WO1998049330A1 - Dna-sequenzen kodierend für die untereinheit chld pflanzlicher magnesium-chelatasen sowie verfahren zur aktivitätsbestimmung pflanzlicher magnesium-chelatasen - Google Patents

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chelatase
plant
host cell
nucleic acid
protein
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PCT/EP1998/002483
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Bernhard Grimm
Jutta Papenbrock
Frank HÄNEL
Susanna GRÄFE
Frank Schmidt
Wolfgang Streber
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Hoechst Schering Agrevo Gmbh
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    • C12N15/8274—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for herbicide resistance

Definitions

  • the present invention relates to the subunit CHLD of plant magnesium chelatase (Mg chelatase), DNA sequences coding for the subunit CHLD of plant magnesium chelatase, a method for producing the subunit CHLD of plant magnesium chelatase, a method for determining the activity of plant magnesium chelatase and transgenes Plants that have been transformed with the Mg chelatase DNA according to the invention.
  • Mg chelatase plant magnesium chelatase
  • DNA sequences coding for the subunit CHLD of plant magnesium chelatase DNA sequences coding for the subunit CHLD of plant magnesium chelatase
  • a method for producing the subunit CHLD of plant magnesium chelatase a method for determining the activity of plant magnesium chelatase and transgenes Plants that have been transformed with the Mg chelatase DNA according to the invention.
  • the chlorophylls as cofactors of the photosystem, contribute to the conversion of light into chemical energy and are therefore necessary for the growth and survival of plants.
  • the magnesium is incorporated into the porphyrin with the help of a membrane-associated enzyme, the Mg chelatase, which is made up of several subunits.
  • the bacterial Mg chelatase consists of three subunits (D, H and I), the corresponding gene sequences of which have been designated bchD, bchH and bchl (Burke et al. (1993), J. Bacteriol. 175, 2414 -2422; Coomber et al. (1990), Mol. Microbiol. 4, 977-989; Gibson et al. (1995), Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 92, 1941-1844; Jensen et al. ( 1996), J. Biol. Chem. 271, 16662-16667).
  • Table I List of genes of known Mg chelatase subunits
  • plant magnesium chelatase Due to its key position in chlorophyll biosynthesis, plant magnesium chelatase represents a fundamentally new starting point for the development of a new generation of highly specific, herbicidal compounds.
  • natural or (e.g. genetically) modified expression products of Mg chelatase or also by specific Mg chelatase inhibitors have a great influence on the vitality and / or the growth of phototrophic single and multicellular organisms, in particular bacteria, algae and plants.
  • a subunit CHLD of vegetable Mg chelatase is surprisingly suitable, together with the subunits CHLI and CHLH, a functionally intact, i.e. to reconstitute enzymatically active, plant-based Mg chelatase; so that the vegetable Mg chelatase subunit CHLD according to the invention provides novel test methods (in vivo and in vitro) of the vegetable Mg chelatase activity.
  • the present invention therefore relates to a nucleic acid molecule, characterized in that it codes for a protein with the function of a plant Mg chelatase subunit CHLD, preferably a nucleic acid molecule according to SEQ ID No. 1, a biologically active fragment thereof and complementary or anti- sense sequences.
  • the invention relates to plant chID sequences, preferably from dicotyledonous plants, particularly preferably Solanaceae and in particular Nicotiana tabacum.
  • Another object of the present invention is a nucleic acid molecule, characterized in that it codes for a protein according to SEQ ID No. 2 with the function of a plant Mg chelatase subunit CHLD or a biologically active fragment thereof, or it is a complementary or anti-sense - Sequence forms such a nucleic acid molecule.
  • the present invention furthermore relates to a nucleic acid molecule, characterized in that it represents an oligonucleotide of at least 10 nucleotides in length, which specifically contains a nucleic acid molecule which codes for a protein with the function of a vegetable Mg chelatase subunit CHLD, preferably SEQ ID No. 1, a fragment thereof, or their complementary or anti-sense sequences hybridized.
  • Specific hybridization generally means the property of a single-stranded nucleic acid molecule with a complementary nucleic acid molecule to form hydrogen bonds, base pairs and, if appropriate, a double strand.
  • the present invention also relates to a nucleic acid molecule which codes for a peptide from the group consisting of SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4 and SEQ ID No. 7, and its complementary or anti-sense sequences.
  • recombinant organism is to be understood as the cell of an organism modified by in vitro modified DNA or by integration of DNA, for example of recombinant yeast, bacteria, algae, insect or plant cells.
  • the present invention furthermore relates to the use of the nucleic acid molecules according to the invention for the amplification, isolation or identification of a nucleic acid molecule, coding for a protein with the function of a plant Mg chelatase subunit CHLD or a biologically active fragment thereof, in particular of chlD structural genes or from chID- mRNA of other organisms, preferably of plant or microbial origin.
  • the subject of the invention is also the use of the nucleic acid molecules according to the invention for the production of antibodies against their expression products.
  • the invention also relates to non-naturally occurring chimeric genes containing a promoter which is functionally fused to a DNA molecule according to the invention.
  • the invention also relates to a vector, preferably a recombinant vector, comprising a nucleic acid molecule according to the invention containing a chimeric gene containing a promoter, which is functionally fused to a DNA molecule according to the invention.
  • the invention also relates to a recombinant host cell, characterized in that this host cell expresses a DNA molecule according to the invention, preferably in that this host cell is stably transformed with a recombinant vector containing a chimeric gene containing a promoter which is functionally fused with a nucleic acid molecule according to the invention or is transformed by other transformation methods known to the person skilled in the art and expresses a DNA molecule according to the invention.
  • the subject of the invention is also the use of the nucleic acid molecules according to the invention for the production of transgenic plants.
  • the invention also relates to transgenic plants, transgenic plant cells, transgenic plant parts, ransgenic plant seeds, transgenic propagation material containing a nucleic acid molecule according to the invention.
  • the invention also relates to processes for the production of transgenic plants, transgenic plant cells, transgenic plant parts, transgenic plant seeds, transgenic propagation material by means of a recombinant host cell, characterized in that this host cell is transformed with a DNA molecule according to the invention.
  • the invention also relates to propagation material of the plants according to the invention, for example fruits, seeds, tubers, rhizomes, seedlings and cuttings.
  • Suitable recipient plants for a gene according to the invention are all agriculturally important monocotyledon and dicotyledonous crop plants, preferably maize and other cereals, such as, for example, wheat, rye, barley, millet, oats, cassava and rice, and also cotton, tobacco, sugar beet, sugar cane, potatoes , Rapeseed, sunflowers, soy or fruit and vegetable plants.
  • maize and other cereals such as, for example, wheat, rye, barley, millet, oats, cassava and rice, and also cotton, tobacco, sugar beet, sugar cane, potatoes , Rapeseed, sunflowers, soy or fruit and vegetable plants.
  • nucleic acid molecules according to the invention are linked to regulatory DNA elements which ensure transcription in plant cells.
  • regulatory DNA elements include promoters in particular.
  • any promoter active in plant cells can be used for the expression.
  • the promoter can be selected so that the expression is constitutive or only in a certain tissue, at a certain time in plant development or at a time determined by external influences.
  • the promoter can be homologous or heterologous to the plant. Suitable promoters are, for example, the 35S RNA promoter of the Cauliflower Mosaic Virus and the ubiquitin promoter from maize for constitutive expression, the patatin gene promoter B33 (Rocha-Sosa et al., EMBO J. 8 (1989), 23-29) for a sink-specific expression (e.g.
  • cloning vectors which contain a replication signal for E. coli and a marker gene for the selection of transformed bacterial cells.
  • examples of such vectors are pBR322, pUC series, M13mp series, pACYC184.
  • the desired sequence can be introduced into the vector at a suitable restriction site.
  • the plasmid obtained is used for the transformation of E. coli cells.
  • Transformed E. coli cells are grown in a suitable medium, then harvested and lysed. The plasmid is recovered. Restriction analyzes, gel electrophoresis and other biochemical-molecular biological methods are generally used as the analysis method for characterizing the plasmid DNA obtained.
  • the plasmid DNA can be cleaved and DNA fragments obtained can be linked to other DNA sequences.
  • Each plasmid DNA sequence can be cloned into the same or different plasmids.
  • a variety of techniques are available for introducing DNA into a plant host cell. These techniques include the transformation of plant cells with T-DNA using Agrobacterium tumefaciens or Agrobacterium rhizogenes as a transformation agent, the fusion of protoplasts, the injection, the electroporation of DNA, the introduction of DNA using the biolistic method etc.
  • plasmids When injecting and electroporation of DNA into plant cells, there are no special requirements for the plasmids used. Simple plasmids such as e.g. PUC derivatives can be used. However, if whole plants are to be regenerated from such transformed cells, the presence of a selectable marker gene is necessary.
  • the Ti or Ri plasmid is used for the transformation of the plant cell, at least the right boundary, but often the right and left boundary of the Ti and Ri plasmid T-DNA as the flank region, must be connected to the genes to be introduced.
  • the DNA to be introduced must be cloned into special plasmids, either in an intermediate vector or in a binary vector.
  • the intermediate vectors can be integrated into the Ti or Ri plasmid of the agrobacteria on the basis of sequences which are homologous to sequences in the T-DNA by homologous recombination. This also contains the vir region necessary for the transfer of the T-DNA. Intermediate vectors cannot replicate in agrobacteria. Using a helper plasmid, the intermediate vector can be transferred to Agrobacterium tumefaciens (conjugation). Binary vectors can replicate in E. coli as well as in Agrobacteria.
  • the agrobacterium serving as the host cell is said to contain a plasmid which carries a vir region.
  • the vir region is necessary for the transfer of the T-DNA into the plant cell; additional T-DNA may be present.
  • the agrobacterium transformed in this way is used to transform plant cells.
  • T-DNA for the transformation of plant cells is described in detail in EP 120 516; Hoekema, in: The Binary Plant Vector System, Offsetdrukkerij Kanters B.V, Alblasserdam (1985), Chapter V; Fraley et al., Crit. Rev. Plant. Sci., 4, 1-46 and An et al. EMBO J. 4 (1985), 277-287.
  • plant explants can expediently be cultivated with Agrobacterium tumefaciens or Agrobacterium rhizogenes.
  • Whole plants can then be regenerated from the infected plant material (e.g. leaf pieces, stem segments, roots, but also protoplasts or suspension-cultivated plant cells) in a suitable medium, which can contain antibiotics or biocides for the selection of transformed cells.
  • the plants thus obtained can then be examined for the presence of the introduced DNA.
  • Other ways of introducing foreign DNA using the biolistic method or by protoplast transformation are known (cf., for example, Willmitzer, L., 1993 Transgenic Plants. In: Biotechnology, A Multi-Volume Comprehensive Treatise (HJ Rehm, G. Reed, A. Pühler , P. Stadler, eds.), Vol. 2, 627-659, VCH Weinheim).
  • the introduced DNA is integrated in the genome of the plant cell, it is generally stable there and is also retained in the progeny of the originally transformed cell. It normally contains a selection marker which gives the transformed plant cells resistance to a biocide such as phosphinothricin or an antibiotic such as kanamycin, G 418, bleomycin or hygromycin.
  • the individually chosen marker should therefore allow the selection of transformed cells from cells that lack the inserted DNA.
  • the transformed cells grow within the plant in the usual way (see also McCormick et al., Plant Cell Reports 5 (1986), 81-84).
  • the resulting plants can be grown normally and crossed with plants that have the same transformed genetic makeup or other genetic makeup.
  • the resulting hybrid individuals have the corresponding phenotypic properties. Seeds can be obtained from the plant cells.
  • Two or more generations should be grown to ensure that the phenotypic trait is stably maintained and inherited. Seeds should also be harvested to ensure that the appropriate phenotype or other characteristics have been preserved.
  • the invention furthermore relates to processes for producing a nucleic acid molecule according to the invention, characterized in that a nucleic acid molecule according to the invention is produced by a process known per se for producing nucleic acids.
  • a nucleic acid molecule according to the invention is produced by a process known per se for producing nucleic acids.
  • the person skilled in the art of cloning cDNA has a large number of different methods for isolating and cloning gene sequences available.
  • sequence information according to the invention can also be used for a large number of other methods known to the person skilled in the art, e.g. the screening of expression libraries for gene isolation with antibodies or for the production of antibodies (polyclonal or monoclonal).
  • the entire plant chID cDNA preferably chID from Nicotiana tabacum according to SEQ ID No. 1, partial sequences from SEQ ID No. 1 or oligonucleotides derived from SEQ ID No. 1 can be used as probes, if appropriate those which are selective with other CHLD coding sequences from a bank of cloned gene fragments of a selected organism, for example Hybridize phototrophic microorganisms or mono- or dicotyledonous plants.
  • Such techniques also include, for example, the screening of genomic or cDNA libraries, cloned in suitable cells or viruses and the amplification by polymerase chain reaction (PCR) using from SEQ ID NO. 1 derived oligonucleotide primer.
  • PCR polymerase chain reaction
  • chID (partial) sequences according to the present invention can also be modified or expanded by standard genetic engineering methods in order to obtain desired properties.
  • chID specific probes are at least 10 nucleotides long, preferably at least 17 nucleotides long.
  • Hybridization probes according to the present invention can be used, for example, to amplify or analyze CHLD-coding sequences (ie CHLD-coding nucleic acid molecules) from a selected organism by means of the PCR method known to the person skilled in the art and can furthermore be used to isolate CHLD-coding sequences other organisms or as a diagnostic agent for the detection of CHLD coding sequences in other organisms or to modify modified CHLD coding sequences of a particular phenotype such as.
  • the chlD-specific hybridization probes can also be used to map the location of a naturally occurring chlD gene in the genome of a plant using standard methods. These methods include, among others, the identification of DNA polymorphisms and the use of such polymorphisms to analyze the segregation of chlD genes relative to other markers with a known gene location. The mapping of chlD genes can be particularly useful for plant breeding may be of interest.
  • chlD-specific hybridization probes or CHLD-encoding (partial) sequences can also be used to inhibit the expression of a chlD gene in planta (antisense technology).
  • CHLD-coding (partial) sequences can also be changed or expanded with new sequence elements and introduced into the genome of plants.
  • the plants can be transformed transiently or stably using conventional methods.
  • the integration of sequences derived from the chID cDNA into the genome of the plant can be used to change the properties of the plant, so that e.g. B. more or less functionally active Mg chelatase or a variant of the Mg chelatase with modified properties is formed in the transgenic plant or that the level of expression of the chlD gene present in the transgenic plant is reduced.
  • the amount of functional Mg chelatase can be increased by standard methods, e.g.
  • the chlD gene is cloned into the transgenic plant alone or together with genes of other Mg chelatase subunits under the transcriptional control of regulatory elements such as promoters and enhancers.
  • An increase in CHLD activity can e.g. B. to increase the chlorophyll content, which may be associated with an increase in yield, or to increase the tolerance to herbicides that inhibit chlorophyll biosynthesis, are used.
  • the cloning of modified sequences according to the invention in transgenic plants may be associated with an increase in herbicide tolerance.
  • the nucleic acid molecules which are introduced into transgenic plants and code for chlD sequences or fragments from these sequences (molecules) can also be provided with regulatory elements such as promoters or enhancers in such a way that the original Mg Chelatase activity in the transgenic plant results (eg cosuppression, formation of chlD antisense RNA).
  • a reduction in the Mg chelatase activity can be used to produce chlorotic plants or plants with chlorotic tissues.
  • a reduced chlorophyll content may be desired, for example, in a later technical processing of plants or parts of plants, or in the cultivation of various useful or ornamental plants, for.
  • B. Vegetables such as chicory.
  • the present invention also relates to a protein, characterized in that the protein has the biological function of a plant Mg chelatase subunit CHLD, preferably according to SEQ ID No. 2, or a biologically active fragment thereof.
  • the invention also relates to the use of a protein with the biological function of a plant Mg chelatase subunit CHLD, preferably according to SEQ ID No. 2 or a biologically active fragment thereof, for determining the activity of a Mg chelatase and for producing antibodies.
  • the invention also relates to processes for producing a protein with the function of a plant Mg chelatase subunit CHLD in a recombinant host cell, characterized in that this host cell is transformed with a nucleic acid molecule according to the invention coding for a plant Mg chelatase subunit CHLD or an active fragment thereof , preferably a DNA sequence coding for a protein with the function of a Mg chelatase or a biologically active fragment thereof is inserted into an expression cassette suitable for the host cell, the expression cassette thus obtained is suitably inserted into a vector suitable for the host cell , a suitable host cell is transformed with the vector thus obtained and the host cell thus transformed is cultivated in a suitable medium and the protein produced by said host cell with the function a plant Mg chelatase subunit CHLD is suitably isolated from the culture medium or the host cell.
  • Another object of the present invention is a method for producing a protein with the function of a plant Mg chelatase or a biologically active fragment thereof in a recombinant host cell, characterized in that this host cell with a nucleic acid molecule according to the invention coding for a plant Mg chelatase or an active fragment is transformed therefrom, preferably a DNA sequence coding for a protein with the function of a Mg chelatase is inserted into an expression cassette suitable for the host cell; the expression cassette thus obtained is suitably inserted into a vector suitable for the host cell, a suitable host cell is transformed with the vector thus obtained; and the host cell thus transformed is cultivated in a suitable medium and the protein produced by said host cell with the function of a plant Mg chelatase is suitably isolated from the culture medium or the host cell.
  • the present invention relates to the production of the vegetable Mg chelatase subunit CHLD and of the vegetable Mg chelatase by genetic engineering.
  • the DNA sequences according to the invention can be cloned into an expression cassette which is suitable for the heterologous expression of the structural gene in the selected host organism.
  • the following DNA sequences encoding CHLD are, for example, suitable for this: vegetable chlD cDNA, vegetable chlD cDNA molecules changed in sequence with common methods, but also synthetic DNA sequences derived from vegetable chlD cDNA or vegetable CHLD protein or their fragments, which enable the expression of a biologically active Mg chelatase CHLD.
  • the introduction of specific regulatory sequences into the Expression cassette may also be desirable, for example promoters, operator sequences, enhancers, terminators, signal sequences, 5'- and 3'-untranslated sequences or sequences coding for suitable fusion proteins.
  • the use of regulatory sequences is a common technique, which can vary widely depending on the expression strategy.
  • the resulting chlD expression cassette provided with the necessary regulatory elements in the appropriate reading frame of the chlD structural gene, can be inserted into an expression vector with which the selected host organism can be transformed.
  • Suitable expression strategies for the production of recombinant proteins and corresponding expression vectors are generally known for host organisms such as, for example, Escherichia coli, insect and plant cells.
  • vector generally denotes a suitable vehicle known to the person skilled in the art which enables the targeted transfer of a single- or double-stranded nucleic acid molecule into a host cell, for example a DNA or RNA virus, a virus fragment, a plasmid construct, which or absence of regulatory elements for nucleic acid transfer in cells may be suitable, such as metal particles can be used in the "particle gun” method, but it can also comprise a nucleic acid molecule which can be brought directly into a cell by chemical or physical methods.
  • a recombinant organism obtained from a chID expression cassette can be used to obtain recombinant Mg chelatase, preferably CHLD protein, or of cell fractions containing CHLD.
  • recombinant organism can also be part of an analytical test system.
  • the chI D structural gene can also together with the structural genes coding for the two other known subunits of Mg chelatase, CHLH and CHLI, are introduced into a host organism with the aid of common molecular genetic methods, so that expression of a functional Mg chelatase occurs there.
  • a preferred expression system is e.g. B. the use of baker's yeast (Saccharomyces cerevisiae) as a host organism. All known yeast vectors which have the appropriate expression signals, such as promoters, and suitable selection markers, such as resistance genes or genes which complement auxotrophy, can serve as vectors.
  • the use of the vegetable Mg chelatase is essentially based on its activity as a heterooligomeric enzyme complex which is directly linked to the presence of the CHLD subunit.
  • the provision of functionally intact, plant-based Mg chelatase enables biochemical reactions to be carried out both in vitro (eg cell-free test system for Mg chelatase) and in vivo, for example in single- or multi-cell recombinant organisms or cell cultures, in particular yeasts, bacteria, algae. Insect cells or plants, and is therefore not limited to phototrophic organisms.
  • the present invention therefore also relates to a method for determining the interaction of plant Mg chelatase subunits, characterized in that a host cell with a DNA sequence coding for a protein with the function of a CHLD subunit or a biologically active fragment thereof, and at least is transformed with a DNA sequence coding for a further subunit of the Mg chelatase in such a way that the Interaction of the Mg chelatase gene products leads to a directly or indirectly, qualitatively or quantitatively measurable signal, preferably by activating a marker gene.
  • the method is suitable for finding specific inhibitors or activators of plant magnesium chelatase, so that i.a. Substances can be identified which have a potential herbicidal, growth-inhibiting or -promoting or phytosanitary effect.
  • a function of the Mg chelatase subunits is to interact with one another. This interaction leads to the formation of an enzyme complex and is a prerequisite for the function of Mg chelatase as an enzyme.
  • the present invention therefore relates to a test system with which the interaction of the Mg chelatase subunit CHLD with one or two further subunits of the enzyme can be detected and quantified in vivo.
  • the interaction of the subunit CHLD with the subunit CHLI can be measured, for example, by connecting both subunits with two further polypeptides or proteins in such a way that a qualitatively and / or quantitatively detectable reaction is caused in the cell by the interaction of the subunits, directly or indirectly .
  • Polypeptides suitable for this are, for example, domains or subunits of regulatory proteins, for example from cellular signal transduction or from transcription processes, the function of which is mediated by a protein-protein interaction.
  • regulatory proteins of DNA transcription are suitable in which the protein-protein interaction of two or more subunits can be detected with the help of a reporter gene, so that the gene product of the reporter gene is only formed if two or more of the above. Subunits interact with each other.
  • one of the two Mg chelatase subunits to be tested is fused with the DNA binding domain
  • the other Mg chelatase subunit is fused with the transcription-activating domain of the regulatory protein. It is irrelevant which of the two proteins is connected to which of the two domains.
