MXPA01001014A - Composicion para la estimulacion de la sintesis del pigmento melanico y procedimiento para su obtencion. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se relaciona con la Medicina Humana y dentro de ella, con la Dermatologia y particularmente, con una composicion desarrollada para la estimulacion del sintesis del pigmento melanico de la piel y por lo tanto, util en el tratamiento del vitiligo. La presente invencion proporciona la composicion de un producto de origen natura util en el tratamiento del vitiligo, el cual no posee efectos toxicos y no origina la reaparicion de la enfermedad. La composicion obtenida estimula la sintesis del pigmento melanico de la piel y la reproduccion de los melanocitos, careciendo totalmente de reacciones secundarias severas. El producto obtenido es de facil obtencion y aplicacion, el efecto repigmentante comienza rapidamente despues de iniciar el tratamiento, siendo irreversible al descontinuar su aplicacion. El color adquirido es identico al de las areas de la piel normal del paciente, las cuales a su vez, no incrementan posteriormente la intensidad de su coloracion. El producto obtenido puede tambien ser empleado para el tratamiento de cualquier proceso de despigmentacion de la piel, por ejemplo aquel que se produce debido a las quemaduras.

Description

COMPOSICIÓN PARA LA ESTIMULACIÓN DE LA SÍNTESIS DEL PIGMENTO MELÁNICO Y PROCEDIMIENTO PARA SU OBTENCIÓN CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con la Medicina Humana y dentro de ella, con la Dermatología y particularmente, con una composición desarrollada para la estimulación de la síntesis del pigmento melánico de la piel y por lo tanto, útil en el tratamiento del vitíligo, así como con el procedimiento de obtención de dicha composición.

ARTE PREVIO El vitíligo o leucoderma es una enfermedad dentro de las más antiguas conocidas por la humanidad, que se caracteriza por la pérdida de las células productoras del pigmento melánico en la piel. Esta enfermedad afecta aproximadamente al 1% de la población mundial, sin distinguir edad, sexo, ni raza. Es de etiología desconocida y sin una terapéutica definida hasta el momento, manifestándose por una gradual despigmentación de la piel de los pacientes sometidos a situaciones de tensión nerviosa externa, lo cual afecta desfavorablemente su psiquismo y conducta social, una vez que se inician sus síntomas externos, bajo el aspecto de áreas de piel blanca rodeadas por un halo de hiperpigmentación, manifestándose fundamentalmente en la cara, tronco o regiones articulares.

Es conocido en el estado de la técnica, que ciertas sustancias químicas de origen vegetal o producidas semi-sintéticamente denominadas psoralenos, pueden ser empleadas para el tratamiento del vitíligo. Estas sustancias, al ser administradas por vía oral o tópica, se concentran en los melanocitos o células productoras del pigmento dérmico, absorbiendo la energía proveniente de la radiación ultravioleta y promoviendo la producción de dicho pigmento, la melanina (Arnold, M. J. Jr. Psoralens and Suntan" Hawai Med. J. 1957-16391 ), (Becker, S.W. Jr., "Methods of increasing skin pigmentation" J. Sec. Cosmetic Ehem. 1958-9-80), (Fitzpatrick, T.B. "Pigmentary Diseases" Current Therapy 1958-314), (Becker, S.W. Jr. "Effects of 8-Methoxy Psoralen and ultraviolet light in human skin", Science 1958-127-878), (Sidi, E. Planat, P. "Practical considerations on actual treatrnent of vitíligo" Revue of Medicins, 1968-23 Dec).

Sin embargo, los psoralenos no están exentos de efectos tóxicos secundarios, siendo capaces de producir dermatitis y necrosis de la piel al ser aplicadas por vía tópica. Además, su efecto es lento y reversible en la mayoría de los casos al descontinuar la mediación.

Por otra parte estas sustancias presentan dificultades para su aplicación, la cual requiere el incremento gradual del tiempo de exposición diario del paciente a la radiación ultravioleta, provocando en ocasiones reacciones tóxicas severas como quemaduras debido a su administración tópica o insuficiencia hepática, trastornos digestivos, renales y nerviosos con su administración por vía oral.

