DE19725847A1 - Antikörper gegen FLIP-Protein - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft Antikörper, die gegen Epitope von FLIP-Proteinen gerichtet sind, darüber hinaus solche DNA- Sequenzen, die für Antikörper kodieren, die gegen Epitope von FLIP-Proteinen gerichtet sind, außerdem Expressions­ vektoren mit den oben genannten DNA-Sequenzen und Wirtszel­ len, die mit diesen Expressionsvektoren transformiert sind, wobei die Erfindung mit Hilfe der verschiedenen Erfindungs­ gegenstände in die Regulation des programmierten Zelltods eingreift.

Die Offenbarung der vorliegenden Erfindung schließt aus­ drücklich den gesamten Inhalt der älteren, nicht veröffent­ lichten, deutschen Patentanmeldung mit dem Aktenzeichen 197 13 393.2 ein. Zu diesem Zweck wird eine Kopie dieser älteren Patentanmeldung als Anlage der vorliegenden Erfindung beigefügt. Im übrigen wird im folgenden an Textstellen der vorliegenden Anmeldung auf jeweils besonders relevante korrespondierende Ausführungen in der älteren Patentanmel­ dung ausdrücklich Bezug genommen.

Der programmierte Zelltod ist unter dem Namen Apoptose bekannt und tritt in den verschiedensten physiologischen Stadien und Situationen auf. Eine zentrale Rolle bei Apoptose spielt der Fas-Rezeptor. Über den Fas-Rezeptor erfolgt eine Umsetzung des extrazellulären Apoptosesignals an eine intrazelluläre Signalkaskade, wobei schließlich der Zelltod ausgelöst wird. Intrazellulär wird das Todessignal (das apoptotische Signal) durch ein zytoplasmatisches Sequenzmotiv des Rezeptors, die sogenannte Todesdomäne (DD) vermittelt. Diese Todesdomäne interagiert mit den Adap­ tormolekülen FADD und/oder TRADD. Dies bedeutet, daß die To­ desdomäne eine Anbindung von Adaptormolekülen an den zyto­ plasmatischen Rezeptorteil bewirkt. In der folgenden Stufe der Kaskade wird das Todessignal durch die Bindung der Protease FLICE (auch genannt caspase-8 oder Mch-5 oder MACH) weitergeleitet. Diese Assoziierung erfolgt über sogenannte Todeseffektordomänen (DEDs), die sowohl am C-Terminus des Adaptormoleküls, z. B. FADD, als auch am N-Terminus der Protease FLICE vorhanden sind. Hinsichtlich der Bedeutung der Apoptose für die Zellhomöostase und des Stands der Technik wird auf die Ausführungen in der oben bezeichneten, älteren Patentanmeldung 197 13 393.2 verwiesen (S. 1, Zeile 28 bis S. 4, Zeile 33).

Unter FLIP-Proteinen sind solche Genprodukte zu verstehen, die die Zellapoptose inhibieren und mindestens eine Todes­ effektordomäne aufweisen. Hierzu gehören neben den nativen Aminosäuresequenzen (aus viralen, prokaryotischen oder euka­ ryotischen Genomen) auch funktionsfähige und funktions­ homologe Derivate oder Allele der nativen Sequenzen bzw. Fragmente der nativen Sequenzen, soweit die oben bezeichne­ ten Merkmale von FLIP-Proteinen erfüllt sind. Unter Deriva­ ten von FLIP-Proteinen versteht man dabei Mutanten, deren Sequenzen durch Deletion(en), Insertion(en) und/oder Substi­ tution(en) gegenüber den nativen Sequenzen verändert sind. Es wird in diesem Zusammenhang ausdrücklich auf die Aus­ führungen in der Patentanmeldung 197 13 393.2 Bezug genommen (S. 5, Zeile 31 bis S. 7, Zeile 33). Die beschriebenen Proteine oder Proteinfragmente tragen im Sinne der vor­ liegenden Erfindung die Bezeichnung FLIP-Proteine.

In der älteren deutschen Patentanmeldung 197 13 393.2 werden DNA-Sequenzabschnitte, sowie die von diesen Abschnitten (Ge­ nen) kodierten Genprodukte, d. h. Proteine mit inhibitori­ schen Eigenschaften auf die Signalkaskade beschrieben. Insbesondere werden virale, humane und murine Proteine beschrieben, die die proteolytische Signaltransduktion unterbrechen und somit die Apoptose blockieren. Ganz besonders werden die DNA- bzw. Aminosäuresequenzen des humanen c-FLIP_L (Fig. 4b, "GenBank"-Zugangsnummer: U97074), des humanen c-FLIP_S- (Fig. 4a, "GenBank"-Zugangs­ nummer: U97075) und des c-FLIP_L-Gens (Genprodukts) der Maus (Fig. 4c, "GenBank"-Zugangsnummer: U97076) beschrieben. Genauso werden auch die DNA- bzw. Aminosäuresequenzen der viralen FLIP-Proteine der Viren EHV-2 (ORFE8), HHV-8 (ORF71), HVS (ORF71), BHV-4, MCV (159L) und MCV (160L) offenbart. Die vorliegende Erfindung nimmt ausdrücklich insoweit auf die ältere deutsche Patentanmeldung 197 13 393.2 Bezug, als in dieser Proteine (FLIP-Proteine) mit den Merkmalen, die Apoptose zu blockieren und mindestens eine Todeseffektordomäne aufzuweisen, beschrieben sind (S. 12, Zeile 30 bis S. 22, Zeile 17).

Alle Ausführungen der älteren Patentanmeldung in bezug auf die FLIP-Proteine nach obiger Definition gehören auch zum Gegenstand der vorliegenden Erfindung.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, Substanzen zu identifizieren, die die blockierende Wirkung der FLIP- Proteine auf die Zellapoptose inhibieren und damit den apoptotischen Signaltransfer trotz zellulärer Expression von FLIP-Protein(en) zellulärer oder viraler Herkunft erlauben.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden Antikörper offenbart, die in der Lage sind, die Inhibition der Apopto­ sesignaltransduktion durch FLIP-Proteine zu unterbinden. Insbesondere offenbart die vorliegende Erfindung solche Antikörper, die an humane, virale und murine Antigene, d. h. FLIP-Proteine, binden.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind daher solche Antikörper, die gegen einen Epitop eines FLIP-Proteins gerichtet sind (Anspruch 1). Unter Epitop versteht man dabei solche Aminosäuresequenzabschnitte eines Proteins, in diesem Fall eines FLIP-Proteins, die antigene Eigenschaften aufweisen. Der Epitop stellt dabei eine Aminosäuresequenz flexibler Länge dar, der in der nativen Aminosäuresequenz eines FLIP-Proteins auftritt. Denkbar sind allerdings auch Epitope mit einer gegenüber der nativen Sequenz mutierten Aminosäureabfolge, wobei der an den mutierten Epitop bindende Antikörper auch ein ausreichendes Bindungsvermögen für die native Sequenz besitzen muß. In der Regel werden also nur Sequenzen mit konservativen Mutationen antigene Eigenschaften besitzen, die auch eine ausreichende Bindungs­ affinität des resultierenden Antikörpers an die native Sequenz sicherstellen.

Unter erfindungsgemäßen Antikörpern sind auch solche Antikörper zu verstehen, deren Aminosäuresequenz durch dem Fachmann geläufige molekularbiologische Verfahren gegenüber einer nativen Aminosäuresequenz, d. h. der Aminosäuresequenz des gezüchteten anti-FLIP-Protein-Antikörpers, verändert ist. Durch gezielte Mutagenese kann eine Vielzahl von An­ tikörpern mit unterschiedlichen Aminosäuresequenzen herge­ stellt werden. In der Folge werden diese Antikörper dann in entsprechend ausgelegten Versuchsanordnungen ("Screening") auf ihre spezifischen biologischen Eigenschaften hin untersucht. Anti-FLIP-Protein-Antikörper mit den erwünschten biologischen Eigenschaften können gegebenenfalls in einem weiteren Mutageneseschritt abermals optimiert werden.

Unter Antikörpern im Sinne der vorliegenden Erfindung versteht man auch Fragmente eines einen Epitop auf einem FLIP-Protein bindenden Antikörpers. Zu solchen Fragmenten gehören auch die folgenden, dem Fachmann geläufigen Aus­ prägungsformen: F(ab), F(ab') und F(ab')₂ (Delaloye et al., J. Clin. Invest. 87, 301 ff., 1986).

In einer bevorzugten Ausführungsform bindet ein erfindungs­ gemäßer Antikörper an ein FLIP-Protein derart, daß die FLIP-Aktivität inhibiert ist (Anspruch 2). Auf diese Weise ist das FLIP-Protein nicht in der Lage, sich mit seinen physio­ logischen Bindungspartnern zu assoziieren. Solche Bindungs­ partner können z. B. die Adaptormoleküle FADD oder TRADD sein, gegebenenfalls auch andere Proteine mit der Fähigkeit, von einem FLIP-Protein, also einem Protein mit mindestens einer Todeseffektordomäne, gebunden werden zu können. Es wird hier ausdrücklich auf die Offenbarung der älteren Patentanmeldung 197 13 393.2 (S. 7, Zeile 35 bis S. 9, Zeile 4) Bezug genommen.

In einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform der vor­ liegenden Erfindung wird durch die Bindung des Antikörpers an das FLIP-Protein der apoptotische Signalweg reaktiviert (Anspruch 3). Das heißt, daß das extrazellulär an die Zelle herangetragene Apoptosesignal alle Stufen der Signalkaskade- trotz der Expression von FLIP-Protein - durchlaufen kann. Dies hat den Zelltod zur Folge. Ein erfindungsgemäßer Anti­ körper ist damit in der Lage, die inhibitorische Wirkung des FLIP-Proteins auf die Apoptose aufzuheben. Trotz einer gegebenenfalls vorhandenen Expression des FLIP-Proteins in der Zelle, z. B. durch die Expression eines zellulären FLIP-Proteins oder eines viralen FLIP-Proteins, durchläuft die Zelle durch die Präsenz des Antikörpers die apoptotischen Reaktionen.

Wie bereits aus der oben zitierten, älteren deutschen Patentanmeldung bekannt, ist eine Hochregulation und Expression des FLIP-Proteins insbesondere bei zahlreichen pathophysiologischen Zuständen anzutreffen. In zahlreichen Tumoren treten Viren mit transformierenden Eigenschaften auf, wobei die Expression viraler FLIP-Proteine hierbei von zentraler Bedeutung ist. Insbesondere gilt dies für Viren des γ-Herpestyps. Als Beispiel sei in diesem Zusammenhang das Karposi-Sarkom mit einer HHV-8-Infektion genannt. Aber auch in Tumoren ohne virale Pathogenese manifestiert sich die Expression von zellulärem FLIP-Protein als tumorigenes Agens. In einem solchen Fall sind die Tumorzellen gegen jeglichem äußeren Apoptosestimulus durch die Inhibition des Apoptosesignalwegs resistent und damit immortalisiert. Die körpereigenen Immunabwehr kann die Zellen nicht mehr eliminieren. Die Bindung eines erfindungsgemäßen anti-FLIP- Protein-Antikörpers an das FLIP-Protein erlaubt dagegen die Rekonstituierung der Apoptosesensitivität der Zelle, also z. B. der immortalisierten Tumorzelle zu einer apoptosefä­ higen und damit eliminierbaren Zelle.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vor­ liegenden Erfindung ist der anti-FLIP-Protein-Antikörper gegen einen Epitop gerichtet, der auf einer Todeseffekt­ ordomäne des FLIP-Proteins liegt (Anspruch 4). Typischerwei­ se erfolgt die Bindung des FLIP-Proteins an Proteine des apoptotischen Signaltransduktionswegs über die Todeseffekt­ ordomäne(n). Ein erfindungsgemäßer Antikörper, der einen Epitop auf einer Todeseffektordomäne erkennt, kann damit besonders effizient die inhibitorische Wirkung von FLIP-Protein(en) aufheben.

Bevorzugt ist der erfindungsgemäße Antikörper gegen ein zelluläres FLIP-Protein gerichtet (Anspruch 5). Zelluläre FLIP-Proteine sind Bestandteil eukaryotischer Genome. Ganz besonders bevorzugt sind in diesem Zusammenhang Antikörper, die Epitope auf FLIP-Proteinen des Humangenoms erkennen (Anspruch 6). Durch die Bindung eines erfindungsgemäßen Antikörpers an ein zelluläres FLIP-Protein kann erfindungs­ gemäß typischerweise die Zelle aus einem Apoptose-insensi­ tiven Zustand in einen Apoptose-sensitiven Zustand überführt werden.

Der erfindungsgemäße Antikörper kann schließlich auch zur Identifikation von Tumoren eingesetzt werden. Nach Entnahme von potentiell tumorigenem Gewebe kann die Expression von FLIP-Proteinen beobachtet werden. Die FLIP-Proteine werden als Tumormarker herangezogen und mit Hilfe der erfin­ dungsgemäßen anti-FLIP-Antikörper detektiert. Die Antikörper werden zu diesem Zweck so markiert, daß ihre Assoziation mit FLIP-Proteinen sichtbar gemacht wird. Dies ist zum einen durch direkte Markierung des erfindungsgemäßen Antikörpers möglich, (z. B. durch Fluoreszenzmarkierung oder radioaktive Markierung, Markierung mit Biotin oder die kovalente Kopplung an ein geeignetes Markerenzym) oder auch indirekt durch einen zweiten gegen den erfindungsgemäßen Antikörper gerichteten anti-anti-FLIP-Protein-Antikörper, der dann gleichfalls nach den oben beschriebenen oder anderen, dem Fachmann jederzeit geläufigen Verfahren markiert sein kann. Insbesondere bevorzugt ist der Einsatz von anti-FLIP-Anti­ körpern bei der Identifizierung von soliden Tumoren, etwa bei dem Kolonkarzinom oder beim Melanom. Erfindungsgemäß wird hiermit die Verwendung von anti-FLIP-Antikörpern zur Detektion von Tumorgewebe in vitro offenbart. Ganz besonders bevorzugt ist der Einsatz der erfindungsgemäßen anti-FLIP-Anti­ körper bei histologischen Techniken.

In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung weisen die anti-FLIP-Antikörper ein Molekulargewicht von ungefähr 16 000 bis 18 000 Dalton auf (Anspruch 7). Die Ermittlung des Molekulargewichts beruhen auf einer, dem Fachmann geläufigen SDS-Page-Analyse. Die anti-FLIP-Protein- Antikörper gehören bei einem solchen Molekulargewicht dem Subtyp IgG der Immunglobuline an. Erfindungsgemäß können jedoch die anti-FLIP-Antikörper auch anderen Subtypen (IgM, IgD oder IgA) angehören. Der Subtyp wird über die jeweilige konstante Region des Antikörpers definiert.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vor­ liegenden Erfindung ist der erfindungsgemäße anti-FLIP- Protein-Antikörper gegen einen FLIP-Protein-Epitop mit der Aminosäuresequenz SAEVIHQVEEALDTDEKEMLFLCRD gerichtet (Anspruch 8). Diese Aminosäuresequenz entspricht einem Epitop der nativen humanen zellulären FLIP-Proteine c-FLIP_L (lange Version) oder c-FLIP_S (kurze Version). Sie ist damit am N-Terminus dieser FLIP-Proteine lokalisiert und bildet gleichzeitig den N-terminalen Bestandteil der Todeseffekt­ ordomäne I.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird der Anti­ körper durch eine Immunstimulierung von Mäusen isoliert (An­ spruch 9). Dies geschieht, indem der Maus, gegebenenfalls aber auch anderen Säugetieren, wie z. B. Pferd, Schwein, Meerschweinchen, Ziege oder Schaf, Hase, Ratte, ein FLIP-Protein, Epitope eines FLIP-Proteins (bevorzugt mit einer Länge von mehr als sieben Aminosäuren) oder ein Derivat eines FLIP-Proteins (z. B. auch Aggregate) mit ausreichenden antigenen Eigenschaften injiziert werden. Die injizierten Peptide oder Proteine sind vorzugsweise aufgereinigt und in wäßrigem Medium löslich. Diese Immunisierungen werden einmal oder mehrfach in entsprechenden Intervallen (z. B. nach 14 Tagen oder in einem Abstand bis zu einem Monat) wiederholt, häufig über einen Zeitraum von bis zu sechs Monaten. Die Maus antwortet auf diese Fremdantigene mit einer Immunre­ aktion, die zur Bildung von Antikörpern führt. Blutentnah­ men, ungefähr eine Woche nach einem "Immunisierungsbooster", erlauben dann die Isolierung der entsprechenden Antikörper aus dem Serum (Harboe & Ingild, Scand. J. Immun. 2 (Suppl. 1), 161, 1973). Bei diesem Vorgehen können polyklonale Antikörper erhalten werden. Polyklonale Antikörper weisen für zahlreiche Anwendungen ausreichende Charakteristiken auf.

In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem anti-FLIP-Protein-Antikörper jedoch um einen monoklonalen Antikörper (Anspruch 10). Ein monoklonaler anti-FLIP- Antikörper wird nach konventionellen Verfahren hergestellt. Hierzu werden die Milzzellen der immunstimulierten Maus nach Erreichen des optimalen Antikörpertiters mit in vitro gezüchteten Myelomzellen in Polyethylenglykol fusioniert und danach in einem HAT-Medium aufgezogen. In diesem Medium können nur sogenannte Hybridomzellen aus Milz und Myelom überleben. Um die geeigneten anti-FLIP-Antikörper produzie­ renden Klone zu isolieren, werden die einzelnen Klone auf ihre Immunoglobulinproduktion überprüft und die produzieren­ den Klone entweder in vitro oder in Tieren, vorzugsweise in Körperhöhlen von Mäusen, aufgezüchtet. Bei der Aufzucht der Antikörper produzierenden Zellen in bspw. der Maus resul­ tiert ein Aszites-Tumor, der große Mengen von Antikörpern freisetzt. Diese spezifischen Antikörper werden durch Standardverfahren gereinigt (s. u.). Hinsichtlich weiterer Einzelheiten zur Produktion monoklonaler Antikörper wird auf "Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A new dimension in biological analyses, Kennet et al., Plenum Press, New York, 1980" und "Antibodies, A Laboratory Manual, Harlow & Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988" Bezug genommen.

