WO2000001221A2 - Verfahren zur interspezifischen hybridisierung - Google Patents

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WO2000001221A2
WO2000001221A2 PCT/DE1999/002062 DE9902062W WO0001221A2 WO 2000001221 A2 WO2000001221 A2 WO 2000001221A2 DE 9902062 W DE9902062 W DE 9902062W WO 0001221 A2 WO0001221 A2 WO 0001221A2
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Heide Schnabl
Ruth Wingender
Hans-Joachim Henn
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Heide Schnabl
Ruth Wingender
Henn Hans Joachim
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
    • C12N5/14—Plant cells

Definitions

  • the invention relates to methods for obtaining protoplasts from leaves of plants, for the fusion of protoplasts and for the production of a plant with new properties (e.g. fungal resistance) after the fusion of protoplasts, and the use of these methods for interspecific hybridization.
  • the subject of the invention is therefore a new method for obtaining cell wall-free cells (protoplasts) from leaves, a method for the fusion of protoplasts and the production of a plant with new properties (e.g. fungal resistance) after the fusion of the protoplasts.
  • the methods according to the invention for the production of protoplasts from leaves of wild species of sunflower (Helianthus ssp.) And for the fusion of protoplasts of a cultivated sunflower (Helianthus annuus L.) on the one hand and a wild species of sunflower (Helianthus ssp.) On the other hand and for Regeneration of individual hybrid cells used to develop fully developed plants.
  • the method according to the invention for obtaining protoplasts from leaves comprises incubating strips of the leaves from the top two to five nodi in mesophyll enzyme solution containing cellulase, pectolyase, macerocyma and driselase for 10-24 hours at 10-24 ° C., increasing the Temperature to 16-30 ° C and incubation with shaking for about 30 minutes and the subsequent purification of the protoplasts.
  • the mesophyll enzyme solution preferably contains 0.05-0.25% cellulase, 0.01-0.15% pectolyase, 0.25-1.5% macerocym and 0.001-0.025% driselase.
  • the leaves come from a Helianthus wild species.
  • the protoplast fusion method of the invention comprises mixing the protoplasts at a density of 1-4.4 million protoplasts / ml, then adding an equal volume of a fusion solution comprising 10-25% PEG (polyethylene glycol) and 3-14% DMSO (dimethyl sulfoxide) ), the incubation for 10-30 minutes at room temperature in the light and the subsequent addition of a salt buffer and the incubation for 1 to 3 hours at room temperature in the light.
  • the fusion solution comprises 10-25% PEG and 6-14% DMSO, in particular 15-20% PEG and 3-7% DMSO.
  • protoplasts from Helianthus annus are fused with protoplasts of a wild Helianthus species.
  • the method according to the invention for producing a plant or a reproductive material of this plant comprises the fusion of protoplasts according to the above-mentioned method and the regeneration of plants or reproductive material of these plants or both from the protoplast and optionally the biological replication of the regenerated plants or the reproductive material thereof Plants.
  • the method according to the invention could be used in all wild types of sunflower tested so far, and thus eliminates the need for complex optimization steps for individual species.
  • Chanabe et al. Plant Cell Rep. 9, 635-638, 1991
  • who used significantly longer incubation times stored for two hours at room temperature in the dark, which contributed significantly to overcoming the protoplasting stress.
  • the process according to the invention for the fusion of protoplasts ensured fusion rates of 3 to 10% in the case of a fusion of protoplasts of the cultivar of the sunflower with those of a wild species.
  • the combination of polyethylene glycol (PEG) and dimethyl sulfoxide (DMSO) in concentrations of 10-25% PEG to 3-14% DMSO has proven successful in order to achieve the above-mentioned fusion rates.
  • Another embodiment of the invention relates to a regeneration process for hybrid cells, which ensures the preservation of fertile interspecific hybrids with the donor species H. maximiliani and H. giganteus. It was important to note that the hybrid was a have different behavior in culture from the respective parent genotypes. Embedding densities, light and temperature conditions as well as the sequence of the phytohormone regime were developed in accordance with these special requirements and a hormone treatment for rooting was introduced. The regeneration was based on the protocol described for H. annuus (Wingender et al. Plant Cell Rep. 742-745, 1996), but for the hybrids the time periods of the individual culture steps were modified depending on the donor type.
  • the 2,4-dichlorophenoxyacetic acid treatment proved to be particularly critical here, which is why the time span here was reduced to a maximum of five days.
  • the time periods were adapted to the developmental states of the micro calli and later larger calli, so that the continuation of the culture steps was decided on a case by case basis.
  • 125 somatic hybrids between H. annuus and H. maximiliani and 47 somatic hybrids between H annuus and H giganteus were obtained.
  • mesophyll cell protoplasts leaves of the uppermost two to five nodes are cut off from week-long to five, preferably two to three-week-old plants propagated in vitro, cut into strips approximately 1 mm wide and cut into 10-30, preferably 15-25 , in particular 18-22 ml of mesophyll enzyme solution, the composition of which is given in Table 1, incubated in the dark.
  • Table 1 Composition of the mesophyll enzyme solution
  • the pH is adjusted to 4.0-7.0, preferably 5.0-6.5, in particular 5.5-5.8, and the solution is sterile filtered.
  • the tissue is first infiltrated with the solution.
  • the protoplasts are released after 1-1.5 h.
  • the entire batch is first filtered through a stainless steel sieve with a mesh size of 50 ⁇ m and the filtrate is then 2-8, preferably 3.5-6.5, in particular 4.5 -5.5 min at 30-70, preferably centrifuged at 40 - 60, especially at 45 - 55 g.
