WO2000007577A2 - Phosphatidylcholin als arzneimittel mit schleimhautschützender wirkung - Google Patents

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Definitions

  • the present invention relates to medicaments containing as an active ingredient phosphatidylcholine in a therapeutically effective amount for the treatment of diseases in which the mucous membrane protective effect of phosphatidylcholine in the large intestine and terminal ileum (pouch mucosa) is advantageous.
  • the drugs are suitable for the treatment of ulcerative colitis, pouchitis, other colon inflammation (Crohn's disease, diversion colitis, infectious enteritis / colitis, inflammation due to radiation, antibiotics, chemotherapeutics, pharmaceuticals or chemicals) and for the prevention of colon cancer.
  • ulcerative colitis and Crohn's disease affect people in adolescence and middle age with increasing frequency (prevalence together 1 - 2%).
  • ulcerative colitis in particular, an increased risk of developing colon cancer is to be emphasized after many years.
  • Crohn's disease can affect the entire gastrointestinal tract (most common location at the end of the small intestine in the terminal lleum).
  • the inflammatory changes are circumscribed, arranged in an otherwise healthy mucous membrane and can change over time.
  • the main complications are inflammatory narrowing of intestinal sections and fistula and abscess formation. Manifestations outside the gastrointestinal tract are possible.
  • the Ulcerative colitis shows continuous inflammation with superficial ulcerations starting from the end of the large intestine (proctum, rectum). Depending on the severity, the colitis can expand and ultimately affect the entire colon. The end of the small intestine is also inflamed to a high percentage ("backwash-lleitis").
  • the main complications are functional restrictions of the large intestine with numerous diarrhea, bleeding from mucosal ulcers and rarely a dramatic inflammation of the entire intestinal wall (toxic megacolon). There is a fear of the frequent occurrence of colon cancer after a long history of the disease. However, there are smooth transitions in the symptoms between the two inflammatory bowel diseases, so that it is often very difficult to distinguish between them.
  • a reservoir is formed from the last loop of the small intestine, placed in the anal canal, fixed there and connected to the natural anus that has been peeled off inside. This creates a new collecting organ for the intestinal contents while maintaining the natural outcome (continence-preserving ileoanal pouch system).
  • the pouch can become inflamed (pouchitis) and cause considerable discomfort.
  • other underlying diseases e.g. familial adenomatous polyposis
  • WO 95/18622 describes the use of derivatives of 2-hydroxy-5-phenylazobenzoic acid as a chemoprotective substance for the treatment of cancer of the colon.
  • the object of the present invention was to provide further medicaments for the treatment of colon diseases.
  • phosphatidylcholine acts as a protective substance for the large intestine.
  • Phosphatidylcholine covers the intestinal cells like a protective film and is therefore suitable as a therapeutic agent for the treatment of ulcerative colitis, pouchitis, other colon inflammations (Morbus Crohn, diversion colitis, infectious enteritis / colitis, inflammation due to radiation, antibiotics, chemotherapeutics, pharmaceuticals or chemicals) as well for the prevention of colon cancer.
  • PC Phosphatidylcholine
  • R, (CH 2 ) n -CH 3
  • R 2 (CH 2 ) n -CH 3
  • oral preparations of phosphatidylcholine with targeted or delayed active ingredient release in the lower ileum and colon and / or rectal administration forms e.g. as a klysma, suppository or foam.
  • Oral administration is preferred for the prophylaxis of colon carcinoma, especially in ulcerative colitis.
  • Oral administration can take the form of suitable dosage forms, for example tablets or capsules, which prevent absorption from the first two thirds of the small intestine and lead to targeted release in the lower section of the small intestine.
  • Drugs containing phosphatidylcholine can be administered locally as rectal onsform (e.g. suppositories, foam or clysms) or orally.
  • Phosphatidylcholine is applied to the lower sections of the small intestine and the colon, especially to protect the large intestinal mucosa from bacterial infection.
  • Pharmaceutical forms which release the active substance with a delay are particularly suitable for oral administration.
  • the retardation is expediently achieved by coatings and / or carrier matrices which are resistant to gastric juices and release the active substance in the deep small intestine and large intestine depending on the pH value.
  • Film coverings which contain, for example, Eudragit ® acrylic polymers for controlled release of active ingredients (for example the products with the brand names Eudragit ® L and Eudragit ® S from Röhm, Darmstadt) are suitable as technologies.
  • a delayed release form is advantageously used for the production of orally administrable phosphatidylcholine in order to avoid resorption in the proximal luminal sections.
  • Phosphatidylcholine can be broken down into large volumes (e.g.
  • phosphatidylcholine preparations can be dissolved in a lipophilic solvent (e.g. soybean oil).
  • a lipophilic solvent e.g. soybean oil
  • the dose to be administered is, for example, 5-20 g in 100 ml soybean oil. 100 ml of the solution can be applied rectally as a Klysma.
  • dosage forms should be used as suppositories or foam preparations.
  • Medicaments according to the invention contain phosphatidylcholine in a therapeutically effective amount which is sufficient to bring about the protective effect on the mucous membrane in the large intestine.
  • the active substance content in the finished drug form is 1 - 500 mg, preferably 100-300 mg.
  • Suitable oral dosage forms are tablets, granules, capsules, pellets or pellet tablets for oral administration.
