WO1998057992A2 - Antikörper gegen flip-protein - Google Patents

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WO1998057992A2
WO1998057992A2 PCT/EP1998/003641 EP9803641W WO9857992A2 WO 1998057992 A2 WO1998057992 A2 WO 1998057992A2 EP 9803641 W EP9803641 W EP 9803641W WO 9857992 A2 WO9857992 A2 WO 9857992A2
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antibodies
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Jürg TSCHOPP
Margot Thome
Kimberly Burns
Martin Irmler
Michael Hahne
Michael SCHRÖTER
Pascal Schneider
Jean-Luc Bodmer
Véronique STEINER
Donata Rimoldi
Kay Hofmann
E. Lars French
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Apotech Research And Development Ltd.
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4747—Apoptosis related proteins

Definitions

  • Antibodies against an epitope of a FLIP protein DNA sequence of an anti-FLIP protein antibody, a vector with a DNA sequence of an anti-FLIP antibody and a host cell stably transfected with such a vector.
  • the invention relates to antibodies which are directed against epitopes of FLIP proteins, moreover to such DNA sequences which code for antibodies which are directed against epitopes of FLIP proteins, and also expression vectors with the above-mentioned DNA sequences and host cell len transformed with these expression vectors, the invention intervening in the regulation of programmed cell death with the aid of the various objects of the invention.
  • the disclosure of the present invention expressly includes the entire content of the older, unpublished, German patent application with the file number 197 13 393.2. For this purpose, a copy of this earlier patent application is attached as an annex to the present invention. Otherwise, text passages of the present application will refer to the relevant relevant statements in the older patent application. express reference.
  • Programmed cell death is known as apoptosis and occurs in a wide variety of physiological stages and situations.
  • the Fas receptor plays a central role in apoptosis.
  • the extracellular apoptosis signal is converted to an intracellular signal cascade via the Fas receptor, finally triggering cell death.
  • the death signal (the apoptotic signal) is mediated intracellularly by a cytoplasmic sequence motif of the receptor, the so-called death domain (DD).
  • DD death domain
  • This death domain interacts with the adapter molecules FADD and / or TRADD. This means that the death domain causes adapter molecules to bind to the cytoplasmic receptor part.
  • the death signal is passed on through the binding of the protease FLICE (also called caspase-8 or Mch-5 or MACH).
  • protease FLICE also called caspase-8 or Mch-5 or MACH.
  • DEDs death effector domains
  • FLIP proteins are understood to mean those gene products that inhibit cell apoptosis and have at least one death effector domain.
  • this also includes functional and functionally homologous derivatives or alleles of the native sequences or fragments of the native sequences, insofar as the features described above are met by FLIP proteins.
  • Derivatives of FLIP proteins are taken to mean mutants whose sequences are deletion (s), insertion (s) and / or Substi- tution (s) are changed compared to the native sequences.
  • the proteins or protein fragments described are called FLIP proteins.
  • the present invention expressly refers to the older German patent application 197 13 393.2, in that it describes proteins (FLIP proteins) with the features that block apoptosis and have at least one death effector domain (p. 12, line 30 to p 22, line 17). All statements of the earlier patent application with regard to the FLIP proteins as defined above also belong to the subject of the present invention.
  • the object of the present invention is to identify substances which inhibit the blocking action of the FLIP proteins on cell apoptosis and thus allow apoptotic signal transfer despite cellular expression of FLIP protein (s) of cellular or viral origin.
  • FLIP protein s
  • antibodies are disclosed which are able to inhibit the inhibition of the apoptosis signal transduction by FLIP proteins.
  • the present invention discloses those antibodies that bind to human, viral and murine antigens, ie FLIP proteins.
  • the present invention therefore relates to those antibodies which are directed against an epitope of a FLIP protein (claim 1).
  • Epitope is understood to mean those amino acid sequence sections of a protein, in this case a FLIP protein, which have antigenic properties.
  • the epitope represents an amino acid sequence of flexible length that occurs in the native amino acid sequence of a FLIP protein.
  • epitopes with an amino acid sequence mutated relative to the native sequence are also conceivable, the antibody binding to the mutated epitope also having to have sufficient binding capacity for the native sequence.
  • sequences with conservative mutations will have antigenic properties that also ensure sufficient binding affinity of the resulting antibody to the native sequence.
  • Antibodies according to the invention are also understood to mean those antibodies whose amino acid sequence has been changed by molecular biological methods familiar to the person skilled in the art compared to a native amino acid sequence, ie the amino acid sequence of the cultured anti-FLIP protein antibody. Through targeted mutagenesis, a large number of antibodies with different amino acid sequences can be produced. Subsequently, these antibodies are then examined for their specific biological properties in appropriately designed test arrangements ("screening"). Anti-FLIP protein antibodies with the desired biological properties can optionally be optimized again in a further mutagenesis step. Antibodies within the meaning of the present invention also mean fragments of an antibody binding an epitope on a FLIP protein.
  • Such fragments also include the following forms of expression which are familiar to the skilled worker: F (ab), F (ab ') and F (ab') 2 (Delaloye et al., J. Clin. Invest. 87, 301 ff., 1986).
  • an antibody according to the invention binds to a FLIP protein in such a way that the FLIP activity is inhibited (claim 2).
  • the FLIP protein is unable to associate with its physiological binding partners.
  • binding partners can e.g. the adapter molecules are FADD or TRADD, optionally also other proteins with the ability to be able to be bound by a FLIP protein, that is to say a protein with at least one death effector domain.
  • the apoptotic signaling pathway is reactivated by the binding of the antibody to the FLIP protein (claim 3).
  • the apoptosis signal delivered to the cell extracellularly can pass through all stages of the signal cascade - despite the expression of FLIP protein. This results in cell death.
  • An antibody according to the invention is thus able to abolish the inhibitory effect of the FLIP protein on apoptosis.
  • the FLIP protein e.g. B. by the expression of a cellular FLIP protein or a viral FLIP protein, the cell undergoes the apoptotic reactions due to the presence of the antibody.
  • the FLIP protein can be found particularly in numerous pathophysiological conditions. Viruses with transforming properties occur in numerous tumors, whereby the expression of viral FLIP proteins is of central importance. This applies in particular to viruses of the 7-herp type. Karposi sarcoma with an HHV-8 infection may be mentioned as an example in this context. But also in tumors without viral pathogenesis, the expression of cellular FLIP protein manifests itself as a tumorigenic agent. In such a case, the tumor cells are resistant to any external apoptosis stimulus by inhibiting the apoptosis signaling pathway and are therefore immortalized. The body's immune system can no longer eliminate the cells.
  • an anti-FLIP protein antibody according to the invention allows the apoptosis sensitivity of the cell, ie, for example, the immortalized tumor cell, to be reconstituted to form an apoptosis-capable and thus eliminable cell.
  • the anti-FLIP protein antibody is directed against an epitope which lies on a death-effect domain of the FLIP protein (claim 4).
  • the FLIP protein binds to proteins of the apoptotic signal transduction pathway via the death effector domain (s).
  • An antibody according to the invention which recognizes an epitope on a death effector domain, can thus particularly efficiently cancel the inhibitory effect of FLIP protein (s).
  • the antibody according to the invention is preferably directed against a cellular FLIP protein (claim 5).
  • Cellular FLIP proteins are part of eukaryotic genomes.
  • Antibodies which recognize epitopes on FLIP proteins of the human genome are very particularly preferred in this context
  • Antibody to a cellular FLIP protein can typically transfer the cell from an apoptosis-insensitive state to an apoptosis-sensitive state.
  • the antibody according to the invention can also be used to identify tumors. After the removal of potentially tumorigenic tissue, the expression of FLIP proteins can be observed.
  • the FLIP proteins are used as tumor markers and detected with the aid of the anti-FLIP antibodies according to the invention.
  • the antibodies are labeled so that their association with FLIP proteins is made visible. This is possible on the one hand by direct labeling of the antibody according to the invention (e.g. by fluorescent labeling or radioactive labeling, labeling with biotin or by covalent coupling to a suitable marker enzyme) or indirectly by a second anti-anti FLIP protein antibody, which can then also be labeled according to the methods described above or other methods which are familiar to the person skilled in the art at any time.
  • anti-FLIP antibodies are particularly preferred in the identification of solid tumors, for example in colon cancer or in melanoma.
  • the use of anti-FLIP antibodies for the detection of tumor tissue in vitro is hereby disclosed.
  • the use of the anti-FLIP antibodies according to the invention is very particularly preferred in histological techniques.
  • the anti-FLIP antibodies have a molecular weight of approximately 16,000 to 18,000 daltons (claim 7). The determination of the molecular weight is based on an SDS page analysis familiar to the person skilled in the art. With such a molecular weight, the anti-FLIP protein antibodies belong to the IgG subtype of the immunoglobulins. According to the invention, however, the anti-FLIP antibodies can also belong to other subtypes (IgM, IgD or IgA). The subtype is about the respective constant region of the antibody defined
  • the antibody is isolated by immunostimulating mice (claim 9). This is done by the mouse, but possibly also other mammals such as horse, pig, guinea pig, goat or sheep, rabbit, rat, a FLIP protein, epitopes of a FLIP protein (preferably with a length of more than seven amino acids) or a derivative of a FLIP protein (eg also aggregates) with sufficient antigenic properties can be injected.
  • the injected peptides or proteins are preferably purified and soluble in an aqueous medium. These immunizations are repeated one or more times at appropriate intervals (eg after 14 days or at intervals of up to one month), often over a period of up to six months.
  • the mouse responds to these foreign antigens with an immune response that leads to the formation of antibodies.
  • Blood draws, about a week after an "immunization booster", then allow the appropriate antibodies to be isolated from the serum (Harboe & Ingild, Scand. J. Immun. 2 (Suppl. 1), 161, 1973). With this procedure, polyclonal antibodies can be obtained. Polyclonal antibodies have sufficient characteristics for numerous applications. In a preferred embodiment, however, the anti-FLIP protein antibody is an onoclonal antibody (claim 10). An anti-FLIP monoclonal antibody is produced by conventional methods.
  • the spleen cells of the immunostimulated mouse are fused with myelo cells grown in vitro in polyethylene glycol and then grown in a HAT medium. Only so-called hybridoma cells from spleen and myeloma can survive in this medium.
  • the individual clones are checked for their immunoglobulin production and the producing clones are grown either in vitro or in animals, preferably in the body cavities of mice.
  • an ascites tumor results which releases large amounts of antibodies.
  • the resulting monoclonal antibodies have the property of being derived from a cell and thus all have the same specific antibody properties, ie they all recognize the same epitope.
  • Antibodies according to the invention can be isolated and purified by the customary methods (Antibodies, A Laboratory Manual, Harlow & Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988). In a list that is by no means exhaustive, the following methods are mentioned: centrifugation, precipitation, peptide and protein column chromatography, HPLC and "reversed phase" HPLC, protein isolation on protein A or protein G columns or all conceivable combinations of these methods.
  • hybrid antibodies are claimed (claim 11). Hybrid antibodies are understood to mean those antibodies whose antigen binding sites recognize different antigens.
  • the two binding sites of an immunoglobulin of the IgG subclass recognize the same epitope.
  • the two antigen binding sites can recognize different epitopes on the FLIP protein.
  • hybrid antibodies are also disclosed which recognize a FLIP protein epitope at one binding site but recognize an epitope of another molecule at the other binding site.
  • This second antigen can be any physiological or non-physiological compounds with antigenic properties.
  • at least one antigen binding site of an antibody according to the invention binds to an epitope of the amino acid sequence of a FLIP protein.
  • the hybrid antibodies are produced by fusing two monoclonal cell lines with the desired epitopes or by chemical synthesis of two antibody fragments with the specific binding sites.
  • those anti-FLIP protein antibodies are claimed which originate from a hybridoma cell line which are viable under the registration number DSM ACC2306 at the DSMZ (German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH, Mascheroder Weg lb , D-38124 Braunschweig, Germany) as depository on April 30, 1997 according to the Budapest Treaty on the international recognition of the deposit of microorganisms by the applicant (claim 12).
  • This hybridoma cell line produces a monoclonal antibody that specifically epitopes on the amino acid sequence SAEVIHQVEEALDT-DEKEMLFLCRD. The molecular weight of the antibody produced by the deposited hybridoma cells was also determined.
  • the determination of the molecular weight is based on an SDS page analysis familiar to the person skilled in the art and the Western blot technique. As part of the SDS-PAGE analysis a Molekularge ⁇ was weight of 900,000 Dalton determined.
  • the anti-FLIP antibodies according to the invention were first used in order to detect the cellular FLIP protein in the cell lysate. The antibody according to the invention was tested with anti-IgM or anti-IgG antibodies (in each case the rat). A signal was only observed with the anti-IgM antibody.
  • the anti-FLIP protein antibodies that are produced by the deposited hybridoma cells therefore belong to the IgM subtype of the immunoglobulins. The subtype is defined by the constant region of the antibody.
  • the monoclonal antibody is bound to a cytotoxic molecule or to a marker molecule (claim 13). It is typically a covalent bond.
  • cytotoxic substances are cytotoxic proteins or protein segments, for example domains, which are linked to a monoclonal antibody according to the invention by the known recombinant methods.
  • recombinant sequences from antibody and cytotoxic protein are provided with suitable promoters and introduced into expression vectors with which host cells are transfected in vitro and / or in vivo.
  • apoptosis-insensitive target cells are sensitized to extracellular apoptotic signals on the one hand by transfection with an expressed recombinant anti-FLIP protein antibody, and on the other hand the effect of the cytotoxic component also leads to cell death.
  • Marker molecules serve to label the antibodies according to the invention. In this way it is possible to determine the presence of the antigen recognized by the antibody qualitatively and / or quantitatively.
  • a covalently bound fluorescent molecule is typically bound to an antibody according to the invention. With appropriate stimulation, the antibody emits a fluorescence signal, for example on a histological section or a Western blot, and thus indicates the presence of the antigen.
