WO1999024569A1 - Recepteur d'acide lysophosphatidique humain et utilisation dudit recepteur - Google Patents

Recepteur d'acide lysophosphatidique humain et utilisation dudit recepteur Download PDF

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WO1999024569A1
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receptor
seq
lpa
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Daikichi Fukushima
Shinji Nakade
Hisanori Haga
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Ono Pharmaceutical Co., Ltd.
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
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    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to a lysophosphatidic acid (LPA) receptor and its use. More specifically, (1) human LPA receptor, (2) human LPA acid-like substance using human LPA receptor protein, human LPA antagonist, antagonist against phospholipid other than LPA responsive to human LPA receptor, or (3) LPA inhibitor containing human LPA receptor or inhibitor for phospholipids other than human LPA, (4) method for producing human LPA receptor, (5) human LPA receptor A monoclonal or polyclonal antibody, (6) cDNA encoding the human LPA receptor, (7) a replication or expression vector comprising the cDNA, and (8) a replication or expression vector. Host cells. Background art
  • the LPA receptor binds to LPA and transmits a signal to cells, causing various physiological phenomena such as cell proliferation, vascular cell dedifferentiation, and cell growth inhibition. Therefore, if human LPA receptor can be obtained, not only can it be used as a drug for vascular spasms and diagnostics, but it can be used as a diagnostic agent, as well as a new type of drug, such as a new type of LPA receptor antagonist. It is expected that it can be used for a wide range of drug development, such as onening ⁇ evaluation. It is known that there are a plurality of LPA receptors. However, for some LPA receptors, the human form has not yet been isolated, and its action and structure have not been clarified.
  • LPA receptor present on cell membrane The receptor binds to LPA and transmits a signal into cells via a G protein coupled to the receptor.
  • G proteins that can be coupled to the LPA receptor include G i and GQ, and these receptors are thought to be involved in responses such as cell growth-enhancing activity and conversely, growth-inhibiting activity.
  • the MAP-kinase system is linked downstream of the G protein, and the LPA receptor has been found to transmit various signals.
  • a receptor using LPA as a ligand has already been isolated from mouse African frog.
  • Tigyi et al. First obtained the LPA receptor from Xenopus laevis oocytes, which has been termed the PSP24 LPA receptor (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 14367-14372, 1996) 0
  • PSP24 LPA receptor Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 14367-14372, 1996)
  • Another type of LPA receptor has been cloned from the mouse, which is referred to as V zg — 1 U. Cell. Biol. 115, 1071-1083, 1996. ).
  • the present inventors have conducted intensive studies with the aim of cloning the human counterpart of the PS ⁇ 24-type L ⁇ receptor expressed in the oocytes of African clawed frogs.
  • the cDNA encoding the PSP24 human LPA receptor was cloned from the tissue, and the entire amino acid sequence of the LPA receptor was successfully determined.
  • the present invention is a.
  • a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, a homolog thereof, a fragment or a fragment of the homolog thereof;
  • human LPA human lysophosphatidic acid
  • a method for producing a human LPA receptor comprising culturing cells transformed with an expression vector comprising the above, and collecting the protein from the culture.
  • a protein or a partial sequence of the protein according to 1 or 2 a monoclonal or polyclonal antibody of the peptide; (7) a cDNA encoding the polypeptide according to 1 or 2; (8) SEQ ID NO: The cDNA according to the above 7, having the nucleotide sequence according to 2, or a fragment that selectively hybridizes to the sequence,
  • FIG. 1 shows the results of Northern hybridization of the expression of the human LPA receptor of the present invention in CHO cells. Detailed description
  • the present invention relates to a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 in a substantially pure form, a homolog thereof, a fragment of the sequence, and a homolog thereof.
  • the invention further relates to cDNAs encoding those polypeptides. More specifically, the present invention relates to the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • the hybridizing cDNA includes the complementary sequence of the above sequence.
  • the conditions for the hybridization are preferably stringent.
  • a homologue of a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 generally means at least 20, preferably at least 30, for example, a continuous amino acid region of 40, 60 or 100 amino acids. At least 70%, preferably at least 80 or 90%, more preferably at least 95% homologous, and such homologs are hereinafter described as polypeptides of the present invention. You.