  • the pelleted protoplasts are resuspended in 8 ml sucrose solution (0.3-0.7 M saccharose, 0.5-1.5 mM CaCl 2 , 0.1-0.5 mM MES, pH 4-7) and with 2 ml Salt buffer (0.1 - 0.5 M KC1, 0.005 - 0.015 M CaCl 2 , 0.1 - 5 M MES, pH 4-7) overlayed.
  • H. annuus hypocotyltrotoplasts with mesophyll protoplasts of a Helianthus species, these were mixed for example in a ratio of 1: 2 (HCPs: MCPs) and a density of 1 - 4.4, in particular 1.5 - 3, preferably 1.8 - 2.4 million protoplasts / ml adjusted.
  • HCPs: MCPs mesophyll protoplasts
  • 150-350, preferably 180-330, in particular 200-300 ⁇ l of this protoplast mixture are added to the center of a petri dish (0-10 cm) and mixed carefully with the same volume of the respective fusion solution. Incubation is carried out for 10-30, preferably 15-25, in particular 18-22 min at RT in the light.
  • the batches are centrifuged 2-8, preferably 3.5-6, in particular 4.5-5.5 min at 80-160, preferably 100-140, especially 110-130 g, the protoplast pellet with 150-250, preferably 190 - 230, in particular with 185 - 215 ⁇ l salt buffer, and the total number of protoplasts and the fusion rate were determined in the Fuchs-Rosenthal hemocytometer. b) regeneration
  • the protoplasts are in a density of 2xl0 4 - lxl 0 5 , preferably 5x10 4 - 9xl0 4 , in particular 6xl0 4 - 8xl0 4 ml "1 in 32 - 40, preferably 33 - 38, in particular 34 - 36 ° C warm agarose (0 , 5% in mKM medium according to Wingender et al. Plant Cell Rep. 15, 742-745, 1996 or KMAR medium according to Schemionek, thesis at the University of Bonn 1995 or in VKM medium according to Binding & Nehls Z. Plant Physiol.
  • the drops are regenerated with 5-15, preferably 9.5-14, in particular with 10-12, ml per petri dish - Liquid medium (400 - 700, preferably 450 - 650, in particular, 550 - 600 mosml) overlaid and at 16 - 30, preferably 20 - 28, especially at 24 - 26 ° C in the dark.
  • the liquid medium is changed two to five times, the time of the change being determined by the stage of development of the cells or microcolonies. Each time the medium is changed, the osmolarity of the medium is reduced by 70-140 mosmol and the hormone composition is changed.
  • the pH is adjusted to 4.0-7.0, preferably 5.0-6.5, in particular 5.5-5.8, and the solution is sterile filtered.
  • Step 1 At the beginning of the culture, the phytohormones BAP and NAA are added to the medium.
  • BAP in a concentration of 1-10 ⁇ M, preferably 2-6 ⁇ M, in particular 4 ⁇ M and NAA in a concentration of 1-10 ⁇ M, preferably 2-6 ⁇ M, in particular 5 ⁇ M.
  • the medium is changed after 4-12, preferably 6-10, in particular 7-8 days.
  • the new medium contains the phytohormone 2,4-D in a concentration of 2 - 20, preferably 5 - 15, in particular 8 - 12 ⁇ M.
  • the duration of the cultivation is 2-10, preferably 4-8, especially 5-7 days.
  • the medium is then changed again.
  • Step 3 This contains BAP and NAA, the B AP concentration corresponding to that used in Step 1; However, NAA in a concentration of 0.1-1, preferably 0.3-0.8, in particular 0.4-0.6 ⁇ M.
  • the cultivation time corresponds to that given in step 1.
  • Step 4 There is a new media change, but no change in the hormone addition. However, the cultures are now further cultivated at 16-30, preferably 20-28, in particular at 24-26 ° C. in a light period of 6-16, preferably 8-14, in particular 11-13 hours. The cultivation period depends on the state of development of the colonies; before the next sub-cultivation step, they must have reached a minimum size of 1 mm in diameter. Experience has shown that this takes 6 to 14 days.
  • Step 5 The further cultivation is carried out on solid medium.
  • the colonies are released from the agarose drops by means of suitable measures, such as carefully crushing the drops or dissolving the agarose or cutting them up, and transferring them to differentiation medium (Table 4).
  • Colonies of 2-12, preferably 4-10, in particular 5-7, agarose drops are applied to each Petri dish (0-10 cm) and cultivated as indicated in step 4.
  • Step 6 As soon as the calli have green, organogenic structures, 1-10, in particular 3-7, preferably 4-6 calli are reacted in Petri dishes (0 5 cm) which contain shoot medium (Table 5).
  • the pH is adjusted to 4.0-7.0, preferably 5.0-6.5, in particular 5.5-5.8, and the solution is autoclaved.
  • the vitamins are added after autoclaving.
  • small shoots develop, which are freed from surrounding callus tissue and then each subcultivated on shoot medium. Since new wound calluses are often formed, this process of removing the callus and subculturing on fresh medium usually has to be repeated several times.
  • the selection of the cultivation vessel is gradually adapted to the extension of the rung.
  • Step 7 If the rungs have a length of 0.5-2, preferably 0.8-1.8, reached in particular from 1 - 1.5 cm, they are cut off at the base and this is briefly immersed in 2 - 10, preferably 4 - 8, in particular 5 - 5.5 M NAA solution. The further cultivation is carried out on modified shoot medium (Table 6).
  • the pH is adjusted to 4.0-7.0, preferably 5.0-6.5, in particular 5.5-5.8, and the solution is autoclaved.
