WO1999009065A1 - Peptid mit radioprotektiver wirkung - Google Patents

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WO1999009065A1
WO1999009065A1 PCT/EP1998/004051 EP9804051W WO9909065A1 WO 1999009065 A1 WO1999009065 A1 WO 1999009065A1 EP 9804051 W EP9804051 W EP 9804051W WO 9909065 A1 WO9909065 A1 WO 9909065A1
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bbi
peptide
peptide according
peptides
radiation
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PCT/EP1998/004051
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Hans Peter Rodemann
Klaus Dittmann
Nuri GÜVEN
Claus Mayer
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Eberhard-Karls-Universität Tübingen Universitätsklinikum
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/81—Protease inhibitors
    • C07K14/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
    • C07K14/811—Serine protease (E.C. 3.4.21) inhibitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
    • A61K8/64—Proteins; Peptides; Derivatives or degradation products thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
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    • A61P17/16—Emollients or protectives, e.g. against radiation
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    • A61Q17/00—Barrier preparations; Preparations brought into direct contact with the skin for affording protection against external influences, e.g. sunlight, X-rays or other harmful rays, corrosive materials, bacteria or insect stings
    • A61Q17/04—Topical preparations for affording protection against sunlight or other radiation; Topical sun tanning preparations
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2800/00—Properties of cosmetic compositions or active ingredients thereof or formulation aids used therein and process related aspects
    • A61K2800/74—Biological properties of particular ingredients
    • A61K2800/78—Enzyme modulators, e.g. Enzyme agonists
    • A61K2800/782—Enzyme inhibitors; Enzyme antagonists
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to a peptide with radioprotective activity.
  • Such a peptide is, for example, from the publication by Dittmann, K., et al. (1995): "Bowman-Birk proteinase inhibitor (BBI) modulates radiosensitivity and radiation-induced differentiation of human fibroblasts in culture", Radiotherapy and Oncology 34, pages 137-143.
  • a radioprotective effect of a peptide is understood to mean its protective activity for cells, tissues or organisms against harmful radiation. Radiation which is particularly harmful to living organisms is ionizing radiation and UV radiation, ie high-energy types of radiation.
  • a peptide has a radioprotective effect if the damage caused by radiation is reduced by this peptide. The mechanisms underlying a radioprotective effect are currently still completely unclear.
  • Damage caused by high-energy radiation is, for example, the change in DNA, i.e. mutagenesis, which can lead to the development of tumors, but also the degeneration, atrophy, fibrosis or necrosis of tissues which are exposed to high levels of radiation.
  • malignant melanoma is promoted by high sun exposure of the skin.
  • the human organism is confronted with particularly high radiation intensities not only when exposed to high levels of sunlight, but also during X-ray diagnostics or during radiation therapy for tumor diseases.
  • UV-filtering substances such as those found in sun milk.
  • UV-filtering substances such as those found in sun milk.
  • the shielding of parts of the body that are not to be irradiated and the most precise local application of the radiation are used.
  • BBI Bowman-Birk protease inhibitor
  • the BBI contains 71 amino acids and has a molecular weight of around 8,000 daltons.
  • One of the characteristics of the BBI is the number of fourteen cysteine residues that form seven disulfide bridges and thus have a significant influence on the folding or secondary structure of the BBI.
  • Fibroblasts are connective tissue cells that occur, for example, in large quantities in the skin.
  • No. 5,376,373 has proposed a method in which the weight and hair loss caused by radiation are inhibited by the oral administration of a "concentrate" obtained from soybeans and in which the BBI is contained.
  • a soybean extract is repeatedly fragmented, precipitated, ultrafiltered, diluted and concentrated again in order to get protective product. It is not known which further constituents, for example further protease inhibitors or the like, are contained in the concentrate.
  • a problem with the oral intake of the BBI with food is that it has been shown in rats that large amounts of trypsin inhibitors lead to hypertrophy and hyperplasia of pancreatic cells and to loss of body weight. Pancreatic tumors even developed in rats that ingested trypsin inhibitors from soybeans for a longer period of time.
  • a peptide with a radioprotective effect comprises a modified form and / or a possibly modified fragment of the Bowman-Birk protease inhibitor.
  • the inventors have surprisingly found that even structurally modified forms and even fragments of the BBI have radioprotective activity. So it is no longer necessary to provide the BBI in its native form in order to obtain a peptide with the desired radioprotective effect.
  • Modified in the sense of the invention is understood to mean any change in the structure or conformation of the BBI and any modification of its amino acid sequence, be it by chemical or enzymatic addition or removal of individual groups of amino acids or by exchange of individual amino acids.
  • a modified form of the BBI also includes a peptide in which additional amino acids have been attached to the N- or C-terminal end of the BBI, for example domains of further proteins or peptides, which facilitate the purification of the BBI and / or further enhance its radioprotective effect .
  • a fragment in the sense of the invention is understood to mean any section of the BBI in which either only individual amino acids or larger amino acid sections of the BBI are missing.
  • Such fragments include, for example, individual domains of the BBI. According to the invention, such fragments can also be modified in the sense set out above.
  • Modified forms of the BBI or BBI fragments can be generated either by treating the native, ie unchanged BBI with chemicals or enzymes or by synthesis using chemical or molecular biological methods.
  • Modified forms or fragments of the BBI are easy to handle because, during their production and storage, no care must be taken to ensure that contact with modifying agents, proteases or the like is excluded.
  • the new peptide has no protease inhibiting activity against trypsin and chymotrypsin.
  • Such a peptide has the considerable advantage of not only blocking the proteases trypsin or chymotrypsin in addition to the radioprotective effect. This is particularly advantageous if the peptide is to be used to protect cells, tissues or organisms against radiation, because, as already explained above, at least peptides with a trypsin-inhibiting effect are harmful to pancreatic cells and can even lead to tumor formation.
  • a peptide according to the invention has a single well-defined effect, namely protection against radiation.
  • these serine proteases are not hindered in their activity at the same time. This also avoids the pancreatic side effects listed above.
  • the peptide has at least two cysteine residues which are present in reduced form.
  • This measure has the advantage that such a peptide can also be used as a radioprotective agent in the presence of reducing agents.
  • Reducing agents in peptides containing cysteine residues lead to their sulfur residues being protonated and thus being present as SH groups.
  • the SH groups form disulfide bridges with one another, which play a key role in determining the folding of the peptide.
  • Reduced agents are often used in the purification of proteins and peptides. Under physiological conditions there are reducing conditions inside cells due to the presence of glutathione.
  • a peptide whose cysteine residues are present in reduced form has the further advantage that it can be produced in bacteria without problems using molecular biological methods.
  • Such expression in bacteria is much easier and more efficient than expression in yeast and higher eukaryotic cells and allows particularly high yields.
  • this system is unsuitable for proteins or peptides in which the cysteine residues are covalently linked to one another via disulfide bridges, since disulfide bridges cannot be formed in bacteria.
  • a reduced form of BBI can easily be expressed in bacteria.
  • amino acid residues of the peptide are in alkylated form.
  • Alkylation is the modification of individual amino acids with alkyl groups, usually methyl groups. This modification is carried out with so-called alkylating reagents, for example with iodoacetamide.
  • the SH groups of the cysteines are provided with a methyl group, ie alkylated. A reoxidation of the SH groups is then no longer possible. This prevents the disulfide bridges from forming again, even under oxidizing conditions.
  • Alkylation of the BBI or of fragments of the BBI has the advantage of maintaining the cysteine residues in their reduced form and thus stabilizing them.
  • the peptide has less than 20, most preferably less than ten, amino acids.
  • Such a drastically reduced BBI fragment has the considerable advantage of being able to distribute and penetrate much better and faster when used on cells, tissues or in the whole organism due to its small size than the total BBI comprising more than 70 amino acids.
  • a good distribution and easy penetration into the tissue is essential when using the peptide as a radio protector, since it can then quickly and comprehensively develop its protective effect against radiation.
  • the peptide is a non-peptide and has the sequence SEQ ID No .: 1 from the attached sequence listing.
  • nonapeptide exerts an equally high radioprotective effect on human fibroblasts as the total BBI.
  • the use of a peptide which is very much smaller than the total BBI and which comprises only nine amino acids (nonapeptide) has the major advantage that this nonapeptide can be produced more easily.
  • a nonapeptide can be easily synthesized, also called Merrifield synthesis. This type of peptide synthesis is a widespread and well-established synthetic method by which such a peptide can be obtained in large quantities and in high purity.
  • the peptide is a nonapeptide with the sequence SEQ ID no. : 2 from the attached sequence listing.
  • terminal cysteine residues of the peptides with the sequences SEQ ID No .: 1 and 2 are covalently linked to one another.
  • ring-shaped or cyclic peptides are formed which are highly stable in an oxidizing environment.
  • An oxidizing milieu is present, for example, in the extracellular matrix of the connective tissue and on all parts of the body that are in contact with the outside air. Since both the linear and the cyclic peptides with the sequences SEQ ID-No .: 1 and 2 have a radioprotective effect, they are effective as radiation protection in both reducing and oxidizing environments and can therefore be used universally.
  • the peptide has the sequence SEQ ID No .: 3 from the attached sequence listing.
  • This peptide contains only seven amino acids, so it is a heptapeptide. By further shortening the peptide while maintaining its radioprotective effect, the peptide is even faster and cheaper to produce and easier to apply.
  • At least one of the amino acids of the peptide has a protective group.
  • Such protective groups can be any of the protective groups known in peptide chemistry, it being preferred that the C-terminal amino acid has an acetyl group and / or the N-terminal amino acid has an amide group.
  • These protective groups have the advantage of protecting the peptides from attack by exopeptidases, so that the peptides have a substantially higher stability in a biological environment, for example in cell culture or in the organism.
  • Protecting groups which block the C-terminal carboxyl and the N-terminal amino group of peptides such as the acetyl or amide groups mentioned, furthermore ensure that the peptides do not form any further peptide bonds with other peptides or with one another, so that also Tandemization of the peptides can be prevented safely. If there are several peptides linked to one another, it can no longer be safely assumed that the radioprotective effect has been retained.
