WO1999020655A1 - Procede de purification de substrats de thrombine et/ou d'inhibiteurs de thrombine ou procede d'elimination de ceux-ci - Google Patents

Procede de purification de substrats de thrombine et/ou d'inhibiteurs de thrombine ou procede d'elimination de ceux-ci Download PDF

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WO1999020655A1
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inhibitor
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blood coagulation
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Toyoaki Suzuki
Kazuya Hosokawa
Masanori Nagata
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Fujimori Kogyo Co., Ltd.
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    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21027—Coagulation factor XIa (3.4.21.27)

Definitions

  • the present invention relates to an affinity adsorbent having thrombin or a substance similar to thrombin which has lost nucleophilicity (activity) without causing steric hindrance to binding to a substrate and Z or an inhibitor as a ligand;
  • the present invention relates to an affinity chromatography using an adsorbent, and a novel method for purifying a thrombin substrate and / or an inhibitor, which comprises the affinity chromatography step. More specifically, as affinity chromatography ligands, thrombin or a substance similar to thrombin that has lost its nucleophilicity (activity) without causing steric hindrance to binding to a substrate or inhibitor such as anhydrothrombin is used.
  • the present invention relates to a method for purifying a thrombin substrate or an inhibitor using the same. Further, the present invention removes a thrombin substrate and / or an inhibitor contained as a contaminant in another purification target by utilizing the specific adsorption / desorption action of the affinity chromatography. It is about the method. Background art
  • Blood coagulation factor VIII (FVIII) is involved in the blood coagulation mechanism, the intrinsic mechanism of the first phase of coagulation before coagulation begins and before thrombin is formed. Since the disease in which the activity of FVIII is reduced is called hemophilia A, the FVIII is called anti-hemophilia globulin or anti-hemophilia factor A.
  • Hemophilia A is a sex-chromosomal recessive inheritance and is classified as mild, moderate, or severe, depending on the degree of reduced factor activity.
  • spontaneous bleeding is rare, and it is difficult to stop bleeding during trauma, surgery, or tooth extraction
  • moderate to severe cases spontaneous bleeding is the main symptom, and bleeding occurs in deep tissues due to intrinsic coagulation disorders.
  • bleeding into the joint cavity is characteristic of this disease. Repeated bleeding causes arthropathy, and the joints contracture and deform, causing dysfunction, as well as intramuscular bleeding, intracranial bleeding, and renal bleeding.
  • Gene therapy or transplantation may be considered for the treatment of patients with hemophilia, but clinical research is currently in progress, and it has not been put into practical use for patients with hemophilia. Therefore, it is necessary to replace FVIII, a deficient factor, with bleeding, and to stop the bleeding each time, or to supplement in advance when bleeding is expected.
  • FVIII preparations used to treat patients with hemophilia include human plasma with FVIII concentrations of 0.1 to Since it is extremely low at 0.2 mg / 1, cryoprecipitate (a high concentration of FVIII), which is a precipitate formed when the frozen Chon I fraction is slowly thawed at low temperature, is used as the preparation. Because of the risk of infection with hepatitis (hepatitis B, hepatitis C) and AIDS (acquired immunodeficiency syndrome) after blood transfusion, liquid heating at 60 ° C for 10 hours is currently used.
  • blood coagulation factor XII I (hereinafter simply referred to as FXIII) is involved in the production of stable fibrin polymer, which is the final stage of the blood coagulation mechanism, and is also called a fibrin stabilizing factor. Normally, it is present in the plasma in an inactive state, but when thrombin is generated by bleeding or the like, it is activated by thrombin and calcium ions to stabilize fibrin. Therefore, in patients with reduced or deficient FXIII, the blood coagulation time shows a normal value, but the fibrin clots formed are unstable, and exhibit phenomena such as post-bleeding. For this reason, FXIII preparations are widely used for promoting wound healing in clinical applications.
  • FXIII which was previously used in Japan, is derived from the placenta. It is pointed out that the morphology is different in the placenta and plasma, 2 there is a possibility that impurities such as immunogen may be contained, and 3 there is a problem in the virus inactivation process. (Japanese Unexamined Patent Publication No. Hei 11-250326), but it has been changed to a raw material derived from plasma. However, FXIII products are covered by imported plasma, as plasma contains only small amounts of FXIII.
  • This FXIII preparation is extracted, purified and separated from plasma, platelets, placenta, etc., and subjected to pasteurization (liquid heating, 60 ° C, 10 hours treatment) to produce various viruses (hepatitis B virus, HIV-1 and other retroviruses) can be inactivated and formulated, or recombinant FXI II (including its analogs with blood clotting activity) can be produced in yeast cells by genetic recombination technology. The product is purified and purified from yeast disrupted supernatant.
  • the main purification methods are, for example, 1 Reewui AG (Loewy, AG), Journal Obha, Oronkar Chemistry (Journal of Biological Ciiemistry) , 236, 2625 (1961), 2Janusuzko B.T. (Janusuzko, ⁇ . ⁇ .), ——Nature, 191, 1093 (1961), 3Bourne VH (Bohn. u, 25, 235 (1972), and Winkelman L. (Thrombos is and Haemostasis), 55, 402 (1986), etc.
  • PC vitamin-dependent Protein
  • APC Npomojurin Activated protein C activates protein C (hereinafter simply referred to as APC).
  • APC is a type of serine protease that inactivates blood coagulation cofactors Factor V (FV, FVa) and Factor VIII (FVII I, FVIIIa), and exhibits strong anticoagulant activity .
  • plasmaminogen activator is released from the blood vessel wall to promote the fibrinolytic system.
  • APC binds to tPA inhibitor and inhibits tPA inhibitory activity of the inhibitor. Also has a fibrinolysis promoting activity).
  • protein C deficiency is also known to cause severe thrombosis, and APC has been shown to be an important regulator of the coagulation and fibrinolysis system. In this way, PC or APC is expected to develop new drugs as anticoagulants and fibrinolytic agents.
  • PC present in plasma or induced in tissue culture systems is extremely small (for example, PC present in plasma is synthesized in the liver, Circulates as a zymogen at a concentration of about 4 g / ml).
  • protein C or activated protein C as an anticoagulant or fibrinolytic agent, it is extremely important to separate and purify it.
  • the method for producing blood-derived APC includes the following method. For example, (1) a method in which protein C purified from human plasma by affinity chromatography using an anti-protein C antibody is activated with human thrombin, and then purified using cation chromatography (Blood Blood). Blood, 63, p.115-121 (1984)), or (2) Kisiel's adsorption and elution of barium citrate from human plasma, ammonium sulfate fractionation, DE AE-Sephadex column chromatography, dextran sulfate agarose Chromatography and polyacrylamide gel electrophoresis-Activate protein C and purify it to AP C Method (Journal of Clinical Investigation, J. Clin.
  • the anti-protein C antibody itself used for affinity chromatography is extremely expensive, and the yield of protein c purified by the affinity chromatography is also 30%.
  • the final APC preparation must be extremely expensive.
  • protein C is specifically adsorbed and desorbed. It is difficult to purify the protein C because it is not coated, the yield of purified protein C is as low as about 30%, and the final APC preparation must be extremely expensive.
  • Examples of a method for preparing APC using a genetic recombination technique include, for example, the methods described in JP-A-61-205487, JP-A-1-2338, or JP-A-1-85084. is there.
  • the protein C or activated protein C raw material thus produced is separated and purified by a combination of ordinary biochemical separation and purification methods.
  • Examples of such a method include a salting-out method using ammonium sulfate, ion-exchange chromatography using an ion exchange resin, a gel filtration method, and an electrophoresis method.
  • thrombin substrates such as blood coagulation factor V, blood coagulation factor XI, protein S, heparin cofactor II, fibrinogen, thrombin receptor, and Z or
  • a method of separation and purification using a combination of ordinary biochemical separation and purification methods is used.To obtain high-purity thrombin substrates and / or inhibitors efficiently and stably, It has the same problem as PC or APC.
  • the present inventors have conducted intensive studies on the thrombin substrate and the inhibitor or the inhibitor to achieve the above object, and as a result, the thrombin substrate and the inhibitor or the ligand as a ligand that reacts specifically and reversibly with the inhibitor or the inhibitor.
  • Affinity chromatography using thrombin that has lost its nucleophilicity (activity) without causing steric hindrance to the binding of, for example, anhydro-thrombin can be used as a thrombin substrate and an inhibitor.
  • the anhydrothrombin and the like are human-derived proteins prepared from human thrombin, and are extremely inexpensive as compared with anti-protein C antibodies and the like by incorporating them into the purification step (including the case where they are incorporated after the final purification step). Therefore, it has been found that the above problem can be solved by separation with anhydrothrombin or the like. Which has led to the completion of the present invention. Further, the present inventors have proposed that the thrombin substrate and / or the inhibitor contained in other purification target substances as contaminants are based on the ability of the anhydrothrombin or the like to specifically separate the thrombin substrate and / or the inhibitor. (Removal-the object to be removed may be of two or more types). Thus, the present invention has been completed.
  • an object of the present invention is to provide an affinity adsorbent having thrombin or a substance similar to thrombin which has lost nucleophilicity (activity) without causing steric hindrance to binding to a substrate and a ligand or an inhibitor as a ligand. And an affinity chromatography using the affinity adsorbent.
  • the object of the present invention is to use a new and inexpensive separation and purification means, and to efficiently and safely and stably provide an inexpensive, high-purity thrombin substrate and / or inhibitor by a simple separation and purification operation and a short purification and separation man-hour. It provides a method for purification.
  • Another object of the present invention is to provide a method for purifying FVIII at low cost without risk of contamination of impurities such as heterologous animal proteins.
  • Another object of the present invention is to reduce the concentration of fibrinogen in blood even by administration without viral infections such as hepatitis (hepatitis B, hepatitis C) and AIDS (acquired immunodeficiency syndrome).
  • An object of the present invention is to provide a method for purifying FVIII which does not cause excessive rise.
  • Another object of the present invention is to provide a method for purifying FXIII, which is contained only in a small amount in plasma, with higher purity and higher recovery than conventional purification methods.
  • Another method of the present invention is to purify FXIII obtained from FXIII derived from natural sources such as platelets other than plasma and placenta with higher purity and higher recovery than conventional purification methods.
  • the objective of the present invention is to provide a purification method in which there is almost no possibility that impurities such as an immunogen at issue are contained and the probability of virus contamination is significantly reduced.
  • Another method of the present invention relates to FXII obtained by genetic recombination.
  • I and its variants mutants having at least one amino acid in the amino acid sequence of FXIII deleted or substituted by genetic recombination and having FXII I activity
  • An object of the present invention is to provide a method for purifying with higher purity and a higher recovery rate than the purification method in which separation and purification are performed using a method for purifying FXII I derived from nature. Disclosure of the invention
  • the method for purifying the thrombin substrate and the inhibitor or the inhibitor according to the present invention is similar to thrombin or thrombin that has lost nucleophilicity (activity) without causing steric hindrance to the binding to the substrate or inhibitor as a ligand.
  • the present invention is characterized by having an affinity chromatography step using an affinity adsorbent having a substance.
  • the power of developing a specific purification method by affinity chromatography using an inexpensive human-derived protein as a ligand for a thrombin substrate and Z or an inhibitor is not yet known.
  • an inexpensive human-derived protein ligand that can be adsorbed and desorbed from the thrombin substrate and / or inhibitor which is a key substance
  • the activity was increased without causing steric hindrance to the binding to the substrate or inhibitor. It has been found that lost thrombin or a substance similar to thrombin is useful.
  • thrombin substrate and Z or inhibitor refers to those that act on thrombin as a substrate or inhibitor, and specifically, fibrinogen (blood coagulation factor I), blood coagulation factor V Substrates such as factor III, blood coagulation factor XIII, blood coagulation factor V, blood coagulation factor XI, protein II, protein S, and thrombin receptor Yuichi, and inhibitors such as heparin cofactor 11.
  • fibrinogen blood coagulation factor I
  • blood coagulation factor V Substrates such as factor III, blood coagulation factor XIII, blood coagulation factor V, blood coagulation factor XI, protein II, protein S, and thrombin receptor Yuichi
  • inhibitors such as heparin cofactor 11.
  • the inhibitor is based on the theory of Michael Is-Menten (enzyme reaction is a reaction between the enzyme and substrate molecules, which forms an enzyme-substrate complex, and then the chemical reaction proceeds. According to the theory that the product is released and the enzyme returns to
  • Thrombin + Activated Thrombin Substrate or Inhibitor Thrombin's nucleophilicity is determined by the charge relay system of amino acids near the active serine in thrombin: the active site of chymotrypsin and other serine proteases A series of hydrogen bonds between the side chains of the amino acids that are responsible for the high degree of nucleophilicity (activity) of the hydroxyl group of the serine residue in the active site. It is said that electrons flow from the negatively charged carboxyl group of aspartic acid to the oxygen of the hydroxyl group of the serine residue, thereby making the oxygen of the hydroxyl group highly nucleophilic.) I have.
  • This charge relay system can significantly reduce nucleophilicity (activity) without disrupting the binding to thrombin substrates and / or inhibitors by disruption by anhydrolysis or genetic manipulation. is there. For example, substitution of aspartic acid in the active site of thrombin with asparagine or substitution of active serine in thrombin with alanine does not cause steric hindrance to binding to thrombin substrate and / or inhibitor.
  • thrombin activity can be significantly reduced. As a result, thrombin or thrombin which has lost nucleophilicity (activity) without causing a dysfunction in binding to the thrombin substrate and the inhibitor or the inhibitor.
  • Substances similar to thrombin include fibrinogen (coagulation factor I), coagulation factor V, coagulation factor VII I, coagulation factor XI, coagulation factor XIII, protein c, protein s, Reversible reaction with thrombin substrate such as thrombin receptor, thrombin inhibitor such as heparin cofactor-II, and other proteins as shown in the following 1 (here, binding with thrombin substrate and / or inhibitor)
  • thrombin substrate such as thrombin receptor
  • thrombin inhibitor such as heparin cofactor-II
  • Anhydrothrombin has an ability to bind to a carrier (support) such as Sepharose and has excellent binding ability due to its specific binding ability to a thrombin substrate and / or an inhibitor. This particular ability has been found to be of great use as a ligand for affinity adsorbents.