  • the vitamins are added after autoclaving.
  • the shoots root themselves and form small plants. Shoots that form wound calluses must be cut again and the NAA treatment repeated. After they have reached a size of 4 - 5 cm, the plants are transferred into sterile soil and vermiculite or sand substrates and cultivated further in the greenhouse.
  • protoplast yields between 2xl0 6 (H. maximiliani, H. nuttallii) - 3xl0 6 (H. giganteus) g '1 fresh weight and division rates (as a measure of vitality) after a week of culture of 60 - 70% can be achieved for all genotypes.
  • fusion rates of 8-10% for different genotypes and division rates of 40-50% after one week of culture could be achieved, with only a very slight loss due to protoplast death due to the fusion solutions being observed.
  • the method according to the invention for the regeneration of interspecific hybrids with new properties has the following advantages:
  • the methods according to the invention enable 1. the reproducible isolation of protoplasts, for example from wild species of sunflower, 2. their efficient and, at the same time, gentle fusion with protoplasts, for example from the culture sunflower, and 3. the regeneration of interspecific, fertile hybrids of the species with new properties. These methods serve to bypass the crossing barrier, for example between cultivated sunflower and its perennial wild species, and thus to make the agronomically interesting genetic properties available in the wild species accessible, for example, for sunflower breeding.

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Abstract

Die Erfindung betrifft Verfahren zur Gewinnung von Protoplasten aus Blättern von Pflanzen, zur Fusion von Protoplasten und zur Herstellung einer Pflanze mit neuen Eigenschaften nach der Fusion von Protoplasten sowie die Verwendung dieser Verfahren zur interspezifischen Hybridisierung.

Description

Verfahren zur interspezifischen Hybridisierung
Die Erfindung betrifft Verfahren zur Gewinnung von Protoplasten aus Blättern von Pflanzen, zur Fusion von Protoplasten und zur Herstellung einer Pflanze mit neuen Eigenschaften (z.B. Pilzresistenz) nach der Fusion von Protoplasten sowie die Verwendung dieser Verfahren zur interspezifischen Hybridisierung.
Die Verwendung nur einer cytoplasmatisch männlichen Sterilität zur Erstellung von Inzuchtlinien (Leclerq, Amelior. Plantes 99-109, 1969) in der konventionellen Sonnenblumen-Hybridzüchtung hat die genetische Variabilität der Sonnenblume stark eingeschränkt. Die zahlreichen He//α«//ι«.s-Wildarten zeigen hingegen eine große Variabilität für züchterisch interessante Merkmale wie Fettsäuregehalt und -Zusammensetzung (Seiler, Econom. Bot. 271-279, 1994; Christov, FAO Progr. Rep. Evaluation of wild Ηelianthus species 31-62, 1994;) Trockentoleranz, cytoplasmatische männliche Sterilität sowie Pilz- und Insektenresistenz (Ηenn et al. Angew. Bot. 5-9, 1997; Seiler, Field Crop Res. 195-230, 1992; Serieys, FAO Progr. Rep. Gentic Evaluation and use of Ηelianthus wild species and their use in breeding programs 18-23, 1987). Somit stellen die Wildarten der Sonnenblume wichtige Genressourcen für die Kulturform dar und konnten auch in einigen Fällen erfolgreich eingesetzt werden. Die interspezifische Ηybridisierung ist jedoch aufgrund von Inkompatibüität, genetischer Distanz und erhöhter Chromosomenzahl in vielen Fällen sehr schwierig, wenn nicht unmöglich. H. annuus kann leicht mit anderen diploiden annuellen Arten gekreuzt werden, bei den perennierenden Arten wird jedoch häufig das Absterben des Embryos, geringe Befruchtungsrate und Sterilität der FI -Generation (Seiler 1992 s.o.) beobachtet. Letzterem kann mit Hilfe einer Colchicinbehandlung entgegengewirkt werden (Jan & Chandler Crop Sei. 643-646, 1988), doch mit bislang unbekannten Konsequenzen für die weiteren Generationen. Ahnliche Probleme treten auch bei Anwendung der Methode des „embryo rescue" auf einem biotechnologischem Verfahren, in dem das nach Befruchtung gebildete Embryo in die Sterilkultur überführt wird (Kräuter et al. Theor. Appl Genet. 521- 525, 1991). Eine weitere Möglichkeit, Kreuzungsbarrieren zu überwinden, besteht in der somatischen Zellfusion, bei der zellwandlose Gewebezellen von Donor- und Akzeptor- pflanzen miteinder verschmolzen werden. Die entstandenen Hybridzellen können anschließend in Kultur genommen und zu Pflanzen regeneriert werden.
1. Sterilkultur und Klonierung von Wildarten der Sonnenblume (Helianthus ssp.) Die in vitro Propagation wird meist im Zierpflanzenanbau eingesetzt zur Produktion von vielen genetisch identischen Pflanzen auf einer kleinen Produktionsfläche. Die perennierenden Wildarten der Sonnenblume stellen Zierpflanzen dar, jedoch werden sie nicht über die in vitro Propagation vermehrt, da sie als mehrjährige Pflanzen über Rhizome verfugen, die unter Einsatz gärtnerischer Praxis eine leichte Vermehrung der Pflanzen gewährleisten. Über die in vitro Propagation von Helianthus giganteus berichteten Krasnyanski & Menczel (Plant Cell Rep. 232-235, 1995) jedoch mit wenigen technischen Details. Genauere Angaben für die sterile Anzucht und Propagation gaben Imhoff et al. (Angew. Bot. 70, 137-139, 1996) für Helianthus giganteus, H. x laetiflorus und H. pauciflorus.