  • the pharmaceutical forms can furthermore contain customary pharmaceutical additives, such as auxiliaries or carriers. For rectal use, primarily clysms, foam preparations, ointments, gels, lotions and suppositories come into question. These contain the
  • Active ingredient in an amount of 10 mg - 10 g, preferably up to 5 g.
  • the dosage forms are administered one or more times a day.
  • the present invention also relates to a diagnostic method for
  • the present invention also relates to a method for determining the phosphatidylcholine concentration in the mucus of the colon mucosa, wherein the sample to be analyzed can be taken, for example, with the aid of a swab preparation.
  • the lipid composition is then determined by means of a suitable lipid chemical analysis, for example by mass spectrometry.
  • MDR Multi Drug Resistance
  • the absence of MDR3-analogous proteins in the terminal ileum can be an indicator of insufficient phosphatidylcholine secretion in the intestinal lumen, with subsequent changes in the composition of the mucus in the large intestine and increased susceptibility to bacteria resident there.
  • the inadequate production of MDR3-analogous proteins could explain the reduced amount of phosphatidylcholine in the intestinal lumen.
  • MDR3-analog protein is present. This significantly reduces phosphatidylcholine secretion into the intestinal lumen, which has been demonstrated in incubation experiments with biopsy samples.
  • the present invention therefore also relates to the detection of MDR3-analogous proteins for the diagnosis of ulcerative colitis in the terminal ileum and pouch epithelium. This also includes all diseases that are associated with a reduced presence of the MDR3-analog protein.
  • the correlation between the concentration or amount of MDR3-analogous proteins can also be used to draw conclusions about the optimal amount of phosphatidylcholine required in the course of therapy with the medicaments according to the invention.
  • the diagnosis thus enables the required dose of phosphatidylcholine to be individually adapted to the patients to be treated.
  • the determination of the phosphatidyl poppy in the intestinal lumen enables an important follow-up in therapy in terms of patient compliance.
  • the MDR3-analogous proteins are determined indirectly via the RT-PCR multiplication of the RNA coding for these proteins (genetic information).
  • the MDR3 protein or the MDR3 proteins are phospholipid transporters in plasma membranes.
  • the human MDR (P-glycoprotein) gene family consists of two members (MDR1 and MDR3). In terms of development, they belong to the very old super family of ABC transporters (ATP-Binding-C_assette). These proteins transport a wide variety of substrates (hydrophobic molecules, oxyanions, Cl " etc.) from the inside of the cell to the outside via the plasma membrane
  • the two homologous MDR genes lie one behind the other in the genome (MDR3 approx. 30 kb downstream from MDR1) and together comprise approximately 230 kb. Both genes consist of 28 exons, 27 of which contain the coding region in the MDR3. Four splicing variants of the MDR3 gene are known, each of which leaves the reading frame intact. In variant C "M1 the whole is missing
  • Exon 23 leads to a coding region shortened by 141 nucleotides. Exon 23 contains the transmembrane domain 11. A lack could lead to a protein with a completely different membrane topology. In MDR3-expressing tissues, the normal transcript and its variants are usually represented equally abundantly.
  • MDR3 is a membrane-based, 170 kD, energy-dependent efflux pump for a wide variety of liphopile substances.
  • MDRI consists of two homologous halves, each with six transmembrane domains and a nucleotide binding site. MDR3 is structurally the same, but has a different tissue-specific distribution pattern and a different function because it does not lead to "multidrug resistance". In mice in which the corresponding mouse-specific gene (mdr2) was switched off
  • MDR3 P-glycoprotein is also responsible for the transport of phosphatidylcholine from the liver cell into the bile. The occurrence of MDR3 in the remaining gastrointestinal tract has not been reported in the literature to date.
  • primers for the amplification of MDR3 -specific transcripts were synthesized.
  • the aim of the primer design is to amplify the desired DNA segment specifically and efficiently.
  • the primer sequences are selected from areas of the MDR3 cDNA sequence in which MDR3 and MDRI have a low homology. Primers which have high homology to MDRI, but whose 3 ' terminal base differs from the MDRI cDNA sequence, are also MDR3-specific.
  • the primer sequence must be chosen so that the primers are unable to form loop structures via intramolecular hydrogen bonds or intermolecular binary dimers.
  • the oligonucleotide length is preferably 20 to 25
  • the GC content should be in the range of 50 to 60%. If possible, the two primers of a pair of primers should be located in different exons so that amplification of genomic DNA can be excluded or recognized in the PCR. According to the invention, primer sequences were selected which enable reliable and specific amplification of MDR3 sequences. Examples of suitable primers that are specific for MDR3 are marked with arrows in the attached figure (Fig. 1, MDRI vs. MDR3).
  • a 25 bp oligonucleotide of bp 241 1-2435 of the cDNA in exon 20 is selected as the 5 'primer.
  • the 3 'primer is a 33 bp oligonucleotide from bp
  • Biopsies are used as the starting material for the RNA isolation Colonoscopies were obtained, using two biopsies from a patient to isolate RNA using the Fast-RNA Kit from Dianova. The amount of total RNA that can be isolated is up to 70 ⁇ g. A + ) RNA can be omitted because the amount of transcript in the total RNA is already sufficient for PCR detection.
  • RNA 5 ⁇ g total RNA is used for a first strand cDNA synthesis.
  • the cDNA synthesis and the PCR are carried out with the ReadyToGo system (Pharmacia) according to the recommendations of the manufacturer.
  • 5 ⁇ g of total RNA are reverse transcribed in cDNA.
