第 28項に記載の方法。
3 0 . 該高分子キャリア一がカルボキシル基を有する多糖誘導体である請求の範 囲第 24項ないし第 29項のいずれか 1項に記載の方法。
3 1 . 該高分子キヤリァ一がカルボキシ C1-4アルキルデキストランポリアルコ一 ルである請求の範囲第 30項に記載の方法。 -
3 2 . 該 D D S化合物中に導入された医薬化合物が抗腫瘍剤又は抗炎症剤である 請求の範囲第 24項ないし第 31項のいずれか 1項に記載の方法。
3 3 .スぺーサ一が N末端側から- Gly-Gly- Phe-Gly-で表されるテトラべプチド又 は N末端側から- Gly- Gly- Gly- Phe-で表されるテトラべプチドである請求の範囲 第 24項ないし第 32項のいずれか 1項に記載の方法。
3 4 . スぺ一サ一が N末端側から- Gly- Gly-Phe-Gly- NH- Y，- CH2-0-C0-で表される 基又は N末端側から- Gly- Gly-Gly- Phe-NH- Y，-CH2- 0-CO-で表される基 （式中、 Y， は ρ—フヱニレン基を示す） である請求の範囲第 24項ないし第 32項のいずれか 1項に記載の方法。
3 5 . ぺプチダ一ゼがひ—キモトリブシン又はパパインである請求の範囲第 24 項ないし第 34項のいずれか 1項に記載の方法。
3 6 . 医薬化合物が （1S，9S)-卜ァミノ- 9 -ェチル - 5-フルォロ- 2，3-ジヒドロ- 9- ハイ ドロキシ- 4-メチル -1H, 12H-ベンゾ [de]ビラノ [3，，4，：6，7]ィンドリジノ [1, 2-b]キノリン- 10，13( 9H, 15H)-ジオンである請求の範囲第 24項ないし第 35項 のいずれか 1項に記載の方法。
3 7 . N末端側から- Gly- Gly-Phe-Gly-で表されるテトラべプチド又は N末端側か ら -Gly-G ly- Gly- Phe-で表されるテトラペプチド含むスぺ一サ一を介してカルボ キシ C1-4アルキルデキストランポリアルコールと（1S，9S)- 1-ァミノ- 9-ェチル -5- フルォロ -2, 3-ジヒ ドロ- 9-ハイ ドロキシ- 4-メチル - 1H, 12H-ベンゾ [de]ビラノ [3，，4，：6,7]ィンドリジノ [1，2- b]キノリン- 10, 13(9H, 15H)-ジオンとが結合した DD S化合物の測定に用いる請求の範囲第 24項ないし第 29項のいずれか 1項に 記載の方法。
38. ベプチダ一ゼとしてひ一キモトリブシン又はパパインを用い、 加水分解物 として （1S，9S)- 9-ェチル - 5-フルォロ- 1-グリシルアミノ- 2，3-ジヒドロ- 9-ハイ ドロキシ- 4 -メチル- 1H, 12H-ベンゾ [de]ビラノ [3，，4，：6，7]インドリジノ [1,2-b] キノリン -10，13(9H,15H)-ジオンを測定する請求の範囲第 37項に記載の方法。
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