WO2000006180A1 - Composicion para la estimulacion de la sintesis del pigmento melanico y procedimiento para su obtencion - Google Patents

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Carlos Manuel Miyares Cao
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Centro De Histoterapia Placentaria
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    • A61Q19/04—Preparations for care of the skin for chemically tanning the skin

Definitions

  • the present invention relates to the branch of Medicine
  • Vitiligo or leucoderma is a disease among the oldest known to civilization that is characterized by the loss of melanin pigment producing cells in the skin. This disease affects approximately 1% of the world population, without distinguishing age, sex, or race. It is of unknown etiology and without a defined therapy so far, manifesting itself by a gradual depigmentation of the skin of patients subjected to situations of extreme nervous tension, which adversely affects their psyche and social behavior once their external symptoms begin, under the aspect of white skin areas surrounded by a halo of hyperpigmentation, manifesting primarily in the face, trunk or joint regions.
  • psoralens are not free of toxic side effects, being able to cause dermatitis and skin necrosis when applied topically. In addition, its effect is slow and reversible in most cases when the medication is discontinued. On the other hand, these substances present difficulties for their application, which requires the gradual increase of the patient's daily exposure time to ultraviolet radiation, sometimes causing severe toxic reactions such as burns due to topical administration or liver failure, digestive, renal disorders and nervous with its oral administration.
  • Melagenina Lotion® is a 50% alcoholic extract of human placenta, which is obtained from healthy pregnant women in aseptic conditions after normal deliveries. This extract contains a lipopro protein of molecular weight between 1500-4000 Daltons, which constitutes its active substance. This substance stimulates the reproduction of melanocytes and the synthesis of the melanin pigment, also accelerating the oxidation of the amino acid L-Dopa in the presence of sunlight, which favors its transformation into melanin after internal chemical processes.
  • Melagenina Lotion® has been used successfully so far for the treatment of vitiligo. According to clinical trials, its use has achieved remarkable effectiveness in all patients where it has been applied (Miyares Cao C, Taboas M. and López H. "Preliminary report on the use of human placental extract in the therapy of Vitiligo ". Cuban Journal of Pharmacy 10
  • Melagenina Lotion® although it lacks harmful side effects, is a product that has to be used in three daily applications with an interval between them of 8 hours, and accompanied by solar or infrared exposure in one of the applications, which makes compliance difficult of treatment by a large part of the patients.
  • the novelty of the present invention consists of a new composition containing the same active ingredient of Melagenin Lotion®, in this case an alfalipoproin obtained from human placental cotyledons, by processing these active ingredient of Melagenin Lotion®, in this case an alfalipoproin obtained from human placental cotyledons, by processing these active ingredient of Melagenin Lotion®, in this case an alfalipoproin obtained from human placental cotyledons, by processing these
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) with organic solvents, and its subsequent redisolution in an ethanol solution with calcium chloride, which allows a product to be obtained that shows a synergistic effect between both components in its pigmenting effect, thus reducing the number of applications of said product of 1 every 8 hours by patients, at 1 every 24 hours, also eliminating the need to expose the patient to solar or infrared radiation after one of the applications.
  • the new product thus obtained hereinafter referred to as "Melagenin Plus", can be used by a single daily application, which constitutes the current practice in world therapeutics.
  • Said product stimulates the synthesis of the melanin skin pigment and the reproduction of the melanocytes as evidenced by the pharmacological tests to which it was subjected, totally lacking severe side reactions as demonstrated by the toxicological, teratological and clinical tests performed. It is easy to obtain and apply, and the repigmentation effect begins quickly (15 to 20 days) after starting treatment, being irreversible when discontinuing the application of the product.
  • the color acquired by the skin where it is applied is identical to the areas of the patient's normal skin, which in turn do not increase the intensity of their coloration later.
  • the raw material from which the active substance of the product is extracted is a human tissue, there are no immune reactions to fear, there are no contraindications regarding age, sex or race for its use. Obtaining the active substance of the Melagenin composition
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) filtered this macerated through thick gauze, allowing it to stand for 24 hours.