  • the PCR is performed with 2 of 33 ul cDNA and 10 pmol from each primer in one
  • the amplification is carried out as follows: once for 5 minutes at 94 ° C., then 33 cycles of 2 seconds at 94 ° C., 2 seconds at 55 ° C. and 45 seconds at 72 ° C.
  • the RT-PCR products are analyzed by agarose gel electrophoresis.
  • the conditions for a successful detection of MDR3 are tested with liver RNA, since there is a particularly high abundance of transcripts.
  • GAPDH is amplified in order to be able to compare the amount of cDNA in the different approaches.
  • the methodology used is also suitable for the "Light Cycler” technology (Röche Diagnostics GmbH or the “Taq Man” PCR technology (Perkin Elmer Applied Bio Systems)), in which a large number of samples can be determined simultaneously, quickly and (semi) quantitatively.
  • Biopsies from the esophagus, stomach, duodenum, terminal ileum, transverse colon and rectum are examined.
  • MDR3 transcripts were detected in the stomach, duodenum and terminal ileum, while they were absent in the esophagus, transverse colon and rectum.
  • RNA MDR3-analogous proteins
  • RNA MDR3-analogous proteins
  • ulcerative colitis patients show MDR3-analogous expression in the terminal ileum. 31 patients with ulcerative colitis were analyzed and compared with 14 healthy and 6 Crohn's disease patients.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft Arzneimittel enthaltend Phosphatidylcholin als Wirkstoff in einer therapeutisch wirksamen Menge zur Behandlung von Erkrankungen, bei denen die schleimhautschützende Wirkung von Phosphatidylcholin im Dickdarm vorteilhaft ist. Gegenstand der Erfindung sind ferner Gebrauch und Applikationsformen von Phosphatidylcholin zur lokalen Therapie von Entzündungen im Dickdarm und zur Prophylaxe gegen Dickdarmkrebs. Phosphatidylcholin kann als rektale Installation zur lokalen Behandlung der Entzündung (in Rektum und Pouch) sowie oral als retardiert freigesetztes Phosphatidylcholin gegeben werden. Die oral applizierte, retardierte Form des Phosphatidylcholins verhindert die frühzeitige Resorption und gewährleistet die gezielte Freisetzung in den unteren Abschnitten des Dünndarms bzw. im Dickdarm.

Description

Phosphatidylcholin als Arzneimittel mit schleimhautschützender Wirkung
Die vorliegende Erfindung betrifft Arzneimittel enthaltend als Wirkstoff Phosphatidylcholin in einer therapeutisch wirksamen Menge zur Behandlung von Erkrankungen, bei denen die schleimhautschützende Wirkung von Phophatidylcholin im Dickdarm und terminalen Ileum (Pouchmucosa) vorteilhaft ist. Die Arzneimittel eigenen sich zur Behandlung von Colitis ulcerosa, Pouchitis, anderen Dickdarmentzündun- gen (Morbus Crohn, Diversionscolitis, infektiöse Enteritis/Colitis, Entzündungen durch Bestrahlung, Antibiotika, Chemotherapeutica, Pharmaka oder Chemikalien) sowie zur Prophylaxe des Dickdarmcarcinoms.
Die chronisch entzündlichen Darmerkrankungen Colitis ulcerosa und Morbus Crohn betreffen in hohem Maße Menschen im jugendlichen und mittleren Lebensalter mit steigender Frequenz (Prävalenz zusammen 1 - 2 %). Der chronische Verlauf mit akuten entzündlichen Schüben sowie zahlreiche Komplikationen (Fistel- und Abszeßbildungen, Stenosen, akute entzündliche Schübe, Blutungen, Funktionsverlust des Dickdarmepithels, extraintestinale Manifestation) kennzeichnen den natürlichen Verlauf dieser Erkrankungen. Insbesondere bei Colitis ulcerosa ist nach langjährigem Verlauf ein erhöhtes Risiko für die Entstehung eines Dickdarmcarcinoms hervorzuheben. Trotz intensiver Forschungsarbeiten ist es bisher nicht gelungen, die Ursache dieser Erkrankungen festzustellen. Deshalb existiert auch nur eine symptomatische Therapie, die nicht ursachenspezifisch ist und häufig nicht die gewünschten Erfolge bewirkt.
Zwischen der Colitis ulcerosa und dem Morbus Crohn bestehen wesentliche Unterschiede, so daß von zwei verschiedenen Entstehungsmechanismen ausgegangen werden kann. Der Morbus Crohn kann prinzipiell den gesamten Gastromtestinaltrakt betreffen (häufigste Lokalisation am Ende des Dünndarmes im terminalen lleum).
Die entzündlichen Veränderungen sind umschrieben, in einer sonst gesunden Schleimhaut angeordnet und können mit der Zeit wechseln. Hauptkomplikationen sind entzündliche Engstellungen von Darmabschnitten sowie Fistel- und Abszeßbildungen. Manifestationen außerhalb des Gastrointestinaltraktes sind möglich. Die Colitis ulcerosa zeigt dagegen eine kontinuierliche Entzündung mit oberflächlichen Ulcerationen ausgehend vom Ende des Dickdarmes (Proktum, Rektum). Je nach Schweregrad kann sich die Colitis nach oben ausdehnen und schließlich den gesamten Dickdarm betreffen. In einem hohen Prozentsatz ist auch das Ende des Dünn- darmes entzündet ("Backwash-lleitis"). Hauptkomplikationen sind Funktionseinschränkungen des Dickdarmes mit zahlreichen Durchfällen, Blutungen aus Schleimhautgeschwüren und selten eine dramatische Entzündung der gesamten Darmwand (toxisches Megacolon). Gefürchtet ist die häufige Entstehung eines Dickdarmcarcinoms nach langjährigem Krankheitsverlauf. Zwischen beiden chronisch entzündli- chen Darmerkrankungen gibt es allerdings fließende Übergänge in der Symptomatik, so daß die Unterscheidung oft sehr schwierig ist.