  • fluorescent probes examples include l-anilino-8-naphthalenesulfonate, l-dimethylaminonaphthalene-5-sulfonyl chloride and fluorescein isothiocyanate or rhodamine or their derivatives.
  • labeling of anti-FLIP antibodies with radioactive isotopes is also possible as an alternative or in combination.
  • Preferred is the use of the ⁇ -emitter 15 I, with which a phenol group of at least one tyrosine of an antibody according to the invention is labeled.
  • 3 emitters such as 3 H, 35 S or 14 C, are used.
  • biotin can be covalently coupled to an antibody according to the invention as a labeling method.
  • the detection is then carried out by binding streptavidin to the biotin molecule, streptavidin again with a "label", e.g. one of the above-mentioned "labels".
  • the marker molecule can also be an enzyme that converts a substrate in a quantifiable way.
  • the enzymes are covalently bound to the antibody.
  • the enzymes are the alkaline phosphatase, the peroxidase or double enzyme systems, in which the product of the first enzyme reaction (the enzyme covalently bound to the antibody) is further reacted by a second, downstream enzyme reaction. First the product of the second reaction is then detected, mostly optically.
  • a protein preferably a marker protein, particularly preferably a marker enzyme
  • a protein is changed by recombination in such a way that the variable region or sections of the variable region with an anti-FLIP protein binding property by means of the recombination known to the person skilled in the art. technology into the amino acid sequence of another protein, in particular a marker enzyme.
  • a marker enzyme e.g. recombined marker enzyme the antigenic binding property of the anti-FLIP antibody with the "label" function or other desired function of the enzyme.
  • the sequence of the binding site of the antibody with an intracellular, cytoplasmic protein can be linked by the methods of recombinant DNA technology. In this way, a hybrid protein is created, which on the one hand can bind FLIP protein and on the other hand can be found in cytoplasm a. This makes it possible to influence the transduction of the apoptosis signal.
  • monoclonal antibodies are disclosed which are "humanized" (claim 14).
  • the recombinant monoclonal antibodies have a variable region, as is obtained after immunostimulation of a mouse or other suitable mammal (eg rat, pig, monkey etc.).
  • a mouse or other suitable mammal eg rat, pig, monkey etc.
  • only portions of the variable region or only the antigen binding site of the monoclonal animal antibody are present in the recombinant antibody.
  • the missing sections of the variable region are supplemented from the sequence of a human antibody.
  • the constant region of the animal antibody is typically always against that in the recombinant humanized antibody corresponding constant region (especially IgG) of the human genome replaced. For this come z. B.
  • Such an antibody is particularly suitable for use in the human organism because it is not recognized as a foreign antigen.
  • the human immune response does not occur, as is to be expected with an originally murine antibody (the mouse or rat).
  • an antibody is claimed which is directed against a monoclonal anti-FLIP antibody according to any one of claims 10 to 14 (claim 15).
  • anti-anti-FLIP protein antibodies are also part of the subject matter of the invention.
  • An anti-FLIP antibody or protein segments of an anti-FLIP antibody are used for immunization.
  • the immune system responds by producing anti-anti-FLIP protein antibodies.
  • the method for producing the anti-anti-FLIP protein antibodies is moreover identical to the methods for producing anti-FLIP protein antibodies described in the present application. These anti-anti-FLIP protein antibodies are particularly important as labeled antibodies for the indirect detection of FLIP protein.
  • the present invention furthermore relates to DNA sequences which code for the anti-FLIP protein antibodies according to the invention (claim 16). Because of the degenerative The character of the genetic code results in numerous nucleotide sequences which can code for an amino acid sequence of an anti-FLIP antibody according to the invention. In particular, the DNA sequence of the anti-FLIP protein antibody which is produced by the hybridoma cell line deposited with the DSMZ under the registration number ACC2306 is claimed.
  • RNA sequences which are complementary to the DNA sequences according to the invention (each with two complementary strands) of the anti-FLIP protein antibodies are also disclosed.
  • the primary transcripts (e.g. the mRNA) of the DNA sequences according to the invention are preferred.
  • a DNA sequence according to the invention can also be operably linked to a promoter. It is then preferably upstream of the DNA sequence according to the invention.
  • this promoter can be a prokaryotic or a eukaryotic promoter. Suitable promoters are mentioned in the previously cited older German patent application, to which express reference is made (page 24, line 1 to page 25, line 6).
  • other control elements such as. B. enhancers or the like, can be linked to the DNA sequence according to the invention. In this context, reference is expressly made to the statements on page 25, lines 8 to 32 in the older application.
  • a DNA sequence according to the invention which accordingly codes for an anti-FLIP antibody, can contain further nucleotide sequences at the N or C terminus.
  • leader sequences which determine the topographic target location of a protein during or after translation are very particularly preferred in this context.
  • a protein can be introduced into certain cellular compartments or z. B. about the endosomal export to Cell membrane or transported into the extracellular space. In this way the functionality of a protein can be controlled.
  • Antibodies are typically prepared for export to extracellular space and then either built into the cell membrane or secreted. In the context of the present invention, it is desirable that anti-FLIP antibodies become effective intracellularly.
  • the apoptotic signal cascade is located in the cytoplasm and consequently also the inhibitory FLIP proteins block the apoptosis mechanism there, it is particularly preferred to keep the anti-FLIP antibodies in the cytoplasm.
  • the use of appropriate "leader sequences" can prevent the export of the antibodies and ensure that the antibodies remain in the cytoplasm.
  • vectors which contain a DNA sequence according to the invention, typically with a promoter and optionally with further of the control elements described above for transcription, translation and / or cell localization (claim 17). They serve to enable the nucleotide sequence according to the invention to be expanded and expressed in specific host cells.
  • vectors are used that can replicate independently of the host chromosome. You have your own “origin of replication". Such sequences are present in bacteria, in yeast or in viruses. In contrast, the "origins" in mammalian expression vectors are not required.
  • Transfection vectors which introduce the DNA sequence according to the invention into specific target cells and can express them there are very particularly preferred. Also with regard to the expression vectors, the disclosure of the older German patent application cited above is expressly incorporated into the present patent application (page 25, line 34 to page 26, line 37).
  • guide form a vector claimed which includes both a DNA-Se acid sequence for encoding anti-FLIP-protein antibodies, as referred to in claim 16, as well as a DNA sequence encoding a Fas protein (claim 18).
  • the apoptosis sensitivity of a cell transfected with such a vector is increased by induction of the expression of Fas, the membrane-bound apoptosis receptor, and of anti-FLIP protein antibody.
  • the upregulation of Fas already represents a stimulus for cell apoptosis. In this way, cell death can be brought about by the expression of the two proteins without an additional extracellular apoptosis signal.
  • a specifically increased apoptosis tendency results from the transfection of the two genes mentioned in the form of a transfection vector and their subsequent expression (as anti-FLIP protein antibody and Fas protein) in the target cell.
  • the integration of genes for other membrane-bound apoptosis receptors, such as TNFR-1 and / or TRAMP, in the vector instead of or together with the gene for Fas protein is also conceivable.
  • the present invention further relates to host cells which are stably transfected with a DNA sequence for an antibody according to the invention (claim 19).
  • the host cells can be used on the one hand to express the antibody according to the invention.
  • the host cells are transfected in vitro, typically with an expression vector containing a DNA sequence for the antibody according to the invention. These cells can be pro- or eukaryotic cells. Reference is expressly made here to the explanations (p. 30, line 17 to p. 31, line 21) of the earlier patent application.
  • the host cells can, however, also in vitro transfected and then retransplanted. It is then typically a transfected autograft, but may also be an allograft.
  • the host cells transfected with the DNA according to the invention can react apoptotically after the transplantation after the triggering of a corresponding apoptosis stimulus.
  • the host cells are particularly preferably transfected in vivo. Such in vivo transfections are explained below for the present invention as a gene therapy approach.
  • the present invention thus also includes all those methods and methods which are known to the person skilled in the art in connection with gene therapy.
  • the DNA sequences of the antibodies according to the invention are suitable for sensitizing the transfected host cells for apoptosis.
  • gene therapy methods are used to specifically target apoptosis cells.
  • DNA sequences of the anti-FLIP protein antibodies according to the invention are coupled to a promoter, which can be tissue-specific, for example.
  • a promoter from melanin-producing cells is ideally selected, which in this case also ensures that the expression of anti-FLIP antibodies takes place exclusively in the melanoma cells concerned.
  • any eukaryotic promoters can be used in connection with the DNA sequences of the anti-FLIP antibodies according to the invention.
  • transfection vectors B. viruses with recombined DNA sequences, colloidal dispersion systems, Liposo en or the DNA sequences of the anti-FLIP antibodies according to the invention, but without being encased by a carrier medium.
  • the viral vectors are exemplary and in no way in conclusion: adenoviruses, herpes viruses or RNA viruses, e.g. B. Retroviruses.
  • RNA sequence according to the invention or the RNA sequences according to the invention if appropriate in combination with other genes, is (are) exchanged for the so-called structural genes of the retroviruses.
  • these recombined nucleotide sequences are not able to code for the viral envelopes (e.g. capsids).
  • plasmids are therefore used which are propagated in helper cell lines, but which are deficient for the packing signal of the nucleotide sequence. In this way, empty viral envelopes are formed which, in the event of a double infection, can be combined with the recombinant nucleotide sequences according to the invention to form infectious viral particles.
  • Macromolecular complexes, nanocapsules, microspheres, oil-in-water emulsions, micelles or liposomes are conceivable as colloidal dispersion systems.
  • liposomes have an artificial membrane that allows RNA or DNA to be enclosed in aqueous solution and then passed on to the target cells in a biologically active form.
  • the binding specificity of the vectors to the target cells must be guaranteed as an essential boundary condition for a successful gene therapy approach.
  • the liposomes must release the trapped DNA or RNA in the cell's cytoplasm.
  • the liposomes it is advantageous to couple the liposomes to a ligand which, due to its binding specificity, interacts selectively with certain surface cells with their surface structures.
  • a ligand which, due to its binding specificity, interacts selectively with certain surface cells with their surface structures.
  • RNA sequences genes which are also of therapeutic use can also be transmitted through the vector system for gene therapy approaches.
  • FIG. 1 a shows a Western blot, anti-FLIP protein antibodies according to the invention being used against PHA-activated human T cells on day 1 and on day 6 after the stimulation.
  • FIG. 1b shows a Western blot, with anti-FLIP protein antibodies according to the invention (recognizing human FLIP- Protein) against concanavalinA-activated mouse splenocytes (day 1 or day 3 after stimulation) were used.
  • FIG. 2 shows the proportion of apoptotic cells after administration of FasL. Various melanoma cell lines were tested.
  • FIG. 3 shows the expression of c-FLIP L in various melanoma cell lines.
  • FIG. 1 a shows that human PHA-activated T cells show a clear band at 55 kD in the Western blot on the first day of the stimulation. This band can still be seen on day 6, albeit very weakly.
  • the FLIP expression in the cells was detected using an anti-FLIP protein antibody according to the invention.
  • the antibody used corresponds to the antibody deposited with the DSMZ in Braunschweig under the registration number DSM ACC2306. This was also used as an anti-FLIP protein antibody in all subsequent experiments.
  • FLIP L -transfected (0.3 ⁇ g DNA) 293T cells (in the presence of z-VAD-fmk) were treated with the anti-FLIP antibody on a Western blot.
  • the bar graph shows the percentage of apoptotic cells after administration of sFasL (0.2 ⁇ g / ml, incubation period: 6 h) for activated cells on the first and sixth day after stimulation.
  • the proportion of apoptotic cells was determined using the method of releasing the Histone-DNA complex determined. It can be seen that the T cells are protected against FasL-induced apoptosis on the first day after stimulation (strong expression of the FLIP protein). On day 6 in contrast (with weak FLIP protein expression) the cells are apoptosis sensitive.
  • Figure lb shows the results of similar experiments as in Figure la. Lysates from mouse splenocytes are examined here on the first and third day after activation with ConcanavalinA. The same antibodies are used as in Figure la (directed against human FLIP protein). The 55 kD band of FLIP L can be seen on the first day, but hardly on the third. The 45 kD band recognizable on day 1 is a processed form of FLIP L.
  • the quality of the anti-FLIP protein antibody ie its sensitivity to the antigen.
  • 293T cells with an expression vector for recombinant flag FLIP L of the mouse were examined with the anti-FLIP protein antibody described for FIG. 1 a or with anti-flag antibody.
  • the signal intensity is comparable for the two antibodies.
  • the apotosesis sensitivity of the activated mouse plenocytes to FasL is plotted. On day 1 (clear FLIP expression), only a small proportion of apoptotic cells can be observed. A large proportion, however, on day 6 after activation.
  • FIG. 2 shows the proportion of apoptotic cells in various melanoma cell lines (DOR, ME304, NA8-MEL, ME280 / 1, ME261, MelJuso and MZ2-MEL) as a diagram, and as a control in Jurkat cells.
  • the apotosis was triggered by incubation (6 h) of the cells with recombinant FasL (1 ⁇ g / ml). All melanoma cell lines show only a very weak sensitivity to apotosis. In contrast, almost all Jurkat cells are subject to apotosis.
  • the surface expression of Fas was determined by FACS analysis ((+): expression of Fas, (-) no expression of Fas).
  • FIG. 3 shows with the aid of an antibody according to the invention that malignant melanoma cells of the cell lines DOR, Me304, NA8-MEL, ME280 / 1, ME280 / 2, GLL.19, MelJuso and MZ2-MEL express the 55 kD FLIP protein. Lysates from these cell lines react with anti-FLIP protein antibodies on the Western blots.
  • Jurkat cells no expression of FLIP protein
  • 293T cells transfected with FLIP L strong FLIP protein expression as expected
  • Tumor cells in the present case melanoma cells, are thus protected against apoptosis by the expression of FLIP protein.