  • This anhydrothrombin is a new concept ligand that uses only its specific binding ability, even though it is made of enzymes.
  • Anhydrothrombin 'thrombin substrate / inhibitor complex Similar to thrombin or thrombin that has lost nucleophilicity (activity) without causing steric hindrance to binding to the above-mentioned substrate or inhibitor such as anhydrothrombin as a ligand
  • a substance is used to specifically adsorb and recover the desired one of the thrombin substrate and / or inhibitor to the ligand.
  • the solution containing the target substance, thrombin substrate and / or inhibitor contains no other thrombin substrate and / or inhibitor other than the target substance, or contains only a trace amount of the target substance. It needs to be in a state. This is because, as described above, other thrombin substrates and / or inhibitors other than these target substances may specifically adsorb to the ligand anhydrothrombin.
  • thrombin substrates and inhibitors from multiple protein solutions as an initial purification step.
  • anhydrothrombin obtained by anhydrolyzing human thrombin is useful as the thrombin which has lost nucleophilicity (activity) without causing steric hindrance to binding to the substrate or the inhibitor.
  • Such anhydrothrombin can be synthesized by the following method. (1) 1. a step of reacting an active serine residue site of thrombin with a synthetic inhibitor;
  • At least in the step of performing a recovery operation at least one compound selected from the group consisting of polyhydric alcohols and saccharides and a salt or an ampholyte are coexistent.
  • At least one compound selected from the group consisting of polyhydric alcohols and saccharides is at least one compound selected from the group consisting of glycerin, ethylene glycol and sucrose. That is.
  • the concentration of the salt or ampholyte is 0.2 M or more.
  • the method for synthesizing the above-mentioned anhydrothrombin comprises:
  • At least in the step of performing a recovery operation at least one compound selected from the group consisting of polyhydric alcohols and saccharides and a salt or an ampholyte are coexistent.
  • FIG. 1 shows an outline of a typical synthesis example according to the specific example.
  • the active serine residue site of thrombin is reacted with the synthetic inhibitor for the purpose of reacting thrombin with the synthetic inhibitor to form an ester bond with the active serine residue of thrombin and thereby losing thrombin activity.
  • a conventionally known method can be used.
  • the method used in the literature Biochemistry 1995, 34, 6454-6463 can be used, and the method exemplified in Table 1 below can be used.
  • Table 1 shows an outline of a method for producing anhydrothrombin, which is a kind of thrombin that has lost nucleophilicity (activity) without causing steric hindrance used in the purification method of FXIII of the present invention without causing bow I. It shows.
  • the thrombin that can be used for the synthesis of the above-mentioned anhydrothrombin is not particularly limited, and various types of commercially available thrombin may be used.
  • Purified thrombin for example, thrombin from Cohn Paste III (human), purified thrombin from Mochida Pharmaceutical Co., Ltd. (Yoshi Yuki), purified thrombin from Midori Cross (human), etc. Can also be used.
  • Examples of the synthetic inhibitors that can be used for the synthesis of the above-mentioned anhydrothrombin include those capable of forming an ester bond by reacting with an active serine residue of thrombin as exemplified in the above-mentioned reaction formula (1).
  • sulfonyl fluorides such as PMSF, 2-phenylethane-1-sulfonyl fluoride, methanesulfonyl fluoride, p-toluenesulfonyl (tosyl) fluoride, Silk mouth lid, diisopropylfluorophosphoric acid (hereinafter also referred to as DFP), 3,4-dichloromouth isocoumarin (hereinafter also referred to as 3,4-DCI), L-1-monochloro-3- [4-trisyl ruside] — 7-amino—2-heptanone non-hydrochloric acid (hereinafter, also referred to as TLCK), L-one-one-mouth—3 -— [4-tosylacacid] -one-one-phenyl ⁇ 2-butanone (hereinafter also referred to as TPCK).
  • DFP diisopropylfluorophosphoric acid
  • the inhibitors are added in advance to methanol, acetone, ethanol, propanol, isopropanol, butanol, propan-1-ol, acetone, dimethylformamide, dimethyl sulfoxide, etc. Those dissolved in a solvent may be used.
  • the thrombin activity is reduced to 3% or less, more preferably 1% or less, in order to reduce the complexity of subsequent separation and removal operations due to excessive addition and to increase the reactivity. It is desirable to do this while checking.
  • a salt solution prepared with NaCI for the purpose of adjusting osmotic pressure and ion balance so as to favor the survival of thrombin Rui further K +, Ca 2 +, Mg2 + an ion salts also of that composition plus several formulated solution such as, pH2 ⁇ l 0 as a buffer system so as to further stably maintain p H,
  • a buffer arbitrarily selected from buffers having a pH of 4 to 8 may be added.
  • Such buffers include, for example, phosphate buffer, carbonate buffer, bicarbonate buffer, Tris buffer, sodium phosphate monobasic buffer, sodium succinate monohydroxide buffer, Examples thereof include potassium phthalate sodium monohydroxide buffer, imidazole-hydrochloric acid buffer, borate buffer, physiological saline, and Good's buffer.
  • the reaction is preferably carried out at a temperature of -30 to 50 ° C, preferably 4 to 40 ° C.
  • the product obtained by the above reaction is purified and separated using a conventionally known method.
  • the method used for the purification and separation is not particularly limited, and examples thereof include gel filtration, ion exchange chromatography, affinity chromatography, ultrafiltration membrane, and dialysis.
  • a solvent for example, Sephadex, biogel, agarose gel, etc.
  • Solvents that can be used here include NaC1 prepared salt solutions for the purpose of adjusting osmotic pressure and ion balance, or K +, Ca2 +, Mg2 +, etc., to improve the survival of thrombin.
  • Such buffers include, for example, phosphate buffer, carbonate buffer, bicarbonate buffer, Tris buffer, sodium citrate monophosphate buffer, sodium succinate monohydroxide buffer, phthalic acid
  • buffers include a sodium monohydroxide buffer, an imidazole-hydrochloride buffer, a borate buffer, a physiological salt solution, and a Good's buffer.
  • an ester bond is dissociated and a serine residue is exchanged for an alanine residue to synthesize anhydrothrombin.
  • a salt solution prepared with NaC1 for the purpose of adjusting the osmotic pressure and ion balance so as to favor the survival of thrombin Or a salt solution prepared by adding several kinds of ions such as K +, Ca2 +, Mg2 +, and the like.
  • the buffer may be a buffer to which a buffer arbitrarily selected from 10 and preferably pH 4 to 8 is added.
  • Such buffers include, for example, phosphate buffer, carbonate buffer, bicarbonate buffer, Tris buffer, citrate-phosphate-sodium buffer, succinate-sodium hydroxide buffer, phthalate
  • examples of the buffer include lium-sodium hydroxide buffer, imidazo-l-l hydrochloric acid buffer, borate buffer, physiological salt solution, and Good's buffer.
  • At least one compound selected from the group consisting of polyhydric alcohols and saccharides used in the synthesis of anhydrothrombin is used in combination with a salt or an ampholyte to form an alkali in a high pH region.
  • a salt or an ampholyte used in the synthesis of anhydrothrombin.
  • At least one compound selected from the group consisting of the above polyhydric alcohols and saccharides is, for example, tetritol (specifically, erythritol! D-Sle! L-Sle! ⁇ , D, L-slate!), Pentitol (specifically, ribitol, D-arabin!, L-arabin!, D, L-arabinitol, xylyl 1 ⁇ 1 ⁇ ) , Hexitol (specifically, aryl, darcitol (galactitol), sorbitol (D-glucitol), L-glucitol, D, L-darcitol, D-mannitol, L— Mannitol, D, L-manni!
  • tetritol specifically, erythritol! D-Sle! L-Sle! ⁇ , D, L-slate!
  • Pentitol specifically, ribitol, D-arabin!, L-arabin
  • polyhydric alcohols such as thyrolethane, trimethylolpropane, anhydrous enenea heptyl, 1,4-butanediol, 1,2,4-butanthrol and 1,2,6-hexanetriol ), Glyceraldehyde dioxyacetone, threose, erythrulose, erythrose, arabinose, ribulose, lipose, xylose, xylulose, lyxose, glucose, fructose, mannose, idose, sorbose, gloss, talose , Tagasse, galactose, arose, psicose, altrose and sucrose such as sucrose. These can be used alone or in combination of two or more. Among them, at least one compound selected from the group consisting of glycerin, ethylene glycol and sucrose is preferred.
  • At least one compound selected from the group consisting of polyhydric alcohols and saccharides described above is used in an environment at a temperature of 23 ° C and a relative humidity of 50%, and when it is a liquid, the weight ratio is at least one.
  • the ratio by volume is preferably at least 5%, more preferably at least 15%.
  • the second and third steps can be performed by relatively increasing the concentration of the salt or ampholyte used together, and the desired effect can be effectively achieved. Can be expressed.
  • the ratio (concentration) of at least one compound selected from the group consisting of the above-mentioned polyhydric alcohols and saccharides to the whole compound is appropriate so that the desired effect can be effectively exhibited according to the type. It is desirable to appropriately determine the appropriate concentration, and it is necessary to consider the type and concentration of the salt or ampholyte used together when making a powerful decision.
  • the salt or ampholyte used for the synthesis of the above-mentioned benzohydrothrombin is selected from the group consisting of the above-mentioned polyhydric alcohols and saccharides.
  • examples of the salt or ampholyte include alkali metal halides such as sodium chloride and potassium chloride, alkaline earth metal halides such as magnesium chloride and calcium chloride, ammonium chloride, ammonium sulfate, and carbonate.
  • ionic strength salt concentration
  • dielectric constant concentration of at least one compound selected from the group consisting of the above-mentioned polyhydric alcohols and saccharides which are readily soluble in water.
  • Low-molecular metal salts and inorganic salts that can be easily adjusted and that facilitate (or simplify) the purification and separation steps (eg, dialysis).
  • An amphoteric electrolyte or the like is desirable, and more specifically, at least one compound selected from the group consisting of sodium chloride, rhodium chloride and glycine is desirable.
  • the concentration of the salt or ampholyte is preferably 0.2 M or more, more preferably 0.5 M or more. However, even if the concentration is less than 0.2 M, the ratio of the compound to the whole is determined as in the case of at least one compound selected from the group consisting of polyhydric alcohols and saccharides described above. By increasing the relative value, the second and third steps can be performed, and the desired effect can be effectively exhibited.
  • an alkali is added and adjusted so that the pH of the reaction system becomes 11 or more (and, if necessary, the above-mentioned polyhydric alcohol). And at least one compound selected from the group consisting of saccharides and a salt or an amphoteric electrolyte), the reaction temperature is maintained at 30 to 50 ° C, preferably at 4 to 40 ° C. .
  • the above pH is less than 11, undesired PMFSF reaction does not occur and anhydrolysis does not proceed.
  • alkali examples include monovalent bases such as sodium hydroxide and potassium hydroxide, divalent bases such as calcium hydroxide, barium hydroxide, calcium oxide, magnesium oxide, calcium carbonate, sodium carbonate, and the like.
  • the solution containing anhydrothrombin synthesized by the alkali treatment is thereafter (after the anhydrolysis reaction), at least one solution selected from the group consisting of the above-mentioned polyhydric alcohols and saccharides. It is returned to its original state (steric structure) by a regeneration operation in the presence of a certain compound and a salt or ampholyte.
  • the regenerating operation is not particularly limited, and a conventionally known method can be used.
  • the same type of solvent as used in the reaction can be used), and the temperature is maintained at a temperature in the range of 30 to 50 ° C for a certain period of time, and the pH is adjusted to the range of 4 to 10 by dialysis. And so on.
  • the regenerated anhydrothrombin is composed of at least one compound selected from the group consisting of coexisting polyvalent alcohols and saccharides, and salts or amphoteric electrolytes (Na) which need to be removed. If one of the salts such as Cl and phosphates or one of the ampholytes can be contained in the eluate used for the final extraction of anhydrothrombin, there is no need to separate and remove it.
  • Purification and separation for the purpose of removing is not particularly limited, and a conventionally known method can be used. Examples thereof include dialysis, ultrafiltration, gel chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography and the like. Can be used.
  • At least one compound selected from the group consisting of polyhydric alcohols and saccharides from a regenerated anhydrothrombin solution is passed through a membrane such as cellulose to a solvent of pH 4 to 10 (see above).
  • a membrane such as cellulose
  • the same type of solvent as used for the anhydrolysis reaction and the regeneration operation can be used).
  • purification and separation are performed for the purpose of removing impurities to obtain a desired anhydrothrombin.
  • a purification / separation method is not particularly limited, and a conventionally known purification / separation method can be used.
  • a purification / separation method is selected from the group consisting of polyhydric alcohols and saccharides.
  • Anhydrothrombin excluding at least one compound comprising The solution is concentrated using a YM 10 membrane or the like, and then benzomidine equilibrated with a solvent having a pH of 4 to 10 (the same solvent used for the above-mentioned anhydrolysis reaction and regeneration operation can be used).
  • the solution is washed by passing it through a Sepharose column, etc., and then a benzamidine solution adjusted to pH 4 to 10 (the solution contains sodium chloride, potassium chloride, chloride, etc. for the purpose of specifically adsorbing the target protein).
  • a benzamidine solution adjusted to pH 4 to 10 the solution contains sodium chloride, potassium chloride, chloride, etc. for the purpose of specifically adsorbing the target protein.
  • a solvent with a pH of 4 to 10 (the same solvent used for the above-mentioned anhydrolysis reaction and regeneration operation) is used to remove benzamidine
  • anhydrothrombin synthesized by a method other than the above, for example, a method using guanidine hydrochloride (Gdn-HCl) in the reaction step instead of PMS can also be appropriately used.
  • the present invention is an affinity adsorbent having thrombin or a substance similar to thrombin which has lost nucleophilicity (activity) without causing steric hindrance to binding to a substrate and Z or an inhibitor as a ligand. .