  • the protective groups also ensure that the peptides are retained in their radioprotective active structure.
  • Another aspect of the present invention is the use of one or more of the peptides mentioned as a radioprotective agent.
  • This use as a radioprotective agent encompasses any use in which the peptides are used to protect against radiation, be it ionizing radiation, UV radiation or electromagnetic radiation.
  • a peptide according to the invention is particularly preferably used for protection against ionizing radiation, in particular of normal tissue, in the radiation therapy of tumor patients.
  • ionizing radiation uses ionizing radiation to treat mostly malignant tumors.
  • the tumor tissue should be maximally damaged and at the same time the surrounding healthy normal tissue should be maximally protected.
  • a peptide according to the invention can be used ideally here since it is either local or, e.g. generalized about the bloodstream. Particularly in the case of the small peptides with the sequences SEQ ID No .: 1-3, a rapid and homogeneous distribution in the tissues is achieved, and thus also a quick protective activity against the radiation. In addition, all peptides according to the invention have a high stability and, at the same time, radioprotective activity both in an oxidizing and in a reducing environment, which further promotes their therapeutic usability.
  • a peptide according to the invention is preferably also used against UV radiation, in particular against the UV radiation of sunlight.
  • the peptides are very stable even under oxidizing conditions, for example in the air, and can have a long-lasting protective action against UV rays. They are therefore suitable to be used as skin protection against high sun radiation.
  • the use of the nona and heptapeptides according to the invention also has the Advantage that the peptides can penetrate the skin because of their small size and are long-lasting there.
  • the invention also relates to a pharmaceutical composition, in particular for intravenous administration, which contains one or more of the peptides according to the invention in a radioprotective effective amount.
  • the peptides can be prepared in the appropriate and customary galenics.
  • percutaneous administration or a local injection into areas of the body or body cavities directly affected by radiation for example, can also be considered.
  • the peptides develop their radioprotective action without simultaneously triggering threatening immune reactions. Because of their small size, the peptides according to the invention have only a low immunogenicity, so that under normal circumstances no allergic reactions are to be expected when the pharmaceutical composition is used on the human or animal body, and the peptides are not eliminated from the respective organism by means of antibodies become.
  • the invention also relates to a cosmetic composition for application to the skin, which is characterized in that it contains one or more of the peptides according to the invention in a radioprotectively effective amount.
  • a cosmetic composition can be presented, for example, as sun milk, skin cream or the like and then contains the usual constituents of such compositions such as oils, emulsions, pigments, etc.
  • the cosmetic composition also includes UV filters such as derivatives of p-aminobenzoic acid , Salicylic acid, cinnamic acid, dibenzoylmethane or the like may contain.
  • such a cosmetic composition offers ideal protection, above all against the UV radiation of sunlight. Since the peptides according to the invention even penetrate the skin due to their small size and are also long-lasting, long-term protection against radiation can be achieved in this way.
  • the invention further relates to a nucleic acid which has a sequence section coding for a peptide according to the invention and, if appropriate, control sequences necessary for the expression of the nucleic acid.
  • nucleic acid is advantageously used to produce a peptide according to the invention using molecular biological techniques, for which purpose it is preferably contained in an expression vector.
  • a peptide according to the invention by nucleic acid expression has the advantage of being a particularly simple possibility of producing the peptide in practically unlimited quantities and of modifying it in a simple manner by the corresponding coding sequence at the nucleic acid level is modified.
  • a number of standard methods are known for this, such as in vitro mutagenesis, site-directed mutagenesis, oligonucleotide synthesis, PCR, etc.
  • Either an in vitro expression system, for example a reticulocyte lysate, or the in vivo expression in bacteria, yeast or eukaryotic cells can be used as the expression system, suitable expression vectors being used in each case. Since the formation of disulfide bridges is not absolutely necessary for the radioprotective effect of the peptides according to the invention, expression can take place in bacteria in which disulfide bridges are not formed.
  • these can also be synthesized as fusion peptides, which means that sequences coding for amino acid sections or domains of known proteins are fused to the nucleic acids according to the invention, which then produces a continuous peptide during expression.
  • fused-on amino acid segments are, for example, so-called histidine tags, by means of which the expressed fusion proteins can be purified via nickel chelate columns, or antigenic determinants, which allow the peptides to be purified using suitable antibody affinity columns.
  • the native BBI is cleaved proteolytically and / or chemically.
  • This process can be based on a BBI purified from soybeans (seeds) or a BBI produced using molecular biology, and the radioprotectively active modified forms or fragments of the BBI are then obtained using (bio) chemical methods.
  • proteases which cleave the BBI for example pepsin, and / or chemical cleavages by cyanogen bromide can be used.
  • Figure 2 shows as a bar graph the chymotrypsin inhibitory activity of native and modified BBI
  • FIG. 4 shows the result of a clonogenic assay with selected fractions of the chromatography from FIG. 3 as a bar diagram
  • 5 shows as a bar graph the result of a clonogenic assay with BBI and four peptides according to the invention under ionizing radiation;
  • FIG. 6 shows, as a bar graph, the result of a clonogenic assay with BBI and four peptides according to the invention under UV radiation;
  • Figure 7 shows as a bar graph the chymotrypsin inhibitory activity of BBI and four peptides according to the invention.
  • FIG. 8 shows the trypsin inhibitory activity of BBI and four peptides according to the invention as a bar chart.
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagles Medium
  • secondary fibroblasts were trypsinized with 0.05% trypsin and 0.1% EDTA and seeded at a cell density of 50 cells per cm 2 in 6-well tissue culture dishes.
  • the cells were cultured with 2 ml DMEM with 20% fetal calf serum per well.
  • the medium was removed and the cells were incubated for 16 hours either in additive-free control medium (in the figures: "0") or in medium which in each case contained 10 ⁇ M of the BBI or a modified BBI form or a BBI fragment .
  • the nona and heptapeptides according to the invention were used at a concentration of 80 ⁇ M.
  • the radiation with ionizing radiation was carried out, the energy dose being either 2 or 4 Gray (Gy).
  • a 6 MeV linear accelerator (Mevatron, Siemens) was used for the irradiation.
  • the cells were then further cultured in BBI-free culture medium for eight days to allow colony formation. Then the cells were fixed, stained and counted, with "K” in the figures indicating the absolute number of clones counted.
  • a clone is a colony or a cell cluster that was created by dividing a cell within the 8-day cultivation.
  • the number of clones corresponds to the extent to which human fibroblasts have survived radiation.
  • the "clonogenic survival" of the cells is therefore also spoken of below. If many cells die when the cells are irradiated, only a few clones form after eight days; if many cells survive, many clones can be counted after 8 days of cultivation. Thus, the clonogenic survival of the cells after radiation is a direct measure of the radioprotective effect of the BBI products used.
  • BBI-A the BBI was first reduced and the cysteine residues were then alkylated with iodoacetamide in order to avoid reoxidation of the cysteine residues.
  • To this Reduction was 8 mg BBI in 0.5 ml PBS and 0.2 ml denaturation buffer (12.5 mM Tris pH 6.8, 80 ⁇ l EDTA, 1% SDS and 20% glycerol) in 20 ⁇ l fresh 2.6 M DTT solution boiled for 10 min.
  • the alkylation was carried out after the reduction by adding 70 ⁇ l of 20% iodoacetamide solution for 60 minutes at 20 ° C. The batches were then dialyzed four times against PBS for 24 hours.
  • BBI, BBI-R and BBI-A were either not treated with ionizing radiation (0 Gy) or irradiated with a single dose of 2 Gy.
  • BBI BBI
  • BBI-R reduced BBI
  • BBI-A alkylated BBI
  • the colored reaction product is detected at 405 nm in a spectrophotometer.
  • a control without BBI (0) was carried out as a control, the measured value of which was equated with 100% chymotrypsin activity (% CH).
  • the blank value with buffer alone is marked with "-" denotes and indicates the background of the buffer solution and the cuvette.
  • Fig. 2 The result of the chymotrypsin test is shown in Fig. 2. While the total BBI inhibits chymotrypsin activity by 80%, the reduced form of BBI (BBI-R) can only inhibit chymotrypsin activity by approx. 30%. In contrast, the reduced and alkylated form of BBI (BBI-A) is no longer able to inhibit chymotrypsin activity.
  • Example 2 Cleavage of the BBI with cyanogen bromide and pepsin and analysis of the cleavage products for protease inhibition and radioprotective activity
  • the total BBI was digested with cynaogen bromide (CNBr) and with the gastric enzyme pepsin.
  • CNBr cynaogen bromide
  • 50 mg of BBI were diluted in 1.5 ml of 70% formic acid.
  • 118 mg of cyanogen bromide added and the mixture incubated at 4 ° C for 20 hours.
  • the reaction mixture was diluted with water and lyphilized.
  • the lyophilisate was then digested with 340 U pepsin at pH 2.5 for 24 hours at 40 ° C. Formic acid was added to stop the digestive reaction.
  • the cleaved material was then separated by molecular sieve chromatography on a Sephadex G25 column. During the column run, 110 fractions were obtained, whose inhibitory activity against trypsin or chymotrypsin was examined in the protease inhibition test listed under 1.3.
  • fractions 30-50 There were a total of three peaks: one peak (Fl) in fractions 30-50, in which both trypsin-inhibiting activity and chymotrypsin-inhibiting activity was detectable, another peak (F2) in fraction 60, in which chymotrypsin-inhibiting Activity was detectable, and a third peak (F3) at fraction 72-73 in which chymotrypsin inhibitory activity was detectable.
  • the fractions contained in the first peak (F1) predominantly contain the uncleaved total BBI, which inhibits both trypsin and chymotrypsin.
  • fractions labeled F2 and F3 contain two cleavage products of the BBI, first the cleavage product with chymotrypsin-inhibiting activity (F2) and the cleavage product with trypsin-inhibiting activity (F3).
  • the three fractions F1, F2 and F3 were used in a clonogenic assay as described under 1.1.