Neben der oft unzureichenden symptomatischen Therapie muß bei der Colitis ulcerosa aufgrund des komplizierten, schweren Krankheitsbildes und der drohenden Gefahr eines Carcinoms häufig der gesamte Dickdarm entfernt werden. Dabei wird aus der letzten Dünndarmschlinge ein Reservoir (Pouch) gebildet, in den Analkanal gelegt, dort fixiert und mit dem innen ausgeschälten, natürlichen Anus verbunden. Damit ist ein neues Auffangorgan für den Darminhalt geschaffen mit Erhalt des natürlichen Ausganges (kontinenzerhaltende ileoanale Pouchanlage). Bei ca. 30% der Patienten mit Colitis ulcerosa kann sich der Pouch entzünden (Pouchitis) und zu erheblichen Beschwerden führen. Wenn eine solche Pouchanlage bei anderen Grunderkrankungen (z.B. familiärer adenomatöser Polyposis) vorgenommen wird, kommt es dagegen nur in Ausnahmefällen zu einer Entzündung.
WO 95/18622 beschreibt die Verwendung von Derivaten der 2-Hydroxy-5-phenyla- zobenzoesäure als chemoprotektive Substanz zur Behandlung von Krebserkrankungen des Colons.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, weitere Arzneimittel zur Behandlung von Dickdarmerkrankungen zur Verfügung zu stellen. Überraschenderweise wurde gefunden, daß Phophatidylcholin als schleimhautschützende Substanz des Dickdarms fungiert. Wie ein Schutzfilm überzieht Phosphatidylcholin die Darmzellen und eignet sich daher als therapeutischer Wirkstoff zur Behandlung von Colitis ulcerosa, Pouchitis, anderen Dickdarmentzündungen (Mor- bus Crohn, Diversionscolitis, infektiöse Enteritis/Colitis, Entzündungen durch Bestrahlung, Antibiotika, Chemotherapeutica, Pharmaka oder Chemikalien) sowie zur Prophylaxe des Dickdarmcarcinoms.
Phosphatidylcholin (PC) (synonym ist auch der Begriff Lecithin gebräuchlich), ist ein zusammengesetztes phosphorhaltiges Lipid (Phospholipid) mit folgender sche- matischer Strukturformel:
0
II H2C-O-C-RI
0 I
II
R2-C-0 H3
Figure imgf000005_0001
R, = (CH2)n -CH3
R2 = (CH2)n -CH3
Zur Behandlung der Colitis ulcerosa, Pouchitis und den anderen oben genannten Dickdarmentzündungen eignen sich orale Präparationen von Phosphatidylcholin mit gezielter oder verzögerter Wirkstofffreisetzung im unteren Ileum und Colon und/oder rektale Applikationsformen, z.B. als Klysma, Suppositorium oder Schaum. Für die Prophylaxe des Coloncarcinoms, insbesondere bei Colitis ulcerosa, ist die orale Applikation bevorzugt. Die orale Gabe kann in Form von geeigneten Darreichungsformen, beispielsweise als Tabletten oder Kapseln, erfolgen, die die Resorption aus den ersten zwei Dritteln des Dünndarms verhindern und zur gezielten Freisetzung im unteren Abschnitt des Dünndarms führen.
Arzneimittel, die Phosphatidylcholin enthalten, können lokal als rektale Applikati- onsform (z.B. Suppositorien, Schaum oder Klysmen) oder auch oral verabreicht werden. Die Applikation von Phosphatidylcholin erfolgt in die unteren Dünndarmabschnitte und das Colon, vor allem zum Schutz der Dickdarmschleimhaut vor bakterieller Infektion. Für die orale Gabe eignen sich insbesondere solche Arzneiformen, die den Wirkstoff verzögert freisetzen (sog. Retardformen). Die Retardierung wird zweckmäßigerweise erreicht durch Überzüge und/oder Trägermatrices, die magen- saftresistent sind und den Wirkstoff in Abhängigkeit des pH-Wertes im tiefen Dünndarm und Dickdarm freisetzen. Als Technismen sind Filmüberzüge geeignet, die beispielsweise Eudragit® - Acrylpolymere zur gesteuerten Wirkstoffabgabe (bei- spielsweise die Produkte mit der Markenbezeichnung Eudragit® L und Eudragit® S der Fa. Röhm, Darmstadt) enthalten.
Zur Herstellung von oral verabreichbarem Phosphatidylcholin wird vorteilhaft eine verzögerte Freisetzungsform verwendet, um die Resorption in den proximalen lleu- mabschnitten zu vermeiden. Phosphatidylcholin kann dabei in großvolumige (z.B.