2. Regeneration von fertilen Pflanzen aus Protoplasten von Helianthus-Arten
Die Regeneration von fertilen Pflanzen, ausgehend von H. annuus Protoplasten, wurde bereits mit verschiedenen Medien sowie Hormonzugaben erreicht. Die Bildung von Sprossen aufgrund von Embryogenese (Krasnyanski & Menczel, Plant Cell Rep. 12, 260-263, 1993; Barth et al. Bot Acta 106, 220-222, 1993) als auch Organogenese (Binding et al. Zeitschr. f. Pflanzenphysiol. 101, 119-130, 1981, Burrus et al. Plant Cell Rep. 10, 161-166, 1991, Fischer et al. Plant Cell Rep. 11, 632-636, 1992) wurde beschrieben. Alle diese Protokolle waren allerdings nur für jeweils wenige Sonnenblumengenotypen anwendbar. Ein Regenerationsprotokoll, das bei vier getesteten Sonnenblumensorten, zwar mit unterschiedlicher Effizienz, doch in jedem Fall fertile Pflanzen ergab, wurde von Wingender et al. (Plant Cell Rep. 15, 742-745, 1996) beschrieben.
Bei Wildarten der Sonnenblume wurde von Protoplasten ausgehende Regeneration von Pflanzen für H. petiolaris (Chanabe et al. Plant Cell Rep. 9, 635-638, 1991) und für H. praecox, H. scaberimus und H. rigidus (Bohorova et al. Plant Cell Rep. 5, 256-258, 1986) berichtet, wobei letztere keine näheren Angaben zur Kultur machten. Eine hohe Ausbeute an embryogenen Calli und Pflanzen wurde im Fall von H. giganteus (Krasnyanski et al. Plant Cell Rep. 11, 7-10, 1992) und H. m ximiliani (Polgar & Krasnyanski Plant Sei. 87, 191- 197, 1992) erhalten.
3. Regeneration von fertilen Pflanzen aus Hybridzellen von Helianthus annuus und Helianthus ssp.
Die Regeneration von Hybriden nach Zellfusion von H. annuus und H. giganteus Protoplasten wurde von Krasnyanski & Menczel (Plant Cell Rep. 14, 232-235, 1995) beschrieben. Von über hundert Pflanzen produzierten aber nur zwei nach Selbstung Samen, während alle anderen steril waren.
Es war daher eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, neue verbesserte Verfahren zur interspezifischen Hybridisierung von Kultursonnenblume und Wildarten der Sonnenblume bereitzustellen. Die Lösung dieser Aufgabe ergibt sich aus den Patentansprüchen und der nachfolgenden Beschreibung.
Gegenstand der Erfindung ist daher ein neues Verfahren zur Gewinnung von zellwandlosen Zellen (Protoplasten) aus Blättern, ein Verfahren zur Fusion von Protoplasten und die Herstellung einer Pflanze mit neuen Eigenschaften (z.B. Pilzresistenz) nach der Fusion der Protoplasten.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden die erfindungsgemäßen Verfahren zur Gewinnung von Protoplasten aus Blättern von Wildarten der Sonnenblume (Helianthus ssp.) und zur Fusion von Protoplasten einer Kultursonnenblume (Helianthus annuus L.) einerseits und einer Wildart der Sonnenblume (Helianthus ssp.) andererseits und zur Regeneration von einzelnen Hybridzellen zu voll entwickelten Pflanzen eingesetzt.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Gewinnung von Protoplasten aus Blättern umfaßt die Inkubation von Streifen der Blätter der obersten zwei bis fünd Nodi in Mesophyll- Enzymlösung, enthaltend Cellulase, Pectolyase, Macerocym und Driselase über 10-24 Stunden bei 10-24° C, die Erhöhung der Temperatur auf 16-30° C und die Inkubation unter Schütteln über etwa 30 Minuten und die nachfolgende Aufreinigung der Protoplasten. Vorzugsweise enthält die Mesophyll-Enzymlösung 0,05-0,25% Cellulase, 0,01-0,15% Pectolyase, 0,25-1,5% Macerocym und 0,001-0,025% Driselase. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Gewinnung von Protoplasten stammen die Blätter von einer Helianthus- Wildart.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Fusion von Protoplasten umfaßt das Mischen der Protoplasten bei einer Dichte von 1-4.4 Millionen Protoplasten/ml, die nachfolgende Zugabe eines gleichen Volumens einer Fusionslösung, umfassend 10-25% PEG (Polyethylenglycol) und 3-14% DMSO (Dimethylsulfoxid), die Inkubation für 10-30 Minuten bei Raumtemperatur im Licht und die nachfolgende Zugabe eines Salzpuffers und die Inkubation für 1 bis 3 Stunden bei Raumtemperatur im Licht. In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Fusion von Protoplasten umfaßt die Fusionslösung 10-25% PEG und 6-14% DMSO, insbesondere 15-20% PEG und 3-7% DMSO. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Fusion der Protoplasten werden Protoplasten von Helianthus annus mit Protoplasten einer Helianthus- Wildart fusioniert.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung einer Pflanze oder von Reproduktionsmaterial dieser Pflanze umfaßt die Fusion von Protoplasten gemäß dem vorstehend genannten Verfahren und die Regenerierung von Pflanzen oder Reproduktionsmaterial dieser Pflanzen oder von beidem aus dem Protoplasten und gegebenenfalls das biologische Replizieren der regenerierten Pflanzen oder des Reproduktionsmaterials von diesen Pflanzen.
