WO1999015691A1 - Procede permettant de diagnostiquer un dysfonctionnement du metabolisme osseux - Google Patents
Procede permettant de diagnostiquer un dysfonctionnement du metabolisme osseux Download PDFInfo
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Definitions
- the present invention relates to a method for diagnosing bone metabolism disorders, particularly osteoporosis and joint diseases.
- the present invention also relates to a monoclonal antibody used for this diagnosis, and a diagnostic kit using this antibody.
- the present invention is useful for a method for diagnosing abnormal bone metabolism, particularly osteoporosis and joint disease, or an analytical reagent for research.
- Bone metabolism depends on the combined activities of osteoblasts, which are responsible for bone formation, and osteoclasts, which are responsible for bone resorption. In healthy adults, bone resorption and bone formation are balanced and bone mass remains constant. Abnormal bone metabolism is thought to be caused by this imbalance.
- Known bone metabolism disorders include osteoporosis, hypercalcemia, bone pageet disease, renal osteodystrophy, rheumatoid arthritis, osteoarthritis, and the like. Osteoporosis is a typical example of these bone metabolic disorders. Osteoporosis is considered to be a pathological condition that causes clinical symptoms such as bone loss and low back pain caused by bone loss.
- osteoporosis There are various causes of bone loss, including aging after growth, bone metastasis of cancer, and diseases such as hyperthyroidism.
- methods for diagnosing osteoporosis include bone X-ray photography (MD method), DPA (Dual photon absorpt i ometry), DEXA (Dual Energy X-ray Absorpt iometry), and CXD (Computed X-ray Dens).
- MD method bone X-ray photography
- DPA Dual photon absorpt i ometry
- DEXA Device Energy X-ray Absorpt iometry
- CXD Computed X-ray Dens
- bone with a physical bone mass measurement device such as There are measurements such as salt content and bone density.
- diagnostic standards for osteoporosis using these diagnostic methods are constantly being revised along with technological innovation.
- r ⁇ CIF significantly improves bone density and strength in animals with various bone metabolic disorders, and that large doses of r ⁇ CIF can be administered to normal animals. Bone density and strength were significantly enhanced in a dose-dependent manner, and it was confirmed that no side effects were expressed in any of organs other than bone tissue, blood chemistry tests, and blood cells. Through these in vivo studies, OCIF was found to be a very tissue-specific cytokine that acts only on bone tissue.
- OCIF is secreted and produced in animal cells as a homodimeric OCIF having a molecular weight of about 120 kDa, and is converted into a monomeric OCIF having a molecular weight of about 60 kDa upon processing of a protease or the like.
- human cell cultures contain humans, as both types of ⁇ ⁇ ⁇ CIF have been confirmed (Tsuda et al .: Biochem. Biophys. Res. Commun. 234, 137-142 (1997)). It is expected that both types of OCIF exist in mammalian body fluids and the like.
- OCIF could be a new bone metabolic marker
- the relationship between the concentration of each type of OCIF or the total concentration of both types in the body fluids of patients with various bone metabolic disorders and the relationship between each type of disease should be examined. Scrutiny is required.
- antibodies that can recognize both types of OCIF equally and antibodies that specifically recognize only homodimers are required.
- no anti-OCIF monoclonal antibody having such characteristics has been obtained so far. Disclosure of the invention
- the present inventors have made an eager search and found that Have affinity (hereinafter dissociation constant 10_ 9 M), found monomer and homodimer type ⁇ _CIF equally recognizing monoclonal antibodies, and monoclonal antibodies specifically recognizing only homodimer type ⁇ _CIF. Furthermore, a highly sensitive enzyme immunoassay kit (sandwich ELISA) was constructed using these antibodies. Using this sandwich ELISA, the OCIF concentration in the serum of young adults and the elderly and in the serum of patients with various diseases including osteoporosis, hyperthyroidism, and cancer was measured. High inverse correlation was found.
- Have affinity hereinafter dissociation constant 10_ 9 M
- the present invention provides a method for diagnosing bone metabolism disorders, particularly osteoporosis and joint destruction due to rheumatism and the like, characterized by measuring the concentration of human osteoclast formation inhibitory factor ( ⁇ CIF), a monoclonal antibody used therefor, It is an object of the present invention to provide an OCIF measurement kit using the same.
- ⁇ CIF human osteoclast formation inhibitory factor
- the present invention relates to a method for diagnosing a bone metabolism disorder by measuring the concentration of an osteoclast formation inhibitory factor (OCIF) in a collected body fluid, and diagnosing a bone metabolism disorder based on the measured concentration.
- OCIF osteoclast formation inhibitory factor
- the diagnosis of the present invention is particularly useful for the diagnosis of osteoporosis and joint diseases.
- Serum, synovial fluid and the like are used as body fluids.
- Osteoporosis is diagnosed primarily by measuring serum OCIF levels.
- Diagnosis of joint disease is mainly made by measuring OCIF concentration in synovial fluid.
- the diagnosis of the present invention is particularly useful for diagnosing osteoporosis. Serum, joint fluid and the like are used as body fluids.
- the present invention also relates to a monoclonal antibody used for these diagnoses.
- Examples of such a monoclonal antibody include a monoclonal antibody that recognizes monomeric and dimeric OCIF equally, and a monoclonal antibody that selectively recognizes only dimer-type ⁇ CIF. More these monoclonal antibodies recognize different Epitopu of OCIF, there are monoclonal antibodies dissociation constant between the antigen has a high affinity for the following 2 X 10- 7 M.
- the present invention relates to an OCIF measurement kit comprising such a monoclonal antibody in its constitution.
- the diagnostic method of the present invention is carried out by collecting body fluids such as blood (serum) and synovial fluid from a subject to be diagnosed and evaluating them with an OCIF measurement kit using the monoclonal antibody.
- body fluids such as blood (serum) and synovial fluid from a subject to be diagnosed and evaluating them with an OCIF measurement kit using the monoclonal antibody.
- the monoclonal antibody of the present invention can be obtained by the following method. That is, human OCIF, which is an immunizing antigen necessary for producing an anti-OCIF monoclonal antibody, was isolated from a culture of human fetal lung fibroblasts and IMR-90 according to the method described in W096 / 26217. Is used. Genetically modified human OCIF can also be used as the immunizing antigen. Recombinant human OCIF can be obtained by incorporating human OCIF cDNA into an expression vector according to a conventional method, expressing the purified product in animal cells such as CH0 cells, BHK cells, Namalwa cells, or insect cells, and purifying it. .
- Monomer and dimer-type ⁇ CIF can be purified by reverse phase chromatography according to the method of Tsuda et al. (Biochem. Biophys. Res. Co., mi. 234, 137-142 (1997)). Also, instead of reversed-phase chromatography, SP Sepharose, sulfated cell opening fine, and Resource S column By combining chromatography, both types of OCIF can be purified respectively. Spleen cells prepared by immunizing mammals with these antigens or lymphocyte cells immunized by the vitro method can be fused with a myeloma cell line (myeloma) to produce a hybridoma.
- myeloma cell line myeloma
- a monoclonal antibody that recognizes monomeric and homodimeric ⁇ CIF equally by evaluating highly purified monomeric OCIF or homodimeric OCIF as antigens in the hybridoma culture, or Hybridomas producing a monoclonal antibody that specifically recognizes only the homodimer-type CIF can be selected and cloned to establish. Further, by culturing the established stable hybridomas, the desired antibody can be obtained.
- the antigen OCIF
- physiological saline or the like is administered intravenously or intraperitoneally.
- Freund's complete adjuvant is administered in combination, and if necessary It is common to administer about 3 to 4 times at intervals of 2 weeks.
- mouse-derived myeloma that fuses with immune cells
- examples of mouse-derived myeloma that fuses with immune cells include, for example, p3 / x63-Ag8, p3-Ul, NS-1, MPC-11, SP-2 / 0-1, FO, P3x63 Ag8.63 and S194. it can.
- human B lymphocytes When producing human antibodies, human B lymphocytes must be immunized in vitro and fused with human myeloma cells or cell lines transformed with Epstein-Barr virus to produce human antibodies. Can be.
- Fusion of the immunized cells with the Mie cell line is performed by a known method, for example, the method of Koehler and Milstein et al. (Koehler et al., Nature, 256, 495-497, 1975).
- an electric pulse method using an electric pulse can also be used.
- Immune lymphocytes and myeloma cell lines are mixed in the usual ratio of cell numbers, and fused by adding polyethylene glycol to a commonly used cell culture medium (without fetal calf serum and FCS). Perform culturing in a HAT selection medium supplemented with FCS, and select fusion cells (hybridomas).
- An antibody that recognizes monomeric and homodimer type OCIF equally and a hybridoma that produces an antibody that specifically recognizes only homodimer type OCIF can be used for detection of normal antibodies such as ELISA, plaque method, octalony method, and agglutination method. The choice can be made using the method used.
- ELISA using purified monomer type and homodimer type OCIF enables the simplest and most accurate assay of the target antibody. In particular, it was difficult to obtain a high-affinity antibody (dissociation constant of 2 ⁇ 10 7 M or less) according to the present invention by ordinary solid-phase ELISA.
- a primary reaction is performed by adding a hybridoma culture solution (50-100) to a 96-Ilumino plate (Nunc) on which an antigen is immobilized, followed by a primary reaction, followed by enzyme labeling.
- a secondary reaction is performed by adding an anti-mouse IgG antibody labeled with oxidase (POD), an enzyme substrate solution (50-100 zl) is added, and after the enzyme reaction, the absorbance of each dinyl is measured.
- POD oxidase
- the hybridoma cultures shown indicate both cases where the hybridomas produce large amounts of antibodies with low antigen affinity and cases where they have low productivity but extremely high antigen affinity. Is present, and it is not easy to determine which one is.
- the solid phase ELISA was improved as follows so that the latter antibody-producing hybridomas having high antigen affinity can be relatively easily identified. That is, human serum or bovine serum is added to each well of a 96-well immunoplate on which the antigen is immobilized, and then a small amount of a hybridoma culture solution is added to each well, and the second- By performing the test in the presence of serum, it is possible to eliminate antibody-producing hybridomas with good productivity but low antigen affinity and to selectively screen antibody-producing hybridomas with high antigen affinity. became.
- an antibody that recognizes both types of ⁇ CIF equally is produced using the monomeric type OCIF and the homodimeric type OCIF as antigens, and an antibody that specifically recognizes only the hybridoma and the homodimeric type OCIF is produced.