Die resultierenden monoklonalen Antikörper haben die Eigen­ schaft von einer Zelle abzustammen und weisen somit alle die gleichen spezifischen Antikörpereigenschaften auf, d. h. sie erkennen alle den gleichen Epitop.

Erfindungsgemäße Antikörper können nach den üblichen Verfahren isoliert und gereinigt werden (Antibodies, A Laboratory Manual, Harlow & Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988). In einer keineswegs abschließenden Aufzählung seien die folgenden Methoden genannt: Zentrifuga­ tion, Präzipitation, Peptid- und Proteinsäulenchromatogra­ phie, HPLC und "reversed phase"-HPLC, Proteinisolierung auf Protein A- oder Protein G-Säulen oder alle denkbaren Kombinationen dieser Methoden.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden Hybridantikörper beansprucht (Anspruch 11). Unter Hybridantikörpern sind solche Antikörper zu verstehen, deren Antigenbindungsstellen verschiedene Antigene erkennen. Typischerweise erkennen die beiden Bindungsstellen eines Immunglobulins der Subklasse IgG den gleichen Epitop. Erfindungsgemäß können jedoch unter Anwendung geeigneter Verfahren bei Hybridantikörpern die beiden Antigenbindungs­ stellen verschiedene Epitope auf dem FLIP-Protein erkennen. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden allerdings auch solche Hybridantikörper offenbart, die an der einen Bin­ dungsstelle einen FLIP-Protein-Epitop, an der anderen Bindungsstelle jedoch einen Epitop eines anderen Moleküls erkennen. Bei diesem zweiten Antigen kann es sich um beliebige physiologische oder nicht-physiologische Ver­ bindungen mit Antigeneigenschaften handeln. Mindestens eine Antigenbindungsstelle eines erfindungsgemäßen Antikörpers bindet jedoch an einen Epitop der Aminosäuresequenz eines FLIP-Proteins. Die Herstellung der Hybridantikörper erfolgt über eine Fusionierung zweier monoklonaler Zellinien mit den gewünschten Epitopen oder durch chemische Synthese zweier Antikörperfragmente mit den jeweils spezifischen Bindungs­ stellen.

In einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform der vor­ liegenden Erfindung werden solche anti-FLIP-Protein-Antikör­ per beansprucht, die aus einer Hybridomazellinie stammen, welche lebensfähig unter der Registriernummer DSM ACC2306 bei der DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Deutschland) als Hinterlegungsstelle am 30. April 1997 nach dem Budapester Vertrag über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen von der Anmelderin hin­ terlegt worden ist (Anspruch 12). Diese Hybridomazellinie produziert einen monoklonalen Antikörper, der spezifisch einen Epitop auf der Aminosäuresequenz SAEVIHQVEEALDTDEKEMLFLCRD.

Auch das Molekulargewicht des durch die hinterlegten Hybridomazellen produzierten Antikörpers wurde bestimmt. Die Ermittlung des Molekulargewichts beruht auf einer, dem Fachmann geläufigen SDS-Page-Analyse und der Western-Blot- Technik. Im Zuge der SDS-Page-Analyse wurde ein Molekularge­ wicht von 900 000 Dalton ermittelt. Zur Durchführung des Western-Blots wurden zunächst die erfindungsgemäßen anti- FLIP-Antikörper eingesetzt, um im Zellysat das zelluläre FLIP-Protein zu detektieren. Mit anti-IgM- bzw. mit anti- IgG-Antikörper (jeweils der Ratte) wurde der erfindungs­ gemäße Antikörper getestet. Nur mit dem anti-IgM-Antikörper wurde ein Signal beobachtet. Die anti-FLIP-Protein-Antikör­ per, die durch die hinterlegten Hybridomazellen produziert werden, gehören folglich dem Subtyp IgM der Immunglobuline an. Der Subtyp wird über die konstante Region des Antikör­ pers definiert.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist der monoklonale Antikörper an ein zytotoxisches Molekül oder an ein Markermolekül gebunden (Anspruch 13). Typischerweise handelt es sich dabei um eine kovalente Bindung.

Als zytotoxische Substanzen sind insbesondere zytotoxische Proteine oder Proteinabschnitte, beispielsweise Domänen, ge­ eignet, die durch die bekannten rekombinanten Verfahren mit einem erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper verbunden werden. Solche rekombinanten Sequenzen aus Antikörper und zytotoxischem Protein werden mit geeigneten Promotoren versehen und in Expressionsvektoren eingebracht, mit denen Wirtszellen in vitro und/oder in vivo transfiziert werden. Auf diese Weise werden Apoptose-insensitive Zielzellen durch die Transfektion mit einem exprimierten rekombinanten anti- FLIP-Protein-Antikörper einerseits für extrazelluläre apoptotische Signale sensibilisiert, andererseits führt auch die Wirkung der zytotoxischen Komponente zum Zelluntergang. Beide Phänomene verstärken damit die Eliminierung der Zielzelle, z. B. der Tumorzelle.

Markermoleküle dienen zur Markierung der erfindungsgemäßen Antikörper. Auf diese Weise gelingt es, die Präsenz des vom Antikörper erkannten Antigens qualitativ und/oder quantita­ tiv zu bestimmen. So ist typischerweise ein kovalent gebundenes fluoreszierendes Molekül an einen erfindungs­ gemäßen Antikörper gebunden. Bei entsprechender Anregung gibt der Antikörper ein Fluoreszenzsignal z. B. auf einem histologischen Schnitt oder einem Western-Blot ab und indiziert damit die Präsenz des Antigens. Als geeignete Fluoreszenzsonden seien beispielhaft 1-Anilino-8-Napht­ halinsulfonat, 1-Dimethylaminonaphthalin-5-sulfonylchlorid und Fluoreszein-Isothiocyanat oder Rhodamin bzw. deren Derivate genannt.

Neben der Fluoreszenzmarkierung ist alternativ oder in Kombination auch eine Markierung der anti-FLIP-Antikörper mit radioaktiven Isotopen möglich. Bevorzugt ist der Einsatz des γ-Strahlers ¹²⁵I, mit dem eine Phenolgruppe mindestens eines Tyrosins eines erfindungsgemäßen Antikörpers markiert wird. Denkbar ist aber auch, daß weiche β-Strahler, wie ³H, ³⁵S oder ¹⁴C, Verwendung finden.

Weiterhin kann als Markierungsmethode Biotin an einen erfindungsgemäßen Antikörper kovalent gekoppelt werden. Die Detektion erfolgt dann durch die Bindung von Streptavidin an das Biotinmolekül, wobei Streptavidin wiederum mit einem "Label", z. B. einem der oben genannten "Label", verbunden ist.

Darüber hinaus kann das Markermolekül auch ein Enzym darstellen, das ein Substrat auf quantifizierbare Weise umsetzt. Die Enzyme sind kovalent an den Antikörper gebun­ den. Typischerweise werden als Enzyme die Alkalische Phosphatase, die Peroxidase oder Doppelenzymsysteme, bei denen das Produkt der ersten Enzymreaktion (des kovalent an den Antikörper gebundenen Enzyms) durch eine zweite, nachgeschaltete Enzymreaktion weiter umgesetzt wird. Erst das Produkt der Zweitreaktion wird dann, zumeist optisch, nachgewiesen.

