WO2000024416A1 - Agents therapeutiques pour deformations osseuses - Google Patents

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WO2000024416A1
WO2000024416A1 PCT/JP1999/005963 JP9905963W WO0024416A1 WO 2000024416 A1 WO2000024416 A1 WO 2000024416A1 JP 9905963 W JP9905963 W JP 9905963W WO 0024416 A1 WO0024416 A1 WO 0024416A1
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WO
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0cif
ocif
polysaccharide
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human
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PCT/JP1999/005963
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Shinichi Mochizuki
Nobuaki Fujise
Chiharu Masuyama
Eisuke Tsuda
Kanji Higashio
Original Assignee
Snow Brand Milk Products Co., Ltd.
Sankyo Co., Ltd.
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Definitions

  • the present invention relates to a novel therapeutic agent for bone metabolism disorders having high activity and high sustainability.
  • the therapeutic agent for bone metabolism disorders of the present invention has excellent therapeutic activity against bone metabolism disorders such as osteoporosis, hypercalcemia, and rheumatoid arthritis, and is useful as a medicine.
  • Bone not only supports the body but also functions as the largest storage organ of calcium in the body, and 99% of the calcium in the body is accumulated in bone. Moreover, bone is constantly subject to the opposing effects of bone resorption and bone formation, and plays an important role in maintaining serum calcium homeostasis. Activation of osteoclasts, which play an important role in bone resorption, causes excess calcium to escape from the bones into the blood, disrupting the homeostasis of blood calcium and causing hypercalcemia. It is known. Hypercalcemia is a disease caused by bone metastasis of cancer, etc., and the number of patients is expected to increase. At present, calcitonin and its derivatives, or bisphosphonate compounds are used as such therapeutic agents for hypercalcemia. However, these therapeutic effects are not satisfactory, and the development of new drugs to replace them is desired.
  • Osteoclastogenesis Inhibitory Factor (W096 / 26217), which is known as a protein factor that suppresses osteoclast differentiation, has been reported to have a serum calcium lowering effect.
  • OCIF Osteoclastogenesis Inhibitory Factor
  • OCIF can be expected as a completely new therapeutic agent for hypercalcemia, but 0CIF is a protein and is rapidly metabolized in vivo. Therefore, development of a more stable and potent OC IP formulation has been desired.
  • an object of the present invention is to provide a therapeutic agent for bone metabolism disorder which further enhances the effect of 0CIF on bone metabolism disorder and maintains the effect thereof.
  • a therapeutic agent for bone metabolism disorders comprising one or more substances selected from the group consisting of an analog or a mutant thereof and a polysaccharide or a derivative thereof.
  • heparin is preferred as the polysaccharide
  • dextran sulfate is preferred as the polysaccharide derivative.
  • a therapeutic agent having excellent activity and sustainability for bone metabolic disorders such as osteoporosis, hypercalcemia, and rheumatoid arthritis is provided and can be useful as a medicine.
  • the present invention also relates to a method for increasing the activity of an osteoclast formation inhibitory factor by using a polysaccharide or a derivative thereof.
  • the OC IF used in the present invention is, for example, a natural type or a recombinant type obtained by the method described in W096 / 26217, and its origin is not particularly limited, but a human type is particularly preferable. belongs to.
  • a natural or recombinant 0CIF includes a monomer type having a molecular weight of about 60 kDa or a dimer type having a molecular weight of about 120 kDa in SDS-PAGE under non-reducing conditions.
  • analogs or mutants of 0CIF may be used.
  • a 0CIF analog cDNA obtained by the hybridization method using an OCIF cDNA fragment as a probe was prepared from a cDNA library prepared using poly (A) + RNA of IMR-90 cells (ATCC CCL-186). Introduce the expression vector and use the vector And those obtained by incorporation into a host, expression in the host, and purification by a conventional method. More specifically, it includes 0CIF2, 0CIF3, 0CIF4, or 0C1F5 described in W096 / 26217.
  • 0CIF2 has a deletion of 21 bp from the 265th guanine to the 285th guanine in the nucleotide sequence of OCIF cDNA, and in the amino acid sequence, the amino acid of OCIF is There is a deletion of 7 amino acids from glutamic acid (Glu) at position 68 to glutamine (Gin) at position 74 in the sequence.
  • Glu glutamic acid
  • Gin glutamine
  • the ninth cytidine in the OCIF cDNA nucleotide sequence has been converted to guanine, and in the amino acid sequence, the nineteenth asparagine (Asn) in the amino acid sequence of 0C1F has been changed to lysine (Lys).
  • this is an amino acid substitution in the signal sequence and does not appear to affect secreted 0CIF3.
  • the 9th cytidine in the OCIF cDNA nucleotide sequence has been converted to guanine, and in the amino acid sequence, the 19th asparagine (Asn) in the 19th amino acid sequence of 0CIF has been changed to lysine (Lys).
  • the 22nd guanine has been converted to thymidine, and in the amino acid sequence, the 14th alanine (Ala) of the amino acid sequence of 0CIF has been changed to serine (Ser).
  • 0CIF5 is a protein in which cytidine at position 9 in the OCIF cDNA nucleotide sequence has been converted to guanine.
  • amino acid sequence asparagine (Asn) at position 19 in the amino acid sequence of OCIF has been changed to lysine (Lys).
  • this is an amino acid substitution in the signal sequence and does not appear to affect secreted 0C I F5.
  • there is an insertion of the latter half of intron 2 of about 1.8 kb between the 400th and 401st positions of the base sequence of OCI FcDNA, and the open reeling frame is stopped therein.
  • a novel amino acid sequence consisting of 12 amino acids is added after the 112th alanine (Ala) in the amino acid sequence of 0C IF.
  • Variants include those in which one or more amino acids have been inserted, added, substituted, or deleted from the amino acid sequence of OCIF. More specifically, a 0C IF mutant cDNA is prepared by inserting a substitution or deletion mutation into the OCI FcDNA by PCR or cleavage with a restriction enzyme, and this cDNA is inserted into an expression vector. Can be incorporated into a commonly used host, expressed in the host, and purified by a conventional method.
  • the polysaccharide used in the present invention is a polymer in which a monosaccharide is formed by a glycosidic bond (Dalkan), and is preferably a heteropolysaccharide (heteroglycan) in which the constituent monosaccharides are composed of two or more kinds.
  • natural polysaccharides such as hyaluronic acid, chondroitin sulfate, dermatan sulfate, heparan sulfate, keratan sulfate, carrageenan, pectin or heparin
  • synthetic polysaccharides such as dextran
  • dextran sulfate is used as the synthetic polysaccharide derivative.