  • CHLD can be linked to the DNA binding domain
  • CHLI can be linked to the transcription activating domain.
  • This binding can be mediated through the interaction of another auxiliary factor, for example a protein-protein interaction or a protein-ligand interaction, such as.
  • B. Streptavidin biotin preference is given to covalent binding, which takes place, for example, by fusion of genes relating to coding regions.
  • GAL4 Gene product of Saccharomyces cerevisiae.
  • a host organism in the genome of which an indicator gene with the corresponding promoter has already been integrated, is transformed with the described fusion genes of the Mg chelatase subunits.
  • Such a host organism is characterized in that it expresses all functions of the transcription system used, with the exception of that regulatory protein which is to be expressed as a recombinant protein. If a microorganism is used as the host organism, then the recombinant organism can then be isolated using conventional microbiological methods and multiplied as desired, and is therefore available to an unlimited extent for use in the test system.
  • Preferred uses as host organisms are therefore easily transformable and cultivable microorganisms, such as yeast species or E. coli.
  • a promoter suitable for the transcription system is linked to a structural gene which codes for an indicator protein.
  • This recombinant gene is characterized in that the activation of the promoter leads directly or indirectly to the expression of the indicator protein.
  • Such an indicator protein is characterized in that it leads to an easily detectable change in the recombinant organism, for example by catalyzing a dye formation or a chemiluminescent reaction, itself being colored or fluorescent, or by contributing to the growth of the microorganism.
  • the use of the system of transcription activation of an indicator gene shown has the advantage over the growth test described below of a mutant complemented by a Mg chelatase subunit that the former allows a more specific signal for an inhibitor of the enzyme or an enzyme function, while the latter Test first inhibitors of cell growth with a different attack point than the Mg chelatase must be excluded by control experiments.
  • the present invention therefore prefers the use of an indicator gene system over the growth test.
  • the Matchmaker TM two-hybrid system from Clontech, Palo Alto, in particular, is an example of such a system which realizes the above-mentioned interactions with the aid of regulatory proteins of the transcription system. California, USA, catalog no. #K 1605-1 from 1995/96, which is hereby incorporated by reference into the disclosure content of the description.
  • piasmids are produced which bring about the expression of CHL D, H and I as fusion proteins with the GAL4 binding domain and the GAL4 activation domain in yeast cells.
  • the DNA sections which code for the three subunits of the Mg chelatase are amplified by means of the polymerase chain reaction (PCR).
  • the plasmids which contain the cDNA of the respective genes are used as templates for the amplification.
  • Synthetic oligonucleotides are used as PCR primers, which are characterized in that the sense primer has homology to the 5 'end and the antisense primer has homology to the 3' end of the respective gene.
  • the primers can also be provided with restriction sites which facilitate cloning into vector plasmids.
  • the shuttle plasmids of the MATCHMAKER TM two-hybrid system are preferably used as vectors: pGBT9 and pAS2 each contain a gene which codes for the GAL4 activation domain. pGAD424 and pACT2 each contain a gene that codes for the GAL4 DNA binding domain. pGBT9 and pGAD424, or pAS2 and pACT2, are used together in one system. pGBT9 and pGAD424 differ from pAS2 and pACT2 in that the genes mentioned are expressed more weakly in the former than in the latter.
  • the subunits coding for the Mg chelatase are each cloned individually into the vectors.
  • Recombinant plasmids are introduced into E. coli by transformation, propagated and isolated. In this way, all 12 possible combinations of all three subunits with all four vectors are produced.
  • the recombinant plasmids are named as follows: Gene CHL D in vector pAS2 is called pCBS1148. Gene CHL D in vector pACT2 is called pCBS1149. Gene CHL D in vector pGBT9 is called pCBS1150. Gene CHL D in vector pGAD424 is called pCBS1151.
  • the CHL H gene in vector pAS2 is referred to as pCBS1152.
  • Gene CHL H in vector pACT2 is called pCBS1153.
  • Gene CHL H in vector pGBT9 is called pCBS1154.
  • Gene CHL H in vector pGAD424 is called pCBS1155.
  • Gene CHL I in vector pAS2 is called pCBS1156.
  • Gene CHL I in vector ⁇ ACT2 is called pCBS1157.
  • Gene CHL I in vector pGBT9 is called pCBS1158.
  • Gene CHL I in vector pGAD424 is called pCBS1159.
  • a reporter yeast strain of the two-hybrid system is then transformed with two plasmids each.
  • a strain is preferably used as the reporter yeast strain, which expresses a GAL4-inducible beta-galactosidase, preferably the strain SFY526 from Clontech, as the indicator protein.
  • the two plasmids are chosen so that one encodes a subunit in fusion with the DNA binding domain, the other encodes a subunit in fusion with the activation domain.
  • the yeast transformation is e.g. by the method of Klebe et al., 1983, Gene, 25, 333-341.
  • a yeast transformed with both plasmids is grown on solid medium and the activity of the beta-galactosidase is blotted on filters according to the method of Breedon and Nasmyth (Breedon, L. and Nasmyth, K. (1985) Regulation of the yeast HO gene. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50, 643-650).
  • the transformed yeast is grown in liquid medium and the activity of the beta-galactosidase is after cell disruption in crude yeast extract according to the method of Munder and Hundst (Munder, T. and Princest, P. (1992). Mol. Cell. Biol. 12 , 2091-2099).
  • the recombinant organism is first grown in a suitable medium.
  • the recombinant cells are then incubated together with the substance to be tested.
  • the incubation conditions are chosen so that a clearly measurable induction of the indicator gene takes place during the incubation period without the addition of substances to be tested. This can e.g. B. happen that the incubation period extends over part of the growth phase.
  • the induction can also take place in that the proteins involved in the transcription activation are expressed with the aid of an inducible promoter.
  • the induction of the indicator gene can be detected using common detection reactions.
  • the indicator gene is activated in the test system, a greater amount of the reporter protein is formed in the host cells as a result of the gene activation than without activation of the indicator gene.
  • the test system is preferably selected so that the reporter protein is produced at least twice as much. An at least ten-fold increase in the production of the reporter protein is particularly preferably achieved.
  • the reporter protein is an enzyme
  • the enzyme activity can be determined using standard measurement methods, for example colorimetric, fluorimetric or luminometric.
  • the whole cells or extracts of different purities made therefrom can be incubated with a suitable color-forming enzyme substrate. The incubation with substrate can take place during the incubation with the substance to be tested or afterwards.
  • a chemical compound interferes with this interaction between the subunits, e.g. B. binds to an "interface region" of a subunit, this compound inhibits the process of oligomerization.
  • This compound can thus reduce the amount of enzymatically active Mg chelatase in an organism and thus also have potential herbicidal activity.
  • This test system can also be used to find herbicidal compounds which are the Inhibit the formation of the active Mg chelatase enzyme complex.
  • analogue transcription system control system in which the interaction of the Mg chelatase subunits has been replaced by another interaction, after the addition of the substance there can be only a significantly less or no measurable inhibition of the indicator reaction.
  • Any type of binding can serve as another interaction, for example also covalent linking of proteins.
  • a substance fulfills the conditions mentioned, its effect can be examined in further test systems, for example in enzymatic tests with Mg chelatase, in plant cell cultures or in herbological tests on whole plants.
  • a Mg chelatase gene can also be introduced into a specific mutant of such an organism which is not capable of growth without the function of the corresponding Mg chelatase, such as, for example, B. a photoautotrophic microorganism in which one or more subunits of Mg chelatase have lost their function due to a mutation.
  • B. a photoautotrophic microorganism in which one or more subunits of Mg chelatase have lost their function due to a mutation.
  • the use of such a mutant has the particular advantage that the growth of the recombinant organism in a suitable medium can serve as a measure of the function of the Mg chelatase and can thus quantitatively describe the influence of substances to be investigated on the Mg chelatase.
  • the growth test is characterized by particularly easy handling and the rapid throughput of substances.
  • the plant chlD gene can be brought into a mutant of an organism, which is characterized in that it is not capable of growth or has a changed phenotype under certain culture conditions without the function of the Mg chelatase, preferably without the function of the CHLD protein .
  • a mutant can be produced, for example, by first changing the structural genes for its own Mg chelatase in a microorganism which requires the activity of a Mg chelatase for phototrophic growth in such a way that no or insufficient amounts of functional enzyme with Mg chelatase activity are formed so that the resulting organism can no longer grow phototrophically.
  • the plant structural genes chll and chlH are also expressed in this mutant.
  • a functional plant Mg chelatase can then be formed in the genetically modified organism, which gives this organism the ability to phototrophic growth again.
  • the growth of such a recombinant organism then directly represents a measure of the activity of the plant Mg chelatase.
  • a growth test can be used to determine with this recombinant organism whether the plant Mg chelatase is inhibited by a chemical compound which is added to the culture medium becomes.
  • the genetically modified organism is grown in culture media with and without the compound to be examined under phototrophic culture conditions.
  • the chemical compound to be investigated is preferably used in concentrations between
  • the compound In order to detect a specific inhibition of Mg chelatase by a chemical compound to be investigated and to rule out other modes of action as the cause of an inhibition of growth, the compound must meet the following criteria: 1. The genetically modified organisms must grow significantly worse in the presence of the compound than in culture medium without the compound. 2. The compound must not significantly reduce the growth of the same organisms under heterotrophic conditions.
  • a changed phenotype of a correspondingly modified organism can be used as an indicator of the catalytic activity of the plant Mg chelatase.
  • Different pigments of phototrophic microorganisms are formed from the reaction product of Mg chelatase, Mg protoporphyrin.
  • the pigmentation of such a recombinant organism then directly represents a measure of the activity of the plant Mg chelatase.
  • this recombinant organism can be used to determine whether the plant Mg chelatase is caused by a chemical compound which is added to the culture medium. is inhibited.
  • the genetically modified organism is grown in culture media with and without the compound to be examined under those culture conditions under which pigments synthesized from Mg protoporphyrin are formed.
  • the chemical compound to be investigated is preferably used in concentrations between 10 "9 M and 10 " 3 M, and particularly preferably in concentrations between 10 "7 M and 10 " 4 M.
  • the compound In order to detect a specific inhibition of Mg chelatase by a chemical compound to be examined and to rule out other modes of action as the cause of a change in the pigmentation, the compound must meet the following criteria:
  • the genetically modified organisms have significantly smaller amounts of pigments, which are formed from Mg protoporphyrin, or a different composition of pigments than in Culture medium without the connection.
  • the compound must not significantly change the pigment formation of the non-genetically modified starting organism under the same culture conditions.
  • condition 1 If both criteria are met, it can be assumed that the compound examined is a specific inhibitor of the plant Mg chelatase. If only condition 1 is fulfilled, but not condition 2, an enzymatic reaction of the Mg chelatase can be used to determine whether the investigated compound is a specific inhibitor of the plant Mg chelatase.
  • a substance fulfills the above-mentioned conditions, it can be examined with or without further biochemical tests directly on whole plants or suitable plant parts for its effect in the plant. Common herbological and physiological methods can be used for this.
  • the production of a biochemical test system for determining a protein function is an essential prerequisite that the protein to be examined can be obtained in a functional state and as pure as possible, ie free from interfering activities. As with all cell proteins, this can be done in the case of a plant Mg chelatase by isolating the individual subunits from plant tissue using standard protein purification processes.
  • a functional plant Mg chelatase contains not only the subunits CHLH and CHLI but also the subunit CHLD, the sequence of which is given by way of example for Nicotiana tabacum in SEQ ID No. 2.
  • the isolation of a heterooligomeric protein, the activity of which is also bound to a membrane fraction of the plant cell, as in the case of Mg chelatase is much more difficult than that of a soluble or homooligomeric or monomeric enzyme, since the protein loses its enzymatic activity in the course of purification which then only with elaborate Methods can be restored.
  • the enzymes of chlorophyll biosynthesis are formed depending on the type of differentiation and the state of development of the cell.
  • these proteins like the Mg chelatase, represent only a small proportion of the total protein of the cell, so that extremely high enrichment factors would have to be achieved when isolated from plant tissue.
  • the use of the nucleic acid molecules coding for the Mg chelatase is preferred for the production of the recombinant plant Mg chelatase, particularly preferably the recombinant Mg chelatase complex consisting of the proteins CHLD, CHLH and CHLI.
  • the recombinant vegetable CHLD protein is particularly preferred.
  • Genetically engineered Mg chelatase preferably genetically engineered CHLD protein
  • CHLD protein can be purified using a variety of standard methods. The suitability of a method depends in each case on the host organism used, the expression strategy and other factors which are known to a person skilled in the art who is experienced in the expression and purification of recombinant proteins.
  • the recombinant protein can also be fused with other peptide sequences by changing its gene sequence in the expression cassette.
  • Preferred fusion partners are peptides or proteins which, as C- or N-terminal fusions, give the recombinant Mg chelatase subunits an affinity for certain column materials or enable a specific localization of the expression product inside or outside the cell, such as by transit or Signal peptides or sequences. Such fusions must not affect the function of the Mg chelatase or z. B. can be split off by installing suitable protease interfaces.
  • fusion partners include oiigohistidine tails, the Strep-Tag TM, the glutathione-S-transferase (GST) or the maltose-binding protein (MalE), without this application is limited to the exemplary fusion partners or their fragments.
  • GST glutathione-S-transferase
  • MalE maltose-binding protein
  • Mg chelatase preferably the CHLD protein
  • specific antibodies can also be produced, with the aid of which Mg chelatase or Mg chelatase subunits can be isolated from recombinant organisms or also from plants.
  • Mg chelatase preferably the CHLD protein
  • CHLD protein The genetic engineering of the Mg chelatase, preferably the CHLD protein, and its purification make it possible for the first time to use a vegetable enzyme with Mg chelatase activity in various degrees of purity up to the pure Mg chelatase complex consisting of the subunits CHLD, CHLH and CHLI, or to get the pure CHLD protein.
  • One application for isolated or enriched Mg chelatase is e.g. in their use in biochemical test systems for determining the enzyme function.
  • the present invention also relates to a method for determining the activity of plant Mg chelatase, a protein with the function of a CHLD being combined with the gene products of the DNA sequences coding for the Mg chelatase subunits I and H in such a way that the enzymatic activity of the Mg chelatase gene products leads to a directly or indirectly, qualitatively or quantitatively measurable signal.
  • the inhibitory effect of a chemical compound on the Mg chelatase can be measured by reducing the typical catalytic activity of the enzyme or by completely inactivating the Mg chelatase in the presence of this compound.
  • the vegetable Mg chelatase consisting of the subunits CHLD, CHLH and CHLI, is incubated in a suitable reaction buffer with its substrates protoporphyrin, ATP and Mg 2+ .
  • Preferred reaction conditions are a reaction buffer with a pH between pH 4 and pH 11, preferably 5-10, in particular 6-9, and reaction temperatures between 2 and 50 ° C, preferably 10-40 ° C.
  • the enzyme inhibition can be quantified by simply comparing the catalytic activity of the Mg chelatase in the absence and in the presence of the chemical compound to be investigated.
  • Various biochemical measuring methods can be used to determine the activity of the Mg chelatase, by means of which either the formation of the reaction products of the reaction catalyzed by the Mg chelatase, for example Mg protoporphyrin, ADP or phosphate, is measured or the decrease in the concentration the enzyme substrates of Mg chelatase, for example protoporphyrin, ATP or Mg 2+ , is measured.
  • Many standard methods for determining the activity of Mg chelatase are available to the person skilled in the art of carrying out enzyme tests.
  • the methods for measuring the conversion of protoporphyrin to Mg-protoporphyrin in the reaction mixture by measuring the different fluorescent properties of Mg-protoporphyrin and protoporphyrin (e.g. Walker et al., Plant Physiol. Biochem. 30: 263-269 (1992 )) or by photometric analysis of the change in absorption resulting from the conversion of protoporpyrin to Mg-protoporphyrin (e.g. Gorchein, Biochem. J. 299: 869-874 (1991)) or by quantification of protoporphyrin or Mg-protoporphyrin by HPLC- Analysis.
  • Another preferred measurement method is the determination of the ATPase activity of the Mg chelatase.
  • phosphate detection e.g. B. by the methods based on the system described by Fiske et al., J. Biol. Chem 66: 375-400 (1925).
  • inhibition type of a chemical compound on the vegetable Mg chelatase can be determined by customary biochemical methods by varying the concentrations of the substrate and the inhibiting substance.
  • Mg chelatase whole cells of the recombinant organism, which recombinantly expresses the three subunits CHLD, CHLH and CHLI of the Mg chelatase, or protein-containing extracts from this organism or differently enriched fractions from this organism containing Mg chelatase can also be used become.
  • Yeast cells may be mentioned as the preferred recombinant host organism for this purpose.
  • a functional Mg chelatase isolated from plant tissue or plant cell cultures and containing the subunits CHLD, CHLH and CHLI can also be used.
  • the genetically engineered Mg chelatase preferably a Mg chelatase complex with the genetically engineered subunit CHLD or the free CHLD subunit
  • the genetically engineered subunit CHLD or the free CHLD subunit can also be used, for example, to elucidate the spatial structure of the plant enzyme.
  • well-known methods such as. B. the X-ray structure analysis of protein crystals or NMR spectroscopy can be used.
  • the structural information about the Mg chelatase, preferably the CHLD subunit can be used, for example, to carry out a rational design of new inhibitors of the Mg chelatase - and thus potential herbicides.
  • Standard methods such as DNA and RNA isolation, sequence analysis, restriction, cloning, gel electrophoresis, radioactive labeling, Southern and Northem blot were carried out according to common methods (Sambrook at al., 1989 Molecular Screening: A laboratory manual 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY USA; Sanger et al., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467).
  • Example 1 Cloning of a tobacco cDNA encoding the CHLD subunit of Mg chelatase
  • VDASGS SEQ ID No. 3
  • TDGRGN SEQ ID No. 4
  • AKGAVM Seq. ID No. 7
  • PCR polymerase chain reaction
  • a lambda ZAP II cDNA bank of tobacco (Nicotiana tabacum SR1, Stratagene) was screened with the isolated and 32 P [dCTP] -labelled approximately 270 bp fragment as hybridization sample.
  • the DNA present in the phagemid p Bluescript SK after cDNA bank screening was isolated and sequenced.
  • the chlD cDNA sequence identified and shown in SEQ ID No. 1 contains a 2274 nucleotide open reading frame, as well as regions not translated at the 5 'and 3' ends.
  • Genomic DNA from tobacco was hybridized with radiolabeled DNA from the CHLD gene.
  • the CHLD gene was cut out of the phagemid p-Bluescript SK- with EcoRI and HindIII. The resulting two fragments of size 2069 bp and 426 bp were radioactively labeled with 32 P (dCTP).
  • the tobacco cDNA fragment for CHLD obtained in pBluescript SK- according to Example 1 was cut out of the vector pBluescript SK- with Kpnl and Xbal and in the binary vector BinAR cut up with Kpnl and Xbal (Höfgen and Willmitzer, Plant Science (1990) 66, 22-230).
  • E. coli strain DH 5 ⁇ was transformed with the construct, then Agrobacterium tumefaciens strain GV 2260. With the leaf disc transformation method (Horsch et al., Science 228, 1229-31), young tobacco leaf discs were incubated with the agrobacteria and the CHLD- antisense gene stably integrated into the plant genome.
  • Example 3 Production of chlD-sense tobacco plants
  • the chID cDNA was cut out of p Bluescript SK- with Smal and Xbal and cloned into the BinAR vector after restriction digestion.
  • the method described in Example 2 was chosen for stable integration into the tobacco genome.
  • the stable integration of the sense or antisense chID genes into the genome of the tobacco plants was confirmed by Southern blot analysis and the mRNA content of the chID transcript was determined by Northern blot analysis.
  • the content is reduced compared to the wild type.
  • chlD-sense plants have only slightly increased chID mRNA levels compared to the wild type.
  • the activity of the Mg chelatase was determined for transgenic and wild type plants according to Lee et al. (1992, Plant Physiol. 99, 1134-1140).
  • the sense and antisense plants always have reduced enzyme activities.
  • the phenomenon of reduced enzyme activities in the presumably CHLD-overexpressed transformants can be explained with the effect of negative dominance.
  • An oversupply of the CHLD subunit will disrupt the fein regulated assembly of the Mg chelatase enzyme complex.
  • protoporphyrin IX and chlorophyll were determined in transgenic and wild type plants (see Table 2). It should be emphasized that the transformants with sense or antisense CHLD mRNA in their examined young leaves (3rd, 5th and 7th leaf) generally have up to 3-5 times higher protoporphyrin contents compared to wild type plants.
  • the chlorophyll content determination confirms the macroscopic phenotype. The content was reduced by up to 25% in individual plants.
  • Plant leaf protoporphyrin IX [%] chlorophyll [%]
  • Example 5 Construction of plasmids for the expression of CHL D, H and I as fusion proteins with the GAL4 binding domain and the GAL4 activation domain
  • Coded subunits of the Mg chelatase amplified by means of polymerase chain reaction (PCR).
  • telomere sequence 100 ng was used as template.
  • the following two oligonucleotides were used as PCR primers used: 5'-TGA CCC GGG GGT AGT GGA ACC TGA AAA ACA ACC-3 'as sense primer with Smal restriction interface and as antisense primer either ⁇ '-GGC GAA TTC TCA AGA TTC CTT TAA TGC AGA TAA-3' with EcoRI restriction interface, or 5'-GCG GTC GAC TCA AGA TTC CTT TAA TGC AGA -3 'with Sall restriction interface.
  • telomere sequence 100 ng was used as template.
  • the following two oligonucleotides were used as PCR primers: as sense primer 5'-GCT GAT ATC GGC TAT TGG CAA TGG TTT ATT CAC-3 'with EcoRV restriction interface and as antisense primer 5'-GCG TCG ACA TTT ATC GAT CGA TTC CCT CAA-3 'with Sall restriction site.
  • To amplify the chll gene 100 ng of the plasmid pNTCHLI were used as template.