  • the skin fibroblasts were treated with the fractions F1 to F3 for 16 hours with a single dose of 2 Gy for 16 hours before irradiation and their clonogenic survival compared to irradiated control cells (0) was analyzed without the addition of a BBI product.
  • fraction F2 ie the cleavage product with the chymotrypsin-inhibiting activity, even having a significantly higher radioprotective effect than uncleaved total BBI (Fl) or cleavage product with trypsin-inhibiting activity Activity (F3).
  • Example 3 Radioprotective effect of the nona and heptapeptides according to the invention In a further clonogenic assay (see 1.1), the radioprotective effect of a total of four BBI fragments according to the invention was investigated in comparison to total BBI.
  • BBI Total BBI
  • four peptides chemically synthesized by Merrifield synthesis were used in the test, the C-terminal amino acids of which had acetyl groups and the N-terminal amino acids of which had amide groups as protective groups.
  • the sequences of these peptides are given in the attached sequence listing.
  • the peptide P1 has the sequence SEQ ID No .: 1, its terminal cysteine residues being crosslinked via a disulfide bridge, so that the peptide P1 has a ring structure.
  • the peptide P2 has the sequence SEQ ID No .: 3. It contains no cysteine residues and therefore adopts a linear conformation.
  • the peptide P3 corresponds to the peptide P1 and thus has the sequence SEQ ID No .: 1, but its terminal cysteine residues are not crosslinked via a disulfide bridge.
  • the peptide P3 thus has a linear structure like P2.
  • the peptide P4 has the sequence SEQ ID No .: 2 and thus has a serine ⁇ valine amino acid exchange compared to the peptides PI and P3 which have the sequence SEQ ID No .: 1. Its terminal cysteine residues are not cross-linked via a disulfide bridge, so that the peptide P4 also has a linear structure.
  • the peptides P1, P3 and P4 are nonapeptides with nine amino acids, while the peptide P2 is a heptapeptide with only seven amino acids.
  • FIG. 1 A change from the procedure described under 1.1 was that the irradiation of the fibroblasts was carried out with a single dose of 4 Gy.
  • the total BBI was used at a concentration of 10 ⁇ M, and the peptides P1-P4 were each used at a concentration of 80 ⁇ M.
  • the peptides according to the invention thus show a protective action against ionizing radiation for human skin fibroblasts which is comparable to that of the total BBI, which is eight to ten times larger. It is shown in FIG. 6 that the peptides exert a protective effect not only against ionizing radiation but also against UV radiation, which is as high or higher than that of the total BBI.
  • Another clonogenic assay was carried out using the total BBI or the four peptides P1 to P4.
  • the irradiation was carried out here with UV-B radiation of 100 joules / m 2 .
  • the clonogenic survival of the human skin fibroblasts was increased by about 40% compared to the untreated cells when total BBI was added.
  • the addition of peptide P1 had an effect as pronounced as the addition of total BBI, and the addition of peptides P2 and P3 even showed a more pronounced effect, which was a further 20% higher than that of the total BBI.
  • the fragment P4 which has a base exchange from serine -> valine compared to the peptide P3, showed a lower effect on the clonogenic survival of the fibroblasts compared to the total BBI. Compared to the control (0), however, the addition of P4 also significantly increased the clonogenic survival of the skin fibroblasts.
  • protease inhibition test was carried out as described under 1.3.
  • the inhibition of chymotrypsin is shown in FIG. 7 and the inhibition of trypsin in FIG. 8.
  • the control designated 0 shows the chymotrypsin or trypsin activity in the absence of BBI or a peptide according to the invention.
  • the peptides according to the invention with a radioprotective effect therefore do not have the undesirable side effect of simultaneously blocking the digestive enzymes chymotrypsin and trypsin.
  • the blocking of these proteases produced in the pancreas (the pancreas) by protease inhibitors leads to serious damage to the pancreas.
  • the peptides according to the invention are therefore suitable for being used for radiation protection of humans, especially since the peptides P1 to P4 diffuse quickly due to their small size and can therefore be distributed well. Because of the small size of the peptides, immunological reactions are also not to be expected.
  • the peptides P1 to P4 have a particularly good effect in protecting against UV radiation, as was shown in exemplary embodiment 3 in connection with FIG. 6. Since the peptides, which contain only nine or seven amino acids, can even penetrate the skin, they are particularly well suited for protecting human skin against increased exposure to the sun. SEQUENCE LOG (5402P148WO)
  • MOLECULE TYPE Peptide
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  • MOLECULE TYPE Peptide
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Abstract

Es wird ein Peptid mit radioprotektiver Wirkung bereitgestellt, das eine modifizierte Form und/oder ein ggf. mofifiziertes Fragment des Bowman-Birk-Protease-Inhibitors (BBI) umfasst.

Description

Peptid mit radioprotektiver Wirkung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Peptid mit radioprotektiver Wirkung.
Ein derartiges Peptid ist bspw. aus der Publikation von Ditt- mann, K., et al. (1995): "Bowman-Birk proteinase inhibitor (BBI) modulates radiosensitivity and radiation-induced dif- ferentiation of human fibroblasts in culture", Radiotherapy and Oncology 34,, Seiten 137-143, bekannt. Unter einer radioprotektiven Wirkung eines Peptids wird dessen schützende Aktivität für Zellen, Gewebe oder Organismen gegenüber schädigender Strahlung verstanden. Für lebende Organismen besonders schädliche Strahlung ist ionisierende Strahlung sowie UV-Strahlung, also energiereiche Strahlungsarten. Ein Peptid weist dann eine radioprotektive Wirkung auf, wenn die durch Strahlung hervorgerufenen Schädigungen durch dieses Peptid reduziert werden. Die einer radioprotektiven Wirkung zugrundeliegenden Mechanismen sind derzeitig noch völlig ungeklärt.
Durch energiereiche Strahlung hervorgerufene Schäden sind bspw. die Veränderung von DNA, also die Mutagenese, die zu Tumorentstehung führen kann, jedoch auch die Degeneration, Atrophie, Fibrosierung oder Nekrose von Geweben, die hoher Strahlung ausgesetzt sind.
So wird bspw. die Entstehung des malignen Melanoms durch hohe Sonnenbelastung der Haut gefördert.
Der menschliche Organismus ist nicht nur bei hoher Sonnenlichtexposition, sondern auch während der Röntgendiagnostik oder bei einer Strahlentherapie von Tumorerkrankungen mit besonders hohen Strahlungsintensitäten konfrontiert.
Einen Schutz gegen UV-Strahlung bieten z.B. UV-filternde Substanzen wie sie bspw. in Sonnenmilch enthalten sind. Als Schutz gegen ionisierende Strahlung wird die Abschirmung nicht zu bestrahlender Körperteile und die möglichst präzise lokale Anwendung der Strahlung eingesetzt. In jüngster Zeit wurde erkannt, daß es Peptide gibt, die eine radioprotektive Wirkung entfalten können. Ein derartiges Peptid ist der eingangs erwähnte Bowman-Birk-Protease-Inhibitor (BBI), ein bereits seit langem bekannter Inhibitor der Serin-Proteasen Trypsin und Chymotrypsin, der in großer Menge in der Sojabohne enthalten ist.
Die Aminosäuresequenz des BBI ist bekannt, das entsprechende Gen der Sojabohne wurde bereits 1984 kloniert (Hammond, R.W. (1984): "Molecular Cloning and Analysis of a Gene Coding for the Bowman-Birk Protease Inhibitor in Soybean", J.Biol.Chem. 269, Seiten 9883-9890).
Der BBI umfaßt 71 Aminosäuren und weist ein Molekulargewicht von rund 8.000 Dalton auf. Eines der Charakteristika des BBI ist die Anzahl von vierzehn Cysteinresten, die sieben Disulfid- brücken ausbilden und somit die Faltung oder Sekundärstruktur des BBI wesentlich mitbestimmen.
Durch chemische und enzymatische Spaltung mit Cyanogenbromid (CNBr) und der Protease Pepsin wird der BBI in zwei Hälften gespalten, von denen die eine die Trypsin-inhibierende Aktivität und die andere die Chymotrypsin-inhibierende Aktivität aufweist (Odani, S. and Ikenaka, T. (1978): "Studies on Soybean Trypsin Inhibitors", J. Biochem. J33., Seiten 747-753).
Neben der Funktion als Protease-Inhibitor wurden zwei weitere physiologische Aktivitäten des BBI nachgewiesen, nämlich eine antikarzinogene und die bereits erwähnte radioprotektive Wirkung. In der Publikation von Clair, B.H.St. (1990) "Suppression of Dimethylhydrazine-induced Carcinogenesis in Mice by Dietary Addition of the Bowman-Birk Protease Inhibitor", Cancer Research 50, Seiten 580-586, wurde gezeigt, daß der BBI eine antikarzinogene Wirkung hat. Bei in vitro-Versuchen mit kultivierten Zellen zeigte sich, daß die Chymotrypsin-inhibierende Domäne eine maligne Transformation der Zellen verhindern konnte. Bei in vivo-Versuchen, bei denen mittels Karzinogenen Tumore bei Mäusen induziert wurden und der BBI oral verabreicht wurde, zeigte sich dagegen, daß die Trypsin-inhibierende Domäne des BBI zur Unterdrückung der Tumorbildung notwendig ist. Diese antikarzinogene Wirkung wird demnach direkt auf die Protease- inhibierende Wirkung des BBI zurückgeführt. Bei den in vivo- Versuchen wurde ferner nachgewiesen, daß autoklavierter, also hitzedenaturierter BBI, keine antikarzinogene Wirkung mehr entfalten konnte.
Die bereits erwähnte radioprotektive Wirkung des BBI wurde in der eingangs genannten Publikation von Dittmann et al. (1995) beschrieben. Hier konnte gezeigt werden, daß der BBI das durch Strahlung hervorgerufene Absterben von kultivierten humanen Fibroblasten reduziert. Fibroblasten sind Bindegewebszellen, die bspw. in großen Mengen in der Haut vorkommen.