  • glucan in which sulfate is esterified is used.
  • heparin having a molecular weight of 3,000 to 6,000 or dextran sulfate is used. Having a molecular weight of 5,000 to 10,000 is used.
  • the therapeutic agent for bone metabolism disorder of the present invention may comprise one or more substances selected from the group consisting of 0C IF, an analog thereof, or a mutant thereof, and a polysaccharide or a derivative thereof. It is preferable to combine 1 to 100 times, particularly 1 to 16 times, the amount of 0C IF, its analog, or its mutant.
  • the preparation of the present invention which combines one or more substances selected from the group consisting of IF, its analogs, and its variants with a polysaccharide or a derivative thereof, has a longer sustainability and a therapeutic effect as compared to administration of 0C IF alone.
  • As an excellent therapeutic agent for bone metabolism disorders it is effective against bone metabolism disorders such as osteoporosis, hypercalcemia, and rheumatoid arthritis.
  • the preparation of the present invention is safely orally or parenterally administered to humans or animals as a medicament.
  • Parenteral administration includes, for example, intravenous injection, intramuscular injection, subcutaneous injection, nasal administration, buccal administration, transmucosal administration and the like.
  • Pharmaceutical preparations to be administered by these administration routes are administered as pharmaceutical compositions together with pharmacologically acceptable carriers, excipients, lubricants, coloring agents, etc., according to known pharmaceutical manufacturing methods. You.
  • a pH adjuster, a buffer, a stabilizer, a solubilizing agent, and the like are added as necessary, and an injection is prepared by a conventional method.
  • Known additives such as human serum albumin surfactant may be used in combination.
  • the surfactant include polyadiones and anionic surfactants.
  • An injection can be prepared by dispensing into a vial to make a solution, or as a lyophilized preparation by dissolving it in distilled water or physiological saline at the time of use.
  • 0C IF was administered intravenously to normal rats once daily for 2 weeks at a dose of 3 or 24 mg / kgday, bone mineral density and bone mass increased, but histopathology in 38 tissues was confirmed. No abnormalities or fluctuations in blood cell count were observed (H. Yasuda et al .: Endocrinology, Vol. 139, PP1329-1337 (1998)).
  • the action of OCIF is highly specific to bone and is expected to be safely administered to humans.
  • the dosage and method of administration of the therapeutic agent for bone metabolism disorder of the present invention to a patient are not particularly limited because they vary depending on conditions such as the degree of the symptom, the age, health condition, and weight of the patient.
  • Parenteral administration of about 0.01 to lmg / kg per day may be administered once or several times a day.
  • the activity of the preparation of the present invention can be measured by measuring the concentration of serum calcium.
  • the sugar can be added to the rat by intravenous administration, blood is collected over time, and the serum calcium concentration is measured by a conventional method.
  • the present invention also relates to a method for increasing the activity of an osteoclast formation inhibitor using a polysaccharide or a derivative thereof. According to the present invention, it is possible to increase the blood concentration of 0CIF and enhance the effect of lowering the serum calcium concentration of 0CIF.
  • FIG. 1 shows the serum calcium concentration of the preparation obtained by adding a polysaccharide to 0CIF in Example 2 three hours after administration.
  • D-1 0 CIF 0.5 mg / kg + dextran sulfate (molecular weight 5,000) 2 mg / kg
  • D-2 0 CIF 0.5 mg / kg + dextran sulfate (molecular weight 8,000) 2 mg / kg
  • D-3 0 CIF 0.5 mg / kg + dextran Sulfuric acid (Molecular weight 10,000) 2mg / kg H-1: 0CIF 0.5mg / kg + Heparin (207.8 units / mg) 2mg / kg
  • H-2 OCIF 0.5mg / kg + heparin (171.2 units / mg) 2mg / kg
  • H-3 OCIF 0.5mg / kg + heparin (Molecular weight 3,000) 2mg / kg
  • H-4 OCIF 0.5mg / kg + heparin (MW 6,000) 2mg / kg
  • FIG. 2 shows the serum potassium concentration 3 hours after the administration when the mixing ratio of 0CIF and the polysaccharide was changed in Example 3.
  • FIG. 3 shows the respective serum calcium concentrations at 3, 6 and 9 hours after administration when a preparation obtained by adding a polysaccharide to 0CIF in Example 4 was administered.
  • FIG. 4 shows the time-dependent change in blood 0CIF concentration when a preparation obtained by adding a polysaccharide to OCIF in Example 5 was administered.
  • A Diagram showing blood concentration of dimer type 0 CIF.
  • FIG. 5 shows the time-dependent change in the ratio of monomeric / dimer-type OCIF in blood when a preparation obtained by adding a polysaccharide to OCIF in Example 5 is administered.
  • FIG. 6 shows the 0CIF concentration in blood 2 and 4 hours after administration of a preparation obtained by adding a polysaccharide (dextran sulfate, lingopectin or cuticle pectin) to OCIF in Example 6. .
  • FIG. 7 shows the blood 0CIF concentration of the preparation obtained by adding a polysaccharide (dextran sulfate, lingopectin or carrageenan) to 0CIF in Example 6 at 2 and 4 hours after administration.
  • a polysaccharide dexaenoic acid
  • FIG. 8 shows the blood 0CIF concentration after intravenous administration of a preparation obtained by adding a polysaccharide (dextran sulfate or lingopectin) to 0CIF in Example 7.
  • FIG. 9 shows the blood 0CIF concentration after intramuscular administration of the preparation of Example 7 in which a polysaccharide (dextran sulfate or lingopectin) was added to 0CIF.
  • a polysaccharide disulfate or lingopectin
  • FIG. 10 shows the serum calcium concentration of the preparation obtained by adding a polysaccharide (lingopectin) to 0CIF in Example 8 four hours after administration.
  • Human 0CIF 500 / g and dextran sulfate 2 mg obtained according to the method described in W096 / 26217 were dissolved in 5 ml of lOmM sodium phosphate buffer (pH 7.0) containing 0.15 M NaCl and 0.01% Tween 80. This solution was sterilized with a sterile filter (Millex GV, Millipore) of 0.22 ⁇ m, and filled into a vial to obtain an injection for intravenous injection.
  • a sterile filter Millex GV, Millipore
  • Human 0CIF (dimer type 1) (recombinant 0CIF obtained by the method described in W096 / 26217) was converted into lOmM sodium phosphate buffer (pH 7.0) containing 0.15M NaCl and 0.01% Tween 80.