  • oligonucleotides were used as PCR primers: as sense primer 5'-CAG CCC GGG GGG TCC ACT ACT AGG-3 'with Smal restriction interface and as antisense primer 5'-CAG GTC GAG GCA CAG TAC AAA GCC-3 'with Sall restriction interface.
  • the shuttle plasmids of the MATCHMAKER TM two-hybrid system were used as vectors: pGBT9 and pAS2 each contain a gene which codes for the GAL4 activation domain. pGAD424 and pACT2 each contain a gene that codes for the GAL4 DNA binding domain. pGBT9 and pGAD424, or pAS2 and pACT2, are used together in one system. pGBT9 and pGAD424 differ from pAS2 and pACT2 in that the genes mentioned are expressed more weakly in the former than in the latter.
  • the gene was amplified using the sense primer with Smal interface and the antisense primer with EcoRI interface and then ligated with the vector cut with Smal and EcoRI.
  • the gene was isolated using the sense primer with Smal interface and the antisense Amplifiers amplified with Sall interface and then d ligated with the vector cut with Smal and Sall.
  • the genes were amplified using the sense and antisense primers and then ligated with the vector cut with Smal and Xhol.
  • the ligated DNA was introduced into E. coli DH 5a by means of transformation and transformed clones were selected on agar medium with 100 ⁇ g ampicillin / ml. Plasmid DNA was isolated from the recombinant bacteria and their identity was checked by means of restriction analysis.
  • Example 6 Determination of the interaction between subunits of Mg chelatase using the two-hybrid system in yeast
  • Competent yeast cells strain SFY 526 (Harper et al., 1993, Cell, 75, 805-816), were produced by the Klebe method (Klebe et al., 1983, Gene, 25, 333-341) and with the transformed plasmids listed in Example 2.
  • SFY 526 was transformed with all plasmids individually and in all possible combinations and onto minimal agar (1.5% agar, 10% YNB glucose) with the addition of amino acids (adenine 20 mg / l; L-histidine-HCl 20 mg / l; L-lysine-HCl 30 mg / l; L-leucine 30 mg / l L-tryptophan 20 mg / l).
  • the yeast strain SFY526 + pAS2-chlD + pACT2-chll to be measured was added to 10ml minimal medium (10% YNB glucose) with the addition of required amino acids (adenine 20mg / l; L-histidine-HCL 20mg / l and L-lysine-HCL 30mg / l) cultivated overnight at 30 ° C. and 180 rpm in a sterile 50 ml steep breast bottle with a metal cap.
  • the optical density (OD 600 ) of this overnight culture was recorded (Beckman DU 640 spectrophotometer), the measured values were between 1.0 and 2.0. 100 ⁇ l of this culture were tested for ⁇ -galactosidase activity.
  • the total sample volume was approx. 1 ml:
  • a 420 is the absorption at 420 nm
  • C is the density of the cell suspension (OD 600 )
  • V is the volume of the cell suspension used and t the incubation time. The measurement was repeated with two further clones and the average was determined
  • Competent cells of the strain SFY526 + pAS2-chlD + pACT2-chlH were produced (Klebe et al, 1983, Gene, 25, 333-341) and with pSG28 (p423TEF + chll, p423TEF Mumberg et al, 1995, Gene, 156, 119-122) Transformants were selected on minimal agar (10% YNB glucose, 1.5% agar) with the addition of adenine (20 mg / l) and L-lysine-HCl (30 mg / l)
  • the cells were sedimented 5 mm at 5000 rpm (Sigma 4K 10) and in 1.5 ml assay buffer (0.1 M tricine pH 7.9, 0.3 M glycerol, 25 mM MgCl 2 , 4 mM DTT) Resuspended this cell suspension was then digested 3x30 seconds by ultrasound on ice with low ultrasound strength. The digested cells were 15 min at 5000 rpm (Sigma 4 K 10) sedimented and continued to work with the supernatant. The protein content of this yeast extract was determined using the BioRad Protein Assay according to the
  • the assay volume was 1 ml.
  • 1 ml assay buffer contained 1 mg protein extract from the digested yeast culture, 4 mM ATP, 1.5 ⁇ M protoporphyrin IX, 50 mM
  • This incubation mix was incubated for one hour at 30 ° C in the dark and then a fluorescence emission spectrum between 500 and 650 nm at an exciting wavelength of 420 nm on a Perkin Elmer Luminescence
  • Spectrometer LS50B recorded and subjected to an HPLC analysis.
  • Fig. 1 (a - d) shows transgenic chID sense and antisense tobacco plants
  • MOLECULE TYPE DNA (genomic)
  • GCT GAA CTT TAT
  • GCT GCT CGT GTA GCC AAA TGC
  • GCT GCC ATC
  • 1158 Ala Glu Leu Tyr Ala Ala Arg Val Ala Lys Cys Leu Ala Ala Ile Asp 360 365 370
  • GAT GAG AAA GAT AGA GAA AAT GAA CAG CAA CAG CCA CAA GTC CCT GAT 1398 Asp Glu Lys Asp Arg Glu Asn Glu Gin Gin Gin Pro Gin Val Pro Asp 440 445 450
  • GGT AGA GCT AAC ATC TCT CTT AAA AGA TCC ACA GAC CCT GAA GCT GAA 2070 Gly Arg Ala Asn Ile Ser Leu Lys Arg Ser Thr Asp Pro Glu Ala Glu 665 670 675
  • GAAAAGCTCC AGAACCAAAT CGACTCAGCT AGGAACGCTC TTTCTGCTGT TACAATCGAT 1080

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Nukleinsäuremolekül, welches für ein Protein mit der Funktion einer pfanzlichen Mg-Chelatase-Untereinheit CHLD oder ein aktives Fragment daraus kodiert; ein Protein, welches die Funktion einer pflanzlichen Mg-Chelatase-Untereinheit CHLD aufweist oder ein aktives Fragment daraus, vorzugsweise ein rekombinantes Protein; ein Verfahren zur Bestimmung der Wechselwirkung pflanzlicher Mg-Chelatase-Untereinheiten, bei dem eine Wirtszelle mit einer DNA-Sequenz gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 3 sowie mindestens mit einer DNA-Sequenz kodierend für eine weitere Untereinheit der Mg-Chelatase in einer Weise transformiert wird, daß die Interaktion der Mg-Chelatase-Genprodukte zu einem direkt oder indirekt, qualitativ oder quantitativ meßbaren Signal führt, vorzugsweise durch die Aktivierung eines Markergens, und transgene Pflanze, transgene Pflanzenzellen, transgene Pflanzenteile, transgene Pflanzensamen, transgenes Vermehrungsgut, enthaltend ein o.g. Nukleinsäuremolekül.

Description

Beschreibung
DNA-Sequenzen kodierend für die Untereinheit CHLD pflanzlicher Magnesium- Chelatasen sowie Verfahren zur Aktivitätsbestimmung pflanzlicher Magnesium- Chelatasen
Die vorliegende Erfindung betrifft die Untereinheit CHLD pflanzlicher Magnesium-Chelatase (Mg-Chelatase), DNA Sequenzen kodierend für die Untereinheit CHLD pflanzlicher Mg-Chelatase, Verfahren zur Herstellung der Untereinheit CHLD der pflanzlichen Mg-Chelatase, Verfahren zur Aktivitätsbestimmung pflanzlicher Mg-Chelatase sowie transgene Pflanzen, die mit der erfindungsgemäßen Mg-Chelatase-DNA transformiert wurden.
Die Chlorophylle haben als Cofaktoren des Photosystems Anteil an der Umwandlung von Licht in chemische Energie und sind somit notwendig für das Wachstum und das Überleben von Pflanzen.
Während der Biosynthese der Chlorophylle erfolgt der Einbau des Magnesiums in das Porphyrin mit Hilfe eines membranassoziierten Enzyms, der Mg-Chelatase, die aus mehreren Untereinheiten aufgebaut ist.
Es ist bereits bekannt, daß die bakterielle Mg-Chelatase aus drei Untereinheiten (D, H und I) besteht, deren korrespondierenden Gensequenzen mit bchD, bchH und bchl bezeichnet wurden (Burke et al. (1993), J. Bacteriol. 175, 2414-2422; Coomber et al. (1990), Mol. Microbiol. 4, 977-989; Gibson et al. (1995), Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 92, 1941-1844; Jensen et al. (1996), J. Biol. Chem. 271 , 16662-16667). Tabelle I: Auflistung der Gene bekannter Mg-Chelatase Untereinheiten
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In bezug auf pflanzliche Mg-Chelatasen wurden bisher zwei Untereinheiten beschrieben, die offenbar den bakteriellen Mg-Chelatase-Untereinheiten bchH und bchl entsprechen (Koncz et al., (1990), EMBO J. 9, 1337-1346; Hudson et al., (1993), EMBO J. 12, 3711-3719; Eibson et al., (1996), Plant Physiol. 121 , 61-71 ). Bislang ist nicht bekannt, welche weiteren Untereinheiten am Aufbau der pflanzlichen Mg-Chelatase beteiligt sind. Mit den beiden bekannten pflanzlichen Untereinheiten CHLI und CHLH konnte weder alleine, noch zusammen mit den bekannten bakteriellen Untereinheiten vom Typ D (CHLD bzw BCHD) eine Enzymaktivität festgestellt werden.
Aufgrund ihrer Schlüsselstellung innerhalb der Chlorophyllbiosynthese stellt die pflanzliche Mg-Chelatase einen grundlegend neuen Angriffspunkt für die Entwicklung einer neuen Generation hochspezifisch wirksamer, herbizider Verbindungen dar. Darüber hinaus kann durch eine Beeinflussung der Genexpression (Suppression, Überexpression), der natürlichen oder (z.B. gentechnisch) modifizierten Expressionsprodukte der Mg-Chelatase oder auch durch spezifische Mg-Chelatase-Inhibitoren in hohem Maße Einfluß auf die Vitalität und/oder das Wachstum von phototrophen ein- und mehrzelligen Organismen, insbesondere Bakterien, Algen und Pflanzen genommen werden.
Die enzymatische Aktivität der pflanzlichen Mg-Chelatase wurde ursprünglich an intakten Chloroplasten gemessen (Castelfranco et al., (1979) Arch. Biochem. Biophys. 192, 592-598; Fuesler et al. (1982) Plant Physiol. 69, 421-423). Inzwischen wurden Aktivitätsbestimmungen auch an aufgebrochenen Piastiden (Walker et al. (1991 ) Proc. Natl. Acad. Sei. 88, 5789-5793) sowie subplastidären Membranfraktionen vorgenommen (Lee et al., (1992), Plant Physiol. 99, 1134- 1140).
Es wurde nun überraschenderweise eine für eine Untereinheit des Enzyms der pflanzlichen Mg-Chelatase kodierende DNA gefunden. Im folgenden wird die DNA- Sequenz als chID und die Aminosäuresequenz als CHLD bezeichnet.
Des weiteren wurde gefunden, daß eine Untereinheit CHLD der pflanzlichen Mg- Chelatase überraschenderweise geeignet ist, zusammen mit den Untereinheiten CHLI und CHLH eine funktionell intakte, d.h. enzymatisch aktive, pflanzliche Mg- Chelatase zu rekonstituieren; so daß die erfindungsgemäße pflanzliche Mg- Chelatase-Untereinheit CHLD neuartige Testverfahren (in-vivo und in-vitro) der pflanzlichen Mg-Chelatase-Aktivität bereitstellt.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Nukleinsauremolekul, dadurch gekennzeichnet, daß es für ein Protein mit der Funktion einer pflanzlichen Mg- Chelatase-Untereinheit CHLD kodiert, vorzugsweise ein Nukleinsauremolekul gemäß SEQ ID Nr. 1 , ein biologisch aktives Fragment daraus sowie komplementäre oder anti-sense-Sequenzen.
Die Erfindung betrifft pflanzliche chlD-Sequenzen, vorzugsweise aus dicotylen Pflanzen, besonders bevorzugt Solanaceae und insbesondere Nicotiana tabacum.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Nukleinsauremolekul, dadurch gekennzeichnet, daß es für ein Protein gemäß SEQ ID Nr. 2 mit der Funktion einer pflanzlichen Mg-Chelatase-Untereinheit CHLD oder ein biologisch aktives Fragment daraus kodiert oder es eine komplementäre oder anti-sense- Sequenz zu einem solchen Nukleinsauremolekul bildet. Darüber hinaus ist Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein Nukleinsauremolekul, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Oligonukleotid von mindestens 10 Nukleotiden Länge darstellt, das spezifisch mit einem Nukleinsauremolekul, das für ein Protein mit der Funktion einer pflanzlichen Mg- Chelatase-Untereinheit CHLD kodiert, vorzugsweise SEQ ID Nr. 1 , einem Fragment daraus, oder deren komplementären oder anti-sense-Sequenzen hybridisiert.
"Spezifisch Hybridisieren" bezeichnet im allgemeinen die Eigenschaft eines einzelsträngigen Nukieinsäuremoleküls mit einem komplementären Nukleinsauremolekul Wasserstoffbrücken, Basenpaare und gegebenenfalls einen Doppelstrang auszubilden.
Ebenso ist Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein Nukleinsauremolekul, welches für ein Peptid aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 3, SEQ ID Nr. 4 und SEQ ID Nr. 7 kodiert, sowie dessen komplementäre oder anti-sense- Sequenzen.
Unter dem Begriff "rekombinanter Organismus" ist die Zelle eines durch in vitro veränderter DNA oder durch Integration von DNA modifizierten Organismus zu verstehen, beispielsweise von rekombinante Hefe-, Bakterien-, Algen, Insektenoder Pflanzenzellen.
Die kleine Schreibweise "chl" bezeichnet konventionsgemäß die Gene der Mg- Chelatase-Untereinheiten D, I, und H, wohingegen die Großschrift "CHL" die Genprodukte, d.h. Proteine, bezeichnet.
Des weiteren ist Gegenstand der vorliegenden Er indung die Verwendung der erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle für die Amplifizierung, Isolierung oder Identifizierung eines Nukieinsäuremoleküls, kodierend für ein Protein mit der Funktion einer pflanzlichen Mg-Chelatase-Untereinheit CHLD oder ein biologisch aktives Fragment daraus, insbesondere von chlD-Strukturgenen oder von chID- mRNA weiterer Organismen, vorzugsweise pflanzlichen oder mikrobiellen Ursprungs.
Erfindungsgegenstand ist auch die Verwendung der erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle zur Herstellung von Antikörpern gegen deren Expressionsprodukte.
Gegenstand der Erfindung sind auch nicht-natürlich vorkommende chimäre Gene, enthaltend einen Promotor, der funktionell mit einem erfindungsgemäßen DNA- Molekül fusioniert ist.
Gegenstand der Erfindung ist auch ein Vektor, vorzugsweise ein rekombinanter Vektor, enthaltend ein erfindungsgemäßes Nukleinsauremolekul enthaltend ein chimäres Gen enthaltend einen Promotor, der funktioneil mit einem erfindungsgemäßen DNA-Molekül fusioniert ist.
Gegenstand der Erfindung ist auch eine rekombinante Wirtszelle, dadurch gekennzeichnet, daß diese Wirtszelle ein erfindungsgemäßes DNA-Molekül exprimiert, vorzugsweise daß diese Wirtszelle stabil mit einem rekombinanten Vektor, enthaltend ein chimäres Gen enthaltend einen Promotor, der funktionell mit einem erfindungsgemäßen Nukleinsauremolekul fusioniert ist, transformiert ist oder nach anderen, dem Fachmann bekannten Transformationsverfahren transformiert ist und ein erfindungsgemäßes DNA Molekül exprimiert.
Erfindungsgegenstand ist ebenfalls die Verwendung der erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle zur Herstellung von transgenen Pflanzen.
Gegenstand der Erfindung sind auch transgene Pflanzen, transgene Pflanzenzellen, transgene Pflanzenteile, ransgene Pflanzensamen, transgenes Vermehrungsgut, enthaltend ein erfindungsgemäßes Nukleinsauremolekul. Gegenstand der Erfindung sind auch Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzen, transgener Pflanzenzellen, transgener Pflanzenteile, transgener Pflanzensamen, transgenen Vermehrungsguts mittels einer rekombinanten Wirtszelle, dadurch gekennzeichnet, daß diese Wirtszelle mit einem erfindungsgemäßen DNA-Molekül transformiert ist.
Die Erfindung betrifft ebenfalls Vermehrungsmaterial der erfindungsgemäßen Pflanzen, beispielsweise Früchte, Samen, Knollen, Wurzelstöcke, Sämlinge und Stecklinge.
Als Empfänger-Pflanzen für ein erfindungsgemäßes Gen kommen alle landwirtschaftlich wichtigen monokotylen und dikotylen Kulturpflanzen in Betracht, vorzugsweise Mais und andere Getreide, wie beispielsweise Weizen, Roggen, Gerste, Hirse, Hafer, Maniok und Reis sowie Baumwolle, Tabak, Zuckerrüben, Zuckerrohr, Kartoffeln, Raps, Sonnenblumen, Soja oder Obst- und Gemüsepflanzen.
Zur Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle in pflanzlichen Zellen werden diese mit regulatorischen DNA-Elementen verknüpft, die die Transkription in pflanzlichen Zellen gewährleisten. Hierzu zählen insbesondere Promotoren. Generell kommt für die Expression jeder in pflanzlichen Zellen aktive Promotor in Frage.
Der Promotor kann dabei so gewählt sein, daß die Expression konstitutiv erfolgt oder nur in einem bestimmten Gewebe, zu einem bestimmten Zeitpunkt der Pflanzenentwicklung oder zu einem durch äußere Einflüsse determinierten Zeitpunkt. In Bezug auf die Pflanze kann der Promotor homolog oder heterolog sein. Geeignete Promotoren sind z.B. der Promotor der 35S RNA des Cauliflower Mosaic Virus und der Ubiquitin-Promotor aus Mais für eine konstitutive Expression, der Patatingen-Promotor B33 (Rocha-Sosa et al., EMBO J. 8 (1989), 23-29) für eine sink-spezifische Expression (z.B. Kartoffelknollen, Rüben, Tomatenfrucht) oder ein Promotor, der eine Expression lediglich in photosynthetisch aktiven Geweben sicherstellt, z.B. der ST-LS1 -Promotor (Stockhaus et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84 (1987), 7943-7947; Stockhaus et al., EMBO J. 8 (1989), 2445-2451 ), alle in Piastiden konstitutiv aktiven Promotoren z.B. die Expressions-Signalsequenzen der psM-Kassette (Staub & Maliga (1993) EMBO Journal 12: 601-606; Zoubenko et al. (1994) Nucleic Acids Research 22:3819-3824) und der Prn Promotor (Svab & Maliga (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90: 913-917) oder für eine endosperm- spezifische Expression der HMG-Promotor aus Weizen, der USP-Promotor, der Phaseolinpromotor oder Promotoren von Zein-Genen aus Mais. Ferner kann eine Terminationssequenz vorhanden sein, die der korrekten Beendigung der Transkription dient sowie der Addition eines Poly-A-Schwanzes an das Transkript, dem eine Funktion bei der Stabilisierung der Transkripte beigemessen wird. Derartige Elemente sind in der Literatur beschrieben (vgl. Gielen et al., EMBO J. 8 (1989), 23-29) und sind im allgemeinen beliebig austauschbar.
Zur Vorbereitung der Einführung fremder Gene in höhere Pflanzen stehen eine große Anzahl von Klonierungsvektoren zur Verfügung, die ein Replikationssignal für E. coli und ein Markergen zur Selektion transformierter Bakterienzellen enthalten. Beispiele für derartige Vektoren sind pBR322, pUC-Serien, M13mp-Serien, pACYC184. Die gewünschte Sequenz kann an einer passenden Restriktionsschnittstelle in den Vektor eingeführt werden. Das erhaltene Plasmid wird für die Transformation von E. coli-Zellen verwendet. Transformierte E. coli- Zellen werden in einem geeigneten Medium gezüchtet, anschließend geerntet und lysiert. Das Plasmid wird wiedergewonnen. Als Analysemethode zur Charakterisierung der gewonnenen Plasmid-DNA werden im allgemeinen Restriktionsanalysen, Gelelektrophoresen und weitere biochemisch- molekularbiologische Methoden eingesetzt. Nach jeder Manipulation kann die Plasmid-DNA gespalten und gewonnene DNA-Fragmente mit anderen DNA- Sequenzen verknüpft werden. Jede Plasmid-DNA-Sequenz kann in den gleichen oder anderen Plasmiden kloniert werden. Für die Einführung von DNA in eine pflanzliche Wirtszelle stehen eine Vielzahl von Techniken zur Verfügung. Diese Techniken umfassen die Transformation pflanzlicher Zellen mit T-DNA unter Verwendung von Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes als Transformationsmittel, die Fusion von Protoplasten, die Injektion, die Elektroporation von DNA, das Einbringen von DNA mittels der biolistischen Methode etc..
Bei der Injektion und Elektroporation von DNA in Pflanzenzellen werden an sich keine speziellen Anforderungen an die verwendeten Plasmide gestellt. Es können einfache Plasmide wie z.B. PUC-Derivate verwendet werden. Sollen aber aus derartig transformierten Zellen ganze Pflanzen regeneriert werden, ist die Anwesenheit eines selektierbaren Markergens notwendig.
Je nach Einführungsmethode gewünschter Gene in die Pflanzenzelle können weitere DNA-Sequenzen erforderlich sein. Werden z.B. für die Transformation der Pflanzenzelle das Ti- oder Ri-Plasmid verwendet, so muß mindestens die rechte Begrenzung, häufig jedoch die rechte und linke Begrenzung der Ti- und Ri-Plasmid T-DNA als Flankenbereich mit den einzuführenden Genen verbunden werden.