  • the supernatant was determined its pigmenting activity, which was positive 20 to 50 days after being used topically on Balb / C 57 BL 6 mouse ears.
  • the precipitate was washed again 2 to 10 times with 100 to 500 ml of acetone, dried under vacuum and at room temperature.
  • the product was redissolved in 90 to 96 ° alcohol containing 0.2 to 4.0 mg / ml calcium chloride.
  • Two protein peaks were obtained, the first from 100 to 300 ⁇ g / ml and the second from 20 to 150 ⁇ g / ml.
  • the pigmenting activity was positive for the second peak, appearing 10 or 20 days after the lyophilized mixture was used topically in the curl.
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) The lyophilized mixtures of both protein peaks were electrophoresed with polyacrylamide gel and agarose, the first being stained with a protein dye (black amido) and the second to detect lipids (sweat). In the protein electrophoresis a small colored band was observed followed by an uncoloured one, both migrated little; a well visible band was also noted in the albumin region. In lipid electrophoresis, only one band was observed in the region where alfalipoproproteins migrate.
  • D Melagenin Lotion with addition of calcium chloride in a concentration of 1 mg / ml (Melagenin Plus) 70% alcohol, 70% alcoholic solution with calcium chloride, 1 mg / ml, as well as Melagenin Lotion® and Melagenina Plus were applied by rubbing them with the fingers of the operator on the ears of the animals.
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) which allows, by microscopic observation, the melanocyte count per mm 2 in said histological structure.
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) black mice treated with Melagenin Lotion® and Melagenin Plus, with respect to the alcohol treated and untreated groups. The increase in the number of melanocytes was greater in animals treated with Melagenin Plus. Other differences found were:
  • Melagenin Lotion® and Melagenin Plus are applied interchangeably in biological tests, it was observed that in the case of Melagenin Plus the pigmenting effect on male curly nipples is visible in only 13 days, while with Melagenin Lotion® this occurs at 18 days. Similarly, in the tail of black mice, a higher concentration of melanin is observed when using Melagenin Plus when the cuts are treated by the histochemical method, where a greater increase in melanocytes in the basal region of the epidermis was observed. Studies of skin irritation of animals.
  • Melagenina Plus was applied to a group of animals in an area of 42 cm 2 with a dose of 20 mg / cm 2 and in that same animal
  • Lotion® 50% Alcoholic Placenta Human Extract
  • applying it topically by rubbing with the fingers on skin areas depigmented by the disease, on three daily occasions with 8-hour intervals (6.00 am, 2.00 pm and 10.00 pm).
  • the treated areas had to be exposed to infrared light lamps of 250 watts intensity, placed 40 cm away, for 15 minutes.
  • the drug application should be repeated every 5 minutes in that time interval.
  • the members of group II would use Melagenina Plus (Alcoholic Extract of Placenta Humana at " 50% containing Calcium Chloride) applying it in the same way 'but on a single daily occasion, without exposure to infrared radiation and with intervals of 24 hours The participants in the trial had to remain before their start without specific treatment.
  • Melagenina Plus Alcoholic Extract of Placenta Humana at " 50% containing Calcium Chloride
  • the patients object of the experience were evaluated monthly for a period of 6 months, set to compare in both groups the degree of repigmentation obtained with each product as well as the occurrence of side reactions.
  • Biopsies of depigmented skin areas were performed at the beginning and end of the experience in 5 patients from each group selected
  • the histological technique of L-Dopa oxidase was used to identify the melanocytes in them.
  • Tables II, III, IV and V The results obtained through said clinical trial are summarized in Tables II, III, IV and V., in which the number of their medical history for identification, age, sex, race have been considered as patient data. and the years they have been suffering from the disease. Among the parameters that have been evaluated are the% of depigmentation at the beginning and at the end of the treatment, the% of pigmentation reached and the bottles of the drug consumed during said treatment. Likewise, the analyzed areas corresponding to each of said treated patients (face, neck, trunk, limbs or genitals) are shown in the table relative to each type of treatment.