  • a fragment of the polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a fragment of the homolog thereof is at least 10 amino acids, preferably at least 15 amino acids, for example, 20 25, 30 Means 40, 50 or 60 amino acid moieties.
  • a cDNA that selectively hybridizes to a cDNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 or 3 is generally at least 20, preferably at least 30, for example, 40, 60 or 1. At least 70%, preferably at least 80 or 90%, more preferably at least 95% homology in 00 consecutive nucleotide sequence regions, Such cDNA is hereinafter referred to as cDNA of the present invention.
  • the cDNA fragment having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 means at least 10 bases, preferably at least 15 bases, for example, 20, 25, 30 or 40 bases, and Such fragments are also included in the cDNA of the present invention.
  • the present invention includes a method for producing the polypeptide of the present invention, which comprises culturing the host cell of the present invention under conditions for expressing the polypeptide of the present invention.
  • the cultivation is preferably carried out under conditions under which the polypeptide of the present invention is expressed and produced from host cells.
  • the antisense mRNA can also be produced by inserting the cDNA of the present invention into the antisense region of the vector as described above. Such antisense mRNA can also be used to control the level of the polypeptide of the present invention in cells.
  • the present invention also includes monoclonal or polyclonal antibodies of the polypeptides of the present invention. Furthermore, the present invention also includes a method for producing a monoclonal or polyclonal antibody of the polypeptide of the present invention. Monoclonal antibodies can be produced by ordinary hybridoma technology using the peptide of the present invention or a fragment thereof as an antigen. The polyclonal antibody can be produced by a conventional method in which a host animal (for example, a rat or a heron) is inoculated with the polypeptide of the present invention and immune serum is collected.
  • a host animal for example, a rat or a heron
  • the present invention also includes a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising the polypeptide of the present invention, an antibody thereof, a pharmaceutically acceptable excipient, and a carrier or carrier.
  • a part thereof is deleted (for example, a polypeptide consisting of only a part essential for the expression of biological activity in SEQ ID NO: 1) Etc.), a part of which is substituted with another amino acid (for example, a substitution with an amino acid having similar physical properties), and a part of which is added or inserted with another amino acid.
  • a part thereof is deleted (for example, a polypeptide consisting of only a part essential for the expression of biological activity in SEQ ID NO: 1) Etc.), a part of which is substituted with another amino acid (for example, a substitution with an amino acid having similar physical properties), and a part of which is added or inserted with another amino acid.
  • the base sequence of cDNA can be changed without changing the amino acid sequence of the polypeptide.
  • the cDNA of the present invention includes all nucleotide sequences encoding the polypeptide shown in SEQ ID NO: 1. By changing the nucleotide sequence, the productivity of the polypeptide may be improved.
  • the cDNA identified by SEQ ID NO: 2 is one embodiment of the cDNA of the present invention, and represents a native sequence.
  • the cDNA shown in SEQ ID NO: 3 represents the sequence obtained by adding the natural untranslated portion to the cDNA identified in SEQ ID NO: 2.
  • Production of cDNA having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 or 3 is performed, for example, according to the following method.
  • RNA is extracted from human adult brain tissue, human kidney tissue, etc., and from various human cell lines using TRIzol reagent (registered trademark, sold by GIBC0BRL), and mRNA / purification is performed.
  • ⁇ Poly (A) + RNA can be purified using a kit (mRNA Purification Kit) (trade name, sold by Pharmacia).
  • CDNA is prepared using the method of Gabler et al. (Gene, 25, 263, 1983) or a commercially available cDNA synthesis kit. For example, it can be introduced into PUC19) or ⁇ phage vector-1 (eg, ⁇ gt11).
  • the cDNA library thus prepared was screened by colony hybridization, plaque hybridization, etc. using a labeled probe according to a conventional method, and the PSP24 human LPA receptor A clone containing a cDNA fragment containing all or part of Can be sorted out. If necessary, the cDNA can be recloned into another vector or the like to isolate the PSP24 type human LPA receptor cDNA.
  • cDNA is prepared as described above, primers are prepared based on the cDNA sequence isolated from African frog, and PSP24 human LPA is The partial length of the receptor cDNA can be cloned and used to perform full-length cloning.
  • P.sup.y (A) .sup. + RNA was purified using Pharmacia.