Werden für die Transformation Agrobakterien verwendet, muß die einzuführende DNA in spezielle Plasmide kloniert werden, und zwar entweder in einen intermediären Vektor oder in einen binären Vektor. Die intermediären Vektoren können aufgrund von Sequenzen, die homolog zu Sequenzen in der T-DNA sind, durch homologe Rekombination in das Ti- oder Ri-Plasmid der Agrobakterien integriert werden. Dieses enthält außerdem die für den Transfer der T-DNA notwendige vir-Region. Intermediäre Vektoren können nicht in Agrobakterien replizieren. Mittels eines Helferplasmids kann der intermediäre Vektor auf Agrobacterium tumefaciens übertragen werden (Konjugation). Binäre Vektoren können sowohl in E. coli als auch in Agrobakterien replizieren. Sie enthalten ein Selektionsmarker-Gen und einen Linker oder Polylinker, welche von der rechten und linken T-DNA Grenzregion eingerahmt werden. Sie können direkt in die Agrobakterien transformiert werden (Holsters et al. Mol. Gen. Genet. 163 (1978), 181-187). Das als Wirtszelle dienende Agrobakterium soll ein Plasmid enthalten, das eine vir-Region trägt. Die vir-Region ist für den Transfer der T-DNA in die Pflanzenzelle notwendig; zusätzliche T-DNA kann vorhanden sein. Das derartig transformierte Agrobakterium wird zur Transformation von Pflanzenzellen verwendet.
Die Verwendung von T-DNA für die Transformation von Pflanzenzellen ist ausführlich in EP 120 516 beschrieben; Hoekema, in: The Binary Plant Vector System, Offsetdrukkerij Kanters B.V, Alblasserdam (1985), Chapter V; Fraley et al., Crit. Rev. Plant. Sei., 4, 1-46 und An et al. EMBO J. 4 (1985), 277-287.
Für den Transfer der DNA in die Pflanzenzelle können Pflanzen-Explantate zweckmäßigerweise mit Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes kokultiviert werden. Aus dem infizierten Pflanzenmaterial (z.B. Blattstücke, Stengelsegmente, Wurzeln, aber auch Protoplasten oder Suspensions-kultivierte Pflanzenzellen) können dann in einem geeigneten Medium, welches Antibiotika oder Biozide zur Selektion transformierter Zellen enthalten kann, wieder ganze Pflanzen regeneriert werden. Die so erhaltenen Pflanzen können dann auf Anwesenheit der eingeführten DNA untersucht werden. Andere Möglichkeiten der Einführung fremder DNA unter Verwendung des biolistischen Verfahrens oder durch Protoplastentransformation sind bekannt (vgl. z.B. Willmitzer, L., 1993 Transgenic Plants. In: Biotechnology, A Multi-Volume Comprehensive Treatise (H.J. Rehm, G. Reed, A. Pühler, P. Stadler, eds.), Vol. 2, 627-659, VCH Weinheim).
Alternative Systeme zur Transformation von monokotylen Pflanzen sind die Transformation mittels des biolistischen Ansatzes, die elektrisch oder chemisch induzierte DNA-Aufnahme in Protoplasten, die Elektroporation von partiell permeabilisierten Zellen, die Makroinjektion von DNA in Blütenstände, die Mikroinjektion von DNA in Mikrosporen und Pro-Embryonen, die DNA-Aufnahme durch keimende Pollen und die DNA-Aufnahme in Embryonen durch Quellung (zur Übersicht: Potrykus, Physiol. Plant (1990), 269 - 273).
Während die Transformation dikotyler Pflanzen über Ti-Plasmid-Vektorsysteme mit Hilfe von Agrobacterium tumefaciens wohl etabliert ist, weisen neuere Arbeiten darauf hin, daß auch monokotyle Pflanzen der Transformation mittels Agrobacterium basierender Vektoren sehr wohl zugänglich sind (Chan et al., Plant Mol. Biol. 22 (1993), 491-506; Hiei et al., Plant J. 6 (1994), 271-282; Bytebier et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84 (1987), 5345 - 5349; Raineri et al., Bio/Technology 8 (1990), 33 - 38; Gould et al., Plant Physiol. 95 (1991 ), 426 - 434; Mooney et al., Plant Cell Tiss. & Org. Cult. 25 (1991 ), 209 - 218; Li et al., Plant Mol. Biol. 20 (1992), 1037 - 1048).
Drei der oben genannten Transformationssysteme konnten in der Vergangenheit für verschiedene Getreide etabliert werden: die Elektroporation von Gewebe, die Transformation von Protoplasten und der DNA-Transfer durch Partikel-Beschüß in regenerierbare Gewebe und Zellen (Jahne et al., Euphytica 85 (1995), 35 - 44).
Die Transformation von Weizen wird in der Literatur verschiedentlich beschrieben (zur Übersicht: Maheshwari et al., Critical Reviews in Plant Science 14 (2) (1995), 149 - 178), vgl. auch Hess et al. (Plant Sei. 72 (1990), 233), Vasil et al. (Bio/Technology 10 (1992), 667 - 674), Weeks et al. (Plant Physiol. 102 (1993), 1077 - 1084) sowie Becker et al. (Plant J. 5(2) (1994), 299 - 307).
Ist die eingeführte DNA einmal im Genom der Pflanzenzelle integriert, so ist sie dort in der Regel stabil und bleibt auch in den Nachkommen der ursprünglich transformierten Zelle erhalten. Sie enthält normalerweise einen Selektionsmarker, der den transformierten Pflanzenzellen Resistenz gegenüber einem Biozid, wie Phosphinothricin, oder einem Antibiotikum, wie Kanamycin, G 418, Bleomycin oder Hygromycin, vermittelt. Der individuelle gewählte Marker sollte daher die Selektion transformierter Zellen gegenüber Zellen, denen die eingeführte DNA fehlt, gestatten. Die transformierten Zellen wachsen innerhalb der Pflanze in der üblichen Weise (siehe auch McCormick et al., Plant Cell Reports 5 (1986), 81-84). Die resultierenden Pflanzen können normal angezogen werden und mit Pflanzen, die die gleiche transformierte Erbanlage oder andere Erbanlagen besitzen, gekreuzt werden. Die daraus entstehenden hybriden Individuen haben die entsprechenden phänotypischen Eigenschaften. Von den Pflanzenzellen können Samen gewonnen werden.
Es sollten zwei oder mehrere Generationen angezogen werden, um sicherzustellen, daß das phänotypische Merkmal stabil beibehalten und vererbt wird. Auch sollten Samen geerntet werden, um sicherzustellen, daß der entsprechende Phänotyp oder andere Eigenarten erhalten geblieben sind.
Gegenstand der Erfindung sind darüber hinaus Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Nukieinsäuremoleküls, dadurch gekennzeichnet, daß ein erfindungsgemäßes Nukleinsauremolekul nach einem an sich bekannten Verfahren zur Herstellung von Nukleinsäuren hergestellt wird. Dem in der Klonierung von cDNA erfahrenen Fachmann stehen hierzu eine Vielzahl verschiedener Methoden zur Isolierung und Klonierung von Gensequenzen zur Verfügung.
Darüber hinaus können die erfindungsgemäßen Sequenzinformationen auch für eine Vielzahl anderer, dem Fachmann bekannter Methoden genutzt werden, wie z.B. der Durchmusterung von Expressionsbibliotheken zur Genisolierung mit Antikörpern oder auch zur Herstellung von Antikörpern (polyklonal oder monoklonal).
Für solche Methoden können die gesamte pflanzliche chlD-cDNA, vorzugsweise chID aus Nicotiana tabacum gemäß SEQ ID Nr.1 , Teilsequenzen aus SEQ ID Nr.1 oder aus SEQ ID Nr.1 abgeleitete Oligonukleotide als Sonden eingesetzt werden, gegebenenfalls solche, welche selektiv mit anderen CHLD-kodierenden Sequenzen aus einer Bank von klonierten Genfragmenten eines ausgewählten Organismus z.B. phototrophe Mikroorganismen oder mono- oder dikotyle Pflanzen hybridisieren.
Solche Techniken schließen beispielsweise auch die Durchmusterung von genomischen oder cDNA-Bibliotheken, kloniert in geeigneten Zellen oder Viren sowie die Amplifizierung durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) unter Verwendung von aus SEQ ID NR. 1 abgeleiteten Oligonukleotid-Primem ein.
Die isolierten chlD-(Teil)-Sequenzen gemäß vorliegender Erfindung, können außerdem durch gentechnische Standard-Methoden verändert oder erweitert werden, um gewünschte Eigenschaften zu erhalten. Um eine selektive Hybridisierung unter in vitro oder in vivo Bedingungen zu erhalten, sind chlD- spezifische Sonden mindestens 10 Nukleotide lang, vorzugsweise mindestens 17 Nukleotide lang.
Hybridisierungssonden gemäß vorliegender Erfindung können beispielsweise genutzt werden, um CHLD-kodierende Sequenzen (d.h. CHLD-kodierende Nukleinsäuremoleküle) aus einem ausgewählten Organismus mittels der dem Fachmann bekannten Methode der PCR zu amplifizieren oder zu analysieren und können des weiteren zur Isolierung von CHLD-kodierenden Sequenzen aus anderen Organismen oder als diagnostisches Mittel zum Nachweis von CHLD- kodierenden Sequenzen in anderen Organismen genutzt werden oder, um modifizierte CHLD-kodierende Sequenzen eines besonderen Phänotyps wie z. B. Herbizidresistenz, verändertem Chlorophyllgehalt, veränderter Fitness, verändertem Ertrag usw. zu identifizieren und zu isolieren.
Die chlD-spezifischen Hybridisierungssonden können auch verwendet werden, um unter Einsatz von Standard-Methoden den Genort eines natürlich vorkommenden chlD-Gens im Genom einer Pflanze zu kartieren. Diese Methoden umfassen, u.a. die Identifizierung von DNA-Polymorphismen und den Einsatz solcher Polymorphismen zur Analyse der Segregation von chlD-Genen relativ zu anderen Markern mit bekanntem Genort. Die Kartierung von chlD-Genen kann besonders für die Pflanzenzüchtung von Interesse sein.
chlD-spezifische Hybridisierungssonden oder CHLD-kodierende (Teil-)Sequenzen können auch dazu genutzt werden, um in planta die Expression eines chlD-Gens zu inhibieren (Antisense-Technologie).
Mittels Standard-Methoden können CHLD-kodierende (Teil-)Sequenzen auch verändert oder um neue Sequenzelemente erweitert und in das Genom von Pflanzen eingebracht werden. Die Pflanzen können dabei nach herkömmlichen Verfahren transient oder stabil transformiert werden. Die Integration von Sequenzen abgeleitet aus der chlD-cDNA in das Genom der Pflanze kann dazu genutzt werden, die Eigenschaften der Pflanze zu verändern, so daß z. B. mehr oder weniger funktioneil aktive Mg-Chelatase oder eine Variante der Mg-Chelatase mit veränderten Eigenschaften in der transgenen Pflanze gebildet wird oder aber, daß das Expressionsniveau des in der transgenen Pflanze vorhandenen chlD-Gens vermindert wird. Beispielsweise kann die Menge an funktioneller Mg-Chelatase durch Standard-Methoden erhöht werden, wenn z.B. das chlD-Gen alleine oder zusammen mit Genen anderer Mg-Chelatase-Untereinheiten unter der transkriptionellen Kontrolle regulatorischer Elemente wie Promotoren und Enhancern in die transgene Pflanze kloniert wird. Eine Erhöhung der CHLD-Aktivität kann z. B. zur Steigerung des Chlorophyllgehaltes, welche mit einer Ertragssteigerung verbunden sein kann, oder zur Erhöhung der Toleranz gegenüber Herbiziden, welche die Chlorophyllbiosynthese inhibieren, eingesetzt werden. Ebenso kann z.B. die Klonierung von veränderten, erfindungsgemäßen Sequenzen in transgene Pflanzen mit einer Erhöhung der Herbizidtoleranz verbunden sein.
Die in transgene Pflanzen eingeführten Nukleinsäuremoleküle, kodierend für chlD- Sequenzen oder Fragmente aus diesen Sequenzen (Molekülen), können aber auch in einer Weise mit regulatorischen Elementen, wie beispielsweise Promotoren oder Enhancern, versehen werden, so daß eine Erniedrigung der ursprünglichen Mg- Chelatase-Aktivität in der transgenen Pflanze resultiert (z.B. Kosuppression, Bildung von chlD-Antisense-RNA). Eine Herabsetzung der Mg-Chelataseaktivität kann zur Herstellung von chlorotischen Pflanzen oder Pflanzen mit chlorotischen Geweben genutzt werden. Ein verminderter Chlorophyllgehalt kann beispielsweise bei einer späteren technischen Verarbeitung von Pflanzen oder Pflanzenteilen erwünscht sein oder bei der Züchtung verschiedener Nutz- oder Zierpflanzen, z. B. Gemüsesorten wie Chicoree.
Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem ein Protein, dadurch gekennzeichnet, daß das Protein die biologische Funktion einer pflanzlichen Mg-Chelatase- Untereinheit CHLD aufweist, vorzugsweise gemäß SEQ ID Nr. 2, oder ein biologisch aktives Fragment daraus.
Gegenstand der Erfindung ist auch die Verwendung eines Proteins mit der biologischen Funktion einer pflanzlichen Mg-Chelatase-Untereinheit CHLD, vorzugsweise gemäß SEQ ID Nr. 2 oder eines biologisch aktiven Fragments daraus, zur Aktivitätsbestimmung einer Mg-Chelatase sowie zur Herstellung von Antikörpern.
Gegenstand der Erfindung sind auch Verfahren zur Herstellung eines Proteins mit der Funktion einer pflanzlichen Mg-Chelatase Untereinheit CHLD in einer rekombinanten Wirtszelle, dadurch gekennzeichnet, daß diese Wirtszelle mit einem erfindungsgemäßen Nukleinsauremolekul kodierend für eine pflanzliche Mg- Chelatase Untereinheit CHLD oder ein aktives Fragment daraus transformiert wird, vorzugsweise eine DNA-Sequenz kodierend für ein Protein mit der Funktion einer Mg-Chelatase oder ein biologisch aktives Fragment daraus in eine für die Wirtszelle geeignete Expressionskassette inseriert wird, die so erhaltene Expressionskassette in geeigneter Weise in einen für die Wirtszelle geeigneten Vektor inseriert wird, eine geeignete Wirtszelle mit dem so erhaltenen Vektor transformiert wird und die so transformierte Wirtszelle in einem geeigneten Medium kultiviert wird und das von besagter Wirtszelle produzierte Protein mit der Funktion einer pflanzlichen Mg-Chelatase Untereinheit CHLD in geeigneter Weise aus dem Kulturmedium oder der Wirtszelle isoliert wird.
Außerdem ist noch ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Proteins mit der Funktion einer pflanzlichen Mg-Chelatase oder einem biologisch aktivem Fragment daraus in einer rekombinanten Wirtszelle, dadurch gekennzeichnet, daß diese Wirtszelle mit einem erfindungsgemäßen Nukleinsauremolekul kodierend für eine pflanzliche Mg-Chelatase oder ein aktives Fragment daraus transformiert wird, vorzugsweise eine DNA-Sequenz kodierend für ein Protein mit der Funktion einer Mg-Chelatase in eine für die Wirtszelle, geeignete Expressionskassette inseriert wird; die so erhaltene Expressionskassette in geeigneter Weise in einen für die Wirtszelle geeigneten Vektor inseriert wird, eine geeignete Wirtszelle mit dem so erhaltenen Vektor transformiert wird; und die so transformierte Wirtszelle in einem geeigneten Medium kultiviert wird und das von besagter Wirtszelle produzierte Protein mit der Funktion einer pflanzlichen Mg- Chelatase in geeigneter Weise aus dem Kulturmedium oder der Wirtszelle isoliert wird.
Die vorliegende Erfindung betrifft insofern die Herstellung der pflanzlichen Mg- Chelatase Untereinheit CHLD sowie der pflanzlichen Mg-Chelatase auf gentechnischem Wege. Z. B. können zur Herstellung der erfindungsgemäßen Proteine in einem Wirtsorganismus die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen in eine Expressionskassette kloniert werden, welche zur heterologen Expression des Strukturgens in dem ausgewählten Wirtsorganismus geeignet ist.
Hierfür sind beispielsweise folgende CHLD-kodierenden DNA-Sequenzen geeignet: pflanzliche chlD-cDNA, mit gängigen Methoden in ihrer Sequenz veränderte pflanzliche chlD-cDNA-Moleküle, aber auch synthetische DNA-Sequenzen, abgeleitet aus pflanzlicher chlD-cDNA oder pflanzlichem CHLD-Protein oder deren Fragmente, die die Expression einer biologisch aktiven Mg-Chelatase CHLD ermöglichen. Die Einführung spezifischer regulatorischer Sequenzen in die Expressionskassette kann außerdem erwünscht sein, beispielsweise von Promotoren, Operatorsequenzen, Enhancern, Terminatoren, Signalsequenzen, 5'- und 3'-untranslatierte Sequenzen oder Sequenzen kodierend für geeignete Fusionsproteine. Die Verwendung regulatorischer Sequenzen ist allgemein übliche Technik, die je nach Expressionsstategie breit variieren kann. Die resultierende chlD-Expressionskassette, versehen mit den notwendigen regulatorischen Elementen im passenden Leserahmen des chlD-Strukturgens, kann in einen Expressionsvektor, mit welchem der ausgewählte Wirtsorganismus transformiert werden kann, inseriert werden. Geeignete Expressionsstrategien zur Herstellung rekombinanter Proteine und entsprechende Expressionsvektoren sind allgemein bekannt für Wirtsorganismen wie beispielsweise Escherichia coli, Insekten- und Pflanzenzellen.
Der Begriff "Vektor" bezeichnet im allgemeinen ein geeignetes, dem Fachmann bekanntes Vehikel, das den gezielten Transfer eines ein- oder doppelsträngigen Nukieinsäuremoleküls in eine Wirtszelle ermöglicht, beispielsweise einen DNA- oder RNA-Virus, ein Virusfragment, ein Plasmidkonstrukt, das in An- oder Abwesenheit von regulatorischen Elementen zum Nukleinsäure-Transfer in Zellen geeignet sein kann, Metallpartikel wie sie z.B. beim "particle gun"-Verfahren eingesetzt werden können, er kann aber auch ein Nukleinsauremolekul umfassen, das durch chemische oder physikalische Verfahren direkt in eine Zelle gebracht werden kann.
Der durch stabile oder transiente Transformation mit z.B. einer chlD- Expressionskasette erhaltene rekombinante Organismus kann zur Gewinnung von rekombinanter Mg-Chelatase, vorzugsweise CHLD-Protein, oder von Zellfraktionen, enthaltend CHLD dienen. Der rekombinante Organismus kann jedoch auch direkt der Bestandteil eines analytischen Testsystems sein.
Das chl D-Strukturgen kann auch zusammen mit den Strukturgenen kodierend für die beiden anderen bekannten Untereinheiten der Mg-Chelatase, CHLH und CHLI, mit Hilfe gängiger molekulargenetischer Verfahren in einen Wirtsorganismus eingebracht werden, so daß es dort zur Expression einer funktionsfähigen Mg- Chelatase kommt.
Ein bevorzugtes Expressionssystem ist z. B. die Verwendung von Bäckerhefe (Saccharomyces cerevisiae) als Wirtsorganismus. Als Vektoren können alle bekannten Hefe-Vektoren dienen, die über die geeigneten Expressionssignale, wie Promotoren, und geeignete Selektionsmarker, wie Resistenzgene oder Gene, die eine Auxotrophie komplementieren, verfügen.
Die Verwendung der pflanzlichen Mg-Chelatase basiert im wesentlichen auf ihrer Aktivität als heterooligomerer Enzymkomplex, die unmittelbar an die Anwesenheit der Untereinheit CHLD gebunden ist. Die Bereitstellung funktionell intakter, pflanzlicher Mg-Chelatase ermöglicht sowohl in vitro (z.B. zellfreies Testsystem der Mg-Chelatase) als auch in vivo die Durchführung von biochemischen Reaktionen, beispielsweise in ein- oder mehrzelligen rekombinanten Organsimen oder Zellkulturen, insbesondere Hefen, Bakterien, Algen, Insektenzellen oder Pflanzen, und ist insofern nicht auf phototrophe Organismen beschränkt.
Diese Reaktionen können einerseits zur Herstellung von Mg-Tetrapyrrolen genutzt werden, andererseits können diese biochemischen Reaktionen dazu verwendet werden, um in einem Testsystem die Wirkung von chemischen Verbindungen, aber auch von heterogenen Stoffgemischen, in bezug auf die Funktion der Mg-Chelatase zu bestimmen.
Die vorliegende Erfindung betrifft daher auch noch ein Verfahren zur Bestimmung der Wechselwirkung pflanzlicher Mg-Chelatase Untereinheiten, dadurch gekennzeichnet, daß eine Wirtszelle mit einer DNA-Sequenz, kodierend für ein Protein mit Funktion einer CHLD-Untereinheit oder einem biologisch aktiven Fragment daraus, sowie mindestens mit einer DNA-Sequenz, kodierend für eine weitere Untereinheit der Mg-Chelatase, in einer Weise transformiert wird, daß die Interaktion der Mg-Chelatase-Genprodukte zu einem direkt oder indirekt, qualitativ oder quantitativ meßbaren Signal führt, vorzugsweise durch die Aktivierung eines Markergens.
Das Verfahren ist geeignet, spezifische Inhibitoren oder Aktivatoren der pflanzlichen Mg-Chelatase aufzufinden, so daß u.a. Stoffe identifiziert werden können, welche eine potentielle herbizide, wachstumshemmende oder -fördernde oder phytosanitäre Wirkung besitzen.
Das Prinzip dieser zellulären (in vivo) Testsysteme beruht darauf, daß ein rekombinanter Organismus, der mit Strukturgenen der pflanzlichen Mg-Chelatase CHLD transformiert worden ist, sowie eine oder beide weiteren Untereinheiten der pflanzlichen Mg-Chelatase funktionell exprimiert, eine essentielle Funktion einer oder mehrerer Untereinheiten in der Weise anzeigt, daß damit Stoffe gefunden werden können, welche diese Funktion beeinflussen.