  • Figure 1 shows the melanocytopoietic action obtained by a black mouse ear test, using groups of

Abstract

La presente invención se relaciona con la rama de la Medicina Humana, y dentro de ella con la Dermatología, y en particular con una composición desarrollada para la estimulación de la síntesis del pigmento melánico de la piel, y por lo tanto útil en el tratamiento del vitiligo. El objetivo técnico de la presente invención es proporcionar una composición de un producto de origen natural útil en el tratamiento del vitiligo, el cual no posee efectos tóxicos y no recidiva de la enfermedad. La composición obtenida estimula la síntesis del pigmento melánico de la piel y la reproducción de los melanocitos según se demostró en los ensayos farmacológicos a que fue sometido, careciendo totalmente de reacciones secundarias severas como demuestran los ensayos toxicológicos, teratológicos y clínicos realizados. El producto obtenido es de fácil obtención y aplicación, el efecto repigmentante comienza rápidamente después de iniciar el tratamiento, siendo irreversible al descontinuar su aplicación. El color adquirido es idéntico al de las áreas de la piel normal del paciente, las cuales a su vez no incrementan posteriormente la intensidad de su coloración. El producto obtenido puede también ser empleado para el tratamiento cualquier proceso de despigmentación de la piel, por ejemplo aquel que se produce debido a las quemaduras.

Description

COMPOSICIÓN PARA LA ESTIMULACIÓN DE LA SÍNTESIS DEL PIGMENTO MELÁNICO Y PROCEDIMIENTO PARA SU OBTENCIÓN.
Sector Técnico La presente invención se relaciona con la rama de la Medicina
Humana, y dentro de ella con la Dermatología, y en particular con una composición desarrollada para la estimulación de la síntesis del pigmento melánico de la piel, y por lo tanto útil en el tratamiento del vitíligo, así como con el procedimiento de obtención de dicha composición.
Técnica Anterior
El vitíligo o leucoderma es una enfermedad dentro de las más antiguas conocidas por la humanidad que se caracteriza por la pérdida de las células productoras del pigmento melánico en la piel. Esta enfermedad afecta aproximadamente al 1% de la población mundial, sin distinguir edad, sexo, ni raza. Es de etiología desconocida y sin una terapéutica definida hasta el momento, manifestándose por una gradual despigmentación de la piel de los pacientes sometidos a situaciones de tensión nerviosa extrema, lo cual afecta desfavorablemente su psiquismo y conducta social una vez que se inician sus síntomas externos, bajo el aspecto de áreas de piel blanca rodeadas por un halo de hiperpigmentación, manifestándose fundamentalmente en la cara, tronco o regiones articulares.
Es conocido del estado , de la técnica que ciertas sustancias químicas de origen vegetal o producidas semi- sintéticamente denominadas psoralenos, pueden ser empleadas para el tratamiento del vitíligo. Estas sustancias, al ser administradas por vía oral o tópica, se concentran en los melanocitos o células productoras del pigmento dérmico, absorbiendo la energía proveniente de la radiación ultravioleta y promoviendo la producción de dicho pigmento, la melanina (Arnold, M. J. Jr. "Psoralens and Suntan" Hawaii Med. J. 1957-16391); (Becker, S.W. Jr. "Methods of increasing skin pigmentation" J. Sec. Cosmetic
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) Ehem. 1958-9-80); (Fitzpatrick, T.B. "Pigmentary Diseases" Current Therapy 1958-314); (Becker, S.W. Jr. "Effects of 8-Methoxy Psoralen and ultraviolet light in human skin". Science 1958-127-878); (Sidi, E. Planat, P. "Practical considerations on actual treatment of vitíligo" Revue of Medicins, 1968-23 Dec).
Sin embargo, los psoralenos no están exentos de efectos tóxicos secundarios, siendo capaces de producir dermatitis y necrosis de la piel al ser aplicadas por vía tópica. Además, su efecto es lento y reversible en la mayoría de los casos al descontinuar la medicación. Por otra parte estas sustancias presentan dificultades para su aplicación, la cual requiere el incremento gradual del tiempo de exposición diario del paciente a la radiación ultravioleta, provocando en ocasiones reacciones tóxicas severas como quemaduras debido a su administración tópica o insuficiencia hepática, trastornos digestivos, renales y nerviosos con su administración por vía oral.