Zur Gewinnung von Protoplasten aus Blättern von Wildarten der Sonnenblume wurde ein von allen Literaturstellen (Chanabe et al. Plant Cell Rep. 9, 635-638, 1991; Bohorova et al. Plant Cell Rep. 5, 256-258, 1986; Krasnyanski et al. Plant Cell Rep. 11, 7-10, 1992; Polgar & Krasnyanski Plant Sei. 87, 191-197, 1992; Imhoff et al. Angew. Bot. 70, 137-139, 1996) abweichendes Verfahren entwickelt, das reproduzierbar hohe Ausbeuten vitaler Protoplasten gewährleistet. Hierbei erwies sich die gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzte Zusammensetzung des Inkubationsmediums, speziell die Konzentration und die Art der eingesetzten Enzyme als entscheidend. Das erfindungsgemäße Verfahren konnte bei allen bislang getesteten Wildarten der Sonnenblume eingesetzt werden und erübrigt somit aufwendige Optimierungsschritte für einzelne Arten. Vor der Weiterverwendung wurden die Protoplasten im Gegensatz zu Chanabe et al. (Plant Cell Rep. 9, 635-638, 1991), die deutlich längere Inkubationszeiten verwendeten, zwei Stunden bei Raumtemperatur im Dunklen gelagert, was wesentlich zur Überwindung des Protoplastierstresses beitrug.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Fusion von Protoplasten gewährleistete bei einer Fusion von Protoplasten der Kultursorte der Sonnenblume mit denen einer Wildart Fusionsraten von 3 - 10 %. Abweichend von der üblichen Praxis hierzu nur eine Chemikalie einzusetzen, erwies sich die Kombination von Polyethylenglykol (PEG) und Dimethylsulfoxid (DMSO) in Konzentrationen von 10-25% PEG zu 3-14% DMSO als erfolgreich, um die vorstehend genannten Fusionsraten zu erzielen. Die Verwendung der von Krasnyanski & Menczel (Plant Cell Rep. 14, 232-235, 1995) beschriebenen Methode (25 % PEG) brachte in keinem Fall ein zufriedenstellendes Ergebnis.
Überraschenderweise wurde gefunden, daß das Mischen der Protoplasten bei einer Dichte von 1-4.4 Millionen Protoplasten/ml, die nachfolgende Zugabe eines gleichen Volumens einer Fusionslösung, umfassend 10-25% PEG (Polyethylenglycol) und 3-14% DMSO (Dimethylsulfoxid), die Inkubation für 10-30 Minuten bei Raumtemperatur im Licht und die nachfolgende Zugabe eines SalzpufFers und die Inkubation für 1 bis 3 Stunden bei Raumtemperatur im Licht zu besonders hohen Fusionsraten führte. Besonders vorteilhaft erwies sich eine Fusionslösung enthaltend 10-25% PEG und 6-14% DMSO, insbesondere 15-20% PEG und 3-7% DMSO bei der Fusion von Protoplasten von Helianthus annus mit Protoplasten einer Helianthus- Wildart.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft ein Regenerationsverfahren für Hybridzellen, das den Erhalt von fertilen interspezifischen Hybriden mit den Donorarten H. maximiliani und H. giganteus gewährleistet. Hierbei war zu beachten, daß die Hybride ein von den jeweiligen parentalen Genotypen abweichendes Verhalten in der Kultur aufweisen. Es wurden Einbettungsdichten, Licht- und Temperaturbedingungen sowie die Abfolge des Phytohormonregimes diesen besonderen Ansprüchen entsprechend entwickelt und eine Hormonbehandlung zur Bewurzelung eingeführt. Die Regeneration erfolgte in Anlehnung an das für H. annuus beschriebene Protokoll (Wingender et al. Plant Cell Rep. 742-745, 1996), wobei jedoch für die Hybride die Zeitspannen der einzelnen Kulturschritte in Abhängigkeit zum Donorgenotyp modifiziert wurden. Hierbei erwies sich die 2,4- Dichlorphenoxyessigsäure-Behandlung als besonders kritisch, weshalb die Zeitspanne hier auf maximal fünf Tage verkürzt wurde. Im weiteren Verlauf des Regenerationsprotokolls wurden die Zeitspannen den Entwicklungszuständen der Mikrokalli und später gebildeten größeren Kalli angepaßt, so daß die zeitliche Weiterfuhrung der Kulturschritte von Fall zu Fall entschieden wurde. Weiterhin gelang es erstmalig, die erhaltenen Regenerate mittels einer Auxinbehandlung und weiterer Subkultivierung auf hormonfreiem Medium zu bewurzeln, wodurch die aufwendige Pfropfung auf eine Wildunterlage umgangen wurde. Es wurden 125 somatische Hybride zwischen H. annuus und H. maximiliani sowie 47 somatische Hybride zwischen H annuus und H giganteus erhalten. Im Gegensatz zu Krasnyanski & Menczel(Plant Cell Rep. 14, 232-235, 1995) wurden nach Selbstung von allen Pflanzen Samen erhalten, die auch keimfähig waren. Der Hybridcharakter der Pflanzen konnte auf genetischer Ebene mittels der RAPD-PCR- Analyse bestätigt werden.
Die nachfolgenden Beispiele erläutern die Erfindung und sind nicht als einschränkend aufzufassen.