La solución técnica análoga más cercana conocida a la presente invencsión es la Melagenina Loción® es un extracto alcohólico al 50% de placenta humana, la cual se obtiene de mujeres gestantes sanas en condiciones asépticas luego de partos normales. Este extracto contiene una lipoproteína de peso molecular entre 1500 - 4000 Daltons, la cual constituye su principio activo. Esta sustancia estimula la reproducción de los melanocitos y la síntesis del pigmento melánico, acelerando además la oxidación del aminoácido L-Dopa en presencia de luz solar, lo que favorece su transformación en melanina luego de procesos químicos internos.

La Melagenina Loción® ha sido utilizada exitosamente hasta el momento para el tratamiento del vitíligo. De acuerdo a los ensayos clínicos realizados, su uso ha alcanzado una efectividad notable en todos los pacientes donde se ha aplicado (Miyares Cao C, Taboas M. y López h. "Informe preliminar sobre el empleo de extracto placentario humano en la terapéutica del Vitíligo". Revista Cubana de Farmacia 10. (1 ). 1976, Miyares Cao C. y colaboradores. "Estudio experimental y clínico del efecto pigmentante epidérmico del extracto placentario humano". Revista Cubana de Farmacia. Volumen 20, No. 6, Noviembre-Diciembre 1981 , Sharma S. K., Jain R. K and Sharma A.K. Topical human placental extract for the treatment of Vitíligo, A preliminary study; Miyares C. y colaboradores: Estudio experimental y clínico del efecto pigmentante epidérmico del extracto placentario humano. Annais Brasileiros de Dermatología. 1986:61 :3 (suplemento), Miyares Cao C. Melagenina Producto Cubano. Nuevo y Eficaz medicamento para el tratamiento del Vitíligo . Serie de Reseñas Nacionales. Ed. Palacio de las Convenciones. La Habana, Pag.15. 1986).

La Melagenina Loción®, aunque carece de efectos nocivos colaterales, es un producto que tiene que ser utilizado en tres aplicaciones diarias con intervalo entre ellas de 8 horas y acompañada de exposición solar o infrarroja en una de las aplicaciones, lo cual dificulta el cumplimiento del tratamiento por una gran parte de los pacientes.

Igualmente es conocido del estado de la técnica que el calcio tiene una participación activa en el proceso de pigmentación de la piel, mediante la estimulación de la actividad secretora de los melanocitos, en relación con la concentración de este ion (Meyer, A. 1986. Influence of calcium on the melanocytes in the inner ear. Abst; 13th International Pigment Cell Conference Oct. 5.6, Tucson, Arizona, USA; Negishi, S. 1986. The role of calcium in light response of onyzias melonophores. Abst; 13th International Pigment Cell Conference Oct. 5-6, Tucson, Arizona, USA).

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La novedad de la presente invención consiste en una nueva composición que contiene el mismo principio activo de la Melagenina Loción®, en este caso una alfalipoproteína obtenida a partir de los cotiledones placentarios humanos, mediante el procesamiento de éstos con solventes orgánicos y su posterior redisolución en una solución de etanol con cloruro de calcio, lo cual permite que se obtenga un producto que muestra un efecto sinérgico entre ambos componentes en su efecto pigmentante, reduciéndose así el número de aplicaciones de dicho producto de 1 cada 8 horas por paciente, a 1 cada 24 horas, eliminándose además la necesidad de exponer al paciente a radiaciones solares o infrarroja luego de algunas de las aplicaciones.

El nuevo producto así obtenido, denominado de aquí en adelante "Melagenina Plus", puede ser empleado mediante una sola aplicación diaria, lo que constituye la práctica actual en la terapéutica mundial.