  • Dextran sulfate (molecular weight 8000 or 10,000: Sigma, and molecular weight 5000 or 50000: Wako Pure Chemical Industries) in 2 ml of a human OCIF 0.25 mg / ml solution prepared by dissolving After dissolving 2 mg of heparin (207.8 or 171.2 units / mg: Wako Pure Chemical Industries, Ltd., and molecular weight 3000 or 6000: Sigma), the mixture was allowed to stand at 4 ° C for 24 hours a day. At the same time, the human 0CIF 0.25 and 2.5 mg / ml solutions and the solvent were left overnight at 4 ° C.
  • test sample solutions were administered with 0C1F and dextran sulfate administration group (Group D), 0C1F and heparin administration group (Group H) (Groups D and H were administered 0.5 mg / kg as 0C IF amount), A 0 CIF single administration group (0.5 mg / kg and 5 mg / kg administration as 0 CIF amount) and a solvent administration group were prepared.
  • a single intravenous dose of 2 ml / kg was administered to a 4-week-old female Wistar rat. Three hours after administration, orbital blood was collected to prepare serum, and the calcium concentration in the obtained serum was measured using a calcium C test (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). It was measured.
  • Fig. 1 shows the results.
  • Dextran sulfate (molecular weight: 5000; Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 1, 2, 4, 8, 16 times the weight of 0 CIF human was dissolved in 2 ml of human OCIF 0.25 mg / ml solution prepared in the same manner as in Example 2. After that, it was left overnight at 4 ° C. Similarly, heparin (207.8 units / mg: Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was dissolved in 2 ml of a human OCIF 0.25 mg / ml solution at the same ratio, and left overnight at 4 ° C.
  • the dextran sulfate or heparin solution adjusted to 4 mg / ml, the human 0CIF solution adjusted to 0.25 and 2.5 mg / ml, and the solvent alone were similarly left to stand at 4 overnight.
  • These test sample solutions were intravenously administered once at a dose of 2 ml / kg to a 4-week-old female Wistar rat, and orbital blood was collected 3 hours after administration to prepare serum.
  • the calcium concentration in the obtained serum was measured using a calcium C test (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).
  • This kit has the specificity enhanced by the addition of 8-quinolinol to the chelate method (ortho-cresol-lfurein complexone (0CPC) method), excluding the effect of magnesium, and is used under alkaline conditions. It combines with CPC to give a purple-red color, and by measuring its absorbance, the calcium concentration can be measured.
  • CPC ortho-cresol-lfurein complexone
  • 20 mg of dextran sulfate (molecular weight: 5000; Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was dissolved in 2 ml of a human 0CIF 2.5 mg / ml solution prepared with a solvent, and the mixture was allowed to stand at 4 ° C for 24 hours.
  • 20 mg of heparin (207.8 units / mg: Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was also dissolved in 2 ml of a 2.5C / ml solution of human 0CIF, and similarly left overnight at 4 ° C.
  • the human 0CIF solution and the solvent adjusted to 2.5 mg / ml were also left overnight at 4 ° C.
  • the obtained test sample solution was intravenously administered once at a dose of 2 ml / kg (5 mg / kg as 0 CIF amount) to a 4-week-old female Wistar-type rat, and the orbit was injected 3, 6, and 9 hours after administration. Blood was collected and serum was prepared. The calcium concentration in the obtained serum was measured using a calcium C test (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). The results are shown in FIG. As a result, in the 5 mg / kg human 0 CIF solution alone administration group, a significant decrease in serum calcium concentration was observed 3 hours after administration, but no serum calcium concentration-lowering effect was observed at 6 and 9 hours after administration. Was.
  • the concentration of human 0CIF in the obtained serum was determined using a monoclonal antibody recognizing dimer type 0 CIF, a monoclonal antibody recognizing monomer type 0 CIF (BIOCHEMICAL AND Using BIOPYSICAL RESEARCH CO, UNICATIONS, Vol.245, pp382-387 (1998)), it was measured by the ELISA method described in W096 / 26217.
  • the total 0CIF concentration was determined as the sum of the dimer-type 0CIF concentration and the monomer-type 0CIF concentration. The results are shown in FIGS. 4 and 5.
  • the human 0CIF solution administered with 4 times the amount of dextran sulfate compared to the human 0CIF alone maintained a clearly higher blood 0CIF concentration than the 500 zg / kg human 0CIF solution alone administered group.
  • Fig. 4 it was confirmed that the conversion of dimer type 0 CIF to monomer type 0 CIF was suppressed in blood (Fig. 5). Therefore, by adding a polysaccharide, it is possible to obtain a dimer type 1 OCIFCBIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH CO ⁇ UN I CAT IONS, Vol. 245, p. Blood levels are sustained.
  • test sample solutions were intravenously administered once to a 4-week-old male Wistar rat at a dose of 2 ml / kg, and two or four hours after administration, blood was collected from the orbit under ether anesthesia to prepare serum.
  • concentration of human 0CIF in the serum thus obtained was measured using the ELISA method described in W096 / 26217. The results are shown in FIG.
  • dextran sulfate was added to the 0CIF solution for intravenous administration or intramuscular administration to a concentration of 0.1%, respectively.
  • apple pectin is dissolved in a solvent to prepare a 3 mg / ml solution, and twice the amount of 0 CIF solution for intravenous or intramuscular administration (containing 100 g / ml and 2000 g / ml OCIF, respectively) was mixed in equal amounts.
  • Each solution was administered once to a 4-week-old male Wistar rat at a dose of lml / kg.
  • intravenous administration was 2, 5, 10, 15, 30, 45, 60, 120, 240, and 360 minutes later, and intramuscular administration was 30 minutes, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 8, After 10 and 24 hours, orbital blood was collected under ether anesthesia to prepare serum.
  • the human 0CIF concentration of the obtained serum was determined by ELISA described in W096 / 26217. It was measured using the method. The results are shown in FIGS. 8 and 9.
  • a mixture of an equal amount of a solvent with a 0C IF solution (2 ml of a 0.25 mg / ml solution of human OCIF) and only the solvent were prepared.
  • a therapeutic agent for bone metabolism disorders comprising one or more substances selected from an osteoclast formation inhibitor, an analog thereof, or a mutant thereof, and a polysaccharide or a derivative thereof.
  • osteoporosis, hypercalcemia, rheumatoid arthritis The present invention provides a therapeutic agent for bone metabolic disorders having an excellent therapeutic effect on bone metabolic diseases such as H and maintaining its activity for a long time, and is useful as a medicine.