In der US 5,376,373 wurde ein Verfahren vorgeschlagen, bei dem der durch Strahlung verursachte Gewichts- und Haarverlust dadurch inhibiert wird, daß ein aus Sojabohnen gewonnenes "Konzentrat", in dem der BBI enthalten ist, oral verabreicht wird. Bei der Isolierung des BBI-Konzentrats wird ein Sojabohnenextrakt mehrfach fragmentiert, präzipitiert, ultrafiltriert, verdünnt und wieder konzentriert, um das radio- protektive Produkt zu erhalten. Welche weiteren Bestandteile, bspw. weitere Protease-Inhibitoren oder ähnliches in dem Konzentrat enthalten sind, ist nicht bekannt.
Ein Problem bei der oralen Aufnahme des BBI mit der Nahrung besteht darin, daß an Ratten nachgewiesen wurde, daß große Mengen von Trypsininhibitoren zu einer Hypertrophie und Hyper- plasie von Pankreaszellen sowie zu Körpergewichtsverlust führt. Bei Ratten, die für längere Zeiträume Trypsininhibitoren aus Sojabohnen mit der Nahrung aufnahmen, entwickelten sich sogar Pankreastumore .
Ein weiteres Problem bei der Verabreichung von Serin-Protease- Inhibitoren, vor allem bei einer intravenösen Verabreichung, besteht darin, daß die Blutgerinnung, an der Serin-Proteasen maßgeblich beteiligt sind, gestört werden kann.
Vor diesem Hintergrund ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Peptid mit radioprotektiver Wirkung bereitzustellen, das mit geringem Aufwand herzustellen ist und bei dem die Nachteile der bereits bekannten radioprotektiven Produkte vermieden werden .
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß ein Peptid mit radioprotektiver Wirkung eine modifizierte Form und/oder ein ggf. modifiziertes Fragment des Bowman-Birk- Protease-Inhibitors umfaßt.
Die Erfinder haben nämlich überraschenderweise festgestellt, daß auch strukturell modifizierte Formen und sogar Fragmente des BBI eine radioprotektive Aktivität aufweisen. Es ist somit nun nicht mehr nötig, den BBI in seiner nativen Form bereitzustellen, um ein Peptid mit der gewünschten radioprotektiven Wirkung zu erhalten.
Dabei wird unter modifiziert im Sinne der Erfindung jede Änderung der Struktur bzw. Konformation des BBI sowie jede Abwandlung seiner Aminosäureabfolge verstanden, sei es durch chemisches oder enzymatisches Hinzufügen oder Wegnehmen einzelner Gruppen von Aminosäuren oder durch Austausch einzelner Aminosäuren. Eine modifizierte Form des BBI beinhaltet auch ein Peptid, bei dem weitere Aminosäuren an das N- oder C-terminale Ende des BBI angehängt wurden, bspw. Domänen weiterer Proteine oder Peptide, die die Reinigung des BBI erleichtern und/oder dessen radioprotektive Wirkung noch verstärken.
Unter einem Fragment im Sinne der Erfindung wird jedes Teilstück des BBI verstanden, bei dem entweder nur einzelne Aminosäuren oder größere Aminosäureabschnitte des BBI fehlen. Derartige Fragmente umfassen bspw. einzelne Domänen des BBI. Erfindungsgemäß können solche Fragmente auch modifiziert im oben dargelegten Sinne sein.
Modifizierte Formen des BBI oder BBI-Fragmente können entweder durch Behandlung des nativen, also unveränderten BBI mit Chemikalien oder Enzymen oder durch Synthese mit chemischen oder molekularbiologischen Methoden erzeugt werden.
Daß auch modifizierte Formen oder Fragemente des BBI eine radioprotektive Wirkung aufweisen können, war nicht zu erwarten, da üblicherweise Modifikationen, vor allem wenn sie die Konformation des Peptids betreffen, die physiologischen Aktivitäten eines Peptids zerstören oder zumindest stark reduzieren.
Darüber hinaus war für die antikarzinogene Aktivität des BBI gezeigt worden, daß durch Beeinträchtigung der BBI-Struktur durch Hitzedenaturierung dessen antikarzinogene Wirkung völlig verloren ging.
Modifizierte Formen oder Fragmente des BBI sind problemlos zu handhaben, weil sowohl während deren Herstellung als auch Aufbewahrung nicht darauf geachtet werden muß, daß ein Kontakt mit modifizierenden Agenzien, Proteasen oder ähnlichem ausgeschlossen ist.
Somit wird die der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe vollkommen gelöst.
In einer bevorzugten Ausgestaltung weist das neue Peptid keine Protease-inhibierende Wirkung gegen Trypsin und Chymotrypsin auf.
Ein derartiges Peptid hat den erheblichen Vorteil, neben der radioprotektiven Wirkung nicht gleichzeitig zusätzlich noch die Proteasen Trypsin oder Chymotrypsin zu blockieren. Dies ist besonders dann vorteilhaft, wenn das Peptid zum Schutz von Zellen, Geweben oder Organismen gegen Strahlung eingesetzt werden soll, denn, wie oben bereits erläutert wurde, sind zumindest Peptide mit Trypsin-inhibierender Wirkung schädlich für Pankreaszellen und können sogar zur Tumorbildung führen. Die Tatsache, daß modifizierte Formen des BBI radioprotektiv wirksam sind, ohne zugleich eine Protease-inhibierenden Aktivität gegen Trypsin und Chymotrypsin zu haben, war umso erstaunlicher, als bisher davon ausgegangen wurde, daß für die weitere Aktivität des BBI, nämlich seine antikarzinogene Wirkung, eine dieser Protease-inhibierenden Domänen notwendig sei (Clair et al., 1990).
Ein erfindungsgemäßes Peptid hat eine einzige wohl-definierte Wirkung, nämlich dem Schutz vor Strahlung. Wenn es in Anwesenheit von Trypsin und Chymotrypsin eingesetzt wird, werden diese Serin-Proteasen nicht gleichzeitig in ihrer Aktivität behindert. So werden auch die oben aufgeführten Pankreas-schädigen- den Nebenwirkungen vermieden.
In einer weiteren bevorzugten Ausgestaltung weist das Peptid zumindest zwei Cysteinreste auf, die in reduzierter Form vorliegen.
Diese Maßnahme hat den Vorteil, daß ein derartiges Peptid auch in Anwesenheit von reduzierenden Agenzien als radioprotektives Agens eingesetzt werden kann. Reduzierende Agenzien führen bei Peptiden, die Cysteinreste enthalten, dazu, daß ihre Schwefelreste protoniert werden und damit als SH-Gruppen vorliegen. Unter oxidierenden Bedingungen bilden die SH-Gruppen untereinander Disulfidbrücken aus, die die Faltung des Peptids wesentlich mitbestimmen.
Reduzierte Agenzien werden häufig bei der Reinigung von Proteinen und Peptiden eingesetzt. Unter physiologischen Bedingungen liegen im Inneren von Zellen aufgrund der Anwesenheit von Glutathion reduzierende Bedingungen vor.
Die Bereitstellung eines Peptids, dessen Cysteinreste in reduzierter Form vorliegen, hat den weiteren Vorteil, daß es problemlos mit molekularbiologischen Methoden in Bakterien hergestellt werden kann. Eine solche Expression in Bakterien ist gegenüber der Expression in Hefen und höheren eukaryontischen Zellen wesentlich einfacher und effizienter und erlaubt besonders hohe Ausbeuten. Für Proteine oder Peptide, bei denen die Cysteinreste über Disulfidbrücken kovalent miteinander verbunden sind, ist dieses System jedoch ungeeignet, da in Bakterien keine Disulfidbrücken ausgebildet werden können. Eine reduzierte Form des BBI kann dagegen ohne weiteres in Bakterien exprimiert werden.
In einer weiteren bevorzugten Ausgestaltung liegen zumindest einige der Aminosäurereste des Peptids in alkylierter Form vor.
Unter Alkylierung versteht man die Modifikation einzelner Aminosäuren mit Alkylgruppen, meist Methylgruppen. Diese Modifikation erfolgt mit sogenannten Alkylierungsreagenzien, bspw. mit Jodacetamid.
Durch die Behandlung des BBI mit Jodacetamid nach Reduktion der Disulfidbrücken werden die SH-Gruppen der Cysteine mit einer Methylgruppe versehen, also alkyliert. Eine Reoxidation der SH- Gruppen ist dann nicht mehr möglich. So wird selbst unter oxi- dierenden Bedingungen verhindert, daß sich die Disulfidbrücken wieder ausbilden. Eine Alkylierung des BBI oder von Fragmenten des BBI hat den Vorteil, die Cysteinreste in ihrer reduzierten Form zu erhalten und damit zu stabilisieren.
In einer weiteren bevorzugten Ausgestaltung weist das Peptid weniger als 20, höchst vorzugsweise weniger als zehn Aminosäuren auf.
Ein solches drastisch verkleinertes BBI-Fragment hat den erheblichen Vorteil, sich bei seinem Einsatz auf Zellen, Geweben oder im ganzen Organismus aufgrund der geringen Größe wesentlich besser und schneller zu verteilen und einzudringen als der über 70 Aminosäuren umfassende Gesamt-BBI.
Eine gute Verteilung sowie ein leichtes Eindringen in das Gewebe ist bei der Verwendung des Peptids als Radioprotektor wesentlich, da es dann schnell und umfassend seine schützende Wirkung gegen Strahlung entfalten kann.
In einer weiter bevorzugten Ausführung ist das Peptid ein Nona- peptid und weist die Sequenz SEQ ID-Nr.: 1 aus dem anliegenden Sequenzprotokoll auf.
Wie den Ausführungsbeispielen zu entnehmen ist, ist es den Erfindern gelungen, nachzuweisen, daß dieses Nonapeptid eine ebenso hohe radioprotektive Wirkung auf menschliche Fibroblasten ausübt wie der Gesamt-BBI. Der Einsatz eines gegenüber dem Gesamt-BBI sehr stark verkleinerten Peptids, das nur neun Aminosäuren umfaßt (Nonapeptid), hat den wesentlichen Vorteil, daß dieses Nonapeptid leichter hergestellt werden kann. Ein Nonapeptid kann nämlich problemlos durch chemische Synthese, auch Merrifield-Synthese genannt, produziert werden. Diese Art der Peptidsynthese ist eine weit verbreitete und gut etablierte Synthesemethode, durch die ein derartiges Peptid in großen Mengen und in hoher Reinheit gewonnen werden kann.