Dicho producto estimula la síntesis del pigmento melánico de la piel y la reproducción de los melanocitos como demuestran los ensayos farmacológicos a que fue sometido, careciendo totalmente de reacciones secundarias severas como demuestran los ensayos toxicológicos, teratológicos y clínicos realizados. Es de fácil obtención y aplicación y el efecto repigmentante comienza rápidamente (15 a 20 días) después de iniciar el tratamiento, siendo irreversible al descontinuar la aplicación del producto. El color adquirido por la piel donde se aplica es idéntico al de las áreas de la piel normal del paciente, las cuales a su vez, no incrementan la intensidad de su coloración posteriormente.

Come la materia prima de donde se extrae el principio activo del producto es un tejido humano, tampoco se producen reacciones inmunológicas que temer, no existiendo contraindicaciones referentes a edad, sexo o raza para su uso.

-.. Obtención del principio activo de la composición Melagenina Plus Para la obtención del principio activo de la presente invención se llevó a cabo el siguiente procedimiento: Se utilizó un kilogramo de cotiledones placentarios que se dejaron congelar durante 7 a 10 días, después de lo cual, fueron triturados y macerados con etanol de 90 a 96° a partes iguales peso/volumen. Se filtró este macerado a través de gasa tupida, dejándose reposar durante 24 horas.

Al sobrenadante se le determinó su actividad pigmentante, la que fue positiva de 20 a 50 días después de ser utilizado en forma tópica sobre orejas de ratón Balb/C 57 BL 6.

A 200 ml de este extracto con el factor pigmentante se le añaden mediante una aguja hipodérmica, 10 ml de una solución saturada de ácido benzoico en etanol de 90 a 96° confeccionada disolviendo de 2 a 8 g de ácido benzoico en 5 a 12 ml de etanol de 90 a 96°.

La mezcla se agitó de 10 a 50 minutos y se filtró con papel de filtro Whatman No. 2 a 5. A continuación se realizó un lavado del precipitado obtenido con 200 a 500 ml de una solución saturada de ácido benzoico en agua destilada confeccionada disolviendo de 2 a 10 g de ácido benzoico en 300 a 1000 ml de agua destilada.

- »• - * Después se removió el precipitado de papel de filtro y se le añadió a éste, de 100 a 500 ml de acetona pura al 30%, se centrifugó a 1500 rpm durante 10 a 30 minutos, descartándose el sobrenadante.

Se volvió a lavar de 2 a 10 veces más el precipitado con 100 a 500 ml de acetona, secándose al vacío y a temperatura ambiente. El producto fue redisuelto en alcohol de 90 a 96° que contiene cloruro de calcio en una concentración de 0.2 a 4.0 mg/ml.

Cinco ml del producto anterior con actividad biológica se filtraron a través de Sephadex O?-30 o 100 equilibrando con buffer fosfato de sodio 5 x 10"1 a 5 x 10"6 moles, pH= 4 a 8, el cual fue empaquetado en una columna de 1 a 3 cm de ancho y de 18 a 40 cm de altura. El flujo fue de 10 a 30 gotas por minuto y las fracciones recolectadas de 5 a 10 ml cada una.

Se obtuvieron 2 picos proteicos, el primero de 100 a 300 µg/ml y el segundo de 20 a 150µg/ml. La actividad pigmentante fue positiva para el segundo pico, apareciendo a los 10 o 20 días después de ser utilizada tópicamente la mezcla liofilizada en el curiel.

Las mezclas liofilizadas de ambos picos proteicos se corrieron en electroforesis con gel de poliacrilamida y en agarosa, tiñéndose la primera con un colorante para proteínas (amído black) y la segunda para detectar lípidos (sudan). En la electroforesis de proteínas se observó una banda pequeña coloreada ¡A*buua i , . . ... . , a. jt JiÉ-MÉfci»'. seguida de otras sin colorear, ambas migraron poco; también se notó una banda bien visible en la región de la albúmina. En la electroforesis de lípidos solo se observó una banda en la región en que migran las alfalipoproteínas.