  • the amplified cDNA After fractionating the amplified cDNA by agarose electrophoresis, it was ligated to pT7Blue-2T-Vector (trade name, sold by Novagen) and transformed into Escherichia coli DH5a to prepare a plasmid. Then, the entire base sequence of this DNA was determined. The determined base sequence is compared with a known nucleic acid sequence registered in the nucleic acid sequence database by BLAS TN, and the amino acid sequence translated from the determined base sequence is converted into a known polypeptide sequence registered in the amino acid sequence database.
  • the amplified cDNA was subjected to subcloning in the same manner as in partial cloning, the entire nucleotide sequence was determined, and the sequence shown in SEQ ID NO: 3 was obtained. Further, the open reading frame was determined and translated into amino acids to obtain the sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • BLAS TN for known nucleic acid sequences registered in the nucleic acid sequence database
  • BLASTP for amino acid sequences of known polypeptides registered in the amino acid sequence database
  • primers were prepared based on the determined base sequence of PSP type 24 human LPA receptor shown in SEQ ID NO: 3 to include the Kozac sequence and the entire translation region, and cloned by PCR. . The following two primers were used. 5 'primer:
  • the specifically amplified cDNA was subcloned in the same manner as in partial cloning, and the entire nucleotide sequence was determined. The sequence shown in SEQ ID NO: 1 was obtained. Furthermore, the open reading frame was determined, and the full length was isolated.
  • Example 5 Protein expression in mammalian cells
  • the receptor of the present invention (human PSP24 type LPA receptor) was introduced into CHO cells by the lipofection method, and cells expressing stable traits were obtained.
  • the gene was integrated into a vector having blastidin-resistant ability, linearized by restriction enzyme digestion, and then introduced into cells.