Eine Funktion der Mg-Chelatase-Untereinheiten besteht darin, miteinander in Wechselwirkung zu treten. Diese Wechselwirkung führt zur Bildung eines Enzymkomplexes und stellt eine Voraussetzung für die Funktion der Mg-Chelatase als Enzym dar.
Die vorliegende Erfindung betrifft daher ein Testsystem, mit dem die Interaktion der Mg-Chelatase-Untereinheit CHLD mit einer oder zwei weiteren Untereinheiten des Enzyms in vivo nachgewiesen und quantitativ bestimmt werden kann.
Die Interaktion der Untereinheit CHLD mit der Untereinheit CHLI kann beispielsweise dadurch gemessen werden, daß beide Untereinheiten so mit zwei weiteren Polypeptiden oder Proteinen verbunden werden, daß in der Zelle durch die Interaktion der Untereinheiten direkt oder indirekt eine qualitativ und/oder quantitativ detektierbare Reaktion verursacht wird. Hierfür geeignete Polypeptide sind z.B. Domänen oder Untereinheiten von regulatorischen Proteinen, beispielsweise aus der zellulären Signaltransduktion oder aus Transkriptionsvorgängen, deren Funktion über eine Protein-Protein- Wechselwirkung vermittelt wird.
Beispielsweise sind regulatorische Proteine der DNA-Transkription geeignet, bei denen die Protein-Protein-Wechselwirkung von zwei oder mehreren Untereinheiten mit Hilfe eines Reportergens nachgewiesen werden kann, so daß das Genprodukt des Reportergens nur dann gebildet wird, wenn zwei oder mehrere der o.g. Untereinheiten miteinander in Wechselwirkung treten.
Um ein solches Testsystem herzustellen, kann z.B. eine der beiden zu testenden Mg-Chelatase-Untereinheiten mit der DNA-Bindedomäne, die andere Mg- Chelatase-Untereinheit mit der transkriptionsaktivierenden Domäne des regulatorischen Proteins fusioniert werden. Dabei ist unerheblich, welches der beiden Proteine mit welcher der beiden Domänen verbunden wird. So kann CHLD mit der DNA-Bindedomäne und CHLI mit der transkriptionsaktivierenden Domäne verbunden werden. Diese Bindung kann über die Wechselwirkung eines weiteren Hilfsfaktors vermittelt werden, beispielsweise eine Protein-Protein-Wechselwirkung oder auch eine Protein-Ligand-Wechselwirkung, wie z. B. Streptavidin-Biotin. Bevorzugt wird jedoch eine kovalente Bindung, welche beispielweise durch Fusion von kodierenden Regionen betreffender Gene erfolgt.
Ein Beispiel für einen solches regulatorisches Protein ist das Genprodukt des GAL4-Gens aus Saccharomyces cerevisiae.
Ein Wirtsorganismus, in dessen Genom bereits ein Indikatorgen mit dem entsprechenden Promotor integriert wurde, wird mit den beschriebenen Fusionsgenen der Mg-Chelatase-Untereinheiten transformiert. Ein solcher Wirtsorganismus zeichnet sich dadurch aus, daß er alle Funktionen des verwendeten Transkriptionssystems exprimiert, ausgenommen dasjenige regulatorische Protein, welches als rekombinantes Protein exprimiert werden soll. Wird als Wirtsorganismus ein Mikroorganismus verwendet, so kann anschließend der rekombinante Organismus mit gängigen mikrobiologischen Methoden isoliert und beliebig vermehrt werden und steht damit in unbegrenztem Ausmaß für den Einsatz in dem Testsystem zur Verfügung. Bevorzugte Verwendung als Wirtsorganismus finden daher leicht transformier- und kultivierbare Mikroorganismen, wie beispielsweise Hefearten oder E. coli .
Des weiteren wird ein für das Transkriptionssystem geeigneter Promotor mit einem Strukturgen verbunden, welches für ein Indikatorprotein kodiert. Dieses rekombinante Gen zeichnet sich dadurch aus, daß die Aktivierung des Promotors mittelbar oder unmittelbar zur Expression des Indikatorproteins führt. Ein solches Indikatorprotein zeichnet sich dadurch aus, daß es in dem rekombinanten Organismus zu einer leicht detektierbaren Veränderung führt, indem es beispielsweise eine Farbstoff bildung oder eine Chemoluminiszenzreaktion katalysiert, selbst farbig ist oder fluoresziert, oder zum Wachstum des Mikroorganismus beiträgt.
Die Verwendung des dargestellten Systems der Trankriptionsaktivierung eines Indikatorgens hat gegenüber dem weiter unten beschriebenen Wachstumstest einer mit einer Mg-Chelatase-Untereinheit komplementierten Mutante den Vorteil, daß mit ersterem ein spezifischeres Signal auf einen Inhibitor des Enzyms bzw. einer Enzymfunktion möglich ist, während bei letzterem Test erst Inhibitoren des Zellwachstums mit anderem Angriffspunkt als der Mg-Chelatase durch Kontrollexperimente ausgeschlossen werden müssen. Die vorliegende Erfindung bevorzugt daher gegenüber dem Wachstumstest die Verwendung eines Indikatorgensystems.
Als Beispiel für einen solches System, das die oben genannten Wechselwirkungen mit Hilfe regulatorischer Proteine des Transkriptionssystems verwirklicht, sei insbesondere das Matchmaker™ two-hybrid-system der Firma Clontech, Palo Alto, California, USA, Katalog-Nr. #K 1605-1 aus dem Jahr 1995/96, genannt, das hiermit per Referenz in den Offenbarungsgehalt der Beschreibung integriert sein soll.
Hierfür werden Piasmide hergestellt, welche die Expression von CHL D, H und I als Fusionsproteine mit der GAL4-Bindedomäne und der GAL4-Aktivierungsdomäne in Hefezellen bewirken. Zur Konstruktion der Expressionsplasmide werden die DNA- Abschnitte, welche für die drei Untereinheiten der Mg-Chelatase kodieren, mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR) amplifiziert.
Zur Amplifizierung werden als Templates die Plasmide verwendet, welche die cDNA der jeweiligen Gene enthalten. Als PCR-Primer werden synthetische Oligonukleotide eingesetzt, die sich dadurch auszeichnen, daß der sense-Primer Homologie zum 5'-Ende, der antisense-Primer Homologie zum 3'-Ende des jeweiligen Gens aufweist. Die Primer können ferner mit Restriktionsschnittstellen versehen sein, die eine Klonierung in Vektorplasmide erleichtern.
Als Vektoren werden bevorzugt die Shuttle-Plasmide des MATCHMAKER™ Zwei- Hybrid-Systems (Clontech) verwendet: pGBT9 und pAS2 enhalten jeweils ein Gen, das für die GAL4-Aktivierungsdomäne kodiert. pGAD424 und pACT2 enhalten jeweils ein Gen, das für die GAL4-DNA-Bindedomäne kodiert. pGBT9 und pGAD424, beziehungsweise pAS2 und pACT2, werden jeweils zusammen in einem System eingesetzt. pGBT9 und pGAD424 unterscheiden sich von pAS2 und pACT2 dadurch, daß bei ersteren die genannten Gene schwächer exprimiert werden als bei letzteren.
Die für die Mg-Chelatase kodierenden Untereinheiten werden jeweils einzeln in die Vektoren kloniert. Rekombinante Plasmide werden durch Transformation in E. coli eingebracht, vermehrt und isoliert. Auf diese Art werden alle 12 möglichen Kombinationen aller drei Untereinheiten mit allen vier Vektoren hergestellt. Die rekombinanten Plasmide werden wie folgt bezeichnet: Gen CHL D in Vektor pAS2 wird bezeichnet als pCBS1148. Gen CHL D in Vektor pACT2 wird bezeichnet als pCBS1149. Gen CHL D in Vektor pGBT9 wird bezeichnet als pCBS1150. Gen CHL D in Vektor pGAD424 wird bezeichnet als pCBS1151. Gen CHL H in Vektor pAS2 wird bezeichnet als pCBS1152. Gen CHL H in Vektor pACT2 wird bezeichnet als pCBS1153. Gen CHL H in Vektor pGBT9 wird bezeichnet als pCBS1154. Gen CHL H in Vektor pGAD424 wird bezeichnet als pCBS1155. Gen CHL I in Vektor pAS2 wird bezeichnet als pCBS1156. Gen CHL I in Vektor ρACT2 wird bezeichnet als pCBS1157. Gen CHL I in Vektor pGBT9 wird bezeichnet als pCBS1158. Gen CHL I in Vektor pGAD424 wird bezeichnet als pCBS1159.
Anschließend wird ein Reporter-Hefestamm des Zweihybrid-Systems mit jeweils zwei Plasmiden transformiert. Als Reporter-Hefestamm wird bevorzugt ein Stamm verwendet, welcher als Indikatorprotein eine durch GAL4 induzierbare beta- Galaktosidase exprimiert, bevorzugt der Stamm SFY526 von Clontech. Die zwei Plasmide werden so gewählt, daß jeweils eines eine Untereinheit in Fusion mit der DNA-Bindedomäne, das andere eine Untereinheit in Fusion mit der Aktivierungsdomäne kodiert. Die Hefe-Transformation wird z.B. nach der Methode von Klebe et al., 1983, Gene, 25, 333-341 durchgeführt. Zur Bestimmung der Induktion des Indikatorgens wird eine mit beiden Plasmiden transformierte Hefe auf Festmedium angezogen und die Aktivität der beta-Galaktosidase wird nach Blotten auf Filter nach der Methode von Breedon und Nasmyth (Breedon, L. and Nasmyth, K. (1985) Regulation of the yeast HO gene. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50, 643-650) bestimmt.
Alternativ wird die transformierte Hefe in Flüssigmedium angezogen und die Aktivität der beta-Galaktosidase wird nach Zellaufschluß in Hefe-Rohextrakt nach der Methode von Munder und Fürst (Munder, T. and Fürst, P. (1992). Mol. Cell. Biol. 12, 2091-2099) bestimmt. Zum Testen von Stoffen wird der rekombinante Organismus zunächst in einem geeigneten Medium angezogen. Anschließend werden die rekombinanten Zellen zusammen mit dem zu testenden Stoff inkubiert. Die Inkubationsbedingungen werden so gewählt, daß während der Inkubationszeit ohne Zusatz zu testender Stoffe eine deutlich meßbare Induktion des Indikatorgens stattfindet. Dies kann z. B. dadurch geschehen, daß sich die Inkubationszeit über einen Teil der Wachstumsphase erstreckt.
Alternativ kann die Induktion auch dadurch geschehen, daß die an der Transkriptionsaktivierung beteiligten Proteine mit Hilfe eines induzierbaren Promotors exprimiert werden. Die Induktion des Indikatorgens kann mit gängigen Detektionsreaktionen nachgewiesen werden. Wenn das Indikatortergen in dem Testsytem aktiviert wird, wird als Folge der Genaktivierung eine größere Menge des Reporterproteins in den Wirtszellen gebildet, als ohne Aktivierung des Indikatorgens. Bevorzugt wird das Testsystem so ausgewählt, daß das Reporterprotein mindestens doppelt so stark produziert wird. Besonders bevorzugt wird eine mindestens zehnfache Steigerung der Produktion des Reporterproteins erzielt. Sofern es sich bei dem Reporterprotein um ein Enzym handelt, kann die Enzymaktivität mittels gängiger Meßmethoden, beispielsweise colorimetrisch, fluorimetrisch oder luminometrisch, bestimmt werden. Dazu können die ganzen Zellen oder daraus gefertigte Extrakte verschiedenen Reinheitsgrades mit einem geeigneten farbbildenden Enzymsubstrat inkubiert werden. Die Inkubation mit Substrat kann bereits während der Inkubation mit dem zu testenden Stoff oder auch danach erfolgen.
Wenn eine chemische Verbindung diese Interaktion zwischen den Untereiheiten stört, indem sie z. B. an einer "Interfaceregion" einer Untereinheit bindet, hemmt diese Verbindung den Prozeß der Oligomerisierung. Somit kann diese Verbindung die Menge an enzymatisch aktiver Mg-Chelatase in einem Organismus vermindern und somit auch potentielle herbizide Wirkung besitzen. Über dieses Test-System können auf diese Weise auch herbizide Verbindungen gefunden werden, welche die Bildung des aktiven Mg-Chelatase Enzymkomplexes hemmen.
Um eine spezifische Interaktion eines Stoffes mit einem Protein der Mg-Chelatase nachzuweisen, muß der Stoff folgende Bedingungen erfüllen:
1. In rekombinanten Zellen muss nach Zusatz des Stoffes eine signifikant geringere Induktion des Indikatorgens stattfinden als in Zellen ohne Zusatz des Stoffes.
2. In einem analogen Transkriptionssystem (Kontrollsystem), bei dem die Wechselwirkung der Mg-Chelatase-Untereinheiten durch eine andere Wechselwirkung ersetzt wurde, darf nach Zusatz des Stoffes nur eine deutlich geringere oder keine meßbare Hemmung der Indikatorreaktion auftreten. Als andere Wechselwirkung kann jede Art der Bindung dienen, beispielsweise auch kovalente Verknüpfung von Proteinen.
Erfüllt ein Stoff die genannten Bedingungen, so kann er in weiteren Testsystemen auf seine Wirkung untersucht werden, beispielsweise in enzymatischen Tests mit der Mg-Chelatase, in Pflanzenzellkulturen oder in herbologischen Tests an ganzen Pflanzen.
Ein Mg-Chelatase-Gen kann außerdem in eine bestimmte Mutante eines solchen Organismus eingebracht werden, die ohne die Funktion der entsprechenden Mg- Chelatase nicht wachstumsfähig ist, wie z. B. ein photoautotropher Mikroorganismus, bei dem eine oder mehrere Untereinheiten der Mg-Chelatase ihre Funktion durch eine Mutation verloren haben. Die Verwendung einer solchen Mutante hat den besonderen Vorteil, daß dadurch das Wachstum des rekombinanten Organismus in einem geeignetem Medium als Maß für die Funktion der Mg-Chelatase gelten kann und somit den Einfluß von zu untersuchenden Stoffen auf die Mg-Chelatase quantitativ beschreiben kann. Der Wachstumstest zeichnet sich durch eine besonders einfache Handhabung und den schnellen Durchsatz von Stoffen aus. Dazu kann das pflanzliche chlD-Gen in eine Mutante eines Organismus gebracht werden, die dadurch gekennzeichnet ist, daß sie ohne die Funktion der Mg- Chelatase, bevorzugt ohne die Funktion des CHLD-Proteins, unter bestimmten Kulturbedingungen nicht wachstumsfähig ist oder einen veränderten Phänotyp aufweist. Eine solche Mutante kann beispielsweise hergestellt werden, indem bei einem Mikroorganismus, der zum phototrophen Wachstum die Aktivität einer Mg- Chelatase benötigt, zunächst die Strukturgene für seine eigene Mg-Chelatase derart verändert werden, daß kein oder keine ausreichenden Mengen funktionsfähiges Enzym mit Mg-Chelataseaktivität mehr gebildet werden, so daß der resultierende Organismus nicht mehr phototroph wachsen kann. In dieser Mutante werden des weiteren die pflanzlichen Strukturgene chll und chlH zur Expresion gebracht. Durch zusätzliche Expression des pflanzlichen chlD-Strukturgens kann dann in dem gentechnisch veränderten Organismus eine funktionelle pflanzliche Mg-Chelatase gebildet werden, die diesem Organismus die Fähigkeit zu phototrophem Wachstum wieder verleiht. Das Wachstum eines solchen rekombinanten Organismus stellt dann direkt ein Maß für die Aktivität der pflanzlichen Mg-Chelatase dar. Durch einen Wachstumstest kann mit diesem rekombinanten Organismus bestimmt werden, ob die pflanzliche Mg-Chelatase durch eine chemische Verbindung, welche dem Kulturmedium zugesetzt wird, inhibiert wird. Dazu wird der gentechnisch veränderte Organismus in Kulturmedien mit und ohne die zu untersuchende Verbindung unter phototrophen Kulturbedingungen angezogen. Die zu untersuchende chemische Verbindung wird dabei bevorzugt in Konzentrationen zwischen
10'9 M und 10"3 M, und besonders bevorzugt in Konzentrationen zwischen 10-7 M und 10-4 M eingesetzt.
Um eine spezifische Inhibition der Mg-Chelatase durch eine zu untersuchende chemische Verbindung nachzuweisen und andere Wirkungsweisen als Ursache für eine Wachstumshemmung auszuschließen, muß die Verbindung folgende Kriterien erfüllen: 1. Die gentechnisch veränderten Organismen müssen in Gegenwart der Verbindung signifikant schlechter wachsen als in Kulturmedium ohne die Verbindung. 2. Die Verbindung darf das Wachstum der gleichen Organismen unter heterotrophen Bedingungen nicht signifikant vermindern.
In gleicher Weise wie das Wachstum, kann auch ein veränderter Phänotyp eines entsprechend veränderten Organismus als Indikator für die katalytische Aktivität der pflanzlichen Mg-Chelatase genutzt werden. Verschiedene Pigmente phototropher Mikroorganismen werden ausgehend von dem Reaktionsprodukt der Mg-Chelatase, Mg-Protoporphyrin, gebildet. Ein wie oben beschrieben konstruierter rekombinanter Mikroorganismus, der anstelle seiner eigenen Mg-Chelatase eine rekombinante pflanzliche Mg-Chelatase, enthaltend das rekombinante CHLD-Protein, besitzt, kann nur dann seine von Mg-Protoporphyrin abgeleiteten Pigmente bilden, wenn die pflanzliche Mg-Chelatase eine ausreichende Aktivität aufweist. Die Pigmentierung eines solchen rekombinanten Organismus stellt dann direkt ein Maß für die Aktivität der pflanzlichen Mg-Chelatase dar. Durch Analyse der Pigmentzusammensetzung kann mit diesem rekombinanten Organismus bestimmt werden, ob die pflanzliche Mg-Chelatase durch eine chemische Verbindung, welche dem Kulturmedium zugesetzt wird, inhibiert wird. Dazu wird der gentechnisch veränderte Organismus in Kulturmedien mit und ohne der zu untersuchenden Verbindung unter solchen Kulturbedingungen angezogen, unter denen aus Mg-Protoporphyrin synthetisierte Pigmente gebildet werden. Die zu untersuchende chemische Verbindung wird dabei bevorzugt in Konzentrationen zwischen 10"9 M und 10"3 M, und besonders bevorzugt in Konzentrationen zwischen 10"7 M und 10"4 M eingesetzt. Um eine spezifische Inhibition der Mg-Chelatase durch eine zu untersuchende chemische Verbindung nachzuweisen und andere Wirkungsweisen als Ursache für eine Veränderung in der Pigmentierung auszuschließen, muß die Verbindung folgende Kriterien erfüllen:
1. Die gentechnisch veränderten Organismen weisen in Gegenwart der Verbindung signifikant geringere Mengen an Pigmenten, die ausgehend von Mg-Protoporphyrin gebildet werden, oder eine veränderte Zusammensetzung an Pigmenten auf, als in Kulturmedium ohne die Verbindung.
2. Die Verbindung darf die Pigmentbildung des nicht gentechnisch veränderten Ausgangsorganismus unter den gleichen Kulturbedingungen nicht signifikant verändern.
Wenn beide Kriterien erfüllt sind, ist davon auszugehen, daß die untersuchte Verbindung ein spezifischer Inhibitor der pflanzlichen Mg-Chelatase ist. Wenn nur Bedingung 1 erfüllt ist, nicht aber Bedingung 2, kann mit Hilfe einer enzymatischen Reaktion der Mg-Chelatase festgestellt werden, ob die untersuchte Verbindung ein spezifischer Inhibitor der pflanzlichen Mg-Chelatase ist.
Erfüllt ein Stoff die obengenannten Bedingungen, so kann er mit oder ohne weitere biochemische Untersuchungen direkt an ganzen Pflanzen oder geeigneten Pflanzenteilen auf seine Wirkung in der Pflanze untersucht werden. Dazu können die gängigen herbologischen und physiologischen Verfahren angewandt werden. Für verschiedene Anwendungen wie z. B. die Herstellung eines biochemischen Testsystems zur Bestimmung einer Proteinfunktion ist eine wesentliche Voraussetzung, daß das zu untersuchende Protein in funktionsfähigem Zustand und möglichst rein, d. h. frei von störenden Aktivitäten, gewonnen werden kann. Wie bei allen Zellproteinen kann dies im Falle einer pflanzlichen Mg-Chelatase dadurch geschehen, daß die einzelnen Untereinheiten mit Hilfe gängiger Verfahren der Proteinreinigung aus pflanzlichem Gewebe isoliert werden. In der vorliegenden Erfindung ist dargelegt, daß eine funktionelle pflanzliche Mg-Chelatase neben den Untereinheiten CHLH und CHLI auch die Untereinheit CHLD enthält, deren Sequenz beispielhaft für Nicotiana tabacum in SEQ ID Nr. 2 angegeben ist. Generell ist die Isolierung eines heterooligomeren Proteins, dessen Aktivität zudem wie bei der Mg-Chelatase auch an eine Membranfraktion der pflanzlichen Zelle gebunden ist, wesentlich schwieriger als die eines löslichen oder homooligomeren beziehungsweise monomeren Enzyms, da das Protein im Verlauf der Reinigung seine enzymatische Aktivität verliert, die anschließend nur mit aufwendigen Methoden wiederhergestellt werden kann. Hinzu kommt, daß die Enzyme der Chlorophyllbiosynthese abhängig von der Art der Differenzierung und vom Entwicklungszustand der Zelle gebildet werden. Des weiteren stellen diese Proteine, wie auch die Mg-Chelatase, nur einen geringen Anteil am Gesamtprotein der Zelle dar, so daß bei einer Isolierung aus pflanzlichem Gewebe ausgesprochen hohe Anreicherungsfaktoren erreicht werden müßten.