In einer weiteren bevorzugten Ausführung ist das Peptid ein Nonapeptid mit der Sequenz SEQ ID-Nr. : 2 aus dem anliegenden Sequenzprotokoll .
Bei diesem Nonapeptid wurde die aus dem natürlich vorkommenden BBI entnommene Sequenz um eine Aminosäure abgewandelt. Das Serin aus der Sequenz SEQ ID-Nr.: 1, also eine hydrophile Aminosäure, wurde in der SEQ ID-Nr.: 2 gegen ein Valin, also eine hydrophobe Aminosäure ausgetauscht. Auch für dieses modifizierte Peptid konnte eine radioprotektive Wirkung nachgewiesen werden, wie aus den Ausführungsbeispielen ersichtlich ist. Auch dieses modifizierte Nonapeptid mit der Sequenz SEQ ID-Nr.: 2 kann problemlos mittels Merrifield-Synthese synthetisiert werden.
In einer weiteren bevorzugten Ausführung sind die terminalen Cysteinreste der Peptide mit den Sequenzen SEQ ID-Nr.: 1 und 2 kovalent miteinander verbunden.
Auf diese Weise entstehen ringförmige oder zyklische Peptide, die in einem oxidierenden Milieu eine hohe Stabilität aufweisen. Ein oxidierendes Milieu liegt bspw. in der extrazellulären Matrix des Bindegewebes sowie an allen Körperteilen vor, die Kontakt mit der Außenluft haben. Da sowohl die linearen als auch die zyklischen Peptide mit den Sequenzen SEQ ID-Nr.: 1 und 2 eine radioprotektive Wirkung aufweisen, sind diese sowohl in reduzierender als auch in oxidie- render Umgebung als Strahlenschutz wirksam und somit universell einsetzbar.
In einer weiteren bevorzugten Ausführung weist das Peptid die Sequenz SEQ ID-Nr.: 3 aus dem anliegenden Sequenzprotokoll auf.
Dieses Peptid umfaßt nur sieben Aminosäuren, es ist also ein Heptapeptid. Durch die weitere Verkürzung des Peptids unter Erhalt seiner radioprotektiven Wirkung ist das Peptid noch schneller und preiswerter herzustellen sowie leichter zu appli- zieren.
Alle Peptide mit den Sequenzen SEQ ID-Nr.: 1 - 3, seien sie ringförmig oder linear, haben den erheblichen Vorteil, keine Protease-inhibierende Aktivität zu haben. Sie können somit ohne die unerwünschte Nebenwirkung der Blockierung der Verdauungsenzyme Trypsin und Chymotrypsin und anderer Serin-Proteasen eingesetzt werden.
In einer weiteren bevorzugten Ausgestaltung weist zumindest eine der Aminosäuren des Peptids eine Schutzgruppe auf.
Derartige Schutzgruppen können beliebige der in der Peptid- chemie bekannten Schutzgruppen sein, wobei es bevorzugt ist, daß die C-terminale Aminosäure eine Acetylgruppe und/oder die N-terminale Aminosäure eine Amidgruppe aufweist. Diese Schutzgruppen haben den Vorteil, die Peptide vor dem Angriff von Exopeptidasen zu schützen, so daß die Peptide in einem biologischen Milieu wie bspw. in der Zellkultur oder im Organismus eine wesentlich höhere Stabilität haben. Schutzgruppen, die die C-terminale Carboxyl- und die N-terminale Ami- nogruppe von Peptiden blockieren, wie die genannten Acetyl- bzw. Amidgruppen, sorgen ferner dafür, daß die Peptide keine weiteren Peptidbindungen mit anderen Peptiden oder untereinander eingehen, so daß auch Tandemisierungen der Peptide sicher verhindert werden. Bei mehreren untereinander verknüpften Peptiden kann nicht mehr sicher davon ausgegangen werden, daß die radioprotektive Wirkung erhalten ist.
Demnach sorgen die Schutzgruppen auch dafür, daß die Peptide in ihrer radioprotektiven wirksamen Struktur erhalten bleiben.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung eines oder mehrerer der genannten Peptide als radioprotek- tives Agens.
Diese Verwendung als radioprotektives Agens umfaßt jede Verwendung, bei der die Peptide zum Schutz gegen Strahlung, sei es ionisierende Strahlung, UV-Strahlung oder elektromagnetische Strahlung, eingesetzt werden.
Besonders bevorzugt wird ein erfindungsgemäßes Peptid zum Schutz gegen ionisierende Strahlung, insbesondere von Normalgewebe bei der Strahlentherapie von Tumorpatienten, eingesetzt. Bei einer derartigen Strahlentherapie werden nämlich ionisierende Strahlungen zur Behandlung meist maligner Tumoren verwendet. Dabei soll das Tumorgewebe maximal geschädigt werden und gleichzeitig das umgebende gesunde Normalgewebe maximal geschont werden.
Um die Belastung des Normalgewebes möglichst gering zu halten, wird die Strahlung wenn möglich lokalisiert eingesetzt. Sehr problematisch ist jedoch der Schutz des in der direkten Umgebung des Tumorgewebes liegenden Normalgewebes. Hier kann ein erfindungsgemäßes Peptid ideal eingesetzt werden, da es entweder lokal oder, z.B. über die Blutbahn, generalisiert eingesetzt werden kann. Insbesondere bei den kleinen Peptiden mit den Sequenzen SEQ ID-Nr.: 1 - 3 wird eine schnelle und homogene Verteilung in den Geweben erreicht, und somit auch eine schnelle schützende Wirksamkeit gegenüber der Strahlung. Zudem weisen alle erfindungsgemäßen Peptide sowohl in oxidierender als auch in reduzierender Umgebung eine hohe Stabilität und zugleich radioprotektive Wirksamkeit auf, was ihre therapeutische Verwendbarkeit zusätzlich begünstigt.
Bevorzugt wird ein erfindungsgemäßes Peptid auch gegen UV- Strahlung, insbesondere gegen die UV-Strahlung des Sonnenlichts eingesetzt.
Hierbei ist vorteilhaft, daß die Peptide auch unter oxidieren- den Bedingungen, also bspw. an der Luft, sehr beständig sind und eine lang anhaltende Schutzwirkung gegen UV-Strahlen ausüben können. Sie sind damit geeignet, als Hautschutz gegen hohe Sonneneinstrahlungen eingesetzt zu werden. Der Einsatz der erfindungsgemäßen Nona- und Heptapeptide hat ferner den Vorteil, daß die Peptide wegen ihrer geringen Größe in die Haut eindringen können und dort lange beständig sind.
Die Erfindung betrifft außerdem eine pharmazeutische Zusammensetzung, insbesondere zur intravenösen Verabreichung, die eines oder mehrere der erfindungsgemäßen Peptide in einer radioprotektiven wirksamen Menge enthält.
Dazu können die Peptide in den jeweils angemessenen und üblichen Galeniken zubereitet sein. Neben einer intravenösen Verabreichung kann auch eine perkutane Verabreichung oder eine lokale Injektion in bspw. durch Bestrahlung direkt betroffene Körpergebiete oder Körperhöhlen in Betracht gezogen werden.
Bei einer derartigen pharmazeutischen Zusammensetzung ist vorteilhaft, daß die Peptide ihre radioprotektive Wirkung entfalten, ohne gleichzeitig bedrohliche Immunreaktionen auszulösen. Aufgrund ihrer geringen Größe haben die erfindungsgemäßen Peptide nämlich nur eine geringe Immunogenität , so daß unter normalen Umständen bei Verwendung der pharmazeutischen Zusammensetzung am menschlichen oder tierischen Körper keine allergischen Reaktionen zu erwarten sind, und die Peptide auch nicht unter Vermittlung von Antikörpern aus dem jeweiligen Organismus eliminiert werden.
Die Erfindung betrifft auch eine kosmetische Zusammensetzung zum Auftragen auf die Haut, die dadurch gekennzeichnet ist, daß sie eines oder mehrere der erfindungsgemäßen Peptide in einer radioprotektiv wirksamen Menge enthält. Eine derartige kosmetische Zusammensetzung kann bspw. als Sonnenmilch, Hautcreme oder ähnliches dargereicht werden und enthält dann die üblichen Bestandteile derartiger Zusammensetzungen wie Öle, Emulsionen, Pigmente usw. Es versteht sich, daß die kosmetische Zusammensetzung zusätzlich auch UV-Filter wie Derivate von p-Aminobenzoesäure, Salizylsäure, Zimtsäure, Dibenzoylmethan oder ähnliches enthalten kann.
Durch die radioprotektive Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Peptide bietet eine solche kosmetische Zusammensetzung einen idealen Schutz vor allem gegen die UV-Strahlung des Sonnenlichts. Da die erfindungsgemäßen Peptide aufgrund ihrer geringen Größe sogar in die Haut eindringen und zudem lange beständig sind, kann so ein Langzeitschutz gegen Strahlung erreicht werden .
Die Erfindung betrifft ferner eine Nukleinsäure, die einen für ein erfindungsgemäßes Peptid codierenden Sequenzabschnitt sowie ggf. zur Expression der Nukleinsäure notwendige Kontrollsequenzen aufweist.
Eine derartige Nukleinsäure wird vorteilhafterweise zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Peptids mit molekularbiologischen Techniken verwendet, wozu sie bevorzugt in einem Expressionsvektor enthalten ist.
Die Herstellung eines erfindungsgemäßen Peptids durch Nuklein- säureexpression hat den Vorteil, eine besonders einfache Möglichkeit zu sein, das Peptid in praktisch unbegrenzten Mengen herzustellen und auf einfache Art und Weise abzuwandeln, indem die entsprechende codierende Sequenz auf Nukleinsäureebene modifiziert wird. Hierfür sind eine Reihe von Standardverfahren wie in vitro-Mutagenese, site-directed mutagenesis, Oligo- nukleotidsynthese, PCR usw. bekannt.