  • the cells were cultured in the presence of BUsticidin (5 g / m 1), and 29 resistant strains were isolated by the ultradilution method. From these clones, total RNA was prepared using TRIzo1 reagent (Gibco BRL), and only clones expressing RT-PCR were selected. The expression level of the clones whose expression was confirmed was measured by Northern hybridization using the full length of the gene as a probe (FIG. 1).
  • the numbers shown on the right side of the figure indicate the size of Liposomal RNA used as a size marker, and a band considered to be a transcript of the gene was observed at around 1.9 kb.
  • As a control all RNAs prepared from the parental C H ⁇ cells were electrophoresed on the left end.

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Description

明細書 ヒトリゾホスファチジン酸受容体物質およびその用途 技術分野
本発明はリゾホスファチジン酸 （L P A )受容体およびその用途に関 する。 さらに詳しく言えば、 （1 )ヒト L P A受容体、 （2)ヒト L P A受 容体蛋白質を用いるヒト L P A酸様物質、 ヒト L P A拮抗物質、 ヒト L P A受容体に反応する L P A以外のリン脂質に対する拮抗物質また は作動物質のスクリーニング方法、 （3)ヒト L P A受容体を含有する L P A阻害剤またはヒト L P A以外のリン脂質に対する阻害剤、 （4)ヒト L P A受容体の製造方法、 （5)ヒト L P A受容体のモノクローナルまた はポリクロ一ナル抗体、 （6)ヒト L P A受容体をコードする c D N A、 (7)前記 c D N Aからなる複製または発現べクタ一、 および（8)前記複 製または発現ベクターで形質転換された宿主細胞に関する。 背景技術
L P A受容体は L P Aと結合し、 細胞内にシグナルを伝え、 細胞増 殖、 血管細胞の脱分化、 細胞の増殖抑制など、 様々な生理現象を引き 起こすことが知られている。 従ってヒト L P A受容体を得ることがで きればそれ自体を利用して、 血管スパズムなどの医薬品、 診断薬とし て応用が期待できるばかりでなく、 新しいタイプの L P A受容体拮抗 剤などの医薬品のスクリ一ニングゃ評価など幅広く医薬品の開発に利 用できることが予想される。 L P A受容体は複数存在することが知ら れているが、 ある種の L P A受容体についてはヒト型は未だ単離され ておらず、 その作用および構造は明確になっていない。
細胞は増殖因子、 ホルモン、 神経伝達物質などの生理活性物質を受 容体を介して認識し、 様々に応答する。 細胞膜上に存在する L P A受 容体は L PAと結合し、 同受容体に共役した G蛋白質を介して細胞内 にシグナルを伝える。 L P A受容体に共役し得る G蛋白質としては G i， G Qなどが知られており、 同受容体は細胞増殖亢進作用、 また 逆の増殖抑制作用などの応答に関与するとされる。 さらに、 G蛋白質 の下流には MA P—キナーゼ系が連動しており、 L P A受容体は多彩 なシグナルを伝達することが分かってきた。
L P Aをリガンドとする受容体は既にマウスゃァフリカツメガエル から単離されている。 例えば、 T i g y i らは L PA受容体をァフリ カツメガエルの卵母細胞より最初に得ており、 これは P S P 2 4型 L P A受容体と称されている （Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 93. 14367-14372, 1996) 0 また、 マウスより別のタイプの L P A受容体がク ローニングされており、 これは V z g — 1 と称されている U. Cell. Biol. 115, 1071-1083, 1996)。
ヒ ト由来 L P A受容体については V z g - 1 のホモログである E d g— 2 (Biochem. Bioph. Res. Commun. , 231, 619-622, 1997)が 報告されているが、 P S Ρ 24型についてのヒ卜での報告はない。 発明の概要
本発明者はァフリカツメガエルの卵母細胞に発現する P S Ρ 2 4型 L Ρ Α受容体のヒ卜でのカウンターパートをクローン化することを目 的として鋭意検討を重ねた結果、 ヒト由来脳組織から P S P 2 4型ヒ ト L P A受容体をコードする c DNAのクローン化および当該 L P A 受容体の全アミノ酸配列の決定に成功した。
