WO1999043818A1

WO1999043818A1 - Nouveaux fragments d'adn regissant l'expression genique predominante dans les organes des fleurs

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Publication number: WO1999043818A1
Application number: PCT/JP1999/000568
Authority: WO
Inventors: Yoshimitsu Takakura; Tsuyoshi Inoue; Hideaki Saito; Toru Ito
Original assignee: Japan Tobacco Inc.
Priority date: 1998-02-25
Filing date: 1999-02-10
Publication date: 1999-09-02
Also published as: CN1266458A; EP0984064A1; CA2288219A1; US20030148320A1; AU2300199A; US7109321B2; EP0984064A4; AU745131B2; KR20010012118A

Description

明細書

花器で優勢な遺伝子発現を指令する新規 DN A断片技術分野

本発明は、花器において外来遺伝子を特異的に発現させる性質を有するプロモ —ターに関するものである。背景技術

従来、花器で発現する遺伝子として、葯特異的なもの、雌蕊特異的なもの等いくつか報告例がある。そのうち遺伝子のプロモーター配列まで明らかになつている例は数少ない。双子葉植物においては、例えば Mariani等の文献（Mariani etal. Nature, 347, 737-741, 1990)には、タバコの葯の夕ペート細胞特異的遺伝子 TA29のプロモ一夕一の発現部位解析が報告されている。また Goldman等の文献 (Goldman et al. The EMBO Journal 13, 2976-2984, 1994)ではタバコの雌蕊の柱頭特異的遺伝子 STIG1の単離、およびそのプロモーターの発現部位解析が報告されている。さらにこれら 2つの文献においては、プロモーターに細菌由来の RNA 分解酵素を連結、植物細胞に導入することにより、それぞれ雄性不稔、雌性不稔タバコを作出している。これらは組織特異的プロモーターの利用による生理 ·形態の人為的操作の例でもある。一方、単子葉植物においては、雌蕊特異的プロモ —夕一の報告は未だなされておらず、葯特異的なプロモーター単離の報告例があるのみである。例えば特表平 6— 5049 1 0号公報では、イネの葯特異的遺伝子の単離およびそのプロモーター配列とその利用法が報告され、またツチャ等の文献（Tsuchiya et al. Plant Mol. Biol. 26, 1737-1746, 1994) では、イネの未熟葯の夕ペート細胞特異的プロモー夕一の発現解析が報告されている。

植物の花器、特に生殖器官の形態や生理的現象を人為的に改良するため、あるいは様々な遺伝子の花器における機能を解析するためには花器で特異的な発現を示すプロモーターが必要不可欠である。ところが主要穀物の大部分を占める単子葉植物において、花器において優勢な発現をする遺伝子の単離例は非常に少ない。特に雌性生殖器官である雌蕊あるいは開花調節を司る鱗被において優勢な発現を示すプロモーター配列は未だ報告されていない。発明の開示

本発明の目的は、従来特に単子葉植物において不可能であった雌蕊あるいは鱗被において外来遺伝子を特異的に発現させ、遺伝子工学的に操作することを可能にする新規な花器特異的プロモ一夕一活性を有する D N A配列を提供することである。

本発明者等は、上記課題を解決するために鋭意研究した結果、水稲の雌蕊 c D N Aライブラリーを雌蕊プローブと葉プローブとを用いてディファレンシャルスクリーニングすることにより、花器特異的発現を示すクローンを単離かつ同定することに成功し、本発明を完成させた。

本発明の第 1の側面によれば、配列表の配列番号 2で表される塩基配列のうち、第 3 3 3 5番目から第 5 1 0 8番目の塩基から成る配列若しくはその一部の配列、またはこれらの配列のうち 1または複数のヌクレオチドが欠失、置換、挿入若しくは付加された配列を含むプロモータ一活性を有する D N A断片が提供される。本発明の好ましい態様においては、配列番号 2で表される塩基配列のうち、第 3 3 3 5番目から第 5 1 0 8番目の塩基から成る配列の一部の配列が、転写開始点（前記配列番号 2で表される塩基配列のうち、第 4 9 9 5番目から第 4 9 9 7 番目の塩基）上流少なくとも 5 0 0塩基から下流であることを特徴とする D N A 断片が提供される。

本発明の好ましい態様においては、配列番号 2で表される塩基配列のうち、第 3 3 3 5番目から第 5 1 0 8番目の塩基から成る配列の一部の配列が、最初の翻訳開始コドン（前記配列番号 2で表される塩基配列のうち、第 5 0 1 6番目から第 5 0 1 8番目の塩基）上流域である D N A断片が提供される。

本発明の好ましい態様においては、翻訳開始コドン上流域が、転写開始点上流少なくとも 5 0 0塩基から下流であることを特徴とする D N A断片が提供される。本発明の好ましい態様においては、配列番号 2で表される塩基配列のうち、第 3 3 3 5番目から第 5 1 0 8番目の塩基から成る配列の一部の配列が、転写開始点（前記配列番号 2で表される塩基配列のうち、第 4 9 9 5番目から第 4 9 9 7 番目の塩基）上流域である D N A断片が提供される。

本発明の好ましい態様においては、転写開始点上流域が、少なくとも転写開始点上流 5 0 0塩基であることを特徴とする D N A断片が提供される。

本発明の好ましい態様においては、配列表の配列番号 2で表される塩基配列のうち、第 3 3 3 5番目から第 5 1 0 8番目の塩基から成る配列、またはこの配列のうち 1または複数のヌクレオチドが欠失、置換、挿入若しくは付加された配列を含むプロモーター活性を有する D N A断片が提供される。

本発明の第 2の側面によれば、配列表の配列番号 2で表される塩基配列のうち、第 1番目から第 5 3 6 9番目の塩基から成る配列若しくはその一部の配列、またはこれらの配列のうち 1または複数のヌクレオチドが欠失、置換、挿入若しくは付加された配列を含むプロモーター活性を有する D N A断片が提供される。

本発明の好ましい態様においては、配列番号 2で表される塩基配列のうち、第 1番目から第 5 3 6 9番目の塩基から成る配列の一部の配列が、 Hind l l l部位 (前記配列番号 2で表される塩基配列のうち、第 3 3 3 5番目から第 3 3 4 0番目の塩基）から下流であることを特徴とする D N A断片が提供される。

本発明の好ましい態様においては、配列番号 2で表される塩基配列のうち、第 1番目から第 5 3 6 9番目の塩基から成る配列の一部の配列が、転写開始点（前記配列番号 2で表される塩基配列のうち、第 4 9 9 5番目から第 4 9 9 7番目の塩基）上流少なくとも 5 0 0塩基から下流であることを特徴とする D N A断片が提供される。

本発明の好ましい態様においては、配列番号 2で表される塩基配列のうち、第 1番目から第 5 3 6 9番目の塩基から成る配列の一部の配列が、第 3番目の Bgl l l部位（前記配列番号 2で表される塩基配列のうち、第 5 1 0 3番目から第 5 1 0 8番目の塩基）から上流であることを特徴とする D N A断片が提供される。本発明の好ましい態様においては、配列番号 2で表される塩基配列のうち、第 1番目から第 5 3 6 9番目の塩基から成る配列の一部の配列が、最初の翻訳開始コドン（前記配列番号 2で表される塩基配列のうち、第 5 0 1 6番目から第 5 0 1 8番目の塩基）上流域である D N A断片が提供される。

本発明の好ましい態様においては、配列番号 2で表される塩基配列のうち、第 1番目から第 5 3 6 9番目の塩基から成る配列の一部の配列力転写開始点（前記配列番号 2で表される塩基配列のうち、第 4 9 9 5番目から第 4 9 9 7番目の塩基）上流域である D N A断片が提供される。

本発明の好ましい態様においては、配列表の配列番号 2で表される塩基配列のうち、第 1番目から第 5 3 6 9番目の塩基から成る配列、またはこの配列のうち 1または複数のヌクレオチドが欠失、置換、挿入若しくは付加された配列を含むプロモーター活性を有する D N A断片が提供される。

本発明の第 3の側面によれば、上記した本発明によるプロモー夕一活性を有する D N A断片とその制御下にある所望の構造遺伝子とを含むキメラ D N A配列が提供される。

本発明の第 4の側面によれば、上記した本発明によるキメラ D N A配列を有する形質転換用ベクターが提供される。

本発明の第 5の側面によれば、配列表の配列番号 2で表される塩基配列のうち、第 1番目から第 5 3 6 9番目の塩基から成る配列もしくは花器特異的プロモー夕一活性を保持するその一部の配列とハイブリダィズし得る、花器特異的プロモー夕一活性を有する D N A断片が提供される。ここで本発明の好ましい態様においては、上記ハイブリダィゼーションは中程度のハイブリダィゼ一シヨン強度の条件下で行われる。