Als Expressionssystem kann entweder ein in vitro-Expressions- system, bspw. ein Retikulozyten-Lysat, oder die in vivo-Expres- sion in Bakterien, Hefen oder eukaryontischen Zellen eingesetzt werden, wobei jeweils geeignete Expressionsvektoren verwendet werden. Da zur radioprotektiven Wirkung der erfindungsgemäßen Peptide die Ausbildung von Disulfidbrücken nicht unbedingt notwendig ist, kann die Expression in Bakterien, in denen Disulfidbrücken nicht ausgebildet werden, erfolgen.
Zur Erleichterung der Herstellung und Reinigung der erfindungsgemäßen Peptide können diese auch als Fusionspeptide synthetisiert werden, was bedeutet, daß für Aminosäureabschnitte oder Domänen bekannter Proteine codierende Sequenzen an die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren anfusioniert werden, wodurch bei der Expression dann ein durchgehendes Peptid erzeugt wird. Beispiele für solche anfusionierten Aminosäureabschnitte sind bspw. sogenannte Histidin-Tags, durch die exprimierte Fusionsproteine über Nickel-Chelat-Säulen gereinigt werden können, oder antigene Determinanten, die es erlauben, die Peptide über geeignete Antikörperaffinitätssäulen zu reinigen.
Bei einem alternativen bevorzugten Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Peptids wird der native BBI proteo- lytisch und/oder chemisch gespalten. Bei diesem Verfahren kann von einem aus Sojabohnen(samen) gereinigten BBI oder molekularbiologisch hergestellten BBI ausgegangen werden, und die radioprotektiv wirksamen modifizierten Formen oder Fragmente des BBI werden daraus dann mit (bio)- chemischen Methoden gewonnen. Dabei können z.B. Proteasen verwendet werden, die den BBI spalten, bspw. Pepsin, und/oder chemische Spaltungen durch Cyanogenbromid erfolgen.
Es versteht sich, daß die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in den jeweils angegebenen Kombinationen, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung verwendbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.
Weitere Vorteile ergeben sich aus den folgenden Ausführungs- beispielen und im Zusammenhang mit der Zeichnung, in der:
Fig. 1 das Ergebnis eines sogenannten klonogenen Assays mit nativem und modifiziertem BBI in Form eines Balkendiagramms zeigt;
Fig. 2 als Balkendiagramm die Chymotrypsin-inhibierende Aktivität von nativem und modifiziertem BBI zeigt;
Fig. 3 das Elutionsprofil einer chromatographischen Auf- trennung von BBI und BBI-Fragmenten zeigt;
Fig. 4 als Balkendiagramm das Ergebnis eines klonogenen Assays mit ausgewählten Fraktionen der Chromatographie aus Fig. 3 zeigt; Fig. 5 als Balkendiagramm das Ergebnis eines klonogenen Assays mit BBI und vier erfindungsgemäßen Peptiden unter ionisierender Strahlung zeigt;
Fig. 6 als Balkendiagramm das Ergebnis eines klonogenen Assays mit BBI und vier erfindungsgemäßen Peptiden unter UV-Bestrahlung zeigt;
Fig. 7 als Balkendiagramm die Chymotrypsin-inhibierende Aktivität von BBI und vier erfindungsgemäßen Peptiden zeigt; und
Fig. 8 als Balkendiagramm die Trypsin-inhibierende Aktivität von BBI und vier erfindungsgemäßen Peptiden zeigt.
Beispiel 1 Radioprotektive Wirkung sowie Protease-inhibie- rende Aktivität von BBI und modifizierten BBI- Formen
A Radioprotektive Wirkung
Die Untersuchung der radioprotektiven Wirkung des BBI sowie modifizierter Formen des BBI wurde im sogenannten klonogenen Assay durchgeführt, der bspw. bei Dittmann, K. et al., Radio- therapy and Oncology 34. (1995), Seiten 137-143, beschrieben ist und der im folgenden kurz erläutert wird. 1.1 Klonogener Assay
Normale humane Fibroblasten wurden in Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM) mit 10 % fötalem Kälberserum unter Standardbedingungen kultiviert. Bei jeder Zellpassage wurde die Zellzahl bestimmt und die Zellen beim Anlegen von Subkulturen mit einer Dichte von 2 x 104 pro cm2 ausgesät.
Für den klonogenen Assay wurden sekundäre Fibroblasten mit 0,05 % Trypsin und 0,1 % EDTA trypsiniert und mit einer Zelldichte von 50 Zellen pro cm2 in 6-Well-Gewebekulturschalen ausgesät. Die Zellen wurden mit 2 ml DMEM mit 20 % fötalem Kälberserum je Vertiefung (Well) kultiviert.
Nach 24 Stunden wurde das Medium entfernt und die Zellen entweder in zusatzfreiem Kontrollmedium (in den Figuren: "0") oder in Medium, das jeweils 10 μM des BBI oder einer modifizierten BBI-Form oder eines BBI-Fragmentes enthielt, für 16 Stunden inkubiert. Die erfindungsgemäßen Nona- und Heptapeptide (siehe Beispiel 3) wurden mit einer Konzentration von 80 μM eingesetzt.
Danach erfolgte die Bestrahlung mit ionisierender Strahlung, wobei die Energiedosis entweder 2 oder 4 Gray (Gy) betrug. Diese Energiedosis entspricht der gesamten umgesetzten Strahlungsenergie in der Masseneinheit Joule/kg = (Gray) . Zur Bestrahlung wurde ein 6 MeV-Linearbeschleuniger (Mevatron, Firma Siemens) verwendet.
Danach wurden die Zellen in BBI-freiem Kulturmedium für acht Tage weiter kultiviert, um eine Koloniebildung zu erlauben. Dann wurden die Zellen fixiert, gefärbt und ausgezählt, wobei in den Figuren "K" die absolute Anzahl an ausgezählten Klonen angibt.
Ein Klon ist dabei eine Kolonie oder ein Zellhaufen, der durch Teilung einer Zelle innerhalb der 8-tägigen Kultivierung entstanden ist. Die Anzahl an Klonen entspricht dem Ausmaß, in dem die menschlichen Fibroblasten die Bestrahlung überlebt haben. Es wird daher im folgenden auch von dem "klonogenen Überleben" der Zellen gesprochen. Wenn bei der Bestrahlung der Zellen viele Zellen sterben, so bilden sich nach acht Tagen nur wenige Klone aus, überleben viele Zellen, so lassen sich nach 8-tägi- ger Kultivierung viele Klone auszählen. Somit ist das klonogene Überleben der Zellen nach Bestrahlung ein direktes Maß für die radioprotektive Wirkung der eingesetzten BBI-Produkte .
1.2 Radioprotektive Wirkung von BBI und modifizierten BBI- Formen
Bei dem klonogenen Assay, dessen Ergebnis in Fig. 1 gezeigt ist, wurden vier verschiedene Ansätze getestet: Bei dem mit "0" bezeichneten Kontrollansatz wurde kein BBI eingesetzt. Bei dem mit "BBI" bezeichneten Ansatz wurde Gesamt-BBI (von der Firma Sigma Biochemicals ) eingesetzt, bei dem mit "BBI-R" bezeichneten Ansatz war der Gesamt-BBI mit dem reduzierenden Agens Dithiothreitol (DTT) vorbehandelt worden, so daß alle Disulfidbrücken des BBI aufgespalten waren.
Bei dem mit "BBI-A" bezeichneten Ansatz wurde der BBI zunächst reduziert und die Cysteinreste dann mit Jodacetamid alkyliert, um eine Reoxidation der Cysteinreste zu vermeiden. Zu dieser Reduktion wurden 8 mg BBI in 0,5 ml PBS und 0,2 ml Denaturie- rungspuffer (12,5 mM Tris pH 6,8, 80 μl EDTA, 1 % SDS und 20 % Glycerin) in 20 μl frischer 2,6 M DTT-Lösung für 10 min gekocht. Die Alkylierung erfolgte nach der Reduktion durch Zusatz von 70 μl 20%iger Jodacetamid-Lösung für 60 Minuten bei 20 °C. Danach wurden die Ansätze viermal gegen PBS für 24 Stunden dialysiert.
Die vier Ansätze 0, BBI, BBI-R und BBI-A wurden entweder nicht mit ionisierender Strahlung behandelt (0 Gy) oder mit einer Einzeldosis von 2 Gy bestrahlt.
Dieser Test wurde in mehreren unabhängigen Experimenten wiederholt und die jeweiligen Ergebnisse gemittelt. Die Fehlerbalken geben die Streubreite der Werte an.
Wie Fig. 1 zu entnehmen ist, beeinflußt der Zusatz von BBI, reduziertem BBI oder reduziertem und alkyliertem BBI ohne Bestrahlung (0 Gy) das Überleben der Zellen im Rahmen der Meßgenauigkeit nicht. Ohne Zusatz von BBI (0) wird das klonogene Überleben von menschlichen Hautfibroblasten nach Bestrahlung mit einer Einzeldosis von 2 Gy um ca. 30 bis 40 % reduziert.
Eine 16-stündige Vorbehandlung mit BBI (BBI), reduziertem BBI (BBI-R) oder reduziertem und alkyliertem BBI (BBI-A) führte zu einer signifikanten Steigerung des klonogenen Überlebens der bestrahlten menschlichen Hautfibroblasten um 20 - 30 %.
Signifikante Unterschiede zwischen BBI, BBI-R und BBI-A waren im Rahmen der Meßgenauigkeit nicht nachweisbar. Das in Fig. 1 gezeigte Ergebnis des klonogenen Assays belegt, daß modifizierte Formen des BBI, nämlich dessen reduzierte Form oder reduzierte und alkylierte Form, eine ebenso hohe radioprotektive Wirkung wie der unveränderte BBI aufweisen.