La solución técnica análoga más cercana conocida a la presente invención es la Melagenina Loción®, Patente No. FR 8220746.
La Melagenina Loción® es un extracto alcohólico al 50% de placenta humana, la cual se obtiene de mujeres gestantes sanas en condiciones asépticas luego de partos normales. Este extracto contiene una lipopro teína de peso molecular entre 1500 - 4000 Daltons, la cual constituye su principio activo. Esta sustancia estimula la reproducción de los melanocitos y la síntesis del pigmento melánico, acelerando además la oxidación del aminoácido L-Dopa en presencia de luz solar, lo que favorece su transformación en melanina luego de procesos químicos internos.
La Melagenina Loción® ha sido utilizada exitosamente hasta el momento para el tratamiento del vitíligo. De acuerdo a los ensayos clínicos realizados, su uso ha alcanzado una efectividad notable en todos los pacientes donde se ha aplicado (Miyares Cao C, Taboas M. y López H. "Informe preliminar sobre el empleo de extracto placentario humano en la terapéutica del Vitíligo". Revista Cubana de Farmacia 10
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) (1). 1976; Miyares Cao C. y colaboradores. Estudio experimental y clínico del efecto pigmentante epidérmico del extracto placentario humano". Revista Cubana de Farmacia. Volumen 20, No. 6, Noviembre-Diciembre 1981 ; Sharma S. K.,. Jain R. K and Sharma A. K. Topical human placental extract for the treatment of Vitíligo, A preliminary study; Miyares C. Y colaboradores: Estudio experimental y clínico del efecto pigmentante epidérmico del extracto placentario humano. Annais Brasileiros de Dermatología. 1986: 61 : 3 (suplemento); Miyares Cao C. Melagenina Producto Cubano. Nuevo y Eficaz medicamento para el tratamiento del Vitíligo. Serie de Reseñas Nacionales. Ed. Palacio de las Convenciones. La Habana, Pag. 15. 1986).
La Melagenina Loción®, aunque carece de efectos nocivos colaterales, es un producto que tiene que ser utilizado en tres aplicaciones diarias con intervalo entre ellas de 8 horas, y acompañada de exposición solar o infrarroja en una de las aplicaciones, lo cual dificulta el cumplimiento del tratamiento por una gran parte de los pacientes.
Igualmente es conocido del estado de la técnica que el calcio tiene una participación activa en le proceso de pigmentación de la piel, mediante la estimulación de la actividad secretora de los melanocitos, en relación con la concentración de este ion (Meyer, A. 1986. Influence of calcium on the melanocytes in the inner éar. Abst; 13* International Pigment Cell Conference Oct. 5-6, Tucson, Arizona, USA; Negishi, S. 1986. The role of calcium in light response of onyzias melonophores.
Abst; 13* International Pigment Cell Conference Oct. 5-6, Tucson, Arizona, USA). Divulgación de la invención
La novedad de la presente invención consiste en una nueva composición conteniendo el mismo principio activo de la Melagenina Loción®, en este caso una alfalipopro teína obtenida a partir de los cotiledones placentarios humanos, mediante el procesamiento de éstos
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) con solventes orgánicos, y su posterior redisolución en una solución de etanol con cloruro de calcio, lo cual permite que se obtenga un producto que muestra un efecto sinérgico entre ambos componentes en su efecto pigmentante, reduciéndose así el número de aplicaciones de dicho producto de 1 cada 8 horas por pacientes, a 1 cada 24 horas, eliminándose además la necesidad de exponer al paciente a radiaciones solares o infrarrojas luego de alguna de las aplicaciones.
El nuevo producto así obtenido, denominado en lo adelante "Melagenina Plus", puede ser empleado mediante una sola aplicación diaria, lo que constituye la práctica actual en la terapéutica mundial.