本発明の第 6の側面によれば、イネまたは他の植物のゲノム D N Aライブラリ一より配列表の配列番号 1で表される塩基配列もしくはその一部の配列をプロ一ブとして用いてスクリーニングすることにより得られる DNA配列から特定し得ることを特徴とする花器特異的プロモー夕一配列が提供される。ここで本発明の好ましい態様においては、上記スクリーニングは、中程度のハイブリダィゼーション強度の条件下でのハイブリダィゼーシヨンにより行われる。

本発明の第 7の側面によれば、配列表の配列番号 1で表される配列のうち、第 2 2番目から 1 2 7 8番目の配列中、もしくはそれらに相補的な塩基配列中の少なくとも連続する 1 5塩基の配列を有する D N A断片が提供される。図面の簡単な説明図 1は、 RPC2 1 3のノーザン分析の結果を示す写真である。

図 2は、 RPC2 1 3の RT- PCR分析の結果を示す写真である。

図 3は、 RPC21 3と RPG106の制限酵素地図の比較を示す説明図である。

図 4は、転写開始点付近の塩基配列を示す説明図である。

図 5は、プライマ一伸長分析の結果を示す写真である。

図 6は、プロモ一夕一発現解析用べクタ一の構築手順を示す模式図である。図 7は、 2 1 3プロモー夕一の G U Sによる発現部位解析結果をまとめたグラフである。

図 8は、 2 1 3プロモー夕一の G U Sによる発現部位解析の一例を示す写真である。発明を実施するための好ましい形態

以下、本発明を詳細に説明する。

本発明者等が見いだした発明の一つは、上述したように、配列表の配列番号 2 で表される塩基配列のうち、第 1番目から第 5 3 6 9番目の塩基から成る配列、および第 3 3 3 5番目から第 5 1 0 8番目の塩基から成る配列、若しくはそれらの一部の配列、またはこれらの配列のうち 1または複数のヌクレオチドが欠失、置換、挿入若しくは付加された配列を含むプロモーター活性を有する D N A断片である。

本発明のプロモーター配列、すなわち配列番号 2に記載されている配列のうち、第 1番目から 5 3 6 9番目までの配列は、他の公知のプロモーター配列と相同性がないことから、新規なプロモータ一配列であると考えられる。

本発明の D N A断片が有するプロモーター活性は、花器特異的である。本明細書において、プロモーター活性が花器特異的であるとは、本発明の D N A断片が、他の器官と比較して主に穂孕み期の未熟雌蕊、開花期の成熟雌蕊、鱗被および内 ·外穎において優勢にプロモーター活性を発現することを意味する。後述する実施例中の逆転写 PCR実験において、これらの花器以外の諸器官における発現量は未熟雌蕊における発現量のおよそ 1 / 1 00未満であった。なお、この場合、調査した器官は、上記花器 3器官の他に、開花期の葯、播種後約 1 ヶ月の葉及び根、受精後 1〜 2週間の未熟種子、発芽直後の種子及びカルスである（図 1、図 2、表 1参照）。

この配列表の配列番号 2で表される塩基配列には、以下の特徴がある。

1. 転写開始点は連続して 3ケ所存在し、転写開始点の塩基は、上流から（：、 A、 A (シ卜シン、アデニン、アデニン）である（配列番号 2の第 4 9 9 5〜4 9 9 7 番目の塩基）。

2. 最も上流の転写開始点の C (シ卜シン）の 31 bp上流に TATAボックス (Corden et al. Science 209, 1406-1414, 1980) 様配列（5' - TATAAA- 3' )が存在する（配列番号 2の第 49 64〜4 9 6 9番目の塩基）。

3. 最も上流の転写開始点の C (シトシン）の 21 bp下流には 1つめの翻訳開始コドン ATGが存在する（配列番号 2の第 5 0 1 6〜 5 0 1 8番目の塩基）。

4. さらに、 1つめの翻訳開始コドンの 273 bp下流には 81 bpのイントロン配列を挟んで 2つめの ATGが同じ読み枠で位置している。

本発明においては、この配列番号 2の塩基配列のうち、推定構造遺伝子領域の上流部位（構造遺伝子領域の 5 ' 末端付近の塩基を一部含んでいるかもしれなレ、すなわち第 1番目から第 5 3 6 9番目の塩基から成る配列、および第 3 3 3 5番目から第 5 1 0 8番目の塩基から成る配列をプロモ一夕一配列として特定したものであるが、これらの配列の一部であってもプロモ一夕一活性を有する場合は、本発明の範囲に含まれるものである。例えば、上述したように、第 4 9 9 5番目に転写開始点が存在することから、第 1番目から第 4 9 94番目までの領域、あるいは第 3 3 3 5番目から第 4 9 94番目までの領域もプロモーター活性を有することが予想される。

さらに、後者の配列においては、たまたま第 3 3 3 5番目に Hindlllの切断部位があつたため、ここからの配列をプロモー夕一配列として特定したものであるが、これより下流の領域から始まる配列であってもプロモーター活性を有することが当然予想される。即ち、これまでに植物から単離されたプロモー夕一のなかで、その転写開始点より上流 0.3 kbないし 0.4 kbの領域が当該プロモーターの組織 ·時期特異性あるいは誘導性をほぼ完全に保持していることが明らかにされた例が、数多く報告されている。例えばイネのタイプ II グルテリン遺伝子のプロモーターでは、胚乳における組織および時期特異的発現は、転写開始点上流 441 bpの断片だけで十分実現される（Takaiwa et al. Plant Mol. Biol. 16: 49-58, 1991)。また、 Brassica oleraceaの自家不和合性関連遺伝子 SLG13のプロモー夕一では、転写開始点より上流 411 bpの範囲が、雌蕊と花粉における発現を規定している（Dzelzkalns et al. The Plant Cell 5: 855-863, 1993) 。あるいはトマ卜の anionic peroxidase遺伝子のプロモーターでは、転写開始点上流 358 bp力器官特異性の他、傷害 '病原菌誘導性をも決定している（Mohan et al. PlantMol. Biol. 2: 475-490, 1993) 。このようにプロモーター配列は、報告された塩基配列の一部であっても、転写開始点の上流域数百 bpであればそのプロモー夕一としての機能特にその特異性をほぼ完全に保持することが少なくない。

したがって、本発明のプロモータ一配列において、本発明において特徴づけられた花器特異性を有する、転写開始点より上流数百 bp、好ましくは転写開始点より上流約 500 b の DN A断片を含む配列も本発明の範囲に含まれるものである。例えば本発明の塩基配列を基に設計されたプライマ一を用いて、 P CRによりィネゲノムから容易に単離された転写開始点より上流数百 bpの領域、またはこれを含む領域が、本発明のプロモーターの本来有する特性を保持していた場合、この短いプロモーター配列は本発明に含まれるものである。

なお、本発明の DN A断片は、例えばイネを材料とする下記実施例に記載された方法により得ることができる。あるいは、本発明によりその塩基配列が明らかになったので、本発明の DNA断片の両端部分とそれぞれ対合する 2つのオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、イネのゲノムを铸型とする PCR法により容易に調製することができる。この配列が花器特異的であるか否かの判断は、このプロモーター配列に /3- glucuronidase (GUS) 遺伝子を接続したキメラ遺伝子を構築し、イネへ導入し、発現部位を確認することにより行なうことができる。

本発明は、これらの配列のうち 1または複数のヌクレオチドが欠失、置換、挿入若しくは付加されたプロモーター活性を有する DN A断片もその範囲に含むものである。

一般に、生理活性を有する DN Aの塩基配列が小さく変更された場合、すなわち、該塩基配列の中の 1又は複数のヌクレオチドが置換され若しくは欠失し又は 1又は複数のヌクレオチドが付加若しくは挿入された場合でも、該 D N Aの生理活性が維持される場合があることは周知の事実である。従って、上記した本発明のプロモーター配列にこのような修飾が加えられ、かつ、プロモーター活性を有する D N A配列も本発明の範囲内に含まれる。すなわち、配列表の配列番号 2で表される塩基配列のうち、第 1番目〜第 5 3 6 9番目の塩基から成る配列および第 3 3 3 5番目〜第 5 1 0 8番目の塩基から成る配列、若しくはプロモータ一活性を有するそれらの一部、例えば転写開始点より上流数百 bpから成る配列に加え, これらの配列のうち少数のヌクレオチドが欠失し、置換し又はこれらの配列に少数のヌクレオチドが挿入若しくは付加された、プロモー夕一活性を有する D N A 配列も本発明の範囲に含まれる。

また、同様に、配列表の配列番号 2で表される塩基配列のうち、第 1番目から第 4 9 9 4番目までの領域、あるいは第 3 3 3 5番目から第 4 9 9 4番目までの領域の塩基から成る配列に加え、これらの配列のうち少数のヌクレオチドが欠失し、置換し又はこれらの配列に少数のヌクレオチドが挿入若しくは付加された、プロモーター活性を有する D N A配列も本発明の範囲に含まれる。