- Each hybridoma is selected and cloned by limiting dilution 3 to 5 times to establish a stable antibody-producing strain.
- the hybridomas thus established can be subcultured by a usual culture method, and can be cryopreserved if necessary.
- Hybridomas can be cultured by a conventional method and recovered from the culture solution.
- Antibodies can also be recovered from ascites obtained by transplanting the hybridoma into the abdominal cavity of a mammal.
- the antibody in the culture solution or ascites can be purified by a method usually used for antibody purification, such as a salting method, ion exchange and gel filtration chromatography, and affinity chromatography using protein A or G.
- the obtained antibodies were antibodies that recognized monomeric and homodimeric ⁇ CIF equally, and antibodies that could specifically recognize only homodimeric ⁇ CIF.
- the amount of OCIF (monomer OCIF + homodimer-type OCIF) and It can be used for measurement of homodimer OCIF only.
- radioimmunoassay By labeling these anti-radioactive isotopes and enzymes, radioimmunoassay (RIA) It can be used in a measurement system known as Enzyme Immunoassay (ELISA), and can measure the amount of OCIF (monomer 10 homodimer type 0CIF amount) or the amount of homodimer type OCIF alone.
- OCIF monomer 10 homodimer type 0CIF amount
- OCIF Enzyme Immunoassay
- the presence of an antibody that specifically recognizes the homodimer type OCIF according to the present invention reveals that different types of monomeric ⁇ CIF and homodimer type OCIF have different epitopes, Indicates that it is an antibody that recognizes the epitope that is not present in Homodimer type 1 ⁇ CIF only.
- An antibody that recognizes monomeric CIF and homodimer OCIF equally obtained by the present invention is used as an immobilized antibody, and as a radioactive isotope or an enzyme-labeled secondary antibody, a monomeric OCIF and a homodimer are used with other common epitopes, respectively. If an antibody that recognizes type 1 OCIF equally and an antibody that specifically recognizes only homodimer type 1 OCIF are used, the amount of OCIF and the amount of homodimer type 1 OCIF can be measured, respectively.
- the 01-26 antibody specifically recognizing only the homodimer type ⁇ CIF disclosed in Example 6 (Table 1) below and the labeled antibody are used.
- An 01-19 or 01-4 antibody that recognizes monomeric ⁇ CIF and homodimer ⁇ CIF equally can also be used.
- the kit for measuring human ⁇ CIF of the present invention comprises: (i) one of the primary antibody and the secondary antibody is the 01-19 or 01-26 antibody;
- the kit is constructed based on the combination of reagents in the conventional sandwich method, except that the antibody is the 01-4 antibody. That is, the immunological assay kit of the present invention comprises (1) a primary antibody immobilized on an insoluble carrier, and (2) a labeled secondary antibody.
- the antibody, (3) lysing agent, (4) detergent, and (5) labeling substance are enzymes, they include a substrate for measuring enzyme activity and a reaction terminator.
- the insoluble carrier examples include, for example, polymers such as polystyrene, polyethylene, polypropylene, polyester, polyacrylonitrile, fluororesin, crosslinked dextran, polysaccharide, latex, magnetic fine particles prepared by coating metal with latex, other paper, glass, Examples include metal, agarose, and combinations thereof.
- the shape of the insoluble carrier can be various shapes such as tray shape, spherical shape, fibrous shape, rod shape, disk shape, container shape, cell, test tube, porous filter and the like.
- enzymes, fluorescent substances, luminescent substances, radioactive substances and the like as the labeling substances for the labeled antibodies.
- enzymes include peroxidase, alkaline phosphatase, 1-D-galactosidase, glucose oxidase, malate dehydrogenase, glucose 6-phosphate dehydrogenase, invertase, and the like.
- the forces that can be used are not limited to those illustrated, and any other force that can be used for immunoassay can be used.
- the labeling substance is an enzyme
- a substrate and, if necessary, a color former are used to measure the activity.
- a Peruokishidaze as enzymes, with H 2 ⁇ 2 as a substrate, 2, 2 'as color former - Ajinoji - [3 - E chill benz thiazoline sulfonic acid]
- Anmoniumu salt (ABTS), 5-Aminosarichiru acid , 0-phenylenediamine, 4-aminoantipyrine, 3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzidine, homosevanillic acid, tyramine, etc.
- alkaline phosphatase as enzyme
- 0-nitrophenyl phosphate 4-methylpumbelliferyl phosphate
- fluorescein fluorescein
- the lysing agent may be any of those usually used for immunological measurement, and includes, for example, phosphate buffer, Tris-HCl buffer, acetate buffer and the like. However, those having a pH in the range of 6.0 to 8.0 are shown as preferable examples.
- a detergent generally used for immunological measurement is also used as it is. Examples include saline, phosphate buffer, Tris-HCl buffer, and mixtures thereof. These detergents may further contain a nonionic surfactant such as Triton II-100. Tween 20 or Brij35, and an ionic surfactant such as sodium dodecyl sulfate or CHAPS.
- Figure 1 is, c showing the calibration curve of EL ISA by 01- 19 antibody and 01-4 antibody of Example 7
- FIG. 2, c indicating a calibration curve of the EL I SA by 01-26 antibody and 01- 4 antibody of Example 7
- Figure 3 is, c indicating osteoporosis patients and blood OC IF concentrations of healthy subjects of Example 8
- FIG. 4 shows the relationship between urinary pyridinoline and blood OCIF concentration in Example 8.
- FIG. 5 shows the relationship between urinary deoxypyridinoline and blood OCIF concentration in Example 8.
- FIG. 6 shows the OC IF concentration in the synovial fluid of the patient of Example 9 having joint swelling.
- the OC IF-producing CH0 cells described in WO 96/26217 are seeded on EX-CE11 301 medium (JRH Biosciences) at a concentration of 1 xiO 5 cells / ml, and a cell culture jar (2 liter capacity) is used. )
- EX-CE11 301 medium JRH Biosciences
- CHAPS 3-[(3-cholaraidopropyl) -dimethylaimnonio] -l-propanesulfonate, Sigma
- the solution was filtered through a filter (Millidisk, Millipore).
- the culture solution is loaded on a SP Sepharose HP column (2.6xl0cm, Pharmacia) pre-equilibrated with 50 mM pristine-HCl buffer containing 0.1% CHAPS, pH 6.0, and washed with the same buffer. Flow rate 4 ml Elution was performed with a linear gradient in which the NaCl concentration was 1 M in Z and 100 minutes, and fractionation was performed in 8 ml increments. According to the method described in W096 / 26217, the OC IF activity of each fraction was measured to obtain a CIF fraction.
- the OC IF fraction was diluted 10-fold with 50 mM Bistris-HCl buffer containing 0.1% CHAPS, pH 6.0, and then preliminarily equilibrated with 50 mM Bistris-HCl buffer, pH 6.0. xl0cm, Seikagaku Corporation).
- the column was washed with 50 mM pistris-HCl buffer, pH 6.0, containing 0.1% CHAPS, and eluted with a linear gradient of 4 M / min for 100 min at a NaCl concentration of 1.5 M.
- One shot The OC IF activity of each fraction was measured in the same manner as described above.
- fraction 1 a part of each fraction was subjected to SDS-PAGE under non-reducing conditions, and fractions having OC IF activity and having a molecular weight of about 60 kDa were collected and designated as fraction 1. It also has OC IF activity, and under non-reducing conditions
- Fractions showing a molecular weight of about 120 kDa by SDS-PAGE were collected and designated as fraction 2.
- Fractions 1 and 2 were each diluted 10-fold with 50 mM Tris-HCl buffer containing 0.1% CHAPS, pH 7.0.
- Each of the two fractions obtained by dilution was loaded onto a Resource S column (0.64 x 3 cm, Pharmacia) pre-equilibrated with 50 mM Tris-HCl buffer containing 0.1% CHAPS, pH 7.0, and then subjected to 0.01% polysorbate.
- IF was dissolved in physiological saline so as to be 100 zg / ml.
- An equal volume of Freund's complete adjuvant was added to a mixture containing equal amounts of both types of OC IF prepared in this way, and the mixture was emulsified well.
- one Balb / c mouse intraperitoneally at 200 z 1 week The mice were immunized three times at intervals.
- the cells were fused according to Milstein, Nature, 256. 495 (1975)). After the completion of the fusion, the cell suspension was cultured in a HAT medium containing hypoxanthine, aminobuterin and thymidine for 10 days. After myeloma cells were killed and hybridomas appeared, the medium was replaced with HT medium from which aminobuterin was removed from HAT medium, and culturing was continued.
- the plate was added to each plate of a Munno plate (Nunc), and allowed to stand at 4 ° C for immobilization of each antigen. Discard the antigen solution in each well and add 0.1% polysorbate 20 in phosphate After washing with buffered saline (PBS-P), 40/1 fetal calf serum (Hyclone) was added to each well. Next, 10 ⁇ 1 of the hybridoma culture supernatant was added to each well, and reacted at room temperature under 80% serum concentration for 2 hours.
- PBS-P buffered saline
- Hyclone fetal calf serum
- Antibodies that exhibit particularly high absorbance and also recognize monomeric and homodimeric OCIF equally or antibody-producing hybridomas that specifically recognize only homodimeric OCIF without recognizing monomeric OCIF are selected.
- Stable antibody-producing hybridomas were established by repeating cloning 3 to 5 times from the doma by limiting dilution. From the obtained antibody-producing strains, a hybridoma strain having higher productivity of the target antibody was selected.
- hybridomas 01-19 and 01-4 that produce the 01-19 antibody or the 01-4 antibody that recognize monomeric ⁇ C IF and homodimeric ⁇ C IF equally are obtained.
- a hybridoma 01-26 that produces a 01-26 antibody that specifically recognizes only the homodimer type II CIF was obtained. These were deposited at the National Institute of Bioscience and Biotechnology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology.Accession number FERM BP-6419 for 01-4, accession number FERM BP-6420 for 01-19, accession number FERM BP-6421 for 01-26. Are respectively given.
- Example 3 Production and purification of monoclonal antibodies
- Each Hypridoma per animal was implanted intraperitoneally into Balb / c mice previously administered with pristane (Aldrich Chemical) with lxlO 6 cells. Two weeks later, the accumulated ascites was collected to obtain ascites containing the monoclonal antibody of the present invention.