  • the figures show on the one hand that the activation of T cells corresponds to a transient resistance to apoptotic signals. This resistance correlates with the expression of FLIP protein.
  • certain tumor cell lines especially melanoma cell lines, but also colon carcinoma cell lines, no longer have apoptosis sensitivity due to the unphysiological expression of FLIP protein and are therefore immortalized.
  • the surface expression of Fas in melanoma cells is of no importance for the lack of apoptosis reaction after appropriate stimulation.
  • This exemplary embodiment describes the production of the monoclonal antibody or the deposited hybridoma cell line (DSM ACC2306), which produces this monoclonal antibody.
  • MAP Multiple Antigenic Peptide
  • Posnett McGrath & Tarn, "A novel method for producing antipeptide antibodies. Production of site-specific antibodies to the T cell antigen receptor ß-chain ", Journal of Biological Chemistry 263 (4): 1719-25, 1988), the sequence corresponding to the amino acids (AS 2 to 26) of the human c-FLIP protein, used by known Techniques (as described in US patent 4,411,993) to produce monoclonal antibodies against FLIP protein.
  • the rats were immunized with the above-mentioned peptide as immunogen, bound to a carrier material which is present as an emulsion in adjuvant (e.g. mineral oil or aluminum hydroxide precipitate).
  • a carrier material which is present as an emulsion in adjuvant
  • 10-100 ⁇ g peptide bound to the carrier material were injected intraperitoneally. However, the injection can also be made subcutaneously.
  • the animals were "boosted” by injecting again as described above. Serum was regularly removed from the tail vein during this period, which was then tested for FLIP antibody against the peptide by means of ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay).
  • the positive animals were given a last injection, this time intravenously, with peptide bound to a carrier material which was dissolved in a physiological saline solution.
  • a carrier material which was dissolved in a physiological saline solution.
  • the animals were sacrificed and the spleen removed.
  • the spleen cells isolated from the spleen were fused with a mouse myeloma cell line (e.g. NF1).
  • the hybridoma cells obtained after the fusion were cultivated on microtiter plates in HAT (hypoxanthine, aminopterin and thymidine) selection medium in order to prevent the growth of unfused spleen or myeloma cells.
  • HAT hyperxanthine, aminopterin and thymidine
  • hybridoma cells were examined for their ability to To produce antibodies which react in an ELISA test against purified peptide (see Engvall et al., Immunochem. 8: 871, 1971 and US patent 4,703,004).
  • the hydridoma cells obtained in this way were cultivated in vitro in culture bottles or in "roller bottles".
  • the monoclonal antibodies were typically purified using affinity chromatography, which is based on the binding of the antibody to peptide, protein A or protein G.
  • This exemplary embodiment shows the detection of the anti-FLIP protein specificity of the anti-FLIP antibody according to the invention.
  • extracts from cells which, after transfection, express human c-FLIP L with a recombined FLAG sequence were examined with an anti-FLIP protein antibody or with an anti-FLAG antibody.
  • native, activated T cells were examined with an anti-FLIP protein antibody.
  • human T lymphocytes were activated with PHA (phytohemagglutinin), as in Klas et al. (Int. Immunol. 5, 625, 1993).
  • PHA phytohemagglutinin
  • Mononuclear peripheral blood cells were isolated using Ficol-Plaque (Pharmacia, Sweden) using density centrifugation. Adherent cells were eliminated due to their adherence to plastic culture dishes for 1 hour. T cells were separated from mononuclear peripheral blood cells using the "rosetting" red sheep blood cells treated with 2-amino-ethylisothiouronium bromide (Madson et al., J. Immunol. Methods 33, 323, 1980).
  • the T cells were activated with PHA (1 ⁇ g / ml) for 18 to 20 hours, washed and cultivated in the presence of recombinant, human IL-2 (20-25 U / ml).
  • the 293T cells were isolated using the method of Thome et al. (Nature 386, 517, 1997) transfected with human c-FLIP L.
  • the complete ORF of the human c-FLIP s and the human c-FLIP L was amplified by PCR methods, a 5 'primer with an EcoRI sequence extension and a 3' primer with a sequence extension for the restriction enzymes BamHI and EcoRI were used here.
  • the insertion took place in the EcoRI site of the vector.
  • the vector is derived from the pCR-3 vector (from Invitrogen).
  • a FLAG sequence which is in the reading frame with the FLIP sequence was also simultaneously inserted into the multiple cloning site of the vector.
  • the fusion protein obtained in this way can be detected both by anti-FLIP antibodies and by anti-FLAG antibodies (M2, Kodak, USA).
  • the cells were distributed at a concentration of 1 to 2 ⁇ 10 6 cells / 10 cm plate or 3 to 6 ⁇ 10 5 cells / 5 cm plate and the following day using the calcium described in the literature -Phosphate precipitation method transfected. The precipitate was left on the cells for 8 hours and the cells were finally harvested 26 to 30 hours after the transfection.
  • FIG. 1 a Western blots (FIG. 1 a) applied cell extracts from activated human T cells on the one hand and cell extracts from 293T cells transiently transfected with c-FLIP L expression vector (with a FLAG sequence) on the other hand.
  • the blots were saturated with 5% milk in PBS with 0.5% Tween and then incubated using monoclonal anti-FLIP protein antibody at a concentration of 5 ⁇ g / ml for 1 hour at room temperature, followed by a second antibody labeled with peroxidase (second antibody from Jackson Laboratories).
  • the detection of the proteins was enhanced by chemiluminescence (Amersham International).
  • the Western blots were analyzed with the aid of the anti-FLIP antibody according to the invention.
  • the antibodies labeled with horseradish peroxidase are reactive towards the anti-FLIP protein antibody according to the invention.
  • the western blots of the activated T lymphocytes (on day 1), like the transfected 293T cells, have the FLIP protein band at a molecular weight of 55 kD.
  • the activated T lymphocytes are apoptosis sensitive on day 6 and thus flip negative. In fact, no FLIP protein band appears in the Western blot from such cell extracts.
  • the Western blots shown show that the anti-FLIP protein antibody according to the invention recognizes the same band pattern as the anti-FLAG antibody. This proves that the anti-FLIP antibody specifically binds only to the transfected FLIP protein.
  • the antibody according to the invention against human cellular cFLIP L protein (as in Example 1 or 2) is tested for its affinity for mouse cFLIP L (FIG. 1b).
  • mouse spleen cells were activated with Concanava-lin A (Löwin et al., Nature 370, 650-2, 1994). Mouse spleen cells were freed from the red blood cells and activated with cocanavalin A (4 ⁇ g / ml) for 1 to 3 days. Cell extracts from appropriately stimulated cells were prepared on day 1 and day 3. On the other hand, 293T cells with flag FLIP expression vectors were transfected according to the methods already described in Example 2. Extracts from these cells were also removed.
  • the cell extracts were each analyzed by the Western blot technique (see exemplary embodiment 2).
  • the FLIP protein detection of the transfected 293T cells was carried out both by an anti-flag antibody (Kodak International Biotechnologies) and by the antibody according to the invention.
  • the cell extracts of the activated spleen cells were examined exclusively with the aid of the antibody according to the invention.
  • the anti-FLIP antibody used recognizes the characteristic 55 kD band of the FLIP protein. It also binds to a processed cleavage product (43 kD) of the long 55 kD protein.
  • the anti-FLIP protein antibody according to the invention directed against a human FLIP protein, therefore also binds to the mouse cFLIP L.
  • the melanoma cells originate from tumor cell samples which had previously been surgically removed from the tumor tissue of patients (Tartaglia et al., Cell 73, 213, 1993).
  • the method described or used in Examples 1, 2, and 3 anti-FLIP antibody was also used in this case for the analysis of cell extracts from eight different melanoma cell lines with the aid of the Western blot technique (see exemplary embodiment 2).
  • extracts from a 293T cell line with a human c-FLIP L expression vector and a Jurkat cell line were examined.
  • the antibody according to the invention showed a clear signal for the anti-FLIP-55 kd protein band for all eight melanoma cell lines.
  • an anti-FLIP protein antibody produced according to embodiment 1 (directed against a sequence of a human FLIP protein) in extracts from activated T-lymphocytes, from various melanoma cell lines and from transfected 293T cells its binding ability to human FLIP -Probes protein. It can also be used as an antibody against a mouse FLIP protein.
  • the anti-FLIP antibodies according to the invention are also used in laboratory experiments. They are then typically marked with a "label". As mentioned above, these can be fluorescent labels, labels with radioactive isotopes, with biotin or enzyme labels or all labeling types familiar to the person skilled in the art on the antibodies according to the invention or on anti-anti-FLIP protein antibodies.
  • Substances that specifically modulate the regulation of the expression of FLIP proteins are of particular interest for medical use. Depending on the pathophysiology, activation or inhibition of the FLIP Protein expression may be desirable.
  • Inhibitors of FLIP expression are particularly relevant as anti-tumor agents. These inhibitors can lead to a reduction in the cellular FLIP protein concentration at all levels of expression control (e.g. transcription, translation, mRNA transport, RNA or protein stability).
  • the antibodies according to the invention are used to demonstrate the effectiveness of such substances with a regulatory function. Substances with an inhibitory potential for FLIP expression are caused by the absence of a corresponding antibody reaction, i.e. by the absence of the corresponding signal of the antibody label (e.g. on tissue sections of tumor cells that normally have a constitutive expression of FLIP protein). Conversely, the antibodies according to the invention also serve for "screening" for substances with an activating effect for FLIP expression.
  • the antibody reaction with FLIP protein gives a stronger signal than would normally be expected for the cells examined.
  • the antibodies according to the invention e.g. Identifies substances that can immortalize apoptosis-sensitive cells by activating the expression of FLIP protein.
  • an anti-FLIP protein antibody according to the invention is an agent for cleaning methods.
  • Antibodies are packed on a solid carrier material (eg dextran) and are then used according to the known methods for protein purification, for example in the context of affinity chromatography (Maniattis et al. , Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 1982).
  • the antigen, ie the FLIP protein is first specifically bound to the antibody, then the medium is washed off the column and finally the antigen is released from the antibody by changing the pH, changing the ionic strength or the like.
  • the antigen, then the FLIP protein is obtained as a purified fraction.
  • the antibodies according to the invention are used in all known methods based on antibody-antigen reactions. These include “immunoblotting”, immunoprecipitation, ELISA (enzyme-linked immunoassay), RIA (radioimmunoassay), FIA (fluorescence immunoassay) and FACS (flow cytometry and cell separations after fluorescence labeling).
  • anti-anti-FLIP protein antibodies can also be packed on a column. If anti-idiotypic antibodies against anti-FLIP protein antibodies are concerned (ie anti-anti-FLIP protein antibodies which are directed against the specific binding site of the anti-FLIP antibodies), these can be used to simulate the antigen (of a FLIP protein) can be used. This results in corresponding applications described above.
  • Antibodies according to the invention are, apart from their use as a detection reagent of FLIP protein in appropriately prepared samples (e.g. histological sections, for example in frozen or formalin-fixed samples or cell extracts) and, apart from their importance as a therapeutic substance with intracellular localization, also for the investigation of biological Activity of the antigen, i.e. the FLIP protein, used. In this way, e.g. in corresponding binding studies, biologically relevant structures of the FLIP protein, e.g. for binding to the adapter molecules.

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Abstract

Die Erfindung betrifft Antikörper, die gegen Epitope von FLIP-Proteinen gerichtet sind, darüber hinaus solche DNA-Sequenzen, die für Antikörper kodieren, die gegen Epitope von FLIP-Proteinen gerichtet sind, außerdem Expressionsvektoren mit den oben genannten DNA-Sequenzen und Wirtszellen, die mit diesen Expressionsvektoren transformiert sind, wobei die Erfindung mit Hilfe der verschiedenen Erfindungsgegenstände in die Regulation des programmierten Zelltods eingreift.

Description

Antikörper gegen FLIP-Protein
Antikörper gegen einen Epitop eines FLIP-Proteins, DNA-Sequenz eines anti-FLIP-Protein-Antikörpers, ein Vektor mit einer DNA-Sequenz eines anti-FLIP-Antikörpers und eine stabil mit einem derartigen Vektor transfizierte Wirtszelle.
Die Erfindung betrifft Antikörper, die gegen Epitope von FLIP-Proteinen gerichtet sind, darüber hinaus solche DNA- Sequenzen, die für Antikörper kodieren, die gegen Epitope von FLIP-Proteinen gerichtet sind, außerdem Expressions- vektoren mit den oben genannten DNA-Sequenzen und Wirtszel- len, die mit diesen Expressionsvektoren transformiert sind, wobei die Erfindung mit Hilfe der verschiedenen Erfindungs- gegenstände in die Regulation des programmierten Zelltods eingreift .
Die Offenbarung der vorliegenden Erfindung schließt ausdrücklich den gesamten Inhalt der älteren, nicht veröffentlichten, deutschen Patentanmeldung mit dem Aktenzeichen 197 13 393.2 ein. Zu diesem Zweck wird eine Kopie dieser älteren Patentanmeldung als Anlage der vorliegenden Erfindung beigefügt. Im übrigen wird im folgenden an Textstellen der vorliegenden Anmeldung auf jeweils besonders relevante korrespondierende Ausführungen in der älteren Patentanmel- dung ausdrücklich Bezug genommen.