ヌクレオチドの付加、挿入、欠失又は置換は、例えば、周知技術である部位特異的変異誘発 (例えば Nuc l. Ac i ds Res. 10 : 6487-6500, 1982)により実施することができ、本明細書において「1又は複数のヌクレオチド」とは、部位特異的変異誘発法により付加、挿入、欠失又は置換できる程度の数のヌクレオチドを意味する。

部位特異的変異誘発は、例えば、所望の変異である特定の不一致の他は変異を受けるべき一本鎖ファージ D N Aに相補的な合成オリゴヌクレオチドプライマ一を用いて次のように行うことができる。すなわち、プライマーとして上記合成ォリゴヌクレオチドを用いてファージに相補的な鎖を合成させ、得られた二重鎖 D N Aでファージ担持性宿主細菌を形質転換する。形質転換された細菌の培養物を寒天にプレートし、ファージを含有する単一細胞からプラークを形成せしめる。そうすると、理論的には、 5 0 %の新コロニーが単鎖として変異を有するファージを含有し、残りの 5 0 %が元の配列を有する。得られたプラークを、上記所望の変異を有する DNAと完全に一致するものとはハイブリツド形成するが、もとの鎖を有する不一致のものとはハイブリツド形成しない温度において、キナーゼ処理された合成プローブとハイブリツド形成せしめる。次に該プローブとハイブリド形成するプラークを拾い、培養し、 DNAを回収する。

なお、プロモーター配列に、その活性を喪失せしめない 1又は複数のヌクレオチドの置換、欠失、付加又は挿入の方法としては、上記の部位特異的変異誘発の他にも、遺伝子を変異原で処理する方法及び遺伝子を選択的に切断し、次に選択されたヌクレオチドを除去、付加、又は置換し、次いで連結する方法が考えられる。

さらに、 PCR法を用いた部位特異的変異導入（Mikaelian et al. Nucl. Acids Res. 20: 376, 1992)による、特定ヌクレオチドの置換、欠失、付加又は挿入や、 Taq DNAポリメラーゼの忠実度の低さを利用したランダムなヌクレオチドの置換 (Zhou et al. Nucl. Acids Res. 19: 6052, 1991)も考えられる。

次に、本発明者等が見いだしたさらなる発明について説明する。

さらなる発明は、イネまたは他の植物由来のゲノムライブラリーより配列表の配列番号 1で表される塩基配列またはその一部をプローブとして用いて得られる配列から特定し得る花器特異的プロモーター配列である。

この、配列表の配列番号 1で表される塩基配列は、後述する実施例に記載されたイネ（I R 24)を用いたディファレンシャルスクリーニングにより得られる。あるいは、本発明によりその塩基配列が明らかになつたので、本発明の DN A断用い、イネの花器由来 cDNA、あるいはゲノムを铸型とする P CR法により容易に調製することができる。

この塩基配列は、その全体をプローブとして用いてもよく、またその一部をプローブとして用いても良い。

ゲノムライブラリーの構築は、これに限定されるものではないが、イネの場合、例えば後述する実施例に詳細に記載されている方法により緑葉を用いて構築する。このようにして得られたライブラリ一より、上記プローブを用いてプロモー夕一を含むゲノム断片を調製し、プロモー夕一配列を特定する。この配列が花器特異的であるか否かの判断は、このプロモ一夕一配列に i3 - g l ucu ron i das e ( G U S ) 遺伝子を接続したキメラ遺伝子を構築し、所望の植物へ導入し、発現部位を確認することにより行なうことができる。

こうして得られたプロモーター配列の花器特異性の程度は本明細書中で後述する実施例 3 ( 2 ) に記載されている特異性の程度と同等（少なくとも任意の花器で優勢）であることが必要である。

最後に、本発明の他の側面である花器特異的プロモーター検索用プローブについて説明する。

本発明のプローブは、配列表の配列番号 1で表される配列のうち、第 2 2番目から 1 2 7 8番目の配列中、もしくはそれらに相補的な塩基配列中の少なくとも連続する 1 5塩基の配列を有する D N A断片よりなるものである。上述した配列番号 1中の第 2 2番目〜第 1 2 7 8番目までの配列もしくはこの配列と相同性の高い配列は、上述した花器特異的な発現をする可能性が高い。したがって、この配列もしくはその一部の配列をプローブとして用いて植物ゲノム D N Aを検索することにより、イネもしくは他の植物中に存在する新たな花器特異的プロモ一夕を見いだすことが可能となる。

プローブは、上記配列に基づいて設計されるものであり、その長さは少なくとも連続する 1 5塩基以上であることが好ましく、 1 5塩基以上であれば上記配列の全長までのいずれの長さであってもよい。また、上述した配列から選定された D N A断片を、上記配列もしくはこれと相同性の高い配列に対し特異的にハイブリダィズする性質を失わないように塩基の付加、欠失、挿入もしくは置換した配列も本発明に含まれる。なお、この塩基配列の付加、欠失、挿入もしくは置換の方法は、上述した本発明の花器特異的プロモーターで用いる方法と同様な方法で行なうことが可能である。

本発明のプローブは、後述する実施例で詳述する方法により得られる配列表の配列番号 1に記載の D N A断片を、適当な制限酵素によって切断することにより調製できる。また、この配列を含む試料を用いて P C R反応を行なうことによつて、調製することも可能である。あるいは、市販の D N A合成機（例えば、パーキンエルマ一社製）により慣用された方法により、プローブとなる一本鎖 D N A を合成することも可能である。

本発明のプローブは慣用された方法により、例えば、放射線同位元素等により標識できる。例えば 32 Pを用いる場合は、ランダムプライミングラベルにより標識し、また、合成オリゴを使用する場合はリン酸化酵素により 5 ' 末端標識する。本発明のプローブを用いる際のハイブリダィゼーシヨンは、慣用された方法により行なうことができる。一般には、中程度のハイブリダィゼーシヨン強度（適当なイオン強度（例えば、 0〜5 0 %ホルムアミド、 6 X S S C、 I Xデンハル卜溶液など）のもとに、室温〜 5 0 でのハイブリダィゼ一シヨンおよび洗浄）によつて行なう。本発明のプロ一ブを対象植物のゲノムライブラリ一に対して用い、ハイブリダィズした対象植物のゲノム DNAを単離し、この遺伝子の上流域を特定することにより新たな花器特異的プロモー夕一を得ることができる。

本発明の花器特異的プロモーターは、従来特に単子葉植物において不可能であつた雌蕊あるいは鱗被を遺伝子工学的に操作 ·改良することを可能にする新規な花器特異的プロモーター配列であることから、下記の用途に用いることができる。

1) 本発明のプロモ一夕一配列またはその一部に耐冷性、耐乾燥性、耐暑性など、ストレス耐性を助長する構造遺伝子を接続することによる、雌性生殖器官の受精能力の改良。

2) 本発明のプロモーター配列またはその一部に不稔化を引き起こす構造遺伝子を接続することによる雌性不稔植物の作出。

3) 本発明のプロモーター配列またはその一部に植物細胞の伸長または分裂を促進する構造遺伝子を連結することによる、花器の部位特異的増大、伸長。

4) 鱗被における発現を利用することによる遺伝子工学的な開花制御。

5) 除草剤耐性あるいは病害抵抗性を賦与する遺伝子を繋げることによる花器全体またはその一部、例えば雌蕊への抵抗性の賦与。

以下の実施例により本発明を例示するが、本発明は実施例によって限定されることはない。実施例

実施例 1 ：花器特異的 cDNAの単離水稲品種「月の光」および「IR24」を温室で栽培し、以下の実験に供試した。

(1) RNAの抽出

「IR24」の葉、未熟 ·成熟雌蕊、葯、鱗被、内，外穎、未熟種子、発芽種子、根、カルス、および未熟穎花（長さ 4.5〜6. Omm) を採取後直ちに液体窒素中で凍結し- 80 。Cで保存した。これらの組織よりフエノール- SDS法（ Watanabe and Price, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. , 79, 6304-6308, 1982) により全 RNAを抽出した。ただし、抽出緩衝液へ酸化防止剤 i3メルカプトエタノールを最終濃度 10 %(V/V)になるように添加した。また、逆転写 PCR実験に供試する組織については微量の DNAの混入を極力抑えるために、塩化リチウム沈澱の代わりに、 RNase インヒビター（RNAguard Pharmacia社）存在下で DNascI (FPLCpure Pharmac i a 社）処理を行った。 40 mM Tris-CI pH7.5、 6 niM MgC12の緩衝液中に、 0.375 ng/ lの全核酸と 1.75 units/μ 1 RNaseインヒビ夕一を混合し、ここへ、 0.375 units/ 1の DNasel (濃度はいずれも最終濃度）を加え、 37^DCで 10〜30分間保温した。 DNaselはフエノール · クロロフオルム抽出により、失活させた。