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Description

明 細 書
骨代謝異常症治療剤 技術分野
本発明は、 活性及びその持続性が高い新規な骨代謝異常症治療剤に関する。 本 発明の骨代謝異常症治療剤は、 骨粗鬆症、 高カルシウム血症、 慢性関節リウマチ 等の骨代謝異常症に対して優れた治療活性を有し、 医薬として有用である。
背景技術
骨は身体の支持能力だけでなく、 生体内カルシウムの最大の貯蔵臓器として機 能しており、 生体に存在するカルシウムの 99%は骨に蓄積されている。 しかも、 骨は絶えず骨吸収と骨形成という相反する作用を常に受けており、 血清カルシゥ ムの恒常性を保つ上で重要な役割を担っている。 骨吸収において重要な役割を担 つている破骨細胞が活性化されると、 骨から過剰なカルシウムが血液中に流出し、 血液中の力ルシゥムの恒常性が崩壊し、 高カルシゥム血症をきたすことが知られ ている。 高カルシウム血症は癌の骨転移等により発症する疾患で、 患者数の増加 が予想され、 その治療剤の開発が急がれている。 現在、 このような高カルシウム 血症治療剤として、 カルシトニン及びその誘導体、 あるいはビスホスホネー ト系 化合物が使用されている。 しかし、 これらの治療効果は満足できるものではなく、 これらに代わる新規薬剤の開発が望まれている。
一方、 破骨細胞の分化を抑制する蛋白性因子として知られている破骨細胞形成 抑制因子（Osteoclastogenesis Inhibitory Factor; OCIF) (W096/26217号公報） が、 血清カルシウム低下作用を有することが報告されている （BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS, Vol.245, pp382-387(1998)； Endocrinol ogy, Vol.139, pp4012- 4015(1998)) 。 OCIFは、 全く新しい高カルシウム血症治療 剤として期待できるが、 0CIFは蛋白質であるため生体内で速やかに代謝される。 そこで、 より安定で作用の強い OC I Pの製剤の開発が望まれていた。
発明の開示
本発明者らは、 上述の状況に鑑み鋭意研究の結果、 0CIFに多糖類を加えて製剤 化することにより、 0CIFの有する骨代謝異常症に対する効果をさらに増強できる ことを見出した。 従って本発明の課題は、 骨代謝異常症に対する 0CIFの効果をさ らに増強し、 その効果を持続せしめた骨代謝異常症治療剤を提供することにある 本発明は、 破骨細胞形成抑制因子 (Osteoclastogenesis Inhibitory Factor; OCIF) 、 その類縁体、 またはその変異体からなる群から選択される一以上の物質 と多糖類またはその誘導体とからなる骨代謝異常症治療剤に関する。
本発明において前記多糖類としてへパリン、 また前記多糖類誘導体としてデキ ストラン硫酸が好ましい。
本発明により、 骨粗鬆症、 高カルシウム血症、 慢性関節リウマチ等の骨代謝異 常症に対して優れた活性とその持続性とを有する治療剤が提供され、 医薬として 有用でめる。
また、 本発明は多糖類またはその誘導体を用いることにより破骨細胞形成抑制 因子の活性を高める方法に関する。
本発明で用いる OC I Fは、 例えば W096/26217号公報に記載された方法により得ら れる天然型あるいは遺伝子組み換え型のものであり、 その由来は特に限定されな いが、 特に好ましくはヒ ト型のものである。 このような天然型あるいは遺伝子組 み換え型 0CIFとしては、 非還元条件下 SDS-PAGEにおける分子量が約 60kDa のモノ マ一型、 あるいは分子量が約 120kDaのダイマ一型のものがある。
また、 本発明では 0CIFの類縁体あるいは変異体を用いても良い。 類縁体として は、 IMR- 90細胞 （ATCC CCL-186) のポリ （A)+ RNA を用いて作成した cDNAライブ ラリーから、 OCIFcDNA断片をプローブとしてハイブリダィゼ一ション法により得 られる 0CIF類縁体の cDNAを発現べクターに揷入し、 そのべクタ一を通常用いられ る宿主に組み込み、 宿主で発現させ、 常法により精製することにより得られるも の等が挙げられる。 より具体的には、 W096/26217号公報に記載された 0CIF2 、 0C IF3 、 0CIF4 、 または 0C1F5 が挙げられる。
これらは、 W096/26217号公報に記載されるように、 0CIF2は、 OCIFcDNAの塩基 配列の 265番目のグァニンから 285 番目のグァニンまでの 21bpの欠失があり、 ァ ミノ酸配列では OCIFのァミノ酸配列の 68番目のグルタミ ン酸（Glu) から 74番目の グルタミ ン（Gin) までの 7ァミノ酸の欠失があるものである。
0CIF3 は、 OCIFcDNAの塩基配列の 9番目のシチジンがグァニンに変換されてい て、 アミノ酸配列では 0C1Fのアミノ酸配列の一 19番目のァスパラギン（Asn) がリ ジン（Lys) に変わっている。 ただし、 この点は、 シグナル配列の中のアミノ酸置 換であり、 分泌される 0CIF3 には影響しないと思われる。 さらに、 OCIFcDNAの塩 基配列の 872 番目のグァニンから 988番目のグァニンまでの 117bpの欠失があり 、 アミノ酸配列では OCIFのアミノ酸配列の 270番目のスレオニン（Thr) から 308 番目のロイシン（Leu) までの 39アミノ酸の欠失がある。
0CIF4 は、 OCIFcDNAの塩基配列の 9番目のシチジンがグァニンに変換されてい て、 アミ ノ酸配列では 0CIFのアミノ酸配列の一 19番目のァスパラギン（Asn) がリ ジン（Lys) に変わっている。 又、 22番目のグァニンがチミジンに変換されていて 、 アミノ酸配列では 0CIFのアミノ酸配列の一 14番目のァラニン（Ala) がセリン（S er) に変わっている。 ただし、 これらはシグナル配列の中のアミノ酸置換であり 、 分泌される 0C1F4 には影響しないと思われる。 さらに OCIFcDNAの塩基配列の 4 00番目と 401番目の間に約 4kbのイントロン 2の揷入があり、 オープンリーリン グフレームがその中で止まる。 アミノ酸配列では 0CIFのアミノ酸配列の 112番目 のァラニン（Ala) の後に 21ァミノ酸からなる新規なァミノ酸配列が付加されてい るものである。