Der programmierte Zelltod ist unter dem Namen Apoptose bekannt und tritt in den verschiedensten physiologischen Stadien und Situationen auf. Eine zentrale Rolle bei Apoptose spielt der Fas-Rezeptor. Über den Fas-Rezeptor erfolgt eine Umsetzung des extrazellulären Apoptosesignals an eine intrazelluläre Signalkaskade, wobei schließlich der Zelltod ausgelöst wird. Intrazellulär wird das Todessignal (das apoptotische Signal) durch ein zytoplasmatisches Sequenzmotiv des Rezeptors, die sogenannte Todesdomäne (DD) vermittelt . Diese Todesdomäne interagiert mit den Adap- tormolekülen FADD und/oder TRADD . Dies bedeutet, daß die To- desdomäne eine Anbindung von Adaptormolekülen an den zyto- plasmatischen Rezeptorteil bewirkt. In der folgenden Stufe der Kaskade wird das Todessignal durch die Bindung der Protease FLICE (auch genannt caspase-8 oder Mch-5 oder MACH) weitergeleitet. Diese Assoziierung erfolgt über sogenannte Todeseffektordomänen (DEDs) , die sowohl am C-Terminus des Adaptormoleküls, z. B. FADD, als auch am N-Terminus der Protease FLICE vorhanden sind. Hinsichtlich der Bedeutung der Apoptose für die Zellhomöostase und des Stands der Technik wird auf die Ausführungen in der oben bezeichneten, älteren Patentanmeldung 197 13 393.2 verwiesen (S. 1, Zeile 28 bis S. 4, Zeile 33) .
Unter FLIP-Proteinen sind solche Genprodukte zu verstehen, die die Zellapoptose inhibieren und mindestens eine Todes- effektordomäne aufweisen. Hierzu gehören neben den nativen Aminosäuresequenzen (aus viralen, prokaryotischen oder euka- ryotischen Genomen) auch funktionsfähige und funktionshomologe Derivate oder Allele der nativen Sequenzen bzw. Fragmente der nativen Sequenzen, soweit die oben bezeichne- ten Merkmale von FLIP-Proteinen erfüllt sind. Unter Derivaten von FLIP-Proteinen versteht man dabei Mutanten, deren Sequenzen durch Deletion (en) , Insertion (en) und/oder Substi- tution(en) gegenüber den nativen Sequenzen verändert sind. Es wird in diesem Zusammenhang ausdrücklich auf die Ausführungen in der Patentanmeldung 19713 393.2 Bezug genommen (S. 5, Zeile 31 bis S. 7, Zeile 33) . Die beschriebenen Proteine oder Proteinfragmente tragen im Sinne der vorliegenden Erfindung die Bezeichnung FLIP-Proteine .
In der älteren deutschen Patentanmeldung 19713 393.2 werden DNA-Sequenzabschnitte, sowie die von diesen Abschnitten (Ge- nen) kodierten Genprodukte, d. h. Proteine mit inhibitorischen Eigenschaften auf die Signalkaskade beschrieben. Insbesondere werden virale, humane und murine Proteine beschrieben, die die proteolytische Signaltransduktion unterbrechen und somit die Apoptose blockieren. Ganz besonders werden die DNA- bzw. Aminosäuresequenzen des humanen c-FLIPL- (Figur 4b, "GenBank" -Zugangsnummer :
U97074) , des humanen c-FLIPs- (Figur 4a, "GenBank" -Zugangs- nummer: U97075) und des c-FLIPL-Gens (Genprodukts) der Maus
(Figur 4c, "GenBank" -Zugangsnummer : U97076) beschrieben. Genauso werden auch die DNA- bzw. Aminosäuresequenzen der viralen FLIP-Proteine der Viren EHV-2 (ORFE8) , HHV-8
(ORF71) , HVS (ORF71) , BHV-4, MCV (159L) und MCV (160L) offenbart. Die vorliegende Erfindung nimmt ausdrücklich insoweit auf die ältere deutsche Patentanmeldung 197 13 393.2 Bezug, als in dieser Proteine (FLIP-Proteine) mit den Merkmalen, die Apoptose zu blockieren und mindestens eine Todeseffektordomäne aufzuweisen, beschrieben sind (S. 12, Zeile 30 bis S. 22, Zeile 17). Alle Ausführungen der älteren Patentanmeldung in bezug auf die FLIP-Proteine nach obiger Definition gehören auch zum Gegenstand der vorliegenden Erfindung.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, Substanzen zu identifizieren, die die blockierende Wirkung der FLIP- Proteine auf die Zellapoptose inhibieren und damit den apoptotischen Signaltransfer trotz zellulärer Expression von FLIP-Protein (en) zellulärer oder viraler Herkunft erlauben. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden Antikörper offenbart, die in der Lage sind, die Inhibition der Apopto- sesignaltransduktion durch FLIP-Proteine zu unterbinden. Insbesondere offenbart die vorliegende Erfindung solche Antikörper, die an humane, virale und murine Antigene, d. h. FLIP-Proteine, binden.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind daher solche Antikörper, die gegen einen Epitop eines FLIP-Proteins gerichtet sind (Anspruch 1) . Unter Epitop versteht man dabei solche Aminosäuresequenzabschnitte eines Proteins, in diesem Fall eines FLIP-Proteins, die antigene Eigenschaften aufweisen. Der Epitop stellt dabei eine Aminosäuresequenz flexibler Länge dar, der in der nativen Aminosäuresequenz eines FLIP-Proteins auftritt. Denkbar sind allerdings auch Epitope mit einer gegenüber der nativen Sequenz mutierten Aminosäureabfolge, wobei der an den mutierten Epitop bindende Antikörper auch ein ausreichendes Bindungsvermögen für die native Sequenz besitzen muß. In der Regel werden also nur Sequenzen mit konservativen Mutationen antigene Eigenschaften besitzen, die auch eine ausreichende Bindungsaffinität des resultierenden Antikörpers an die native Sequenz sicherstellen.
Unter erfindungsgemäßen Antikörpern sind auch solche Antikörper zu verstehen, deren Aminosäuresequenz durch dem Fachmann geläufige molekularbiologische Verfahren gegenüber einer nativen Aminosäuresequenz , d.h. der Aminosäuresequenz des gezüchteten anti-FLIP-Protein-Antikörpers , verändert ist. Durch gezielte Mutagenese kann eine Vielzahl von Antikörpern mit unterschiedlichen Aminosäuresequenzen hergestellt werden. In der Folge werden diese Antikörper dann in entsprechend ausgelegten Versuchsanordnungen ( "Screening" ) auf ihre spezifischen biologischen Eigenschaften hin untersucht. Anti-FLIP-Protein-Antikörper mit den erwünschten biologischen Eigenschaften können gegebenfalls in einem weiteren Mutageneseschritt abermals optimiert werden. Unter Antikörpern im Sinne der vorliegenden Erfindung versteht man auch Fragmente eines einen Epitop auf einem FLIP-Protein bindenden Antikörpers. Zu solchen Fragmenten gehören auch die folgenden, dem Fachmann geläufigen Aus- prägungsformen: F(ab), F(ab') und F(ab')2 (Delaloye et al . , J. Clin. Invest. 87, 301 ff., 1986).
In einer bevorzugten Ausführungsform bindet ein erfindungs- gemäßer Antikörper an ein FLIP-Protein derart, daß die FLIP- Aktivität inhibiert ist (Anspruch 2) . Auf diese Weise ist das FLIP-Protein nicht in der Lage, sich mit seinen physiologischen Bindungspartnern zu assoziieren. Solche Bindungspartner können z.B. die Adaptormoleküle FADD oder TRADD sein, gegebenenfalls auch andere Proteine mit der Fähigkeit, von einem FLIP-Protein, also einem Protein mit mindestens einer Todeseffektordomäne, gebunden werden zu können. Es wird hier ausdrücklich auf die Offenbarung der älteren Patentanmeldung 197 13 393.2 (S. 7, Zeile 35 bis S. 9, Zeile 4) Bezug genommen.
In einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird durch die Bindung des Antikörpers an das FLIP-Protein der apoptotische Signalweg reaktiviert (Anspruch 3) . Das heißt, daß das extrazellulär an die Zelle herangetragene Apoptosesignal alle Stufen der Signalkaskade - trotz der Expression von FLIP-Protein - durchlaufen kann. Dies hat den Zelltod zur Folge. Ein erfindungsgemäßer Antikörper ist damit in der Lage, die inhibitorische Wirkung des FLIP-Proteins auf die Apoptose aufzuheben. Trotz einer gegebenenfalls vorhandenen Expression des FLIP-Proteins in der Zelle, z. B. durch die Expression eines zellulären FLIP- Proteins oder eines viralen FLIP-Proteins, durchläuft die Zelle durch die Präsenz des Antikörpers die apoptotischen Reaktionen.
Wie bereits aus der oben zitierten, älteren deutschen Patentanmeldung bekannt, ist eine Hochregulation und Expression des FLIP-Proteins insbesondere bei zahlreichen pathophysiologischen Zuständen anzutreffen. In zahlreichen Tumoren treten Viren mit transformierenden Eigenschaften auf, wobei die Expression viraler FLIP-Proteine hierbei von zentraler Bedeutung ist. Insbesondere gilt dies für Viren des 7-Herpestyps . Als Beispiel sei in diesem Zusammenhang das Karposi-Sarkom mit einer HHV- 8 -Infektion genannt. Aber auch in Tumoren ohne virale Pathogenese manifestiert sich die Expression von zellulärem FLIP-Protein als tumorigenes Agens. In einem solchen Fall sind die Tumorzellen gegen jeglichem äußeren Apoptosestimulus durch die Inhibition des Apoptosesignalwegs resistent und damit immortalisiert . Die körpereigenen Immunabwehr kann die Zellen nicht mehr eliminieren. Die Bindung eines erfindungsgemäßen anti-FLIP- Protein-Antikörpers an das FLIP-Protein erlaubt dagegen die Rekonstituierung der Apoptosesensitivität der Zelle, also z.B. der immortalisierten Tumorzelle zu einer apoptosefä- higen und damit eliminierbaren Zelle.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der anti-FLIP-Protein-Antikörper gegen einen Epitop gerichtet, der auf einer Todeseffekt - ordomäne des FLIP-Proteins liegt (Anspruch 4) . Typischerweise erfolgt die Bindung des FLIP-Proteins an Proteine des apoptotischen Signaltransduktionswegs über die Todeseffektordomäne (n) . Ein erfindungsgemäßer Antikörper, der einen Epitop auf einer Todeseffektordomäne erkennt, kann damit besonders effizient die inhibitorische Wirkung von FLIP- Protein (en) aufheben.
Bevorzugt ist der erfindungsgemäße Antikörper gegen ein zelluläres FLIP-Protein gerichtet (Anspruch 5) . Zelluläre FLIP-Proteine sind Bestandteil eukaryotischer Genome. Ganz besonders bevorzugt sind in diesem Zusammenhang Antikörper, die Epitope auf FLIP-Proteinen des Humangenoms erkennen
(Anspruch 6) . Durch die Bindung eines erfindungsgemäßen
Antikörpers an ein zelluläres FLIP-Protein kann erfindungs- gemäß typischerweise die Zelle aus einem Apoptose-insensi- tiven Zustand in einen Apoptose-sensitiven Zustand überführt werden.
Der erfindungsgemäße Antikörper kann schließlich auch zur Identifikation von Tumoren eingesetzt werden. Nach Entnahme von potentiell tumorigenem Gewebe kann die Expression von FLIP-Proteinen beobachtet werden. Die FLIP-Proteine werden als Tumormarker herangezogen und mit Hilfe der erfin- dungsgemäßen anti-FLIP-Antikörper detektiert . Die Antikörper werden zu diesem Zweck so markiert, daß ihre Assoziation mit FLIP-Proteinen sichtbar gemacht wird. Dies ist zum einen durch direkte Markierung des erfindungsgemäßen Antikörpers möglich, (z. B. durch Fluoreszenzmarkierung oder radioaktive Markierung, Markierung mit Biotin oder die kovalente Kopplung an ein geeignetes Markerenzym) oder auch indirekt durch einen zweiten gegen den erfindungsgemäßen Antikörper gerichteten anti-anti-FLIP-Protein-Antikörper, der dann gleichfalls nach den oben beschriebenen oder anderen, dem Fachmann jederzeit geläufigen Verfahren markiert sein kann.
Insbesondere bevorzugt ist der Einsatz von anti-FLIP-Anti- körpern bei der Identifizierung von soliden Tumoren, etwa bei dem Kolonkarzinom oder beim Melanom. Erfindungsgemäß wird hiermit die Verwendung von anti-FLIP-Antikörpern zur Detektion von Tumorgewebe in vitro offenbart. Ganz besonders bevorzugt ist der Einsatz der erfindungsgemäßen anti-FLIP- Antikörper bei histologischen Techniken.
In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung weisen die anti-FLIP-Antikörper ein Molekulargewicht von ungefähr 16000 bis 18000 Dalton auf (Anspruch 7) . Die Ermittlung des Molekulargewichts beruhen auf einer, dem Fachmann geläufigen SDS-Page-Analyse . Die anti-FLIP-Protein- Antikörper gehören bei einem solchen Molekulargewicht dem Subtyp IgG der Immunglobuline an. Erfindungsgemäß können jedoch die anti-FLIP-Antikörper auch anderen Subtypen (IgM, IgD oder IgA) angehören. Der Subtyp wird über die jeweilige konstante Region des Antikörpers definiert
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vor- liegenden Erfindung ist der erfindungsgemäße anti-FLIP-
Protein-Antikörper gegen einen FLIP-Protein-Epitop mit der
Aminosäuresequenz SAEVIHQVEEALDTDEKEMLFLCRD gerichtet
(Anspruch 8) . Diese Aminosäuresequenz entspricht einem
Epitop der nativen humanen zellulären FLIP-Proteine c-FLIPL (lange Version) oder c-FLIPs (kurze Version) . Sie ist damit am N-Terminus dieser FLIP-Proteine lokalisiert und bildet gleichzeitig den N-terminalen Bestandteil der Todeseffekt- ordomäne I .