- the dissociation constant of the monoclonal antibody was measured according to the method of Betrand Friguet et al. Uouriml of Immunological Methods, 77, 305-319, 1986). That is, the purified antibody obtained in Example 4 was mixed with 5% ng / ml of 40% Block Ace (Snow Brand Milk Products) and 0.1% polys orbate 20 in 0.2M Tris-HCl pH 7.4 (primary buffer buffer). ), And the purified monomeric or homodimer type 1 recombinant CIF (r0CIF) described in Example 1 diluted with a primary buffer to a concentration of 6.25 ng / ml to 10 g / ml.
- the OCIF was mixed with an equal volume, and allowed to stand at 4 for 15 hours to bind the OCIF to the monoclonal antibody. Fifteen hours later, antibodies unbound to ⁇ CIF are measured by a solid phase E USA on which solid-phase r ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ CIF (10 zg / niK 100 1 / well) of monomeric or dimeric form is immobilized. The dissociation constants for the antibody monomer type 1 and homodimer type 1 ⁇ CIF were calculated.
- the class and subclass of the monoclonal antibody of the present invention were assayed using an immunoglobulin class and subclass analysis kit (Amersham). The test is This was performed according to the protocol specified in the kit. Table 1 shows the results obtained in Examples 5 and 6.
- antibodies 01-4 and 01-19 are antibodies that recognize monomeric and homodimeric OCIF almost equally, and antibody 01-26 is an antibody that specifically recognizes only homodimeric OCIF. It was confirmed that there was. In addition, all antibodies belonged to Igd, and it was revealed that the dissociation constant for monomeric or homodimeric ⁇ CIF was 2 ⁇ 10 17 M or less, and was an extremely high affinity antibody.
- a sandwich ELISA was constructed using the three types of antibodies 01-4, 01-26 and 01-19 obtained by the above method as a solid phase antibody and a labeled antibody, respectively.
- Antibody labeling was performed using maleimide-activated peroxidase kit (Pierce).
- FIG. 1 shows the results when an antibody that recognizes monomeric and homodimer OCIF almost equally as the primary antibody, and an antibody that specifically recognizes only homodimer type ⁇ CIF.
- Figure 2 shows the results when using -26.
- an antibody that recognizes monomer type 1 and homodimer type 1 ⁇ CIF almost equally, a solid phase antibody 01-19, an antibody that recognizes both types of ⁇ CIF equally.
- the measurement sensitivity of the sandwich ELISA using -4 as the POD-labeled antibody was about 25 pg / ml, indicating that it was possible to measure an extremely small amount of OCIF.
- FIG. 1 shows the results when an antibody that recognizes monomeric and homodimer OCIF almost equally as the primary antibody, and an antibody that specifically recognizes only homodimer type ⁇ CIF.
- Figure 2 shows the results when using -26.
- an antibody that recognizes monomer type 1 and homodimer type 1 ⁇ CIF almost equally
- Example 7 0 CIF concentration in serum of healthy individuals and patients with osteoporosis (based on diagnostic criteria of the Japanese Society for Bone Metabolism), and a partial improvement of the OCIS ELISA system (monomer type 0 CIF + homodimer type 0 CIF) described in Example 7 And measured. That is, in order to measure the ⁇ CIF concentration (monomer type 0C IF + homodimer type 0CIF), the antibody 01-19 that recognizes both types of ⁇ CIF equally was immobilized on a 96-well plate in the same manner as in Example 7.
- a primary buffer (0.2 M Tris-HCl, pH 7.4 containing 40% block ace and 0.1% polysorbate 20) containing purified mouse IgG (Capel) at 20 ⁇ g / ml was added to each bottle. 1 and then each human serum diluted 4-fold with the primary buffer were added and left at room temperature for 2 hours. After washing 6 times with phosphate-buffered saline (PBS-P) containing 0.1% polysorbate 20, the POD-labeled antibody 01-4 that recognizes both types of OCIF is purified.
- PBS-P phosphate-buffered saline
- FIG. 3 shows the test results of serum concentrations of OCIF (monomer type 0CIF + homodimer type-1 CIF) in osteoporosis patients and healthy subjects.
- the significance test of the results shown in FIGS. 3 to 5 was performed by Student's non-paired t test.
- serum OCIF monomer type 0 CIF + homodimer type OCiF
- serum OCIF levels in osteoporosis patients were significantly higher than those in healthy individuals. Therefore, by measuring serum OCIF concentration, the pathological condition of osteoporosis patients can be ascertained, and it became clear that OCIF could be a new way of determining bone metabolism to determine osteoporosis.
- Fig. 4 shows the relationship between serum OCIF (monomer type 0CIF + homodimer type 0 CIF) concentration and urinary pyridinoline concentration in healthy subjects and osteoporosis patients
- Fig. 5 shows the relationship between urinary deoxypyridinoline concentration.
- the pyridinoline concentration of 42 pmol / zmol Cr (the amount of pyridinoline praol per mol of creatinine)
- the deoxypyridinoline concentration of 6.2 pmol / ⁇ mol are the upper limits of the normal values for Japanese.
- the serum 0 CIF concentration of patients showing high pyridinoline and deoxypyridinoline concentrations was significantly higher.
- Pyridinoline and deoxypyridinoline are cross-linking molecules of collagen that are formed in the bone matrix after collagen is incorporated into the bone matrix and released by bone destruction during bone resorption. These molecules are said to have high specificity as bone resorption markers, and are widely used for evaluation of clinical specimens. The correlation between ⁇ C IF concentration and these two markers was confirmed, indicating that serum ⁇ C IF concentration is useful as a bone metabolism marker.
- Synovial fluid was collected after obtaining informed consent from 6 patients with gout and gout attack (G).
- the OCIF concentration in these synovial fluids was measured by partially modifying the OCIF ELISA system described in Example 8 (monomer type 0CIF + homodimer type 0CIF). did. That is, the synovial fluid was diluted 16-fold with the primary buffer, and 50 ⁇ l thereof was added to each gel of a 96 ⁇ l immunoplate on which antibodies 01-19 were immobilized. All operations except this operation were performed in the same manner as in Example 8.
- FIG. 6 shows the test results of the ⁇ C IF (monomer type 0 CIF + homodimer type 0 C IF) concentration in the synovial fluid of a patient with joint swelling.
- the Kruskal-Wallis Test and Mann-Whitney Test were used for statistical analysis of the data shown in Fig. 6.
- the lowest OCIF concentration in synovial fluid in the six OA patients was 4.79 ng / ml, whereas the OCIF concentration in synovial fluid showed a low value of 4.0 ng / ml or less. 15 out of 43 RA patients were diagnosed.
- OCIF may not suppress osteoclast formation and activity in the joints of some RA patients whose OCIF concentration in the synovial fluid was low.
- 0CIF-ELISA was shown to be useful for the diagnosis of rheumatoid arthritis (RA), osteoarthritis (0A), trauma (Tr), and gout attacks (G).
- RA rheumatoid arthritis
- the CIF concentration was 23.6 ng / ml, which was high (the median ⁇ CIF concentration in the synovial fluid of the 43 RA patients shown in Example 9 was about 6 ng / ml).
- the CRP of the plasma at this time was 5.4 mg / dl, which clearly showed an inflammatory response. CRP did not become completely negative and remained around 3 mg / dl until 1997. Knee Xp was confirmed from 1983 to 1997, but mainly due to changes in osteoarthritis (OA), and no bone erosion was observed in the finger joints and wrist joints.
- OA osteoarthritis
- Substrate solution here, TMB solution
- reaction stop solution TMB stop reagent
- Substrate solution here, TMB solution
- TMB stop reagent for measuring labeled enzyme activity 10 ml each Measurement method (Kit 1 and Kit 2)
- the diagnosis of bone metabolism disorders can be easily performed by measuring the concentration of human osteoclast formation inhibitory factor (0C IF) in collected body fluids (blood, synovial fluid, etc.). And accurately.
- C IF human osteoclast formation inhibitory factor
- the monoclonal antibody and a kit for measuring CIF using the monoclonal antibody are used. Therefore, diagnosis of abnormal bone metabolism, particularly osteoporosis and joint disease, can be easily performed as described above. And can be performed accurately.