0CIF5 は、 OCIFcDNAの塩基配列の 9番目のシチジンがグァニンに変換されてい て、 アミノ酸配列では OC I Fのアミノ酸配列の一 19番目のァスパラギン（Asn) がリ ジン（Lys) に変わっている。 ただし、 これはシグナル配列の中のアミノ酸置換で あり、 分泌される 0C I F5 には影響しないと思われる。 さらに、 OC I FcDNAの塩基配 列の 400番目と 401番目の間に約 1. 8 kbのイン トロン 2の後半部分の揷入があり 、 オープンリーリングフレームがその中で止まっている。 アミノ酸配列では 0C I F のアミノ酸配列の 112番目のァラニン（Ala) の後に 12アミノ酸からなる新規なァ ミノ酸配列が付加されているものである。
変異体としては、 0C I Fのアミノ酸配列に対し 1以上のアミノ酸が挿入、 付加、 置換、 あるいは欠失されたものが挙げられる。 より具体的には、 OC I FcDNAに PCR 法あるいは制限酵素による切断により置換あるいは欠失変異を入れた 0C I F変異体 cDNAを作成し、 この cDNAを発現べクタ一に挿入し、 そのべクタ一を通常用いられ る宿主に組み込み、 宿主で発現させ、 常法により精製することにより得られるも のが挙げられる。
本発明で用いる多糖類は、 単糖がグリコシド結合によって生じた重合体 （ダル カン） であり、 好ましくは構成単糖が 2種以上からなるヘテロ多糖 （ヘテログリ カン） である。 具体的には、 天然多糖類として例えばヒアルロン酸、 コン ドロイ チン硫酸、 デルマタン硫酸、 へパラン硫酸、 ケラタン硫酸、 カラギ一ナン、 ぺク チンまたはへパリンなど、 あるいは合成多糖類としては例えばデキストランなど 、 また、 合成多糖類の誘導体としては例えばデキス トラン硫酸などが用いられる 特に好ましくはグルカンが硫酸エステル化されたものが用いられ、 例えばへパリ ンの分子量 3，000〜6，000 のものあるいはデキストラン硫酸の分子量 5，000〜 10, 000のものが用いられる。 本発明の骨代謝異常症治療剤は、 0C I F、 その類縁 体、 またはその変異体からなる群から選択される一以上の物質、 及び多糖類また はその誘導体を、 多糖類またはその類縁体が 0C I F、 その類縁体、 またはその変異 体に対し 1〜100 倍量、 特に 1〜16倍量の割合で組み合わせるのが好ましい。 0C I F、 その類縁体、 またはその変異体からなる群から選択される一以上の物質と多 糖類またはその誘導体とを組み合わせた本発明製剤は、 0C I F単独投与に比べて持 続性と治療効果が優れた骨代謝異常症治療剤として、 例えば骨粗鬆症、 高カルシ ゥム血症、 慢性関節リウマチ等の骨代謝異常症に対して有効である。
本発明の製剤は、 ヒ トあるいは動物に対し、 医薬として経口的及び非経口的に 安全に投与される。 非経口的投与としては、 例えば静脈注射、 筋肉内注射、 皮下 注射、 経鼻投与、 口腔内投与、 経粘膜投与等が挙げられる。 これらの投与経路で 投与するための製剤は公知の製剤学的製法に準じ、 製剤として薬理学的に許容さ れ得る担体、 賦形剤、 滑沢剤、 着色剤等と共に医薬品組成物として投与される。 注射剤を調製する場合は、 0C IF及び多糖類の他に、 必要に応じ p H調整剤、 緩衝 剤、 安定化剤、 可溶化剤などを添加して、 常法により注射剤とする。 その際、 ヒ ト血清アルブミ ンゃ界面活性剤等の公知の添加剤を併用してもよい。 界面活性剤 としては、 例えばポリア二オン類や陰イオン性界面活性剤等が挙げられる。 注射 剤はバイアル瓶に分注し溶液製剤にするか、 あるいは凍結乾燥製剤として、 用時 に適時蒸留水や生理的食塩水等に溶解することによって調製することができる。 0C IFを 3または 24mg/kg · day の用量で正常ラッ トに 1 日 1回 2週間連続静脈内 投与したところ、 骨密度と骨量の増大が確認されたが、 38組織における組織病理 学的な異常や血球数の変動等は観察されなかった（H. Yasuda et al.： Endocr ino logy, Vo l. 139， PP1329- 1337(1998) )。 このように、 OC I Fの作用は骨に特異性が高 く、 安全にヒ 卜に投与できることが期待される。
本発明の骨代謝異常症治療剤を患者に投与する場合の投与量と投与方法は、 症 状の程度、 患者の年齢、 健康状態、 体重などの条件によって異なるので特に限定 されないが、 例えば成人 1 日当たり約 0. 01〜lmg/kgを非経口的に 1 日 1〜数回投 与すれば良い。 また、 本発明製剤の活性は、 血清カルシウムの濃度を測定するこ とにより行うことができる。 例えば、 適当な溶媒を用いて調製した OC IF溶液に多 糖類を添加したものをラッ 卜に静脈内投与し、 経時的に採血を行いその血清カル シゥム濃度を常法により測定することにより行うことができる。
また、 本発明は、 多糖類またはその誘導体を用いて破骨細胞形成抑制因子の活 性を高める方法に関する。 本発明によると、 0CIFの血中濃度を高め、 0CIFの血清 カルシゥム濃度低下作用を増強することができる。
図面の簡単な説明
第 1図は、 実施例 2における、 0CIFに多糖類を添加した製剤の、 投与 3時間後 の血清カルシウム濃度を示す。
〔符号の説明〕
D- 1 ： 0CIF 0.5mg/kg+デキストラン硫酸 （分子量 5， 000) 2mg/kg D- 2 ： 0CIF 0.5mg/kg+デキストラン硫酸 （分子量 8， 000) 2mg/kg D- 3 ： 0CIF 0.5mg/kg+デキストラン硫酸 （分子量 10， 000) 2mg/kg H- 1 ： 0CIF 0.5mg/kg +へパリン (207.8 units/mg) 2mg/kg
H- 2 ： OCIF 0.5mg/kg +へパリン （171.2 units/mg) 2mg/kg
H- 3 : OCIF 0.5mg/kg +へパリン （分子量 3,000) 2mg/kg