Dicho producto estimula la síntesis del pigmento melánico de la piel y la reproducción de los melanocitos como demuestran los ensayos farmacológicos a que fue sometido, careciendo totalmente de reacciones secundarias severas como demuestran los ensayos toxicológicos, teratológicos y clínicos realizados. Es de fácil obtención y aplicación, y el efecto repigmentante comienza rápidamente (15 a 20 días) después de iniciar el tratamiento, siendo irreversible al descontinuar la aplicación del producto. El color adquirido por la piel donde se aplica es idéntico al de las áreas de la piel normal del paciente, las cuales a su vez no incrementan la intensidad de su coloración posteriormente.
Como la materia prima de donde se extrae el principio activo del producto es un tejido humano, tampoco se producen reacciones inmunológicas que temer, no existiendo contraindicaciones referentes a edad, sexo o raza para su uso. Obtención del principio activo de la composición Melagenina
Plus.
Para la obtención del principio activo de la presente invención se llevó a cabo el siguiente procedimiento:
Se utilizó un kilogramo de cotiledones placentarios que se dejaron congelar durante 7 a 10 días, después de lo cual fueron triturados y macerados con etanol de 90 a 96° a partes iguales peso/volumen. Se
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) filtró este macerado a través de gasa tupida, dejándose reposar durante 24 horas.
Al sobrenadante se le determinó su actividad pigmentante, la que fue positiva de 20 a 50 días después de ser utilizado en forma tópica sobre orejas de ratón Balb/C 57 BL 6.
A 200 mi de este extracto con el factor pigmentante se le añaden mediante una aguja hipodérmica 10 mi de una solución saturada de ácido benzoico en etanol de 90 a 96° confeccionada disolviendo de 2 a 8 g de ácido benzoico en 5 a 12 mi de etanol de 90 a 96°. La mezcla se agitó de 10 a 50 minutos y se filtró con papel de filtro Whatman No. 2 a 5. A continuación se realizó un lavado del precipitado obtenido con 200 a 500 mi de una solución saturada de ácido benzoico en agua destilada confeccionada disolviendo de 2 a 10 g de ácido benzoico en 300 a 1000 mi de agua destilada. Después se removió el precipitado del papel de filtro y se le añadió a éste de 100 a 500 mi de acetona pura al 30 %, se centrifugó a 1500 rpm durante 10 a 30 minutos, descartándose el sobrenadante.
Se volvió a lavar de 2 a 10 veces más el precipitado con 100 a 500 mi de acetona, secándose al vacío y a temperatura ambiente. El producto fue redisuelto en alcohol de 90 a 96° que contiene cloruro de calcio 0.2 a 4.0 mg/ml.
Cinco mi del anterior producto con actividad biológica se filtraron a través de Sephadex G-30 ó 100 equilibrando con buffer fosfato de sodio 5 x 10'1 a 5 x 10"6 moles, pH = 4 a 8, el cual fue empaquetado en una columna de 1 a 3 cm de ancho y de 18 a 40 cm de altura. El flujo fue de 10 a 30 gotas por minuto y las fracciones recolectadas de 5 a 10 mi cada una.
Se obtuvieron dos picos proteicos, el primero de 100 a 300 μg/ml y el segundo de 20 a 150 μg/ml. La actividad pigmentante fue positiva para el segundo pico, apareciendo a los 10 ó 20 días después de ser utilizada tópicamente la mezcla liofilizada en el curiel.
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) Las mezclas liofilizadas de ambos picos proteicos se corrieron en electroforesis con gel de poliacrilamida y en agarosa, tiñéndose la primera con un colorante para proteínas (amido black) y la segunda para detectar lípidos (sudan). En la electroforesis de proteínas se observó una banda pequeña coloreada seguida de otra sin colorear, ambas migraron poco; también se notó una banda bien visible en la región de la albúmina. En la electroforesis de lípidos solo se observó una banda en la región en que migran las alfalipopro teínas.