核酸配列データベースに登録されている既知の核酸配列に対して B LA S TNにより、 またアミノ酸配列データベースに登録されてい る既知のポリペプチドのァミノ酸配列に対して B LA S T Pにより検 索した結果、 P S P 2 4型ヒト L P A受容体をコードする核酸配列と 一致する配列はなかった。 また、 疎水性プロッ トによる解析から、 当 該 L P A受容体のポリぺプチドは 7回膜貫通領域を持つことが予想さ れた。 このことから、 当該ポリペプチドは、 新規の膜蛋白質であるこ とが判明した。
本発明は、
( 1 ) 配列番号 1で示されるアミノ酸配列、 そのホモログ、 フラグメ ントまたはそのホモログのフラグメントからなる蛋白質、
( 2 ) 配列番号 1で示されるアミノ酸配列またはそのホモログからな るヒトリゾホスファチジン酸 （ヒト L P A)受容体、
( 3 ) 前記 1または 2に記載の蛋白質を用いることを特徴とするヒ卜 L PA酸様物質、 ヒト L PA拮抗物質、 ヒト L P A受容体に反応する
L P A以外のリン脂質に対する拮抗物質または作動物質のスクリー二 ング方法、
(4) 前記 1または 2に記載の蛋白質を有効成分として含有するヒト LP A酸阻害剤、 またはヒト L P A以外のリン脂質に対する阻害剤、 (5) 前記 1または 2に記載の蛋白質をコードする DNAを含む発現 ベクターで形質転換された細胞を培養し、 培養物から当該蛋白質を採 取することからなるヒト L P A受容体の製造方法、
( 6 ) 前記 1または 2に記載の蛋白質あるいはその蛋白質の部分配列 からなるぺプチドのモノクローナルまたはポリクローナル抗体、 (7) 前記 1または 2に記載のポリペプチドをコードする c DNA、 (8) 配列番号 2に記載の塩基配列を有する前記 7記載の c DNA、 またはその配列に選択的にハイプリダイズするフラグメント、
( 9 ) 配列番号 3に記載の塩基配列を有する前記 7記載の c D N A、 またはその配列に選択的にハイプリダイズするフラグメント、
( 1 0) 前記 6から 9のいずれかの項に記載の c D N Aからなる複製 または発現ベクター、 および
( 1 1 ) 前記 1 0記載の複製または発現ベクターで形質転換された宿 主細胞に関する。 図面の簡単な説明
図 1は、 本発明ヒト L P A受容体の C H O細胞での発現のノザンハ ィブリダイゼ一ションの結果を示す。 詳細な説明
本発明は、 実質的に純粋な形である配列番号 1で示されるアミノ酸 配列からなるポリペプチド、 そのホモローグ、 その配列のフラグメン トおよびそのホモローグに関する。
本発明はさらにそれらのポリペプチドをコードする c D N Aに関す る。 より具体的には、 配列番号 2で示される塩基配列に関する。
ハイプリダイズする c D N Aには、 上記配列の相補配列も含まれる。 ハイブリダィズさせるための条件は、 ストリンジェントであること が好ましい。
配列番号 1で示されるアミノ酸配列からなるポリべプチドのホモ口 —グとは、 一般に少なくとも 2 0個、 好ましくは少なくとも 3 0個、 例えば 4 0 、 6 0または 1 0 0個の連続したアミノ酸領域で、 少なく とも 7 0 %、 好ましくは少なく とも 8 0または 9 0 %、 より好ましく は 9 5 %以上相同性であるものであり、 そのようなホモローグは、 以 後本発明のポリペプチドとして記載される。
さらに、 配列番号 1で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド のフラグメント、 またはそれらのホモローグのフラグメントとは、 少 なく とも 1 0アミノ酸、 好ましくは少なくとも 1 5アミノ酸、 例えば 2 0 、 2 5 、 3 0 、 4 0 、 5 0または 6 0アミノ酸部分を意味する。 配列番号 2または 3で示される塩基配列を有する c D N Aに選択的 にハイブリダィズする c D N Aとは、 一般に、 少なく とも 2 0個、 好 ましくは少なくとも 3 0個、 例えば 4 0 、 6 0または 1 0 0個の連続 した塩基配列領域で、 少なくとも 7 0 %、 好ましくは少なくとも 8 0 または 9 0 %、 より好ましくは 9 5 %以上相同性であるものであり、 そのような c D N Aは、 以後本発明の c D N Aとして記載される。 配列番号 2で示される塩基配列を有する c D N Aのフラグメントと は、 少なく とも 1 0塩基、 好ましくは少なく とも 1 5塩基、 例えば 2 0、 2 5、 3 0または 4 0塩基部分を意味し、 そのようなフラグメ ントも本発明の c D N Aに含まれる。
さらに、 本発明には、 本発明のポリペプチドを発現させるための条 件下で、 本発明の宿主細胞を培養することからなる本発明のポリぺプ チドの製造方法も含まれる。 培養は、 本発明のポリペプチドが発現し、 宿主細胞より製造される条件下で行なわれることが好ましい。