0,68 ml Inhalt) Kapseln (z.B. Gelatine) eingebracht werden. Diese sind beispielsweise mit Acrylpolymeren überzogen, z.B. Verwendung der o.g. Eugradit® -Präparaten). Eine Kombination aus Eugradit® S- und L- Verbindungen (z.B. Eugradit® L/S 100) gewährt eine verzögerte Freisetzung bei pH > 6,4, wie er im terminalen lleum vorkommt. Die Verwendung von Eugradit® Präparaten und deren Mischung (L-, S- und R- Verbindungen) ist seit langem etabliert. Ferner ist es möglich, daß auch andere Überzüge oder Darreichungsformen (auch Neuentwicklungen) zur Freisetzung im terminalen lleum eingesetzt werden können, wenn sie sich als optimale Lösung anbieten.
Zur Herstellung der Klysmen können Phosphatidylcholin-Präparationen (Lecithin) in einem lipophilen Lösungsmittel aufgelöst werden (z.B. Sojaöl). Die zu verabreichende Dosis beträgt beispielsweise 5 - 20 g in 100 ml Sojaöl. 100 ml der Lösung können als Klysma rektal appliziert werden. Daneben sollen Darreichungsformen als Suppositorien oder Schaumpräparationen einsetzbar sein.
Erfindungsgemäße Arzneimittel enthalten Phosphatidylcholin in einer therapeutisch wirksamen Menge, die ausreicht, um die schleimhautschützende Wirkung im Dickdarm zu bewirken. Der Wirkstoffgehalt in der Fertigarzneiform beträgt 1 - 500 mg, bevorzugt 100 - 300 mg. Für die orale Gabe kommen als geeignete Arzneiformen Tabletten, Granulate, Kapseln, Pellets oder Pellettabletten in Frage. Die Arzneiformen können ferner übliche pharmazeutische Zusatzstoffe, wie Hilfs- oder Trägerstoffe enthalten. Für die rektale Anwendung kommen primär Klysmen, Schaumprä- parationen, Salben, Gele, Lotionen und Suppositorien in Frage. Diese enthalten den
Wirkstoff in einer Menge von 10 mg - 10 g, vorzugsweise bis zu 5 g. Je nach Schwere der Erkrankung werden die Arzneiformen ein- oder mehrfach täglich verabreicht.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner ein diagnostisches Verfahren zum
Nachweis von Krankheiten, die mit einer verminderten Sekretion von Phosphatidylcholin in das intestinale Lumen einhergehen, wie z.B. die Colitis ulcerosa, die Pouchitis bei Colitis ulcerosa oder auch die Diversionscolitis. In diesem Zusammenhang bezieht sich die vorliegende Erfindung auch auf ein Verfahren zur Bestimmung der Phosphatidylcholinkonzentration im Schleim der Colonschleimhaut, wobei die zu analysierende Probe beispielsweise mit Hilfe eines Tupfpräparates entnommen werden kann. Anschließend wird durch eine geeignete lipidchemische Analyse, beispielsweise durch Massenspektrometrie, die Lipidzusammensetzung bestimmt.
Überraschenderweise wurde gefunden, daß als Indikator für die schleimhautschützende Wirkung des sich im Darmschleim befindlichen Phosphatidylchohns die Bestimmung von MDR3-analogen Proteinen von diagnostischer Bedeutung ist (MDR = Multi Drug Resistance). Das Fehlen von MDR3-analogen Proteinen im terminalen lleum kann in diesem Zusammenhang ein Indikator für eine unzureichende Phospha- tidylcholinsekretion ins Darmlumen mit nachfolgender Veränderung der Schleimzusammensetzung im Dickdarm und gesteigerter Anfälligkeit gegenüber dort ansässigen Bakterien darstellen. Die unzureichende Produktion von MDR3-analogen Proteinen könnte so die reduzierte Menge an Phophatidylcholin im Darmlumen erklären. Im Sinne der vorliegenden Erfindung konnte gezeigt werden, daß im Mucosaepithel des terminalen lleum oder des Pouches bei Patienten mit Colitis ulcerosa kein
MDR3-analoges Protein vorhanden ist. Dadurch ist die Phosphatidylcholinsekretion in das Darmlumen deutlich vermindert, welches in Inkubationsexperimenten mit Biopsieproben bewiesen wurde. Somit ist ferner Gegenstand der vorliegenden Erfindung der Nachweis von MDR3-analogen Proteinen zur Diagnose der Colitis ulcerosa im terminalen lleum und Pouchepithel. Dies beinhaltet auch alle Erkrankungen, die mit verminderter Präsenz des MDR3-analogen Proteins einhergehen.
Aus der Korrelation zwischen der Konzentration oder Menge an MDR3-analogen Proteinen können auch Rückschlüsse auf die erforderliche optimale Menge an Phosphatidylcholin im Laufe der Therapie mit den erfindungsgemäßen Arzneimitteln gefolgert werden. Die Diagnose ermöglicht so eine individuelle Anpassung der erforderlichen Dosis an Phosphatidylcholin der zu behandelnden Patienten. Außerdem ermöglicht die Bestimmung des Phosphatidylchohns im Darmlumen eine unter dem Aspekt der Patientencompliance wichtige Verlaufskontrolle in der Therapie.
Die Bestimmung der MDR3-analogen Proteine erfolgt indirekt über die RT-PCR- Vermehrung der für diese Proteine codierenden RNA (genetische Information).