  • the above-mentioned anhydrothrombin As the thrombin which has lost nucleophilicity (activity) without causing steric hindrance to binding to Z or an inhibitor, the above-mentioned anhydrothrombin is preferable.
  • at least one amino acid sequence of thrombin may be used instead of anhydrothrombin as described above.
  • a variant of thrombin in which the amino acid consists of an amino acid sequence deleted, substituted or added by genetic recombination, and has lost nucleophilicity (activity) without causing steric hindrance to binding to substrates or inhibitors It may be.
  • the site called the anion binding site of thrombin is considered important. Therefore, it is possible to purify a thrombin substrate and Z or an inhibitor using thrombin which has lost its nucleophilicity (activity) without causing steric hindrance while retaining the binding site. Therefore, such a mutant of thrombin can be used as a ligand in the affinity adsorbent of the present invention.
  • amino acid residues that are considered to confer the nucleophilicity (activity) of thrombin by a charge relay system are deleted, substituted or added.
  • a mutant of thrombin is used that has lost its nucleophilicity (activity) without causing steric hindrance to binding to the substrate or inhibitor.
  • substitution of asparagine for asparagine in the active site of thrombin or for substitution of alanine for active serine in the thrombin active site does not cause steric hindrance to binding to a substrate or inhibitor (Activity) can be obtained.
  • the present invention uses an affinity adsorbent having thrombin or a substance similar to thrombin which has lost nucleophilicity (activity) without causing steric hindrance to binding to a substrate and / or an inhibitor as a ligand.
  • the present invention provides an affinity chromatography comprising: A substance similar to thrombin, which has lost nucleophilicity (activity) without causing steric hindrance to binding to the substrate and Z or an inhibitor, has deleted at least one amino acid of thrombin by genetic recombination, It is preferably a mutant of thrombin consisting of a substituted or added amino acid sequence.
  • Constituent requirements of affinity adsorbents other than the ligand and method of manufacturing affinity adsorbents eg, selection of carrier and its production method, presence or absence of a spacer, selection of ligand immobilization mode, method of ligand immobilization) (Reaction), concentration of immobilized ligand, etc.
  • affinity adsorbents other than the ligand and method of manufacturing affinity adsorbents (eg, selection of carrier and its production method, presence or absence of a spacer, selection of ligand immobilization mode, method of ligand immobilization) (Reaction), concentration of immobilized ligand, etc.) can be applied to a wide range of conventionally known techniques, and may be appropriately selected from these and used.
  • the thrombin substrate and Z or inhibitor which can be applied to the purification method of the present invention include a wide range of factors involved in the blood coagulation system, and include fibrinogen (coagulation factor I), blood coagulation factor VIII In addition to factors such as blood coagulation factor XIII, blood coagulation factor V, and blood coagulation factor XI, proteins that serve as substrates for thrombin such as protein C and protein S, as well as heparinco factor-1 And the like, which act as thrombin inhibitors.
  • fibrinogen coagulation factor I
  • blood coagulation factor VIII In addition to factors such as blood coagulation factor XIII, blood coagulation factor V, and blood coagulation factor XI, proteins that serve as substrates for thrombin such as protein C and protein S, as well as heparinco factor-1 And the like, which act as thrombin inhibitors.
  • the thrombin substrate and Z or inhibitor that can be applied to the above-mentioned purification method of the present invention include human-derived thrombin substrates and / or inhibitors such as plasma, platelets, and placenta, and thrombin substrates obtained by genetic recombination.
  • Z or an inhibitor comprises a thrombin substrate and an amino acid sequence in which at least one amino acid of the amino acid sequence of Z or the inhibitor has been deleted, substituted or added by a genetic engineering operation, and And variants thereof that maintain blood coagulation activity and antithrombin activity, respectively).
  • the method for preparing the thrombin substrate and / or the inhibitor using the gene recombination technique is not particularly limited, and a method in which conventionally known gene recombination techniques relating thereto can be widely used. It is. Specifically, for example, in the case of preparing activated protein C, see JP-A-61-205487, JP-A-1-2338, or JP-A-1-85084. Issue Activated protein C prepared by a production method similar to that described is exemplified. In addition, protein C may be prepared using the above-mentioned gene recombination technique, and protein C may be purified by the purification method of the present invention, and then activated to obtain activated protein C.
  • the method for activating protein C to activated protein C is not particularly limited.
  • the method is activated by thrombin isolated from blood such as human lung, or activated by an equivalent protease. It can also be carried out by a method.
  • an affinity port comprising thrombin or a substance similar to thrombin, which has lost nucleophilicity (activity) without causing steric hindrance to binding to the substrate or inhibitor, is used as a ligand.
  • one step is incorporated into the step of purifying the thrombin substrate and / or the inhibitor. Which step in the step of purifying the thrombin substrate and / or the inhibitor can achieve the intended purpose.
  • the affinity chromatography step using thrombin which has lost nucleophilicity (activity) without causing steric hindrance to binding to the substrate or the inhibitor, as a ligand, comprises: It is characterized in that it is incorporated into the step of removing the thrombin substrate and / or inhibitor contained as impurities.
  • This invention is an application of the above-mentioned purification and separation step, which focuses on the property of specifically adsorbing and desorbing a thrombin substrate and Z or an inhibitor with anhydrothrombin or the like which is a ligand for affinity chromatography. Rather, the thrombin substrate and Z or an inhibitor (eg, fibrinogen) or the like contaminated as contaminants can be easily separated and removed using the affinity chromatography.
  • the affinity chromatography The description regarding the ligands such as anhydrothrombin and the like, and the thrombin substrate and / or the inhibitor is the same as that described in the above-mentioned purification method, and is omitted here.
  • FIG. 1 shows a photograph instead of a drawing, showing the result of electrophoresis of FXIII finally purified in Example 1, which is one embodiment of the present invention. It is. BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
  • This solution was adjusted to pH 7.8 with 1 M Tris-HCl buffer Z50% glycerin ZpH7, and kept at 4 t for 12 hours. Thereafter, the solution was dialyzed against 50 mM Tris-HCl buffer Z1M NaC1 / pH7.5, and further subjected to 50 mM Tris-HCl-buffer / 0.1 M NaC1 / pH7.5. This solution was applied to a benzamidine sepharose column equilibrated with 50 mM Tris-HCl buffer Z0.1 M NaClZ pH 7.5. Thoroughly wash the impurity peaks with the same buffer, and add 50 mM Tris-HCl buffer.
  • FXIII preparation (Fivirogamine P, manufactured by Hoechst) was dissolved in 5 OmM Tris-HCl buffer ZO. 2M NaC1 / pH7.5, and the solution was applied to the column equilibrated with the same buffer. Further, impurities were completely washed by a NaC 1 gradient operation, and eluted with 5 OmM Tris-HCl buffer 0.2 M NaC 1 /0.2 M benzamidine Z pH 7.5. The first 15 ml of the benzamidine peak was collected and used as FXIII solution. More than 80% was recovered and obtained by electrophoresis in a single molecular weight (Mr) 320 000 band.
  • Figure 2 shows a photograph instead of a drawing for electrophoresis.
  • the column was washed with 4 column volumes of the same buffer, and eluted with 50 mM Tris-HC1Z 0.2 MNaC1 / 0.1 MCaC12 / 0.2 M benzamidine / "pH 7.5.
  • the activity of blood coagulation factor VIII in the eluate was measured with S-2222 (Daiichi Pharmaceutical Co., Ltd.). As a result, an activity of 60% or more was confirmed.
  • Example 5 When the same experiment as in Example 4 was carried out on 1000 u of human blood-derived blood coagulation factor VIII (manufactured by Japan Red Cross Co., Ltd., Cross Eight M (trade name)), approximately 60% activity was confirmed.
  • human blood-derived blood coagulation factor VIII manufactured by Japan Red Cross Co., Ltd., Cross Eight M (trade name)
  • Example 8 A sample obtained by dialysis of citrate plasma under the same conditions as in Example 6 was added to a column packed with anhydrothrombin sepharose as in Example 6, and then 5 OmM Tris-HC 1 Z0.5 M NaC Washed at 1 / ⁇ 7.5. After the impurity peak was over, elution was carried out with 5 OmM Tris-HC 1Z0.2 M NaC I / O. 1 M benzamidinno pH 7.5. Book According to the method, the specific activity was increased about 1000-fold, and the purification was performed with a recovery of about 60%.
  • Blood coagulation factor V produced by the method of K. Suzuki, B. Dahlback, J. Stenflo, J. Biol. Chem., 257, 6556 (1982)
  • blood coagulation factor XI BN Bouma, JH Griffin, J. Biol. Chem., 252, 6432 (1977)
  • the specific activities were about 1.2 times and 1.1 times, respectively.
  • the recovery was about 65% and 70%, respectively.
  • a novel and inexpensive means for separation and purification as a ligand that reacts specifically and reversibly with a thrombin substrate and an inhibitor or a nucleophile without causing steric hindrance to binding with the substrate or the inhibitor ( Thrombin having lost its activity), for example, affinity chromatography using anhydrothrombin or the like, and by providing the affinity chromatography step, the affinity chromatography can be performed from the group consisting of a thrombin substrate and an inhibitor.
  • a method for purifying one selected thrombin substrate and ⁇ or inhibitor simple separation and purification operations and short purification separation man-hours make it extremely inexpensive and high-yield compared to, for example, a production method using anti-protein C antibody.
  • Rate yield by anti-protein C antibody is as low as about 30%, but about twice as high as about 60%
  • the thrombin substrate and / or inhibitor (including two or more types) contained as contaminants during the production (particularly, purification and separation) of a purified product such as a preparation other than the thrombin substrate and / or the inhibitor are further included.
  • Can be applied, and ⁇ is a highly effective method for purifying and separating thrombin substrates and It is possible to provide a removed by means.
  • the method for purifying FXIII of the present invention makes it possible to purify both the natural and the genetically engineered FXIII with higher purity and higher recovery rate than the intended purification method of the prior art.
  • FXIII derived from human plasma which is excellent in safety, recovery and purification can be further improved, leading to effective use of precious plasma.