葉、根（図 1では根（土）と表記）は播種後 1ヶ月の温室育成の株より、未熟雌蕊は出穂前 1週間〜 2週間の株より、成熟雌蕊、葯、鱗被、内外穎は、開花直前〜数日前、未熟種子は開花後 1〜2週間の株より採取した。また、発芽種子、根は、 N6培地（Chu et al. Scientia Sinica, 18, 659-668, 1975 ) 上で播種後それぞれ 1、 3週間無菌的に育成した植物体のものを用いた。カルスは、 2, 4- Dを 2 mg/1添加した N6固形培地上で種子より誘導し、同じ組成の液体培地中で 3週間振盪培養をしたものを用いた。雌蕊および葉の全 RNAについては、 Oligotex- dT30 super (宝酒造）を用いて添付説明書に従ってポリ A+RNAを調製した。

(2) 雌蕊 cDNAライブラリーの構築

雌蕊より単離精製した約 l^gのポリ A + RNAを铸型とし、 ZAP- cDNA合成キット (STRATAGENE社）を用いて cDNA合成を行った。 ^{3 2} Pの取り込み率による定量の結果、 oligo-dTプライミングにより逆転写された第一鎖 cDNAは約 55 ng、そこから直接合成された第二鎖 cDNAは約 72 ngであった。キット添付の説明書に従つて cDNAに EcoRIアダプターをつなぎ、 Xholで消化した後、ベクタ一 UniZAP XRへ連結した。その後ファージ DNAを Giga pack G ld packaging extract (STRATAGENE社）を用いてファージ粒子へパッケージングした。次いで大腸菌 PLK-F'を宿主細胞としてプレー卜へ展開し、ライブラリ一サイズを調べたところ、 3X106 pf_uの雌蕊 _cDNAライブラリーであると算出された。

(3) ディファレンシャルスクリーニング

基本的には Gasser et al. (The Plant Cell 1, 15-24, 1989) の方法に従つた。雌蕊 cDNAライブラリーから約 2, 000 pfuのファージを大腸菌 PLK-F'に感染させ、 14X10 cm角型シャーレに展開した。各々のプレー卜についてナイロンメンブレンフィル夕一 Hybond- N+ (Amcrsham社）を用いてレプリカフィルターを作成し、添付の説明書に従ってフィル夕一を処理した。ハイブリダィゼ一シヨン用プロ一ブとして、雌蕊と葉のポリ A + RNA約 100 ng (または全 RNA約 2 g) より合成した一本鎖 cDNAを用いた。 1の RNA溶液に 0.5 mMの d(ATG)TP、 lOmMの DTT、 ΙΧΜ-MuLV緩衝液（BRL社）を加え、 30 ng/ / 1のランダム DNAへキサマ一

(Pharmacia社）（または 80 ng// 1のオリゴ dTプライマー（Amersham社））を加えた（濃度はいずれも最終濃度）。 65°Cで 5分間処理し RNAの二次構造を解離させた後、室温でプライマーをアニーリングさせた。さらに 1.5 unit/ / 1の RNase インヒビ夕一（RNA guard Pharmacia社）、 10 uni i/β 1の逆転写酵素 M-MuLV

(BRL社）、 4 Ci/ lの [α- 32p] dCTPを加え（いずれも最終濃度）、計 20 1の反応液を 37でで 1時間ィンキュベ一トした。

さらに、非放射性の dCTPを最終濃度 0.5 mMになるように加え、 30分間反応を続けた。 Quick Spinカラム G - 50 Sephadex (BOEIIRINGER MANNHEIM社）を用いてラベルした DNAプローブの精製を行った。また 2 Nの NaOHを等量（最終濃度 1N) 加えることによりプローブを 1本鎖化した。フィル夕一はあらかじめプレハイブリダィゼーシヨン緩衝液（0.25 M Na 2 HP04 pH7.2、 7 % SDS、 1 mM EDTA, IXデンハルト溶液）中で 68T：、 10分間処理しておき、そこへ一本鎖化したプロ一ブ（ 0.2-0.3X10⁷ cpm/ml終濃度）とキャリアー DNA (0.1 mg/ml サケ精巣 DNA、 0.1 /ml λ DNA, 0.1 zg/mlイネ DNA) を加え、 68°Cでー晚（16- 24時間）ハイブリダィゼーシヨンを行った。フィルタ一の洗浄は、緩衝液（20 mM Na2HP04 pH7.2、 1% SDS、 1 mM EDTA) 中で室温、 68°Cで 15分を 2回ずつ行った。その後 Kodak X-Omatフィルムを 4〜5日間- 70°Cでフィル夕一に露光させた。約 30, 000個のプラークを供試した結果、雌蕊プローブでハイブリダィゼーションシグナルが強く検出され、しかも、葉プローブではシグナルが弱いプラークが一次選抜で 198個選抜された。このうちの 152クローンに関して、二次選抜を行つた。この際、プラークハイブリダィゼーシヨンの高いバックグラウンドを避けるため、また、選抜の効率化を図るため以下の方法で選抜を行った。まず一次選抜されたプラークをクロロフオルムを一滴滴下した 200 1 の SM緩衝液（0.1 MNaCK 7 mM MgS04 , 50 πιΜ Tris-Cl ρΗ7.5, 0.01% ゼラチン）中で 4°Cで保存した。この保存液を希釈し、プラークがごく低密度（10〜100 pfu /プレート）になるようにファージを播き、互いに離れたプラークを 1つ単離し、同じ緩衝液中で保存した。この保存液からファージを高濃度で含むプレート溶菌液を用意し、 ZAP cDNA合成キットの説明書に従って in vivo excisionを行い、ファージゲノムよりプラスミド（pBluescriptSK(- )) を調製した。

制限酵素 EcoRI及び Xhol (宝酒造）で消化することにより cDNAインサートを単離精製した。これを 0.8 %ァガロースゲル電気泳動で分画後、 HybondN+ナイ口ンメンプレンフィルタ一に転写し、雌蕊、葉プローブの他、葯、発芽種子、根、カルスまたは未熟種子の全 RNAからオリゴ dTプライマーを用いて合成した一本鎖 cDNAプローブを用いてディファレンシャルハイブリダィゼーションを行った。その結果、雌蕊プローブにハイブリダィズし、他のプローブに対しては殆どハイブリダィズしない 6つの cDNAクローンが得られた。このうちィンサ一ト cDNAの長さが約 1.5kbのクローンを「RPC213」と命名し、以下の実験に供試した。

(4) c DN Aクローンの発現器官特異性の解析

1) ノーザンハイブリダィゼ一シヨン分析

上記 3)で選抜された cDNAクローン「RPC213」について各器官での発現パ夕一ン及びその発現量を見るためにノーザンハイプリダイゼーシヨンを行った。フィルターの作製は以下のように行った。

まず上述 1)の各器官の全 RNA20 figを Sambrook el al. (Molecular Cloning, 1982)の方法に従って、脱イオンした Glyoxal と DMS0を用いて二次構造を除去した後、 1 ァガロースゲル中で分画した。次いで常法により RNAをナイロンメンブレン Gene Screen Plus (DU PONT社）に転写した。 80°C、真空で、 1時間乾燥させた後、フィル夕一を 20 mM Tris- CI pH8.0中で 5分間煮沸し Glyoxal を除去した。プローブは上記 cDNAの EcoRI- Xhol 1.5 kb断片をマルチプライムラべリングシステム（Amersham社）で RI ラベルしたものを用いた。プレハイブリダィゼ一ションおよびハイブリダィゼーションはフィルター添付の説明書に従い行った。洗浄は 2XSS 1% SDS及び 0.2XSS SDSを各々室温で 5分、 0.16XSS \% SDS、 65°Cで 15分を 2回行った後、 2XSSC、室温で 1分間という条件で行った。 Kodak X-Omat フィルムを一晩- 70°Cでフィル夕一に露光させた。

その結果、図 1に示す様に、成熟雌蕊において強いハイブリダィゼ一ションシグナルが検出され、内 ·外穎とカルスにおいて弱いシグナルが検出され、さらに葉と葯、および未熟種子において極めて弱いシグナルが検出された。その他の諸器官においてはシグナルは検出されなかった。従って、ノーザン分析の結果から、単離されたクローンは成熟雌蕊において比較的強く発現し、内 ·外穎とカルスにおいては弱く発現し、また葉と葯、および未熟種子においては極く微量にしか発現しないことが明らかとなった。なお転写物のサイズは、およそ 1.6kbと推定された。