Efecto pigmentante sinérgico de la Melagenina y el Calcio. La evaluación de la actividad melanocitopoyética del producto resultante se realizó mediante la aplicación tópica de la Melagenina Plus durante un período de tiempo de 5 días consecutivos en una ocasión diaria sobre la epidermis de las orejas de ratones negros de la cepa B6 D2. Para el ensayo se utilizaron 60 ratones negros separados en 4 grupos denominados A, B, C y D e integrados por 5 ratones cada uno, a los cuales se les aplicaron los siguientes tratamientos. Grupo Tratamiento tópico diario
A Alcohol 70 %, como vehículo de la Melagenina®
(Control) B Solución alcohólica al 70 % con adición de cloruro de calcio en concentración 1 mg/ml C Melagenina Loción®
D Melagenina Loción con adición de cloruro de calcio en concentración de 1 mg/ml (Melagenina Plus) El alcohol al 70 %, la solución alcohólica al 70 % con cloruro de calcio, 1 mg/ml, así como la Melagenina Loción® y la Melagenina Plus fueron aplicados frotándolos con los dedos del operador sobre las orejas de los animales.
Concluido el tiempo de tratamiento se dejan transcurrir 48 horas y se sacrifican los animales para posteriormente extraerles la epidermis de las orejas y someterlos a la técnica histoquímica de la L-Dopa oxidasa,
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) que permite, mediante la observación microscópica, el conteo de melanocitos por mm2 en dicha estructura histológica.
Para determinar el número de melanocitos por mm2 se seleccionan 5 áreas diferentes de la zona más densamente poblada de cada oreja y utilizando un programa particular elaborado para este fin (sección específica para conteo de células) se determinó el número de células por mm2 en cada una de las 5 zonas de manera que se obtienen 150 valores de melanocitos por mm2 para cada grupo (15 animales por grupo y 10 conteos por cada animal). Los valores obtenidos en el conteo de melanocitos por mm2 fueron sometidos a análisis de varianza de clasificación simple y con posterioridad a un test de Kruskal-Wallis y test Student Newman-Keuls
(SNK), a fin de determinar entre cuáles grupos existían diferencias significativas. Los resultados obtenidos mediante la experiencia se pueden observar en la Tabla I, y quedando gráficamente mostrados en la Figura 1.
Tabla I
Test de Kruskal-Wallis
Cantidad de melanocitos/ mm2 X N
180 . 66 a 150
111 . 29 b 150
66 . 83 c 150
62 . 79 c 150 para p< 0.001
a= Melagenina Plus b= Melagenina Loción c= Alcohol al 70 % + Calcio 1 mg/ml d= alcohol al 70 % Se observó que para p < 0.001 existió un incremento significativo del número de melanocitos/ mm2 en la epidermis de las orejas de los
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) ratones negros tratados con Melagenina Loción® y Melagenina Plus, respecto a los grupos tratados con alcohol y sin tratar. El incremento del número de melanocitos fue mayor en los animales tratados con Melagenina Plus. Otras diferencias encontradas fueron:
• Existen diferencias significativas entre los resultados obtenidos empleando Melagenina Plus y empleando Melagenina Loción® solamente.
• Existen diferencias significativas entre los resultados obtenidos empleando Melagenina Plus y empleando alcohol más calcio solamente.
• Existen diferencias significativas entre los resultados obtenidos empleando Melagenina Plus y empleando alcohol solamente.
• Existen diferencias significativas entre los resultados obtenidos empleando Melagenina Loción® y empleando alcohol más calcio.
• Existen diferencias significativas entre los resultados obtenidos empleando Melagenina Loción® y el grupo Control tratado con alcohol solamente.
• No existen diferencias significativas entre el grupo Control y el grupo tratado con alcohol más calcio.
Adicionalmente se comprobó que cuando se aplican indistintamente la Melagenina Loción® y la Melagenina Plus en ensayos biológicos, se observó que en el caso de la Melagenina Plus el efecto pigmentante en pezones de curíeles machos es visible en sólo 13 días, mientras que con la Melagenina Loción® esto ocurre a los 18 días. De igual forma en la cola de los ratones negros se observa mayor concentración de melanina al utilizar Melagenina Plus cuando los cortes son tratados por el método histoquímico, donde se observó a un mayor incremento de los melanocitos en la región basal de la epidermis. Estudios de irritación en piel de animales.