Das MDR3 Protein bzw. die MDR3 Proteine sind Phospholipidtransporter in Plasmamembranen. Die menschliche MDR (P-Glykoprotein) Genfamilie besteht aus zwei Mitgliedern (MDR1 und MDR3). Sie gehören entwicklungsgeschichtlich zur sehr alten Superfamilie der ABC-Transporter (ATP-Binding-C_assette). Diese Proteine transportieren unterschiedlichste Substrate (hydrophobe Moleküle, Oxyanio- nen, Cl" u.a.) von der Innenseite der Zelle über die Plasmamembran nach außen unter
Aufwendung von Energie (ATP). Die beiden homologen MDR Gene liegen im Genom hintereinander (MDR3 ca. 30 kb downstream von MDR1) und umfassen zusammen etwa 230 kb. Beide Gene bestehen aus jeweils 28 Exons, von denen 27 beim MDR3 die Kodierregion enthalten. Vom MDR3 Gen sind vier Splicevarianten be- kannt, von denen jede das Leseraster intakt läßt. In Variante C"M1 fehlt das gesamte
Exon 23 und führt so zu einer um 141 Nukleotide verkürzten Kodierregion. Exon 23 enthält die Transmembrandomäne 11. Ein Fehlen könnte zu einem Protein mit völlig unterschiedlicher Membrantopologie führen. In MDR3 exprimierenden Geweben sind das normale Transkript und dessen Varianten meist gleich abundant vertreten.
Das Produkt des MDRl-Gens ist verantwortlich für die Resistenz gegen verschiedene Cytostatika und gab der Familie ihren Namen: multidrug resistance (MDR). MDR3 ist eine membranständige, 170 kD große, energieabhängige Effluxpumpe für verschiedenste liphopile Substanzen. Wie bei anderen Mitgliedern der ABC-Trans- porter besteht MDRl aus zwei homologen Hälften, jede mit sechs transmembranen Domänen und einer Nukleotid-Bindungsstelle. MDR3 ist strukturell genauso aufgebaut, hat aber sowohl ein anderes gewebespezifisches Verteilungsmuster als auch eine andere Funktion, da es nicht zur "multidrug resistance" führt. In Mäusen, in welchen das entsprechende Maus-spezifische Gen (mdr2) ausgeschaltet wurde
(knock-out-Mausmodell), fand sich eine vollständige Unfähigkeit der Leber, Phosphatidylcholin in die Galle zu sezernieren. Man schloß daraus, daß auch MDR3 P-Glycoprotein für den Transport von Phosphatidylcholin aus der Leberzelle in die Galle verantwortlich ist. Über das Vorkommen von MDR3 im übrigen Ga- strointestinaltrakt wurde bisher in der Literatur nicht berichtet.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung in repräsentativer Weise.
Beispiel 1
Bestimmung von MDR3 -analogen Proteinen über MDR3-RNA im Gastrointestinal- trakt mittels RT-PCR
Zur Untersuchung einer möglichen Expression wurden Primer zur Amplifikation von MDR3 -spezifischen Transkripten synthetisiert. Ziel des Primerdesigns ist es, das gewünschte DNA-Segment spezifisch und effizient zu amplifizieren. Zur Gewährleistung der Spezifität werden die Primersequenzen aus Bereichen der MDR3-cDNA- Sequenz gewählt, in denen MDR3 und MDRl eine geringe Homologie aufweisen. Dabei sind Primer, die eine hohe Homologie zu MDRl aufweisen, deren 3 '-termi- nale Base sich jedoch von der MDRl-cDNA-Sequenz unterscheidet, auch MDR3- spezifisch. Um eine effiziente Amplifizierung des gewünschten DNA-Fragmentes sicherzustellen, müssen weitere Faktoren berücksichtigt werden. Die Primersequenz muß so gewählt werden, daß die Primer nicht in der Lage sind, über intramolekulare Wasserstoffbrückenbindungen Schleifenstrukturen oder über intermolekulare Bin- düngen Dimere zu bilden. Die Oligonukleotidlänge beträgt vorzugsweise 20 bis 25
Basenpaare. Der GC-Gehalt sollte im Bereich von 50 bis 60 % liegen. Die beiden Primer eines Primerpaares sollen nach Möglichkeit in verschiedenen Exons liegen, damit eine Amplifizierung genomischer DNA bei der PCR ausgeschlossen bzw. erkannt werden kann. Erfindungsgemäß wurden Primersequenzen ausgewählt, die eine zuverlässige und spezifische Amplifikation von MDR3-Sequenzen ermöglichen. Beispiele geeigneter Primer, die spezifisch für MDR3 sind, sind in der beigefügten Abbildung (Abb. 1, MDRl vs MDR3) mit Pfeilen entsprechend gekennzeichnet.
Legende zu Abb. 1 :
Homologie zwischen den cDNA-Sequenzen von MDRl und MDR3. Die obere Zeile zeigt jeweils die MDRl-, die untere die MDR3-Sequenz. Identische Basen sind durch senkrechte Striche zwischen den Sequenzen markiert. Sequenzen, von denen Primer abgeleitet werden können, sind fett gedruckt; die Orientierung der Primer ist durch Pfeile gekennzeichnet (5' — >3' bzw. 3'< 5').