H- 4 ： OCIF 0.5mg/kg +へパリン （分子量 6， 000) 2mg/kg
* * ：危険率 1 %以下で有意差あり
第 2図は、 実施例 3における、 0CIFと多糖類の混合比を変えて投与した時の、 投与 3時間後の血清力ルシゥム濃度を示す。
〔符号の説明〕
* * ：危険率 1 %以下で有意差あり
第 3図は、 実施例 4における、 0CIFに多糖類を添加した製剤を投与した時の、 投与 3， 6, 9時間後のそれぞれの血清カルシウム濃度を示す。
〔符号の説明〕
* * ：危険率 1 %以下で有意差あり 第 4図は、 実施例 5における、 OCIFに多糖類を添加した製剤を投与した時の、 経時的な血中 0CIF濃度の変化を示す。
〔符号の説明〕
A ： ダイマ一型 0CIFの血中濃度を示す図。
B ： モノマ一型 0CIFの血中濃度を示す図。
•： 0C1F
〇： 0CIF+デキス トラン硫酸
第 5図は、 実施例 5おける、 OCIFに多糖類を添加した製剤を投与した時の、 モ ノマー型/ダイマ一型 OCIFの血中における割合の経時変化を示す。
〔符号の説明〕
A ： OCIF
B ： 0CIF+デキストラン硫酸
〇：ダイマ一型 0CIF
Δ： モノマー型 0CIF
第 6図は、 実施例 6における、 OCIFに多糖類 （デキス トラン硫酸、 リ ンゴぺク チン又は甘皮類べクチン） を添加した製剤の、 投与後 2及び 4時間後の血中 0CIF 濃度を示す。
[符号の説明]
□： 0.5mg/kg 0C1F単独投与
◊： 0.5mg/kg OCIF + 0.5¾；デキストラン硫酸
〇： 0.5mg/kg OCIF + 0.5%リ ンゴぺクチン
△： 0.5mg/kg 0CIF+0.5%甘皮類べクチン
第 7図は、 実施例 6における、 0CIFに多糖類 （デキス トラン硫酸、 リ ンゴぺク チン又はカラギ一ナン） を添加した製剤の、 投与後 2及び 4時間後の血中 0CIF濃 度を示す。 [符号の説明]
□： 0.5mg/kg OCIF単独投与
O： 0.5mg/kg 0CIF + 0.5%デキストラン硫酸
〇： 0.5mg/kg OCIF+0.5%リ ンゴぺクチン
△： 0.5mg/kg 0CIF + 0.5%カラギーナン （ラムダ）
第 8図は、 実施例 7における、 0CIFに多糖類 （デキス トラン硫酸又はリ ンゴぺ クチン） を添加した製剤の、 静脈内投与後の血中 0CIF濃度を示す。
[符号の説明]
〇： 50//g/kg OCIF単独投与
△： 50 /g/kg 0CIF + 0.1%デキストラン硫酸
□： 50〃g/kg 0CIF+0.15%リ ンゴぺクチン
第 9図は、 実施例 7における、 0CIFに多糖類 （デキス トラン硫酸又はリ ンゴぺ クチン） を添加した製剤の、 筋肉内投与後の血中 0CIF濃度を示す。
[符号の説明]
〇： lmg/kg OCIF単独投与
△： lmg/kg 0CIF+0.1%デキス トラン硫酸
： lmg/kg 0CIF + 0.15%リ ンゴぺクチン
第 10図は、 実施例 8における、 0CIFに多糖類 （リ ンゴぺクチン） を添加した製 剤の、 投与 4時間後の血清カルシウム濃度を示す。
発明を実施するための最良の形態
〔実施例〕
以下の実施例により本発明をより具体的に説明するが、 これらは単に具体的 に例示したのみであり、 本発明はこれらによって何ら限定されるものではない。 〔実施例 1〕
注射剤の製造 · 1 W096/26217号公報記載の方法に従って得られたヒ ト OCIF 500 /g 及びへパリ ン 2mgを、 0.15M NaCl及び 0.01%Tween 80を含む 10mM リン酸ナトリゥム緩衝液 （ pH7.0) 5mlに溶解し、 この溶液を 0.22〃m の滅菌フィルタ一 （Millex GV， ミ リポ ァ社） で滅菌した後、 バイアル瓶に充塡することにより静注用注射剤を得た。
注射剤の製造 · 2
W096/26217号公報記載の方法に従って得られたヒ ト 0CIF 500 /g 及びデキスト ラン硫酸 2 mgを、 0.15M NaCl及び 0.01%Tween 80を含む lOmM リン酸ナトリウム 緩衝液（pH 7.0) 5mlで溶解し、 この溶液を 0.22〃m の滅菌フィルタ一 （Millex G V， ミ リポア社） で滅菌した後、 バイアル瓶に充塡することにより静注用注射剤を 得た。
〔実施例 2〕
多糖類の添加による 0CIFの血清カルシウム濃度低下効果 · 1
ヒ ト 0CIF (ダイマ一型）（W096/26217号公報記載の方法により得られた遺伝子組 換え型 0CIF) を、 0.15M NaCl及び 0, 01%Tween 80を含む lOmM リン酸ナトリウム 緩衝液（pH 7.0) (以下、 溶媒と称す） に溶解して調製したヒ ト OCIF 0.25mg/ml溶 液 2mlに、 デキス トラン硫酸 （分子量 8000または 10000 ： シグマ社、 及び分子量 5000または 50000 ：和光純薬社） あるいはへパリ ン （207.8 または 171.2 unit/ mg :和光純薬社、 及び分子量 3000または 6000： シグマ社） 2mgを溶解した後、 4 °Cで一昼夜放置した。 同時にヒ ト型 0CIF 0.25 及び 2.5 mg/ml 溶液並びに溶媒に ついても、 4 °Cで一昼夜放置した。 これらの被験試料液を、 それぞれ 0C1Fとデキ ス トラン硫酸投与群 （D群） 、 0C1Fとへパリ ン投与群 （H群）（D群及び H群は 0C IF量として 0.5mg/kg投与) 、 0CIF単独投与群 (0CIF量として 0.5mg/kg及び 5mg/kg 投与） 、 及び溶媒投与群として準備した。 4週齢の雌性ウィスター系ラッ 卜に 2m 1/kgの用量で静脈内単回投与した。 投与 3時間後に眼窩採血を行い血清を調製し、 得られた血清中のカルシウム濃度をカルシウム Cテス ト （和光純薬社） を用いて 測定した。 結果を第 1図に示す。 この結果、 種々のデキス トラン硫酸あるいはへ パリンを添加した 0.5mg/kgヒ 卜 0CIF投与により、 有意な血清カルシウム濃度低下 作用の増強効果が認められた。 従って、 多糖類の添加により、 ヒ ト 0CIFの血清力 ルシゥム濃度低下作用を増強できることが確認された。