- INDUSTRIAL APPLICABILITY The present invention is useful for a method for diagnosing abnormal bone metabolism, particularly osteoporosis and joint disease, or an analytical reagent for research. Reference to microorganisms
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Description
明 細 書 骨代謝異常症の診断方法 技術分野
本発明は、 骨代謝異常症、 特に骨粗鬆症及び関節疾患の診断方法に関する。 また、 本発明はこの診断に用いるモノクローナル抗体、 及びこの抗体を用いた 診断用キッ トに関する。
本発明は骨代謝異常症、 特に骨粗鬆症及び関節疾患の診断方法、 あるいは研究 用分析試薬などに有用である。 背景技術
骨代謝は、 骨形成を担当する骨芽細胞と骨吸収を担当する破骨細胞の、 総合さ れた活性に依存している。 健常成人では骨吸収と骨形成の均衡が保たれ、 骨量は 一定に維持される。 骨代謝異常は、 この均衡が崩れることにより発生すると考え られている。 骨代謝異常症として、 骨粗鬆症、 高カルシウム血症、 骨ページエツ ト病、 腎性骨異栄養症、 慢性関節リウマチ及び変形性関節症等が知られている。 これらの骨代謝異常症の代表として骨粗鬆症が挙げられる。 骨粗鬆症は骨量の減 少とそれが原因となって起こる骨折や腰背痛等の臨床症状を呈する病態と考えら れている。 骨量減少は、 成長期以降の加齢や癌の骨転移及び甲状腺機能亢進等の 疾病に伴って生じるなど、 その原因は様々である。 現在行われている骨粗鬆症の 診断方法としては、 骨の X線撮影 （MD法） 、 D P A (Dual photon absorpt i omet ry) 、 D E X A (Dual Energy X-ray Absorpt iometry) 、 C X D (Computed X- ray Dens i tometry) 及び低周波超音波等による物理学的骨量測定装置による、 骨
塩量、 骨密度等の測定がある。 現在これらの診断方法を用いた骨粗鬆症の診断基 準は、 技術革新に伴い常に改定が進められている。
確かに骨塩量、 骨密度の低下は将来の骨折の危険性を予測させる。 しかしなが ら、 骨塩量、 骨密度の低下が起こり得る全ての骨折の危険因子ではなく、 多くは 加齢に伴う現象、 例えばコラーゲン線維の弾性低下、 骨構造の質的劣化、 筋力低 下等によっても骨折の危険性は増大すると考えられている。 現時点では筋力低下 以外のこれらの因子を非侵襲的に計測できず、 将来解決すべき重要な課題となつ ている。 さらに骨塩量、 骨密度の低下は骨代謝の破綻の結果を観察しているに過 ぎず、 その原因又は今後の病態の動向を示すものではないと言われている。 この ような骨密度測定の欠点を補うものとして、 骨代謝調節因子 （副甲状腺ホルモン
(PTH) 、 活性型ビタミン D 3 、 及びカルシトニンなど） 、 又骨代謝回転に伴って 骨組織から遊離してくる種々の因子 （骨型アル力リフォスファターゼ、 酸性フォ スファタ一ゼ、 ピリジノリン、 デォキシピリジノリン、 タイプ 1プロコラーゲン ペプチド、 ォステオカルシンなど） の血中濃度あるいは尿中排泄量を測定するこ とで病態を把握しょうとする試みがなされている。 これらの因子は測定時点での 骨代謝動態を示すものであり、 骨量減少の有無及びその程度を早期から予測でき ると期待されている。 しかしこのような骨代謝マーカーにも、 局所的な骨代謝の 変動を表さなかったり、 食事等の影響や日内変動が大きかったり、 上記諸因子が 必ずしも骨代謝を反映して特異的に動いている訳ではないこと等の種々の問題が 残されている。 このような現状から、 これらの問題の解決に止まらず、 鋭敏かつ 特異性の高い新しい骨代謝マーカーとその測定法の開発が骨粗鬆症を始めとする 様々な骨代謝疾患の的確な診断法や予防 ·治療法の確立のために求められている。 本発明者らは、 ヒト胎児肺線維芽細胞 90 (ATCC CCL186)の培養液中に破骨 細胞形成抑制因子 (osteoclastogenesi s inhibi tory factor, 0C IF) が存在する
ことを発見し、 その単離に成功した。 更に、 この蛋白質をコードする cDNAのクロ 一二ングにも成功し、 遺伝子組み換え〇C I F (rOCIF) を用いた in vi tro及び in vivo 薬効評価を通して、 骨代謝改善薬としてその有用性を確認した（W0 96/262 17号公報） 。 引き続き、 本発明者らは、 r〇C I Fの投与は各種の骨代謝異常疾 患動物において、 骨密度及び骨強度を顕著に改善すること、 又、 正常動物への r 〇C I Fの大量投与においても、 用量依存的に骨密度及び強度を顕著に増強し、 骨組織以外の各種臓器、 血液生化学検査、 血球系細胞のいずれにおいても全く副 作用を発現しないことを確認した。 これらの vivo試験を通して、 O C I Fは 骨組織にのみ作用する極めて組織特異性の高いサイ トカインであることが判明し た。 更に、 本発明者らは、 動物細胞において O C I Fは分子量約 120 kDa のホモ ダイマー型 O C I Fとして分泌生産され、 プロテアーゼ等のプロセッシングを受 けて分子量約 60kDaのモノマー型 O C I Fになることを確認した。 さらに、 ヒト 細胞培養液にはこの両タイプの〇 C I Fの存在が確認されているように （Tsuda et al.： Biochem. Biophys. Res. Commun. 234， 137-142 (1997)) 、 ヒトを含む 哺乳動物体液などには、 この両タイプの O C I Fの存在が予想される。 従って、 O C I Fが新しい骨代謝マ一カーとなりうるかどうかを明らかにするためには、 各種骨代謝異常疾患患者の体液中のそれぞれのタイプの O C I Fの濃度あるいは 両タイプの総濃度と各疾患の関係を精査することが必要である。 そのためには、 両タイプの O C I Fを等しく認識できる抗体ならびにホモダイマーだけを特異的 に認識する抗体が必要である。 しかしながら、 これまでこのような特徵を有する 抗 O C I Fモノクローナル抗体は得られていない。 発明の開示
本発明者らは、 このような状況に鑑み鋭意探索の結果、 O C I Fに極めて高い
親和性 （解離定数が 10_9M以下） を有し、 モノマー及びホモダイマー型〇C I F を等しく認識するモノクローナル抗体、 及びホモダイマー型〇C I Fのみを特異 的に認識するモノクローナル抗体を見出した。 さらに、 これらの抗体を用いて高 感度の酵素免疫測定キッ ト （サンドイッチ E L I S A) を構築した。 このサンド イッチ E L I S Aを用いて若年成人や高齢者の血清、 及び骨粗鬆症、 甲状腺機能 亢進症、 癌を含む各種疾患患者の血清中の O C I F濃度を測定した結果、 血清〇 C I F濃度と骨密度の間に高い逆相関が見出された。 また慢性関節リウマチ、 変 形性関節症、 外傷、 痛風発作といった各種関節疾患患者の関節液中の O C I F濃 度を測定した結果、 関節破壊のより進んだ患者の関節液中の O C I F濃度が低い ことが見出された。 以上の結果より、 このサンドィツチ E L I S Aは血清〇C I F濃度を測定することにより骨密度の動態を、 また関節液中の〇C I F濃度を測 定することにより関節破壊の進行を、 それぞれ的確に把握でき、 O C I Fは骨量 の減少と関節破壊を早期に予測できる新しレ、骨代謝異常症診断マ一力一として有 用であることを見出した。 従って本発明は、 ヒト破骨細胞形成抑制因子 （〇C I F ) 濃度を測定することを特徴とする骨代謝異常症、 特に骨粗鬆症及びリウマチ 等による関節破壊の診断方法、 これに用いるモノクローナル抗体、 及び抗体を用 いた O C I F測定用キットを提供することを課題とする。
本発明は、 採取した体液中の破骨細胞形成抑制因子 （O C I F ) の濃度を測定 し、 その濃度によつて骨代謝異常を診断することによりなる骨代謝異常症の診断 方法に関する。
本発明の診断は、 特に骨粗鬆症、 関節疾患の診断に有用である。 体液としては 、 血清、 関節液等が用いられる。 骨粗鬆症の診断は、 主に血清 O C I F濃度を測 定することにより行う。 関節疾患の診断は、 主に関節液中の O C I F濃度 測定 することにより行う。
本発明の診断は、 特に骨粗鬆症の診断に有用である。 体液としては、 血清、 関 節液等が用いられる。
また本発明は、 これらの診断に用いられるモノクロ一ナル抗体に関する。
このようなモノ クローナル抗体としては、 モノマー型及びダイマー型の O C I Fを等しく認識するモノクローナル抗体、 ダイマ一型の〇C I Fのみを選択的に 認識するモノクロ一ナル抗体等がある。 さらにこれらのモノクローナル抗体には、 O C I Fの異なるェピトープを認識し、 抗原との解離定数が 2 X 10— 7M以下の高 親和性を有するモノ クローナル抗体がある。
さらに本発明は、 これらのモノクロ一ナル抗体を構成に含む O C I F測定用キ ッ トに関する。
本発明における診断方法は、 診断対象者から血液 （血清） 、 関節液等の体液を 採取し、 これを前記モノクローナル抗体を用いた O C I F測定用キッ 卜で評価す ることにより行なう。
本発明のモノクローナル抗体は、 以下の方法により得ることができる。 即ち、 抗 O C I Fモノクローナル抗体の作製に必要な免疫用抗原であるヒト O C I Fと しては、 W096/26217号公報記載の方法に従って、 ヒト胎児肺繊維芽細胞、 IMR - 90の培養液から単離されたものが用いられる。 又、 免疫用抗原として、 遺伝子組 み換えヒト O C I Fを用いることもできる。 遺伝子組み換えヒト O C I Fは、 ヒ ト O C I F c D NAを常法に従って発現ベクターに組み込み、 CH0 細胞、 BHK細 胞、 Namalwa細胞等の動物細胞あるいは昆虫細胞などで発現させ、 精製すること により得ることができる。 モノマー及びダイマー型〇C I Fは、 Tsuda らの方法 (Biochem. Biophys. Res. Co画 mi. 234, 137-142 (1997)) に従い、 逆相クロマ トグラフィ一によりそれぞれ精製することができる。 又、 逆相クロマト ラフィ —の代わりに、 SPセファロ一ス、 硫酸化セル口ファイン、 及びリ ソース Sカラム