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird der Antikörper durch eine Immunstimulierung von Mäusen isoliert (Anspruch 9) . Dies geschieht, indem der Maus, gegebenenfalls aber auch anderen Säugetieren, wie z.B. Pferd, Schwein, Meerschweinchen, Ziege oder Schaf, Hase, Ratte, ein FLIP- Protein, Epitope eines FLIP-Proteins (bevorzugt mit einer Länge von mehr als sieben Aminosäuren) oder ein Derivat eines FLIP-Proteins (z.B. auch Aggregate) mit ausreichenden antigenen Eigenschaften injiziert werden. Die injizierten Peptide oder Proteine sind vorzugsweise aufgereinigt und in wäßrigem Medium löslich. Diese Immunisierungen werden einmal oder mehrfach in entsprechenden Intervallen (z.B. nach 14 Tagen oder in einem Abstand bis zu einem Monat) wiederholt, häufig über einen Zeitraum von bis zu sechs Monaten. Die Maus antwortet auf diese Fremdantigene mit einer Immunre- aktion, die zur Bildung von Antikörpern führt. Blutentnahmen, ungefähr eine Woche nach einem "Immunisierungsbooster" , erlauben dann die Isolierung der entsprechenden Antikörper aus dem Serum (Harboe & Ingild, Scand. J. Immun. 2 (Suppl. 1), 161, 1973) . Bei diesem Vorgehen können polyklonale Antikörper erhalten werden. Polyklonale Antikörper weisen für zahlreiche Anwendungen ausreichende Charakteristiken auf . In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem anti-FLIP-Protein-Antikörper jedoch um einen onoklonalen Antikörper (Anspruch 10) . Ein monoklonaler anti-FLIP- Antikörper wird nach konventionellen Verfahren hergestellt. Hierzu werden die Milzzellen der immunstimulierten Maus nach Erreichen des optimalen Antikörpertiters mit in vi tro gezüchteten Myelo zellen in Polyethylenglykol fusioniert und danach in einem HAT-Medium aufgezogen. In diesem Medium können nur sogenannte Hybridomzellen aus Milz und Myelom überleben. Um die geeigneten anti-FLIP-Antikörper produzierenden Klone zu isolieren, werden die einzelnen Klone auf ihre Immunoglobulinproduktion überprüft und die produzierenden Klone entweder in vi tro oder in Tieren, vorzugsweise in Körperhöhlen von Mäusen, aufgezüchtet. Bei der Aufzucht der Antikörper produzierenden Zellen in bspw. der Maus resultiert ein Aszites-Tumor, der große Mengen von Antikörpern freisetzt. Diese spezifischen Antikörper werden durch Standardverfahren gereinigt (s.u.). Hinsichtlich weiterer Einzelheiten zur Produktion monoklonaler Antikörper wird auf "Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A new dimension in biological analyses, Kennet et al . , Plenum Press, New York, 1980" und "Antibodies, A Laboratory Manual, Harlow & Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988" Bezug genommen.
Die resultierenden monoklonalen Antikörper haben die Eigenschaft von einer Zelle abzustammen und weisen somit alle die gleichen spezifischen Antikörpereigenschaften auf , d. h. sie erkennen alle den gleichen Epitop. Erfindungsgemäße Antikörper können nach den üblichen Verfahren isoliert und gereinigt werden (Antibodies, A Laboratory Manual, Harlow & Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988) . In einer keineswegs abschließenden Aufzählung seien die folgenden Methoden genannt: Zentrifuga- tion, Präzipitation, Peptid- und Proteinsäulenchromatogra- phie, HPLC und "reversed phase"-HPLC, Proteinisolierung auf Protein A- oder Protein G-Säulen oder alle denkbaren Kombinationen dieser Methoden. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden Hybridantikörper beansprucht (Anspruch 11) . Unter Hybridantikörpern sind solche Antikörper zu verstehen, deren Antigenbindungsstellen verschiedene Antigene erkennen . Typischerweise erkennen die beiden Bindungsstellen eines Immunglobulins der Subklasse IgG den gleichen Epitop. Erfindungsgemäß können jedoch unter Anwendung geeigneter Verfahren bei Hybridantikörpern die beiden Antigenbindungsstellen verschiedene Epitope auf dem FLIP-Protein erkennen. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden allerdings auch solche Hybridantikörper offenbart, die an der einen Bindungsstelle einen FLIP-Protein-Epitop, an der anderen Bindungsstelle jedoch einen Epitop eines anderen Moleküls erkennen. Bei diesem zweiten Antigen kann es sich um beliebige physiologische oder nicht-physiologische Verbindungen mit Antigeneigenschaften handeln. Mindestens eine Antigenbindungsstelle eines erfindungsgemäßen Antikörpers bindet jedoch an einen Epitop der Aminosäuresequenz eines FLIP-Proteins. Die Herstellung der Hybridantikörper erfolgt über eine Fusionierung zweier monoklonaler Zellinien mit den gewünschten Epitopen oder durch chemische Synthese zweier Antikörperfragmente mit den jeweils spezifischen Bindungsstellen.
In einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden solche anti-FLIP-Protein-Antikör- per beansprucht, die aus einer Hybridomazellinie stammen, welche lebensfähig unter der Registriernummer DSM ACC2306 bei der DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg lb, D-38124 Braunschweig, Deutschland) als Hinterlegungsstelle am 30. April 1997 nach dem Budapester Vertrag über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen von der Anmelderin hinterlegt worden ist (Anspruch 12) . Diese Hybridomazellinie produziert einen monoklonalen Antikörper, der spezifisch einen Epitop auf der Aminosäuresequenz SAEVIHQVEEALDT- DEKEMLFLCRD . Auch das Molekulargewicht des durch die hinterlegten Hybridomazellen produzierten Antikörpers wurde bestimmt. Die Ermittlung des Molekulargewichts beruht auf einer, dem Fachmann geläufigen SDS-Page-Analyse und der Western-Blot- Technik. Im Zuge der SDS-Page-Analyse wurde ein Molekularge¬ wicht von 900000 Dalton ermittelt. Zur Durchführung des Western-Blots wurden zunächst die erfindungsgemäßen anti- FLIP-Antikörper eingesetzt, um im Zellysat das zelluläre FLIP-Protein zu detektieren. Mit anti-IgM- bzw. mit anti- IgG-Antikörper (jeweils der Ratte) wurde der erfindungsgemäße Antikörper getestet. Nur mit dem anti-IgM-Antikörper wurde ein Signal beobachtet. Die anti-FLIP-Protein-Antikör- per, die durch die hinterlegten Hybridomazellen produziert werden, gehören folglich dem Subtyp IgM der Immunglobuline an. Der Subtyp wird über die konstante Region des Antikörpers definiert.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist der monoklonale Antikörper an ein zytotoxisches Molekül oder an ein Markermolekül gebunden (Anspruch 13) . Typischerweise handelt es sich dabei um eine kovalente Bindung.
Als zytotoxische Substanzen sind insbesondere zytotoxische Proteine oder Proteinabschnitte, beispielsweise Domänen, ge- eignet, die durch die bekannten rekombinanten Verfahren mit einem erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper verbunden werden. Solche rekombinanten Sequenzen aus Antikörper und zytotoxischem Protein werden mit geeigneten Promotoren versehen und in Expressionsvektoren eingebracht, mit denen Wirtszellen in vi tro und/oder in vivo transfiziert werden. Auf diese Weise werden Apoptose-insensitive Zielzellen durch die Transfektion mit einem exprimierten rekombinanten anti- FLIP-Protein-Antikörper einerseits für extrazelluläre apoptotische Signale sensibilisiert , andererseits führt auch die Wirkung der zytotoxischen Komponente zum Zelluntergang.
Beide Phänomene verstärken damit die Eliminierung der Zielzelle, z.B. der Tumorzelle. Markermoleküle dienen zur Markierung der erfindungsgemäßen Antikörper. Auf diese Weise gelingt es, die Präsenz des vom Antikörper erkannten Antigens qualitativ und/oder quantitativ zu bestimmen. So ist typischerweise ein kovalent gebundenes fluoreszierendes Molekül an einen erfindungsgemäßen Antikörper gebunden. Bei entsprechender Anregung gibt der Antikörper ein Fluoreszenzsignal z.B. auf einem histologischen Schnitt oder einem Western-Blot ab und indiziert damit die Präsenz des Antigens. Als geeignete Fluoreszenzsonden seien beispielhaft l-Anilino-8-Napht- halinsulfonat , l-Dimethylaminonaphthalin-5-sulfonylchlorid und Fluoreszein-Isothiocyanat oder Rhodamin bzw. deren Derivate genannt .
Neben der Fluoreszenzmarkierung ist alternativ oder in Kombination auch eine Markierung der anti-FLIP-Antikörper mit radioaktiven Isotopen möglich. Bevorzugt ist der Einsatz des γ-Strahlers 15I , mit dem eine Phenolgruppe mindestens eines Tyrosins eines erfindungsgemäßen Antikörpers markiert wird. Denkbar ist aber auch, daß weiche |3-Strahler, wie 3H, 35S oder 14C, Verwendung finden.
Weiterhin kann als Markierungsmethode Biotin an einen erfindungsgemäßen Antikörper kovalent gekoppelt werden. Die Detektion erfolgt dann durch die Bindung von Streptavidin an das Biotinmolekül , wobei Streptavidin wiederum mit einem "Label", z.B. einem der oben genannten "Label", verbunden ist.
Darüber hinaus kann das Markermolekül auch ein Enzym darstellen, das ein Substrat auf quantifizierbare Weise umsetzt. Die Enzyme sind kovalent an den Antikörper gebunden. Typischerweise werden als Enzyme die Alkalische Phosphatase, die Peroxidase oder Doppelenzymsysteme, bei denen das Produkt der ersten Enzymreaktion (des kovalent an den Antikörper gebundenen Enzyms) durch eine zweite, nachgeschaltete Enzymreaktion weiter umgesetzt wird. Erst das Produkt der Zweitreaktion wird dann, zumeist optisch, nachgewiesen .
In einer weiteren denkbaren Ausführungsform wird ein Protein, vorzugsweise ein Markerprotein, insbesondere bevorzugt ein Markerenzym, durch Rekombination derart verändert, daß die variable Region oder Abschnitte der variablen Region mit einer anti-FLIP-Protein-Bindungseigen- schaft durch die dem Fachmann geläufige Rekombination- stechnologie in die Aminosäuresequenz eines anderen Proteins, insbesondere eines Markerenzyms, integriert werden. Auf diese Weise vereinigt das z.B. rekombinierte Markerenzym die antigene Bindungseigenschaft des anti-FLIP-Antikörpers mit der "Label" -Funktion oder einer anderen gewünschten Funktion des Enzyms. Ferner kann die Sequenz der Bindungs- stelle des Antikörpers mit einem intrazellulären, cytoplas- matischen Protein durch die Methoden der DNA-Rekombinationstechnologie verbunden werden. Auf diese Weise wird ein Hybridprotein geschaffen, das einerseits FLIP-Protein binden kann und andererseits aber im Zytoplas a anzutreffen ist. Dadurch wird es möglich, die Transduktion des Apoptosesi- gnals zu beeinflussen.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden monoklonale Antikörper offenbart, die "humanisiert" sind (Anspruch 14) . In einem solchen Fall weisen die rekombinanten monoklonalen Antikörper eine variable Region, auf, wie sie nach der Immunstimulierung einer Maus oder eines anderen geeigneten Säugetiers (z.B. Ratte, Schwein, Affe etc.) erhalten wird. In einer weiteren Ausführungsform liegen im rekombinanten Antikörper nur Abschnitte der variablen Region oder auch nur die Antigenbindungsstelle des monoklonalen Tier-Antikörpers vor. In einem solchen Fall werden die fehlenden Abschnitte der variablen Region aus der Sequenz eines humanen Antikörpers ergänzt. Die konstante Region des Tier-Antikörpers wird im rekombinanten humanisierten Antikörper jedoch typischerweise stets gegen die entsprechende konstante Region (insbesondere IgG) des Humangenoms ersetzt. Hierfür kommen z. B. die humanen Sequenzen der konstanten Regionen IgGl bis IgG4 in Frage, wobei typischerweise die adäquaten isotypischen Äquivalente gewählt werden (beispielsweise ist der murine Subklassentyp IgGl äquivalent mit dem humanen Subklassentyp IgG4) . Typische Verfahren zur Herstellung von humanisierten oder Chimären Antikörpern, auf die in der vorliegenden Erfindung Bezug genommen wird, finden sich bei Riechmann et al . (Nature 332, 323, 1988), Liu et al . (PNAS, 84, 3439, 1987) und Winter &_ Harris (TIPS 14, 139, 1993) .
Ein solcher Antikörper eignet sich dann vor allem deshalb zum Einsatz im menschlichen Organismus, da er nicht als Fremdantigen erkannt wird. Insoweit unterbleibt die humane Immunreaktion, wie sie etwa bei einem originär murinen Antikörper (der Maus oder Ratte) zu erwarten ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein Antikörper beansprucht, der gegen einen monoklonalen anti-FLIP-Antikörper nach einem der Ansprüche 10 bis 14 gerichtet ist (Anspruch 15). Dies bedeutet, daß auch anti-anti-FLIP- Protein-Antikörper zum Erfindungsgegenstand gehören. Zur Immunisierung wird ein anti-FLIP-Antikörper bzw. Protein- abschnitte eines anti-FLIP-Antikörpers eingesetzt. Das Immunsystem antwortet darauf mit der Produktion von anti- anti-FLIP-Protein-Antikörpern. Das Verfahren zur Herstellung der anti-anti-FLIP-Protein-Antikörper ist darüber hinaus identisch mit den in der vorliegenden Anmeldung beschriebe- nen Verfahren zur Herstellung von anti-FLIP-Protein-Antikör- pern. Diese anti-anti-FLIP-Protein-Antikörper sind insbesondere als markierte Antikörper zur mittelbaren Detektion von FLIP-Protein von Bedeutung.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind DNA- Sequenzen, die für die erfindungsgemäßen anti-FLIP-Protein- Antikörper kodieren (Anspruch 16) . Aufgrund des degenerier- ten Charakters des genetischen Codes ergeben sich zahlreiche Nukleotidsequenzen, die für eine Aminosäuresequenz eines erfindungsgemäßen anti-FLIP-Antikörpers kodieren können. Insbesondere wird die DNA-Sequenz jenes anti-FLIP-Protein- Antikörpers beansprucht, der durch die bei der DSMZ unter der Registriernummer ACC2306 hinterlegte Hybridomazellinie produziert wird.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden auch die zu den erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen (mit jeweils beiden komplementären Strängen) der anti-FLIP-Protein-Antikörper jeweils komplementären RNA-Sequenzen offenbart . Insbesondere sind die Primärtranskripte (z.B. die mRNA) der erfindungs- gemäßen DNA-Sequenzen bevorzugt.