Se aplicó el producto Melagenina Plus a un grupo de animales en un área de 42 cm2 con una dosis de 20 mg/cm2 y en ese mismo animal
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) se aplicó el solvente.
Durante las dos semanas del experimento no se observó ningún tipo de irritación o afectación en la piel. Los estudios histopatológicos no reflejan daño. Como conclusión se puede señalar que el producto Melagenina
Plus no produce irritación en la piel.
Ensayos clínicos en humanos.
Para llevar a cabo estos ensayos, se seleccionaron aleatoriamente, 30 pacientes enfermos de vitíligo. Los pacientes fueron separados en dos grupos de forma alterna denominados I y II, e integrados por 15 pacientes cada uno.
A los pertenecientes al grupo I se les indicó utilizar Melagenina
Loción® (Extrato Alcohólico de Placenta Humana al 50 %) aplicándola tópicamente mediante frotación con los dedos sobre las áreas de piel despigmentadas por la enfermedad, en tres ocasiones diarias con intervalos de 8 horas (6.00 am, 2.00 pm y 10.00 pm).
En una de estas ocasiones las áreas tratadas debían exponerse a lámparas de luz infrarroja de 250 watts de intensidad, colocadas a 40 cm de distancia, durante 15 minutos. La aplicación del medicamento debe repetirse cada 5 minutos en ese intervalo de tiempo.
A su vez los integrantes del grupo II utilizarían Melagenina Plus (Extracto Alcohólico de Placenta Humana al" 50% conteniendo Cloruro de Calcio) aplicándola de igual' forma pero en una sola ocasión diaria, sin la exposición a la radiación infrarroja y con intervalos de 24 horas. Los participantes en el ensayo debieron permanecer antes de su inicio sin tratamiento específico alguno.
Los pacientes objeto de la experiencia fueron evaluados mensualmente durante un período de tiempo de 6 meses, fijado para comparar en ambos grupos el grado de repigmentación obtenido con cada producto así como la aparición de reacciones secundarias.
Se practicaron biopsias de áreas de piel despigmentadas al inicio y final de la experiencia en 5 pacientes de cada grupo seleccionados
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) aleatoriamente.
La técnica histológica de L-Dopa oxidasa fue utilizada para identificar los melanocitos en las mismas.
Conjuntamente se determinaron las diferencias en el consumo de frascos del medicamento en cada grupo.
Para el procedimiento del análisis estadístico del porcentaje de reducción de la superficie corporal despigmentada en cada grupo, así como para la determinación de la misma por paciente, se utilizó un programa elaborado con tal objetivo (Coyula, R. Automatización de la Creación de Historia Clínica de los enfermos de Vitíligo. Ira Conferencia Latinoamericana de Aplicaciones de la Matemática y la Computación a la Biología. CENIC, 31 Oct. - 30 Nov. 1991 , La Habana, Cuba).
Los resultados obtenidos mediante dicho ensayo clínico se resumen en las Tablas II, III, IV y V., en las cuales se han considerado como datos de los pacientes el número de su historia clínica para su identificación, la edad, el sexo, la raza y los años que llevan padeciendo de la enfermedad. Entre los parámetros que se han evaluado se encuentran el % de despigmentación al inicio y al finalizar el tratamiento, el % de pigmentación alcanzado y los frascos del medicamento consumidos durante dicho tratamiento. Así mismo, las áreas analizadas correspondientes a cada uno de dichos pacientes tratados (cara, cuello, tronco, extremidades o genitales) se muestran en la tabla relativa a cada tipo de tratamiento.
Tabla II: Resultados alcanzados empleando la Melagenina Loción®
Figure imgf000013_0001
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) Tabla III: Áreas analizadas en pacientes tratados con Melagenina Loción ®
Figure imgf000014_0001
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) Tabla IV: Resultados alcanzados empleando la Melagenina
Plus.