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Description

明 細 基質および または阻害剤の精製方法または除去方法 技術分野
本発明は、 リガンドとして基質および Zまたは阻害剤との結合に立体 障害を引き起こさずに求核性 （活性） を失わせたトロンビンまたはトロ ンビンに類似した物質を有する親和性吸着体、 当該親和性吸着体を用い てなるァフィ二ティークロマトグラフィー、 さらに、 当該ァフィ二ティ 一クロマトグラフィーの工程を有することを特徴とする新規なトロンビ ン基質および または阻害剤の精製方法に関するものである。 より詳し くは、 ァフィ二ティークロマトグラフィーのリガンドとしてアンヒドロ トロンビンのような基質または阻害剤との結合に立体障害を引き起こさ ずに求核性 （活性） を失わせたトロンビンまたはトロンビンに類似した 物質を用いて、 トロンビン基質おょぴ または阻害剤を精製する方法に 関するものである。 さらに、 本発明は、 上記ァフィ二ティ一クロマトグ ラフィ一の特異的な吸脱着作用を利用して、 他の精製対象物中に夾雑物 として含まれているトロンビン基質および/または阻害剤を除去する方 法に関するものである。 背景技術
血液凝固第 V I I I因子 （FVIII) は、 血液凝固機構において、 凝血 が始まりトロンビンが形成される前までの凝血第一相の内因性機序に関 与するものである。 この FVIII活性が低下している疾患を血友病 Aとよ ぶことから、 該 FVIIIは、 抗血友病グロブリンまたは抗血友病因子 Aと 呼ばれている。 血友病 Aは、 性染色体劣性遺伝であり、 因子活性低下の程度により、 軽症、 中等症、 重症に分類され、 軽症では、 自然出血はまれであり、 外 傷や手術、 抜歯時の止血困難によって初めて気づく程度であるが、 中等 症ないし重症例では、 自然出血が主症状となり、 内因性凝固障害のため 出血が深部組織に起こり、 特に関節腔内への出血はこの疾患に特徴的で、 反復出血により関節症をきたし、 さらに関節は拘縮変形して機能障害を 呈するようになるほか、 筋肉内出血、 頭蓋内出血、 腎出血等が認められ る。
こうした血友病の患者治療には、 遺伝子治療あるいは移植治療も考え られるが現時点では臨床的研究が進められている段階であり、 血友病患 者に対して実用化はされておらず、 現状では、 出血時に欠損因子である FVIIIを補充し、 その都度、 止血を図るか、 もしくは出血が予想される ときに予備的に補充する治療が必要となっている。
こうした血友病の患者治療に用いられる FVIII製剤 （欠乏している FV IIIの血中レベルを止血水準まで高め、 出血を防止するもの） としては、 ヒト血漿中の FVIIIの濃度が 0 . 1〜0 . 2 m g / 1と極めて少ないた め、 Chon I分画を凍結したものを低温で徐々に融解した際に生ずる沈 澱であるクリオプレシピテート （FVIIIが高濃度に存在する） を製剤と して用いていたが、 輸血後に肝炎 （B型肝炎、 C型肝炎） や A I D S (後天性免疫不全症候群） に感染する危険性があるため、 現在では、 6 0 °Cで 1 0時間液状加熱した乾燥濃縮人血液凝固第 VIII因子製剤や、 6 5 °Cで 9 5時間乾燥加熱処理した乾燥濃縮人血液凝固第 VIII因子製剤等 の安全性の極めて高い加熱製剤が使用されているほかに、 献血者血漿を 原料に、 加熱処理や有機溶媒 界面活性剤処理 （T N B P Zォクトキシ ノール 9処理） にてウィルス不活化し、 抗 FVIIIモノクローナル抗体を 使用して精製分離した乾燥濃縮人血液凝固^ VIII因子製剤や、 例えば、 特開平 7— 2 7 8 1 9 7号 （特許番号 2 5 1 3 9 9 3号） 等に開示され ているように、 遺伝子組み換え技術により産生された産物を第 VIII： C 因子活性の C—末端サブュニットに対するモノクローナル抗体を使つた ァフィ二ティ一クロマトグラフィー等により精製されたリコンビナント 製剤がある。
しかしながら、 加熱処理や有機溶媒 界面活性剤処理にてウィルス不 活化が図られ安全性が高められた製剤も、 非 A非 B型肝炎等のウィルス 感染症の危険性を完全に否定できず、 また加熱製剤ではフィプリノ一ゲ ンが含まれているので、 投与により血中のフイブリノ一ゲン濃度が過度 に上昇するおそれがある。 一方、 上記モノクローナル抗体を使用して精 製分離する場合には、 （1 ) モノクローナル抗体に異種動物蛋白が使わ れていることが多いことから、 製剤中に異種動物蛋白混入の危険性があ り、 （2 ) コスト面でも該モノクローナル抗体自体が極めて高価である ため、 最終的に得られる製剤も高価なものにならざるを得ないとする問 題がある。 また、 血液凝固第 XII I因子 （以下、 単に FXIIIともいう） は、 血液凝 固機構の最終段階である安定性フイブリンポリマーの生成に関与しフィ ブリン安定化因子ともよばれる。 平常は、 不活性状態で血漿中に存在す るが、 出血などによりトロンビン (Thrombin) が生成されると、 トロン ビンとカルシウムイオンにより活性化され、 フイブリンを安定化する。 よって、 FXIIIが減少もしくは欠損している患者において、 血液凝固時 間は正常値を示すが、 形成されたフイブリン塊が不安定であるため、 後 出血などの現象を呈する。 そのため、 FXIII製剤の臨床適応については、 広く創傷治癒促進に用いられている。
以前国内で使用されていた FXIIIは、 胎盤由来であるが、 ① FXIIIの含 有される形態が胎盤中と血漿中で異なること、 ②免疫原となるような不 純物の含まれる可能性があること、 ③ウィルスの不活化の工程に問題が あること、 などが指摘され （特開平 1一 2 5 0 3 2 6号公報） 、 血漿由 来の原料へ変更された。 しかしながら、 血漿中には少量しか FXIIIが含 まれていないため、 FXIII製剤は輸入血漿によってまかなわれている。 この FXIII製剤は、 血漿、 血小板、 胎盤などから抽出、 精製分離され、 パスッリセーシヨン （液状加熱、 6 0 °C、 1 0時間処理） を施すことに より、 各種ウィルス （B型肝炎ウィルス、 H I V— 1等のレトロウィル ス等） を不活化して製剤化するか、 あるいは遺伝子組換え技術により酵 母細胞内に組換え FXI II (血液凝固活性を有するその類似体を含む） を 産生させ、 酵母破壊上清から精製して製剤化している。 こうした血漿、 血小板、 胎盤、 組換え FXIIIなどより精製する場合、 主な精製方法は、 例えば、 ①レエウイ A. G . (Loewy, A. G. ) , ジャーナル ォブ ハ、 ォロンカル ケミストリ一 (Journal of Biological Ciiemistry) , 236、 2625 (1961) 、 ②ジャヌスコ B . T. (Janusuzko, Β. Τ. ) , ネ —チユア一（Nature)、 191、 1093 (1961) 、 ③ボーン V. H. (Bohn. V. H. ) , ブルート（Bl u 、 25, 235 (1972) 、 ④ウィンケルマン L . (Winkelman L. ) 等、 トロンボシス アンド へモス夕シス （Thrombos is and Haemostasis) , 55、 402 (1986) 等に記載されているように、 硫 酸アンモニゥム、 ァクリノ一ル、 アルコール、 クェン酸三ナトリウム、 ダリシンなどの沈澱法やゲル瀘過などの組み合わせであり、 FXIIIの純 度は約 1 5〜5 0 %である。 また、 プロテイン C (以下、 単に P Cとも略称する） は、 ビタミン 依存性の糖蛋白質、 すなわち、 ひ一カルボキシグルタミン酸含有蛋白質 の一種であり、 血管内皮細胞表層のト口ンポモジュリンの存在下でト口 ンビンによって活性化されて活性化プロテイン C (以下、 単に APCと も略称する） となる。 APCは、 セリンプロテア一ゼの一種であり、 血 液凝固系の補酵素である第 V因子 （FV、 FVa) と第 VIII因子 （FVII I、 FVIIIa) を不活化し、 強い抗凝固作用を示す。 また、 血管壁からプ ラスミノーゲン 'ァクチべ一ターを放出させ、 線溶系を促進させること が知られている （APCは t PAインヒビ夕一と結合して当該インヒビ 夕一の t PA阻害活性を抑制するため線溶促進活性をも有する） 。 さら に、 プロテイン C欠損症は重度の血栓症を呈すことも知られており、 A P Cは、 血液凝固線溶系の重要な制御因子であることが明らかにされて いる。 このように PCもしくは APCは抗凝固剤、 線溶系剤としての新 たな医薬品の開発が期待されている。
従来から、 血漿中に存在する P Cあるいは組織培養系中に誘発される PCの量は、 非常に微量であることが知られている （例えば、 血漿中に 存在する P Cは肝臓で合成され、 血漿中で酵素前駆体として約 4 g/ m 1の濃度で循環している） 。 プロテイン Cもしくは活性化プロテイン Cを抗凝固剤、 線溶系剤として広く安全に使用するためには、 分離精製 することが極めて重要である。
血液由来の A PCの製法としては、 以下の方法が挙げられる。 例えば、 (1) ヒト血漿から抗プロテイン C抗体を用いたァフィ二ティークロマ トグラフィ一により精製されたプロテイン Cを、 ヒトトロンビンで活性 化した後、 陽イオンクロマトグラフィーを用いて精製する方法 （ブラッ ド Blood, 63， p.115-121(1984)), あるいは (2) Kisielによる、 ヒト 血漿からクェン酸バリウム吸着 ·溶出、 硫酸アンモニゥム画分化、 DE AE—セフアデックスカラムクロマトグラフィー、 デキストラン硫酸ァ ガロースクロマトグラフィーおよびポリアクリルアミドゲル電気泳動等 - の工程により精製して得られたプロテイン Cを活性化して AP Cとする 方法 （ジャーナル ォブ クリニカル インヴエスティゲーシヨン J. Clin. Invest., 64, p.761-769 (1979)) 、 あるいは (3) 市販のプロテ イン Cを含有する血液凝固製剤を T ay 1 o r等の方法 （ジャーナル ォブ クリニカル インヴエスティゲーシヨン J. Clin. Invest., 79, p. 918-925 (1987)) で活性化して A P Cとする方法等がある。
しかしながら、 上記 （1) の製法の場合、 ァフィ二ティ一クロマトグ ラフィ一に用いる抗プロテイン C抗体自体が極めて高価であり、 また、 該ァフィニティ一クロマトグラフィーによって精製されるプロテイン c の収率も 30 %程度と低く、 最終的に得られる AP C製剤も極めて高価 なものにならざるを得ないとする問題がある。 また、 上記 （2) の製法 の場合、 プロテイン Cの精製分離工程が多く、 かつ該精製分離操作も複 雑であり、 又、 上記 （1) の製法のようにプロテイン Cを特異的に吸脱 着させるものではないため高純度化が難しく、 精製されるプロテイン C の収率も 30%程度と低く、 最終的に得られる APC製剤も極めて高価 なものにならざるを得ないとする問題がある。
また、 遺伝子組換え技術を用いて A PCを調製する方法としては、 例 えば、 特開昭 61— 205487号、 特開平 1一 2338号あるいは特 開平 1— 85084号等に記載された方法等がある。 このようにして生 産されたプロテイン Cもしくは活性化プロテイン C原料は、 通常の生化 学的分離精製法を組み合わせて分離精製される。 そのようなものとして は、 例えば、 硫酸アンモニゥムによる塩析法、 イオン交換樹脂によるィ オン交換クロマトグラフィー、 ゲル濾過法、 電気泳動法などが挙げられ る。
しかしながら、 通常の生化学的分離精製法を組み合わせて分離精製す る方法の場合においても、 上記 （2) の製法の場合と同様に、 PCもし くは A P Cの精製分離工程が長く、 かつ該精製分離操作も複雑であり、 又、 上記 （1 ) の製法のように P Cもしくは A P Cを特異的に吸脱着さ せるものではないため高純度化が難しく、 精製される P Cもしくは A P Cの収率も 3 0 %程度と低い。
また、 上述した P Cもしくは A P C以外にも、 血液凝固第 V因子、 血 液凝固第 XI因子、 プロテイン S、 へパリンコファクタ一 II、 フイブリノ 一ゲン、 トロンビンレセプ夕一のようなトロンビン基質および Zまたは 阻害剤の製法に関しても、 通常の生化学的分離精製法を組み合わせて分 離精製する方法が使われており、 高純度のトロンビン基質および また は阻害剤を効率よく安定的に得るには、 上記 P Cもしくは A P Cと同様 の問題がある。 本発明者らは、 上記目的を達成すべく、 トロンビン基質およびノまた は阻害剤につき鋭意検討した結果、 トロンビン基質およびノまたは阻害 剤と特異的かつ可逆的に反応するリガンドとして基質ないし阻害剤との 結合に立体障害を引き起こさずに求核性 （活性） を失わせたトロンビン、 例えば、 アンヒドロトロンビン（Anhydro- Thrombin)等を用いてなるァフ ィニティ一クロマトグラフィーをトロンビン基質およびノまたは阻害剤 の精製工程 （精製最終工程後に組み込む場合を含む） に組み入れること により、 該アンヒドロトロンビン等はヒトトロンビンから調製されたヒ ト由来蛋白であり、 かつ抗プロテイン C抗体等に比して極めて安価であ るので、 該アンヒドロトロンビン等による分離により上記問題は解決さ れることを見出し、 本発明を完成するに至ったものである。 さらに、 本 発明者らは、 該アンヒドロトロンビン等によりトロンビン基質および または阻害剤を特異的に分離できる作用に基づき、 他の精製対象物中に 夾雑物として含まれているトロンビン基質および または阻害剤 （除去 - する対象物は、 2種以上であってもよい） の除去にも適用できる事を見 出し、 本発明を完成するに至ったものである。 即ち、 本発明の目的は、 リガンドとして基質およびノまたは阻害剤と の結合に立体障害を引き起こさずに求核性 （活性） を失わせたトロンビ ンまたはトロンビンに類似した物質を有する親和性吸着体および当該親 和性吸着体を用いてなるァフィ二ティークロマトグラフィーを提供する ものである。
また、 本発明の目的は、 新規かつ安価な分離精製手段を利用し、 簡単 な分離精製操作および短い精製分離工数により、 安価で高純度のトロン ビン基質および または阻害剤を効率よく安全かつ安定的に精製する方 法を提供するものである。
また、 本発明の目的は、 異種動物蛋白等の不純物の混入の危険性がな く、 かつ安価に FVIIIを精製する方法を提供するものである。
また、 本発明の他の目的は、 肝炎 （B型肝炎、 C型肝炎） 、 A I D S (後天性免疫不全症候群） などのウィルス感染を伴うことなく、 投与に よっても血中のフイブリノ一ゲン濃度が過度に上昇するおそれのない F VIIIを精製する方法を提供するものである。