B Inhibitor-Wirkung
Als nächsts wurde untersucht, ob die modifizierten Formen des BBI als Protease-Inhibitoren gegenüber Chymotrypsin wirken oder nicht. Dazu wurde ein Protease-Inhibitionstest durchgeführt, der im folgenden kurz erläutert wird.
1.3 Protease-Inhibitionstest
Ein Ansatz mit 50 μl TLCK-behandeltem Chymotrypsin (0,1 mg/ml) wurde mit 50 μl einer Lösung mit BBI (BBI), reduziertem BBI (BBI-R) oder reduziertem und alkyliertem BBI (BBI-A) zusammen mit 50 μl PBS und 50 μl des Chymotrypsin-Substrats Acetyl-A-A- P-F-pNa (0,5 mg/ml von Bachern Heidelberg, BRD) in 12,5 % DMSO, 87,5 % PBS für 10 Minuten inkubiert. Das farbige Reaktionsprodukt wird bei 405 nm in einem Spektrophotometer nachgewiesen.
Sollte die Inhibition der Protease Trypsin (siehe Beispiel 4, Fig. 8) bestimmt werden, so wurde als Substrat das Peptid CBZ- R-pNA (1 mg/ml) sowie TPCK-behandeltes Trypsin (0,1 mg/ml) verwendet und der Test im übrigen wie beschrieben durchgeführt.
Als Kontrolle wurde ein Ansatz ohne BBI (0) durchgeführt, dessen Meßwert mit 100 % Chymotrypsinaktivität (% CH) gleichgesetzt wurde. Der Blankwert mit Puffer allein ist mit "-" bezeichnet und gibt den Hintergrund der Pufferlösung und der Küvette an.
1.4 Inhibition von Chymotrypsin durch BBI und modifzierte BBI- Foπnen
Das Ergebnis des Chymotrypsin-Tests ist in Fig. 2 gezeigt. Während der Gesamt-BBI die Chymotrypsinaktivität um 80 % inhibiert, kann die reduzierte Form des BBI (BBI-R) die Chymotrypsinaktivität nur um ca. 30 % inhibieren. Dagegen ist die reduzierte und alkylierte Form des BBI (BBI-A) nicht mehr dazu in der Lage, die Chymotrypsinaktivität zu inhibieren.
Die bei einem Einsatz der modifizierten Formen des BBI (BBI-R und BBI-A) als radioprotektive Agenzien unerwünschte Nebenwirkung, daß Chymotrypsin, ein Verdauungsenzym, gleichzeitig inhibiert wird, ist somit bei den modifizierten BBI-Formen stark reduziert oder fehlt völlig.
Beispiel 2 Spaltung des BBI mit Cyanogenbromid und Pepsin sowie Analyse der Spaltprodukte auf Protease- Inhibition und radioprotektive Aktivität
In diesem Experiment wurde nachgewiesen, daß auch Teilfragmente des BBI eine radioprotektive Wirkung aufweisen.
2.1 Spaltung des BBI
Der Gesamt-BBI wurde mit Cynaogenbromid (CNBr) und mit dem Magenenzym Pepsin verdaut. Dazu wurden 50 mg BBI in 1,5 ml 70%iger Ameisensäure verdünnt. Dann wurden 118 mg Cyanogen- bromid zugegeben und der Ansatz 20 Stunden bei 4°C inkubiert. Das Reaktionsgemisch wurde mit Wasser verdünnt und lyphili- siert. Das Lyophilisat wurde dann mit 340 U Pepsin bei pH 2,5 für 24 Stunden bei 40°C verdaut. Um die Verdauungsreaktion zu beenden, wurde Ameisensäure hinzugegeben.
2.2 Auftrennung der Spaltungsprodukte
Das gespaltene Material wurde dann durch Molekularsieb-Chromatographie auf einer Sephadex G25-Säule aufgetrennt. Während des Säulenlaufs wurden 110 Fraktionen gewonnen, deren inhibitorische Aktivität gegenüber Trypsin oder Chymotrypsin in dem unter 1.3 aufgeführten Protease-Inhibitionstest untersucht wurde .
2.3 Protease-Inhibition
Fig. 3 zeigt das Ergebnis der Protease-Inhibition der einzelnen Säulenfraktionen, wobei die punktförmigen Symbole die Trypsin- inhibierende Aktivität (anti Trypsin) und die rautenförmigen Symbole die Chymotrypsin-inhibierende Aktivität (anti Chymotrypsin) darstellen.
Es zeigten sich insgesamt drei Peaks: ein Peak (Fl) bei den Fraktionen 30-50, in dem sowohl Trypsin-inhibierende Aktivität als auch Chymotrypsin-inhibierende Aktivität nachweisbar war, ein weiterer Peak (F2) bei Fraktion 60, in dem Chymotrypsin- inhibierende Aktivität nachweisbar war, und ein dritter Peak (F3) bei Fraktion 72-73, in dem Chymotrypsin-inhibierende Aktivität nachweisbar war. Die in dem ersten Peak (Fl) enthaltenen Fraktionen beinhalten vorwiegend den ungespaltenen Gesamt-BBI, der sowohl Trypsin als auch Chymotrypsin inhibiert. Die mit F2 und F3 bezeichneten Fraktionen enthalten zwei Spaltprodukte des BBI, einmal das Spaltprodukt mit Chymotrypsin-inhibierender Aktivität (F2) und das Spaltprodukt mit Trypsin-inhibierender Aktivität (F3).
2.4 Klonogener Assay
Die drei Fraktionen Fl, F2 und F3 wurden in einen klonogenen Assay eingesetzt, wie er unter 1.1 beschrieben wurde. Die Haut- fibroblasten wurden vor der Bestrahlung mit einer Einzeldosis von 2 Gy für 16 Stunden mit den Fraktionen Fl bis F3 behandelt und deren klonogenes Überleben im Vergleich zu bestrahlten Kontrollzellen (0) ohne Zusatz eines BBI-Produktes analysiert.
Alle drei Fraktionen zeigten gemäß Fig. 4 eine deutliche Steigerung des klonogenen Überlebens, wobei die Fraktion F2, also das Spaltprodukt mit der Chymotrypsin-inhibierenden Aktivität, sogar einen wesentlich höheren radioprotektiven Effekt als ungespaltener Gesamt-BBI (Fl) oder Spaltprodukt mit Trypsin- inhibierender Aktivität (F3) aufwies.
Durch die hier gezeigten Ergebnisse ist nachgewiesen, daß durch chemische und enzymatische Spaltung erzeugte Peptidfragmente des BBI eine ebenso hohe oder sogar wesentlich höhere radioprotektive Wirkung als der Gesamt-BBI entfalten.
Beispiel 3 Radioprotektive Wirkung der erfindungsgemäßen Nona- und Heptapeptide In einem weiteren klonogenen Assay (siehe 1.1) wurde die radioprotektive Wirkung von insgesamt vier erfindungsgemäßen BBI- Fragmenten im Vergleich zu Gesamt-BBI untersucht.
In den Test eingesetzt wurde Gesamt-BBI (BBI) sowie vier durch Merrifield-Synthese chemisch synthetisierte Peptide, deren C- terminale Aminosäuren Acetylgruppen und deren N-terminale Aminosäuren Amidgruppen als Schutzgruppen aufwiesen. Die Sequenzen dieser Peptide sind im beigefügten Sequenzprotokoll angegeben.
Das Peptid Pl weist die Sequenz SEQ ID-Nr.: 1 auf, wobei seine terminalen Cysteinreste über eine Disulfidbrücke vernetzt sind, so daß das Peptid Pl eine Ringstruktur aufweist. Das Peptid P2 hat die Sequenz SEQ ID-Nr.: 3. Es enthält keine Cysteinreste und nimmt daher eine lineare Konformation ein.
Das Peptid P3 entspricht dem Peptid Pl, hat also die Sequenz SEQ ID-Nr.: 1, wobei seine terminalen Cysteinreste jedoch nicht über eine Disulfidbrücke vernetzt sind.
Das Peptid P3 hat somit wie P2 eine lineare Struktur.
Das Peptid P4 hat die Sequenz SEQ ID-Nr.: 2 und weist damit gegenüber den Peptiden Pl und P3, die die Sequenz SEQ ID-Nr.: 1 haben, einen Serin → Valin Aminosäureaustausch auf. Seine terminalen Cysteinreste sind nicht über eine Disulfidbrücke vernetzt, so daß auch das Peptid P4 eine lineare Struktur aufweist. Die Peptide Pl, P3 und P4 sind Nonapeptide mit neun Aminosäuren, das Peptid P2 ist dagegen ein Heptapeptid mit nur sieben Aminosäuren.
In Fig. 5 ist das Ergebnis des klonogenen Assays gezeigt. Eine Änderung gegenüber dem unter 1.1 beschriebenen Verfahren bestand darin, daß die Bestrahlung der Fibroblasten mit einer Einzeldosis von 4 Gy durchgeführt wurde.
Neben den Ansätzen, bei denen Gesamt-BBI bzw. die Peptide Pl - P4 eingesetzt wurden, wurden ferner zwei Kontrollansätze durchgeführt: einmal ein Ansatz mit unbestrahlten Fibroblasten ohne Zusatz von BBI oder einem Peptid (U) , zum anderen ein Ansatz mit bestrahlten Fibroblasten, jedoch ebenfalls ohne Zusatz von BBI oder einem der Peptide (0).
Der Gesamt-BBI wurde mit einer Konzentration von 10 μM, die Peptide Pl - P4 jeweils mit einer Konzentration von 80 μM eingesetzt.
Wie aus Fig. 5 ersichtlich ist, zeigten alle Peptide eine radioprotektive Wirkung, die mit der des Gesamt-BBI vergleichbar ist. Dabei waren die Peptide Pl und P3, also die lineare und die zirkuläre Form der Sequenz SEQ ID-Nr.: 1, gegenüber den Peptiden P2 (Heptapeptid) und P4 (Basenaustausch) in ihrer radioprotektiven Wirkung noch ausgeprägter.