Aufgrund der beschriebenen Schwierigkeiten wird gemäß der vorliegenden Erfindung die Verwendung der für die Mg-Chelatase kodierenden Nukleinsäuremoleküle zur Herstellung der rekombinanten pflanzlichen Mg- Chelatase bevorzugt, besonders bevorzugt des rekombinanten Mg-Chelatase Komplexes bestehend aus den Proteinen CHLD, CHLH und CHLI. Ganz besonders bevorzugt genannt sei das rekombinante pflanzliche CHLD-Protein.
Gentechnisch produzierte pflanzliche Mg-Chelatase, vorzugsweise gentechnisch hergestelltes CHLD-Protein, kann mittels einer Vielzahl von Standard-Methoden gereinigt werden. Die Eignung einer Methode hängt jeweils vom verwendeten Wirtsorganismus, der Expressionsstategie und anderen Faktoren ab, die einem in der Expression und Reinigung rekombinanter Proteine erfahrenen Fachmann bekannt sind. Zum Zweck der Reinigung kann das rekombinante Protein auch durch entsprechende Veränderung seiner Gen-Sequenz in der Expressionskassette mit weiteren Peptidsequenzen fusioniert werden. Bevorzugt sind als Fusionspartner Peptide oder Proteine zu verwenden, die als C- oder N-terminale Fusionen dem rekombinanten Mg-Chelatase Untereinheiten eine Affinität zu bestimmten Säulenmaterialien verleihen oder eine bestimmte Lokalisierung des Expressionsprodukts innerhalb oder außerhalb der Zelle ermöglichen, wie z.B. durch Transit- oder Signalpeptide oder -Sequenzen. Solche Fusionen dürfen die Funktion der Mg-Chelatase nicht beeinflussen oder müssen z. B. durch Einbau geeigneter Proteaseschnittstellen abspaltbar sein. Als Beispiele für Fusionspartner seien Oiigohistidin-Tails, das Strep-Tag™ , die Glutathion-S-Transferase (GST) oder das Maltose-Bindende Protein (MalE) genannt, ohne daß diese Anwendung auf die beispielhaft angegebenen Fusionspartner oder deren Fragmente beschränkt ist. Für die Reinigung eines aktiven Mg-Chelatase Komplexes kann es auch ausreichend sein, wenn lediglich eine der im Komplex vorhandenen Untereinheiten mit einem derartigen Peptid oder Protein fusioniert ist. Des weiteren können ausgehend von bereits geringen Mengen rekombinant hergestellter Mg-Chelatase, bevorzugt des CHLD-Proteins, auch spezifische Antikörper hergestellt werden, mit deren Hilfe Mg-Chelatase oder Mg-Chelatase-Untereinheiten aus rekombinanten Organismen oder auch aus Pflanzen isoliert werden können.
Die gentechnische Herstellung der Mg-Chelatase, vorzugsweise des CHLD- Proteins, und deren Reinigung ermöglichen erstmalig, ein pflanzliches Enzym mit Mg-Chelatase-Aktivität in verschiedenen Reinheitsgraden bis hin zum reinen Mg- Chelatase-Komplex, bestehend aus den Untereinheite CHLD, CHLH und CHLI, oder auch das reine CHLD-Protein zu erhalten. Eine Anwendungsmöglichkeit für isolierte oder angereicherte Mg-Chelatase besteht z.B. in deren Verwendung in biochemischen Testsystemen zur Bestimmung der Enzymfunktion.
Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren zur Bestimmung der Aktivität pflanzlicher Mg-Chelatase, wobei ein Protein mit der Funktion einer CHLD mit den Genprodukten der DNA-Sequenzen kodierend für die Mg-Chelatase- Untereinheiten I und H in einer Weise zusammen gebracht wird, daß die enzymatische Aktivität der Mg-Chelatase-Genprodukte zu einem direkt oder indirekt, qualitativ oder quantitativ meßbaren Signal führt.
Der inhibitorische Effekt einer chemischen Verbindung auf die Mg-Chelatase kann durch eine Reduktion der typischen Katalyseaktivität des Enzyms oder der kompletten Inaktivierung der Mg-Chelatase in Gegenwart dieser Verbindung gemessen werden. Dazu wird die pflanzliche Mg-Chelatase, bestehend aus den Untereinheiten CHLD, CHLH und CHLI, in einem geeigneten Reaktionspuffer mit ihren Substraten Protoporphyrin, ATP und Mg2+ inkubiert. Als bevorzugte Reaktionsbedingungen seien ein Reaktionspuffer mit einem pH- Wert zwischen pH 4 und pH 11 , vorzugsweise 5-10, insbesondere 6-9, und Reaktionstemperaturen zwischen 2 und 50°C, vorzugsweise 10-40°C genannt.
Die Quantifizierung der Enzyminhibition kann durch einen einfachen Vergleich der katalytischen Aktivität der Mg-Chelatase in Abwesenheit und in Anwesenheit der zu untersuchenden chemischen Verbindung geschehen.
Zur Bestimmung der Aktivität der Mg-Chelatase können verschiedene biochemische Meß-Methoden eingesetzt werden, durch die entweder die Entstehung der Reaktionsprodukte der von der Mg-Chelatase katalysierten Reaktion, z.B. Mg- Protoporphyrin, ADP oder Phosphat, gemessen wird oder aber die Abnahme der Konzentration der Enzymsubstrate der Mg-Chelatase, z.B. Protoporphyrin, ATP oder Mg2+, gemessen wird. Dem in der Durchführung von Enzymtests erfahrenen Fachmann stehen viele Standardmethoden zur Bestimmung der Aktivität von Mg- Chelatase zur Verfügung. Bevorzugt genannt seien die Methoden zur Messung des Umsatzes von Protoporphyrin zu Mg-Protoporphyrin im Reaktionsansatz durch Messung der unterschiedlichen Fluoreszenseigenschaften von Mg-Protoporphyrin und Protoporphyrin (z. B. Walker et al., Plant Physiol. Biochem. 30:263-269 (1992)) oder durch photometrische Analyse der aus der Umsetzung von Protoporpyrin zu Mg-Protoporphyrin resultierenden Absorptionsänderung (z. B. Gorchein, Biochem. J. 299:869-874 (1991 )) oder durch Quantifizierung von Protoporphyrin oder Mg- Protoporphyrin durch HPLC-Analyse. Als weitere bevorzugte Meßmethode sei die Bestimmung der ATPase-Aktivität der Mg-Chelatase genannt, wobei beispielsweise die Entstehung von Phosphat durch einen Phosphatnachweis, z. B. nach den Methoden basierend auf dem System beschrieben von Fiske et al., J. Biol. Chem 66:375-400 (1925), nachgewiesen werden kann. Darüber hinaus kann durch Variation der Konzentrationen des Substrates und des inhibierenden Stoffes mit gängigen biochemischen Verfahren der Hemm-Typ einer chemischen Verbindung an der pflanzlichen Mg-Chelatase bestimmt werden. Anstelle von gereinigter Mg-Chelatase können auch ganze Zellen des rekombinanten Organismus, welcher die drei Untereinheiten CHLD, CHLH und CHLI der Mg-Chelatase rekombinant exprimiert, oder proteinhaltige Extrakte aus diesem Organismus oder verschieden stark angereicherte Mg-Chelatase-haltige Fraktionen aus diesem Organismus verwendet werden. Als bevorzugter rekombinanter Wirtsorganismus zu diesem Zwecke seien Hefezellen genannt. Alternativ kann auch eine aus Pflanzengewebe oder Pflanzenzellkulturen isolierte funktionsfähige Mg-Chelatase, enthaltend die Untereinheiten CHLD, CHLH und CHLI, verwendet werden.
Wird mit Hilfe der biochemischen oder zellbiologischen Testsysteme festgestellt, daß eine chemische Verbindung in vitro die pflanzliche Mg-Chelatase inhibiert, so kann diese Verbindung direkt an ganzen Pflanzen oder geeigneten Pflanzenteilen bezüglich ihrer Wirkung auf Pflanzen untersucht werden. Dazu stehen dem in der Bewertung von Wirkstoffen an Pflanzen erfahrenen Fachmann eine Vielzahl gängiger herbologischer und physiologischer Verfahren zur Verfügung.
Des weiteren kann die gentechnisch hergestellte Mg-Chelatase, vorzugsweise ein Mg-Chelatase-Komplex mit der gentechnisch hergestellten Untereinheit CHLD oder auch die freie CHLD-Untereinheit, beispielsweise auch verwendet werden, um die Raumstruktur des pflanzlichen Enzyms aufzuklären. Zur Aufklärung der Raumstruktur können allgemein bekannte Verfahren, wie z. B. die Röntgenstrukturanalyse von Proteinkristallen oder NMR-Spektroskopie verwendet werden. Die Strukturinformationen über die Mg-Chelatase, vorzugsweise die CHLD- Untereinheit können beispielsweise verwendet werden, um ein rationales Design von neuen Inhibitoren der Mg-Chelatase - und somit potentiellen Herbiziden - durchzuführen.
Auf die Erfindung der deutschen Patentanmeldung 197 17 656.9, deren Priorität die vorliegende Anmeldung beansprucht, sowie der Zusammenfassung der vorliegenden Anmeldung wird hiermit ausdrücklich Bezug genommen, sie gelten durch Zitat als Bestandteil der Beschreibung.
Die folgenden Beispiele dienen der näheren Erläuterung der Erfindung und stellen in keiner Weise eine Einschränkung dar:
Standard Methoden, wie DNA- und RNA-Isolierung, Sequenzanalyse, Restriktion, Klonierung, Gelelektrophorese, radioaktive Markierung, Southern- und Northem- Blot wurden nach gängigen Verfahren durchgeführt (Sambrook at al., 1989 Molecular Screening: A laboratory manual 2. Aufl. Cold Spring Harbour Laboratory Press, N.Y. USA; Sanger et al., 1977, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74, 5463-5467).
Beispiel 1 : Klonierung einer Tabak-cDNA, die für die CHLD-Untereinheit der Mg- Chelatase kodiert
Zur Identifizierung der chlD-cDNA aus Tabak wurden die Peptidsequenzen VDASGS (SEQ ID Nr. 3), TDGRGN (SEQ ID Nr. 4) und AKGAVM (Seq. ID Nr. 7) ausgewählt, welche den aus dem chlD-Gen von Synechocystis PCC6803 (Jensen et al. (1996) J. Biol. Chem. 271 , 16662-16667) abgeleiteten Proteinsequenzen entsprechen, um folgende Mischung aus DNA-Primersequenzen herzustellen:
1. : GA(CT) GT(ACTG) GA(GA) AA(AG) (TA)C(ACGT) GT(ACGT)
2.: AT (AG)TT (ACGT)CC (ACGT)CG (ACGT)CC (AG)TC (ACGT)G
3.: GC(ACGT) AA (AG) GG (ACGT) GC (ACGT) GT (ACGT) ATG C
Diese Primer wurden in einer Polymerase-Kettenreaktion (PCR) eingesetzt, um die genomische DNA aus Synechocystis PCC 6803 zu amplifizieren: 2 Zyklen mit jeweils 1 min 94°, 2 min 45°C, 3 min 72°C, dann 28 Zyklen jeweils 30 sec 94°C, 90 sec 60°C, 2 min 72°C. Die PCR ergab ein DNA-Fragment von ca. 270 bp, das in den Klonierungsvektor pCRTMII (Invitrogen, San Diego) kloniert und zur weiteren Handhabung durch Restriktionsverdau isoliert wurde.
Mit dem isolierten und 32P[dCTP] markierten ca. 270 bp langen Fragment als Hybridisierungsprobe wurde eine Lambda ZAP ll-cDNA-Bank von Tabak (Nicotiana tabacum SR1 , Stratagene) nach Vorschrift gescreent.
Die nach cDNA-Bank-Screening im Phagemid p Bluescript SK- vorliegende DNA wurde isoliert und sequenziert. Die identifizierte und in SEQ ID Nr. 1 dargestellte chlD-cDNA-Sequenz enthält einen 2274 Nukleotide langen offenen Leserahmen, sowie am 5'- und 3'-Ende nicht translatierte Regionen.
Genomische DNA von Tabak wurde mit radioaktiv markierter DNA des CHLD-Gens hybridisiert. Dazu wurde das CHLD-Gen mit EcoRI und Hindlll aus dem Phagemid p-Bluescript SK- ausgeschnitten. Die resultierenden zwei Fragmente der Größen 2069 bp und 426 bp wurden mit 32P(dCTP) radioaktiv markiert.
Beispiel 2 Herstellung von chlD-antisense Tabakpflanzen
Das gemäß Beispiel 1 in pBluescript SK- erhaltene Tabak-cDNA Fragment für CHLD wurde mit Kpnl und Xbal aus dem Vektor pBluescript SK- herausgeschnitten und in den mit Kpnl und Xbal aufgeschnittenen binären Vektor BinAR (Höfgen und Willmitzer, Plant Science (1990) 66, 22-230) hineinligiert. Zunächst wurde der E. coli Stamm DH 5 α mit dem Konstrukt transformiert, anschließend Agrobacterium tumefaciens Stamm GV 2260. Mit der Blattscheiben Transformationsmethode (Horsch et al., Science 228, 1229-31 ) wurden junge Tabakblattscheiben mit den Agrobakterien inkubiert und das CHLD-antisense Gen in das pflanzliche Genom stabil integriert. Beispiel 3 Herstellung von chlD-sense Tabakpflanzen
Zur Herstellung der chlD-sense Tabakpflanzen wurde die chID cDNA mit Smal and Xbal aus p Bluescript SK- herausgeschnitten und in den BinAR Vektor nach Restriktionverdau hineinkloniert. Für die stabile Integration in das Tabakgenom wurde das in Beispiel 2 beschriebene Verfahren gewählt.
Beispiel 4 Analyse der transgenen Tabakpflanzen
Es wurden 67 Sense-Pflanzen und 56 Antisense-Pflanzen isoliert. Die transgenen Pflanzen mit Antisense- oder Sense-Genen für CHLD zeigten graduell unterschiedliche Chlorophylldefizienzen. Chlorotische Blätter wiesen diverse Variationsmuster auf. Es gab einheitlich entfärbte, gelblich-grüne Blätter, Blätter mit Flecken unterschiedlicher Pigmentierung, mit weißen Arealen entlang der Blattadern und grünen Interkostalfeldern. Mit zunehmenden Alter verloren die Blätter an Chlorophyll. Die Pflanzen mit reduziertem Chlorophyllgehalt zeigten auch einen beeinträchtigten Wuchs (siehe Fig. 1a bis 1d).
Des weiteren wurde die stabile Integration der Sense- oder Antisense-chID Gene in das Genom der Tabakpflanzen durch Southern-Blot Analyse bestätigt und durch Northern-Blot Analyse der mRNA-Gehalt des chID Transkripts bestimmt. In den Antisense-Pflanzen ist der Gehalt im Vergleich zum Wildtyp reduziert. chlD- sense Pflanzen weisen im Vergleich zum Wildtyp nur leicht erhöhte chID mRNA Gehalte auf.
Die Aktivität der Mg-Chelatase wurde für transgene- und Wildtyppflanzen nach Lee et al. (1992, Plant Physiol. 99, 1134-1140) bestimmt. Die Sense- und Antisense-Pflanzen haben stets verringerte Enzymaktivitäten. Das Phänomen der reduzierten Enzymaktivitäten in den vermutlich CHLD- überexprimierten Transformanten kann mit Wirkung der negativen Dominanz erklärt werden. Ein Überangebot der CHLD-Untereinheit sorgt für eine Störung des fein regulierten Zusammenbaus des Mg Chelatase-Enzymkomplexes.
Der Gehalt an Protoporphyrin IX und Chlorophyll wurde in transgenen- und Wildtyppflanzen bestimmt (siehe Tabelle 2). Hervorzuheben ist, daß die Transformanten mit Sense- oder Antisense CHLD mRNA in ihren untersuchten jungen Blättern (3., 5. und 7. Blatt) in der Regel bis zu 3 - 5 fach erhöhte Protoporphyringehalte im Vergleich zu Wildtyppflanzen aufweisen.
Die Chlorophyllgehaltsbestimmung bestätigt den makroskopischen Phänotyp. Der Gehalt war in einzelnen Pflanzen bis zu 25 % reduziert.
Tabelle 2 Relativer Protoprophyrin IX- und Chlorophyllgehalt in Sense- und Antisensepflanzen
Pflanze Blatt Protoporphyrin IX [%] Chlorophyll [%]
SNN 3 100 100
5 100
7 100 100
AS7 3 584 25
5 542
7 157 28
AS9 3 135 50
5 120
7 - 49
AS13 3 160 78
5 102
7 115 78
AS18 3 374 74
5 470
7 295 80
AS21 3 231 95 5 188
7 98 101
S1 3 189 78
5 262
7 297 80
S20 3 423 32
5 293
7 144 25
S22 3 189 117
5 151
7 115 94
S29 3 298 25
5 265
7 137 26
S38 3 257 120
5 127
7 - 107
SNN = Wildtyp
S Sense
AS = Antisense
Beispiel 5: Konstruktion von Plasmiden für die Expression von CHL D, H und I als Fusionsproteine mit der GAL4-Bindedomäne und der GAL4- Aktivierungsdomäne
Zur Konstruktion der Expressionsplasmide wurde die DNA, welche für die drei
Untereinheiten der Mg-Chelatase kodiert, mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR) amplifiziert.
Zur Amplifizierung des chlD-Gens wurden als Template 100 ng des Plasmids pNTCHLD verwendet. Als PCR-Primer wurden folgende beiden Oligonukleotide eingesetzt: 5'-TGA CCC GGG GGT AGT GGA ACC TGA AAA ACA ACC-3' als sense-Primer mit Smal-Restriktionsschnittstelle und als antisense-Primer entweder δ'-GGC GAA TTC TCA AGA TTC CTT TAA TGC AGA TAA-3' mit EcoRI- Restriktionsschnittstelle, oder 5'-GCG GTC GAC TCA AGA TTC CTT TAA TGC AGA -3' mit Sall-Restriktionsschnittstelle.
Zur Amplifizierung des CHLH-Gens wurden als Template 100 ng des Plasmids pNTCHLH verwendet. Als PCR-Primer wurden folgende beiden Oligonukleotide eingesetzt: als sense-Primer 5'-GCT GAT ATC GGC TAT TGG CAA TGG TTT ATT CAC-3' mit EcoRV-Restriktionsschnittstelle und als antisense-Primer 5'-GCG TCG ACA TTT ATC GAT CGA TTC CCT CAA-3' mit Sall-Restriktionsschnittstelle. Zur Amplifizierung des chll-Gens wurden als Template 100 ng des Plasmids pNTCHLI verwendet. Als PCR-Primer wurden folgende beiden Oligonukleotide eingesetzt: als sense-Primer 5'-CAG CCC GGG GGG TCC ACT ACT AGG-3' mit Smal- Restriktionsschnittstelle und als antisense-Primer 5'-CAG GTC GAG GCA CAG TAC AAA GCC-3' mit Sall-Restriktionsschnittstelle.
Als Vektoren wurden die Shuttle-Plasmide des MATCHMAKER™ Zwei-Hybrid- Systems (Clontech) verwendet: pGBT9 und pAS2 enhalten jeweils ein Gen, das für die GAL4-Aktivierungsdomäne kodiert. pGAD424 und pACT2 enhalten jeweils ein Gen, das für die GAL4-DNA-Bindedomäne kodiert. pGBT9 und pGAD424, beziehungsweise pAS2 und pACT2, werden jeweils zusammen in einem System eingesetzt. pGBT9 und pGAD424 unterscheiden sich von pAS2 und pACT2 dadurch, daß bei ersteren die genannten Gene schwächer exprimiert werden als bei letzteren.
Zur Klonierung von chID in Vektor pACT2 wurde das Gen mittels des sense-Primers mit Smal-Schnittstelle und des antisense-Primers mit EcoRI-Schnittstelle amplifiziert und anschließend mit dem mit Smal und EcoRI geschnittenen Vektor ligiert.
Zur Klonierung von chID in jeweils einen der Vektoren pAS2, pGBT9 und pGAD424 wurde das Gen mittels des sense-Primers mit Smal-Schnittstelle und des antisense- Primers mit Sall -Schnittstelle amplifiziert und anschließen d mit dem mit Smal und Sall geschnittenen Vektor ligiert.
Zur Klonierung von jeweils einem der Gene chlH und I in jeweils einen der Vektoren pAS2, pGBT9 und pGAD424 wurde die Gene jeweils mittels des sense- und des antisense-Primers amplifiziert und anschließend mit den jeweils mit Smal und Sall geschnittenen Vektoren ligiert.
Zur Klonierung von jeweils einem der Gene chlH und I in den Vektor pACT2 wurden die Gene mittels des sense- und des antisense-Primers amplifiziert und anschließend mit dem mit Smal und Xhol geschnittenen Vektor ligiert. Die ligierte DNA wurde mittels Transformation in E. coli DH 5a eingebracht und transformierte Klone wurden auf Agar-Medium mit 100 μg Ampicillin/ml selektiert. Aus den rekombinanten Bakterien wurde Plasmid-DNA isoliert und mittels Restriktionsanalyse auf ihre Identität überprüft.
Auf diese Art wurden alle 12 möglichen Kombinationen aller drei Untereinheiten mit allen vier Vektoren hergestellt.
Beispiel 6: Bestimmung der Interaktion zwischen Untereinheiten der Mg- Chelatase mittels des Zwei-Hybrid-Systems in Hefe
ß-Galactosidase-Flüssigassay in Hefe (Munder und Fürst, 1992, Mol. Cell. Biol. 12, 2091-2099) am Beispiel des Stammes SFY526+pAS2-chlD+pACT2-chll
Es wurden kompetente Hefezellen, Stamm SFY 526 ( Harper et al.,1993, Cell, 75, 805-816), nach der Methode von Klebe hergestellt (Klebe et al.,1983, Gene, 25, 333-341 ) und mit den unter Beispiel 2 aufgeführten Plasmiden transformiert. Dabei wurde SFY 526 mit allen Plasmiden einzeln, als auch in allen möglichen Kombinationen transformiert und auf Minimalagar ( 1 ,5% Agar, 10% YNB-Glukose) unter Zusatz von Aminosäuren ( Adenin 20mg/l; L-Histidin-HCI 20mg/l; L-Lysin-HCI 30mg/l; L-Leucin 30mg/l L-Tryptophan 20mg/l) selektiert.