また、 本発明の目的は、 血漿中に少量しか含まれていない FXIIIを従 来の精製方法に比べ高純度、 高回収率に精製する方法を提供するもので ある。
また、 本発明の他の方法は、 血漿以外の血小板や胎盤などの天然由来 の FXIIIにより得られた FXIIIを従来の精製方法に比べ高純度、 高回収率 に精製し、 さらに従来の精製方法で問題となっていた免疫原となるよう な不純物の含まれる可能性がほとんどなく、 ウィルスの混入される確率 が著しく減る精製方法を提供するものである。
また、 本発明の他の方法は、 遺伝子組み換え操作により得られた FXII Iおよびその変異体 （FXIIIのアミノ酸配列の少なくとも一のアミノ酸が 遺伝子組換操作により欠失若しくは置換されたアミノ酸配列からなり、 かつ FXII I活性を有する変異体） に対しても蛋白質等の不純物の分離精 製を天然由来の FXII Iの精製方法を利用して行っている当該精製方法に 比べ高純度、 高回収率に精製する方法を提供するものである。 発明の開示
本発明に係る卜ロンビン基質およびノまたは阻害剤の精製方法は、 リ ガンドとして基質または阻害剤との結合に立体障害を引き起こさずに求 核性 （活性） を失わせたトロンビンまたはトロンビンに類似した物質を 有する親和性吸着体を用いてなるァフィ二ティークロマトグラフィーの 工程を有することを特徴とするものである。
すなわち、 本発明では、 トロンビン基質および Zまたは阻害剤につい て今だ知られていない安価なヒト由来蛋白をリガンドに用いたァフィ二 ティ一クロマトグラフィーによる特異的精製法を開発する上で、 その力 ギとなるトロンビン基質および/または阻害剤との吸脱着が可能で安価 なヒ卜由来蛋白によるリガンドを得るべく鋭意検討した結果、 基質また は阻害剤との結合に立体障害を引き起こさずに活性を失わせたトロンビ ンまたはトロンビンに類似した物質が有用であることを見出したもので ある。
本発明では、 卜ロンビン基質および Zまたは阻害剤とは、 トロンビン に対しそれぞれ基質または阻害剤として作用するものをいい、 具体的に は、 フイブリノ一ゲン （血液凝固第 I因子） 、 血液凝固第 V III因子、 血液凝固第 XIII因子、 血液凝固第 V因子、 血液凝固第 XI因子、 プロティ ン〇、 プロテイン S、 トロンビンレセプ夕一などの基質、 へパリンコフ アクター 11などの阻害剤が挙げられる。 これらのトロンビン基質および または阻害剤は、 ミカエリス一メンテン（Michael is- Menten)の説 （酵 素反応は、 酵素分子と基質分子が結合し、 酵素基質複合体を生じてから 化学反応が進行し、 この複合体から反応生産物が遊離して酵素は反応初 期時の状態に戻るとする説） により①のような反応形態をとる。
① トロンビン +トロンビン基質ないし阻害剤
^ トロンビン ' トロンピン基質ないし阻害剤複合体
一トロンビン +活性化トロンビン基質ないし阻害剤 トロンビンの求核性 （活性） は、 トロンビン中の活性セリン付近のァ ミノ酸の電荷リレー系（charge relay system：キモトリプシンおよび他 のセリンプロテアーゼの活性部位に存在しているアミノ酸の側鎖間の一 連の水素結合をいい、 活性部位におけるセリン残基の水酸基の高度な求 核性 （活性） の原因となっている。 すなわち、 その一連の水素結合は、 ァスパラギン酸の負に荷電したカルボキシル基からセリン残基の水酸基 の酸素へ電子を流し、 その結果、 水酸基の酸素を高度に求核的にするも のである。 ） が関与していると言われている。
この電荷リレー系は、 アンヒドロ化や遺伝子操作によって破壊するこ とによりトロンビン基質および/または阻害剤との結合に立体障害を引 き起こさずに求核性 （活性） を著しく低下させることが可能である。 例 えば、 トロンビン活性部位中のァスパラギン酸をァスパラギンに置換等 するか、 またはトロンビン中の活性セリンをァラニンに置換等すること により、 トロンビン基質および または阻害剤との結合に立体障害を引 き起こさずにトロンビンの活性 （求核性） を著しく低下させることがで きる。 これにより、 卜ロンビン基質およびノまたは阻害剤との結合に立 体障害を引き起こさずに求核性 （活性） を失わせたトロンビンまたはト ロンビンに類似した物質は、 フイブリノ一ゲン （血液凝固第 I因子） 、 血液凝固第 V因子、 血液凝固第 VII I因子、 血液凝固第 XI因子、 血液凝 固第 XIII因子、 プロテイン c、 プロテイン s、 トロンビンレセプターな どのトロンビンの基質、 へパリンコファクタ一 IIなどのトロンビンの阻 害剤、 その他蛋白と可逆的な以下の②のような反応 （ここでは、 卜ロン ビン基質および または阻害剤との結合に立体障害を引き起こさずに活 性 （求核性） を失わせたトロンビンまたはトロンビンに類似した物質と してアンヒドロトロンビンを用いた例を示す。 ） をすることがわかった。 すなわち、 トロンビンを合成阻害剤と反応させてトロンビンの活性セリ ン残基とエステル結合を形成せしめることで、 トロンビン基質および Z または阻害剤との結合に立体障害を引き起こさずにトロンビン活性を失 わせたアンヒドロトロンビンは、 セファロース等の担体 （支持体） に結 合する能力が残っており、 トロンビン基質および または阻害剤に対す る特異的な結合能力により優れた結合性を有するものである。 この特殊 な能力は、 親和性吸着体のリガンドとして大いに利用できることがわか つたのである。 このアンヒドロトロンビンは酵素を素材にしているにも かかわらず、 その特異的結合能力だけを利用する新しい概念のリガンド といえる。
②アンヒドロトロンビン +トロンビン基質ないし阻害剤
^アンヒドロトロンビン ' トロンビン基質ないし阻害剤複合体 リガンドとして上記アンヒドロトロンビン等の基質または阻害剤との 結合に立体障害を引き起こさずに求核性 （活性） を失わせたトロンビン またはトロンビンに類似した物質を用い、 該リガンドにトロンビン基質 および または阻害剤のなかの所望の 1つを特異的に吸着させ回収する には、 一般的なァフィ二ティクロマトグラフィーの操作と同様の極めて 簡単な操作によって行うことができる。 すなわち、 目的物質であるトロ ンビン基質およびノまたは阻害剤のなかの所望の 1つを含む溶液を適当 な塩濃度で、 かつ適当な p H領域に調製し、 例えば、 上記リガンドを固 定化した担体 （=吸着体） を用いたカラム等に流し、 次に、 適当な緩衝 液等でカラムを洗浄した後、 溶離液を流すと吸着されていた目的物質が 鋭いピークとなって溶出回収されるものである。 これにより、 所期の効 果を達成することができるものである。 尚、 目的物質であるトロンビン 基質および または阻害剤を含む溶液中には、 目的物質以外の他のトロ ンビン基質およびノまたは阻害剤が含まれない状態若しくは目的物質に 対してごく微量しか含まれない状態にしておく必要がある。 これは、 上 述したようにこれらの目的物質以外の他のトロンビン基質および/また は阻害剤もリガンドであるアンヒドロトロンビンと特異的に吸着するこ とがあるためである。 従って、 遺伝子組み換え技術によるトロンビン基 質および または阻害剤の産生後の分離精製では特に問題はないが、 ヒ 卜由来血漿からこうした目的物質を分離精製する場合にはこの点に十分 に留意する必要がある。 例えば、 ヒト由来血漿からプロテイン Cを分離 精製する場合には、 血漿をクェン酸バリウムによる吸着 ·溶出操作によ り、 プロテイン Cと他の血液凝固第 V III因子、 血液凝固第 XIII因子等 とを簡単に分離することができる。
また、 初期精製段階として、 複数のタンパク溶液からいくつかのトロ ンビン基質および阻害剤を精製または除去することも可能である。 上記基質または阻害剤との結合に立体障害を引き起こさずに求核性 (活性） を失わせたトロンビンとしては、 上述の通り、 ヒトトロンビン をアンヒドロ化してなるアンヒドロトロンビンが有用である。
かかるアンヒドロトロンビンは、 以下の方法で合成できる。 (1) 1. トロンビンの活性セリン残基部位と合成阻害剤とを反応さ せる工程、
2. pH 1 1以上でアルカリ処理を行う工程、
3. 回収操作を行う工程、
を含み、 かつ前記各工程を順次行うアンヒドロ卜ロンビンの合成方法で あって、
少なくとも回収操作を行う工程において、 多価アルコールおよび糖類 よりなる群から選ばれてなる少なくとも 1種の化合物と塩もしくは両性 電解質を共存させることを特徴とするものである。
また、 （2) 上記 （1) に記載のアンヒドロトロンビンの合成方法 において
、 前記多価アルコールおよび糖類よりなる群から選ばれてなる少なくと も 1種の化合物が、 グリセリン、 エチレングリコールおよびショ糖より なる群から選ばれてなる少なくとも 1種の化合物であることを特徴とす るものである。
さらに、 （3) 上記 （1) または （2) に記載のアンヒドロトロン ビンの合成方法において、 前記塩もしくは両性電解質が、 塩化ナトリウ ム、 塩化カリウムおよびグリシンよりなる群から選ばれてなる少なくと も 1種の化合物であることを特徵とするものである。
さらにまた、 （4) 上記 （1) 〜 （3) のいずれか 1つに記載のァ ンヒドロトロンビンの合成方法において、 前記多価アルコールおよび糖 類よりなる群から選ばれてなる少なくとも 1種の化合物は、 気温 23°C、 相対湿度 50%の環境下において、 液体である場合は重量比で、 粉体、 粒体または固体である場合は体積比で、 全体に対する割合が 5 %以上で あることを特徴とするものである。
また、 （5) 上記 （1) 〜 （4) のいずれか 1つに記載のアンヒド 4 ロトロンビンの合成方法において、 前記塩もしくは両性電解質の濃度が、 0. 2M以上であることを特徴とするものである。
上記アンヒドロ卜ロンビンの合成方法は、
1. トロンビンの活性セリン残基部位と合成阻害剤とを反応させるェ 程 （第 1工程） 、
2. pHl 1以上でアルカリ処理を行う工程 （第 2工程） 、
3. 回収操作を行う工程 （第 3工程） 、
を含み、 かつ前記各工程を順次行うアンヒドロトロンビンの合成方法で あって、
少なくとも回収操作を行う工程において、 多価アルコールおよび糖類 よりなる群から選ばれてなる少なくとも 1種の化合物と塩もしくは両性 電解質を共存させることを特徴とするものである。
具体的に合成阻害剤としてフエニルメタンスルホニルフルオリド （以 下、 PMSFともいう） の場合を例にとれば、 下記反応式として表すこ とができる。 なお、 当該具体例に係る代表的な合成例の概略を図 1に示 す。
Figure imgf000016_0001
な一卜ロンビンのセリン残基 PMS—トロンビン アンヒドロ卜ロンビン
以下、 上記アンヒドロトロンビンの合成方法を上記 1〜3の工程に従 つて説明する。 ( 1 ) 第 1工程
第 1工程では、 トロンビンを合成阻害剤と反応させてトロンビンの活 性セリン残基とエステル結合を形成せしめてトロンビン活性を失わせる 目的で、 トロンビンの活性セリン残基部位を合成阻害剤と反応させるも のであり、 従来既知の方法を利用することができる。 例えば、 文献 （Bi ochemistry 1995, 34, 6454—6463) 等に用いられている方法などを利用 することができるほか、 下記、 表 1に例示する方法を採ることができる。 ここに、 表 1は、 本発明の FXIIIの精製方法に用いられる立体障害は 弓 Iき起こさずに求核性 （活性） を失わせたトロンビンの 1種であるアン ヒドロトロンビンの製造方法の概略を示すものである。
表 1
Figure imgf000018_0001
なお、 上記アンヒドロトロンビンの合成に用いることのできるトロン ピンとしては、 特に制限されるものでなく、 既に市販されている各種の 精製トロンビン、 例えば、 コーンペースト （Cohn Paste) III (ヒト 由来） のトロンビン、 持田製薬株式会社製の精製トロンビン （ゥシ由 来） 、 株式会社ミドリ十字製の精製トロンビン （ヒト由来） 等をそのま ま用いることができる。
また、 上記アンヒドロトロンビンの合成に用いることのできる合成阻 害剤としては、 上記反応式 （1 ) に例示したように、 トロンビンの活性 セリン残基と反応してエステル結合を形成することのできるものであれ ば、 特に制限されるものではなく、 例えば、 P M S F、 2—フエニルェ タン一 1ースルホニルフルオリド、 メタンスルホニルフルオリド、 p— トルエンスルホニル （トシル） フルオリドなどの各種のスルホニルフル オリド、 卜シルク口リド、 ジイソプロピルフルォロリン酸 （以下、 D F Pともいう） 、 3 , 4—ジクロ口イソクマリン （以下、 3， 4 - D C I ともいう） 、 L— 1一クロロー 3— [ 4—卜シルァシド] —7—ァミノ —2—ヘプ夕ノン—塩酸 （以下、 T L C Kともいう） 、 L一 1一クロ口 —3— [ 4—トシルァシド] 一 4一フエ二ルー 2—ブタノン （以下、 T P C Kともいう） などが挙げられる。
なお、 これら合成阻害剤を添加する際には、 該阻害剤をあらかじめメ タノ一ル、 アセトン、 エタノール、 プロパノール、 イソプロパノール、 ブ夕ノール、 プロパン一 2—オール、 アセトン、 ジメチルホルムアミド、 ジメチルスルホキシドなどの溶媒に溶解したものを用いてもよい。 また、 合成阻害剤を添加する際には、 過剰な添加によるその後の分離除去操作 の煩わしさを低減し、 また反応性を高めるため、 トロンビン活性を 3 % 以下、 より好ましくは 1 %以下になるまで、 確認しながら行うことが望 ましい。
さらに、 反応溶媒としては、 トロンビンの生存に良好なように、 浸透 ' 圧やイオンの平衡を調節する目的で N a C Iが調合された塩類溶液、 あ るいはさらに K+、 Ca2+、 Mg2+などのイオンを数種加えた組成のも のが調合された塩類溶液であって、 さらに p Hを安定に維持するように 緩衝系として pH2〜l 0、 好ましくは pH4〜8を示す緩衝液から任 意に選ばれたものを加えたものであれば良い。 こうした緩衝液としては、 例えば、 リン酸緩衝液、 炭酸塩緩衝液、 重炭酸塩緩衝液、 トリス緩衝液、 クェン酸一リン酸ナ卜リゥム緩衝液、 コハク酸一水酸化ナ卜リゥム緩衝 液、 フタル酸カリウム一水酸化ナトリウム緩衝液、 イミダゾール—塩酸 緩衝液、 ホウ酸緩衝液、 生理的塩類溶液あるいはグッド （Good) の 緩衝液などを挙げることができる。
また、 反応条件としては、 一般に熱的変化がトロンビンの安定化に大 きく影響することから、 反応温度は— 30〜50°C、 好ましくは 4〜4 0°Cの範囲で行うことが望ましい。
上記反応により得られた生成物は、 従来公知の方法を用いて精製分離 を行う。