Beispiel einer repräsentativen, MDR3 spezifischen PCR:
Als 5'-Primer wird ein 25 bp großes Oligonukleotid von bp 241 1-2435 der cDNA im Exon 20 ausgewählt. Der 3 '-Primer ist ein 33 bp großes Oligonukleotid von bp
3180-3148 und liegt im Exon 25. Das entstehende PCR-Produkt ist damit 769 bp groß. Mit diesem Primerpaar kann auch die Splicevariante C"141 in der RNA nachgewiesen werden, da hier das Exon 23 fehlt und so das entstehende PCR-Produkt um 141 Basenpaare verkürzt ist. Als Ausgangsmaterial für die RNA-lsolierung werden Biopsien verwendet, die bei Gastroskopien bzw. Koloskopien anfielen. Dabei werden jeweils 2 Biopsien eines Patienten zur Isolierung von RNA mit dem Fast-RNA Kit der Firma Dianova verwendet. Die Mengen an Gesamt RNA, die damit isoliert werden kann, beträgt bis zu 70 μg. Auf eine Isolierung von Poly(A+)RNA kann verzichtet werden, da die Menge an Transkript in der Gesamt-RNA bereits für einen PCR-Nachweis ausreichend ist.
5 μg Gesamt-RNA wird für eine Erststrang cDNA-Synthese eingesetzt. Die cDNA- Synthese und die PCR erfolgen mit dem ReadyToGo- System (Pharmacia) nach den Empfehlungen des Herstellers. 5 μg Gesamt-RNA werden revers in cDNA transkri- biert. Die PCR wird mit 2 von 33 μl cDNA und 10 pmol von jedem Primer in einem
Gesamtvolumen von 25 μl angesetzt. Die Amplifizierung wird wie folgt durchgeführt: Einmal 5 Minuten bei 94 °C, daran anschließend 33 Zyklen von 2 sec bei 94 °C , 2 sec bei 55 °C und 45 sec bei 72 °C. Die RT-PCR-Produkte werden durch Agaro- segelelektrophorese analysiert. Die Bedingungen für einen erfolgreichen Nachweis von MDR3 werden mit Leber-RNA ausgetestet, da hier eine besonders hohe Abun- danz an Transkripten vorliegt. Als interner Standard wird GAPDH amplifiziert, um die Menge an cDNA in den verschiedenen Ansätzen vergleichen zu können. Die eingesetzte Methodik eignet sich auch für die „Light Cycler"-Technologie (Röche Dia- gnostics GmbH oder die „Taq Man"-PCR Technologie (Perkin Eimer Applied Bio- Systems)), bei der eine große Anzahl von Proben gleichzeitig, schnell und (semi)quantitativ bestimmt werden kann.
Es werden Biopsien aus Osophagus, Magen, Duodenum, terminalem lleum, Colon transversum und Rektum untersucht. Bei gesunden Patienten konnten MDR3 -Transkripte in Magen, Duodenum und terminalem lleum nachgewiesen werden, während sie im Osophagus, Colon transversum und Rektum fehlten.
Der oben genannte Ansatz wird auch immer und in gleicher Menge die Splicevari- ante C"141 mitamplifziert. Die beiden PCR-Produkte wurden dann im pucl8 kloniert und ansequenziert. Dadurch konnte dokumentiert werden, daß es sich bei den ampli- fizierten Sequenzen wirklich um MDR3 handelt. Grundsätzlich ist es nach der oben beschriebenen Methode auch möglich, außer dem organspezifischen MDR3 -analogen Protein andere homologe Proteine im lleum nachzuweisen, wobei es sich bei diesen anderen homologen Proteinen beispielsweise um Isoformen des MDR3-ana- logen Proteins (z.B. Isoform des Leber oder Darm MDR3 -Proteins) handeln kann.
Beispiel 2
Expression von MDR3-analogen Proteinen (RNA) im ileoanalen Pouchepithel
Untersucht wurden Patienten, die aufgrund einer fortgeschrittenen Colitis ulcerosa colektomiert werden mußten und einen Pouch erhielten. Bei keinem dieser Colitis ulcerosa Patienten konnten in der Pouchschleimhaut MDR3-analoge Transkripte nachgewiesen werden. Es stellte sich deshalb die Frage, ob das Fehlen der Transkripte auf die Tatsache zurückzuführen war, daß es sich um Colitis ulcerosa Patienten handelte. Denkbar wäre auch, daß mit Anlegen eines Pouches per se und des damit einhergehenden veränderten bakteriellen Milieus für das terminale lleum ein ver- ändertes Expressionsmuster aufgetreten sein könnte. Deshalb wurden im Vergleich
Patienten untersucht, die einen Pouch nach Colektomie bei familiärer adenomatöse Polyposis (FAP) erhielten. Diese Patienten wiesen MDR3 -Transkripte im Pouch auf. Dies wies darauf hin, daß das Fehlen von MDR3 im Pouch spezifisch für die Colitis ulcerosa ist. Die dadurch möglicherweise bedingte verminderte Phosphatidylcholin- Sekretion in den Schleim könnte somit die beobachtete Pouchitis bahnen. Da die Pouchschleimhaut der des terminalen lleums entspricht, müßte folgerichtig bei Colitis ulcerosa auch in diesem Dünndarmabschnitt MDR3 fehlen.
Beipiel 3
Expression von MDR3 -analogen Proteinen (RNA) im terminalen lleum bei Gesunden, Patienten mit Morbus Crohn und Colitis ulcerosa
Es wurde untersucht, ob Colitis ulcerosa Patienten im terminalen lleum eine MDR3- analoge Expression zeigen. Analysiert wurden 31 Patienten mit Colitis ulcerosa und verglichen mit 14 Gesunden und 6 Morbus Crohn Patienten.