Beispiel 1: Gewinnung von Pro toplasten
Zur Isolation der Mesophyllzellprotoplasten (MCPs) werden Blätter der obersten zwei bis fünf Nodi von einwöchigen bis fünf, vorzugsweise zwei bis drei Wochen alten in vitro propagierten Pflanzen abgeschnitten, in ca. 1 mm breite Streifen geschnitten und in 10 -30, vorzugsweise 15 - 25, insbesondere 18 - 22 ml Mesophyll-Enzymlösung, deren Zusammensetzung in Tabelle 1 angegeben ist, im Dunklen inkubiert. Tabelle 1: Zusammensetzung der Mesophyll-Enzymlösung
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Der pH wird auf 4,0 - 7,0, vorzugsweise auf 5,0 - 6,5, insbesondere auf 5,5- 5,8 eingestellt und die Lösung sterilfiltriert. In der beispielsweise 10 - 24, vorzugsweise 14 -22, insbesondere 16 - 20 stündigen ersten Phase der Inkubation bei beispielsweise 10 - 24, insbesondere 14 - 22, vorzugsweise bei 16 - 20°C wird zunächst das Gewebe mit der Lösung infiltriert. Nach Erhöhung der Temperatur auf beispielsweise 16 - 30, insbesondere 20 - 28, vorzugsweise 24 - 27°C und Schütteln bei 60 - 110, vorzugsweise 70 - 90, insbesondere 75 - 85 rpm werden nach 1 - 1,5 h die Protoplasten freigesetzt. Zu deren Aufreinigung wird der gesamte Ansatz zunächst durch ein Edelstahlsieb mit einer Maschenweiten von 50 μm filtriert und das Filtrat anschließend 2 - 8, vorzugsweise 3,5 -6,5, insbesondere 4,5 -5,5 min bei 30 - 70, vorzugsweise bei 40 - 60, insbesondere bei 45 - 55 g zentrigfugiert. Die pelletierten Protoplasten werden in 8 ml Saccharoselösung (0,3 - 0,7 M Saccharaose, 0,5 - 1,5 mM CaCl2, 0,1 - 0,5 mM MES, pH 4 - 7) resuspendiert und mit 2 ml Salzpuffer (0,1 - 0,5 M KC1, 0,005 - 0,015 M CaCl2, 0,1 - 5 M MES, pH 4 - 7) überschichtet. In der Interphase dieses diskontinuierlichen 2-Phasen Gradienten sammeln sich nach erneuter Zentrifugation bei 30 - 70g, vorzugsweise bei 40 - 60g, insbesondere bei 45 - 55g , für 2 - 8 min, die intakten Protoplasten. Die Anzahl der gereinigten Protoplasten wird im Fuchs-Rosenthal-Hämocytometer bestimmt. Beispiel 2: Protoplastenfusion und Regeneration der Hybride a) Fusion
Zur Fusion von H. annuus Hypokotylptrotoplasten mit Mesophyllprotoplasten einer Helianthus-Wüdart wurden diese beispielsweise im Verhältnis 1 : 2 (HCPs : MCPs) gemischt und eine Dichte von 1 - 4,4, insbesondere 1,5 - 3, vorzugsweise von 1,8 - 2,4 Mio Protoplasten/ml eingestellt. Von dieser Protoplastenmischung werden 150 - 350, vorzugsweise 180 - 330, insbesondere 200 - 300 μl in die Mitte einer Petrischale (0 10 cm) gegeben und vorsichtig mit dem gleichen Volumen der jeweiligen Fusionslösung gemischt. Die Inkubation erfolgt für 10 - 30 , vorzugsweise bei 15 -25, insbesondere 18 - 22 min bei RT im Licht. Anschließend werden vorsichtig 10 - 30, vorzugsweise 15 -25, insbesondere 18 - 22 ml Salzpuffer (s.o.) hinzugegeben und für 1 - 3 vorzugsweise 1,5 - 2,5, insbesondere 1,8 - 2,2 h bei RT im Licht inkubiert. Die Zusammensetzung der jeweiligen Fusionslösung in Abhängigkeit von der verwendeten Wildart wird in Tabelle 2 angegeben.
Tabelle 2 Zusammensetzung der Fusionslösungen
Figure imgf000010_0001
Die Ansätze werden 2- 8, vorzugsweise 3,5 - 6, insbesondere 4,5 - 5,5 min bei 80 - 160, vorzugsweise bei 100 - 140, insbesondere bei 110 - 130g zentrifügiert, das Protoplastenpellet mit 150 - 250, vorzugsweise 190 - 230, insbesondere mit 185 - 215 μl Salzpuffer resuspendiert und die Gesamtzahl an Protoplasten sowie die Fusionsrate im Fuchs-Rosenthal-Hämocytometer bestimmt. b) Regeneration
Die Protoplasten werden in einer Dichte von 2xl04 - lxl 05, vorzugsweise 5x104 - 9xl04, insbesondere 6xl04 - 8xl04 ml"1 in 32 - 40, vorzugsweise 33 - 38, insbesondere 34 - 36°C warme Agarose (0,5%ig in mKM-Medium nach Wingender et al. Plant Cell Rep. 15, 742- 745, 1996 oder KMAR-Medium nach Schemionek, Dissertation Universität Bonn 1995 oder in VKM-Medium nach Binding & Nehls Z. Pflanzenphysiol. 85, 279-280, 1977 oder in Kultivierungs-Medium nach Kao & Michayluk Planta 126, 105-110, 1975) gegeben und in Tropfen von 20 - 80, vorzugsweise 30 - 70, insbesondere von 40 - 60 μl in Plastikpetrischalen (0 10 cm) verteilt, wobei pro Schale 10 - 50, vorzugsweise 15 - 35, insbesondere 18 -25 Tropfen ausplattiert werden. Nach Erstarren der Agarose werden die Tropfen mit 5 - 15, vorzugsweise 9,5 - 14, insbesondere mit 10 - 12 ml pro Petrischale Regenerations-Flüssigmedium (400 - 700, vorzugsweise 450 - 650, insbesondere, 550 - 600 mosml) überschichtet und bei 16 - 30, vorzugsweise 20 - 28, insbesondere bei 24 - 26°C im Dunkeln inkubiert. Im Verlauf der Kultur wird das Flüssigmedium zwei- bis fünfmal gewechselt, wobei der Zeitpunkt des Wechsels vom Entwicklungsstadium der Zellen bzw. Mikrokolonien bestimmt wird. Bei jedem Mediumwechsel wird die Osmolarität des Mediums um 70 - 140 mosmol verringert und die Hormonzusammensetzung verändert.