本発明の c D N Aは、 上記のようなベクタ一のアンチセンス領域に 挿入することでアンチセンス m R N Aを製造することもできる。 この ようなアンチセンス m R N Aは、 細胞中の本発明のポリペプチドのレ ベルを制御することに用いることもできる。
本発明は、 本発明におけるポリペプチドのモノクロ一ナルまたはポ リクローナル抗体も含む。 さらに本発明におけるポリペプチドのモノ クロ一ナルまたはポリクローナル抗体の製造方法も含む。 モノクロ一 ナル抗体は、 本発明のペプチドまたは、 その断片を抗原として用い、 通常のハイプリ ドーマの技術により製造することができる。 ポリクロ —ナル抗体は、 宿主動物 （例えば、 ラッ トやゥサギ等）に本発明のポリ ペプチドを接種し、 免疫血清を回収する、 通常の方法により製造する ことができる。
本発明には、 本発明のポリペプチド、 その抗体と薬学的に許容され る賦形剤およびノまたは担体を含有する薬学的組成物も含まれる。 本発明のポリぺプチドとしては、 配列番号 1ァミノ酸配列を有する もの以外に、 その一部が欠損したもの （例えば、 配列番号 1中、 生物 活性の発現に必須な部分だけからなるポリべプチド等）、 その一部が他 のアミノ酸と置換したもの （例えば、 物性の類似したアミノ酸に置換 したもの）、 およびその一部に他のアミノ酸が付加または挿入されたも のも含まれる。
よく知られているように、 ひとつのアミノ酸をコードするコ ドンは
1〜 6種類 （例えば、 M e tは 1種類、 L e uは 6種類）知られている。 従って、 ポリべプチドのアミノ酸配列を変えることなく c DNAの塩 基配列を変えることができる。
本発明の c DNAには、 配列番号 1で示されるポリぺプチドをコ一 ドするすべての塩基配列群が含まれる。 塩基配列を変えることによつ て、 ポリペプチドの生産性が向上することがある。
配列番号 2で特定される c DNAは、 本発明の c D N Aの一態様で あり、 天然型配列を表わす。
配列番号 3で示される c DNAは、 配列番号 2で特定される c DN Aに天然の非翻訳部分を加えた配列を示す。
配列番号 2または 3中に示される塩基配列を有する c DN Aの作製 は、 例えば以下の方法に従って行なわれる。
ヒト L P A受容体の c D N Aクロ一ニング
一般的にはヒ卜成人脳組織、 ヒト腎組織などからまた、 種々のヒト 細胞株などより TRIzol reagent (登録商標、 GIBC0BRLより販売）を用い て全 RNAを抽出し、 mRNA · プュリイ フィケ一シヨ ン · キッ ト (mRNA Purification Kit ) (商品名、 Pharmacia より販売）などを用 いて p o l y (A)+ RNAを精製することができる。 ガブラーらの方 法 （Gene, 25, 263, 1983 )または市販の c D N A合成キッ トを用いて c DNAを作製し、 必要に応じて長塩基対のものを分別した後、 ブラ スミ ドベクタ一 （例えば P U C 1 9 )や λファージベクタ一 （例えば、 λ g t 1 1)に導入することができる。
このようにして作製された c DN Aライブラリ一から常法に準じて、 標識プローブを用いてコロニーハイブリダィゼ一シヨンやプラークハ ィプリダイゼーションなどでスクリーニングし、 P S P 2 4型ヒト L P A受容体の全部またはその一部を含む c DN A断片を含むクローン を選別することができる。 さらに必要に応じて当該 c DNAを他のベ クタ一などに再クローニングすることにより P S P 2 4型ヒ ト L P A 受容体 c DN Aを単離することができる。 またこれとは全く別の方法 として、 上記にて c DN Aを作製し、 アフリカッメガエルより単離さ れた c DNA配列をもとにプライマーを作製し、 P C R法により P S P 2 4型ヒト L P A受容体 c DN Aの部分長をクローニングし、 さら にこれを利用して全長のクロ一ニングを行なうことができる。 発明を実施するための最良の形態 以下に本発明の実施例を挙げて具体的に説明するが、 これらは本発 明の範囲を制限するものではない。 実施例 1 ： P O 1 y (A)+ RNAおよび c DNAの調製
ヒト成人脳組織より TRIzol reagent (登録商標、 GIBC0BRLより販売） を用いて全 R N Aを抽出し、 mRNA Purification Kit (商品名、
Pharmaciaより販売）を用いて p o 1 y (A) + RNAを精製した。
この p o 1 y (A) + RNAをもとにマラソン ' c DNA · アンプリ フィ ケーシヨ ン （Marathon cDNA Amplification Kit) (商品名、
Clontech社より販売））により c DNA合成を行なった。 実施例 2 P S P 24型ヒト L P A受容体の部分クローニング