Die erfindungsgemäßen Peptide zeigen somit für menschliche Hautfibroblasten eine Schutzwirkung gegen ionisierende Strahlung, die mit der des acht- bis zehnmal größeren Gesamt-BBI vergleichbar ist. Daß die Peptide nicht nur gegen ionisierende Strahlung, sondern auch gegen UV-Strahlung eine Schutzwirkung ausüben, die ebenso hoch oder höher als die des Gesamt-BBI ist, ist in Fig. 6 gezeigt.
Wieder wurde ein klonogener Assay durchgeführt, in den der Gesamt-BBI oder die vier Peptide Pl bis P4 eingesetzt wurden.
Die Bestrahlung erfolgte hier mit UV-B-Strahlung von 100 Joule/m2.
Das klonogene Überleben der menschlichen Hautfibroblasten war unter Zusatz von Gesamt-BBI gegenüber den unbehandelten Zellen um ca. 40 % erhöht. Der Zusatz des Peptids Pl hatte eine ebenso ausgeprägte Wirkung wie der Zusatz von Gesamt-BBI, und der Zusatz der Peptide P2 und P3 zeigte sogar eine ausgeprägtere Wirkung, die um weitere 20 % höher war als die des Gesamt-BBI.
Das Fragment P4 , das gegenüber dem Peptid P3 einen Basenaustausch von Serin -> Valin aufweist, zeigte gegenüber dem Gesamt-BBI eine geringere Auswirkung auf das klonogene Überleben der Fibroblasten. Im Vergleich zu der Kontrolle (0) steigerte jedoch auch der Zusatz von P4 das klonogene Überleben der Hautfibroblasten signifikant.
Die in Fig. 5 und 6 gezeigten Experimente belegen, daß die erfindungsgemäßen Peptide sowohl gegenüber ionisierender Strahlung als auch gegenüber UV-Strahlung eine radioprotektive Wirkung entfalten, die mit der des Gesamt-BBI vergleichbar, teilweise sogar verbessert ist. Somit sind die erfindungsgemäßen Peptide ideal als radioprotektive Agenzien einsetzbar.
Beispiel 4 Protease-inhibierende Aktivität der erfindungsgemäßen Peptide
In den Experimenten, deren Ergebnisse in den Fig. 7 und 8 gezeigt sind, wurde die Protease-inhibierende Aktivität des BBI mit der der Peptidfragmente Pl bis P4, die bereits in Beispiel 3 vorgestellt wurden, verglichen.
Der Test der Protease-Inhibition wurde wie unter 1.3 beschrieben durchgeführt. Dabei ist in Fig. 7 die Inhibition von Chymotrypsin und in Fig. 8 die Inhibition von Trypsin gezeigt.
Die mit 0 bezeichnete Kontrolle zeigt die Chymotrypsin- bzw. Trypsin-Aktivität in Abwesenheit von BBI bzw. einem erfindungsgemäßen Peptid.
Wie aus Fig. 7 ersichtlich ist, inhibiert ein Zusatz von 0,05 M und 0,1 mM Gesamt-BBI (BBI) die Chymotrypsin-Aktivität um 80 bzw. 90 %. Im Vergleich dazu inhibiert der Zusatz von 0,1 mM des Peptids Pl, P2, P3 oder P4 die Chymotrypsin-Aktivität nicht oder nur um wenige Prozent.
Wie aus den in Fig. 8 gezeigten Ergebnissen hervorgeht, gilt das gleiche für die Trypsin-inhibierende Aktivität. Während der Gesamt-BBI in einer Konzentration von 0,05 mM oder 0,1 mM die Aktivität von Trypsin um über 90 % inhibiert, zeigt der Zusatz von 0,1 mM jedes der Peptide Pl, P2 , P3 oder P4 keine Auswirkung auf die Aktivität von Trypsin. Dieses Beispiel zeigt, daß keines der erfindungsgemäßen Peptide eine inhibierende Wirkung auf die Proteasen Chymotrypsin oder Trypsin ausübt.
Die erfindungsgemäßen Peptide mit radioprotektiver Wirkung haben daher nicht den unerwünschten Nebeneffekt, gleichzeitig auch die Verdauungsenzyme Chymotrypsin und Trypsin zu blockieren. Wie in Versuchen mit Ratten gezeigt wurde, führt die Blockierung dieser im Pankreas (der Bauchspeicheldrüse) hergestellten Proteasen durch Protease-Inhibitoren zu schweren Schädigungen des Pankreas.
Die erfindungsgemäßen Peptide sind somit dazu geeignet, zum Strahlenschutz des Menschen verwendet zu werden, zumal die Peptide Pl bis P4 aufgrund ihrer geringen Größe schnell diffundieren und sich somit gut verteilen können. Wegen der geringen Größe der Peptide ist auch nicht mit immunologischen Reaktionen zu rechnen.
Eine besonders gute Wirkung entfalten die Peptide Pl bis P4 beim Schutz gegen UV-Strahlung, wie in Ausführungsbeispiel 3 im Zusammenhang mit Fig. 6 gezeigt wurde. Da die nur neun bzw. sieben Aminosäuren umfassenden Peptide sogar in die Haut eindringen können, sind sie zum Schutz der menschlichen Haut gegen erhöhte Sonnenbelastung besonders gut geeignet. SEQUENZPROTOKOLL (5402P148WO)
(1) ALLGEMEINE ANGABEN:
(i) ANMELDER:
(A) NAME: Eberhard-Karls-Universitaet Tuebingen,
Universitaetsklinikum
(B) STRASSE: Geissweg 3
(C) ORT: Tuebingen
(E) LAND: DE
(F) POSTLEITZAHL: D-72076
(ii) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG: Peptid mit radioprotektiver Wirkung
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 3
(iv) COMPUTER-LESBARE FASSUNG:
(A) DATENTRAEGER : Floppy disk
(B) COMPUTER: IBM PC co patible
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: Patentin Release #1.0, Version #1.30 (EPA)
(2) ANGABEN ZU SEQ ID Nr : 1:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LAENGE: 9 Aminosaeuren
(B) ART: Aminosaeure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear oder circulaer
(ii) ART DES MOLEKUELS: Peptid (iii) HYPOTHETISCH: NEIN (iv) ANTISENSE: NEIN
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr : 1:
Cys Ala Leu Ser Tyr Pro Ala Gin Cys 1 5
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO : 2:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LAENGE: 9 Aminosaeuren
(B) ART: Aminosaeure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear oder circulaer (ii) ART DES MOLEKUELS: Peptid (iii) HYPOTHETISCH: NEIN (iv) ANTISENSE: NEIN
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr: 2:
Cys Ala Leu Val Tyr Pro Ala Gin Cys 1 5
[2) ANGABEN ZU SEQ ID Nr: 3:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LAENGE: 7 Aminosaeuren
(B) ART: Aminosaeure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKUELS: Peptid (iii) HYPOTHETISCH: NEIN (iv) ANTISENSE: NEIN
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr : 3
Ala Leu Ser Tyr Pro Ala Gin 1 5

Claims

Patentansprüche
1. Peptid mit radioprotektiver Wirkung, dadurch gekennzeichnet, daß es eine modifizierte Form und/oder ein gegebenenfalls modifiziertes Fragment des Bowman-Birk-Pro- tease-Inhibitors (BBI) umfaßt.
2. Peptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es keine Protease-inhibierende Wirkung gegen Trypsin und Chymotrypsin aufweist.
3. Peptid nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß es zumindest zwei Cysteinreste aufweist, die in reduzierter Form vorliegen.
4. Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß zumindest einige seiner Aminosäurereste in alkylierter Form vorliegen.
5. Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß es weniger als 20, vorzugsweise weniger als 10 Aminosäuren aufweist.
6. Peptid nach Anspruch 5 mit der Sequenz SEQ ID-Nr.: 1:
Cys Ala Leu Ser Tyr Pro Ala Gin Cys.
7. Peptid nach Anspruch 5 mit der Sequenz SEQ ID-Nr.: 2:
Cys Ala Leu Val Tyr Pro Ala Gin Cys.
8. Peptid nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß seine terminalen Cysteinreste kovalent miteinander verbunden sind.
9. Peptid nach Anspruch 5 mit der Sequenz SEQ ID-Nr.: 3:
Ala Leu Ser Tyr Pro Ala Gin.
10. Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß zumindest eine seiner Aminosäuren eine Schutzgruppe aufweist.
11. Peptid nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß seine C-terminale Aminosäure eine Acetylgruppe aufweist.
12. Peptid nach Anspruch 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, daß seine N-terminale Aminosäure eine Amidgruppe aufweist.
13. Verwendung eines oder mehrerer der Peptide nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 12 als radioprotektives Agens .
14. Verwendung nach Anspruch 13 zum Schutz gegen ionisierende Strahlung, insbesondere von Normalgewebe bei der Strahlentherapie von Tumorpatienten.
15. Verwendung nach Anspruch 13 zum Schutz der Haut gegen UV- Strahlung, insbesondere gegen die UV-Strahlung des Sonnenlichts.
16. Pharmazeutische Zusammensetzung, insbesondere zur intravenösen Verabreichung, dadurch gekennzeichnet, daß sie eines oder mehrere der Peptide nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 12 in einer radioprotektiv wirksamen Menge enthält.
17. Kosmetische Zusammensetzung zum Auftragen auf die Haut, dadurch gekennzeichnet, daß sie eines oder mehrere der Peptide nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 12 in einer radioprotektiv wirksamen Menge enthält.
18. Nukleinsäure, die einen für ein Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 10 kodierenden Sequenzabschnitt sowie gegebenenfalls zur Expression der Nukleinsäure notwendige Kontrollsequenzen aufweist.
19. Nukleinsäure nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß sie in einem Expressionsvektor enthalten ist.
20. Verfahren zur Herstellung eines Peptids nach einem der Anspruch 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß eine Nukleinsäure nach Anspruch 18 oder 19 mit molekularbiologischen Methoden exprimiert wird.
21. Verfahren zur Herstellung eines Peptids nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß der native Bowman-Birk-Protease-Inhibitor proteolytisch und/oder chemisch gespalten wird.
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