In einer weiteren denkbaren Ausführungsform wird ein Protein, vorzugsweise ein Markerprotein, insbesondere bevorzugt ein Markerenzym, durch Rekombination derart verändert, daß die variable Region oder Abschnitte der variablen Region mit einer anti-FLIP-Protein-Bindungseigen­ schaft durch die dem Fachmann geläufige Rekombinations­ technologie in die Aminosäuresequenz eines anderen Pro­ teins, insbesondere eines Markerenzyms, integriert werden. Auf diese Weise vereinigt das z. B. rekombinierte Markerenzym die antigene Bindungseigenschaft des anti-FLIP-Antikörpers mit der "Label"-Funktion oder einer anderen gewünschten Funktion des Enzyms. Ferner kann die Sequenz der Bindungs­ stelle des Antikörpers mit einem intrazellulären, cytoplas­ matischen Protein durch die Methoden der DNA-Rekombinations­ technologie verbunden werden. Auf diese Weise wird ein Hybridprotein geschaffen, das einerseits FLIP-Protein binden kann und andererseits aber im Zytoplasma anzutreffen ist. Dadurch wird es möglich, die Transduktion des Apoptosesi­ gnals zu beeinflussen.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden monoklonale Antikörper offenbart, die "humanisiert" sind (Anspruch 14). In einem solchen Fall weisen die rekom­ binanten monoklonalen Antikörper eine variable Region, auf, wie sie nach der Immunstimulierung einer Maus oder eines anderen geeigneten Säugetiers (z. B. Ratte, Schwein, Affe etc.) erhalten wird. In einer weiteren Ausführungsform liegen im rekombinanten Antikörper nur Abschnitte der variablen Region oder auch nur die Antigenbindungsstelle des monoklonalen Tier-Antikörpers vor. In einem solchen Fall werden die fehlenden Abschnitte der variablen Region aus der Sequenz eines humanen Antikörpers ergänzt. Die konstante Region des Tier-Antikörpers wird im rekombinanten humani­ sierten Antikörper jedoch typischerweise stets gegen die entsprechende konstante Region (insbesondere IgG) des Human­ genoms ersetzt. Hierfür kommen z. B. die humanen Sequenzen der konstanten Regionen IgG1 bis IgG4 in Frage, wobei typischerweise die adäquaten isotypischen Äquivalente gewählt werden (beispielsweise ist der murine Subklassentyp IgG1 äquivalent mit dem humanen Subklassentyp IgG4). Typische Verfahren zur Herstellung von humanisierten oder chimären Antikörpern, auf die in der vorliegenden Erfindung Bezug genommen wird, finden sich bei Riechmann et al. (Nature 332, 323, 1988), Liu et al. (PNAS, 84, 3439, 1987) und Winter & Harris (TIPS 14, 139, 1993).

Ein solcher Antikörper eignet sich dann vor allem deshalb zum Einsatz im menschlichen Organismus, da er nicht als Fremdantigen erkannt wird. Insoweit unterbleibt die humane Immunreaktion, wie sie etwa bei einem originär murinen Anti­ körper (der Maus oder Ratte) zu erwarten ist.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein Antikörper beansprucht, der gegen einen monoklonalen anti-FLIP-Antikör­ per nach einem der Ansprüche 10 bis 14 gerichtet ist (Anspruch 15). Dies bedeutet, daß auch anti-anti-FLIP- Protein-Antikörper zum Erfindungsgegenstand gehören. Zur Immunisierung wird ein anti-FLIP-Antikörper bzw. Protein­ abschnitte eines anti-FLIP-Antikörpers eingesetzt. Das Immunsystem antwortet darauf mit der Produktion von anti­ anti-FLIP-Protein-Antikörpern. Das Verfahren zur Herstellung der anti-anti-FLIP-Protein-Antikörper ist darüber hinaus identisch mit den in der vorliegenden Anmeldung beschriebe­ nen Verfahren zur Herstellung von anti-FLIP-Protein-Antikör­ pern. Diese anti-anti-FLIP-Protein-Antikörper sind ins­ besondere als markierte Antikörper zur mittelbaren Detektion von FLIP-Protein von Bedeutung.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind DNA- Sequenzen, die für die erfindungsgemäßen anti-FLIP-Protein- Antikörper kodieren (Anspruch 16). Aufgrund des degenerier­ ten Charakters des genetischen Codes ergeben sich zahlreiche Nukleotidsequenzen, die für eine Aminosäuresequenz eines erfindungsgemäßen anti-FLIP-Antikörpers kodieren können. Insbesondere wird die DNA-Sequenz jenes anti-FLIP-Protein- Antikörpers beansprucht, der durch die bei der DSMZ unter der Registriernummer ACC2306 hinterlegte Hybridomazellinie produziert wird.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden auch die zu den erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen (mit jeweils beiden kom­ plementären Strängen) der anti-FLIP-Protein-Antikörper jeweils komplementären RNA-Sequenzen offenbart. Insbesondere sind die Primärtranskripte (z. B. die mRNA) der erfindungs­ gemäßen DNA-Sequenzen bevorzugt.

Eine erfindungsgemäße DNA-Sequenz kann außerdem operabel mit einem Promotor verbunden sein. Er liegt dann vorzugsweise stromaufwärts von der erfindungsgemäßen DNA-Sequenz. Dieser Promotor kann, abhängig vom experimentellen Ziel, ein proka­ ryotischer oder ein eukaryotischer Promotor sein. Geeignete Promotoren werden in der vorher zitierten älteren deutschen Patentanmeldung genannt, worauf ausdrücklich Bezug genommen wird (S. 24, Zeile 1 bis S. 25, Zeile 6). Gleichermaßen können auch weitere Steuerungselemente, wie z. B. Enhancer oder ähnliche, mit der erfindungsgemäßen DNA-Sequenz verbunden sein. In diesem Zusammenhang wird ausdrücklich auf die Ausführungen auf der S. 25, Zeilen 8 bis 32, in der älteren Anmeldung Bezug genommen.

Darüber hinaus kann eine erfindungsgemäße DNA-Sequenz, die demnach für einen anti-FLIP-Antikörper kodiert, weitere Nukleotidsequenzen am N- oder C-Terminus enthalten. Ganz be­ sonders bevorzugt sind in diesem Zusammenhang sogenannte "Leader-Sequenzen", die während oder nach der Translation den topographischen Zielort eines Proteins bestimmen. So etwa kann ein Protein in bestimmte zelluläre Kompartimente eingeschleust oder z. B. über den endosomalen Export in die Zellmembran oder in den extrazellulären Raum transportiert werden. Auf diese Weise läßt sich die Funktionalität eines Proteins steuern. Antikörper werden typischerweise für den Export in den extrazellulären Raum vorbereitet und dann entweder in die Zellmembran eingebaut oder sekretiert. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist es wünschenswert, daß anti-FLIP-Antikörper intrazellulär zur Wirksamkeit gelangen. Da die apoptotische Signalkaskade im Zytoplasma angesiedelt ist und folglich auch die inhibitorischen FLIP-Proteine dort den Apoptosemechanismus blockieren, ist der Verbleib der anti-FLIP-Antikörper im Zytoplasma ganz besonders bevorzugt. Durch den Einsatz entsprechender "Leader-Sequenzen" kann der Export der Antikörper verhindert und ein Verbleib der Antikörper im Zytoplasma sichergestellt werden.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung sind Vektoren, die eine erfindungsgemäße DNA-Sequenz, typischer­ weise mit einem Promotor und gegebenenfalls mit weiteren der oben beschriebenen Steuerungselemente für die Transskrip­ tion, Translation und/oder Zellokalisation enthalten (An­ spruch 17). Sie dienen dazu, daß die erfindungsgemäße Nukleotidsequenz in spezifischen Wirtszellen vermehrt und exprimiert werden kann. Im allgemeinen werden Vektoren verwendet, die sich unabhängig vom Wirtschromosom autonom replizieren können. Sie besitzen einen eigenen "origin of replication". Solche Sequenzen sind in Bakterien, in Hefe oder in Viren vorhanden. Dagegen sind die "origins" in Expressionsvektoren von Säugern nicht erforderlich. Ganz besonders bevorzugt sind Transfektionsvektoren, die die erfindungsgemäße DNA-Sequenz in bestimmte Zielzellen einschleusen und dort zur Expression bringen können. Auch in bezug auf die Expressionsvektoren wird ausdrücklich die Offenbarung der oben zitierten älteren deutschen Patentan­ meldung in die vorliegende Patentanmeldung aufgenommen (S. 25, Zeile 34 bis S. 26, Zeile 37).

Darüber hinaus wird in einer besonders bevorzugten Aus­ führungsform ein Vektor beansprucht, der sowohl eine DNA-Se­ quenz für die Kodierung von anti-FLIP-Protein-Antikörpern, so wie in Anspruch 16 bezeichnet, als auch eine DNA-Sequenz, die für ein Fas-Protein kodiert, umfaßt (Anspruch 18). Durch eine Induktion der Expression von Fas, dem membranständigen Apoptoserezeptor, und von anti-FLIP-Protein-Antikörper wird die Apoptose-Sensitivität einer mit einem solchen Vektor transfizierten Zelle verstärkt. Bereits die Hochregulation von Fas stellt einen Stimulus für die Zellapoptose dar. Auf diese Weise kann ohne ein zusätzliches extrazelluläres Apoptosesignal der Zelltod durch die Expression der beiden Proteine herbeigeführt werden. Dies ist insbesondere für einen gentherapeutischen Ansatz, d. h. einer in vivo Trans­ fektion z. B. von Tumorzellen, relevant. Eine spezifisch erhöhte Apoptosetendenz z. B. von Tumorzellen resultiert damit aus der Transfektion der beiden genannten Gene in Form eines Transfektionsvektors und ihrer nachfolgenden Ex­ pression (als anti-FLIP-Protein-Antikörper und Fas-Protein) in der Zielzelle. Denkbar ist allerdings auch die Integra­ tion von Genen für andere membranständige Apoptoserezepto­ ren, wie TNFR-1 und/oder TRAMP, im Vektor anstelle oder gemeinsam mit dem Gen für Fas-Protein.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Wirtszellen, die mit einer DNA-Sequenz für einen erfindungs­ gemäßen Antikörper stabil transfiziert sind (Anspruch 19). Die Wirtszellen können einerseits zur Expression des erfindungsgemäßen Antikörpers herangezogen werden. Hierbei werden die Wirtszellen in vitro, typischerweise mit einem eine DNA-Sequenz für den erfindungsgemäßen Antikörper enthaltenden Expressionsvektor, transfiziert. Bei diesen Zellen kann es sich um pro- oder eukaryotische Zellen handeln. Es wird hier ausdrücklich auf die Ausführungen (S. 30, Zeile 17 bis S. 31, Zeile 21) der älteren Patentanmel­ dung Bezug genommen.