Eine erfindungsgemäße DNA-Sequenz kann außerdem operabel mit einem Promotor verbunden sein. Er liegt dann vorzugsweise stromaufwärts von der erfindungsgemäßen DNA-Sequenz. Dieser Promotor kann, abhängig vom experimentellen Ziel, ein proka- ryotischer oder ein eukaryotischer Promotor sein. Geeignete Promotoren werden in der vorher zitierten älteren deutschen Patentanmeldung genannt, worauf ausdrücklich Bezug genommen wird (S. 24, Zeile 1 bis S. 25, Zeile 6). Gleichermaßen können auch weitere Steuerungseiemete, wie z. B. Enhancer oder ähnliche, mit der erfindungsgemäßen DNA-Sequenz verbunden sein. In diesem Zusammenhang wird ausdrücklich auf die Ausführungen auf der S. 25, Zeilen 8 bis 32, in der altern Anmeldung Bezug genommen.
Darüber hinaus kann eine erfindungsgemäße DNA-Sequenz, die demnach für einen anti-FLIP-Antikörper kodiert, weitere Nukleotidsequenzen am N- oder C-Terminus enthalten. Ganz besonders bevorzugt sind in diesem Zusammenhang sogenannte "Leader-Sequenzen" , die während oder nach der Translation den topographischen Zielort eines Proteins bestimmen. So etwa kann ein Protein in bestimmte zelluläre Kompartimente eingeschleust oder z. B. über den endosomalen Export in die Zellmembran oder in den extrazellulären Raum transportiert werden. Auf diese Weise läßt sich die Funktionalität eines Proteins steuern. Antikörper werden typischerweise für den Export in den extrazellulären Raum vorbereitet und dann entweder in die Zellmembran eingebaut oder sekretiert. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist es wünschenswert, daß anti-FLIP-Antikörper intrazellulär zur Wirksamkeit gelangen. Da die apoptotische Signalkaskade im Zytoplasma angesiedelt ist und folglich auch die inhibitorischen FLIP-Proteine dort den Apoptosemechanismus blockieren, ist der Verbleib der anti-FLIP-Antikörper im Zytoplasma ganz besonders bevorzugt. Durch den Einsatz entsprechender "Leader-Sequenzen" kann der Export der Antikörper verhindert und ein Verbleib der Antikörper im Zytoplasma sichergestellt werden.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung sind Vektoren, die eine erfindungsgemäße DNA-Sequenz, typischerweise mit einem Promotor und gegebenenfalls mit weiteren der oben beschriebenen Steuerungselemente für die Transskrip- tion, Translation und/oder Zellokalisation enthalten (Anspruch 17) . Sie dienen dazu, daß die erfindungsgemäße Nukleotidsequenz in spezifischen Wirtszellen vermehrt und exprimiert werden kann. Im allgemeinen werden Vektoren verwendet, die sich unabhängig vom Wirtschromosom autonom replizieren können. Sie besitzen einen eigenen "origin of replication" . Solche Sequenzen sind in Bakterien, in Hefe oder in Viren vorhanden. Dagegen sind die "origins" in Expressionsvektoren von Säugern nicht erforderlich. Ganz besonders bevorzugt sind Transfektionsvektoren, die die erfindungsgemäße DNA-Sequenz in bestimmte Zielzellen einschleusen und dort zur Expression bringen können. Auch in bezug auf die Expressionsvektoren wird ausdrücklich die Offenbarung der oben zitierten älteren deutschen Patentanmeldung in die vorliegende Patentanmeldung aufgenommen (S. 25, Zeile 34 bis S. 26, Zeile 37).
Darüber hinaus wird in einer besonders bevorzugten Aus- führungsform ein Vektor beansprucht, der sowohl eine DNA-Se¬ quenz für die Kodierung von anti-FLIP-Protein-Antikörpern, so wie in Anspruch 16 bezeichnet, als auch eine DNA-Sequenz, die für ein Fas-Protein kodiert, umfaßt (Anspruch 18) . Durch eine Induktion der Expression von Fas, dem membranständigen Apoptoserezeptor, und von anti-FLIP-Protein-Antikörper wird die Apoptose-Sensitivität einer mit einem solchen Vektor transfizierten Zelle verstärkt. Bereits die Hochregulation von Fas stellt einen Stimulus für die Zellapoptose dar. Auf diese Weise kann ohne ein zusätzliches extrazelluläres Apoptosesignal der Zelltod durch die Expression der beiden Proteine herbeigeführt werden. Dies ist insbesondere für einen gentherapeutischen Ansatz, d.h. einer in vivo Trans- fektion z.B. von Tumorzellen, relevant. Eine spezifisch erhöhte Apoptosetendenz z.B. von Tumorzellen resultiert damit aus der Transfektion der beiden genannten Gene in Form eines Transfektionsvektors und ihrer nachfolgenden Expression (als anti-FLIP-Protein-Antikörper und Fas-Protein) in der Zielzelle. Denkbar ist allerdings auch die Integra- tion von Genen für andere membranständige Apoptoserezepto- ren, wie TNFR-1 und/oder TRAMP, im Vektor anstelle oder gemeinsam mit dem Gen für Fas-Protein.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Wirtszellen, die mit einer DNA-Sequenz für einen erfindungsgemäßen Antikörper stabil transfiziert sind (Anspruch 19) . Die Wirtszellen können einerseits zur Expression des erfindungsgemäßen Antikörpers herangezogen werden. Hierbei werden die Wirtszellen in vi tro, typischerweise mit einem eine DNA-Sequenz für den erfindungsgemäßen Antikörper enthaltenden Expressionsvektor, transfiziert . Bei diesen Zellen kann es sich um pro- oder eukaryotische Zellen handeln. Es wird hier ausdrücklich auf die Ausführungen (S. 30, Zeile 17 bis S. 31, Zeile 21) der älteren Patentanmel- düng Bezug genommen.
Andererseits können die Wirtszellen jedoch auch in vi tro transfiziert und dann retransplantiert werden. Es handeln sich dann typischerweise um ein transfiziertes Autotransplantat, gegebenfalls jedoch auch um Allotransplantate . Die mit der erfindungsgemäßen DNA transfizierten Wirtszellen können nach der Transplantation nach der Auslösung eines entsprechenden Apoptosestimulus apoptotisch reagieren.
Besonders bevorzugt werden die Wirtszellen jedoch in vivo transfiziert . Derartige in vivo-Transfektionen werden im folgenden für die vorliegende Erfindung als gentherapeutischer Ansatz erläutert.
Die vorliegende Erfindung schließt damit auch all diejenigen Methoden und Verfahren ein, die dem Fachmann im Zusammenhang mit der Gentherapie geläufig sind. Insbesondere sind die DNA-Sequenzen der erfindungsgemäßen Antikörper dazu geeignet, die transfizierten Wirtszellen für die Apoptose zu sensibilisieren. Hierbei werden gentherapeutische Verfahren also dazu benutzt, in spezifischer Weise Zielzellen der Apoptose zuzuführen. DNA-Sequenzen der erfindungsgemäßen anti-FLIP-Protein-Antikörper werden an einen Promoter gekoppelt, der beispielsweise gewebespezifisch sein kann. So etwa wird beim gentherapeutischen Ansatz zur Apoptosesen- sibilisierung von Melanomzellen idealerweise ein Promoter aus Melanin-produzierenden Zellen gewählt, der solchenfalls auch sicherstellt, daß die Expression von anti-FLIP-Antikör- pern ausschließlich in den betroffenen Melanomzellen erfolgt. Im Prinzip können jedoch beliebige eukaryotische Promotoren in Verbindung mit den erfindungsgemäßen DNA- Sequenzen der anti-FLIP-Antikörper eingesetzt werden.
Als Transfektionsvektoren kommen alle dem Fachmann geläufigen Systeme in Frage: z. B. Viren mit rekombinierten DNA- Sequenzen, kolloidale Dispersionssysteme, Liposo en oder auch die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen der anti-FLIP- Antikörper, ohne aber von einem Trägermedium umhüllt zu sein. Als virale Vektoren seien beispielhaft und keineswegs abschließend genannt: Adenoviren, Herpesviren oder RNA- Viren, z. B. Retroviren.
Für die Herstellung der retroviralen Transportsysteme wird auf die durch die Literatur bekannten Verfahren verwiesen. Insbesondere kommen hier Kombinationen von zwei viralen Genomen in Betracht, wobei jedes Genom für sich genommen keine Fähigkeit zur Produktion infektiöser viraler Partikel besitzt. Die erfindungsgemäße RNA-Sequenz oder die erfin- dungsgemäßen RNA-Sequenzen ggf. in Kombination mit weiteren Genen wird (werden) gegen die sogenannten Strukturgene der Retroviren ausgetauscht. Dadurch sind diese rekombinierten Nukleotidsequenzen nicht in der Lage, für die viralen Umhüllungen (z.B. Kapside) zu kodieren. Um intakte virale Partikel herzustellen, wird daher auf Plasmide zurückgegriffen, die in Helferzellinien vermehrt werden, aber für das Packungssignal der Nukleotidsequenz defizient sind. Auf diese Weise entstehen leere virale Umhüllungen, die sich im Falle einer Doppelinfektion mit den erfindungsgemäß rekom- binanten Nukleotidsequenzen zu infektiösen viralen Partikeln zusammensetzen lassen.
Als kolloidale Dispersionssysteme sind makromolekulare Komplexe, Nanokapseln, Mikrosphären, Öl-in-Wasser-Emulsio- nen, Mizellen oder Liposomen denkbar. Bevorzugt ist in diesem Zusammenhang der Einsatz von Liposomen. Liposomen weisen eine künstliche Membran auf, die es erlaubt, RNA oder DNA in wässriger Lösung einzuschließen und dann in biologisch aktiver Form an die Zielzellen weiterzugeben. Die Bindungsspezifität der Vektoren an die Zielzellen muß als wesentliche Randbedingung für einen erfolgreichen gentherapeutischen Ansatz gewährleistet sein. Außerdem müssen die Liposomen die eingeschlossene DNA oder RNA im Zytoplasma der Zelle freisetzen. Vorteilhaft ist in diesem Zusammenhang die Kopplung der Liposomen an einen Liganden, der durch seine Bindungsspezifität für gewisse Zielzellen selektiv mit deren Oberflächenstrukturen interagiert . Hierfür eignen sich beispielsweise monoklonale Antikörper, Zucker, Glykolipide oder Proteine. Im vorliegenden Fall ist eine Kopplung der als Vektoren eingesetzen Liposomen an monoklonale Antikörper, die z.B. einen gewissen Tumormarker auf der Tumorziel- zelle erkennen, besonders vorteilhaft.
Neben der erfindungsgemäßen DNA der anti-FLIP-Protein- Antikörper können auch weitere rekombinierte Gene im Transfektionsvektor vorhanden sein. Beispielhaft seien hier selektierbare Markergene genannt, die es erlauben, als Reportergene den Nachweis einer stabilen Transfektion der erfindungsgemäßen DNA zu führen. Weiterhin können Gene für eine bestimmte Oberflächenstruktur, die die Bindungsspezifi- tät an die Zielzellen sicherstellt, im Transfektionssystem integriert sein. Ein solches Gen dient dann zur Expression eines Genprodukts, das als Ligand an einen Rezeptor der Zielzelle bindet und eine gezielte Gentherapie der betroffenen Zellen erlaubt. Darüber hinaus können neben den erfindungsgemäßen DNA- oder im Fall von Retroviren RNA-Sequenzen auch Gene, die gleichfalls von therapeutischem Nutzen sind, durch das Vektorsystem für gentherapeutische Ansätze übertragen werden. Zu denken ist hier insbesondere an für Apoptoserezeptoren kodierende Gene, ganz besonders an den Fas-Rezeptor, oder andere Gene, deren (verstärkte) Ex- pression eine Beschleunigung der Apoptose der transfizierten Zelle bewirkt.
Die vorliegende Erfindung wird durch die nachfolgenden Figuren näher erläutert:
Figur la stellt einen Western-Blot dar, wobei gegen PHA- aktivierte, humane T-Zellen am Tag 1 bzw. am Tag 6 nach der Stimulierung erfindungsgemäße anti-FLIP-Protein-Antikörper eingesetzt wurden.
Figur lb stellt einen Western-Blot dar, wobei erfindungsgemäße anti-FLIP-Protein-Antikörper (erkennen humanes FLIP- Protein) gegen ConcanavalinA-aktivierte Splenozyten der Maus (Tag 1 bzw. Tag 3 nach der Stimulierung) eingesetzt wurden. Figur 2 stellt den Anteil an apoptotischen Zellen nach der Gabe von FasL dar. Getestet wurden diverse Melanoma-Zel- linien.
Figur 3 stellt die Expression von c-FLIPL in diversen Melanoma-Zellinien dar.