Tabelle 3, Zusammensetzung des flüssigen Regenerations-Mediums
Figure imgf000011_0001
Figure imgf000012_0001
Der pH wird auf 4,0 - 7,0, vorzugsweise auf 5,0 - 6,5, insbesondere auf 5,5- 5,8 eingestellt und die Lösung sterilfiltriert.
Schritt 1: Zu Beginn der Kultur werden dem Medium die Phytohormone BAP und NAA zugesetzt. BAP in einer Konzentration von 1 - 10 μM, vorzugsweise 2- 6 μM, insbesondere 4 μM und NAA in einer Konzentration von 1 - 10 μM, vorzugsweise 2 - 6 μM, insbesondere 5 μM. Je nach Zellteilungsrate und Entwicklung der eingebetteten Zellen erfolgt der Wechsel des Mediums nach 4 - 12, vorzugsweise 6- 10, insbesondere 7 - 8 Tagen. Schritt 2: Das neue Medium enthält das Phytohormon 2,4-D in einer Konzentration von 2 - 20, vorzugsweise 5 - 15, insbesondere 8 - 12 μM. Die Dauer der Kultivierung beträgt 2 - 10, vorzugsweise 4 - 8, insbesondere 5 - 7 Tage. Danach wird das Medium erneut gewechselt. Schritt 3 : Dieses enthält BAP und NAA, wobei die B AP-Konzentration der in Schritt 1 verwendeten entspricht; NAA jedoch in einer Konzentration von 0.1 - 1, vorzugsweise 0,3 - 0,8, insbesondere 0,4 - 0,6 μM. Die Kultivierungsdauer entspricht der in Schritt 1 angegebenen. Schritt 4: Es erfolgt ein erneuter Medienwechsel, jedoch keine Veränderung in der Hormonzugabe. Die Kulturen werden jetzt jedoch bei 16 - 30, vorzugsweise 20 - 28, insbesondere bei 24 - 26°C in einer Lichtperiode von 6 -16, vorzugsweise 8 - 14, insbesonder 11 - 13 Stunden weiterkultiviert. Die Kulturdauer richtet sich nach dem Entwicklungszustand der Kolonien; vor dem nächsten Subkultivierungsschritt müssen sie eine Mindestgröße von 1 mm Durchmesser erreicht haben. Hierfür werden erfahrungsgemäß 6 - 14 Tage benötigt. Schritt 5: Die weitere Kultivierung wird auf Festmedium durchgeführt. Hierzu werden die Kolonien aus den Agarosetropfen mittels geeigneter Maßnahmen wie vorsichtiges Zerdrücken der Tropfen oder Auflösen der Agarose oder Zerschneiden derselben freigesetzt und auf Differenzierungsmedium (Tabelle 4) überführt. Pro Petrischale (0 10 cm) werden Kolonien aus 2 - 12, vorzugsweise 4 - 10, insbesondere 5 - 7 Agarosetropfen aufgebracht und wie unter Schritt 4 angegeben kultiviert.
Tabelle 4, Zusammensetzung des Differenzierungsmediums
Figure imgf000013_0001
MES 0,4 - 0,8 g/1
B5-Vitamine(1000x konzentriert Gamborg et al.,Exp. Cell Res. 1968) 0,3 - 0,7 ml/1
Der pH wird auf 4,0 - 7,0, vorzugsweise auf 5,0 - 6,5, insbesondere auf 5,5- 5,8 eingestellt und die Lösung autoklaviert. Sterilfiltrierte Vitamine und Hormone werden anschließend zugesetzt. Die Konzentration an BAP entspricht der unter Schritt 4 angegebenen während NAA in einer Endkonzentration von 0,05 - 0,4, vorzugsweise 0,08 - 0,2, insbesondere 0,09 - 0,12 μM zugesetzt wird. Schritt 6: Sobald die Kalli grüne, organogene Strukturen aufweisen, werden 1 - 10, insbesondere 3 - 7, vorzugsweise 4 - 6 Kalli in Petrischalen (0 5 cm), die Sproßmedium (Tabelle 5) enthalten, umgesetzt.
Tabelle 5, Zusammensetzung des Sproßmediums
Figure imgf000014_0001
Der pH wird auf 4,0 - 7,0, vorzugsweise auf 5,0 - 6,5, insbesondere auf 5,5- 5,8 eingestellt und die Lösung autoklaviert. Die Vitamine werden nach dem Autoklavieren hinzugegeben. Im weiteren Verlauf der Kultur entwickeln sich kleine Sprosse, die von umgebenden Kallusgewebe befreit werden und anschließend jeweils auf Sproßmedium subkultiviert werden. Da häufig neuer Wundkallus gebildet wird, muß dieser Vorgang des Entfernens von Kallus und Subkultivierung auf frischem Medium meist mehrfach wiederholt werden. Hierbei wird graduell die Wahl des Kultivierungsgefässes der Streckung der Sprosse angepaßt. Schritt 7: Haben die Sprosse eine Lange von 0,5 - 2, vorzugsweise von 0,8 -1,8, insbesondere von 1 - 1,5 cm erreicht, so werden sie an der Basis abgechnitten und diese für kurze Zeit in 2 - 10, vorzugsweise 4 - 8, insbesondere 5 - 5,5 M NAA-Lösung getaucht. Die weitere Kultivierung erfolgt auf modifiziertem Sproßmedium (Tabelle 6).