Andererseits können die Wirtszellen jedoch auch in vitro transfiziert und dann retransplantiert werden. Es handeln sich dann typischerweise um ein transfiziertes Autotrans­ plantat, gegebenenfalls jedoch auch um Allotransplantate. Die mit der erfindungsgemäßen DNA transfizierten Wirtszellen können nach der Transplantation nach der Auslösung eines entsprechenden Apoptosestimulus apoptotisch reagieren.

Besonders bevorzugt werden die Wirtszellen jedoch in vivo transfiziert. Derartige in vivo-Transfektionen werden im folgenden für die vorliegende Erfindung als gentherapeuti­ scher Ansatz erläutert.

Die vorliegende Erfindung schließt damit auch all diejenigen Methoden und Verfahren ein, die dem Fachmann im Zusammenhang mit der Gentherapie geläufig sind. Insbesondere sind die DNA-Sequenzen der erfindungsgemäßen Antikörper dazu ge­ eignet, die transfizierten Wirtszellen für die Apoptose zu sensibilisieren. Hierbei werden gentherapeutische Verfahren also dazu benutzt, in spezifischer Weise Zielzellen der Apoptose zuzuführen. DNA-Sequenzen der erfindungsgemäßen anti-FLIP-Protein-Antikörper werden an einen Promoter gekoppelt, der beispielsweise gewebespezifisch sein kann. So etwa wird beim gentherapeutischen Ansatz zur Apoptoseen­ sibilisierung von Melanomzellen idealerweise ein Promoter aus Melanin-produzierenden Zellen gewählt, der solchenfalls auch sicherstellt, daß die Expression von anti-FLIP-Antikör­ pern ausschließlich in den betroffenen Melanomzellen erfolgt. Im Prinzip können jedoch beliebige eukaryotische Promotoren in Verbindung mit den erfindungsgemäßen DNA- Sequenzen der anti-FLIP-Antikörper eingesetzt werden.

Als Transfektionsvektoren kommen alle dem Fachmann geläufi­ gen Systeme in Frage: z. B. Viren mit rekombinierten DNA- Sequenzen, kolloidale Dispersionssysteme, Liposomen oder auch die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen der anti-FLIP-Anti­ körper, ohne aber von einem Trägermedium umhüllt zu sein. Als virale Vektoren seien beispielhaft und keineswegs abschließend genannt: Adenoviren, Herpesviren oder RNA- Viren, z. B. Retroviren.

Für die Herstellung der retroviralen Transportsysteme wird auf die durch die Literatur bekannten Verfahren verwiesen. Insbesondere kommen hier Kombinationen von zwei viralen Genomen in Betracht, wobei jedes Genom für sich genommen keine Fähigkeit zur Produktion infektiöser viraler Partikel besitzt. Die erfindungsgemäße RNA-Sequenz oder die erfin­ dungsgemäßen RNA-Sequenzen ggf. in Kombination mit weiteren Genen wird (werden) gegen die sogenannten Strukturgene der Retroviren ausgetauscht. Dadurch sind diese rekombinierten Nukleotidsequenzen nicht in der Lage, für die viralen Umhüllungen (z. B. Kapside) zu kodieren. Um intakte virale Partikel herzustellen, wird daher auf Plasmide zurückgegrif­ fen, die in Helferzellinien vermehrt werden, aber für das Packungssignal der Nukleotidsequenz defizient sind. Auf diese Weise entstehen leere virale Umhüllungen, die sich im Falle einer Doppelinfektion mit den erfindungsgemäß rekom­ binanten Nukleotidsequenzen zu infektiösen viralen Partikeln zusammensetzen lassen.

Als kolloidale Dispersionssysteme sind makromolekulare Komplexe, Nanokapseln, Mikrosphären, Öl-in-Wasser-Emulsio­ nen, Mizellen oder Liposomen denkbar. Bevorzugt ist in diesem Zusammenhang der Einsatz von Liposomen. Liposomen weisen eine künstliche Membran auf, die es erlaubt, RNA oder DNA in wäßriger Lösung einzuschließen und dann in biolo­ gisch aktiver Form an die Zielzellen weiterzugeben. Die Bindungsspezifität der Vektoren an die Zielzellen muß als wesentliche Randbedingung für einen erfolgreichen gen­ therapeutischen Ansatz gewährleistet sein. Außerdem müssen die Liposomen die eingeschlossene DNA oder RNA im Zytoplasma der Zelle freisetzen. Vorteilhaft ist in diesem Zusammenhang die Kopplung der Liposomen an einen Liganden, der durch seine Bindungsspezifität für gewisse Zielzellen selektiv mit deren Oberflächenstrukturen interagiert. Hierfür eignen sich beispielsweise monoklonale Antikörper, Zucker, Glykolipide oder Proteine. Im vorliegenden Fall ist eine Kopplung der als Vektoren eingesetzten Liposomen an monoklonale Antikör­ per, die z. B. einen gewissen Tumormarker auf der Tumorziel­ zelle erkennen, besonders vorteilhaft.

Neben der erfindungsgemäßen DNA der anti-FLIP-Protein- Antikörper können auch weitere rekombinierte Gene im Transfektionsvektor vorhanden sein. Beispielhaft seien hier selektierbare Markergene genannt, die es erlauben, als Reportergene den Nachweis einer stabilen Transfektion der erfindungsgemäßen DNA zu führen. Weiterhin können Gene für eine bestimmte Oberflächenstruktur, die die Bindungsspezifi­ tät an die Zielzellen sicherstellt, im Transfektionssystem integriert sein. Ein solches Gen dient dann zur Expression eines Genprodukts, das als Ligand an einen Rezeptor der Zielzelle bindet und eine gezielte Gentherapie der betroffe­ nen Zellen erlaubt. Darüber hinaus können neben den erfin­ dungsgemäßen DNA- oder im Fall von Retroviren RNA-Sequenzen auch Gene, die gleichfalls von therapeutischem Nutzen sind, durch das Vektorsystem für gentherapeutische Ansätze übertragen werden. Zu denken ist hier insbesondere an für Apoptoserezeptoren kodierende Gene, ganz besonders an den Fas-Rezeptor, oder andere Gene, deren (verstärkte) Ex­ pression eine Beschleunigung der Apoptose der transfizierten Zelle bewirkt.

Die vorliegende Erfindung wird durch die nachfolgenden Figuren näher erläutert:

Fig. 1a stellt einen Western-Blot dar, wobei gegen PHA-aktivierte, humane T-Zellen am Tag 1 bzw. am Tag 6 nach der Stimulierung erfindungsgemäße anti-FLIP-Protein-Antikörper eingesetzt wurden,

Fig. 1b stellt einen Western-Blot dar, wobei erfindungs­ gemäße anti-FLIP-Protein-Antikörper (erkennen humanes FLIP-Protein) gegen ConcanavalinA-aktivierte Splenozyten der Maus (Tag 1 bzw. Tag 3 nach der Stimulierung) eingesetzt wurden,

Fig. 2 stellt den Anteil an apoptotischen Zellen nach der Gabe von FasL dar. Getestet wurden diverse Mela­ noma-Zellinien,

Fig. 3 stellt die Expression von c-FLIP_L in diversen Melanoma-Zellinien dar.

In Fig. 1a wird dargestellt, daß humane PHA-aktivierte T-Zellen am ersten Tag der Stimulierung eine deutliche Bande bei 55 kD im Western-Blot zeigen. Diese Bande ist am Tag 6, wenn auch sehr schwach, noch erkennbar. Die Detektion der FLIP-Expression in den Zellen erfolgte über einen erfin­ dungsgemäßen anti-FLIP-Protein-Antikörper. Der eingesetzte Antikörper entspricht dem unter der Registriernummer DSM ACC2306 bei der DSMZ in Braunschweig hinterlegten Antikör­ per. Dieser wurde als anti-FLIP-Protein-Antikörper auch in allen nachfolgenden Experimenten eingesetzt. Als Kontrolle wurden mit FLIP_L transfizierte (0,3 µg DNA) 293T-Zellen (in der Anwesenheit von z-VAD-fmk) auf einem Western-Blot mit dem anti-FLIP-Antikörper behandelt. Es zeigt sich eine deutliche Bande für das transfizierte FLIP-Protein bei 55 kD. Auf dem Nitrozellulose-Blot wurde durch Anfärbung mit Ponceau S - ebenfalls zur Kontrolle - die vergleichbare Proteinauftragung für die untersuchten Zellen nachgeprüft. Auf diese Weise sind die Signale der stimulierten Zellen nach 1 bzw. 6 Tag(en) auch in quantitativer Hinsicht aussagekräftig.