2) 逆転写 PC R (RT-PCR) 分析

cDNAクローンの器官特異的発現についてより高い感度で解析するために、イネ各器官の RNAを铸型とした逆転写 PCRを行った。まず、 GENESIS 2000蛍光シークェンサ一（DuPont社）を用いて、プラスミド pBluescript SK (-)に挿入された cDNAの塩基配列を部分的に決定した。シークェンサ一添付の説明書に従い、 M13 および M4プライマー（宝酒造）より T7 DNA polymerase反応を行い、 6 %ァクリルアミドゲルで電気泳動を行った。 5' (EcoRI)側、 3' (Xhol)側の両方向からの塩基配列の決定を行った。このうち 3'側の約 400ヌクレオチド（mRNAセンス鎖）分の DNA塩基配列を参考にしてプライマ一

213S； 5'-CGCTATGGCCCGTTTCAGCT-3' (配列番号 3) および、

213AS； 5' -GTCGTCCTGCCGCTTCATTAC-3' (配列番号 4)

を DNA合成機（ABI社）により合成し、 0PCカートリッジ（ABI社）により精製し、逆転写 PCR実験に供試した。このプライマ一により約 250 bpの産物が増幅されることが期待される。上述の各器官の全 RNA10 figを、 500 ngのオリゴ（1T15プライマー（Amersham 社）と混合し、 55 1の反応液中で 7(TC、 1 0分問処理し二次構造を解離させ、氷上で急冷した後、 lXlst strand buffer (BRL社）、 0.5 mM dNTPmix, 10 mM DTT、 2 units/ l RNase インヒビ夕一（RNAguard Pharmacia社）、 10 units/^ 1逆転写酵素 Superscript (BRL社）（濃度はいずれも最終濃度）の 100 /x 1の反応液中で 37 ：、 60分間保温した。続いて 95°Cで 5分間処理し RNA-cDNAハイプリッドを解離させた後、氷上で冷却した。この溶液の cDNA濃度を 100 ng/;u l と見なした。次に合成された各器官の cDNAを希釈し、 100 ng//i l、 10 ng/ L 1 ng/ H K 0.1 ng/ 1の 4種類の希釈系列を作製し、 PCR反応の铸型とした。

PCR反応は以下の条件で行った。まず cDNA希釈液 1 1 に対し、最終濃度で 0.5 pmole//z 1プライマ一、 0.2 mM dNTP、 1 XPCR緩衝液、 0.05 U Taqポリメラーゼ（宝酒造）の反応液 20 1 を調製した。これを GeneA即 9600 (Perkin Elmer 社）を用いて 94 3分を 1回、 94 0.5分、 60°C 1分、 72°C 1分を 30回、 72°C 6 分を 1回という条件で PCRを行った。 PCR産物はァガロースゲル電気泳動、ェチジゥムブロマイド染色後、写真撮影した。各バンドの濃度を比較し、同じ濃さの 2サンプルには、本遺伝子に由来する cDNAが等量含まれていると評価した。

RPC213遺伝子のプライマ一については、予めプラスミドクローンを使って期待される分子量の産物が増幅されることを確認した。このプライマ一を用いて逆転写 PCR実験を行ったところ、図 2Aに示すように、まず、 100 ngの cDNAを铸型に用いた場合、成熟雌蕊と内 ·外穎、およびカルスにおいて濃い PCR産物のバンドが検出され、葯と未熟種子では薄いバンドが、また葉と発芽種子、根においては非常に薄いバンドが検出された。このうち成熟雌蕊と内 ·外穎では、銬型 cDNA 量を 1 ngにまで希釈した場合にも PCR産物が検出されたのに対し、カルス、葯ぉよび未熟種子では 10 ngまでしか産物が検出されなかった。さらに葉と発芽種子、根においては 100 ngより銹型を希釈すると産物が検出されなかった。これらバンドの検出の有無、およびバンドの濃淡の比較の結果から RPC213遺伝子のイネ各器官における発現量を比較すると、成熟雌蕊を 1とした場合、内 ·外穎では 1〜 1/10程度、葯と未熟種子、およびカルスでは 1/10程度、その他の器官では 1/100 程度と推定された。次に、花器の各部位および発達段階における発現を解析した。铸型として、成熟雌蕊全体、成熟雌蕊の柱頭、成熟雌蕊の子房、未熟雌蕊全体、鱗被より調製した cDNAを用いた。また、葉の cDNAおよびプラスミド DNAを対照として用いた。 RPC213特異的プライマーで PCRを行った。その結果、図 2 Bに示す様に、 1 0 ng の cDNAを铸型とした場合、葉以外の全ての器官で PCR産物が検出された。このうち未熟雌蕊、柱頭および鱗被においては踌型を 0. 1 ngにまで希釈しても産物が検出されたのに対し、成熟雌蕊およびその子房部においては 1 ngまでしか産物が検出されなかった。このことから、花器各部位における RPC213の発現量は、成熟雌蕊全体を 1とした場合、未熟雌蕊、柱頭および鱗被では 10程度、また子房では 1 程度であると推定された。従って逆転写 PCRの結果から、 RPC213遺伝子は未熟雌蕊と成熟雌蕊の柱頭および鱗被で強く優勢に発現し、成熟雌蕊の子房と内 ·外穎で弱く、その他の組織では微量にしか発現しない遺伝子であることが明らかとなつた。

以上 1)ノーザン分析の結果と 2) RT - PCRの結果を併せて表 1にまとめた。

表 1 RPC213遺伝子の発現解析のまとめ

。。成熟未熟内 . 未熟発芽根

解析法 \ 雌蕊柱頭子房雌蕊纖外穎葯種子種子根 (土）カルス oo

ノーザン分析 + + NT NT NT NT + 一 + + 一 + 1

R T - P C R 1 10 1 10 10 1 - 0.1 0.1 0.1 0.01 0.01 0.01 NT 0.1

+ + ；強い発現、 + ；弱い発現、土：；微量な究現、一；発現なし。

N T ；未解析。 RT-PCRの数値は成熟雌蕊を 1とした場合の相対値を示した。

(5) RPC213の塩基配列の決定

花器特異的発現を示す cDNAクローン RPC213 (約 1.5 kbp) の全塩基配列を、蛍光シークェンサ一（モデル 373A、 Applied Biosystems社）を用いて決定した。先に述べた、 M13プライマ一（宝酒造）を用いて決定した塩基配列情報を基に、プライマ一を合成し、さらに未解読領域の塩基配列を決定した。このプライマ一ゥォーキングを重ねることにより、最終的に、総塩基配列数 1496 bpの RPC213の塩基配列を決定した。 0RF検索を行い、最大の 0RFをとる読み枠を同定した。この読み枠において、翻訳終止コドン TGAのおよそ 70 bpおよび 90 bp下流に、ポリ Aシグナル様酉己歹 iJ (Heidecker and Messing, Annu. Rev. Plant Physiol.37, 439-466, 1986) が位置していた。 RPC213の全塩基配列を配列表の配列番号 1に示す。ただし、配列表 1の塩基配列には、後で述べるゲノムクローンの塩基配列を参考に、転写開始点以降の 28 bp分を付加してあるので、総塩基数は 1524 bp である。

配列番号 1に記載の配列の特徴は以下の通りである。

ntl、 nt2、 nt3：プライマー伸長によって決定された RPC213遺伝子の転写開始点 nt22〜！ U24： RPC213遺伝子の 1つめの翻訳開始コドン

iU295〜nt297： RPC213遺伝子の 2つめの翻訳開始コドン

ntl276〜ntl278： RPC213遺伝子の翻訳終止コドン

ntl343〜ntl348、 ntl365〜ntl370：ポリ A付加シグナル

ntl507〜！ 1U524：ポリ A 実施例 2 ：プロモーターの単離

(1) ゲノミックライブラリ一の作製

ゲノミック DNAを播種後約 2ヶ月のイネ品種「IR24」の葉から SDS—フエノール法と塩化リチウム沈殿法で単離精製した後、まず予備試験として制限酵素

Mbol (宝酒造）で部分分解し、見かけ上 16〜23 kbのサイズの断片を多く含む酵素反応条件を決定した。続いてこの決定した反応条件でゲノミック DNAを消化した後、ショ糖密度勾配遠心を行った。ショ糖は緩衝液（20 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA, 200 mM NaCl) へ溶解し、濃度を 5段階（10, 17.5, 25, 32.5, 40%) 作成した。このショ糖溶液を遠心管（40PA、日立）へ下からこの順で重層し、最後に部分分解 DNA溶液を重層した。 SRP28SA (日立）ロー夕一を用いて 20, 000 rpm> 17時間、 20°Cで遠心後、ベリス夕ポンプを用いて 0.5 mlづっ 80画分に分け、 16〜23 kbの DNAを最も多く含む画分を調製した。この DNA画分をべクタ一 λ DASH II/ BamHI(STRATAGENE社）へ T4 DNAリガーゼ（ BOEHRINGER MANNHEIM 社) を用レてライケ一シヨンし、 Gigapackl I Gold packaging extract