Efecto pigmentante sinérgico de la Melagenina y el Calcio La evaluación de la actividad melanocitopoyética del producto resultante se realizó mediante la aplicación tópica de la Melagenina Plus durante un período de 5 días consecutivos en una ocasión diaria sobre la epidermis de las orejas de ratones negros de la cepa B6 D2. Para el ensayo se utilizaron 60 ratones negros separados en 4 grupos denominados A, B, C y D e integrados por 5 ratones cada uno, a los cuales se les aplicaron lo siguientes tratamientos. Grupo Tratamiento tópico diario A Alcohol 70%, como vehículo de la Melagenina ® (Control) B Solución alcohólica al 70% con adición de cloruro de calcio en concentración 1 mg/ml C Melagenina Loción® D Melagenina Loción con adición de cloruro de calcio en concentración de 1 mg/ml (Melagenina Plus) El alcohol al 70%, la solución alcohólica al 70% con cloruro de calcio, 1 mg/ml, así como la Melagenina Loción® y la Melagenina Plus fueron aplicados frotándolos con los dedos del operador sobre las orejas de los animales.

Concluido el tiempo de tratamiento se dejan transcurrir 48 horas y se sacrifican los animales para posteriormente extraerles la epidermis de las orejas y someterlos a la técnica histoquímica de la L-Dopa oxidasa, que permite, mediante la observación microscópica, el conteo de melanocitos por mm2 en dicha estructura histológica.

Para determinar el número de melanocitos por mm2 se seleccionan 5 áreas diferentes de la zona más densamente poblada de cada oreja y utilizando una programa particular elaborado para este fin (sección específica para conteo de células) se determinó el número de células por mm2 en cada una de las 5 zonas de manera que se obtienen 150 valores de melanocitos por mm2 para cada grupo (15 animales por grupo y 10 conteos por cada animal).

Los valores obtenidos en el conteo de melanocitos por mm2 fueron sometidos a análisis de varianza de clasificación simple y con posteridad a un test de Kruskal-Wailis y test Student Newman-Keuls (SNK), a fin de determinar entre cuáles grupos existían diferencias significativas.

Los resultados obtenidos mediante la experiencia se pueden observar en la Tabla I, y quedando gráficamente mostrados en la Figura I.

Tabla I Test de Kruskal-Wailis Cantidad de melanocitos / mm2 X N 180.66 a 150 111.29 b b 150 66.83 c 150 62.79 d 150 para p<0.001 a= Melagenina Plus b= Melagenina Loción c= Alcohol al 70% + Calcio 1 mg/ml d= alcohol al 70% Se observó que para p < 0.001 existió un incremento significativo del número de melanocitos/mm2 en la epidermis de las orejas de los ratones negros tratados con Melagenina Loción® y Melagenina Plus, respecto a los grupos tratados con alcohol y sin tratar.

El incremento del número de melanocitos fue mayor en los animales tratados con Melagenina Plus. Otras diferencias encontradas fueron: • Existen diferencias significativas entre los resultados obtenidos empleando Melagenina Plus y empleando Melagenina Loción® solamente.

• Existen diferencias significativas entre los resultados obtenidos empleando Melagenina Plus y empleando alcohol más calcio solamente.

• Existen diferencias significativas entre los resultados obtenidos empleando Melagenina Plus y empleando alcohol solamente.

• Existen diferencias significativas entre los resultados obtenidos empleando Melagenina Loción® y empleando alcohol más calcio.

• Existen diferencias significativas entre los resultados obtenidos empleando Melageniina Loción® y el grupo Control tratado con alcohol solamente.

• No existen diferencias significativas entre el grupo Control y el grupo tratado con alcohol más calcio.

Adicionalmente se comprobó que cuando se aplican indistintamente la Melagenina Loción® y la Melagenina Plus en ensayos biológicos, se observó que el caso de la Melagenina Plus el efecto pigmentante en pezones de curieles machos es visible en sólo 13 días, mientras que con la Melagenina Loción® esto ocurre a los 18 días. De igual forma, en la cola de los ratones negros se observa mayor concentración de melanina al utilizar Melagenina Plus cuando los cortes son tratados por el método histoquímico, donde se observó un incremento de los melanocitos en la región basal de la epidermis.