In Figur la wird dargestellt, daß humane PHA-aktivierte T- Zellen am ersten Tag der Stimulierung eine deutliche Bande bei 55 kD im Western-Blot zeigen. Diese Bande ist am Tag 6, wenn auch sehr schwach, noch erkennbar. Die Detektion der FLIP-Expression in den Zellen erfolgte über einen erfindungsgemäßen anti-FLIP-Protein-Antikörper. Der eingesetzte Antikörper entspricht dem unter der Registriernummer DSM ACC2306 bei der DSMZ in Braunschweig hinterlegten Antikörper. Dieser wurde als anti-FLIP-Protein-Antikörper auch in allen nachfolgenden Experimenten eingesetzt. Als Kontrolle wurden mit FLIPL-transfizierte (0,3 μg DNA) 293T-Zellen (in der Anwesenheit von z-VAD-fmk) auf einem Western-Blot mit dem anti-FLIP-Antikörper behandelt. Es zeigt sich eine deutliche Bande für das transfizierte FLIP-Protein bei 55 kD. Auf dem Nitrozellulose-Blot wurde durch Anfärbung mit Ponceau S - ebenfalls zur Kontrolle - die vergleichbare Proteinauftragung für die untersuchten Zellen nachgeprüft. Auf diese Weise sind die Signale der stimulierten Zellen nach 1 bzw. 6 Tag(en) auch in quantitativer Hinsicht aussagekräftig . Das Balkendiagramm stellt den Prozentsatz von apoptotischen Zellen nach Gabe von sFasL (0,2 μg/ml , Inkubationsdauer: 6 h) für aktivierte Zellen am ersten und sechsten Tag nach der Stimulierung dar. Der Anteil der apoptotischen Zellen wurde mittels der Methode der Freisetzung des Histon-DNA-Komplexes bestimmt . Es zeigt sich, daß die T-Zellen am ersten Tag nach der Stimulierung (starke Expression des FLIP-Proteins) gegenüber der FasL- induzierten Apoptose geschützt sind. Am Tag 6 dagegen (bei schwacher FLIP-Protein-Expression) sind die Zellen Apoptose-sensitiv.
Figur lb zeigt die Ergebnisse von ähnlichen Experimenten wie in Figur la. Es werden hier Lysate von Mäuse-Splenocyten am ersten und dritten Tag nach der Aktivierung mit Concanava- linA untersucht. Eingesetzt werden die gleichen Antikörper wie in Figur la (gegen humanes FLIP-Protein gerichtet) . Die 55 kD-Bande von FLIPL ist am ersten Tag zu erkennen, am dritten dagegen kaum noch. Bei der am Tag 1 erkennbaren 45 kD-Bande handelt es sich um eine prozessierte Form von FLIPL.
Zugleich wurde die Qualität des anti-FLIP-Protein-Antikör- pers, d.h. seine Sensitivität gegenüber dem Antigen, gete- stet. Hierzu wurden 293T-Zellen mit einem Expressionsvektor für rekombinantes Flag-FLIPL der Maus mit dem für Figur la beschriebenen anti-FLIP-Protein-Antikörper bzw. mit anti- Flag-Antikörper untersucht . Die Signalintensität ist für die beiden Antikörper vergleichbar. Wie auch in Figur la, ist die Apotosesensitivität der aktivierten Mäusesplenozyten gegenüber FasL aufgetragen. Am Tag 1 (deutliche FLIP-Expression) ist nur ein geringer Anteil apoptotischer Zellen zu beobachten. Ein großer Anteil dagegen am Tag 6 nach der Aktivierung.
In Figur 2 ist als Diagramm der Anteil der apoptotischen Zellen bei verschiedene Melanomzellinien (DOR, ME304, NA8- MEL, ME280/1, ME261, MelJuso und MZ2-MEL) sowie als Kontrolle bei Jurkat-Zellen aufgetragen. Die Apotose wurde durch Inkubation (6 h) der Zellen mit rekombinantem FasL (1 μg/ml) ausgelöst. Sämliche Melanomzellinien zeigen nur eine sehr schwache Apotosesensitivität. Dagegen unterliegen nahezu alle Jurkat-Zellen der Apotose. Durch FACS-Analyse wurde die Oberflächenexpression von Fas bestimmt ( (+) : Ex- pression von Fas, (-) keine Expression von Fas) .
Diese Ergebnisse zeigen, daß Tumorzellen, im vorliegenden Fall Melanomzellen, gegen eine Induktion der Apotose ge- schützt sind.
Figur 3 zeigt mit Hilfe eines erfindungsgemäßen Antikörpers, daß maligne Melanomzellen der Zellinien DOR, Me304, NA8-MEL, ME280/1, ME280/2, GLL.19, MelJuso und MZ2-MEL das 55 kD FLIP-Protein exprimieren. Auf den Western-Blots reagieren Lysate dieser Zellinien mit anti-FLIP-Protein-Antikörper. Als Kontrollen dienten Jurkat-Zellen (keine Expression von FLIP-Protein) und mit FLIPL transfizierte 293T-Zellen (erwartungsgemäß starke FLIP-Protein-Expression) . Damit sind Tumorzellen, im vorliegenden Fall Melanomazellen, durch die Expression von FLIP-Protein gegenüber der Apoptose geschützt .
Die Figuren zeigen einerseits, daß die Aktivierung von T- Zellen mit einer transienten Resistenz gegenüber apoptotischen Signalen korrespondiert. Diese Resistenz korreliert mit der Expression von FLIP-Protein. Andererseits wird gezeigt, daß gewisse Tumorzellinien, vor allem Melanomzel- linien, aber auch Kolonkarzinomzellinien, durch die unphysiologische Expression von FLIP-Protein keine Apoptose- sensitivität mehr aufweisen und damit immortalisiert sind. Dabei ist, wie in Figur 2 gezeigt, die Oberflächenexpression von Fas bei Melanomzellen ohne Bedeutung für die fehlende Apoptosereaktion nach entsprechender Stimulation.
Die folgende Erfindung wird durch die nachfolgenden Aus- führungsbeispiele näher erläutert:
1. Ausführungsbeispiel
Dieses Ausführungsbeispiel beschreibt die Herstellung des monoklonalen Antikörpers bzw. der hinterlegten Hybridomazellinie (DSM ACC2306) , die diesen monoklonalen Antikörper produziert.
Als Antigen wurde hierzu gereinigtes Peptid mit der Sequenz (NH2-SAEVIHQVEEALDTDEKEMLFLCRD-COOH) , gebunden an ein das MAP Trägermaterial (MAP (Multiple Antigenic Peptide) ; Posnett, McGrath & Tarn, "A novel method for producing anti- peptide antibodies. Production of site-specific antibodies to the T cell antigen receptor ß-chain", Journal of Biologi- cal Chemistry 263(4) : 1719-25, 1988), wobei die Sequenz den Aminosäuren (AS 2 bis 26) des humanen c-FLIP-Proteins entspricht, verwendet, um mittels bekannter Techniken (wie im U.S. -Patent 4,411,993 beschrieben) monoklonale Antikörper gegen FLIP-Protein herzustellen.
Die Immunisierung der Ratten erfolgte mit dem oben bezeichneten Peptid als Immunogen, gebunden an ein Trägermaterial, welches als Emulsion in Adjuvans (z.B. Mineralöl oder Aluminiumhydroxyd- Präzipitat) vorliegt. Zur Immunisierung wurden 10-100 μg Peptid, gebunden an das Trägermaterial, intraperitoneal injiziert. Die Injektion kann jedoch auch subkutan erfolgen. Drei bis vier Wochen später wurden die Tiere "geboosted" , indem nochmals eine Injektion, wie oben beschrieben, vorgenommen wurde. Während dieser Zeitdauer wurde den Tieren regelmäßig Serum aus der Schwanzader entnommen, welches dann mittels ELISA (Enzyme-Linked- Immunosorbent Assay) gegen das Peptid auf FLIP-Antikörper getestet wurde.
Sobald der gewünschte Antikörpertiter erreicht war, erhielten die positiven Tiere eine letzte Injektion, diesmal intravenös, mit Peptid, gebunden an ein Trägermaterial, welches in einer physiologischen Salzlösung gelöst war. Drei bis vier Tage später wurden die Tiere getötet, und die Milz entfernt. Die aus der Milz isolierten Milzzellen wurden mit einer Mäuse-Myelomazellinie (z.B. NF1) fusioniert. Die nach der Fusion erhaltenen Hybridomazellen wurden auf Mikroti- terplatten in HAT- (Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin) Selektionsmedium kultiviert, um das Wachstum von nicht- fusionierten Milz- oder Myelomazellen zu verhindern.
Die Hybridomazellen wurden auf ihre Fähigkeit untersucht, Antikörper zu produzieren, welche in einem ELISA-Test gegen gereinigtes Peptid reagieren (s. Engvall et al . , Immunochem. 8:871, 1971 und U.S. -Patent 4,703,004) .
Die auf diese Weise erhaltenen Hydridomazellen wurden in vi tro in Kulturflaschen oder in "roller bottles" kultiviert. Die Aufreinigung der monoklonalen Antikörper erfolgte typischerweise mittels Äffinitätschromatographie, welche auf der Bindung des Antikörpers an Peptid, Protein A oder Protein G beruht.
2. Ausführungsbeispiel
Dieses Ausführungsbeispiel zeigt den Nachweis der anti-FLIP- Protein-Spezifität des erfindungsgemäßen anti-FLIP-Antikör- pers .
Zu diesem Zweck wurden einerseits Extrakte von Zellen, die nach Transfektion humanes c-FLIPL mit einer rekombinierten FLAG-Sequenz exprimieren, mit einem anti-FLIP-Protein- Antikörper oder mit einem anti-FLAG-Antikörper untersucht. Andererseits wurden native, aktivierte T-Zellen mit einem anti-FLIP-Protein-Antikörper untersucht .
Hierzu wurden humane T-Lymphozyten mit PHA (Phytohämag- glutinin) aktiviert, so wie bei Klas et al . (Int. Immunol . 5, 625, 1993) beschrieben. Zusammengefaßt stellt sich das Vorgehen folgendermaßen dar: Mononukleäre periphere Blutzellen wurden über Ficol-Plaque (Pharmacia, Schweden) mit Hilfe der Dichtezentrifugation isoliert. Adhärente Zellen wurden auf Grund ihrer Adhärenz während 1 Stunde an Plastikkulturschalen eliminiert. T- Zellen wurden von mononukleären peripheren Blutzellen mit Hilfe des "rosettings" mit 2-Amino-Ethylisothiouroniumbromid behandelten roten Schafsblutzellen abgetrennt (Madson et al . , J. Immunol. Methods 33, 323, 1980) . Die T-Zellen wurden mit PHA (1 μg/ml) für 18 bis 20 Stunden aktiviert, gewaschen und in Anwesenheit von rekombinantem, humanen IL-2 (20-25 U/ml) kultiviert.
Die 293T-Zellen wurden nach der Methode von Thome et al . (Nature 386, 517, 1997) mit humanem c-FLIPL transfiziert .
Für die Isolierung von cDNA-Klonen des humanen und des murinen FLIP wurde als 32P-markierte Sonde ein durch PCR- Amplifikation erhaltenes DNA-Fragment der im EST-Klon 309776 enthaltenen DNA-Sequenz des humanen c-FLIPs benutzt. Dieses Fragment entspricht dem in Figur 4a (ältere deutsche Patentanmeldung mit dem amtlichen Aktenzeichen 19713 393.2) mit 394 bis 903 numerierten DNA-Sequenzabschnitt. Das Screening der λ-ZAP cDNA-Bank von aktivierten humanen Lymphozyten (Fa. Stratagene, auf Anfrage erhältlich durch Hermann Eibel, Universität Freiburg, Deutschland) zur Isolierung der humanen Formen von c-FLIP und das Screening einer entsprechenden Bank von murinen Herzmuskelzellen (Stratagene) zur Isolierung des murinen c-FLIPL wurde nach Empfehlung des Herstellers durchgeführt .
Das komplette ORF des humanen c-FLIPs und des humanen c- FLIPL wurde durch PCR-Methoden amplifiziert , wobei ein 5'- Primer mit einer EcoRI -Sequenz -Verlängerung und ein 3'- Primer mit einer Sequenz -Verlängerung für die Restriktionsenzyme BamHI und EcoRI hier verwendet wurden. Die Insertion erfolgte in die EcoRI Schnittstelle des Vektors. Der Vektor ist abgeleitet vom pCR-3 -Vektor (von der Firma Invitrogen) . In die multiple Klonierungsstelle des Vektors wurde gleichzeitig auch eine FLAG-Sequenz insertiert, die im Leseraster mit der FLIP-Sequenz ist. Das dadurch erhaltene Fusionsprotein kann sowohl durch anti-FLIP-Antikörper als auch durch anti-FLAG-Antikörper (M2, Kodak, USA) detektiert werden. Um eine vorübergehende Transfektion von 293T-Zellen zu erreichen, wurden die Zellen bei einer Konzentration von 1 bis 2xl06 Zellen/10 cm Platte oder 3 bis 6xl05 Zellen/5 cm Platte verteilt und am darauffolgenden Tag mit Hilfe der in der Literatur beschriebenen Kalzium-Phosphat-Präzipitations- methode transfiziert . Das Präzipitat wurde auf den Zellen für 8 Stunden belassen und die Zellen wurden schließlich 26 bis 30 Stunden nach der Transfektion geerntet.
Auf Western-Blots (Figur la) wurden einerseits Zellextrakte von aktivierten humanen T-Zellen, andererseits Zellextrakte aus mit c-FLIPL-Expressionsvektor (mit einer FLAG-Sequenz) transient transfizierten 293T-Zellen aufgetragen. Die Blots wurden mit 5%iger Milch in PBS mit 0,5% Tween saturiert und dann mit Hilfe von monoklonalem anti-FLIP-Protein-Antikörper bei einer Konzentration von 5 μg/ml für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert, wobei darauf ein zweiter Antikörper, der mit Peroxidase markiert war, aufgegeben wurde (zweiter Antikörper von den Jackson Laboratories) . Die Detektion der Proteine wurde durch Chemiluminiszenz verstärkt (Amersham International) .