Das Balkendiagramm stellt den Prozentsatz von apoptotischen Zellen nach Gabe von sFasL (0,2 µg/ml, Inkubationsdauer: 6 h) für aktivierte Zellen am ersten und sechsten Tag nach der Stimulierung dar. Der Anteil der apoptotischen Zellen wurde mittels der Methode der Freisetzung des Histon-DNA-Komplexes bestimmt.

Es zeigt sich, daß die T-Zellen am ersten Tag nach der Stimulierung (starke Expression des FLIP-Proteins) gegenüber der FasL-induzierten Apoptose geschützt sind. Am Tag 6 dagegen (bei schwacher FLIP-Protein-Expression) sind die Zellen Apoptose-sensitiv.

Fig. 1b zeigt die Ergebnisse von ähnlichen Experimenten wie in Fig. 1a. Es werden hier Lysate von Mäuse-Splenocyten am ersten und dritten Tag nach der Aktivierung mit Concanava-linA untersucht. Eingesetzt werden die gleichen Antikörper wie in Fig. 1a (gegen humanes FLIP-Protein gerichtet). Die 55 kD-Bande von FLIPL ist am ersten Tag zu erkennen, am dritten dagegen kaum noch. Bei der am Tag 1 erkennbaren 45 kD-Bande handelt es sich um eine prozessierte Form von FLIPL.

Zugleich wurde die Qualität des anti-FLIP-Protein-Antikör­ pers, d. h. seine Sensitivität gegenüber dem Antigen, gete­ stet. Hierzu wurden 293T-Zellen mit einem Expressionsvektor für rekombinantes Flag-FLIP_L der Maus mit dem für Fig. 1a beschriebenen anti-FLIP-Protein-Antikörper bzw. mit anti- Flag-Antikörper untersucht. Die Signalintensität ist für die beiden Antikörper vergleichbar.

Wie auch in Fig. 1a, ist die Apotosesensitivität der aktivierten Mäusesplenozyten gegenüber FasL aufgetragen. Am Tag 1 (deutliche FLIP-Expression) ist nur ein geringer Anteil apoptotischer Zellen zu beobachten. Ein großer Anteil dagegen am Tag 6 nach der Aktivierung.

In Fig. 2 ist als Diagramm der Anteil der apoptotischen Zellen bei verschiedene Melanomzellinien (DOR, ME304, NA8-MEL, ME280/1, ME261, MelJuso und MZ2-MEL) sowie als Kon­ trolle bei Jurkat-Zellen aufgetragen. Die Apotose wurde durch Inkubation (6 h) der Zellen mit rekombinantem FasL (1 µg/ml) ausgelöst. Sämtliche Melanomzellinien zeigen nur eine sehr schwache Apotosesensitivität. Dagegen unterliegen nahezu alle Jurkat-Zellen der Apotose. Durch FACS-Analyse wurde die Oberflächenexpression von Fas bestimmt ((+) : Ex­ pression von Fas, (-) keine Expression von Fas).

Diese Ergebnisse zeigen, daß Tumorzellen, im vorliegenden Fall Melanomzellen, gegen eine Induktion der Apotose ge­ schützt sind.

Fig. 3 zeigt mit Hilfe eines erfindungsgemäßen Antikörpers, daß maligne Melanomzellen der Zellinien DOR, Me304, NA8-MEL, ME280/1, ME280/2, GLL.19, MelJuso und MZ2-MEL das 55 kD FLIP-Protein exprimieren. Auf den Western-Blots reagieren Lysate dieser Zellinien mit anti-FLIP-Protein-Antikörper. Als Kontrollen dienten Jurkat-Zellen (keine Expression von FLIP-Protein) und mit FLIPL transfizierte 293T-Zellen (erwartungsgemäß starke FLIP-Protein-Expression). Damit sind Tumorzellen, im vorliegenden Fall Melanomazellen, durch die Expression von FLIP-Protein gegenüber der Apoptose ge­ schützt.

Die Figuren zeigen einerseits, daß die Aktivierung von T-Zellen mit einer transienten Resistenz gegenüber apoptoti­ schen Signalen korrespondiert. Diese Resistenz korreliert mit der Expression von FLIP-Protein. Andererseits wird gezeigt, daß gewisse Tumorzellinien, vor allem Melanomzel­ linien, aber auch Kolonkarzinomzellinien, durch die un­ physiologische Expression von FLIP-Protein keine Apoptose­ sensitivität mehr aufweisen und damit immortalisiert sind. Dabei ist, wie in Fig. 2 gezeigt, die Oberflächenexpression von Fas bei Melanomzellen ohne Bedeutung für die fehlende Apoptosereaktion nach entsprechender Stimulation.

Die folgende Erfindung wird durch die nachfolgenden Aus­ führungsbeispiele näher erläutert:

1. Ausführungsbeispiel

Dieses Ausführungsbeispiel beschreibt die Herstellung des monoklonalen Antikörpers bzw. der hinterlegten Hybridomazel­ linie (DSM ACC2306), die diesen monoklonalen Antikörper produziert.

Als Antigen wurde hierzu gereinigtes Peptid mit der Sequenz (NH₂-SAEVIHQVEEALDTDEKEMLFLCRD-COOH), gebunden an ein das MAP Trägermaterial (MAP (Multiple Antigenic Peptide); Posnett, McGrath & Tam, "A novel method for producing anti­ peptide antibodies. Production of site-specific antibodies to the T cell antigen receptor β-chain", Journal of Biologi­ cal Chemistry 263 (4): 1719-25, 1988), wobei die Sequenz den Aminosäuren (AS 2 bis 26) des humanen c-FLIP-Proteins ent­ spricht, verwendet, um mittels bekannter Techniken (wie im US-Patent 4,411,993 beschrieben) monoklonale Antikörper gegen FLIP-Protein herzustellen.

Die Immunisierung der Ratten erfolgte mit dem oben bezeich­ neten Peptid als Immunogen, gebunden an ein Trägermaterial, welches als Emulsion in Adjuvans (z. B. Mineralöl oder Aluminiumhydroxyd-Präzipitat) vorliegt. Zur Immunisierung wurden 10-100 µg Peptid, gebunden an das Trägermaterial, intraperitoneal injiziert. Die Injektion kann jedoch auch subkutan erfolgen. Drei bis vier Wochen später wurden die Tiere "geboosted", indem nochmals eine Injektion, wie oben beschrieben, vorgenommen wurde. Während dieser Zeitdauer wurde den Tieren regelmäßig Serum aus der Schwanzader entnommen, welches dann mittels ELISA (Enzyme-Linked- Immunosorbent Assay) gegen das Peptid auf FLIP-Antikörper getestet wurde.

Sobald der gewünschte Antikörpertiter erreicht war, erhiel­ ten die positiven Tiere eine letzte Injektion, diesmal in­ travenös, mit Peptid, gebunden an ein Trägermaterial, welches in einer physiologischen Salzlösung gelöst war. Drei bis vier Tage später wurden die Tiere getötet, und die Milz entfernt. Die aus der Milz isolierten Milzzellen wurden mit einer Mäuse-Myelomazellinie (z. B. NF1) fusioniert. Die nach der Fusion erhaltenen Hybridomazellen wurden auf Mikroti­ terplatten in HAT-(Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin) Selektionsmedium kultiviert, um das Wachstum von nicht­ fusionierten Milz- oder Myelomazellen zu verhindern.

Die Hybridomazellen wurden auf ihre Fähigkeit untersucht, Antikörper zu produzieren, welche in einem ELISA-Test gegen gereinigtes Peptid reagieren (s. Engvall et al., Immunochem. 8 : 871, 1971 und US-Patent 4,703,004).

Die auf diese Weise erhaltenen Hydridomazellen wurden in vitro in Kulturflaschen oder in "roller bottles" kultiviert. Die Aufreinigung der monoklonalen Antikörper erfolgte typischerweise mittels Affinitätschromatographie, welche auf der Bindung des Antikörpers an Peptid, Protein A oder Protein G beruht.

2. Ausführungsbeispiel

Dieses Ausführungsbeispiel zeigt den Nachweis der anti-FLIP- Protein-Spezifität des erfindungsgemäßen anti-FLIP-Antikör­ pers.

Zu diesem Zweck wurden einerseits Extrakte von Zellen, die nach Transfektion humanes c-FLIP_L mit einer rekombinierten FLAG-Sequenz exprimieren, mit einem anti-FLIP-Protein- Antikörper oder mit einem anti-FLAG-Antikörper untersucht. Andererseits wurden native, aktivierte T-Zellen mit einem anti-FLIP-Protein-Antikörper untersucht.

Hierzu wurden humane T-Lymphozyten mit PHA (Phytohämag­ glutinin) aktiviert, so wie bei Klas et al. (Int. Immunol. 5, 625, 1993) beschrieben.