Estudios de irritación en piel de animales Se aplicó el producto Melagenina Plus a un grupo de animales en un área de 42 cm2 con una dosis de 20 mg/cm2 y en ese mismo animal se aplicó el solvente.

Durante las dos semanas del experimento no se observó ningún tipo de irritación o afectación en la piel. Los estudios histopatológicos no reflejan daño.

Como conclusión se puede señalar que el producto Melagenina Plus no produce irritación en la piel.

Ensayos clínicos en humanos Para llevar a cabo estos ensayos, se seleccionaron aleatoriamente, 30 pacientes enfermos de vitíligo.

. , Los pacientes fueron separados en dos grupos de forma alterna denominados I y II, e integrados por 15 pacientes cada uno.

A los pertenecientes al grupo I se les indicó utilizar Melagenina Loción® (Extracto Alcohólico de Placenta Humana al 50%) aplicándola tópicamente mediante frotación con los dedos sobre las áreas de piel despigmentada por la enfermedad, en tres ocasiones diarias con intervalo de 8 horas (6.00 am, 2.00 pm y 10.00 pm).

En una de estas ocasiones las áreas tratadas debían exponerse a lámparas de luz infrarroja de 250 watts de intensidad, colocadas a 40 cm de distancia, durante 15 minutos. La aplicación del medicamento debe repetirse cada 5 minutos en ese intervalo de tiempo.

A su vez, los integrantes del grupo II utilizarían Melagenina Plus (Extracto Alcohólico de Placenta Humana al 50% conteniendo Cloruro de Calcio) aplicándola de igual forma pero en una sola ocasión diaria, sin la exposición a la radiación infrarroja y con intervalos de 24 horas.

Los participantes objeto de la experiencia fueron evaluados mensualmente durante un período de tiempo de 6 meses, fijado para comparar en ambos grupos el grado de repigmentación, obtenido con cada producto así como la aparición de reacciones secundarias. ^ - , .... . . - - ,*. .-fr^fjflfi r-- Se practicaron biopsias de áreas despigmentadas de piel al inicio y al final del experimento en 5 pacientes seleccionados aleatoriamente de cada grupo.

La técnica histológica de L-Dopa oxidasa fue utilizada para identificar los melanocitos en las mismas.

Conjuntamente se determinaron las diferencias en el consumo de frascos del medicamento en cada grupo.

Para el procedimiento del análisis estadístico del porcentaje de reducción de la superficie corporal despigmentada en cada grupo, así como para la determinación de la misma por paciente, se utilizó un programa elaborado para tal objetivo (Coyula, R. Automatización de la Creación de Historia Clínica de los enfermos de Vitíligo. 1ra. Conferencia Latinoamericana de Aplicaciones de la Matemática y la Computación a la Biología. CENIC, 31 Oct-30 Nov. 1991 , La Habana, Cuba).

Los resultados obtenidos mediante dicho ensayo clínico se resumen en las Tablas II, lll, IV y V, en las cuales se han considerado como datos de los pacientes, el número de su historia clínica para su identificación, la edad, el sexo, la raza y los años que llevan padeciendo de la enfermedad. Entre los parámelros que se han evaluado se encuentran el % de despigmentación al inicio y al finalizar el tratamiento, el % de pigmentación alcanzado y los frascos de medicamento consumidos durante dicho tratamiento. Asimismo, las áreas analizadas correspondientes a cada uno de dichos pacientes tratados (cara, cuello, tronco, extremidades o genitales) se muestran en la tabla relativa a cada tipo de tratamiento.

Tabla lll: Áreas analizadas en pacientes tratados con Melagenina Loción® Tabla IV: Resultados alcanzados empleando la Melagenina Plus A partir de las tablas anteriores puede observarse que luego de concluidos los 6 meses de tratamiento, se aprecia un valor promedio de disminución de la superficie corporal despigmentada por la enfermedad del 59.11% en el grupo 10 tratado con Melagenina Loción® y del 50.79% en el tratado con Melagenina Plus, *? áiiM lbS&k¿lJm# M.*t. sin apreciarse diferencia significativa alguna entren ambos resultados para un valor p< 0.05.