Der zu vermessende Hefestamm SFY526+pAS2-chlD+pACT2-chll wurde in 10ml Minimalmedium (10% YNB-Glukose) unter Zusatz benötigter Aminosäuren ( Adenin 20mg/l; L-Histidin-HCL 20mg/l und L-Lysin-HCL 30mg/l) über Nacht bei 30°C und 180 rpm in einer sterilen 50ml-Steilbrustflasche mit Metallkappe kultiviert. Die optische Dichte (OD600) dieser Übernachtkultur wurde erfaßt (Beckman DU 640 Spectrophotometer), die gemessenen Werte lagen dabei zwischen 1 ,0 und 2,0. 100μl von dieser Kultur wurden auf ß-Galactosidase-Aktivität getestet. Das Probenvolumen betrug insgesamt ca. 1ml:
100 μl Kultur
700 μl Z-Puffer + Mercaptoethanol 50 μl Trichlormethan 50 μl O,1% SDS Parallel wurde ein Leerwert mitgeführt: 700 μl Z-Puffer
50 μl Trichlormethan 50 μl O,1 % SDS
Probe und der mitgeführte Leerwert wurden für jeweils 30 Sekunden gevortext und je 160μl ONPG-Lösung (4mg o-Nitrophenyl ß-D-Galactopyranoside auf 1ml Z-Puffer + Mercaptoethanol) zugegeben. Danach wurden die Proben vorsichtig geschüttelt und bei 30°C im Wasserbad inkubiert. Nach einer Stunde wurde die Reaktion durch Zugabe von 400μl 1 M Na2C03 abgestopt und die Proben 10 min bei 13000 rpm (Heraeus Biofuge fresco, Festwinkelrotor 24) zentrifugiert. Der Überstand wurde bei 420nm gegen den Leerwert vermessen ( Beckman DU 640 Spectrophotometer) und die ß-Galactosidase-Aktivität berechnet: U=1000 A420 (CVt)-1
A420 ist dabei die Absorption bei 420 nm, C ist die Dichte der Zellsuspension (OD600), V ist das eingesetzte Volumen der Zellsuspension und t die Inkubationszeit. Die Messung wurde mit zwei weiteren Klonen wiederholt und der Mittelwert bestimmt
Benotigte Losungen Z-Puffer 1000 ml
16,1 g Na2HP04x7H20 5,5 g NaH2P04x7H20 0,75 g KCI MgS04x7H20 Z-Puffer + Mercaptoethanol (frisch angesetzt)
100 ml Z-Puffer + 270 μl Mercaptoethanol
Beispiel 7 Rekonstitutionsassay Mg-Chelatase-Aktivitat in Hefe (Willows et al , 1996, Eur J Biochem 235,438-443) Stamm SFY526+pAS2- chlD+pACT2-chlH+pSG28
Es wurden kompetente Zellen des Stammes SFY526+pAS2-chlD+pACT2-chlH hergestellt (Klebe et al , 1983, Gene, 25, 333-341 ) und mit pSG28 (p423TEF+chll, p423TEF Mumberg et al , 1995, Gene, 156, 119-122) transformiert Transformanten wurden auf Minimalagar (10 %YNB-Glukose, 1 ,5% Agar) unter Zusatz von Adenin (20mg/l) und L-Lysin-HCI (30mg/l) selektiert
15 ml einer Vorkultur (Minimalmedium 10% YNB-Glukose + 20 mg/l Adenin + 30 mg/l L-Lysin-HCI ) dieses Stammes wurden 24 Stunden bei 30°C und 180 rpm in einer sterilen 50ml-Steιlbrustflasche mit Metallkappe kultiviert 150 ml Hauptkultur (Minimalmedium 10% YNB-Glukose + 20 mg/l Adenin + 30 mg/l L-lysm-HCI) wurden mit 7,5 ml Vorkultur beimpft und 20 Stunden bei 30°C und 180 rpm unter Nutzung eines sterilen 500 ml-Erlenmeyerkolbens mit Wattestopfen geschüttelt Die Zellen wurden 5 mm bei 5000 rpm (Sigma 4K 10) sedimentiert und in 1 ,5 ml Assay-Puffer (0,1 M Tricin pH 7,9, 0,3 M Glycerol, 25 mM MgCI2, 4 mM DTT) resuspendiert Anschließend wurde diese Zeilsuspension 3x30 Sekunden durch Ultraschall auf Eis bei geringer Ultraschallstarke aufgeschlossen Die aufgeschlossenen Zellen wurden 15 min bei 5000 rpm (Sigma 4 K 10) sedimentiert und es wurde mit dem Überstand weitergearbeitet. Der Proteingehalt dieses Hefeextraktes wurde unter Nutzung des BioRad Protein Assay nach der
Methode von Bradford bestimmt.
Das Assayvolumen betrug 1 ml. 1 ml Assay-Puffer enthielten 1 mg Proteinextrakt der aufgeschlossenen Hefekultur, 4 mM ATP, 1 ,5 μM Protoporphyrin IX, 50 mM
Phosphocreatin und 10 U Creatinphosphokinase.
Dieser Inkubationsmix wurde eine Stunde bei 30°C im Dunkeln inkubiert und danach ein Fluoreszenz-Emissions-Spektrum zwischen 500 und 650 nm bei einer anregenden Wellenlänge von 420 nm an einem Perkin Eimer Luminescence
Spectrometer LS50B aufgenommen und einer HPLC-Analyse unterzogen.
Fig. 1 (a - d) zeigt transgene chID Sense- und Antisense-Tabakpflanzen
SEQUENZPROTOKOLL
(1) ALLGEMEINE INFORMATION:
(i) ANMELDER:
(A) NAME: Hoechst Schering AgrEvo GmbH
(B) STRASSE: -
(C) ORT: Frankfurt
(D) BUNDESLAND: -
(E) LAND: Deutschland
(F) POSTLEITZAHL: 65926
(G) TELEPHON: 069-305-82808 (H) TELEFAX: 069-35-7175 (I) TELEX: -
(n) ANMELDETITEL: DNA-Sequenzen kodierend fuer die Untereinheit
CHLD pflanzlicher Magneεium-Chelatasen sowie Verfahren zur Aktivitaetsbestimmung pflanzlicher Magnes um-Chelatasen
(m) ANZAHL DER SEQUENZEN: 7
(IV) COMPUTER-LESBARE FORM:
(A) DATENTRÄGER: Floppy disk
(B) COMPUTER: IBM PC compatible
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: Patentin Release #1.0, Version #1.25 (EPA)
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 1:
(l) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LANGE: 2495 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsaure
(C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(n) ART DES MOLEKÜLS: DNS (genomisch)
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLUSSEL: exon
(B) LAGE: 1..39
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLUSSEL: CDS
(B) LAGE: 40..2313
( x) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLUSSEL: exon
(B) LAGE: 41..2495
( i) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1:
CATCTAAAAT CCTAAATCAA AAACTTCGAT GCTATAAAA ATG GGG TTT TGT TCA 54
Met Gly Phe Cys Ser 1 5
ACT TCA ACC CTC CCA CAA ACA TCA CTA TCC AAT TCT CAA TCT TCA ACA 102 Thr Ser Thr Leu Pro Gin Thr Ser Leu Ser Asn Ser Gin Ser Ser Thr 10 15 20
TTC TTC ACA TAC TTA AAA CCA TGC CCA ATT CTA TCC TCC ACA TAT TTA 150 Phe Phe Thr Tyr Leu Lys Pro Cys Pro Ile Leu Ser Ser Thr Tyr Leu 25 30 35
AGG CCG GAA CGG CTA AAA TTT CGC CTC AGA ATA AGT GCC ACT GCA ACT 198 Arg Pro Glu Arg Leu Lys Phe Arg Leu Arg Ile Ser Ala Thr Ala Thr 40 45 50
ATT GAT TCA CCT AAT GGC GCT GTT GCA GTA GTG GAA CCT GAA AAA CAA 246 Ile Asp Ser Pro Asn Gly Ala Val Ala Val Val Glu Pro Glu Lys Gin 55 60 65
CCT GAG AAA ATT TCC TTT GGT AGA CAG TAT TTT CCT CTA GCT GCT GTT 294 Pro Glu Lys Ile Ser Phe Gly Arg Gin Tyr Phe Pro Leu Ala Ala Val 70 75 80 85
ATT GGA CAG GAT GCT ATT AAA ACT GCT CTT TTA CTT GGG GCC ATT GAC 342 Ile Gly Gin Asp Ala Ile Lys Thr Ala Leu Leu Leu Gly Ala Ile Asp 90 95 100
CGT GAG ATA GGA GGA ATT GCA ATA TGT GGG AAG CGT GGA ACA GCG AAA 390 Arg Glu Ile Gly Gly Ile Ala Ile Cys Gly Lys Arg Gly Thr Ala Lys 105 110 115
ACG TTA ATG GCA CGT GGA TTG CAT GCT ATT CTG CCA CCA ATT GAA GTA 438 Thr Leu Met Ala Arg Gly Leu His Ala Ile Leu Pro Pro Ile Glu Val 120 125 130
GTT GTT GGC TCA ATG GCA AAT GCT GAT CCG AAC TGT CCC GAT GAG TGG 486 Val Val Gly Ser Met Ala Asn Ala Asp Pro Asn Cys Pro Asp Glu Trp 135 140 145
GAA GAC GGG CTA GCT GAC AGA GCA GAA TAT GGG TCT GAT GGT AAT ATC 534 Glu Asp Gly Leu Ala Asp Arg Ala Glu Tyr Gly Ser Asp Gly Asn Ile 150 155 160 165
AAG ACC CAG ATA GTT AAA TCC CCA TTT GTT CAG ATT CCC CTT GGT GTC 582 Lys Thr Gin Ile Val Lys Ser Pro Phe Val Gin Ile Pro Leu Gly Val 170 175 180
ACA GAA GAT AGA TTG ATT GGC TCT GTT GAT GTC GAG GAG TCC GTG AAA 630 Thr Glu Asp Arg Leu Ile Gly Ser Val Asp Val Glu Glu Ser Val Lys 185 190 195
TCT GGA ACC ACT GTC TTT CAA CCA GGC CTC CTC GCA GAA GCT CAT CGA 678 Ser Gly Thr Thr Val Phe Gin Pro Gly Leu Leu Ala Glu Ala His Arg 200 205 210
GGA GTT CTA TAT GTT GAT GAG ATT AAT CTA TTA GAT GAA GGT ATA AGT 726 Gly Val Leu Tyr Val Asp Glu Ile Asn Leu Leu Asp Glu Gly Ile Ser 215 220 225
AAC CTA CTT CTG AAT GTA TTG ACT GAG GGA GTC AAT ATT GTA GAA AGA 774 Asn Leu Leu Leu Asn Val Leu Thr Glu Gly Val Asn Ile Val Glu Arg 230 235 240 245
GAG GGA ATC AGC TTT CGA CAT CCA TGC AAA CCA CTA CTA ATT GCT ACC 822 Glu Gly Ile Ser Phe Arg His Pro Cys Lys Pro Leu Leu Ile Ala Thr 250 255 260
TAT AAC CCT GAA GAG GGT GCG GTT CGT GAG CAT CTG CTA GAC CGT ATT 870 Tyr Asn Pro Glu Glu Gly Ala Val Arg Glu His Leu Leu Asp Arg Ile 265 270 275 GCG ATT AAT TTA AGT GCA GAT CTT CCA ATG AGT TTT GAC GAT CGT GTT 918 Ala Ile Asn Leu Ser Ala Asp Leu Pro Met Ser Phe Asp Asp Arg Val 280 285 290
GCA GCT GTT GAC ATA GCA ACA CGT TTT CAG GAG TGT AGC AAT GAG GTT 966 Ala Ala Val Asp Ile Ala Thr Arg Phe Gin Glu Cys Ser Asn Glu Val 295 300 305
TTT AAA ATG GTG GAT GAA GAA ACA GAC AGT GCA AAA ACC CAG ATA ATA 1014 Phe Lys Met Val Asp Glu Glu Thr Asp Ser Ala Lys Thr Gin Ile Ile 310 315 320 325
TTG GCA AGG GAG TAT TTA AAG GAT GTC ACA ATC AGT AGA GAT CAA CTA 1062 Leu Ala Arg Glu Tyr Leu Lys Asp Val Thr Ile Ser Arg Asp Gin Leu 330 335 340
AAA TAC TTG GTC ATG GAA GCA ATT CGT GGT GGC TGC CAG GGG CAC CGA 1110 Lys Tyr Leu Val Met Glu Ala Ile Arg Gly Gly Cys Gin Gly His Arg 345 350 355
GCT GAA CTT TAT GCT GCT CGT GTA GCC AAA TGC TTA GCT GCC ATC GAT 1158 Ala Glu Leu Tyr Ala Ala Arg Val Ala Lys Cys Leu Ala Ala Ile Asp 360 365 370
GGA CGT GAA AAA GTT GGT GTT GAT GAG CTG AAA AAA GCT GTA GAG CTT 1206 Gly Arg Glu Lys Val Gly Val Asp Glu Leu Lys Lys Ala Val Glu Leu 375 380 385
GTC ATC CTC CCA CGT TCA ACT ATA GTT GAA AAC CCA CCA GAC CAG CAA 1254 Val Ile Leu Pro Arg Ser Thr Ile Val Glu Asn Pro Pro Asp Gin Gin 390 395 400 405
AAC CAG CAG CCA CCT CCT CCC CCT CCC CCT CCC CAA AAT CAA GAT TCT 1302 Asn Gin Gin Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Gin Asn Gin Asp Ser 410 415 420
TCA GAA GAG CAG AAT GAA GAA GAA GAA AAA GAA GAA GAA GAT CAA GAG 1350 Ser Glu Glu Gin Asn Glu Glu Glu Glu Lys Glu Glu Glu Asp Gin Glu 425 430 435
GAT GAG AAA GAT AGA GAA AAT GAA CAG CAA CAG CCA CAA GTC CCT GAT 1398 Asp Glu Lys Asp Arg Glu Asn Glu Gin Gin Gin Pro Gin Val Pro Asp 440 445 450
GAG TTT ATT TTT GAT GCG GAA GGT GGT TTA GTG GAT GAA AAA CTT CTC 1446 Glu Phe Ile Phe Asp Ala Glu Gly Gly Leu Val Asp Glu Lys Leu Leu 455 460 465
TTC TTT GCA CAA CAA GCA CAA AGA CGC AAA GGA AAA GCT GGA CGA GCA 1494 Phe Phe Ala Gin Gin Ala Gin Arg Arg Lys Gly Lys Ala Gly Arg Ala 470 475 480 485
AAG AAG GTC ATC TTT TCC GAA GAT AGA GGT CGA TAT ATA AAG CCA ATG 1542 Lys Lys Val Ile Phe Ser Glu Asp Arg Gly Arg Tyr Ile Lys Pro Met 490 495 500
CTT CCA AAG GGT CCA GTG AAG AGA TTG GCA GTT GAT GCA ACT CTA AGA 1590 Leu Pro Lys Gly Pro Val Lys Arg Leu Ala Val Asp Ala Thr Leu Arg 505 510 515
GCA GCG GCA CCA TAT CAG AAG TTA CGA AGA GCA AAG GAC ATC CAA AAA 1638 Ala Ala Ala Pro Tyr Gin Lys Leu Arg Arg Ala Lys Asp Ile Gin Lys 520 525 530 ACT CGC AAG GTT TAT GTA GAG AAA ACT GAC ATG AGA GCC AAA AGA ATG 1686 Thr Arg Lys Val Tyr Val Glu Lys Thr Asp Met Arg Ala Lys Arg Met 535 540 545
GCA CGC AAA GCC GGA GCT CTG GTG ATA TTC GTA GTT GAC GCT AGT GGG 1734 Ala Arg Lys Ala Gly Ala Leu Val Ile Phe Val Val Asp Ala Ser Gly 550 555 560 565
AGT ATG GCA CTG AAT AGA ATG CAG AAT GCC AAA GGA GCA GCA CTT AAA 1782 Ser Met Ala Leu Asn Arg Met Gin Asn Ala Lys Gly Ala Ala Leu Lys 570 575 580
CTA CTT GCA GAG AGT TAT ACA AGC AGA GAT CAG GTC TGT ATC ATT CCC 1830 Leu Leu Ala Glu Ser Tyr Thr Ser Arg Asp Gin Val Cys Ile Ile Pro 585 590 595
TTC CGC GGA GAT GCT GCT GAA GTT TTG TTG CCA CCT TCT AGG TCA ATA 1878 Phe Arg Gly Asp Ala Ala Glu Val Leu Leu Pro Pro Ser Arg Ser Ile 600 605 610
TCG ATG GCA AGA AAT CGT CTT GAG AGA CTT CCC TGT GGA GGG GGT TCT 1926 Ser Met Ala Arg Asn Arg Leu Glu Arg Leu Pro Cys Gly Gly Gly Ser 615 620 625
CCC CTT GCT CAT GGG CTT ACG ACG GCA GTT AGA GTT GGA ATG AAT GCA 1974 Pro Leu Ala His Gly Leu Thr Thr Ala Val Arg Val Gly Met Asn Ala 630 635 640 645
GAA AAG AGT GGT GAT GTT GGA CGT ATC ATG ATT GTT GCA ATT ACT GAT 2022 Glu Lys Ser Gly Asp Val Gly Arg Ile Met Ile Val Ala Ile Thr Asp 650 655 660
GGT AGA GCT AAC ATC TCT CTT AAA AGA TCC ACA GAC CCT GAA GCT GAA 2070 Gly Arg Ala Asn Ile Ser Leu Lys Arg Ser Thr Asp Pro Glu Ala Glu 665 670 675
GCT TCT GAT GCA CCC AGA CCT TCT TCC CAA GAG CTG AAG GAT GAG ATT 2118 Ala Ser Asp Ala Pro Arg Pro Ser Ser Gin Glu Leu Lys Asp Glu Ile 680 685 690
CTC GAG GTG GCT GGT AAA ATA TAC AAA ACA GGA ATG TCT CTC CTC GTC 2166 Leu Glu Val Ala Gly Lys Ile Tyr Lys Thr Gly Met Ser Leu Leu Val 695 700 705
ATA GAT ACA GAA AAT AAG TTT GTT TCT ACT GGT TTT GCG AAA GAA ATC 2214 Ile Asp Thr Glu Asn Lys Phe Val Ser Thr Gly Phe Ala Lys Glu Ile 710 715 720 725
GCG AGA GTA GCT CAA GGG AAG TAC TAT TAT TTA CCA AAT GCT TCA GAT 2262 Ala Arg Val Ala Gin Gly Lys Tyr Tyr Tyr Leu Pro Asn Ala Ser Asp 730 735 740
GCT GTG ATA TCT GCA GCA ACA AAG GAT GCA TTA TCT GCA TTA AAG GAA 2310 Ala Val Ile Ser Ala Ala Thr Lys Asp Ala Leu Ser Ala Leu Lys Glu 745 750 755
TCT TGACCTAAAC TCGATCGAAT TAATTGTAAA TGTTGTTTTG AGTATAGATT 2363
Ser
ATTGGGAGGA TATAAGAGCT TGCTTGATAA TTCTTATCTT TTGTTGTACT AATTGAACTT 2423 ATTTCTCAAT TATGCAATCA GGGTAATGAA GATTCTTTTC ATTTCAAAAA AAAAAAAAAA 2483 AAAGGAATTC GA 2495
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 2:
(l) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 758 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure (D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2:
Met Gly Phe Cys Ser Thr Ser Thr Leu Pro Gin Thr Ser Leu Ser Asn 1 5 10 15
Ser Gin Ser Ser Thr Phe Phe Thr Tyr Leu Lys Pro Cys Pro Ile Leu 20 25 30
Ser Ser Thr Tyr Leu Arg Pro Glu Arg Leu Lys Phe Arg Leu Arg Ile 35 40 45
Ser Ala Thr Ala Thr Ile Asp Ser Pro Asn Gly Ala Val Ala Val Val 50 55 60
Glu Pro Glu Lys Gin Pro Glu Lys Ile Ser Phe Gly Arg Gin Tyr Phe 65 70 75 80
Pro Leu Ala Ala Val Ile Gly Gin Asp Ala Ile Lys Thr Ala Leu Leu 85 90 95
Leu Gly Ala Ile Asp Arg Glu Ile Gly Gly Ile Ala Ile Cys Gly Lys 100 105 110
Arg Gly Thr Ala Lys Thr Leu Met Ala Arg Gly Leu His Ala Ile Leu 115 120 125
Pro Pro Ile Glu Val Val Val Gly Ser Met Ala Asn Ala Asp Pro Asn 130 135 140
Cys Pro Asp Glu Trp Glu Asp Gly Leu Ala Asp Arg Ala Glu Tyr Gly 145 150 155 160
Ser Asp Gly Asn Ile Lys Thr Gin Ile Val Lys Ser Pro Phe Val Gin 165 170 175
Ile Pro Leu Gly Val Thr Glu Asp Arg Leu Ile Gly Ser Val Asp Val 180 185 190
Glu Glu Ser Val Lys Ser Gly Thr Thr Val Phe Gin Pro Gly Leu Leu 195 200 205
Ala Glu Ala His Arg Gly Val Leu Tyr Val Asp Glu Ile Asn Leu Leu 210 215 220
Asp Glu Gly Ile Ser Asn Leu Leu Leu Asn Val Leu Thr Glu Gly Val 225 230 235 240
Asn Ile Val Glu Arg Glu Gly Ile Ser Phe Arg H s Pro Cys Lys Pro 245 250 255 Leu Leu Ile Ala Thr Tyr Asn Pro Glu Glu Gly Ala Val Arg Glu His 260 265 270
Leu Leu Asp Arg Ile Ala Ile Asn Leu Ser Ala Asp Leu Pro Met Ser 275 280 285