精製分離に用いられる方法としては、 特に制限されるものでなく、 例 えば、 ゲル濾過、 イオン交換クロマトグラフィー、 ァフィ二テイクロマ トグラフィ一、 限外濾過膜、 透析などが挙げられる。 代表的なゲル濾過 について説明すれば、 反応後の溶液を、 溶媒で膨潤させたゲル （例えば、 セフアデックス、 バイオゲル、 ァガロースゲルなど） 粒子のカラムに添 加し溶媒を流し続けることで、 まず高分子溶質のトロンビン生成物、 遅 れて低分子溶質の合成阻害剤などが溶出し両者が分離されるものである。 ここで使用することのできる溶媒としては、 トロンビンの生存に良好な ように、 浸透圧やイオンの平衡を調節する目的で N a C 1が調合された 塩類溶液、 あるいはさらに K+、 Ca2+、 Mg2+などのイオンを数種加 えた組成のものが調合された塩類溶液であって、 さらに pHを安定に維 - 持するように緩衝系として pH2〜l 0、 好ましくは pH4〜8を示す 緩衝液を加えたものであれば良い。 こうした緩衝液としては、 例えば、 リン酸緩衝液、 炭酸塩緩衝液、 重炭酸塩緩衝液、 トリス緩衝液、 クェン 酸一リン酸ナトリウム緩衝液、 コハク酸一水酸化ナトリウム緩衝液、 フ タル酸力リゥム一水酸化ナトリゥム緩衝液、 ィミダゾールー塩酸緩衝液、 ホウ酸緩衝液、 生理的塩類溶液あるいはグッド （G o o d ) の緩衝液な どを挙げることができる。
( 2 ) 第 2工程および第 3工程
第 2、 第 3工程では、 エステル結合を解離させると共にセリン残基を ァラニン残基に交換してアンヒドロトロンビンを合成し、 さらに高 p H 領域から中性付近に p Hをもどして再生する間に、 凝集 ·会合を起こさ ずに簡便な操作によって該アンヒドロトロンビンを高収率で得る目的で、 第 1工程で精製分離されたトロンビン生成物に対し、 P H I 1以上での アルカリ処理を行う工程 （第 2工程） と、 回収操作を行う工程 （第 3ェ 程） を順次行うものであって、 少なくとも回収操作を行う工程において、 多価アルコールおよび糖類よりなる群から選ばれてなる少なくとも 1種 の化合物と塩もしくは両性電解質を共存させることを特徴とするもので ある。
まず、 第 1工程で精製分離されたトロンビン生成物を溶解させる溶媒 としては、 トロンビンの生存に良好なように、 浸透圧やイオンの平衡を 調節する目的で N a C 1が調合された塩類溶液、 あるいはさらに K+ 、 C a 2+、 M g2+などのイオンを数種加えた組成のものが調合された塩類 溶液であつて、 さらに p Hを安定に維持するように緩衝系として p H 2 〜 1 0、 好ましくは p H 4〜 8を示す緩衝液から任意に選ばれたものを 加えたものであれば良い。 こうした緩衝液としては、 例えば、 リン酸緩 衝液、 炭酸塩緩衝液、 重炭酸塩緩衝液、 トリス緩衝液、 クェン酸—リン - 酸ナトリウム緩衝液、 コハク酸—水酸化ナトリウム緩衝液、 フタル酸カ リウムー水酸化ナトリウム緩衝液、 イミダゾ一ルー塩酸緩衝液、 ホウ酸 緩衝液、 生理的塩類溶液あるいはグッド （G o o d ) の緩衝液などを挙 げることができる。
また、 アンヒドロトロンビンの合成に使用される多価アルコールおよ び糖類よりなる群から選ばれてなる少なくとも 1種の化合物は、 塩もし くは両性電解質との併用により高 p H領域でのアルカリ処理において、 蛋白の凝集 ·会合を起こさずアンヒドロ化を促進し、 回収操作において、 高 p H領域から中性付近に p Hをもどす際に、 凝集 ·会合を起こさずァ ンヒドロトロンビンを再生する目的で添加するものである。 ただし、 回 収操作にのみ用いても上記アンヒドロトロンビンの合成の目的を達成し 得るものである。
上記多価アルコールおよび糖類よりなる群から選ばれてなる少なくと も 1種の化合物としては、 例えば、 テトリトール （具体的には、 エリト リ ！ ^一ル、 D—スレイ！ ル、 L—スレイ！ ^一ル、 D , L—スレイ！ ル） 、 ペンチトール （具体的には、 リビトール、 D—ァラビ二! ル、 Lーァラビ二！ ル、 D， L—ァラビ二トール、 キシリ 1 ^一ル） 、 へキ シトール （具体的には、 ァリ！ ル、 ダルシトール （ガラクチトール） 、 ソルビトール （D—グルシ卜一ル） 、 L—グルシトール、 D, L—ダル シトール、 D—マンニ! ル、 L—マンニトール、 D, L—マンニ! ^一 ル、 D—アルトリトール、 L一アルトリトール、 D , L—アルトリトー ル、 D Γジ! ル、 L fジ! ^一ル） 、 ヘプチトール、 マルチ! ^一ル、 ラクチ卜一ル、 グリセリン、 エチレングリコール、 ジエチレングリコー ル、 トリエチレングリコール、 プロピレングリコール、 ジプロピレング リコール、 1， 3—ブチレングリコール、 ネオペンチルグリコール、 ぺ ンタメチレングリコ一ル、 へキサメチレングリコール、 ペン夕エリトリ 1 ^一ル、 ジペン夕エリトリ ！ ル、 トリペン夕エリトリ ] ^一ル、 トリメ チロ一ルェタン、 トリメチロールプロパン、 無水ェンネアへプチ! ル、 1， 4—ブタンジオール、 1 , 2 , 4 _ブタントリオ一ルおよび 1， 2 , 6—へキサントリオ一ルなどの多価アルコール （糖アルコールを含む） 、 グリセリンアルデヒドジォキシアセトン、 トレオース、 エリトルロース、 エリトロース、 ァラビノース、 リブロース、 リポース、 キシロース、 キ シルロース、 リキソース、 グルコース、 フルクト一ス、 マンノース、 ィ ド一ス、 ソルボース、 グロ一ス、 タロース、 タガ] ス、 ガラクト一ス、 ァロース、 プシコース、 アルトロースおよびショ糖などの糖類などが挙 げられる。 これらは 1種単独若しくは 2種以上を混合して用いることが できる。 なかでも、 グリセリン、 エチレングリコールおよびショ糖より なる群より選ばれてなる少なくとも 1種の化合物が好ましい。
また、 上記多価アルコールおよび糖類よりなる群から選ばれてなる少 なくとも 1種の化合物は、 気温 2 3 °C、 相対湿度 5 0 %の環境下におい て、 液体である場合は重量比で、 粉体、 粒体または固体である場合は体 積比で、 全体に対する割合が 5 %以上、 好ましくは 1 5 %以上であるこ とが望ましい。 ただし、 全体に対する割合が 5 %未満であっても、 併用 する塩もしくは両性電解質の濃度を相対的に高めることにより、 第 2〜 第 3工程を行うことは可能であり、 所望の効果を有効に発現できる。 よ つて、 上記多価アルコールおよび糖類よりなる群から選ばれてなる少な くとも 1種の化合物の全体に対する割合 （濃度） は、 その種類に応じて、 所望の効果を有効に発現できるように適当な濃度を適宜決定することが 望ましく、 力 る決定に際しては併用する塩もしくは両性電解質の種類 や濃度を考慮する必要がある。
上記ァンヒドロトロンビンの合成に使用される塩もしくは両性電解質 は、 上記多価アルコールおよび糖類よりなる群から選ばれてなる少なく - とも 1種の化合物との併用により高 p H領域でのアル力リ処理において、 蛋白の凝集 ·会合を起こさずアンヒドロ化を促進し、 回収操作において、 高 p H領域から中性付近に p Hをもどす際に、 凝集 ·会合を起こさずァ ンヒドロトロンビンを再生する目的で添加されるものであって、 かかる 目的を得るに適した塩濃度 （イオン強度） 、 誘電率が得られるならば特 に制限されるものではなく、 有機、 無機は限定されるものではない。 よって、 上記塩もしくは両性電解質としては、 例えば、 塩化ナ卜リウ ム、 塩化カリウム等のハロゲン化アルカリ金属、 塩化マグネシウム、 塩 化カルシウム等のハロゲン化アルカリ土類金属、 塩化アンモニゥム、 硫 酸アンモニゥム、 炭酸ナトリウム、 炭酸カリウム、 炭酸マグネシウム、 炭酸アンモニゥム、 炭酸カルシウム、 炭酸水素ナトリウム、 炭酸水素力 ルシゥム、 炭酸水素カリウム、 炭酸水素アンモニゥム、 リン酸ナトリウ ム、 リン酸水素ニナトリウム、 リン酸二水素カリウム、 リン酸水素ニァ ンモニゥム、 ホウ酸ナトリウム、 ホウ酸カリウムなどの無機酸塩、 クェ ン酸ナトリウム、 クェン酸カリウム、 クェン酸マグネシウム、 クェン酸 カルシウム、 クェン酸アンモニゥム、 フタル酸ナトリウム、 フタル酸カ リウム、 フタル酸マグネシウム、 フタル酸カルシウム、 フ夕ル酸アンモ 二ゥム、 コハク酸ナトリウム、 コハク酸カリウム、 コハク酸マグネシゥ ム、 コハク酸カルシウム、 コハク酸アンモニゥム、 酢酸ナトリウム、 酢 酸カリウム、 酢酸カルシウム、 酢酸マグネシウム、 酢酸アンモニゥム等 の有機酸塩、 グリシン、 ァラニン等の両性電解質となるアミノ酸などの 水に可溶な塩もしくは両性電解質が挙げられる。 これらは 1種単独若し くは 2種以上を混合して用いることができる。 なかでも、 水に昜溶で、 併存する上記多価アルコールおよび糖類よりなる群から選ばれてなる少 なくとも 1種の化合物の濃度に応じて最適なイオン強度 （塩濃度） 、 誘 電率に容易に調整でき、 さらに精製分離工程 （例えば透析など） が容易 (ないし簡略化できるもの） である低分子のアル力リ金属塩や無機塩類、 両性電解質などが望ましく、 具体的には、 塩化ナトリウム、 塩化力リウ ムおよびグリシンよりなる群から選ばれてなる少なくとも 1種の化合物 が望ましいといえる。
また、 上記塩もしくは両性電解質の濃度は、 0 . 2 M以上、 好ましく は 0 . 5 M以上とすることが望ましい。 ただし、 当該濃度が 0 . 2 M未 満であっても、 上述した多価アルコールおよび糖類よりなる群から選ば れてなる少なくとも 1種の化合物の場合と同様に当該化合物の全体に対 する割合を相対的に高めることにより、 第 2〜第 3工程を行うことは可 能であり、 所望の効果を有効に発現できる。
第 2工程において、 アルカリで処理してアンヒドロ化するには、 反応 系の p Hが 1 1以上となるように、 アルカリを添加して調整し （さらに、 必要に応じて、 上述した多価アルコールおよび糖類よりなる群から選ば れてなる少なくとも 1種の化合物と塩もしくは両性電解質の共存下で） 、 反応温度一 3 0〜5 0 °C、 好ましくは 4〜4 0 °Cの範囲を保持する。 上 記 p Hが 1 1未満の場合には、 脱 P M S F反応が起こらずアンヒドロ化 が進行せず好ましくない。 上記アルカリとしては、 例えば、 水酸化ナト リウム、 水酸化カリウムなどの 1価の塩基、 水酸化カルシウム、 水酸化 バリウム、 酸化カルシウム、 酸化マグネシウム、 炭酸カルシウム、 炭酸 ナトリゥムなどの 2価の塩基、 水酸化鉄などの 3価の塩基などを挙げる ことができる。 上記反応温度が一 3 0 °C未満の場合には、 反応系が凍結 する可能性があり好ましくなく、 一方、 5 0でを超える場合には、 トロ ンビンが蛋白変性を受け、 その後の再生操作によっても元の状態に戻ら なくなるなど好ましくない。
次に、 第 3工程において、 上記アルカリ処理により合成されたアンヒ ドロトロンビンを含む溶液は、 その後 （アンヒドロ化反応後） 、 上述し ' た多価アルコールおよび糖類よりなる群から選ばれてなる少なくとも 1 種の化合物と塩もしくは両性電解質の共存下で再生操作により元の状態 (立体構造状態） に戻される。 該再生操作としては、 特に制限されるも のでなく、 従来公知の方法を利用することができ、 例えば、 反応後の系 (溶液） の p Hを 4〜 1 0の範囲に溶媒 （上記アンヒドロ化反応で用い たと同種の溶媒などが使用できる） にて調整し、 一 3 0〜5 0 °Cの温度 範囲で一定時間保持する方法、 透析により p Hを 4〜 1 0の範囲に調整 する方法などをとることができる。
次に、 再生されたアンヒドロトロンビンは、 共存させた多価アルコ一 ルおよび糖類よりなる群から選ばれてなる少なくとも 1種の化合物、 さ らに除去する必要のある塩あるいは両性電解質 （N a C lやリン酸塩類 等の塩あるいは両性電解質の 1種が、 最終的なアンヒドロトロンビンの 抽出操作に用いる溶出液に含まれていてもよいような場合には、 あえて 分離除去する必要のないこともある） を除去することを目的とした精製 分離を行う。 かかる精製分離方法としては、 特に制限されるものでなく、 従来公知の方法を利用することができ、 例えば、 透析、 限外濾過、 ゲル クロマトグラフィー、 イオン交換クロマトグラフィー、 ァフィ二テイク 口マトグラフィ一などを利用することができる。 代表的な透析操作では、 再生したアンヒドロトロンビン溶液から多価アルコールおよび糖類より なる群から選ばれてなる少なくとも 1種の化合物をセルロースなどの膜 を介して p H 4〜l 0の溶媒 （上記アンヒドロ化反応や再生操作に用い たと同種の溶媒などが使用できる） に透過させる。
次いで、 不純物を除去することを目的として精製分離を行い、 所望の アンヒドロトロンビンを得る。 かかる精製分離方法としては、 特に制限 されるものでなく、 従来公知の精製分離方法を利用することができ、 例 えば、 図 1に概略したように、 多価アルコールおよび糖類よりなる群か ら選ばれてなる少なくとも 1種の化合物を除いたアンヒドロトロンビン 溶液を、 YM 1 0メンブランなどを用いて濃縮し、 次に、 p H 4〜1 0 の溶媒 （上記アンヒドロ化反応や再生操作に用いたと同種の溶媒などが 使用できる） で平衡化したべンザミジンセファロ一スカラム等に通液し て洗浄し、 さらに p H 4〜 l 0に調整されたべンザミジン溶液 （当該溶 液には、 目的蛋白を特異的吸着させる目的で塩化ナトリウム、 塩化カリ ゥム、 塩化カルシウム、 塩化マグネシウムなどの塩類が含まれていても よい） で溶出し、 ベンザミジンを除去する目的で p H 4〜l 0の溶媒 (上記アンヒドロ化反応、 再生操作に用いたと同種の溶媒などが使用で きる） で透析して所望のアンヒドロトロンビン溶液を抽出する方法、 限 外濾過による分離ゃセフアデックスカラムによるゲル濾過等の方法など をとることができる。
アンヒドロトロンビンは、 上記以外の方法で、 例えば、 P M Sに変え て反応工程中で塩酸グァニジン （G d n— H C 1 ) を用いる方法などに よって合成したアンヒドロトロンビンも適当に利用することができる。 また、 本発明は、 リガンドとして基質および Zまたは阻害剤との結合 に立体障害を引き起こさずに求核性 （活性） を失わせたトロンビンまた はトロンビンに類似した物質を有する親和性吸着体である。 基質および