Tabelle 6, Zusammensetzung des modifizierten Sproßmediums
Figure imgf000015_0001
Der pH wird auf 4,0 - 7,0, vorzugsweise auf 5,0 - 6,5, insbesondere auf 5,5- 5,8 eingestellt und die Lösung autoklaviert. Die Vitamine werden nach dem Autoklavieren hinzugegeben. Im weiteren Verlauf bewurzeln sich die Sprosse und bilden kleine Pflanzen. Sprosse, die Wundkallus bilden, müssen erneut abgeschnitten und die NAA-Behandlung wiederholt werden. Die Pflanzen werden nachdem sie eine Größe von 4 - 5 cm erreicht haben, in steriles Substrat aus Erde und Vermiculite bzw. Sand überführt und im Gewächshaus weiterkultiviert.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Isolation von Protoplasten konnten Ausbeuten an Protoplasten zwischen 2xl06 (H. maximiliani, H. nuttallii) - 3xl06 (H. giganteus) g'1 Frischgewicht und Teilungsraten (als Maß der Vitalität) nach einer Woche Kultur von 60 - 70% für alle Genotypen erzielt werden. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Fusion der Protoplasten konnten Fusionsraten von 8 - 10% für verschiedene Genotypen und Teilungsraten nach einer Woche Kultur von 40 - 50% erzielt werden, wobei nur ein sehr geringer Verlust durch Absterben der Protoplasten aufgrund der Fusionslösungen zu beobachten war.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Regeneration von interspezifischen Hybriden mit neuen Eigenschaften (z.B. Pilzresistenz) weist die folgenden Vorteile auf:
• Bewurzelung der Regenerate durch kurze Hormonbehandlung, keine Pfropfung notwendig • Erhalt von zum größten Teil (80%) fertilen Pflanzen
• Einbringung von Wildartgenom in die Kultursonnenblume unter Umgehung der Kreuzungsbarriere zwischen den Arten, zum Zwecke des Erhaltens von Pflanzen mit neuen Eigenschaften (z.B. Pilzresistenz).
Die erfindungsgemäßen Verfahren ermöglichen, 1. die reproduzierbare Isolierung von Protoplasten zum Beispiel aus Wildarten der Sonnenblume, 2. deren effiziente und gleichzeitig schonende Fusion mit Protoplasten zum Beispiel aus der Kultursonnenblume und 3. die Regeneration von interspezifischen, fertilen Hybriden der Arten mit neuen Eigenschaften. Diese Verfahren dienen dazu, die Kreuzungsbarriere zum Beispiel zwischen Kultursonnenblume und deren perennierenden Wildarten zu umgehen und so die in den Wildarten vorhandenen agronomisch interessanten genetischen Eigenschaften zum Beispiel für die Sonnenblumenzüchtung zugänglich zu machen.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Gewinnung von Protoplasten aus Blättern umfassend die Inkubation von Streifen der Blätter der obersten zwei bis fünf Nodi in Mesophyll-
Enzymlösung, enthaltend Cellulase, Pectolyase, Macerocym und Driselase über 10-
24 Stunden bei 10-24° C, die Erhöhung der Temperatur auf 16-30° C und die Inkubation unter Schütteln über etwa 30 Minuten und nachfolgender Aufreinigung der Protoplasten.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Mesophyll- Enzymlösung 0,05-0,25% Cellulase, 0,01-0,15% Pectolyase, 0,25-1,5% Macerocym und 0,001-0,025% Driselase enthält.
3. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Blätter von einer Helianthus- Wildart stammen.
4. Verfahren zur Fusion von Protoplasten durch
Mischen der Protoplasten bei einer Dichte von 1-4.4 Millionen Protoplasten/ml, nachfolgender Zugabe eines gleichen Volumens einer Fusionslösung, umfassend 10-
25% PEG und 3-14% DMSO, Inkubation für 10-30 Minuten bei Raumtemperatur im Licht und nachfolgender Zugabe eines Salzpuffers und Inkubation für 1 bis 3 Stunden bei Raumtemperatur im Licht.
5. Verfahren gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Fusionslösung
10-25% PEG
70-110 mM Mannit
40-80 mM CaCl2
20-30 mM Glycin
3-14% DMSO umfaßt.
6. Verfahren gemäß Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß Protoplasten von Helianthus annus mit Protoplasten einer Helianthus-Wildart gemischt werden, um Pflanzen mit neuen Eigenschaften zu erhalten.
7. Verfahren zur Herstellung einer Pflanze oder von Reproduktionsmaterial dieser Pflanze, wobei das Verfahren umfaßt, die Fusion von Protoplasten gemäß einem der Ansprüche 4-6, die Regenerierung von Pflanzen oder Reproduktionsmaterial dieser Pflanzen oder von beidem aus dem Protoplasten und gegebenenfalls das biologische Replizieren der regenerierten Pflanzen oder des Reproduktionsmaterials von diesen Pflanzen.
8. Pflanzen erhältlich nach dem Verfahren gemäß Anspruch 7.
9. Pflanzenzellen erhältlich durch die Fusion der Protoplasten gemäß einem der Ansprüche 4-6.
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