Der, von der unter der Registriernummer DMS ACC2306 (mit dem von der Anmelderin zugeteilten Bezugszeichen 7F10-2) bei der DSMZ am 30.4.1997 hinterlegten Hybridoma-Zellinie produzierte anti-FLIP-Protein-Antikörper wurde für diesen Versuch verwendet. Dieser Antikörper wurde nach dem in Ausführungsbeispiel 1 dargestellten Verfahren hergestellt.
Mit Hilfe des erfindungsgemäßen anti-FLIP-Antikörpers wurden die Western-Blots analysiert. Die mit Meerettich-Peroxidase markierten Antikörper sind reaktiv gegenüber dem erfindungsgemäßen anti-FLIP-Protein-Antikörper. Die Western-Blots der aktivierten T-Lymphozyten (am Tag 1) weisen genauso wie die transfizierten 293T-Zellen die FLIP-Proteinbande bei einem Molekulargewicht von 55 kD auf. Die aktivierten T-Lymphozyten sind am Tag 6 Apoptose-sensitiv und damit Flip-negativ. Tatsächlich erscheint im Western-Blot von solchen Zellextrakten keine FLIP-Proteinbande .
Zugleich zeigen die dargestellten Western-Blots, daß der erfindungsgemäße anti-FLIP-Protein-Antikörper das gleiche Bandenmuster erkennt wie der anti-FLAG-Antikörper. Dies beweist, daß der anti-FLIP-Antikörper spezifisch ausschließlich an das transfizierte FLIP-Protein bindet.
3. Ausführungsbeispiel
In diesem Ausführungsbeispiel wird der erfindungsgemäße Antikörper gegen humanes zelluläres cFLIPL-Protein (wie in Beispiel 1 bzw. 2) auf seine Affinität gegenüber cFLIPL der Maus getestet (Figur lb) .
Hierzu wurden einerseits Milzzellen der Maus mit Concanava- lin A aktiviert (Löwin et al . , Nature 370, 650-2, 1994). Maus-Milzzellen wurden von den roten Blutzellen befreit und mit Cocanavalin A (4 μg/ml) während 1 bis 3 Tagen aktiviert. Zellextrakte von entsprechend stimulierten Zellen wurden am Tag 1 und am Tag 3 hergestellt. Andererseits wurden 293T- Zellen mit Flag-FLIP-Expressionsvektoren nach den bereits in Beispiel 2 beschriebenen Verfahren transfiziert . Extrakte dieser Zellen wurden gleichfalls entnommen.
Die Zellextrakte wurden jeweils durch die Western-Blot- Technik analysiert (s. Ausführungsbeispiel 2). Die FLIP-Protein-Detektion der transfizierten 293T-Zellen erfolgte sowohl durch einen anti-Flag-Antikörper (Kodak International Biotechnologies) als auch durch den erfindungsgemäßen Antikörper. Die Zellextrakte der aktivierten Milzzellen wurden ausschließlich mit Hilfe des erfindungsgemäßen Antikörpers untersucht.
Als weitere Kontrolle für die Spezifität des anti-FLIP- Antikörpers wurden Zellextrakte von einen Tag alten, mit Concanavalin A stimulierten Mausmilzzellen mit der Western- Blot-Technik analysiert. Hierzu wurde beim ersten Inkuba¬ tionsschritt mit dem anti-FLIP-Antikörper zusätzlich 10 μg/ml des Antigen-Peptids zugegeben. Die Zugabe des Peptids führt zu einer Kompetition zwischen Peptid und FLIP-Protein um die anti-FLIP-Antikörper. Dadurch wird das Signal auf dem Western-Blot eliminiert. Tatsächlich ist kein Signal auf dem Western-Blot zu erkennen. Auch hierdurch wird gezeigt, daß die vom anti-FLIP-Protein-Antikörper erzeugten Banden (bei mit Concanavalin A stimulierten Mausmilzzellen) spezifisch das FLIP-Protein erkennen.
In den aufgetragenen Extrakten der Milzzellen (Extrakte vom Tag 1) und der transfizierten 293T-Zellen erkennt der eingesetzte anti-FLIP-Antikörper jeweils die charakteristische 55 kD-Bande des FLIP-Proteins. Zudem bindet er an ein prozessiertes Spaltprodukt (43 kD) des langen 55 kD-Pro- teins . Der erfindungsgemäße anti-FLIP-Protein-Antikörper, gegen ein humanes FLIP-Protein gerichtet, bindet also gleichfalls an das cFLIPL der Maus.
Darüber hinaus zeigt ein Vergleich der durch den anti-Flag- Antikörper und den anti-FLIP-Antikörper hervorgerufenen Intensität der 55 kD-FLIP-Bande, daß beide Antikörper in den transfizierten 293T-Zellen eine vergleichbare Bandenstärke bewirken.
4. Ausführungsbeispiel
In diesem Ausführungsbeispiel wird die Bindungsspezifität eines humanen anti-cFLIPL-Protein-Antikörpers gegenüber verschiedenen Melanomzellinien demonstriert (Figur 3) .
Die Melanomzellen stammen aus Tumorzellproben, die zuvor aus dem Tumorgewebe von Patienten chirurgisch entfernt worden waren (Tartaglia et al . , Cell 73, 213, 1993). Der in den Beispielen 1, 2, und 3 beschriebene bzw. ver- wendete anti-FLIP-Antikörper wurde auch in diesem Fall zur Analyse von Zellextrakten von acht verschiedenen Melanomzellinien mit Hilfe der Western-Blot-Technik eingesetzt (s. Ausführungsbeispiel 2) . Als Vergleich wurden Extrakte einer 293T-Zellinie mit einem humanes c-FLIPL enthaltenden Expressionsvektor und einer Jurkat-Zellinie untersucht. Der erfindungsgemäße Antikörper zeigte für alle acht Melanomzellinien ein deutliches Signal für die anti-FLIP-55 kd-Protein-Bande .
Zusammenfassend ist festzuhalten, daß ein nach Ausführungsbeispiel 1 hergestellter anti-FLIP-Protein-Antikörper (gegen eine Sequenz eines humanen FLIP-Proteins gerichtet) in Extrakten von aktivierten T-Lymphozyten, von verschiedensten Melanomzellinien und von transfizierten 293T-Zellen seine Bindungsfähikeit an humanes FLIP-Protein unter Beweis stellt. Darüber hinaus ist er auch als Antikörper gegen ein FLIP-Protein der Maus einsetzbar.
Weiterhin werden folgendes Verwendungen der vorliegenden Erfindungsgegenstände offenbart:
Verwendung finden die erfindungsgemäßen anti-FLIP-Antikörper auch im laborexperimentellen Bereich. Typischerweise sind sie dann mit einem "Label" markiert. Es kann sich, wie oben erwähnt, um Fluoreszenzmarkierungen, um Markierungen mit radioaktiven Isotopen, mit Biotin oder um Enzymmarkierungen bzw. um alle dem Fachmann geläufigen Markierungsarten auf den erfindungsgemäßen Antikörpern oder auf anti-anti-FLIP- Protein-Antikörpern handeln.
Substanzen, die gezielt die Regulation der Expression von FLIP-Proteinen modulieren, sind für den medizinischen Einsatz von besonderem Interesse. Abhängig von der Pathophy- siologie kann eine Aktivierung oder Inhibierung der FLIP- Protein-Expression erwünscht sein.
Inhibitoren der FLIP-Expression sind dabei insbesondere als anti-Tumor-Agentien relevant. Diese Inhibitoren können auf allen Ebenen der Expressionskontrolle (z.B. Transkription, Translation, mRNA-Transport , der RNA- oder Proteinstabilität) zu einer Reduzierung der zellulären FLIP-Protein- Konzentration führen. Zum Nachweis der Wirksamkeit derartiger Substanzen mit regulatorischer Funktion werden die erfindungsgemäßen Antikörper eingesetzt. Substanzen mit einem für die FLIP-Expression inhibitorischem Potential werden durch das Ausbleiben einer entsprechenden Antikörperreaktion, d.h. durch das Ausbleiben des entsprechenden Signals der Antikörpermarkierung, identifiziert (z.B. auf Gewebeschnitten von Tumorzellen, die normalerweise eine konstitutive Expression von FLIP-Protein aufweisen) . Umgekehrt dienen die erfindungsgemäßen Antikörper auch zum "Screening" nach Substanzen mit einer für die FLIP-Expression aktivierenden Wirkung. In diesem Fall ergibt sich durch die Antikörperreaktion mit FLIP-Protein ein stärkeres Signal als es für die untersuchten Zellen normalerweise zu erwarten wäre. Derart werden durch die erfindungsgemäßen Antikörper z.B. Substanzen identifiziert, die Apoptose- sensitive Zellen immortalisieren können, indem sie die Expression von FLIP-Protein aktivieren.
Außerdem stellt ein erfindungsgemäßer anti-FLIP-Protein- Antikörper ein Agens für Reinigungsmethoden dar. Antikörper werden auf ein festes Trägermaterial (z.B. Dextran) gepackt und dienen dann nach den an sich bekannten Verfahren zur Proteinreinigung bspw. im Rahmen der Affinitätschromatographie (Maniattis et al . , Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 1982) . Auf diese Weise wird das Antigen, also das FLIP-Protein, zunächst spezifisch an den Antikörper gebunden, dann das Medium von der Säule gewaschen und schließlich durch pH-Wechsel, Wechsel der Ionenstärke o.a. das Antigen vom Antikörper gelöst. Das Antigen, also das FLIP-Protein, wird als gereinigte Fraktion erhalten.
Ferner kommen die erfindungsgemäßen Antikörper in allen bekannten, auf Antikörper-Antigen-Reaktionen beruhenden Verfahren zum Einsatz. Zu nennen wäre das "Immunoblotting" , Immunpräzipitierung, ELISA (Enzymgebundener Immunoassay) , RIA (Radioimmunoassay) , FIA (Fluoreszenzimmunoassay) und FACS (Durchflußzytometrie und Zelltrennungen nach Fluoreszenzmarkierung) .
Vergleichbare Anwendungen ergeben sich auch für anti-anti- FLIP-Protein-Antikörper . Auch sie können auf eine Säule gepackt werden. Sofern es sich um anti-idiotypische Antikörper gegen anti-FLIP-Protein-Antikörper handelt (d.h. anti- anti-FLIP-Protein-Antikörper, die gegen die spezifische Bindungsstelle der anti-FLIP-Antikörper gerichtet sind) , können diese zur Simulation des Antigens (eines FLIP- Proteins) eingesetzt werden. Daraus ergeben sich entsprechende, oben beschriebene Anwendungen.
Erfindungsgemäße Antikörper werden, abgesehen von ihrer Verwendung als Nachweisreagens von FLIP-Protein in entsprechend aufbereiteten Proben (z.B. histologischen Schnitten, etwa in gefrorenen oder formalinfixierten Proben, oder Zellextrakten) und abgesehen von ihrer Bedeutung als therapeutische Substanz mit intrazellulärer Lokalisation, auch zur Untersuchung der biologischen Aktivität des Antigens, also des FLIP-Proteins, eingesetzt. Derart können z.B. in entsprechenden Bindungsstudien biologisch relevante Strukturen des FLIP-Proteins, z.B. für die Bindung an die Adaptormoleküle, untersucht werden.

Claims

Ansprüche
1. Antikörper, dadurch gekennzeichnet, daß er gegen einen Epitop eines FLIP-Proteins gerichtet ist.
2. Antikörper nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß er durch die Bindung an ein FLIP-Protein die FLIP- Aktivität inhibiert .
3. Antikörper nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß er den apoptotischen Signalweg aktiviert.
4. Antikörper nach einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß er gegen einen Epitop auf einer Todeseffektordomäne eines FLIP-Proteins gerichtet ist.
5. Antikörper nach einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß er gegen ein zelluläres
FLIP-Protein gerichtet ist.
6. Antikörper nach einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß er gegen ein humanes zel- luläres FLIP-Protein gerichtet ist.
7. Antikörper nach einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß er ein Molekulargewicht von 17000 +/- 500 Dalton bei einer SDS-Page-Analyse aufweist .
8. Antikörper nach einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß er gegen einen Epitop auf einem FLIP-Proteinabschnitt mit der Aminosäuresequenz SAEVIHQVEEALDTDEKEMLFLCRD gerichtet ist.
9. Antikörper nach einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß er aus einer immunstimulierten Maus isoliert ist.
10. Antikörper nach einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß er monoklonal ist.
11. Antikörper nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um einen Hybridantikörper handelt.
12. Antikörper nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß er von der Hybridoma-Zellinie DSM ACC2306 expri- miert wird.
13. Antikörper nach einem der Ansprüche 10 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß an ihn ein cytotoxisches oder ein
Markermolekül gebunden ist .
14. Antikörper nach einem der Ansprüche 10 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß er eine variable Region eines Antikörpers nach einem der Ansprüche 1 bis 9 und eine konstante Region mit der Sequenz einer Subklasse der humanen IgG-Familie aufweist.
15. Antikörper, dadurch gekennzeichnet, daß er gegen einen Antikörper nach einem der Ansprüche 10 bis 14 gerichtet ist .
16. DNA-Sequenz, dadurch gekennzeichnet, daß sie für einen Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 15 codiert.
17. Vektor, dadurch gekennzeichnet , daß er eine DNA-Sequenz nach Anspruch 16 umfaßt.
18. Vektor, dadurch gekennzeichnet , daß er eine DNA-Sequenz nach Anspruch 16 und eine für ein Fas-Protein codierende DNA-Sequenz umfaßt.
19. Wirtszelle, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine stabil transfizierte DNA-Sequenz nach Anspruch 16 umfaßt.
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Non-Patent Citations (3)

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Title
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