ァフリカツメガエルの卵母細胞より得られた L P A受容体 （P S P 2 4 )の塩基配列の情報に基づいて、 センス、 アンチセンスそれぞれ 1 8個ずつのプライマーを作製し、 このプライマ一間で P C Rを行な つた。 そのうち、 あるプライマーの組み合わせでヒト P S P 2 4型ク ローンの部分断片と思われるバンドが増幅された。 この P C Rに用い たプライマーのセッ 卜を以下に示す。
アフリカッメガエル P S P 2 4プライマ一 # 1 5 ： 5 ' — TTC CT TATTATTGTACAGAGGCAGG - 3 ' ( 2 5 m e r ) (配 列番号 4)、 ァフリカツメガエル P S P 24プライマ一 # 2 1 : 5 ' - AAGAGAAT CAAAATAGTGGTGAAGG- 3 ' ( 2 5 me r ) (配列番号 5)。
増幅された c D N Aをァガロース電気泳動で分画後、 pT7Blue- 2 T - Vector (商品名、 Novagenより販売）に連結し、 大腸菌 DH 5 aに形質 転換してプラスミ ドを調製した。 そして、 この DNAの全塩基配列を 決定した。 決定した塩基配列を核酸配列データベースに登録されてい る既知の核酸配列に対して B L A S TNにより、 また決定した塩基配 列を翻訳したアミノ酸配列をアミノ酸配列データベースに登録されて いる既知のポリぺプチドのァミノ酸配列に対して B L A S T Pにより 検索した結果、 アフリカッメガエル P S P 24型 L P A受容体と相同 性を示し、 かつ決定した DN Aの核酸配列およびアミノ酸配列と一致 する配列はなかった。 このことからこの P C R産物は新規の遺伝子の 部分長であることが判明した。 実施例 3 ： ヒト P S P 24型 L P A受容体の全長クローニング
次にマ ラ ソ ン c D N Aア ンプリ ケーシ ヨ ン （ Marathon cDNA Amplification kit (商品名、 Clontech社より販売））を用いて全長クロ —ニングを試みた。 決定した部分長の塩基配列内に新たにプライマ一 を作製し （F l , F 2 , F 3 , R 1 , R 2および R 3)、 このプライマ 一と 5 ' 側あるいは 3 ' 側のアダプタ一配列特異的プライマ一 （AP 1 , A P 2 )間で 5 ' - R A C E (Rapid Amplification of cDNA Ends)および 3 ' —RACEを行なった。 そのうち以下のプライマ一の 組み合わせでヒ ト P S P 2 4型 L P A受容体クローンの 5 ' 部分ある いは 3 ' 部分と思われるバンドが増幅された。 この P C Rに用いたプ ライマーのセッ 卜を以下に示す。 5 ' - -RAC E
1 s t P C R Nested P CR
R 1 -AP I R 2 - A P 2
R 2 -AP I R 3 - AP 2
R 3 -AP I R 3 - A P 2
3， - -RACE
1 s t P C R Nested P CR
1一 A P 1 F 2 - A P 2
2一 A P 1 F 3 - AP 2
R 1プライマー ：
5 ' - GC C CATGT CAATGC TCAT CTGGAAAGG - 3 ' ( 2 7 m e r ) (配列番号 6)、
R 2プライマー ：
5 ' -AGGTC T CTG CAGACT CATGAGAC C CAG — 3 ' ( 2 7 m e r ) (配列番号 7 )、
R 3プライマ一 ：
5 ' -GC TGGC C TGGC TGAGGCATATA C C TT C — 3 ' ( 2 7 m e r ) (配列番号 8)、
F 1プライマー ：
5 ' -GTC CAGAGGCAGGATAAGC TAAAC C CA — 3 ' (2 7me r ) (配列番号 9)、
F 2プライマー ：
5 ' - C C GAC CTGCAGATAC CTT C C C GAG C T C 一 3 ' (2 7 m e r ) (配列番号 1 0)、 F 3プライマー ：
5 ' -AC CAAT C CAGGCTAC CAGGC TTATGTG 一 3 ' ( 2 7 m e r ) (配列番号 1 1 )
A P 1プライマー ：
5 ' 一 C C A T C C T A AT A C G A C T C A C T AT A G G G C 一 3 ' ( 2 7 m e r ) (配列番号 1 2) :
AP 2プライマ一 ：
5 ' 一 A C T C A C T A T A G G G C T C G A G C G G C - 3 ' (2 3me r) (配列番号 1 3)。