Zusammengefaßt stellt sich das Vorgehen folgendermaßen dar: Mononukleäre periphere Blutzellen wurden über Ficol-Plaque (Pharmacia, Schweden) mit Hilfe der Dichtezentrifugation isoliert. Adhärente Zellen wurden auf Grund ihrer Adhärenz während 1 Stunde an Plastikkulturschalen eliminiert. T-Zellen wurden von mononukleären peripheren Blutzellen mit Hilfe des "rosettings" mit 2-Amino-Ethylisothiouroniumbromid behandelten roten Schafsblutzellen abgetrennt (Madson et al., J. Immunol. Methods 33, 323, 1980). Die T-Zellen wurden mit PHA (1 µg/ml) für 18 bis 20 Stunden aktiviert, gewaschen und in Anwesenheit von rekombinantem, humanen IL-2 (20-25 U/ml) kultiviert.

Die 293T-Zellen wurden nach der Methode von Thome et al. (Nature 386, 517, 1997) mit humanem c-FLIP_L transfiziert.

Für die Isolierung von cDNA-Klonen des humanen und des murinen FLIP wurde als ³²P-markierte Sonde ein durch PCR- Amplifikation erhaltenes DNA-Fragment der im EST-Klon 309776 enthaltenen DNA-Sequenz des humanen c-FLIP_L benutzt. Dieses Fragment entspricht dem in Fig. 4a (ältere deutsche Patentanmeldung mit dem amtlichen Aktenzeichen 197 13 393.2) mit 394 bis 903 numerierten DNA-Sequenzabschnitt. Das Screening der λ-ZAP cDNA-Bank von aktivierten humanen Lymphozyten (Fa. Stratagene, auf Anfrage erhältlich durch Hermann Eibel, Universität Freiburg, Deutschland) zur Isolierung der humanen Formen von c-FLIP und das Screening einer entsprechenden Bank von murinen Herzmuskelzellen (Stratagene) zur Isolierung des murinen c-FLIP_L wurde nach Empfehlung des Herstellers durchgeführt.

Das komplette ORF des humanen c-FLIP_S und des humanen c-FLIP_L wurde durch PCR-Methoden amplifiziert, wobei ein 5'-Primer mit einer EcoRI-Sequenz-Verlängerung und ein 3'-Primer mit einer Sequenz-Verlängerung für die Restriktions­ enzyme BamHI und EcoRI hier verwendet wurden. Die Insertion erfolgte in die EcoR1 Schnittstelle des Vektors. Der Vektor ist abgeleitet vom pCR-3-Vektor (von der Firma Invitrogen). In die multiple Klonierungsstelle des Vektors wurde gleich­ zeitig auch eine FLAG-Sequenz insertiert, die im Leseraster mit der FLIP-Sequenz ist. Das dadurch erhaltene Fusions­ protein kann sowohl durch anti-FLIP-Antikörper als auch durch anti-FLAG-Antikörper (M2, Kodak, USA) detektiert werden.

Um eine vorübergehende Transfektion von 293T-Zellen zu erreichen, wurden die Zellen bei einer Konzentration von 1 bis 2×10⁶ Zellen/10 cm Platte oder 3 bis 6×10⁵ Zellen/5 cm Platte verteilt und am darauffolgenden Tag mit Hilfe der in der Literatur beschriebenen Kalzium-Phosphat-Präzipitations­ methode transfiziert. Das Präzipitat wurde auf den Zellen für 8 Stunden belassen und die Zellen wurden schließlich 26 bis 30 Stunden nach der Transfektion geerntet.

Auf Western-Blots (Fig. 1a) wurden einerseits Zellextrakte von aktivierten humanen T-Zellen, andererseits Zellextrakte aus mit c-FLIP_L-Expressionsvektor (mit einer FLAG-Sequenz) transient transfizierten 293T-Zellen aufgetragen. Die Blots wurden mit 5%iger Milch in PBS mit 0,5% Tween saturiert und dann mit Hilfe von monoklonalem anti-FLIP-Protein-Antikör­ per bei einer Konzentration von 5 µg/ml für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert, wobei darauf ein zweiter Antikör­ per, der mit Peroxidase markiert war, aufgegeben wurde (zweiter Antikörper von den Jackson Laboratories). Die Detektion der Proteine wurde durch Chemiluminiszenz ver­ stärkt (Amersham International).

Der, von der unter der Registriernummer DMS ACC2306 (mit dem von der Anmelderin zugeteilten Bezugszeichen 7F10-2) bei der DSMZ am 30.4. 1997 hinterlegten Hybridoma-Zellinie produzier­ te anti-FLIP-Protein-Antikörper wurde für diesen Versuch verwendet. Dieser Antikörper wurde nach dem in Ausführungs­ beispiel 1 dargestellten Verfahren hergestellt.

Mit Hilfe des erfindungsgemäßen anti-FLIP-Antikörpers wurden die Western-Blots analysiert. Die mit Meerrettich-Peroxidase markierten Antikörper sind reaktiv gegenüber dem erfindungs­ gemäßen anti-FLIP-Protein-Antikörper. Die Western-Blots der aktivierten T-Lymphozyten (am Tag 1) weisen genauso wie die transfizierten 293T-Zellen die FLIP-Proteinbande bei einem Molekulargewicht von 55 kD auf. Die aktivierten T-Lymphozy­ ten sind am Tag 6 Apoptose-sensitiv und damit Flip-negativ.

Tatsächlich erscheint im Western-Blot von solchen Zellex­ trakten keine FLIP-Proteinbande.

Zugleich zeigen die dargestellten Western-Blots, daß der erfindungsgemäße anti-FLIP-Protein-Antikörper das gleiche Bandenmuster erkennt wie der anti-FLAG-Antikörper. Dies beweist, daß der anti-FLIP-Antikörper spezifisch ausschließ- lich an das transfizierte FLIP-Protein bindet.

3. Ausführungsbeispiel

In diesem Ausführungsbeispiel wird der erfindungsgemäße Antikörper gegen humanes zelluläres cFLIP_L-Protein (wie in Beispiel 1 bzw. 2) auf seine Affinität gegenüber cFLIP_L der Maus getestet (Fig. 1b).

Hierzu wurden einerseits Milzzellen der Maus mit Concanava­ lin A aktiviert (Lowin et al., Nature 370, 650-2, 1994). Maus-Milzzellen wurden von den roten Blutzellen befreit und mit Cocanavalin A (4 µg/ml) während 1 bis 3 Tagen aktiviert. Zellextrakte von entsprechend stimulierten Zellen wurden am Tag 1 und am Tag 3 hergestellt. Andererseits wurden 293T-Zellen mit Flag-FLIP-Expressionsvektoren nach den bereits in Beispiel 2 beschriebenen Verfahren transfiziert. Extrakte dieser Zellen wurden gleichfalls entnommen.

Die Zellextrakte wurden jeweils durch die Western-Blot-Technik analysiert (s. Ausführungsbeispiel 2).

Die FLIP-Protein-Detektion der transfizierten 293T-Zellen erfolgte sowohl durch einen anti-Flag-Antikörper (Kodak International Biotechnologies) als auch durch den erfin­ dungsgemäßen Antikörper. Die Zellextrakte der aktivierten Milzzellen wurden ausschließlich mit Hilfe des erfindungs­ gemäßen Antikörpers untersucht.

Als weitere Kontrolle für die Spezifität des anti-FLIP- Antikörpers wurden Zellextrakte von einen Tag alten, mit Concanavalin A stimulierten Mausmilzzellen mit der Western- Blot-Technik analysiert. Hierzu wurde beim ersten Inkuba­ tionsschritt mit dem anti-FLIP-Antikörper zusätzlich 10 µg/ml des Antigen-Peptids zugegeben. Die Zugabe des Peptids führt zu einer Kompetition zwischen Peptid und FLIP-Protein um die anti-FLIP-Antikörper. Dadurch wird das Signal auf dem Western-Blot eliminiert. Tatsächlich ist kein Signal auf dem Western-Blot zu erkennen. Auch hierdurch wird gezeigt, daß die vom anti-FLIP-Protein-Antikörper erzeugten Banden (bei mit Concanavalin A stimulierten Mausmilzzellen) spezifisch das FLIP-Protein erkennen.

In den aufgetragenen Extrakten der Milzzellen (Extrakte vom Tag 1) und der transfizierten 293T-Zellen erkennt der eingesetzte anti-FLIP-Antikörper jeweils die charakteristi­ sche 55 kD-Bande des FLIP-Proteins. Zudem bindet er an ein prozessiertes Spaltprodukt (43 kD) des langen 55 kD-Pro­ teins. Der erfindungsgemäße anti-FLIP-Protein-Antikörper, gegen ein humanes FLIP-Protein gerichtet, bindet also gleichfalls an das cFLIP_L der Maus.

Darüber hinaus zeigt ein Vergleich der durch den anti-Flag- Antikörper und den anti-FLIP-Antikörper hervorgerufenen Intensität der 55 kD-FLIP-Bande, daß beide Antikörper in den transfizierten 293T-Zellen eine vergleichbare Bandenstärke bewirken.

4. Ausführungsbeispiel

In diesem Ausführungsbeispiel wird die Bindungsspezifität eines humanen anti-cFLIP_L-Protein-Antikörpers gegenüber verschiedenen Melanomzellinien demonstriert (Fig. 3).