〔実施例 3〕
多糖類の添加量による 0CIFの作用増強効果
実施例 2と同様に調製したヒ ト OCIF 0.25mg/ml溶液 2mlに、 ヒ ト 0CIFに対して デキス トラン硫酸 （分子量 5000：和光純薬社） 1， 2， 4， 8, 16倍重量を溶解した 後、 4°Cで一昼夜放置した。 同様に、 へパリ ン（207.8 units/mg ：和光純薬社） も同じ比率でヒ ト型 OCIF 0.25mg/ml溶液 2mlに溶解し、 4 °Cで一昼夜放置した。 さらに、 4 mg/ml に調製したデキストラン硫酸またはへパリン溶液、 0.25 及 び 2.5 mg/ml に調製したヒ 卜 0CIF溶液、 及び溶媒のみについても、 同様に 4でで 一昼夜放置した。 これらの被験試料液を、 4週齢の雌性ウィスター系ラッ トに 2m 1/kgの用量で静脈内単回投与し、 投与 3時間後に眼窩採血を行い、 血清を調製し た。 得られた血清中のカルシウム濃度を、 カルシウム Cテス ト （和光純薬社） を 用いて測定した。 なお、 このキッ トは、 キレート法 （オルトクレゾ一ルフ夕レイ ンコンプレキソン（0CPC)法） に 8—キノ リノールを添加し、 マグネシウムの影響 を除き、 特異性を高めたもので、 アルカリ条件下で 0CPCと結合して紫紅色を呈し 、 その吸光度を測定することにより、 カルシウム濃度を測定できるものである。 結果を第 2図に示す。 この結果、 デキス トラン硫酸を、 ヒ ト 0CIFに対し 4倍量以 上添加した場合に、 有意な血清カルシウム濃度低下作用が認められた。 また、 へ パリ ンを、 ヒ ト 0CIFに対し等量を添加した場合でも、 有意な血清カルシウム濃度 低下作用が認められた。 従って、 ヒ ト 0CIFと多糖類を特定の割合で同時に投与す ることにより、 0CIFの血清カルシウム濃度低下作用がさらに増強されることが確 認された。 〔実施例 4〕
多糖類の添加による OC I Fの持続性増強効果
溶媒で調製したヒ ト 0CIF 2.5mg/ml 溶液 2 mlに、 デキス トラン硫酸 （分子量 50 00：和光純薬社） 20mgを溶解した後、 4°Cで一昼夜放置した。 へパリ ン（207.8 u nits/mg ：和光純薬社） 20mgもヒ 卜 0CIF 2.5mg/ml 溶液 2mlに溶解し、 同様に 4 °Cで一昼夜放置した。 さらに、 2.5 mg/mlに調製したヒ ト 0CIF溶液及び溶媒につ いても、 4 °Cで一昼夜放置した。 得られた被験試料液を、 4週齢の雌性ウイスタ —系ラッ 卜にそれぞれ 2ml/kg (0CIF量として 5mg/kg) の用量で静脈内単回投与し、 投与 3， 6, 9 時間後に眼窩採血を行い、 血清を調製した。 得られた血清中のカル シゥム濃度を、 カルシウム Cテス ト （和光純薬社） を用いて測定した。 結果を第 3図に示す。 この結果、 5mg/kgヒ ト 0CIF溶液単独投与群では、 投与 3時間後で有 意な血清カルシウム濃度の低下は認められたものの、 投与 6及び 9時間には血清 カルシウム濃度低下作用は認められなかった。
一方、 ヒ ト 0CIFに対して 4倍量のデキストラン硫酸またはへパリンを添加した 2.5 mg/ml ヒ ト 0CIF溶液は、 投与 9時間後でも有意な血清カルシウム濃度低下作 用を有することが認められた。 従って、 ヒ ト 0CIFと多糖類を同時に投与すること により、 持続性増強効果が得られることが確認された。
〔実施例 5〕
多糖類の添加による血中 0CIF濃度の持続効果 · 1
実施例 2と同様に調製したヒ ト 0CIF1 mg/ml 溶液 1mlにデキス トラン硫酸 4 mg /ml 溶液 1mlを加え、 4 °Cで一昼夜放置した。 この被験試料液を、 9週齢の雄性 ウィスター系ラッ トに lml/Jigの用量で静脈内単回投与し、 投与 2， 5, 10， 15， 3 0， 45， 60， 120, 240, 360, 480, 600, 720, 1440 分後に眼窩採血を行い血清を 調製した。 得られた血清中のヒ ト 0CIF濃度を、 ダイマ一型 0CIFを認識するモノク 口一ナル抗体、 モノマ一型 0CIFを認識するモノ クローナル抗体（BIOCHEMICAL AND BIOPYSICAL RESEARCH CO顧 UNICATIONS, Vol.245， pp382- 387(1998))を用いて、 W096/26217号公報記載の ELISA法により測定した。 尚、 全 0CIF濃度は、 ダイマ一 型 0CIF濃度とモノマ一型 0CIF濃度の和として求めた。 結果を第 4図及び第 5図に 示す。 この結果、 500 zg/kgヒ ト 0CIF溶液単独投与群に比べて、 ヒ ト 0CIFに対し て 4倍量のデキストラン硫酸を添加したヒ ト 0CIF溶液投与群は、 明らかに高い血 中 0CIF濃度を維持した （第 4図） 。 また、 ダイマ一型 0CIFからモノマー型 0CIFへ の血中で変換が抑制されることが確認された （第 5図） 。 従って、 多糖類を添加 することにより、 0CIF血中濃度、 特に血清カルシウム濃度低下活性の高いダイマ 一型 OCIFCBIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH CO删 UN I CAT IONS, Vol.245, p p382- 387(1998)) の血中濃度が持続される。
〔実施例 6〕
多糖類の添加による血中 0CIF濃度の持続効果 ' 2
実施例 2と同様に調製したヒ 卜 0CIF 0.25mg/nil溶液 2mlに、 デキストラン硫酸 、 リンゴぺクチン、 又は甘皮類べクチン （全て和光純薬社） の 0.5 溶液 （溶媒： 0.15M NaCl, 0.01% ポリソルべ一ト 80含有 10mMリ ン酸ナトリウム緩衝液 （pH 7.0)) を等量混合し、 室温にて 4時間放置し、 被験試料液を作製した。 又、 対照 として 0.25mg/ml 0CIF溶液（2ml) のみについても、 同様に溶媒を等量混合し室温 にて 4時間放置した。 これらの被験試料液を、 4週齢の雄性ウィスター系ラッ ト に 2ml/kgの用量で静脈内単回投与し、 投与 2及び 4時間後にエーテル麻酔下で眼 窩採血を行い血清を調製した。 得られた血清中のヒ ト型 0CIF濃度を、 W096/26217 号公報記載の ELISA法を用いて測定した。 結果を第 6図に示す。