Zまたは阻害剤との結合に立体障害を引き起こさずに求核性 （活性） を 失わせたトロンビンとしては、 上述したアンヒドロトロンビンが好まし い。 また、 基質または阻害剤との結合に立体障害を引き起こさずに求核 性 （活性） を失わせた卜ロンビンとしては、 上述したようなアンヒドロ トロンビンの代わりに、 トロンビンのアミノ酸配列の少なくとも一のァ ミノ酸が遺伝子組換操作により欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸 配列からなり、 かつ基質または阻害剤との結合に立体障害を引き起こさ ずに求核性 （活性） を失わせたトロンビンの変異体であってもよい。 ト ロンビンとトロンビン基質および Zまたは阻害剤との結合部位は完全に は明らかにされていないが、 トロンビンのァニオンバインディングサイ 卜と呼ばれる部位が重要と考えられている。 よって、 このバインディン グサイトを保持したままに立体障害を引き起こさずに求核性 （活性） を 失わせたトロンビンによりトロンビン基質および Zまたは阻害剤の精製 が可能である。 従って、 この様なトロンビンの変異体をリガンドとして 本発明の親和性吸着体に使用することができる。
ここに、 このようなトロンビンの変異体を使用する際には、 トロンビ ンの求核性 （活性） を電荷リレー系により付与していると考えられるァ ミノ酸残基を欠失、 置換若しくは付加することにより、 基質または阻害 剤との結合に立体障害を引き起こさずに求核性 （活性） を失わせたトロ ンビンの変異体が使用される。 例えば、 トロンビン活性部位中のァスパ ラギン酸からァスパラギンへの置換、 またはトロンビン活性部位中の活 性セリンからァラニンへの置換により、 基質または阻害剤との結合に立 体障害を引き起こさずに求核性 （活性） を失わせたトロンビンを得るこ とができる。 更に、 本発明は、 リガンドとして基質および/または阻害剤との結合 に立体障害を引き起こさずに求核性 （活性） を失わせたトロンビンまた はトロンビンに類似した物質を有する親和性吸着体を用いてなるァフィ 二ティークロマトグラフィーを提供するものである。 前記基質および Z または阻害剤との結合に立体障害を引き起こさずに求核性 （活性） を失 わせたトロンビンに類似した物質が、 遺伝子組換え操作によりトロンビ ンの少なくとも 1つのアミノ酸を欠失、 置換または付加したアミノ酸配 列からなるトロンビンの変異体であることが好ましい。 また、 基質およ び Zまたは阻害剤との結合に立体障害を弓 Iき起こさずに求核性 （活性） を失わせたトロンビンが、 アンヒドロトロンビンであることが好ましい。 当該リガンド以外の親和性吸着体の構成要件及び親和性吸着体の製造 方法 （例えば、 担体の選択及びその製法、 スぺ一ザの有無、 リガンド固 定化様式の選択、 リガンドの固定化の方法 （反応） 、 固定化リガンドの 濃度など） に関しては、 従来既知の技術を幅広く適用することができる ものであり、 これらの中から適宜選択して使用すればよい。
本発明の精製方法の適用対象となり得るトロンビン基質および Zまた は阻害剤としては、 血液凝固系に関与する因子を広く含むものとし、 フ イブリノ一ゲン （血液凝固第 I因子） 、 血液凝固第 VIII因子、 血液凝 固第 XIII因子、 血液凝固第 V因子、 血液凝固第 XI因子などの各因子のほ か、 プロテイン C、 プロテイン Sなどの卜ロンビンの基質となるものや、 更にへパリンコファクタ一 IIなどのトロンビンの阻害剤となるもの等が 挙げられる。
上記本発明の精製方法の適用対象となり得る卜ロンビン基質および Z または阻害剤は、 血漿、 血小板、 胎盤などのヒト由来のトロンビン基質 および または阻害剤、 並びに遺伝子組換え操作により得られたトロン ビン基質および Zまたは阻害剤 （さらに、 本発明においては、 遺伝子組 換え操作により、 トロンビン基質および Zまたは阻害剤のアミノ酸配列 の少なくとも一のアミノ酸が欠失、 置換もしくは付加されたアミノ酸配 列からなり、 かつ血液凝固活性および抗トロンビン活性をそれぞれ維持 するその変異体を含むものとする） が挙げられる。 この際、 遺伝子組み 換え技術を用いてトロンビン基質および/または阻害剤を調製する方法 としては、 特に制限されるものではなく、 これらに関する従来既知の遺 伝子組み換え技術を幅広く利用することができるものである。 具体的に 活性化プロテイン Cを調製する場合を例にとれば、 特開昭 6 1 - 2 0 5 4 8 7号、 特開平 1— 2 3 3 8号あるいは特開平 1— 8 5 0 8 4号等に 記載された方法と同様の製造方法により調製される活性化プロテイン C が例示される。 なお、 上記遺伝子組換え技術を用いてプロテイン Cを調 製し、 本発明の精製方法によりプロテイン Cを精製した後、 活性化して 活性化プロテイン Cとしてもよい。 なお、 プロテイン Cから活性化プロ ティン Cへの活性化の方法には特に制約はなく、 例えば、 ヒトゃゥシな どの血液より分離したトロンビンにより活性化する方法、 あるいは等価 なプロテアーゼにより活性化する方法などにより実施することもできる。 さらに、 本発明では、 上記基質または阻害剤との結合に立体障害を引 き起こさずに求核性 （活性） を失わせたトロンビンまたはトロンビンに 類似した物質をリガンドに用いてなるァフィ二ティーク口マトグラフィ 一の工程をトロンビン基質および または阻害剤の精製工程に組み入れ るものであるが、 該トロンビン基質および または阻害剤の精製工程の いずれの段階に組み入れるかは、 所期の目的を達成でき、 さらに最も効 果的で高収率を得ることができる段階がいずれであるのかを予備実験等 を通じて求めるなど、 従来既知の精製方法に応じて適宜決定すればよい。 さらに、 本発明では、 上記基質または阻害剤との結合に立体障害を引 き起こさずに求核性 （活性） を失わせたトロンビンをリガンドに用いて なるァフィ二ティ一クロマトグラフィーの工程を、 夾雑物として含有さ れているトロンビン基質および/または阻害剤の除去工程に組み入れる ことを特徴とするものである。 かかる発明は、 上記精製分離工程の応用 であって、 該ァフィニティ一クロマトグラフィーのリガンドであるアン ヒドロトロンビン等によりトロンビン基質および Zまたは阻害剤を特異 的に吸脱着し得る特性に着目して、 他の精製対象物中に、 むしろ夾雑物 として混入したトロンビン基質および Zまたは阻害剤 （例えば、 フイブ リノ一ゲン等） を該ァフィニティークロマトグラフィーを用いて簡単に 分離 ·除去できるものである。 該ァフィニティ一クロマトグラフィーの リガンドであるアンヒドロトロンビン等およびトロンビン基質おょぴ/ または阻害剤に関する説明に関しては、 上記精製方法で説明したと同様 であり、 ここでは省略する。 図面の簡単な説明
第 1図は、 本発明の一実施態様である実施例 1において最終的に精 製された FXIIIにつき、 電気泳動を行つた結果を表わしているものにつ いて、 図面に代わる写真を示したものである。 発明を実施するための最良の形態
<実施例 1 ；親和性吸着体の製造およびァフィ二ティ一クロマトグラフ ィ一並びに精製方法 >
Cohn Paste III由来ひ一トロンビン 52. lmgを 5mM リン酸緩 衝液/ 0. 1M NaC l/pH6. 5 10mlに溶解した溶液に、 7 %フエニルメタンスルフォニルフルオリド （PMSF) メタノール溶 液 30 1を 30分おきに総活性が 1 %未満にまで加える。 この溶液を 0°Cに冷却し、 1M Na〇Hを0. 05ml添加し、 12分間反応さ せた。 反応後 3 M NaC 1溶液を 5 m 1加え、 さらに 19 gのグリセ リンを加えた。
この溶液を 1M トリス塩酸緩衝液 Z50% グリセリン ZpH7を 用い、 pHを 7. 8に調整し、 4t：、 12時間保持した。 その後、 50 mM トリス塩酸緩衝液 Z1M NaC 1 /pH7. 5に透析し、 さら に 50mM トリス塩酸緩衝液/ 0. 1M NaC 1 /pH7. 5に透 析した。 この溶液を 50 mM トリス塩酸緩衝液 Z0. 1M NaC 1 ZpH7. 5で平衡化したベンザミジンセファロ一スカラムに添加した。 同緩衝液で不純物ピークを完全に洗浄し、 50mM トリス塩酸緩衝液 /0. 1 M Na C 1 /0. 2M ベンザミジン ZpH7. 5により溶 出した。 この溶液を 5 OmM トリス塩酸緩衝液 Z1M Na C 1 / H7. 5により透析しベンザミジンを除去した。 得られたアンヒドロト ロンビン 28 mgを NHS—活性カラム（NHS- Activated Column) (ファ ルマシア社製） に固定化し、 親和性吸着体であるアンヒドロトロンビン セファロ一スを得た。
当該カラムに対し FXIII製剤 （フイビロガミン P、 へキスト社製） を 5 OmM トリス塩酸緩衝液 ZO. 2M NaC 1 /pH7. 5に溶解 し、 同緩衝液で平衡化したカラムに流した。 さらに、 NaC 1のグラジ ェ一シヨン操作により不純物を完全に洗浄し、 5 OmM トリス塩酸緩 衝液 0. 2M N a C 1 /0. 2M ベンザミジン ZpH7. 5によ つて溶出した。 ベンザミジンのピークを始めの 1 5ml回収し FXIII溶 液とした。 80%以上回収され、 電気泳動により分子量 （Mr) 320 000 単一バンドで得られた。 図 2は、 電気泳動を表わしているもの につい、 て図面に代わる写真を示したものである。 ぐ実施例 2 >
ヒト血漿より特開平 1—250326号の開示方法で得られた FXIII 溶液を含む水溶液を 50 mM トリス塩酸緩衝液 0. 1M NaC 1 /pH7. 5に対し透析後、 得られた溶液を同緩衝液で平衡化したアン ヒドロトロンビンカラムに流した （アンヒドロトロンビンカラムは実施 例 1に同じ） 。 さらに、 0. 1〜1M N a C 1のグラジュェ一シヨン 操作によって不純物を完全に洗浄し、 5 OmM トリス塩酸緩衝液 0. 2M NaC 1 /0. 2M ベンザミジン _ pH7. 5によって溶出し た。 回収率は約 80%で、 さらに電気泳動により M r 320000 単 一バンドで得られた。 ぐ実施例 3 >
ヒト血漿よりウィンケルマン L. (Winkelman L. ) 等、 トロンポシ ス アン卜 へモスタシス (Thrombosis and Haemostasis) , 55、 402 (1986) に記載されている方法により得られた FXIII溶液を 5 OmM ト リス塩酸緩衝液 0. 2M NaC 1/ρΗ7. 5に対し透析し、 同緩 衝液で平衡化したアンヒドロトロンビンカラムに流した （アンヒドロト ロンビンカラムは実施例 1に同じ） 。 さらに、 0. 1〜1M NaC l のグラジュエーシヨン操作によって不純物を完全に洗浄し、 5 OmM トリス塩酸緩衝液/ 0. 2M NaC 1/0. 2M ベンザミジンによ つて溶出した。 回収率は約 80%で、 さらに電気泳動により Mr 320 000 単一バンドで得られた。 ぐ実施例 4 >
遺伝子組み換え血液凝固第 VIII因子 （バクス夕一社製、 リコネイ ト (商品名） ） l O O O uを 50mM T r i s -HC 1/0. 2M N a C 1 /0. 1 M C a C 12 , p H 7. 5/1 0mlに溶解し、 実 施例 1で得たアンヒドロトロンビンセファロ一スを充填したカラムに流 した。
カラム容積 4倍の同緩衝液で洗浄し、 50mM Tr i s— HC 1Z 0. 2 M N a C 1 /0. 1M C a C 12 /0. 2M ベンズアミ ジン/ "pH7. 5で溶出した。 合成基質 S— 2222 (第一薬品株式会 社製） で溶出液の血液凝固第 VIII因子の活性を測定したところ、 60 % 以上の活性が確認できた。
<実施例 5 > 人血漿由来血液凝固第 VIII因子 （日本赤十字社製、 クロスエイト M (商品名） ） 1000 uについて、 実施例 4と同様の実験を行ったとこ ろ、 約 60 %の活性が確認できた。
<実施例 6>
クェン酸血漿 1リットルに対し 1 M B aC 12 を 0. 5時間で 80 ml滴下し遠心分離 （4°C、 400 OXg) し沈澱を得た。 この沈澱を 5 OmM リン酸緩衝液， 0. 1M NaC 1 , 5mM ベンズアミジン， p H6. 5で洗浄し、 0. 5リットルのクェン酸生食に溶解した。 再度、 lM B aC l2 を 0. 5時間で 80 m 1滴下し遠心分離 （4°C、 40
00 X g) を行い、 0. 2M EDTA (エチレンジァミン四酢酸） ， ρ Η 7に溶解した。 さらにこの溶液の 40〜70 %硫酸アンモニゥム分画 を 5 OmM トリス- HC 1， 0. 1 M NaC 1 , H7. 5に溶解し、 同緩衝液に透析した後、 デキストラン硫酸ァガロースにて PC分画を回 収した後、 同緩衝液で平衡化した実施例 1で得たアンヒドロトロンビン セファロ一スを充填したカラムに添加した。 0. 1Mから 2M Na C 1までの濃度勾配をかけ溶出した。 その結果、 プロテイン Cは、 約 1M NaC 1程度で溶出されることが確認された。 本法によって、 約 1 2 000倍に比活性が上昇し、 約 60%の回収率で精製された。
<実施例 7 >
クェン酸血漿を実施例 6と同様の条件で透析まで行った試料を実施例 6と同様のアンヒドロトロンビンセファロ一スを充填したカラムに添加 した後、 5 OmM 卜リス - HC 1 Z0. 5M NaC 1/ρΗ7. 5で 洗浄した。 不純物ピークが終わった後、 5 OmM トリス— HC 1Z0. 2M NaC I/O. 1 M ベンズアミジンノ p H 7. 5で溶出した。 本 法によって、 約 1 0 0 0 0倍に比活性が上昇し、 約 6 0 %の回収率で精 製された。 ぐ実施例 8 >
血液凝固第 V因子 (K. Suzuki , B. Dahlback, J. Stenf lo, J. Biol. Chem. , 257, 6556 (1982) の方法により調製したものを用いた。 ） および血液 凝固第 XI因子 (B. N. Bouma, J. H. Griffin, J. Biol. Chem. , 252, 6432 (1 977) の方法により調製したものを用いた。 ） を、 それぞれ、 実施例 1 と同様のアンヒドロトロンビンセファロ一スを充填したカラムに添加し た。 実施例 1と同様の方法によりカラムの洗浄および濃度勾配による溶 出を行い、 血液凝固第 V因子および血液凝固第 XI因子を回収したところ、 比活性がそれぞれ約 1 . 2倍及び約 1 . 1倍上昇し、 回収率はそれぞれ 約 6 5 %及び 7 0 %であった。 産業上の利用可能性
本発明では、 新規かつ安価な分離精製手段として、 トロンビン基質お よびノまたは阻害剤と特異的かつ可逆的に反応するリガンドとして基質 または阻害剤との結合に立体障害を引き起こさずに求核性 （活性） を失 わせたトロンビン、 例えば、 アンヒドロトロンビン等を用いてなるァフ ィニティ一クロマトグラフィーを見出し、 該ァフィニティークロマトグ ラフィ一の工程を設けることにより、 トロンビン基質および阻害剤より なる群から選ばれてなる 1つのトロンビン基質および Ζまたは阻害剤の 精製方法において、 簡単な分離精製操作および短い精製分離工数により、 例えば、 抗プロテイン C抗体等を使用する製法に比して極めて安価で高 収率 （抗プロテイン C抗体による収率が 3 0 %程度と低いのに対し約 2 倍の 6 0 %程度と高収率である） で高純度のトロンビン基質および Ζま たは阻害剤を効率よく、 異種動物蛋白等の不純物の混入の危険性がなく 安全かつ安定的にトロンビン基質および または阻害剤の所望の 1つを 精製することができるものである。