Bei keinem der Colitis ulcerosa Patienten konnte mit der verwendeten, hoch sensiti- ven Technik MDR3 -analoge RNA im terminalen lleum nachgewiesen werden, während es bei allen gesunden Kontrollpersonen und bei den Morbus Crohn Patienten nachweisbar war. Dieses eindeutige Ergebnis weist daraufhin, daß ausschließlich bei Colitis ulcerosa ein Defekt in der Expression des MDR3-Analogons vorliegt. Daraus kann geschlossen werden, daß bei diesen Patienten eine gestörte Phospholipidsekre- tion in den Darm vorliegt, welches die Schleimzusammensetzung so stört, daß Bakterien das Epithel eher angreifen können.

Claims

P a t e n t a n s p r ü c h e
1. Arzneimittel enthaltend als Wirkstoff Phosphatidylcholin in einer therapeutisch wirksamen Menge zur Behandlung von Erkrankungen, bei denen die schleimhautschützende Wirkung von Phophatidylcholin im Dickdarm vorteilhaft ist.
2. Arzneimittel nach Anspruch 1 zur Behandlung von Colitis ulcerosa.
3. Arzneimittel nach Anspruch 1 zur Behandlung von Pouchitis.
4. Arzneimittel nach Anspruch 1 zur Behandlung von Dickdarmerkrankungen oder von Entzündungen im Dickdarm (Morbus Crohn, Diversionscolitis, in- fektiöse Enteritis/Colitis, Entzündungen durch Bestrahlung, Antibiotika, Chemotherapeutica, Pharmaka oder Chemikalien).
5. Arzneimittel nach Anspruch 1 zur Behandlung oder Prophylaxe des Dickdarmcarcinoms.
6. Arzneimittel nach einem der Ansprüche 1 - 5 als rektal zu applizierende Arzneiform zur lokalen Behandlung von Entzündungen in Rektum oder Pouch.
7. Arzneimittel nach einem der Ansprüche 1- 5 als oral zu applizierende Arznei- form mit verzögerter Wirkstofffreisetzung im unteren lleum und Colon.
8. Verwendung von Phophatidylcholin zur Herstellung von Arzneimitteins zur Behandlung von Erkrankungen, bei denen die schleimhautschützende Wirkung von Phophatidylcholin im Dickdarm vorteilhaft ist.
Verfahren zur Bestimmung der An- oder Abwesenheit von MDR3 -Transkripten in einer Probe von Patienten mit Verdacht auf Vorliegen von Magen- und Darmerkrankungen, bei denen die Behandlung mit Phosphatidylcholin indiziert ist.
10. Verfahren nach Anspruch 9 zur Bestimmung von MDR3 -Transkripten bei Patienten mit Colitis ulcerosa.
1 1. Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, wobei die Probe erhältlich ist von Biopsien aus Osophagus, Magen, Duodenum, terminalem lleum, Colon transversum oder Rektum.
12. Verfahren zur Bestimmung von Phosphatidylcholin in einer Probe erhältlich aus Schleim von Rektum (Pouch) zum Nachweis von Colitis ulcerosa, Pouchitis, Dickdarmentzündungen, Morbus Crohn, Diversionscolitis, infektiöse Enteritis/Colitis, Entzündungen durch Bestrahlung, Antibiotika, Chemotherapeu- tica, Pharmaka oder Chemikalien, oder Dickdarmcarcinomen.
13. Diagnostischer Test zum Nachweis von Colitis ulcerosa, Pouchitis, Dickdarmentzündungen, Morbus Crohn, Diversionscolitis, infektiöse Enteritis/Colitis, Entzündungen durch Bestrahlung, Antibiotika, Chemotherapeutica, Pharmaka oder Chemikalien, oder Dickdarmcarcinomen, enthaltend MDR3-spezifische
Primer zum Nachweis von Mutationen in der MDR3-Genfamilie und ihrer Interaktionspartner (z.B. Transkriptionsfaktoren).
14. Diagnostischer Test nach Anspruch 13 enthaltend einen oder mehrere der fol- genden Primer:
Forward:
GCA AAG AAC GGA ACA GCC TG CCA TCA TGG CCATAG CTC ACG CAT CAA TGA CAC CAC TGA AC
ACC CTT CTC GAG CTA ACG TC CTG ATG AGG GCA CAA TTA AC CAG GAA GCC AGA TCC AGT CAG AAA GGC TGC CAC TAG AAT GG GTG TCA GAA GAG CCT TGA TGT GG
AGC AAT GCT AAG ACA GGA CAT GAG C GGA AAG ATT GCA ACA GAG GC GTG AAG AGG GGC TGAAGC CTG
Reverse:
GTT CAG TGG TGT CAT TGA TG GAC GTTAGC TCG AGA AGG GT GTT AAT TGT GCC CTC ATC AG CTG ACT GGA TCT GGC TTC CTG CCA TTC TAG TGG CAG CCT TT CCA CAT CAA GGC TCT TCT GAC AC GCC TCT GTT GCAATC TTT CC CAG GCT TCA GCC CCT CTT CAC
TCG GGT GGG ATA GTT GAA CAC G GGG CTC GGG CAA TAG CAA TCC TC
15. Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels zur lokalen Gentherapie im lleum mit dem idealen MDR3-analogen Gen bei Patienten mit fehlender oder verminderter Expression des MDR3-analogen Proteins.
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