(STRATAGENE社）でファージ粒子へパッケージングした。以上の手順でイネゲノミックライブラリ一を構築した。ライブラリ一サイズは約 5X106 pf_uと算出された。

(2) クローンの選抜

約 10,000 pfuのファージを感染用の大腸菌 SRBP2と混合し、 14X10 cm角型シヤーレへ展開し、 39°Cでー晚培養した。ナイロンメンブレンフィル夕一 HybondN + (Amersham社）をプラーク表面と接触させ、フィルター添付の説明書に従ってフィルターを処理した。イネ花器特異的 cDNA (RPC213) の 5'側の EcoRI- Sal I 0.6 kb断片をマルチプライムラべリングシステム（Amersham社）で RIラベルしたものをプロ一ブとして用い、プラークハイブリダィゼ一シヨンを行った。ハイブリダィゼ一シヨン及び洗浄の条件は実施例 1 (3)に従った。但し、 IXデンハルト液とキャリアー DNAの使用は省略した。この方法により 100, 000個のプラークから 6 個の陽性クローンを選抜した。次に、これらのプラークからファージ DNAを調製し、これらを铸型として RPC213特異的プライマー 213S、 213ASを用いた PCRを行つた。その結果、 2クローン（RPG106、 RPG107と命名）において期待される約 250bpの産物が増幅された。

(3) プロモ一夕一を含む領域のサブクローニング

上記 2つの RPC213のゲノムクローンから DNAを抽出し、制限酵素 Sacl、 Hindlll (宝酒造）で消化後、 0.8 ¾；ァガロースゲル中で DNA断片を分画した。また、水稲品種アキヒカリ、 IR24の播種後約 1ヶ月の植物体から、フエノール- SDS 法（Komari et al. Theor. Ap l. Genet. 77, 547-552, 1989) により DNAを単離精製した。約 5 /xgの DNAを Sacl、 Hindlllで消化し、同様に電気泳動を行った。次に DNAをナイロンメンブレンフィルター HybondN+ (Amersham社）にブロッテングした後、前記 0.6 kbの cDNA断片を実施例 14) 1 と同様に RI ラベルしたものをプローブとしてサザンハイブリダイゼーションを行った。

ハイプリダイゼーション及び先浄の条件はフィルター添付の説明書に従った。その結果、 RPG106において全ゲノム DNAの場合と同サイズのバンドが現れた。そこでプローブと反応した RPG106の Sad 6.0 kb断片を pBluescriptの同サイ卜にサブクローニングした。次にプロモーターを含んだ領域をさらに特定するために BglII、 HindllK SacK Sal Iの計 4種の制限酵素を用いて物理地図を作成した (図 3) 。

(4) RPG106 Sad - Sail 5.4 kbの全塩基配列の決定

ゲノムクローン RPG106は、図 3に示したように 4所の Bglll部位がある。これらの制限部位を利用してまず、 RPG106を 5つの断片に分断した。即ち、 RPG106 Sad 6.0 kb(pBluescript)を BamHI、 Bglllで消化して、 Sacl-Bglll 0.7 kb ( + pBluescript), Bglll 2.1 kb、 Bglll 2.3 kb, Bglll 0.8 kb, Bglll - Sacl

0.07kb( + pBluescriptのマルチクローニング部位）の 5つの断片に分解した。このうち前 4者の塩基配列を決定した。 Sacl- Bglll 0.7 kbには pBluescriptが連結したままなので、プラスミドを再環状化した。それ以外の 3つの断片については、正逆両方向に pBluescriptの BamHI部位に挿入したプラスミドを作成した。 Bglll 2.1 kbには、その内部に 2つの Spel部位、 1つの Xhol部位があり、また、 Bglll 2.3 kb断片中には、 2つの EcoRV部位と 1つの Sailおよび Spel部位がある。各々の断片に関してこれらの制限部位を利用し、さらに細かくサブクロ一二ングを行い、 RPG106 Sacl 6.0 kbのほぼ全体を網羅する都合 14種のプラスミドを作成した。これらのプラスミドについて、 M13プライマ一（宝酒造）を用いて蛍光シークェンサ一（モデル 373A、 Applied Biosys tems社）により両鎖の塩基配列を決定した。この方法で明確に解読できなかった領域はプライマーウォーキングにより塩基配列を決定した。最終的に、総塩基配列数 5396 bpの RPG106

Sacl- Sail 5.4 kbの全塩基配列を決定した。この塩基配列を配列表の配列番号 2 に示した。

配列番号 2に記載の配列の特徴は以下の通りである。

ntl〜！ it5369、 nt3335〜！ it5108： GUSによってプロモーター活性を確認した配列 nt4964〜nt4969： TATAボックス様配列

nt4995、 4996、 4997：プライマー伸長によって決定された RPC213遺伝子の転写開始点

nt5016〜nt5018： RPC213遺伝子の 1つめの翻訳開始コドン

nt5370〜nt 5372： RPC213遺伝子の 2つめの翻訳開始コドン

IU516ト 1 5242：ィントロン配列

ntl〜！ U6：制限酵素 Sacl部位

nt729〜nt734、 nt2811〜！ it2816、 rU5103〜ni5108：制限酵素 Bgl 11部位

nt3335〜nt3340：制限酵素 Hindlll部位

RPC213 cDNAクローンと塩基配列を比較した結果、 RP 13遺伝子の 1つめの ATGと、 2つめの ATGの間には 81 bpのイントロン配列が存在することが明ら力、となった。なお、図 3の斜線で示したように、 cDNAの 5'末端から 1つめの Sail サイトまで領域（およそ 300 bp) と、この領域に相当するゲノム DNA RPG106の塩基配列は、イントロン配列以外は完全に一致した。

(5) 転写開始点の決定

RPC213のプロモーター領域を特定するため、まず RT- PCRにより転写単位の 5' 末端の解析を行った。上述のゲノムクローン RPG106 Bgl II 2.3 kb断片の 3'側約 300 bpの領域の塩基配列を参考に 4つのセンスプライマー 213A、 213B.213C, 213D および 1つのアンチセンスプライマ一 213Zを合成した（図 4参照）。铸型として成熟雌蕊 cDNAを 10 ng使用し、また対照として葉 cDNAを 10 ng、ゲノムクローン RPG106 Bgl II 2.3 kbを 10 ng使用した。 PCRの反応条件は実施例 1 (4) 2)に従った。その結果、対照とした葉 cDNAにおいてはどのプライマ一の組合わせでも増幅産物が得られなかったのに対して、雌蕊 cDNAにおいては 213Aと 213Zの組合せによりゲノムクロ一ンと同じサイズの産物が増幅された。この結果から 213Aと 213Bの間に cDNA配列の分断点、即ち、転写開始点、または、イントロンの 3'末端が存在すると考えられた。

次にプライマー伸長法による転写開始点の決定を行った。そのため RT - PCRに用いたプライマー 213Z ； 5' - TGCTGGTATGGATGTGATG - 3' (配列番号 5 )

に加え、プライマー伸長実験のためもう一つのプライマー

213Z-2； 5'-CTGACGAGGCTGTTGCTG-3' (図 4) (配列番号 6) を合成した。両プライマ一 10 pmolesを、 MEGARABEL (宝酒造）キットにより、 [ァ- ³ 2p]ATPを用いて 5'末端をラベルした。この末端ラベルされたプライマ一 0. 1 pmole (0.3X10⁶ cpm) と未熟穎花（出穂前 1〜2週間）と葉の全 RNA 50;^gとを、 3 units/μ 1の RNaseインヒビ夕一（ RNAguard, Pharmacia社）存在下で緩衝液（0.25 M KC1, 2 niM Tris-HCl pH8.0, 0. I πιΜ EDTA) 中で 10 1の反応系で 42 、 2時間アニーリングさせた。その後、緩衝液（66 mM Tris-HCl pH8.3, 6.6 mM gCl 2, 1.3 mM DTT, 0.66 mM dNTP, 130 /ig/mlァクチノマイシン D) を 30 il l, 逆転写酵素（SUPERSCRIPT , BRL社）を 1 / I (200 units)加え、 42°Cで 1時間保温した。さらに酢酸アンモニゥムを用いたエタノール沈殿を行い、 70%エタノールで洗浄後、風乾し泳動用緩衝液（T7 Sequencing kil (Pharmacia社）の反応停止液と 0.1 M NaOH, 1 mM EDTAを 2 ： 1に混合したもの）に溶解した。