Figure imgf000015_0001
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) Tabla V: Áreas analizadas en pacientes tratados con Melagenina Plus
Figure imgf000016_0001
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) A partir de las tablas anteriores puede observarse que luego de concluidos los 6 meses de tratamiento, se aprecia un valor promedio de disminución de la superficie corporal despigmentada por la enfermedad de 59.1 1% en el grupo tratado con Melagenina Loción® y del 50.79% en el tratado con Melagenina Plus, sin apreciarse diferencia significativa alguna entre ambos resultados para un valor p < 0.05.
No se registraron reacciones secundarias locales o sistémicas en los pacientes de los grupos sometidos al ensayo.
Las biopsias practicadas en los 5 pacientes cada grupo mostraron la reaparición de los melanocitos en las áreas de vitíligo seleccionadas para el estudio histológico pre y post tratamiento.
Finalmente se observó un mayor consumo de frascos de medicamento en el grupo tratado con Melagenina Loción® con un total de 264 y un promedio de 17,6 frascos por pacientes en los 6 meses que duró la experiencia, respecto al grupo tratado con Melagenina Plus, en el cual solo se utilizaron 56 frascos, con un promedio de 3.7 frascos por pacientes en igual tiempo.
El estudio histológico realizado demostró que el efecto repigmentante de ambos productos sobre las áreas afectadas por vitíligo se debe a que los mismos inducen la reproducción de los melanocitos en dichos sitios de nuevo.
La ausencia de reacciones secundarias locales sistemáticas reafirma la inocuidad de ambos productos. .
La acción sinérgica de Calcio y la Melagenina facilita el cumplimiento del tratamiento por parte de las pacientes de vitíligo, reduciéndose el número de aplicaciones diarias del producto y por consiguiente el consumo de frascos en cada tratamiento. Asimismo la nueva formulación permite que se elimine la necesidad de exponer al paciente a radiaciones solares o infrarrojas luego de la aplicación. Breve descripción de las Figuras.
La Figura 1 muestra la acción melanocitopoyética obtenida mediante un ensayo en oreja de ratón negro, empleando grupos de
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) animales a los cuales se les aplicaron diferentes tratamientos: A = Melagenina Plus B = Melagenina Loción C = Alcohol al 70 % + Calcio 1 mg/ml D = Alcohol al 70 %
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26)

Claims

REIVINDICACIONES
1. Procedimiento para la obtención de una composición para la estimulación de la síntesis del pigmento melánico caracterizado porque comprende los siguientes pasos:
- un kilogramo de cotiledones placentarios congelados es triturado y macerado con etanol de 90 a 96° a partes iguales peso /volumen, el macerado se filtra dejándose reposar durante 24 horas, - 200 mi del extracto conteniendo el factor pigmentante se le añaden una solución saturada de ácido benzoico en etanol de 90 a 96°,
- la mezcla se agita de 10 a 50 minutos y se filtra,
- lavado del precipitado obtenido con una solución saturada de ácido benzoico en agua destilada, se remueve el precipitado y se le añade acetona al 30 %,
- se centrifuga el extracto a 1500 rp durante 10 a 30 minutos descartándose el sobrenadante,
- lavado nuevamente del precipitado con acetona, secándose al vacío y a temperatura ambiente,
- redisolución del producto en alcohol de 90 a 96° conteniendo cloruro de calcio 0.2 a 4.0 mg/ml,
- filtración del producto obtenido mediante Sephadex equilibrando con buffer fosfato de sodio pH = 4 a 8. 2. Composición para la estimulación de la síntesis del pigmento melánico caracterizada porque está constituida por una mezcla de extracto alcohólico de placenta humana al 50% conteniendo cloruro de calcio a una concentración entre 0.
2 y 4.0 mg/ml
3. Uso de una mezcla de extracto alcohólico de placenta humana al 50% conteniendo cloruro de calcio a una concentración entre 0.2 y 4.0 mg/ml para la fabricación de un medicamento útil en el tratamiento del vitíligo caracterizado porque dicha
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) mezcla se aplica tópicamente a los pacientes mediante frotación con los dedos en las áreas afectadas como una única aplicación diaria, sin necesidad de exposición a la radiación infrarroja y tópicamente durante un periodo de tratamiento entre 6 meses y un año, en dependencia de la afectación de la enfermedad.
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26)
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