本発明では、 さらに、 トロンビン基質および または阻害剤以外の他 の製剤等の精製物の製造 （特に、 精製分離） 時に、 夾雑物として含有さ れているトロンビン基質および または阻害剤 （2種以上含まれていて もよい） を、 トロンビン基質および Zまたは阻害剤と特異的かつ可逆的 に反応するリガンドとして基質および Zまたは阻害剤との結合に立体障 害を引き起こさずに求核性 （活性） を失わせたトロンビン、 例えば、 ァ ンヒドロトロンビン等を用いてなるァフィ二ティ一クロマトグラフィー による除去操作によって極めて効果的に取り除くことができるため、 こ うした製剤等の精製物の純度を高める手段にも適用することができ、 ΦΪ 広い製剤等の精製分離方法における極めて有効なトロンビン基質および ノまたは阻害剤の除去手段を提供することができる。
具体的には、 本発明の FXIIIの精製方法により、 天然および遺伝子操 作による FXIIIのいずれであっても所期の目的である従来の精製方法に 比べ高純度、 高回収率に精製することができるほか、 ヒトの胎盤由来の FXIIIにおいて問題とされる免疫原となりうる物質やウイルスを効果的 に分離除去することができ、 これらの混入の可能性を著しく軽減するこ とができる。 また、 安全性に優れるヒトの血漿由来の FXIIIにおいても、 回収率および精製度のさらなる向上につながり貴重な血漿の有効利用に つながる。
更に、 本発明では、 リガンドとして基質および阻害剤との結合に立体 障害をおこさずに活性を失わせたトロンビン、 例えば、 アンヒドロトロ ンビン (Anhydro-Thrombin)等を用いてなるァフィ二ティ一クロマト
-を FVIIIの精製工程に組み入れることにより、 異種動物蛋白 等の不純物の混入の危険性がなく、 かつモノク口一ナル抗体等に比して 安価に FVIIIを精製することができる。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . リガンドとして基質および Zまたは阻害剤との結合に立体障害を 引き起こさずに求核性 （活性） を失わせたトロンビンまたはトロンビン に類似した物質を有する親和性吸着体。
2 . 前記基質および Zまたは阻害剤との結合に立体障害を引き起こさず に求核性 （活性） を失わせたトロンビンに類似した物質が、 遺伝子組換 え操作によりトロンビンの少なくとも 1つのアミノ酸を欠失、 置換また は付加したアミノ酸配列からなるトロンビンの変異体であることを特徵 とする請求項 1に記載の親和性吸着体。
3 . 前記基質および/または阻害剤との結合に立体障害を引き起こさず に求核性 （活性） を失わせたトロンビンが、 アンヒドロトロンビンであ ることを特徴とする請求項 1に記載の親和性吸着体。
4. トロンビン基質および または阻害剤の精製または除去に用いる、 請求項 1に記載の親和性吸着体。
5 . 前記トロンビン基質および Zまたは阻害剤が、 血液凝固第 V因子、 血液凝固第 VIII因子、 血液凝固第 XI因子、 血液凝固第 XIII因子、 プロテ イン C、 プロテイン S、 へパリンコフアクター II、 トロンビンレセプ夕 一およびフイブリノ一ゲンからなる群から選ばれる 1種以上のトロンビ ン基質およびノまたは阻害剤であることを特徴とする請求項 4に記載の 親和性吸着体。
6 . リガンドとして基質およびノまたは阻害剤との結合に立体障害を 引き起こさずに求核性 （活性） を失わせたトロンビンまたはトロンビン に類似した物質を有する親和性吸着体を用いてなるァフィ二ティ一クロ マ卜グラフィ一。
7 . 前記基質およびノまたは阻害剤との結合に立体障害を引き起こさ ずに求核性 （活性） を失わせたトロンビンに類似した物質が、 遺伝子組 換え操作によりトロンビンの少なくとも 1つのアミノ酸を欠失、 置換ま たは付加したアミノ酸配列からなるトロンビンの変異体であることを特 徴とする請求項 6に記載のァフィ二ティ一クロマトグラフィー。
8. 前記基質および Zまたは阻害剤との結合に立体障害を引き起こさず に求核性 （活性） を失わせたトロンビンが、 アンヒドロトロンビンであ ることを特徴とする請求項 6に記載のァフィ二ティ一クロマトグラフィ
9 . トロンビン基質およびノまたは阻害剤の精製または除去に用いる、 請求項 6に記載のァフィ二ティ一クロマトグラフィー。
1 0 . 前記トロンビン基質および Zまたは阻害剤が、 血液凝固第 V因子、 血液凝固第 VIII因子、 血液凝固第 XI因子、 血液凝固第 XIII因子、 プロテ イン C、 プロテイン S、 へパリンコファクタ一11、 トロンビンレセプ夕 一およびフィプリノ一ゲンからなる群から選ばれる 1種以上のトロンビ ン基質および Zまたは阻害剤であることを特徴とする請求項 9に記載の ァフィ二ティ一クロマトグラフィー。
1 1 . リガンドとして基質および/または阻害剤との結合に立体障害 を引き起こさずに求核性 （活性） を失わせたトロンビンまたはトロンビ ンに類似した物質を有する親和性吸着体を用いてなるァフィ二ティーク 口マトグラフィ一の工程を有することを特徴とするトロンビン基質およ び Zまたは阻害剤の精製方法。
1 2 . 前記基質および または阻害剤との結合に立体障害を引き起こさ ずに求核性 （活性） を失わせたトロンビンに類似した物質が、 遺伝子組 換え操作によりトロンビンの少なくとも 1つのアミノ酸を欠失、 置換ま たは付加したアミノ酸配列からなるトロンビンの変異体であることを特 徵とする請求項 1 1に記載の精製方法。
1 3 . 前記基質および Zまたは阻害剤との結合に立体障害を引き起こ さずに求核性 （活性） を失わせたトロンビンが、 アンヒドロトロンビン であることを特徴とする請求項 1 1に記載の精製方法。
1 4. 前記トロンビン基質および または阻害剤が、 血液凝固第 V因 子、 血液凝固第 VIII因子、 血液凝固第 XI因子、 血液凝固第 XIII因子、 プ 口ティン C、 プロテイン S、 へパリンコフアクター II、 トロンビンレセ プターおよびフイブリノ一ゲンからなる群から選ばれる 1種以上のトロ ンビン基質および Zまたは阻害剤であることを特徴とする請求項 1 1に 記載の精製方法。
1 5 . リガンドとして基質および または阻害剤との結合に立体障害 を引き起こさずに求核性 （活性） を失わせたトロンビンまたはトロンビ ンに類似した物質を有する親和性吸着体を用いてなるァフィ二ティーク 口マトグラフィ一の工程を有することを特徴とする、 夾雑物として含有 されているトロンビン基質および Zまたは阻害剤の除去方法。
1 6 . 前記基質および Zまたは阻害剤との結合に立体障害を引き起こ さずに求核性 （活性） を失わせたトロンビンに類似した物質が、 遺伝子 組換え操作によりトロンビンの少なくとも 1つのアミノ酸を欠失、 置換 または付加したアミノ酸配列からなるトロンビンの変異体であることを 特徴とする請求項 1 5に記載の除去方法。
1 7 . 前記基質および Zまたは阻害剤との結合に立体障害を引き起こ さずに求核性 （活性） を失わせたトロンビンが、 アンヒドロトロンビン であることを特徴とする請求項 1 5に記載の除去方法。
1 8 . 前記トロンビン基質および Zまたは阻害剤が、 血液凝固第 V因 子、 血液凝固第 VIII因子、 血液凝固第 XI因子、 血液凝固第 XIII因子、 プ 口ティン C、 プロテイン S、 へパリンコファクタ一 II、 トロンビンレセ プ夕一およびフイブリノ一ゲンからなる群から選ばれる 1種以上の卜口 ンビン基質および または阻害剤であることを特徴とする請求項 1 5に 記載の除去方法。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1568709A2 (de) 2004-02-24 2005-08-31 ZLB Behring GmbH Reinigung von Fibrinogen

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006002479A1 (en) * 2004-07-05 2006-01-12 U.S. Filter Wastewater Group, Inc. Hydrophilic membranes
FR2889078B1 (fr) * 2005-07-27 2007-11-02 Aventis Pharma Sa Nouvelle methode de chromatographie d'affinite d'antithrombine iii
CN101511456B (zh) * 2006-07-14 2012-06-13 西门子工业公司 改进的单过硫酸盐膜处理法
ATE546520T1 (de) * 2007-01-04 2012-03-15 Crucell Holland Bv Faktor-xi-reinigung
AU2013315547A1 (en) 2012-09-14 2015-02-26 Evoqua Water Technologies Llc A polymer blend for membranes
WO2017011068A1 (en) 2015-07-14 2017-01-19 Evoqua Water Technologies Llc Aeration device for filtration system
CN110314414B (zh) * 2019-07-23 2021-10-19 宝锐生物科技泰州有限公司 凝血因子xiii的分离纯化方法及其应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5810522A (ja) * 1981-07-13 1983-01-21 Nippon Sekijiyuujishiya 不活化トロンビンゲルによるアンチトロンビン３の精製法
JPS59167519A (ja) * 1983-03-15 1984-09-21 Nippon Sekijiyuujishiya 不活化トロンビンゲルにより血漿タンパク質混合液からフイブリノ−ゲンを除去する方法
JPH1059863A (ja) * 1996-08-19 1998-03-03 Fujimori Kogyo Kk アンチトロンビンｉｉｉの分離精製方法
EP0882789A2 (en) * 1997-06-05 1998-12-09 Fujimori Kogyo Co., Ltd. Method for synthesis of anhydrothrombin

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5688768A (en) * 1991-02-19 1997-11-18 Cor Therapeutics, Inc. Recombinant thrombin receptor and related pharmaceuticals
US5840499A (en) * 1994-03-31 1998-11-24 Trustees Of The University Of Pennsylvania Method and kit for detection of thrombin receptor activation of platelets and other cells
JPH1149800A (ja) * 1997-06-05 1999-02-23 Fujimori Kogyo Kk アンヒドロトロンビンの合成方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5810522A (ja) * 1981-07-13 1983-01-21 Nippon Sekijiyuujishiya 不活化トロンビンゲルによるアンチトロンビン３の精製法
JPS59167519A (ja) * 1983-03-15 1984-09-21 Nippon Sekijiyuujishiya 不活化トロンビンゲルにより血漿タンパク質混合液からフイブリノ−ゲンを除去する方法
JPH1059863A (ja) * 1996-08-19 1998-03-03 Fujimori Kogyo Kk アンチトロンビンｉｉｉの分離精製方法
EP0882789A2 (en) * 1997-06-05 1998-12-09 Fujimori Kogyo Co., Ltd. Method for synthesis of anhydrothrombin

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ASHTON R. W., ET AL.: "PREPARATION AND CHARACTERIZATION OF ANHYDROTHROMBIN.", BIOCHEMISTRY., MAIK NAUKA - INTERPERIODICA, RU, vol. 34., no. 19., 1 January 1995 (1995-01-01), RU, pages 6454 - 6463., XP000938937, ISSN: 0006-2979, DOI: 10.1021/bi00019a027 *
See also references of EP1026172A4 *
TOMONO T., SAWADA E.: "PREPARATION OF ANHYDRO-THROMBIN AND ITS INTERACTION WITH PLASMA ANTITHROMBIN III.", ACTA HAEMATOLOGICA, S. KARGER, BASEL, CH, vol. 49., no. 04., 1 July 1986 (1986-07-01), CH, pages 969 - 979., XP000912136, ISSN: 0001-5792 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1568709A2 (de) 2004-02-24 2005-08-31 ZLB Behring GmbH Reinigung von Fibrinogen
EP2264069A2 (de) 2004-02-24 2010-12-22 CSL Behring GmbH Reinigung von Fibrinogen
EP2267025A2 (de) 2004-02-24 2010-12-29 CSL Behring GmbH Reinigung von Fibrinogen

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