クロマトグラフィーを組み合わせることにより、 両タイプの O C I Fをそれぞれ 精製することができる。 これらの抗原により哺乳動物を免疫し調製した脾臓細胞 力、、 あるいは vi tro 法により免疫したリンパ球細胞を、 骨髄腫細胞株 （ミエ ローマ） などと融合させハイプリ ドーマを作製することができる、 このハイプリ ドーマ培養液について、 高度に精製されたモノマ一型 O C I Fあるいはホモダイ マ一型 O C I Fをそれぞれ抗原として用い評価することによって、 モノマ一型及 びホモダイマー型〇C I Fを等しく認識するモノクロ一ナル抗体、 あるいはホモ ダイマー型〇C I Fのみを特異的に認識するモノ クローナル抗体を生産するハイ ブリ ド一マを選択、 クロ一ニングして樹立することができる。 また、 樹立した安 定なハイプリ ドーマをそれぞれ培養することにより、 目的とする抗体を得ること ができる。
ハイプリ ドーマの作製にあたって哺乳動物を使用する場合は、 特に限定されな いが、 マウスやラットなどの小動物を用いるのが一般的である。 免疫は、 抗原で ある O C I Fを生理食塩水などで適当な濃度に希釈し、 この溶液を静脈内や腹腔 内に投与し、 これに必要に応じてフロイント完全アジュバントを併用投与し、 動 物に 1〜2週間の間隔で 3〜4回程度投与する方法が一般的である。 本発明にお ける O C I Fに高親和性 （解離定数が 2 X 10— 7M以下） の抗 O C I Fモノ クロ一 ナル抗体の作製に当たっては、 目的のモノクロ一ナル抗体が得られやすいように 1週間間隔で 3回免疫し、 更に抗原とフロイント不完全アジュバントを併用して 1週間間隔で 4回追加免疫し、 出来るだけ血中抗 O C I Fタイターを高める。 こ のようにして免疫された動物を最終免疫後 3日目に解剖して、 脾臓を摘出し、 脾 臓細胞を免疫細胞として使用するのが良い。 免疫細胞と細胞融合するマウス由来 のミエローマとしては、 例えば p3/x63- Ag8、 p3-Ul 、 NS - 1、 MPC- 11、 SP- 2/0一、 FO 、 P3x63 Ag8. 653及び S194などが例示できる。 又、 ラッ ト由来の細胞としては R -
210 などの細胞株がある。 ヒト型の抗体を生産する場合には、 ヒト Bリンパ球を in vi tro で免疫し、 ヒトミエローマ細胞や EBウィルスにより形質転換した細胞 株と細胞融合させることにより、 ヒト型の抗体を生産することができる。
免疫された細胞とミエ口一マ細胞株との融合は公知の方法、 例えば Koehler と Mi lsteinらの方法 (Koehler et al.， Nature, 256, 495-497， 1975) が一般的に 使用されるが、 電気パルスを利用した電気パルス法なども使用可能である。 免疫 リンパ球とミエローマ細胞株は、 通常行われている細胞数の比率に混合し、 一般 に使用される細胞培養用培地 （牛胎児血清、 FCS 不含） にポリエチレングリコー ルを添加して融合処理を行い、 F C S添加 H A T選択培地で培養を行い、 融合細 胞 （ハイプリ ドーマ） を選別する。
モノマー型及びホモダイマ一型 O C I Fを等しく認識する抗体、 及びホモダイ マー型 O C I Fのみを特異的に認識する抗体をそれぞれ生産するハイプリ ドーマ を、 E L I S A、 プラーク法、 ォクタロニー法、 凝集法など通常抗体の検出に使 用されている方法を用いて選択することができる。 精製モノマー型及びホモダイ マ一型 O C I Fを用いた E L I S Aで、 最も簡便且つ精度良く目的とする抗体を 検定することができる。 特に、 本発明による高親和性抗体 （解離定数が 2x l0_7 M以下） を得るには、 通常のソリッ ドフヱーズ E L I S Aでは困難であった。 即 ち、 通常のソリッドフヱ一ズ E L I S Aでは、 抗原を固相化した 96ゥヱルイ厶ノ プレート （Nunc社） にハイプリ ドーマ培養液 （50- 100 を加え一次反応を行い 、 次いで酵素標識、 例えば、 パーォキシダーゼ (POD) 標識した抗マウス IgG抗体 を加えて第二次反応を行ない、 酵素基質溶液 （50- 100 z l)を加えて酵素反応後、 各ゥニルの吸光度を測定する。 この際、 高い吸光度を示すハイプリ ドーマ培養液 は、 そのハイプリ ドーマが抗原親和性が低い抗体を大量に生産している場 と、 その生産性が低くても、 極めて抗原親和性が高い抗体を生産している場合の両方
が存在することを示しており、 そのどちらであるかを容易に判別できない。 そこ で、 本発明においては、 後者の抗原親和性の高い抗体生産ハイプリ ドーマを比較 的容易に識別できるように、 以下のようにソリッ ドフェーズ E L I S Aを改良し た。 即ち、 抗原を固相化した 96ゥヱルイムノプレートの各ゥエルにヒト血清ある いは牛血清を添加し、 次いでハイプリ ドーマ培養液を少量各ゥエルに添加し、 第 —次反応を約 80〜90%血清存在下で実施することにより、 生産性が良好であるが 、 抗原親和性が低い抗体産生ハイプリ ドーマを排除でき、 抗原親和性の高い抗体 産生ハイプリ ドーマを選択的にスクリーニングすることが可能になった。 この改 良ソリッ ドフヱーズ E L I S Aにおいて、 モノマ一型 O C I F及びホモダイマー 型 O C I Fを抗原として、 両タイプの〇C I Fを等しく認識する抗体を生産する ハイプリ ドーマ及びホモダイマー型 O C I Fのみを特異的に認識する抗体を生産 するハイプリ ドーマをそれぞれ選び、 限界希釈法により 3〜5回クローニングし 、 安定な抗体生産株として樹立する。 このようにして樹立されたハイプリ ドーマ は通常の培養方法により継代培養可能であり、 必要に応じて凍結保存できる。 ハ イブリ ドーマは常法により培養して、 その培養液から回収することができる。 ま た、 ハイプリ ドーマを哺乳動物の腹腔内に移植することにより得られる腹水から 抗体を回収することもできる。 培養液あるいは腹水中の抗体は、 塩折法、 イオン 交換及びゲル濾過クロマトグラフィ一、 プロテイン A又は Gを用いるァフィニテ ィ一クロマトグラフィーなど、 抗体の精製に通常用いられる方法により精製する ことができる。 得られた抗体は、 モノマー型及びホモダイマー型〇C I Fを等し く認識する抗体、 及びホモダイマー型〇C I Fのみを特異的に認識できる抗体で 、 それぞれ O C I F量 （モノマー型 O C I F +ホモダイマ一型 O C I F ) 及びホ モダイマー型 O C I Fのみの測定に利用することができる。 これらの抗 放射 性アイソトープや 酵素ラベルすることにより、 ラジオィムノアッセィ（RIA) や
ェンザィ厶ィ厶ノアッセィ（ELISA) として知られている測定系に用いることがで き、 O C I F量 （モノマー十ホモダイマー型 0CIF量） やホモダイマー型 O C I F のみの量を測定することができる。 特に本発明によるホモダイマ一型 O C I Fを 特異的に認識する抗体の存在は、 モノマー型〇C I Fとホモダイマ一型 O C I F には異なるェピトープが存在することを明らかにすると共に、 この抗体はモノマ 一型〇C I Fには存在せずホモダイマ一型〇C I Fのみに存在するェピトープを 認識する抗体であることを示している。 本発明によって得られるモノマー型〇C I F及びホモダイマー型 O C I Fを等しく認識する抗体を固相化抗体として、 又 放射性ァイソトープあるいは酵素標識した第二次抗体としてそれぞれ他の共通ェ ピトープでモノマ一型 O C I F及びホモダイマ一型 O C I Fを等しく認識する抗 体及びホモダイマ一型 O C I Fのみを特異的に認識する抗体を用いれば、 O C I F量及びホモダイマ一型 O C I F量をそれぞれ測定することができるという特徴 を有する。 さらに、 ホモダイマー型 O C I Fのみを測定したい場合、 固相化抗体 として、 以下の実施例 6 (第 1表） に開示するホモダイマー型〇C I Fのみを特 異的に認識する 01- 26 抗体、 標識抗体としてモノマー型〇C I F及びホモダイマ 一型〇C I Fを等しく認識する 01-19 あるいは 01-4抗体を使用することもできる 。 これらの測定系を用いることにより、 血液、 尿、 及び関節液などの生体試料や 細胞培養液中の O C I F量及びホモダイマー型 O C I F量のみを容易に且つ高感 度で測定することができる。
本発明のヒト〇C I Fを測定するためのキッ トは、 （i) 第 1次抗体または第 2 次抗体のいずれか一方の抗体が 01- 19 あるいは 01- 26抗体であり、 且つ（i i)他の 抗体が 01- 4抗体であることを除いて、 通常のサンドィツチ法における試薬（reage nt) の組合せに基づいてキッ トが構成される。 すなわち、 本発明の免疫学^ [測定 キットは、 （1) 不溶性担体に固定化された第 1次抗体、 （2) 標識化された第 2次
抗体、 （3) 溶解剤、 （4) 洗浄剤および (5) 標識物質が酵素である場合には、 酵素 活性を測定するための基質および反応停止剤を含んでいる。 不溶性担体としては 、 例えばポリスチレン、 ポリエチレン、 ポリプロピレン、 ポリエステル、 ポリア クリルニトリル、 フッ素樹脂、 架橋デキストラン、 ポリサッカライ ド、 ラテック ス、 ラテックスに金属等をメツキした磁性微粒子などの高分子、 その他紙、 ガラ ス、 金属、 ァガロースおよびこれらの組合せなどを例示することができる。 また 不溶性担体の形状としては、 トレィ状、 球状、 繊維状、 棒状、 盤状、 容器状、 セ ル、 試験管、 多孔性フィルターなどの種々の形状であることができる。 また、 標 識化抗体の標識物質としては、 酵素、 蛍光物質、 発光物質および放射性物質等を 使用するのが有利である。 酵素としては、 ペルォキシダ一ゼ、 アルカリフォスフ ァ夕一ゼ、 一D—ガラク トシダ一ゼ、 グルコースォキシダーゼ、 リンゴ酸デヒ ドロゲナーゼ、 グルコース 6 リン酸デヒドロゲナーゼ、 インベルターゼ等を、 蛍 光物質としては、 フルォレツセインイソチオシァネート、 フィコピリプロテイン 等を、 発光物質としては、 イソルシノール、 ルシゲニン等を、 そして放射性物質 としては、 Γ 2 5 、 I 1 3 1 、 C1 4、 H3 等を用いることができる力、 これらは例 示したものに限らず、 免疫学的測定法に使用し得るものであれば、 他のものでも 使用できる。