又、 前述と同様の方法で、 ヒ ト OCIF 0.25mg/ml溶液 2mlに、 デキストラン硫酸 、 リ ンゴぺクチン、 又はカラギーナン （ラムダ） （全て和光純薬社） の 0.5 溶液 を等量混合し、 室温にて 4時間放置し、 被験試料液を調製した。 又、 対照として 0.25mg/ml OCIF溶液のみについても、 同様に溶媒を等量混合し室温にて 4時間放 置した。 これらの被験試料液を、 4週齢の雄性ウィスター系ラッ トに 2ml/kgの用 量で静脈内単回投与し、 投与 2及び 4時間後にエーテル麻酔下で眼窩採血を行い 血清を調製した。 得られた血清中のヒ ト型 OCIF濃度を、 W096/26217号公報記載の ELISA法を用いて測定した。 結果を第 7図に示す。
これらの結果、 ヒ ト型 OCIF溶液単独投与群に比べて、 デキストラン硫酸、 リ ン ゴぺクチン、 甘皮類べクチンを添加したいずれの被験試料投与群でも、 明らかに 高い血中 0CIF濃度を維持した （第 6図） 。 また、 カラギーナンを添加した被験試 料投与群でも同様に、 明らかに高い血中 OCIF濃度を維持した （第 7図） 。 よって 、 これらの多糖類を添加することにより、 OCIFの血中濃度が持続されることが確 認された。
〔実施例 7〕
多糖類の添加による血中 0CIF濃度の持続効果 ' 3
多糖類としてデキストラン硫酸あるいはリンゴぺクチン （和光純薬社） を用い て、 投与経路の違いによる血中 0CIFの持続効果を検討した。 溶媒 （0.15M NaCK 0.01% ポリソルべ一ト 80含有 10mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.0))でヒ 卜 0CIFを 静脈投与用は 50 g/ml、 筋肉内投与用は 1000 zg/mlになるように希釈した OCIF溶 液を準備し、 これに上述の多糖類を加え、 それぞれ被験試料液とした。 この時、 デキス卜ラン硫酸は静脈投与用あるいは筋肉内投与用 0CIF溶液に、 それぞれ 0.1% になるように添加した。 又、 リンゴぺクチンは、 溶媒に溶解して 3mg/mlに調製し た溶液を、 2倍量の静脈投与用あるいは筋肉内投与用 0CIF溶液 （それぞれ 100 g/ml及び 2000 g/ml OCIF 含有） に等量混合した。 それぞれの溶液を 4週齢の雄 性ウィスター系ラッ 卜に lml/kgの用量で単回投与した。 投与後、 静脈内投与は 2， 5， 10， 15, 30, 45， 60， 120, 240, 360 分後に、 筋肉内投与は 30分、 1， 2, 3， 4, 5, 6， 8， 10, 24 時間後に、 それぞれエーテル麻酔下で眼窩採血を行い血清 を調製した。 得られた血清のヒ ト型 0CIF濃度を、 W096/26217号公報記載の ELISA 法を用いて測定した。 結果を第 8図及び第 9図に示す。
この結果、 デキストラン硫酸あるいはリンゴぺクチンを添加した 0C IF溶液の、 静脈内投与 （第 8図） あるいは筋肉内投与 （第 9図） において、 明らかに高い血 中 0C I F濃度を維持した。 よって、 これらの多糖類を添加することにより、 OC iFの 血中濃度が持続されること、 及び血中 0C IF濃度の持続効果は投与経路にかかわら ず観察されることが確認された。
〔実施例 8〕
多糖類の添加による 0C IFの血清カルシウム濃度低下効果 · 2
実施例 2と同様に調製したヒ ト 0C IF 0. 25mg/ml溶液 2mlに対して、 リ チン （和光純薬社） の 0. 5%溶液 （溶媒： 0. 15M NaCl， 0. 01 %ポリ ソルべ一 ト含有 lOm リン酸ナトリウム緩衝液 （pH7. 0)) を等量混合し、 室温にて 4時間放置し 、 被験試料液を調製した。 同時に、 0C IF溶液 （ヒ ト 0C I F 0. 25mg/ml溶液 2ml) に 溶媒を等量混合したもの、 及び溶媒のみを用意した。 それぞれの被験試料液を、 4週齢の雄性ウィスター系ラッ 卜に 2ml/kgの割合で静脈内単回投与した。 投与 4 時間後にエーテル麻酔下で眼窩採血を行い血清を調製し、 得られた血清中のカル シゥム濃度をカルシウム Cテス ト （和光純薬社） を用いて測定した。 結果を第 10 図に示す。 この結果、 0. 5mg/kgヒ ト型 0CIF溶液単独投与群では血清カルシウム濃 度低下作用は認められなかったが、 リ ンゴぺクチンを添加した 0. 5mg/kgヒ ト型 0C IF投与群では、 有意な血清カルシウム濃度低下作用が認められた。 従って、 多糖 類の添加により、 ヒ 卜型 0C I Fの血清カルシウム濃度低下作用を増強できることが 確認された。
産業上の利用可能性
本発明により、 破骨細胞形成抑制因子、 その類縁体、 またはその変異体から選 択される一以上の物質、 及び多糖類またはその誘導体からなる骨代謝異常症治療 剤が提供される。 本発明により、 骨粗鬆症、 高カルシウム血症、 慢性関節リウマ チ等の骨代謝疾患に対して優れた治療効果を有し、 その活性を長時間維持できる 骨代謝異常症治療剤が提供され、 医薬として有用である。

Claims

請 求 の 範 囲
(1) 破骨細胞形成抑制因子 (Osteoclastogenesis Inhibitory Factor; OCIF) 、 その類縁体、 またはその変異体からなる群から選択される一以上の物質と多糖 類またはその誘導体とからなる骨代謝異常症治療剤。
(2) 0CIFがヒ ト 0CIFである請求の範囲 1記載の骨代謝異常症治療剤。
(3) 多糖類がへパリン、 ぺクチン、 及び Zまたはカラギ一ナンである請求の範囲 1記載の骨代謝異常症治療剤。
(4) 多糖類誘導体がデキストラン硫酸である請求の範囲 1記載の骨代謝異常症治 療剤。
(5) 多糖類またはその誘導体を用いて破骨細胞形成抑制因子の活性化を高める方 法。
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