Die Melanomzellen stammen aus Tumorzellproben, die zuvor aus dem Tumorgewebe von Patienten chirurgisch entfernt worden waren (Tartaglia et al., Cell 73, 213, 1993).

Der in den Beispielen 1, 2, und 3 beschriebene bzw. ver­ wendete anti-FLIP-Antikörper wurde auch in diesem Fall zur Analyse von Zellextrakten von acht verschiedenen Melanomzel­ linien mit Hilfe der Western-Blot-Technik eingesetzt (s. Ausführungsbeispiel 2). Als Vergleich wurden Extrakte einer 293T-Zellinie mit einem humanes c-FLIP_L enthaltenden Expres­ sionsvektor und einer Jurkat-Zellinie untersucht.

Der erfindungsgemäße Antikörper zeigte für alle acht Melanomzellinien ein deutliches Signal für die anti-FLIP-55 kd-Protein-Bande.

Zusammenfassend ist festzuhalten, daß ein nach Ausführungs­ beispiel 1 hergestellter anti-FLIP-Protein-Antikörper (gegen eine Sequenz eines humanen FLIP-Proteins gerichtet) in Extrakten von aktivierten T-Lymphozyten, von verschiedensten Melanomzellinien und von transfizierten 293T-Zellen seine Bindungsfähigkeit an humanes FLIP-Protein unter Beweis stellt. Darüber hinaus ist er auch als Antikörper gegen ein FLIP-Protein der Maus einsetzbar.

Weiterhin werden folgendes Verwendungen der vorliegenden Erfindungsgegenstände offenbart:
Verwendung finden die erfindungsgemäßen anti-FLIP-Antikörper auch im laborexperimentellen Bereich. Typischerweise sind sie dann mit einem "Label" markiert. Es kann sich, wie oben erwähnt, um Fluoreszenzmarkierungen, um Markierungen mit radioaktiven Isotopen, mit Biotin oder um Enzymmarkierungen bzw. um alle dem Fachmann geläufigen Markierungsarten auf den erfindungsgemäßen Antikörpern oder auf anti-anti-FLIP- Protein-Antikörpern handeln.

Substanzen, die gezielt die Regulation der Expression von FLIP-Proteinen modulieren, sind für den medizinischen Ein­ satz von besonderem Interesse. Abhängig von der Pathophy­ siologie kann eine Aktivierung oder Inhibierung der FLIP- Protein-Expression erwünscht sein.

Inhibitoren der FLIP-Expression sind dabei insbesondere als anti-Tumor-Agentien relevant. Diese Inhibitoren können auf allen Ebenen der Expressionskontrolle (z. B. Transkription, Translation, mRNA-Transport, der RNA- oder Proteinstabili­ tät) zu einer Reduzierung der zellulären FLIP-Protein- Konzentration führen. Zum Nachweis der Wirksamkeit der­ artiger Substanzen mit regulatorischer Funktion werden die erfindungsgemäßen Antikörper eingesetzt. Substanzen mit einem für die FLIP-Expression inhibitorischem Potential werden durch das Ausbleiben einer entsprechenden Anti­ körperreaktion, d. h. durch das Ausbleiben des entsprechenden Signals der Antikörpermarkierung, identifiziert (z. B. auf Gewebeschnitten von Tumorzellen, die normalerweise eine konstitutive Expression von FLIP-Protein aufweisen).

Umgekehrt dienen die erfindungsgemäßen Antikörper auch zum "Screening" nach Substanzen mit einer für die FLIP-Ex­ pression aktivierenden Wirkung. In diesem Fall ergibt sich durch die Antikörperreaktion mit FLIP-Protein ein stärkeres Signal als es für die untersuchten Zellen normalerweise zu erwarten wäre. Derart werden durch die erfindungsgemäßen Antikörper z. B. Substanzen identifiziert, die Apoptose­ sensitive Zellen immortalisieren können, indem sie die Expression von FLIP-Protein aktivieren.

Außerdem stellt ein erfindungsgemäßer anti-FLIP-Protein- Antikörper ein Agens für Reinigungsmethoden dar. Antikörper werden auf ein festes Trägermaterial (z. B. Dextran) gepackt und dienen dann nach den an sich bekannten Verfahren zur Proteinreinigung bspw. im Rahmen der Affinitätschromatogra­ phie (Maniattis et al., Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 1982). Auf diese Weise wird das Antigen, also das FLIP-Protein, zunächst spezifisch an den Antikörper gebunden, dann das Medium von der Säule gewaschen und schließlich durch pH-Wechsel, Wechsel der Ionenstärke o. ä. das Antigen vom Antikörper gelöst. Das Antigen, also das FLIP-Protein, wird als gereinigte Fraktion erhalten.

Ferner kommen die erfindungsgemäßen Antikörper in allen bekannten, auf Antikörper-Antigen-Reaktionen beruhenden Verfahren zum Einsatz. Zu nennen wäre das "Immunoblotting", Immunpräzipitierung, ELISA (Enzymgebundener Immunoassay), RIA (Radioimmunoassay), FIA (Fluoreszenzimmunoassay) und FACS (Durchflußzytometrie und Zelltrennungen nach Fluo­ reszenzmarkierung).

Vergleichbare Anwendungen ergeben sich auch für anti-anti- FLIP-Protein-Antikörper. Auch sie können auf eine Säule gepackt werden. Sofern es sich um anti-idiotypische Antikör­ per gegen anti-FLIP-Protein-Antikörper handelt (d. h. anti­ anti-FLIP-Protein-Antikörper, die gegen die spezifische Bindungsstelle der anti-FLIP-Antikörper gerichtet sind), können diese zur Simulation des Antigens (eines FLIP-Proteins) eingesetzt werden. Daraus ergeben sich entspre­ chende, oben beschriebene Anwendungen.

Erfindungsgemäße Antikörper werden, abgesehen von ihrer Verwendung als Nachweisreagens von FLIP-Protein in ent­ sprechend aufbereiteten Proben (z. B. histologischen Schnit­ ten, etwa in gefrorenen oder formalinfixierten Proben, oder Zellextrakten) und abgesehen von ihrer Bedeutung als therapeutische Substanz mit intrazellulärer Lokalisation, auch zur Untersuchung der biologischen Aktivität des Antigens, also des FLIP-Proteins, eingesetzt. Derart können z. B. in entsprechenden Bindungsstudien biologisch relevante Strukturen des FLIP-Proteins, z. B. für die Bindung an die Adaptormoleküle, untersucht werden.

Claims (19)

1. Antikörper, dadurch gekennzeichnet, daß er gegen einen Epitop eines FLIP-Proteins gerichtet ist.

2. Antikörper nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß er durch die Bindung an ein FLIP-Protein die FLIP- Aktivität inhibiert.

3. Antikörper nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeich­ net, daß er den apoptotischen Signalweg aktiviert.

4. Antikörper nach einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß er gegen einen Epitop auf einer Todeseffektordomäne eines FLIP-Proteins gerich­ tet ist.

5. Antikörper nach einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß er gegen ein zelluläres FLIP-Protein gerichtet ist.

6. Antikörper nach einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß er gegen ein humanes zel­ luläres FLIP-Protein gerichtet ist.

7. Antikörper nach einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß er ein Molekulargewicht von 17000 +/- 500 Dalton bei einer SDS-Page-Analyse aufweist.

8. Antikörper nach einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß er gegen einen Epitop auf einem FLIP-Proteinabschnitt mit der Aminosäuresequenz SAEVIHQVEEALDTDEKEMLFLCRD gerichtet ist.

9. Antikörper nach einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß er aus einer immunstimu­ lierten Maus isoliert ist.

10. Antikörper nach einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß er monoklonal ist.

11. Antikörper nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um einen Hybridantikörper handelt.

12. Antikörper nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß er von der Hybridoma-Zellinie DSM ACC2306 expri­ miert wird.

13. Antikörper nach einem der Ansprüche 10 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß an ihn ein cytotoxisches oder ein Markermolekül gebunden ist.

14. Antikörper nach einem der Ansprüche 10 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß er eine variable Region eines Antikörpers nach einem der Ansprüche 1 bis 9 und eine konstante Region mit der Sequenz einer Subklasse der humanen IgG-Familie aufweist.

15. Antikörper, dadurch gekennzeichnet, daß er gegen einen Antikörper nach einem der Ansprüche 10 bis 14 gerich­ tet ist.

16. DNA-Sequenz, dadurch gekennzeichnet, daß sie für einen Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 15 codiert.

17. Vektor, dadurch gekennzeichnet, daß er eine DNA-Sequenz nach Anspruch 16 umfaßt.

18. Vektor, dadurch gekennzeichnet, daß er eine DNA-Sequenz nach Anspruch 16 und eine für ein Fas-Protein codie­ rende DNA-Sequenz umfaßt.

19. Wirtszelle, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine stabil transfizierte DNA-Sequenz nach Anspruch 16 umfaßt.