標識物質が酵素である場合には、 その活性を測定するために基質、 必要により 発色剤が用いられる。 酵素としてペルォキシダーゼを用いる場合には、 基質とし て H 2〇2を用い、 発色剤として 2， 2' -アジノジ- 〔3 - ェチルベンズチアゾリン スルホン酸〕 アンモニゥム塩（ABTS)、 5-ァミノサリチル酸、 0 - フエ二レンジァ ミ ン、 4-ァミノアンチピリン、 3， 3' , 5， 5' - テトラメチルベンジジン、 ホモセ バニリ ン酸、 チラミ ン等を、 酵素にアルカリフォスファターゼを用いる場舍は基 質として 0- ニトロフエニルフォスフェート、 4-メチルゥンベリフェリルリン酸
等を、 酵素に yS-D- ガラク トシダーゼを用いる場合は基質としてフルォレセイン
- ジ- （yS-D- ガラクトビラノシド） 、 4-メチルゥンベリフェリル- -D- ガラ クトビラノシド等を用いることができる。 前記免疫学的測定のキッ トにおいて（3 ) 溶解剤としては、 免疫学的測定に通常使用されるものであればよく、 例えばリ ン酸緩衝液、 トリス塩酸緩衝液、 酢酸緩衝液などを含んだ pHが 6.0〜8.0 の範囲 のものが好適な例として示される。 さらに（4) 洗浄剤としては、 同様に免疫学的 測定に一般的に使用されているものがそのまま使用される。 その例としては、 生 理食塩水、 リン酸緩衝液、 トリス塩酸緩衝液およびこれらの混合液が挙げられる 。 これらの洗浄剤にはさらに Triton Χ-100. Tween 20または Bri j35の如き非ィォ ン系界面活性剤、 ドデシル硫酸ナトリウム、 CHAPS の如きイオン系界面活性剤を 加えてもよい。 図面の簡単な説明
第 1図は、 実施例 7の 01- 19 抗体と 01-4抗体による EL I S Aの検量線を示す c
〔符号の説明〕
〇：ホモダイマ一型 0CIF
•：モノマ一型 0CIF
第 2図は、 実施例 7の 01-26 抗体と 01- 4抗体による EL I SAの検量線を示す c
〔符号の説明〕
〇：ホモダイマー型 0CIF
秦：モノマー型 0CIF
第 3図は、 実施例 8の骨粗鬆症患者及び健常人の血中 OC I F濃度を示す c
第 4図は、 実施例 8の尿中ピリジノ リンと血中 OC I F濃度の関係を示す。 第 5図は、 実施例 8の尿中デォキシピリジノリンと血中 OC I F濃度の関係を示 す。
第 6図は、 実施例 9の関節腫張を認めた患者の関節液中の OC I F濃度を示す。
〔符号の説明〕
RA: 慢性関節リウマチ
OA: 変形性関節症
Tr: 外傷
G: 痛風発作 発明を実施するための最良の形態
以下の実施例をもって本発明をより詳細に説明するが、 これらは単に例示する のみであり、 本発明はこれらによって何ら限定されるものではない。
〔実施例 1〕
抗原用モノマー型 OC I F及びホモダイマ一型 OC I Fの精製
WO 96/26217号公報記載の OC I F生産 CH0細胞を、 EX-CE11 301 培地 （JRH バイオサイエンス社） に 1 xiO5 cells/mlとなるように播種し、 細胞培養用ジャ 一 （2リツ トル容量） を用いて 37°Cで 7日間培養した。 得られた培養液に 0.1 % になるように CHAPS (3-[(3-cholaraidopropyl)-dimethylaimnonio]-l-propanesulf onate、 シグマ社） を加え、 酢酸で pH 6.0に調整した後、 0.22〃mのフィルタ一 (ミ リディスク、 ミ リポア社） で濾過した。 培養液を、 予め 0.1 % CHAPSを含む 50 mM ピス ト リス- 塩酸緩衝液、 pH 6.0で予め平衡化した SPセファロ一ス HP力 ラム（2.6xl0cm、 フアルマシア社） に負荷し、 同緩衝液で洗浄した後、 流速 4 ml
Z分、 100 分間で NaCl濃度が 1 Mになる直線勾配で溶出を行い、 8mlずつフラク ショネーションした。 W096/26217号記載の方法に従い各フラクションの OC I F 活性を測定し、 〇C I F画分を得た。 この OC I F画分を 0.1 % CHAPSを含む 50 mMビストリス—塩酸緩衝液、 pH 6.0で 10倍希釈した後、 予め 50mM ビストリス— 塩酸緩衝液、 pH 6.0で平衡化した硫酸化セル口ファインカラム（2.6 xl0cm、 生化 学工業社） に負荷した。 このカラムを、 0.1 % CHAPSを含む 50 mM ピストリス— 塩酸緩衝液、 pH 6.0で洗浄した後、 流速 4 ml/分、 100 分間で NaCl濃度が 1.5 M になる直線勾配で溶出を行い、 8mlずつフラクシヨネ一シヨンした。 各フラクシ ヨンの OC I F活性を、 前記と同様の方法で測定した。 又、 各フラクションの一 部を非還元条件下で SDS-PAGEにかけ、 OC I F活性を有し、 その分子量が約 60 k Daを示す分画を集め、 画分 1 とした。 又、 OC I F活性を有し、 非還元条件下で
SDS-PAGE で約 120kDa の分子量を示す分画を集めて、 画分 2とした。 画分 1及 び 2をそれぞれ 0.1 % CHAPSを含む 50 mM トリスー塩酸緩衝液、 pH 7.0で 10倍に 希釈した。 希釈して得られた両画分をそれぞれ、 予め 0.1 % CHAPS を含む 50 mM トリス—塩酸緩衝液、 pH 7.0で予め平衡化したリソース Sカラム （0.64x3cm、 フアルマシア社） に負荷し、 0.01% polysorbate 80 を含む 10 m リン酸ナトリ ゥ厶緩衝液、 PH 7.0で洗浄した後、 流速 lml/ 分、 15分間で NaCl濃度が 0.6 Mに なる直線勾配で溶出を行い、 0.5 mlずつフラクシヨネ一シヨンした。 画分 1及び 画分 2をそれぞれ負荷することによって得られた各フラクションの OC I F活性 を前記同様に測定し、 OC I F活性を有するフラクションを集めて、 画分 1から モノマー型 OC I F、 画分 2からホモダイマー型〇C I Fを得た。
〔実施例 2〕
マウスの免疫及びハイブリ ドーマの作製 ― 実施例 1記載の方法で精製されたモノマー型 OC I F及びホモダイマー型 OC
I Fを、 それぞれ 100 zg/mlになるように生理食塩水に溶解した。 このようにし て調製した両タイプの OC I Fを等量含む混合液に、 同容量のフロイント完全ァ ジュバントを加え良く乳化した後、 Balb/cマウス 1匹当たり腹腔内に 200 z 1 ず つ 1週間間隔で 3回投与し、 マウスを免疫した。 次に、 両タイプの OC I Fをそ れぞれ 25 /g/ml含む混合液に、 同容量のフロイント不完全アジュバントを添加し 充分乳化したものを、 上記 Balb/cマウス 1匹あたり 200 jx l ずつ、 1週間間隔で
4回追加免疫した。 4回目の追加免疫の 1週間後、 両タイプの OC I Fをそれぞ れ 100 zg/ml含む混合液を Balb/cマウス 1 匹当たり 100 μ. \ ずつ静脈内に投与し た。 最終免疫後 3日目に脾臓を摘出、 脾臓細胞を分離し、 マウスミエローマ細胞
P3X63-AG8.653 (ATCC CRL- 1 5 8 0 ) と公知の方法 （Koehler, G. and
Milstein, ， Nature, 256. 495 (1975)) に従い細胞融合した。 融合終了後、 細胞懸濁液をヒポキサンチン、 アミノブテリン及びチミジンを含む HAT培地中 で 10日間培養した。 ミエローマ細胞が死滅し、 ハイプリ ドーマが出現した後、 HA T培地からアミノブテリンを除いた HT培地に培地交換し培養を継続した。
〔実施例 3 )
ハイブリ ドーマの選択及^ローニング
融合 10日後にハイプリ ドーマの出現を認めたので、 上記に記載した改良ソリツ ドフェーズ EL I SAにより、 モノマー型 OC I F及びホモダイマ一型〇C I F を等しく認識する高親和性抗体及びホモダイマー型 OC I Fのみを特異的に認識 する高親和性抗体生産ハイプリ ドーマの選択を行った。 即ち、 予めモノマー型及 びホモダイマー型 OC I Fをそれぞれ 5〃g/mlになるように 0.1 M炭酸水素ナト リウ厶溶液 （PH9.6)に溶解し、 それぞれの抗原溶液を 50^ 1 ずつ 96ゥヱルイ厶ノ プレート （Nunc社） の各ゥヱルに加え、 4 °Cでー晚静置しそれぞれの抗原 固相 化した。 各ゥヱル中の抗原溶液を捨て、 0.1 % polysorbate 20 を含むリン酸塩
緩衝生理食塩水 （PBS- P)で洗浄し、 各ゥエルに 40 / 1 の牛胎仔血清 （ハイクロー ン社） を加えた。 次いで、 各ゥヱルに 10〃 1 のハイプリ ドーマ培養上清を加え、 80%血清濃度下、 室温で 2時間反応させた。 反応後、 プレートを P B S— Pで洗 浄し、 25%ブロックエースを含む生理食塩水で 5000分の 1に希釈したパーォキシ ダ一ゼ標識抗マウス IgG (KPL社） を各ゥエルに 加え、 室温で 2時間反応さ せた。 プレートを PBS- P で洗浄した後、 各ゥヱルに 50 / 1 の酵素基質溶液（TMB， ScyTek社） を加えて発色させた後、 反応停止液 （stopping reagent, ScyTek社） 50 1 を加えて酵素反応を停止した。 各ゥエルの 450nm における吸光度をマイク 口プレートリーダ一 （ィ厶ノリ一ダ一 NJ2000 、 日本ィンターメッ ド社） を用い て測定し、 抗体生産ハイプリ ドーマを選択した。 特に高い吸光度を示し、 しかも モノマー型及びホモダイマー型 O C I Fを等しく認識する抗体あるいはモノマ一 型 O C I Fを認識せず、 ホモダイマー型 O C I Fのみを特異的に認識する抗体生 産ハイブリ ドーマを選択し、 それぞれのハイプリ ドーマから限界希釈法により 3 〜5回クローニングを繰り返すことにより、 安定な抗体生産ハイプリ ドーマを樹 立した。 得られた抗体生産株の中から、 さらに目的抗体の生産性が高いハイプリ ドーマ株を選別した。
このようにしてモノマー型〇C I F及びホモダイマー型〇C I Fを等しく認識 する 01- 19 抗体あるいは 01-4抗体を産生するハイプリ ドーマ 01- 19 及び 01- 4を得 た。 またホモダイマ一型〇C I Fのみを特異的に認識する 01- 26抗体を産生する ハイプリ ドーマ 01- 26 を得た。 これらを工業技術院生命工学工業技術研究所に寄 託し、 01- 4には受託番号 FERM BP-6419 、 01-19 には受託番号 FERM BP - 6420 、 01-26 には受託番号 FERM BP- 6421 がそれぞれ付与されている。
〔実施例 4〕
モノクローナル抗体の生産及び精製