No se registraron reacciones químicas locales o sistémicas en los pacientes 5 de los grupos sometidos al ensayo.

Las biopsias practicadas en los 5 pacientes de cada grupo mostraron la reaparición de los melanocitos en las áreas de vitíligo seleccionadas para el estudio histológico pre y post tratamiento. 10 Finalmente se observó un mayor consumo de frascos de medicamento en el grupo tratado con Melagenina Loción® con un total de 264 y un promedio de 17.6 frascos por paciente en los 6 meses que duró la experiencia, respecto al grupo tratadlo con Melagenina Plus, en el cual sólo se utilizaron 56 frascos, con un 15 promedio de 3.7 frascos por paciente en igual tiempo.

El estudio histológico realizado demostró que el efecto repigmentante de ambos productos sobre las áreas afectadas por vitíligo, se debe a que los mismos inducen la reproducción de los melanocitos en dichos sitios de nuevo. 20 La ausencia de reacciones secundarias locales sistemáticas reafirma la inocuidad de ambos productos.

La acción sinérgica del Calcio y la Melagenina facilita el cumplimiento del 25 tratamiento por parte de los pacientes de vitíligo, reduciéndose el número de aplicaciones diarias del producto y por consiguiente, el consumo de frascos en cada tratamiento. Asimismo, la nueva formulación permite que se elimine la necesidad de exponer al paciente a radiaciones solares o infrarrojas luego de la aplicación. 30 ,r ^ £l S ..-í¿?-* La Figura 1 muestra la acción melanocitopoyética (área sombreada = No. de melanocitos/mm2) obtenida mediante un ensayo en oreja de ratón negro, empleando grupos de animales a los cuales se les aplicaron diferentes . tratamientos: 5* . A Alcohol 70%, como vehículo de la Melagenina® (Control) B Solución alcohólica al 70% con adición de Cloruro de Calcio en concentración de 1 mg/ml 10 C Melagenina Loción® D Melagenina Loción con adición de Cloruro de Calcio en concentración de 1 mg/ml (Melagenina Plus) 15 20 25 30

Claims (3)

REIVINDICACIONES

1. Procedimiento para la obtención de una composición para la estimulación de la síntesis del pigmento melánico, caracterizado porque comprende los siguientes pasos: - trituración y maceramiento de un kilogramo de cotiledones placentarios congelados con etanol de 90 a 96° por partes iguales peso/volumen. - Filtración del macerado con reposo durante 24 horas. - Adición a 200 ml del extracto que contiene el factor pigmentante de una solución saturada de ácido benzoico en etanol de 90 a 96°. - Agitación de la mezcla de 10 a 50 minutos y filtración. - Lavado del precipitado obtenido con una solución saturada de ácido benzoico en agua destilada. - Remoción del precipitado y adición de acetona al 30%. - Centrifugación del extracto a 1500 rpm durante 10 a 30 minutos, descartando el sobrenadante - Lavar nuevamente el precipitado con acetona, secar al vacío y a temperatura ambiente, - Redisolución del producto en alcohol de 90 a 96° que con una concentración de cloruro de calcio de 0.2 a 4.0 mg/ml. - Filtración del producto obtenido, utilizando Sephadex, equilibrando con solución buffer de fosfato de sodio, a un pH de 4 a 8.

2. Una composición para la estimulación de la síntesis del pigmento melánico, caracterizada porque comprende: una mezcla de extracto alcohólico de placenta humana al 50% que contiene cloruro de calcio a una concentración entre 0.2 y 4.0 mg/ml.

3. El uso de la composición de conformidad con la reivindicación 2 para la fabricación de un medicamento útil en el tratamiento del vitíligo mediante la aplicación tópica a los pacientes frotando con los dedos las áreas afectadas, en donde dicha aplicación es diaria, sin exposición a la radiación infrarroja. . i ?-?-i