全量を 95でで 3分間加熱した後、 6 %アクリルアミドゲルで電気泳動を行った。また同じプライマーを用い、 RPG106 Bglll 2.3 kbを含むプラスミドを铸型に T7 Sequencing kitでシーケンス反応を行った産物、および、 10 bp, 50 bpラダー

(BRL社）を MEGARABELキットと [ァ- 32_P]_ATPを用いて交換反応により末端ラベルした産物もマーカ一として同時に泳動した。その結果、図 5に示すように、この遺伝子が発現していない葉の RNAからは伸長産物が得られなかったのに対し、未熟穎花の全 RNAを铸型にした場合には、 213Zプライマ一では 2本、 213Z- 2プライマ一では 3本の伸長産物のバンドが検出された。隣接して泳動したシーケンスラダ一と比較したところ、産物の検出された位置は両プライマ一とも同じであつた。この結果により、 213Aと 213Bの間には連続する 3ケ所の転写開始塩基" CAA" が存在し、 RPC213はこれらシトシンあるいはアデニンから転写されることが判明した。図 4から明らかなように、最上流の転写開始点の C (シトシン）の 31bp上流には TATAボックス様配列（5'- TATAAAT- 3') が位置していた。この TATAボックスから転写開始点までの距離は、植物における他の遺伝子の例 Uoshi, Nucleic Acids Res. , 15, 6643-6653, 1987) とよく似ている。また、この転写開始点の C の 21 bp下流には翻訳開始コドン（1つめの ATG) が存在していた。この ATGを含む読み枠は、先に述べた cDNAの読み枠と一致したので、一般的には転写開始点から 21 bp下流の ATGが翻訳開始コドンであると考えられる。しかし、転写開始点と翻訳開始コドンの距離が近すぎるとも考えられ、 1つめの ATGの 273 bp下流に同じ読み枠で存在する 2つめの ATGが真の翻訳開始コドンである可能性がある。しかも 1つめの ATGの A (アデニン）の 3塩基上流の塩基は C (シトシン）であるのに対し、 2つめの ATGの A (アデニン）の 3塩基上流の塩基は A (アデニン）であり、真核細胞の mRNAにおける翻訳開始コドンの周辺塩基のコンセンサス

(Kozak, J. Cell Biol. , 108, 229-241, 1989) とよく一致する。実施例 3 ：プロモーター発現部位解析

(1) プロモータ一発現解析用べクタ一の構築とイネの形質転換

単離したプロモーターの発現を in vivoで解析するために、 GUSレポーター遺伝子を連結したベクターの構築を以下のように行った（図 6) 。ベクターは PSB21 (Komari et al. Plant J. , 10, 165-174, 1996) を採用した。このべクタ一内の 35Sプロモーターの両端にある単一の Hindlll部位と、 BamHI部位を利用した。

まず、 RPG106 Sad 6.0 kMpBluescr ipOを Hindi 1し Bglllで二重消化し、 RPC213遺伝の 1つめの ATGの 87 bp下流にある Bglll部位からの上流域約 1.8 kbpから成るプロモーター断片を調製した。この断片を、予め同酵素で消化し 35S プロモータ一を除去したベクタ一 PSB21と接続した。このプラスミドベクタ一を pYOT213aGと命名した。 pYOT213 aGにおいて、 RPC213遺伝子の 1つめの ATGと GUS遺伝子の ATGは同じ読み枠となっている。従って、 RPC213遺伝子の翻訳が 1 つめの ATGから開始された場合、 GUSタンパクは融合タンパクとして翻訳される。次に、 RPC213遺伝子の翻訳が 2つめの ATGから開始されることを想定して、また、より広い範囲のプロモーター断片を調製するために、以下のような方法でベクタ一を構築した。まず、 PCRによりプロモーター領域の一部を増幅するため、 1組のプライマー

213P-5H-2 ； 5'-GACGTGATCCACGGCATTGACG-3' (配列番号 7) 213P 2ndATG-Bam； 5' -CGGGGATCCGTTCTCCTCCACCCACGC-3' (配列番号 8) を合成した。 213P-5H-2は RPG106の唯一の Hindlll部位の上流に位置している。また、 213P 2ndATG-Bamは RPC213遺伝子の 2つめの翻訳開始点 ATG直上流の塩基配列と BamHI部位を有している。プライマ一各 100 pmolesと、铸型の RPG106 を予めアルカリ変性させた DNA約 1 gと、 Extaq (宝酒造）を用いて 100 の反応系で P CRを行った。

反応条件は、 94t:3分を 1回、 94°C 1分、 60°C 1分、 72°C2.5分を 20回、 72°C 6分を 1回とした。増幅産物を pCRIIUnvi ogen社）へクローニングした後、塩基配列を確認した。このプラスミドを Hindlll と BamHIで消化し、 RPC213プロモ一夕一 2.0 kb断片を単離した後、予め同酵素で処理して 35Sプロモーターを除去したベクター PSB21 と連結した。完成したプラスミドをさらに Hindi Πで消化し、脱リン酸化後、 RPG106 Sacl6.0 kb (pBluescript) を Hindll I消化して切り出した RPG106 Hindlll 3.3 kb断片を挿入した。このプラスミドベクタ一を pYOT213 /3Gと命名した。このベクターは、 RPC213遺伝子の 2つめの ATGの直上流約 5.3kbのプロモーター断片の下流に GUS遺伝子が配置された構造を有する。こうして構築された両ベクターをそれぞれ Agrobacterium tumefaciens LBA4404株へ三菌系接合により導入してイネの形質転換実験に供試した。

イネの形質転換は、 Hiei et al. (Plant J. , 6, 271 -282 , 1994) の方法に従レ、イネ品種「月の光」の未熟胚由来カルスを材料とした。

(2) GUSの組織学的観察によるプロモーター発現部位解析

pY0T213aGまたは pY0T213 /3 Gを導入した形質転換体に関して、各々の個体から葉、根、および出穂 ·開花期の穎花を採取し、 lefferson et al. (EMB0 J. , 6, 3901-3907, 1987) の方法に従い、 X- glue. (5- bromo- 4 - chloro- 3- indoly卜 3 - D - glucuronic acid)を基質とした GUS染色を行い、実体顕微鏡および光学顕微鏡下で細胞組織学的観察を行った。穎花内部における調査器官は、雌蕊、葯、鱗被内 '外穎、および穎花基部とし、プロモ一夕一による GUS発現の強さを + + (強い発現）から一（発現が検出限界以下）まで 4段階設定した（表 2) 。なお、図 7においては、黒色が強い発現、斜線が普通〜弱い発現、うすい灰色が非常に弱い発現、白色が発現なし、を示し、 L, R， P, A, R〇， G, B Sの順に葉、根、雌蕊、葯、鱗皮、内 ·外穎、穎花基部をそれぞれ示す。

その結果、 pYOT213 a Gを導入した形質転換体では、調査を行ったいずれの器官においても、 GUS染色されない個体が多かったが、任意の器官でプロモーター活性による GUS遺伝子の発現の見られた形質転換体が 5個体得られた。これらの個体のうち、 pYOT213 a G- 17では、雌蕊と鱗被において GUS発現が観察され、内 - 外穎と穎花基部においても非常に弱い発現が認められた (表 2 ) 。この結果は、ノーザンハイブリダィゼーション分析や RT- PCRの結果とほぼ一致する。また pYOT213 a G - 4については GUS発現が雌蕊特異的に検出された（表 2 ) 。雌蕊での発現部位は花柱と子房との境界部分であった（図 8 A) 。 5個体のうち葉と根、および葯における GUS発現の見られた個体はなく、雌蕊における発現が見られたものが 2個体、鱗被における発現が見られたものが 1個体であった（図 7 ) 。また、非常に弱い発現ではあるが、内 ·外穎、穎花基部における発現が見られた個体がそれぞれ 4個体、 3個体あった。