実施例 3で得られた目的の抗体、 即ち高親和性でモノマー型及びホモダイマー 型 O C I Fを等しく認識する抗体及びホモダイマー型 O C I Fのみを特異的に認 識する抗体生産ハイプリ ドーマをそれぞれ培養し、 マウス一匹当たりそれぞれの ハイプリ ドーマを lxlO6 細胞ずつ、 予めプリスタン （アルドリッチケミカル社） を投与しておいた Balb/c系マウスの腹腔内に移植した。 2週間後、 蓄積した腹水 を採取し、 本発明のモノクローナル抗体を含む腹水を得た。 プ πティン Aカラム
(フアルマシア社） クロマトグラフィーにより、 腹水から精製抗体を得た。
〔実施例 5〕
モノ クローナル抗体の解離定数（Kd 値） の測定
Betrand Friguet らの方法 Uouriml of Immunological Methods, 77, 305-319, 1986) に従い、 モノクローナル抗体の解離定数を測定した。 即ち、 実施例 4で得 られた精製抗体を、 5ng/mlに 40%ブロックエース （雪印乳業社） 、 0. 1 % polys orbate 20 を含む 0. 2M Tris-HCl pH7. 4( 1次バッファ一） で希釈し、 これに実施 例 1記載の精製モノマー型あるいはホモダイマ一型の遺伝子組み換え〇C I F (r 0CIF) を 6. 25ng/ml〜10 g /ml になるように 1次バッファーで希釈したものを 等容量混ぜ、 4でで 15時間静置することにより O C I Fとモノクローナル抗体を 結合させた。 15時間後、 〇C I Fと未結合の抗体をモノマー型あるいはダイマー 型の r〇C I F (10 z g/niK 100 1/ゥエル） を固相化したソリッ ドフェーズ E USAにて測定することにより、 モノクロ一ナル抗体のモノマ一型及びホモダイマ 一型〇C I Fに対する解離定数を算定した。
〔実施例 6〕
モノク口一ナル抗体のクラス及びサブクラスの検定
本発明のモノクロ一ナル抗体のクラス及びサブクラスを、 ィ厶ノグロプリンク ラス及びサブクラス分析キッ ト （アマシャム社） を用いて検定した。 検定は、 キ
ッ 卜に指示されているプロトコールに従い実施した。 実施例 5及び 6で得られた 結果を第 1表に示す。
第 1表
抗体名 サブクラス 解離定数 解離定数
(対モノマー） (対ダイマ一）
2
1
〔実施例 7〕
OC I Fの EL I S Aによる測定
上記方法により得られた 3種の抗体 01- 4、 01-26 及び 01- 19をそれぞれ固相抗 体と標識抗体として、 サンドイッチ EL I SAを構築した。 抗体の標識は、 マレ イミ ド活性化パーォキシダーゼキッ ト （ピアス社） を用いて行った。 モノマー型 及びホモダイマー型 OC I Fを等しく測定する EL I SAには 01- 19抗体を 1次 抗体として、 あるいはホモダイマ一型 OC I Fを特異的に測定する E L I SAに は 01- 26抗体を 1次抗体として、 それぞれ lO zg/mlになるよう 0.1M 炭酸水素ナ トリウム溶液 （PH9.6)に溶解し、 100 ιι\ ずつ 96ゥヱルイ厶ノプレート （Nunc社 ) の各ゥヱルに加え、 4 °Cでー晚静置し固相化した。 各ゥヱルの溶液を捨て、 50 %濃度のブロックエース （雪印乳業社） 300 \ を加え、 室温で 2時間静置しブ ロッキングした。 ブロッキング後、 プレートを 0.1 % polysorbate 20 を含むリ
ン酸塩緩衝生理食塩水（PBS- P) で洗浄した。 モノマー型 OC I F及びホモダイマ —型 OC I Fをそれぞれ 40%ブロックエース （雪印乳業社） 及び 0.1 % polysor bate 20 を含む 0.2M Tris-HCl (pH 7.4) (—次バッファ一） に溶解、 希釈し、 種 々の濃度の両タイプ OC I F溶液を調製した。 種々の濃度に調製したモノマー型 及びホモダイマー型〇C I F溶液それぞれを 100 \ずつ各ゥヱルに加え、 室温 で 2時間反応させた。 2時間後、 プレートを PBS— Pで洗浄し、 25%ブロック エース (雪印乳業社) 及び 0.1 % polysorbate 20 を含む 0.1M Tris-HCl (pH7.4 )(2次バッファー） で希釈した POD標識 01- 4抗体をモノマー型及びホモダイマ 一型 OC I Fを等しく認識する抗体として各ゥヱルに 100 PL \ 加え、 室温で 2時 間反応させた。 プレートを PBS— Pで洗浄した後、 各ゥエルに 100〃1 の酵素 基質溶液（TMB， ScyTek社） を加えて発色させた後、 反応停止液（stopping reagent, ScyTek社） を 100 ιι\ずつ各ゥエルに加えて酵素反応を停止した。 各ゥエルの 450nmにおける吸光度をマイクロプレートリーダ一を用いて測定した。 第一次抗 体としてモノマー型及びホモダイマー型 OC I Fをほぼ等しく認識する抗体、 01 -19 を使用した時の結果を第 1図に、 又ホモダイマ一型〇C I Fのみを特異的に 認識する抗体 01- 26 を用いた時の結果を図 2に、 それぞれ示す。 この結果、 第 1 図に示したように、 モノマ一型及びホモダイマ一型〇C I Fをほぼ等しく認識す る抗体、 01-19 を固相抗体とし、 両タイプの〇C I Fを等しく認識する抗体、 01 -4を POD標識抗体とした時のサンドイッチ EL I S Aの測定感度は約 25 pg/ml で極めて微量の OC I Fを測定することができることが明らかになった。 又、 第 2図に示したように、 ホモダイマ一型 OC I Fのみを特異的に認識する抗体 01 - 2 6 を固相抗体とし、 モノマー型及びホモダイマー型 OC I Fを等しく認識する抗 体 01-4を POD標識抗体としたサンドイッチ EL I SAの測定感度は 50 pg/mlで 、 高感度でホモダイマー型 OC I Fのみを測定できることを認めた。
〔実施例 8〕
健常人及び骨粗鬆症患者の血清中 OC I Fの測定
健常人及び骨粗鬆症患者 （日本骨代謝学会の診断基準に基づく） の血清中の 0 C I F濃度を、 実施例 7記載の OC I Fの EL I SA系 （モノマー型 0CIF+ホモ ダイマー型 0CIF) を一部改良して測定した。 即ち、 〇C I F濃度 （モノマー型 0C IF+ホモダイマー型 0CIF) の測定には、 両タイプの〇C I Fを等しく認識する抗 体 01-19 を実施例 7と同様に 96ゥヱルイ厶ノプレートに固相化し、 各ゥヱルに精 製マウス IgG (カペル社） を 20〃g/mlになるよう加えた 1次バッファ一 （40%ブロ ックエース及び 0.1 % polysorbate 20 を含む 0.2 M Tris-HCl, pH 7.4) を 50〃 1 加え、 次いで 1次バッファーで 4倍希釈した各ヒト血清を 加え、 室温で 2時間静置した。 0.1 % polysorbate 20 を含むリン酸塩緩衝生理食塩水 （PBS- P)で 6回洗浄後、 両タイプの OC I Fを等しく認識する抗体 01- 4の POD標識体 を精製マウス IgGを 10〃g /ml になるように加えた 2次バッファ一 （25%ブロッ クエース及び 0.1 % polysorbate 20 を含む 0.1 Tris-HCl, pH 7.4) で 3000倍 に希釈した溶液を 100 ml ずつ各ゥエルに加えて、 室温で 2時間静置した。 PB S— Pで 6回洗浄後、 酵素基質溶液 （TMB， ScyTek社） を 100 l ずつ各ゥエル に加え、 室温で 20分間反応させた後、 反応停止液 （stopping reagent, ScyTek 社） を 100 ill ずつ各ゥエルに添加して、 反応を停止した。 各ゥエルの 450ηπιの 吸光度を、 マイクロプレートリーダーを用いて測定した。 既知量の OC I Fを含 む 1次バッファ一についても同様に操作し、 第 1図と同様に OC I Fの検量線を 作製し、 血清試料の吸光度から血清中の OC I F濃度を求めた。
骨粗鬆症患者及び健常人の、 血清中の OC I F (モノマー型 0CIF+ホモダイマ 一型 0CIF) 濃度の試験結果を第 3図に示す。 第 3〜 5図に示す結果の有意差検定 は、 Student's non-paired t検定にて行った。 この結果、 骨粗鬆症患者と健常
人との間には、 血清 O C I F (モノマー型 0CIF+ホモダイマ一型 OCiF) 濃度に有 意な差異が認められ、 骨粗鬆症患者の血清 O C I F濃度は、 健常人のそれよりも 有意に高かった。 よって、 血清 O C I F濃度を測定することにより、 骨粗鬆症患 者の病態を把握できることから、 O C I Fは骨粗鬆症を判定する新しい骨代謝マ 一力一になり得ることが明らかとなった。
又、 健常人と骨粗鬆症患者の血清 O C I F (モノマー型 0CIF+ホモダイマ一型 0CIF) 濃度と尿中ピリジノリン濃度の関係を第 4図に、 尿中デォキシピリジノリ ン濃度との関係を第 5図に、 それぞれ示す。 ここで、 ピリジノリン濃度 42 pmol/ zmol Cr (クレアチニン l mol 当りのピリジノリン praol量） 、 デォキシピリジ ノリン濃度 6. 2pmol/〃mol は、 それぞれ日本人の正常値の上限値である。 この 結果、 ピリジノリン、 デォキシピリジノリン濃度が高値を示す患者の血清 0 C I F濃度は、 有意に高かった。 ピリジノリン及びデォキシピリジノリンはコラーゲ ンの架橋分子であり、 コラーゲンが骨基質に取り込まれた後に骨基質内で生成さ れ、 骨吸収時の骨破壊により放出される。 これらの分子は骨吸収マーカーとして の特異性が高いとされており、 臨床検体の評価に幅広く利用されているものであ る。 〇 C I F濃度とこの二つのマーカーとの相関が認められたことにより、 血清 中〇C I F濃度は骨代謝マーカ一として有用であることが明らかとなった。
〔実施例 9〕
関節腫張を認めた患者の関節液中 O C I F濃度の測定
関節疾患の治療を目的として病院を訪れ、 診察の結果明らかな関節腫張を認め た慢性関節リウマチ（RA)患者 43例、 変形性関節症 (OA)患者 6例、 外傷 (Tr)患者 3 例、 および痛風発作（G) 患者 6例よりインフォ一ムドコンセントを得た上で関節 液を採取した。 これらの関節液中の O C I F濃度を、 実施例 8に記載した O C I Fの E L I S A系 （モノマ一型 0CIF+ホモダイマー型 0CIF) を一部改変して測定
した。 即ち、 関節液は 1次バッファーで 1 6倍希釈した後、 その 50〃1 を抗体 01 - 19 を固相化した 96ゥヱルイムノプレートの各ゥヱルに加えた。 この操作以外の 全ての操作は、 実施例 8の方法と同様に実施した。