増幅された c DN Aを部分クローニングと同様の手法でサブク口一 ニングし、 全塩基配列を決定し、 配列番号 3に示す配列を得た。 さら にオープンリ一ディングフレームを決定し、 アミノ酸に翻訳して配列 番号 1 に示す配列を得た。 核酸配列データベースに登録されている既 知の核酸配列に対して B L A S TNにより、 またアミノ酸配列データ ベースに登録されている既知のポリべプチドのアミノ酸配列に対して B L A S T Pにより検索した結果、 本発明のポリペプチド、 P S P 2 4型ヒト L P A受容体をコ一ドする核酸配列と一致する配列はなか つた。 このことから、 本発明のポリペプチドは新規の膜蛋白質である ことが判明した。 また同類の 7回膜貫通領域を持つ膜蛋白質である P AF受容体、 LTB 4受容体などとのホモロジ一もなかったことから、 本クローンはアフリカッメガエルの P S P 2 4 L P A受容体のヒ卜で のカウンターパ一トである可能性が示唆された。 実施例 4 ：全長 c D N Aのクローニングおよび塩基配列の決定
全長 c DNAのクローニングは配列番号 3に示す決定された P S P 24型ヒト L P A受容体の塩基配列をもとに K o z a c配列と全翻訳 領域を含む様にプライマーを作製し、 P C R法によりクローニングし た。 用いたプライマーは次の 2種である。 5 ' 側プライマー ：
5 ' -AAAC CATGGTC TTC T C GG CAGTGTTGA — 3 ' (2 7 m e r ) (配列番号 1 4)、
3 ' 側プライマー ：
5 ' - TCACAC CAC C GTC C GATGTT C C C CACA 一 3 ' (2 7 m e r ) (配列番号 1 5)。
特異的に増幅された c D N Aを、 部分クローニングと同様の手法で サブクローニングし、 全塩基配列を決定し、 配列番号 1に示す配列を 得た。 さらにオープンリーディングフレームを決定し、 全長を単離し た。 実施例 5 ：哺乳動物細胞でのタンパク発現
本発明受容体 （ヒト P S P 24型 L P A受容体）を CHO細胞に、 リ ポフエクシヨン法を用いて導入し、 安定形質発現細胞を取得した。 受 容体発現を最大にするために、 該遺伝子をブラ スチシジン (B sticidin)耐性マ一力一を持つベクターに組込み、 制限酵素切断 により、 直鎖状にした後、 細胞に導入した。 次にブラスチシジン (BUsticidin) ( 5 g /m 1 )存在下で培養し、 耐性株を限外希釈法 により 2 9個単離した。 これらのクローンから T R I z o 1 試薬 (Gibco BRL)を用いて全 RN Aを調製し、 RT— P C Rにより発現し ているクローンのみを選択した。 発現が確認されたクローンについて、 該遺伝子の全長をプローブとして、 ノザンハイブリダィゼーシヨン (Nothern Hybridization)法により、 発現量の強弱を測定した （図 1)。 図の右横に示した数字は、 サイズマーカーとして用いたリポゾ一マル R N Aの大きさを示しており、 1.9k b付近に該遺伝子の転写物と考 えられるバンドが観察された。 左端にコントロールとして親株の C H 〇細胞から調製した全 R N Aを泳動した。

Claims

請求の範囲
1. 配列番号 1で示されるアミノ酸配列、 そのホモログ、 フラグメン 卜またはそのホモログのフラグメントからなる蛋白質。
2. 配列番号 1で示されるアミノ酸配列またはそのホモログからなる ヒトリゾホスファチジン酸 （ヒト LP A)受容体。
3. 請求の範囲 1または 2に記載の蛋白質を用いることを特徴とする ヒト L PA酸様物質、 ヒト L PA拮抗物質、 ヒト L PA受容体に反応 する L P A以外のリン脂質に対する拮抗物質または作動物質のスクリ 一二ング方法。
4. 請求の範囲 1または 2に記載の蛋白質を有効成分として含有する ヒト L P A酸阻害剤、 またはヒト L P A以外のリン脂質に対する阻害 剤。
5. 請求の範囲 1または 2に記載の蛋白質をコ一ドする DNAを含む 発現ベクターで形質転換された細胞を培養し、 培養物から当該蛋白質 を採取することからなるヒト L P A受容体の製造方法。
6. 請求の範囲 1または 2に記載の蛋白質あるいはその蛋白質の部分 配列からなるぺプチドのモノクロ一ナルまたはポリクローナル抗体。
7. 請求の範囲 1または 2に記載のポリぺプチドをコ一ドする c D N
A。
8 . 配列番号 2に記載の塩基配列を有する請求の範囲 7記載の c D N A、 またはその配列に選択的にハイプリダイズするフラグメント。
9 . 配列番号 3に記載の塩基配列を有する請求の範囲 7記載の c D N A、 またはその配列に選択的に八イブリダィズするフラグメント。
1 0 . 請求の範囲 6から 9のいずれかの項に記載の c D N Aからなる 複製または発現べクタ一。
1 1 . 請求の範囲 1 0記載の複製または発現ベクターで形質転換され た宿主細胞。
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