00568 表 2

表 2 2 1 3プロモーターの G U Sによる発現部位解析のまとめ

ベクタ 1回体番"^ 形質転換イネの器官

根雌蕊葯鳞被内 .外桌百頁花基部

DY0T213«G 4 +

土

7 + 土

土士

28 土 ± pYOT213SG 3 土土 + + + + +

4 + + + + + + + + +

6 + + + + + 士 + 土

7 土 + +十 + + 十

8 + + +

1 1 + + + + + + + + + +

1 3 + + + + + +

1 5 + 土 + 士 +

1 6 土士 + 士士

1 7 士 + 士 +

2 0 + + + +

2 2 + 土 + + + + + + + +

2 3 + + + + + +

+ + ：強い発現、 + ：普通〜弱、発現、土 .非常に弱い、一 -発現なし。一方、 PYOT213/3Gを導入した形質転換体では、 1 3個体中、葉と根における GUS発現が全くないか、または非常に弱く、かつ、花器における GUS発現が検出された個体、即ち花器特異的プロモーター活性を示した個体が 5個体（PYOT213 3 G-3, 7, 8, 16, 17) 得られた（表 2 ) 。このうち、雌蕊、鱗被で比較的強く、葯では非常に弱い、即ちノーザンハイブリダィゼーシヨン分析や RT-PCRの結果とよく一致する形質転換体は 2個体（PYOT213/3G-7と 8) であった。花器特異的発現が観察された個体以外の形質転換体計 8個体においても、葉や根における発現は見られるものの、花器における比較的強いプロモーター活性が認められた（表 2) 。例えば、 pY0T213i3G- 6では、葉や根における GUS発現は観察されるが、それ以上に、特に雌蕊において強い GUS発現が見られた。また、内 ·外穎や、葯、鱗被、および穎花基部において、弱い発現が見られた（図 8 B) 。 pY0T213i3G- 17では、葉や根においては発現が非常に弱いか、または発現がほとんどないが（図 8 D) 、雌蕊において比較的強い発現が見られた（図 8 C) 。 pY0T213)3Gを導入した形質転換体の雌蕊において、 GUS発現が観察される部位は主に柱頭部で、柱頭軸および柱頭の毛状組織で発現が見られた（図 8 B、 C) 。器官別に GUS発現結果をまとめる（図 7) と、葉、根においては、強い発現の見られた個体はなく、葉で全体の 1/2強、根で全体の 1/3弱の個体で普通〜弱い発現が認められたが、残りの個体に関しては発現が非常に弱いか、または全くなかった。これに対して、花器においては、葯以外の全ての器官、即ち雌蕊、鱗被、内 ·外穎、および穎花基部において、強いプロモーター活性が認められた。このうち特に雌蕊については、 1 3個体全てにおいて明確な GUS発現が認められ、うち 1個体で青色に強く染まる GUS染色像（強い発現）が得られた。また、鱗被と内 ·外穎においても全体の 2/3程度の個体でプロモー夕一活性による GUS遺伝子の発現が認められ、このうちのさらに半数以上の個体（それぞれ 5個体、 6個体）で強い GUS発現が検出された。また、穎花基部で強い発現を示す個体が 2個体あった。

以上のことから、 GUS遺伝子と接続した 2つの DNA断片が、花器で優勢なプロモータ一活性を有していることが明らかとなった。また、その活性の強さは、断片長のより長い 2 1 3 ]3の方が高かった。 2 1 3 のプロモー夕一活性が 2 1 3 αの活性よりも高かった一方で、上述のように両プロモーター断片の器官特異性はよく似ていることから、 2 1 3 3の塩基配列中に含まれ、かつ 2 1 3 αの塩基配列中には存在しない 2 1 3ひより 5 ' 側の Sacl- Hindlll 3.3 kb断片か、若しくは 2 1 3 αより 3 ' 側の Bgl IIから 2nd ATGまでの DNA配列中に（おそらく後者に） RPC213プロモーターの発現量を制御する（高発現に寄与する）塩基配列が含まれているものと考えられる。産業上の利用の可能性

本発明によれば、雌蕊や鱗被などの花器諸器官に対しても遺伝子工学的操作が可能となる。

Claims

請求の範囲

1 . 配列表の配列番号 2で表される塩基配列のうち、第 3 3 3 5番目から第 5 1 0 8番目の塩基から成る配列若しくはその一部の配列、またはこれらの配列のうち 1または複数のヌクレオチドが欠失、置換、挿入若しくは付加された配列を含むプロモ一夕一活性を有する D N A断片。

2 . 前記配列番号 2で表される塩基配列のうち、第 3 3 3 5番目から第 5 1 0 8番目の塩基から成る配列の一部の配列が、転写開始点（前記配列番号 2で表される塩基配列のうち、第 4 9 9 5番目から第 4 9 9 7番目の塩基）上流少なくとも 5 0 0塩基から下流であることを特徴とする請求項 1記載の D N A断片。

3 . 前記配列番号 2で表される塩基配列のうち、第 3 3 3 5番目から第 5 1 0 8番目の塩基から成る配列の一部の配列が、最初の翻訳開始コドン（前記配列番号 2で表される塩基配列のうち、第 5 0 1 6番目から第 5 0 1 8番目の塩基）上流域である請求項 1記載の D N A断片。

4 . 前記翻訳開始コドン上流域が、転写開始点上流少なくとも 5 0 0塩基から下流であることを特徴とする請求項 3記載の D N A断片。

5 . 前記配列番号 2で表される塩基配列のうち、第 3 3 3 5番目から第 5 1 0 8番目の塩基から成る配列の一部の配列が、転写開始点（前記配列番号 2で表される塩基配列のうち、第 4 9 9 5番目から第 4 9 9 7番目の塩基）上流域である請求項 1記載の D N A断片。

6 . 前記転写開始点上流域が、少なくとも転写開始点上流 5 0 0塩基であることを特徴とする請求項 5記載の D N A断片。

7 . 配列表の配列番号 2で表される塩基配列のうち、第 3 3 3 5番目から第 5 1 0 8番目の塩基から成る配列、またはこの配列のうち 1または複数のヌクレオチドが欠失、置換、挿入若しくは付加された配列を含むプロモー夕一活性を有する D N A断片。

8 . 配列表の配列番号 2で表される塩基配列のうち、第 1番目から第 5 3 6 9 番目の塩基から成る配列若しくはその一部の配列、またはこれらの配列のうち 1 または複数のヌクレオチドが欠失、置換、挿入若しくは付加された配列を含むプ口モーター活性を有する D N A断片。

9. 前記配列番号 2で表される塩基配列のうち、第 1番目から第 5369番目の塩基から成る配列の一部の配列が、 Hindlll部位（前記配列番号 2で表される塩基配列のうち、第 3335番目から第 3340番目の塩基）から下流であることを特徴とする請求項 8記載の DN A断片。

1 0. 前記配列番号 2で表される塩基配列のうち、第 1番目から第 5369 番目の塩基から成る配列の一部の配列が、転写開始点（前記配列番号 2で表される塩基配列のうち、第 4995番目から第 4997番目の塩基）上流少なくとも 500塩基から下流であることを特徴とする請求項 8記載の DNA断片。

1 1. 前記配列番号 2で表される塩基配列のうち、第 1番目から第 5369 番目の塩基から成る配列の一部の配列が、第 3番目の Bglll部位（前記配列番号

2で表される塩基配列のうち、第 5 103番目から第 5 1 08番目の塩基）から上流であることを特徴とする請求項 8記載の D N A断片。

1 2. 前記配列番号 2で表される塩基配列のうち、第 1番目から第 5369番目の塩基から成る配列の一部の配列が、最初の翻訳開始コドン（前記配列番号 2 で表される塩基配列のうち、第 5016番目から第 50 1 8番目の塩基）上流域である請求項 8記載の D N A断片。

1 3. 前記配列番号 2で表される塩基配列のうち、第 1番目から第 5369番目の塩基から成る配列の一部の配列が、転写開始点（前記配列番号 2で表される塩基配列のうち、第 4995番目から第 4997番目の塩基）上流域である請求項 8記載の DN A断片。

14. 配列表の配列番号 2で表される塩基配列のうち、第 1番目から第 5 36 9番目の塩基から成る配列、またはこの配列のうち 1または複数のヌクレオチドが欠失、置換、挿入若しくは付加された配列を含むプロモー夕一活性を有する D NA断片。

1 5. 前記請求項 1から 14に記載のプロモーター活性を有する DNA断片とその制御下にある所望の構造遺伝子とを含むキメラ DN A配列。

16. 前記請求項 1 5記載のキメラ DNA配列を有する形質転換用ベクター。

1 7. 配列表の配列番号 2で表される塩基配列のうち、第 1番目から第 53 69番目の塩基から成る配列もしくは花器特異的プロモーター活性を保持するその一部の配列とハイブリダィズし得る、花器特異的プロモーター活性を有する D N A断片。

1 8 . 上記ハイブリダイゼ一ションが中程度のハイブリダイゼーション強度の条件下で行われる、請求項 1 7記載の D N A断片。

1 9 . イネまたは他の植物のゲノム D N Aライブラリ一より配列表の配列番号 1で表される塩基配列もしくはその一部の配列をプローブとして用いてスクリ —ニングすることにより得られる DNA配列から特定し得ることを特徴とする花器特異的プロモーター配列。

2 0 . 上記スクリーニングが、中程度のハイブリダィゼーシヨン強度の条件下でのハイブリダィゼーシヨンにより行われる、請求項 1 9記載の花器特異的プロモ—ター配列。

2 1 配列表の配列番号 1で表される配列のうち、第 2 2番目から 1 2 7 8 番目の配列中、もしくはそれらに相補的な塩基配列中の少なくとも連続する 1 5 塩基の配列を有する D N A断片。