関節腫張を認めた患者関節液中〇C I F (モノマ一型 0CIF+ホモダイマー型 0C IF) 濃度の試験結果を第 6図に示す。 また、 第 6図に示したデータの統計解析に は Kruskal-Wal l is Testおよび Mann-Whi tney Testを使用した。 この結果、 関節 液中の O C I F濃度は、 痛風発作 (G) 例に比し R A患者の方が有意に低値を示し た （p=0. 0023) 。 また、 6例の OA患者の関節液中の O C I F濃度の最低値は 4. 7 9 ng/ml であった一方、 関節液中の O C I F濃度が、 4. 0 ng/ml 以下の低値を示 した RA患者は 43例中 15例に達した。 これらの結果から、 関節液中の O C I F濃度 が低値を示した一部の R A患者の関節において、 O C I Fの不足により破骨細胞 の形成と活性が抑制されていない可能性が示唆された。 また、 0CIF-ELISAが慢性 関節リウマチ（RA)、 変形性関節症 (0A)、 外傷 (Tr)、 および痛風発作 (G) の病態の 診断に有用であることが示された。
〔実施例 1 0〕
慢性関節リウマチ（RA)患者の膝関節液中 O C I F濃度と病態の関係
関節液中の〇C I F濃度と関節破壊の進行との相関を検討するため、 retrospe ct ive cohort studyを慢性関節リウマチ（RA)患者 2例につき、 実施した。
(症例し 66才、 男性）
1982年 （50才時） 、 多関節痛を自覚。 1983年、 病院で初診を受け、 American Col lege of Rheumatology の R Aの分類基準を満たし R Aと診断された。 以後、 抗リウマチ薬 （メルカプターゼ） により一時寛解となり、 抗リウマチ薬の投与を 中止した。 1990年、 R Aを再発し、 抗リウマチ薬の投与を再開した。 1992年 3月 18日、 右膝関節が腫張し、 穿刺により関節液を採取した。 この時の関節液中の 0
C I F濃度は 23.6 ng/mlであり、 高値を示した （実施例 9で示した 43例の RA患者 の関節液中の〇C I F濃度の中央値は約 6ng/ml)。 この時の血漿の CRPは 5.4 mg/dlであり、 明らかに炎症反応を呈した。 CRPは完全には陰性化はせず、 19 97年まで 3mg/dl前後を呈していた。 膝 X-pは 1983年から 1997年まで確認されてい るが、 変形性関節症 (OA)の変化が主体であり、 手指関節および手関節においても 骨糜爛は認められなかつた。
(症例 2、 60才、 女性）
1987年 （49才） 、 多関節痛を自覚。 1993年 8月 17日、 病院で初診を受け、 Ame rican College of Rheumatology の R Aの分類基準を満たし R Aと診断された。 このとき右膝関節が腫張しており、 穿刺により関節液を採取した。 この時の関節 液中の OC I F濃度は 3.0ng/ml と低値を示し、 また血漿の CRPは 13.7 mg/d 1 と強い炎症反応を呈していた。 その後、 抗リゥマチ薬 （メソトレキセ一ト） の 投与により CRPは徐々に低下し、 1994年 3月 18日には 4. lmg/dl 、 同年 6月 27 日には 1.1 mg/dlにまで低下した。 し力、し膝 X- pは、 Larsen分類 （Laresen A. et al.， Acta Radiol. Diag. 18， 481-49L 1977)によると、 1993年 9月 1 曰には grade III 、 1994年 3月 18日には grade IV 、 同年 6月 27日には grade Vと、 関 節破壤は確実に進行し、 同年 10月 4日には、 人工関節置換術を施行された。
上記 2例、 即ち関節破壊の進行が穏やかであった症例 1 と関節破壊が進行した 症例 2での関節液中の OC I F濃度の測定結果から、 リウマチによる関節破壊の 危険度の評価や関節破壊の治療効果の評価に関節液中の OC I F濃度測定が有用 であることが示された。
〔実施例 1 1〕
モノマー型およびダイマ一型 OC I F測定用キッ ト 1(80検体）
① 01-19抗体を実施例 7の方法で固相化し、 予め Mock Ace でブロッキングし
た 96ゥエルプレート： 1 枚
② 実施例 7の方法で POD標識化した 01-4 抗体： 10/zKlOOO倍濃度）
③ 遺伝子組み換え型 OC I F (モノマー型） 標準品： 0.5ng/ml 400〃1
④ 検体の希釈液（0.01% Tween 20 と 40% BlockAceを含む 0.2M Tris-HCl 緩衝液、 pH 7.4): 10ml
⑤ 標識抗体の希釈液（0.01% Tween 20 と 25% BlockAceを含む 0.1M Tris-HCl 緩 衝液、 H 7.4)： 10ml
⑥ 96 ゥヱルプレート洗浄のための洗浄液（0.1% Tween 20 を含む PBS (-)：): 1 リ ッ トル
⑦ 標識化酵素活性を測定するための基質溶液 （ここでは TMB 溶液） および反応 停止液 （TMB stop reagent) ： 各 10ml
ダイマー型 OC I F測定用キッ ト 2(80検体）
① 01-26抗体を実施例 7の方法で固相化し、 予め Block Ace でブロッキングし た 96ゥエルプレート： 1 枚
② 実施例 7の方法で POD標識化した 01- 4 抗体： 10^ 1(1000倍濃度）
③ 遺伝子組み換え型 0CIF (ダイマー型） 標準品： 0.5ng/ml 400^1
④ 検体の希釈液（0.01% Tween 20 と 40% BlockAceを含む 0.2M Tris-HCl 緩衝液、 pH 7.4): 10ml
⑤ 標識抗体の希釈液（0.01% Tween 20 と 25% BlockAceを含む 0.1M Tris-HCl 緩 衝液、 pH 7.4): lOral
⑥ 96ゥエルプレート洗浄のための洗浄液（0.1% Tween 20を含む PBS (-) )： 1 リッ トル
⑦ 標識化酵素活性を測定するための基質溶液 （ここでは TMB溶液） およ 応 停止液 （TMB stop reagent) ： 各 10ml
測定方法 （キッ ト 1およびキッ ト 2 )
プレート①の各ゥエルに希釈液④で希釈した検体及びヒト遺伝子組み換え型 0 C I F標準品③を段階希釈した溶液を 100 づっ加える。 室温にて約 2時間放 置した後、 洗浄液⑥ 300 / 1 でプレートの各ゥヱルを 5〜6 回洗浄する。 この洗 浄操作には自動プレートウォッシヤーを用いてもよい。 洗浄したプレートの各ゥ エルに POD 標識した 01-4抗体②を希釈液⑤で 1000倍希釈した溶液 100 z l づっを 加え、 再び室温にて約 2 時間放置する。 洗浄液⑥でプレートの各ゥヱルを 5〜6 回洗浄する。 この洗浄操作には自動プレートウォッシャーを用いてもよい。 酵素 基質溶液⑦を各ゥエルに 100 / 1 づっ加え、 室温にて 20〜30分放置する。 各ゥェ ルに反応停止液⑦を 100 1 加えることにより酵素反応を停止する。 各ゥエルの 450nm における吸光度をマイクロプレートリーダ一を用いて測定する。 ヒト遺伝 子組み換え型 O C I F標準品③を段階希釈したものを加えた各ゥエルの 450nm の 吸光度よりヒト遺伝子組み換え型 O C I F濃度の検量線を作製し、 この検量線か ら各検体の〇C I F濃度を求める。 産業上の利用の可能性
本発明により、 採取した体液 （血液、 関節液等） 中のヒト破骨細胞形成抑制因 子（0C IF)濃度を測定することにより、 骨代謝異常症、 特に骨粗鬆症及び関節疾患 の診断を簡易的にかつ正確に行うことができる。 本発明の診断には、 前記モノク ローナル抗体、 及びそのモノクローナル抗体を用いた〇C I F測定用キッ トが用 いられるので、 骨代謝異常、 特に骨粗鬆症及び関節疾患の診断を前記のように簡 易的かつ正確に行うことができるものである。 本発明は、 骨代謝異常症、 特に骨 粗鬆症及び関節疾患の診断方法、 あるいは研究用分析試薬などに有用である。
微生物への言及
当該微生物を寄託した寄託機関の名称及びあて名
寄託機関：通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所 住 所： 日本国茨城県つくば市東 1丁目 1番 3号 寄託機関に寄託した日付：平成 9年 （1997) 年 10月 16日 寄託機関の寄託について付した寄託番号 ： FERM BP- 6419 寄託機関：通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所 住 所： 日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番 3号 寄託機関に寄託した日付 ：平成 9年 （1997) 年 10月 16日 寄託機関の寄託について付した寄託番号 ： FERM BP-6420 寄託機関：通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所 住 所： 日本国茨城県つくば市東 1丁目 1番 3号 寄託機関に寄託した日付 ：平成 9年 （1997) 年 10月 16日 寄託機関の寄託について付した寄託番号 ： FERM BP-6421
Claims
1. 採取した体液中の破骨細胞形成抑制因子 (0CIF)の濃度を測定しその濃度によ つて骨代謝異常を診断することを特徴とする骨代謝異常症の診断方法。
2. 体液が血清または関節液である請求の範囲 1に記載の骨代謝異常症の診断方
3. 骨代謝異常症が骨粗鬆症である請求の範囲 1又は 2に記載の骨代謝異常症の 診断方法。
4. 骨代謝異常症が関節疾患である請求の範囲 1又は 2に記載の骨代謝異常症の 診断方法。
5. 骨代謝異常症が慢性関節リゥマチである請求の範囲 1又は 2に記載の骨代謝 異常症の診断方法。
6. モノマー型〇C I F及びダイマ一型 0CIFを等しく認識するモノ クローナル抗 体。
7. ダイマー型の OC I Fのみを選択的に認識するモノクローナル抗体。
8. OC I Fの異なるェピトープを認識し、 抗原との解離定数が 2X10— 7M以下 の高親和性を有する請求の範囲 6又は 7に記載のモノクロ一ナル抗体。
9. OC I Fの異なるェピトープを認識し、 抗原との解離定数が 10— 9M以下の高 親和性を有するモノマー型 OC I F及びダイマー型 OC I Fを等しく認識する モノクローナル抗体と、 OC I Fの異なるェピトープを認識し、 抗原との解離 定数の 2X10—7M以下の高親和性を有するダイマー型の〇C I Fのみを選択的 に認識するモノ クローナル抗体とを構成に含む OC I F測定用キット。
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