Phe Asp Asp Arg Val Ala Ala Val Asp Ile Ala Thr Arg Phe Gin Glu 290 295 300
Cys Ser Asn Glu Val Phe Lys Met Val Asp Glu Glu Thr Asp Ser Ala 305 310 315 320
Lys Thr Gin Ile Ile Leu Ala Arg Glu Tyr Leu Lys Asp Val Thr Ile 325 330 335
Ser Arg Asp Gin Leu Lys Tyr Leu Val Met Glu Ala Ile Arg Gly Gly 340 345 350
Cys Gin Gly His Arg Ala Glu Leu Tyr Ala Ala Arg Val Ala Lys Cys 355 360 365
Leu Ala Ala Ile Asp Gly Arg Glu Lys Val Gly Val Asp Glu Leu Lys 370 375 380
Lys Ala Val Glu Leu Val Ile Leu Pro Arg Ser Thr Ile Val Glu Asn 385 390 395 400
Pro Pro Asp Gin Gin Asn Gin Gin Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro 405 410 415
Gin Asn Gin Asp Ser Ser Glu Glu Gin Asn Glu Glu Glu Glu Lys Glu 420 425 430
Glu Glu Asp Gin Glu Asp Glu Lys Asp Arg Glu Asn Glu Gin Gin Gin 435 440 445
Pro Gin Val Pro Asp Glu Phe Ile Phe Asp Ala Glu Gly Gly Leu Val 450 455 460
Asp Glu Lys Leu Leu Phe Phe Ala Gin Gin Ala Gin Arg Arg Lys Gly 465 470 475 480
Lys Ala Gly Arg Ala Lys Lys Val Ile Phe Ser Glu Asp Arg Gly Arg 485 490 495
Tyr Ile Lys Pro Met Leu Pro Lys Gly Pro Val Lys Arg Leu Ala Val 500 505 510
Asp Ala Thr Leu Arg Ala Ala Ala Pro Tyr Gin Lys Leu Arg Arg Ala 515 520 525
Lys Asp Ile Gin Lys Thr Arg Lys Val Tyr Val Glu Lys Thr Asp Met 530 535 540
Arg Ala Lys Arg Met Ala Arg Lys Ala Gly Ala Leu Val Ile Phe Val 545 550 555 560
Val Asp Ala Ser Gly Ser Met Ala Leu Asn Arg Met Gin Asn Ala Lys 565 570 575
Gly Ala Ala Leu Lys Leu Leu Ala Glu Ser Tyr Thr Ser Arg Asp Gin 580 585 590 Val Cys Ile Ile Pro Phe Arg Gly Asp Ala Ala Glu Val Leu Leu Pro 595 600 605
Pro Ser Arg Ser Ile Ser Met Ala Arg Asn Arg Leu Glu Arg Leu Pro 610 615 620
Cys Gly Gly Gly Ser Pro Leu Ala His Gly Leu Thr Thr Ala Val Arg 625 630 635 640
Val Gly Met Asn Ala Glu Lys Ser Gly Asp Val Gly Arg Ile Met Ile 645 650 655
Val Ala Ile Thr Asp Gly Arg Ala Asn Ile Ser Leu Lys Arg Ser Thr 660 665 670
Asp Pro Glu Ala Glu Ala Ser Asp Ala Pro Arg Pro Ser Ser Gin Glu 675 680 685
Leu Lys Asp Glu Ile Leu Glu Val Ala Gly Lys Ile Tyr Lys Thr Gly 690 695 700
Met Ser Leu Leu Val Ile Asp Thr Glu Asn Lys Phe Val Ser* Thr Gly 705 710 715 720
Phe Ala Lys Glu Ile Ala Arg Val Ala Gin Gly Lys Tyr Tyr Tyr Leu 725 730 735
Pro Asn Ala Ser Asp Ala Val Ile Ser Ala Ala Thr Lys Asp Ala Leu 740 745 750
Ser Ala Leu Lys Glu Ser 755
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 3:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LANGE: 6 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(11) ART DES MOLEKÜLS: Protein
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLUSSEL: Protein
(B) LAGE: 1..6
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 3:
Val Asp Ala Ser Gly Ser 1 5
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 4:
(1) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LANGE: 6 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear (ll) ART DES MOLEKÜLS: Protein
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLUSSEL: Protein
(B) LAGE: 1..6
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 4:
Thr Asp Gly Arg Gly Asn 1 5
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 5:
(l) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LANGE: 1579 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsaure
(C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ll) ART DES MOLEKÜLS: DNS (genomisch)
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLUSSEL: exon
(B) LAGE: 1..1579
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 5:
CCCAAAATTC TTCTTCTTCT TCTTCACTGA AAAATTCTAA ACAAAATGGC TTCACTACTA 60
GGAACTTCCT CTTCAGCAGC AGCTGCAATA TTAGCTTCTA CACCCTTGTC TTCTCGCTCC 120
TGTAAGCCTG CCGTTTTCTC CCTCTTCCCT TCTTCAGGGC AGAGTCAAGG GAGGAAGTTT 180
TATGGAGGGA TTAGAGTCCC AGTTAAGAAA GGGAGGTCCC AATTCCATGT GGCAATTTCA 240
AATGTTGCGA CGGAAATCAA CCTGCTCAAG AACAGGGTCA GAAACTTGCT GGAGGAGAGC 300
CAGAGACCGG TGTATCCATT TGCAGCTATA GTGGGACAAG ATGAAATGAA GTTATGTCTT 360
TTGCTGAATG TAATTGATCC AAAGATTGGA GGTGTGATGA TAATGGGTGA TAGGGGAACC 420
GGGAAGTCCA CCACGGTTAG ATCTTTGGTA GATTTACTTC CTGAAATCAA AGTTATTTCT 480
GGTGATCCGT TCAATTCAGA TCCAGATGAC CAAGAAGTAA TGAGTGCAGA AGTCCGTGAC 540
AAATTGAGGA GCGGACAGCA GCTTCCTATA TCTCGTACGA AAATCAACAT GGTTGATTTA 600
CCGCTTGGTG CTACTGAGGA CAGGGTGTGT GGCACAATCG ACATTGAGAA AGCTCTTACT 660
GAGGGTGTGA AGGCTTTCGA GCCTGGTCTT CTTGCTAAAG CTAACAGAGG AATACTTTAC 720
GTCGATGAGG TTAATCTTTT GGACGACCAT TTAGTAGATG TTCTTTTGGA TTCTGCAGCA 780
TCGGGATGGA ACACTGTTGA AAGAGAGGGG ATATCAATAT CACACCCTGC CCGGTTTATC 840
CTTATTGGTT CGGGTAATCC TGAAGAAGGA GAACTTAGGC CACAACTTCT TGATCGATTT 900
GGAATGCATG CCCAAGTGGG GACCGTGAGA GATGCAGAGC TGAGAGTGAA GATAGTTGAG 960 GAAAGAGCTC GTTTTGATAA GAACCCCAAG GAATTCAGGG AATCATACAA GGCAGAGCAA 1020
GAAAAGCTCC AGAACCAAAT CGACTCAGCT AGGAACGCTC TTTCTGCTGT TACAATCGAT 1080
CATGATCTTC GAGTTAAAAT CTCTAAGGTC TGTGCAGAAC TAAACGTCGA TGGATTGAGA 1140
GGTGATATAG TCACTAACAG GGCAGCAAGA GCGTTGGCTG CACTAAAAGG AAGAGATAAG 1200
GTAACTCCGG AAGATATCGC CACTGTCATT CCCAACTGCT TAAGACACAG GCTGAGGAAG 1260
GATCCGTTGG AATCTATTGA CTCGGGTGTA CTTGTTGTTG AGAAATTTTA TGAGGTTTTC 1320
GCCTAAGCGT TTTATAGAGT GAGATACTTA TTTTTGGCTT TATTTTCCAT TCATAAATCA 1380
TCTAAAGATT TGACAATTGT AACACTAGAC TTTTGCTTAA TTTTGGCTTT GTACTGTGCT 1440
TAAGAAATGG GTTCAGAATT ACCTGTAGCC AGTTGTATTT GGTTATGACT GCTTTATTTC 1500
TGAAATGCTT AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AΑAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA 1560
AAAAAAAAAA AAGGAATTC 1579 (2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 6:
(l) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LANGE: 4578 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsaure
(C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ll) ART DES MOLEKÜLS: DNS (genomisch)
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLUSSEL: exon
(B) LAGE: 1..4578
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 6:
AGCCACTACT CTCCACATAA AACTATAAAC TTAGAACATT TCACTTGAAA AAAGAGAGGA 60
AAAAAGTGAA GCAGAAATCT TTTCTCAAAA CACAATCTAT AGGAAGTTAA ATTCAACTTC 120
CACACTTCCA AGATTCTTGT TTCAAGTTTC GTTTAGTTTT TTTTTCTTGG TTTTTTTTAT 180
AGTTTTCTGT ACAATTTTGT GTAGAATCAA GAAACGAAAG AGTTAAAGTT TGAAACTTTT 240
TTACAAGTTT GAAACAATGG CTTCTTTGGT TTCTTCACCA TTTACATTGC CAAATTCAAA 300
AGTAGAACAC TTGTCATCCA TTTCTCAAAA GCATTACTTT CTTCACTCAT TTCTTCCCAA 360
GAAAATAAAC CCCACTTACT CAAAATCACC AAAGAAATTC CAATGTAATG CTATTGGCAA 420
TGGTTTATTC ACTCAAACAA CTCAAGAAGT TAGGAGAATT GTGCCTGAAA ATACTCAGGG 480
ACTTGCTACT GTGAAAATAG TCTATGTTGT ATTGGAAGCT CAGTACCAAT CATCACTTAC 540
TGCTGCTGTT CAGACACTGA ACAAGAATGG TCAGTTTGCT TCTTTTGAGG TTGTGGGGTA 600
CTTGGTTGAG GAGCTTAGAG ATGAGAATAC TTATAAAATG TTTTGTAAAG ATCTTGAGGA 660
TGCAAATGTG TTTATTGGTT CATTGATTTT TGTGGAAGAA TTGGCTTTAA AGGTAAAATC 720 TGCAGTGGAG AAAGAAAGGG ACAGACTTGA TGCAGTTTTG GTGTTTCCAT CAATGCCTGA 780
GGTGATGAGG TTGAACAAGT TGGGATCTTT TAGTATGTCA CAATTGGGGC AATCAAAGAG 840
TCCATTTTTT GAGCTTTTCA AGAAGAAGAA ACCTTCTTCT GCAGGTTTTT CTGATCAGAT 900
GTTGAAGCTT GTGAGAACAT TGCCTAAGGT TTTGAAGTAT TTACCAAGTG ATAAAGCTCA 960
AGATGCTAGG TTGTACATAC TAAGTTTGCA GTTTTGGCTA GGAGGTTCAC CTGATAATTT 1020
GGTGAATTTC TTGAAAATGA TTTCTGGTTC TTATGTTCCT GCTCTTAAAG GGATGAAAAT 1080
CGACTACTCG GATCCGGTTT TGTACTTGGA TAATGGAATT TGGCACCCTT TGGCTCCTTG 1140
TATGTATGAT GATGTGAAGG AGTATTTGAA TTGGTATGCA ACAAGGAGAG ATACTAATGA 1200
GAAACTCAAG AGTTCAAATG CTCCTGTTGT TGGGCTGGTT TTGCAAAGGA GTCATATTGT 1260
TACTTGTGAT GAGAGTCACT ATGTGGCTGT GATCATGGAA TTGGAGGCAA AGGGGGCTAA 1320
AGTTATCCCA ATTTTTGCCG GTGGGCTAGA CTTTTCGAGG CCAATTGAGA GATATTTCAT 1380
TGATCCTATT ACAAAGAAGC CTTTTGTGAA TTCAGTAATA TCACTTTCTG GTTTTGCACT 1440
TGTTGGAGGG CCAGCAAGAC AAGACCATCC AAGGGCAATA GAGGCTTTGA TGAAACTTGA 1500
TGTGCCTTAT ATTGTGGCAT TGCCTTTGGT TTTCCAAACA ACAGAGGAAT GGTTGAACAG 1560
TACTTTGGGG CTGCACCCTA TTCAGGTGGC TCTACAAGTT GCTCTCCCTG AGCTGGATGG 1620
AGGAATGGAG CCCATCGTAT TCGCCGGTCG CGATCCAAGA ACAGGGAAAT CACATGCTCT 1680
TCACAAAAGA GTGGAGCAGC TTTGCACCAG GGCAATCAAA TGGGGAGAGT TAAAGAGAAA 1740
AACAAAGGCT GAGAAGAGGT TGGCAATCAC TGTCTTCAGC TTTCCTCCAG ACAAAGGCAA 1800
TGTCGGAACT GCTGCATACT TGAATGTCTT TGCCTCCATA TACTCTGTTC TCAAAGATCT 1860
CAAGAAAGAC GGCTACAACG TTGAGGGGCT GCCTGAGACT TCTGCACAAC TTATTGAAGA 1920
AGTAATTCAC GACAAAGAAG CTCAGTTCAG CAGCCCAAAT CTTAACATAG CTTACAAGAT 1980
GAATGTTAGA GAATACCAGA AGCTAACCCC CTATGCTACT GCTCTTGAAG AAAACTGGGG 2040
GAAAGCACCT GGTAATTTGA ACTCTGATGG AGAAAACCTC TTGGTATATG GTAAACAGTA 2100
CGGCAATGTC TTTATCGGTG TTCAGCCCAC GTTTGGATAC GAGGGTGACC CGATGAGACT 2160
TCTGTTCTCC AAATCAGCTA GCCCTCACCA TGGTTTTGCT GCATACTATT CCTTTGTGGA 2220
GAAAATTTTC AAAGCTGATG CAGTTCTCCA CTTTGGTACT CATGGTTCTC TTGAGTTCAT 2280
GCCAGGTAAA CAGGTGGGAA TGAGCGATGC TTCTTTCCCT GATAGTCTCA TTGGAAACAT 2340
TCCCAATGTC TATTACTATG CAGCAAACAA CCCATCTGAA GCAACTATTG CCAAACGAAG 2400
GAGTTATGCG AATACCATTA GCTACTTGAC TCCTCCGGCT GAGAATGCTG GACTCTACAA 2460
GGGACTCAAG CAGCTCAGTG AGCTCATTTC CTCATACCAA TCTCTGAAAG ACTCAGGCCG 2520
TGGCCAACAG ATTGTGAACT CTATCATCAG TACAGCTAGA CAGTGTAATC TTGACAAGGA 2580
TGTTGATCTT CCAGAAGAAG GGGAGGAAAT CTCGGCCAAA GAGCGTGACC TTGTGGTAGG 2640 AAAAGTATAC TCTAAGATTA TGGAGATCGA GTCTCGTCTT CTTCCGTGTG GACTTCACAT 2700
CATTGGTGAA CCTCCAACCG CGATGGAAGC AGTTGCTACT CTTGTCAATA TTGCGACATT 2760
GGACCGTCCT GAAGAGGGTA TTTCTGCCCT TCCATCTATA TTGGCTGCGA CGGTTGGAAG 2820
AAGCATTGAG GAGATTTACA GAGGCAATGA CCAGGGCATC TTACGAGATG TGGAGCTGCT 2880
CCGTCAAATT ACTGAGGCAT CACGTGGAGC AATATCAGCA TTTGTTGAAC GTACGACAAA 2940
CAACAAGGGT CAGGTTGTGA ATGTCAATGA CAAGCTAACC TCAATCCTTG GTTTTGGTAT 3000
AAATGAACCA TGGATCCAGT ATTTGTCAAA CACCCAATTT TACAGAGCTG ATAGGGACAA 3060
GCTCAGAGTT CTATTCCAGT TCTTGGGAGA GTGTCTGAAG CTAATTGTCG CTAACAACGA 3120
GGTGGGAAGC TTGAAACAGG CTCTAGAAGG GAAATATGTT GAACCAGGTC CAGGAGGGGA 3180
TCCGATCAGA AACCCGAAAG TTTTGCCTAC TGGGAAAAAC ATCCATGCTT TGGACCCACA 3240
AGCTATTCCC ACAATAGCAG CAGTGCAGAG TGCCAAAATT GTTGTTGAAA GATTGTTGGA 3300
GAGGCAAAAG GCCGACAACG GGGGCAAGTA CCCGGAGACT GTTGCTCTGG TTCTTTGGGG 3360
AACAGACAAC ATCAAGACCT ATGGAGAGTC ATTGGCACAG GTTATGTGGA TGATTGGTGT 3420
TAGGCCAGTT ACAGACTCGT TAGGACGGGT TAACCGGGTG GAACCTGTTA GCCTTGAAGA 3480
GCTTGGAAGG CCTAGAGTTG ATGTTGTTGT CAACTGCTCT GGGGTGTTCA GAGATCTCTT 3540
CATCAATCAG ATGAATCTCC TTGACCGAGC AGTCAAGATG GTTGCAGAGC TCGACGAGCC 3600
AGAAGACCAA AACTACGTCA GGAAACATGC ACTAGAACAA GCAAAAACAC TCGGAGTTGA 3660
TGTTCGTGAA GCTGCTACAA GGATCTTCTC AAATGCTTCA GGATCTTACT CCTCCAACAT 3720
TAACCTTGCT GTTGAGAATT CAACATGGAA TGATGAGAAG CAACTTCAAG ACATGTACTT 3780
GAGCCGAAAG TCATTTGCAT TTGACTGTGA TGCCCCTGGT GTTGGCATGA CTGAGAAGAG 3840
GAAAGTTTTT GAGATGGCTC TTAGCACGGC TGATGCCACA TTCCAGAACC TTGACTCATC 3900
TGAAATTTCA TTCACAGACG TGAGTCACTA CTTCGATTCA GACCCAACCA ACCTTGTGCA 3960
AAACCTCAGG AAAGACGGGA AGAAGCCTAG TGCATACATT GCTGACACCA CTACTGCTAA 4020
TGCTCAGGTA CGTACGTTGT CTGAGACTGT GAGGCTTGAC GCAAGGACAA AGTTGTTGAA 4080
CCCCAAGTGG TATGAAGGCA TGCTATCCAC TGGCTACGAG GGTGTTCGTG AGATTGAGAA 4140
ACGATTAACT AACACAGTGG GGTGGAGTGC AACTTCAGGC CAAGTTGATA ATTGGGTGGA 4200
TGAAGAAGCC AACACAACCT TCATTCAAGA TCAGGAGATG TTGAACAGGC TCATGAACAC 4260
AAATCCAAAT TCTTTCAGGA AGTTGCTTCA GACATTCTTG GAAGCCAACG GGCGTGGATA 4320
CTGGGAAACT TCTGCAGAGA ACATTGAGAA ACTCAAGCAA TTATACTCAG AAGTTGAAGA 4380
CAAGATTGAG GGAATCGATC GATAAATGTA TAGCAAAAAG AATGATCTCT GATTATTGCC 4440
TGTTTGTTCC TAACTGTTTC TGATGTGAAT TCCTTTGACA GTCCCCAGTG TAATTTTGTT 4500
CATTTTTGGG GATGTCCTAC TTCTATGAGA AAATACTGCT TCCATATATT CAAATTTGAG 4560 CTTGAAAAAA AAAAAAAA 4578
2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 7:
(l) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LANGE: Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(n) ART DES MOLEKÜLS: Protein
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLUSSEL: Protein
(B) LAGE: 1..6
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 7: Ala Lys Gly Ala Val Met

Claims

Patentansprüche:
1. Nukleinsauremolekul, dadurch gekennzeichnet, daß es für ein Protein mit der Funktion einer pflanzlichen Mg-Chelatase-Untereinheit CHLD oder ein aktives Fragment daraus kodiert.
2. Nukleinsauremolekul gemäß Anspruch 1 , gekennzeichnet durch SEQ ID Nr. 1 oder ein aktives Fragment daraus.
3. Nukleinsauremolekul gemäß Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß es für ein Protein gemäß SEQ ID Nr. 2 kodiert oder für ein aktives Fragment daraus.
4. Nukleinsauremolekul, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Oligonukleotid von mindestens 10 Nukleotiden Länge darstellt, das spezifisch mit einem Nukleinsauremolekul gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 3 hybridisiert.
5. Nukleinsauremolekul, dadurch gekennzeichnet, daß es für ein Peptid kodiert, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID Nr. 3 und SEQ ID Nr. 4 und SEQ ID Nr. 7.
6. Nukleinsauremolekul, dadurch gekennzeichnet, daß es eine antisense oder komplementäre Sequenz der Nukleinsäuremoleküle gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 5 darstellt.
7. Verwendung eines Nukieinsäuremoleküls gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 6 zur Amplifizierung, Isolierung oder Identifizierung eines Nukieinsäuremoleküls, kodierend für ein Protein mit der Funktion einer pflanzlichen Mg-Chelatase-Untereinheit CHLD oder ein biologisch aktives Fragment daraus.
8. Verwendung eines Nukieinsäuremoleküls gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 6 zur Herstellung von Antikörpern.
9. Verwendung eines Nukieinsäuremoleküls gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 6 zur Herstellung von transgenen Pflanzen.
10. Protein, dadurch gekennzeichnet, daß es die Funktion einer pflanzlichen Mg-Chelatase-Untereinheit CHLD aufweist oder ein aktives Fragment daraus, vorzugsweise rekombinantes Protein.
11. Protein gemäß Anspruch 10, gekennzeichnet durch SEQ ID Nr. 2 oder ein aktives Fragment daraus, vorzugsweise rekombinantes Protein.
12. Verwendung eines Proteins gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 10 und 11 zur Aktivitätsbestimmung einer Mg-Chelatase.
13. Verwendung eines Proteins gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 10 und 11 zur Herstellung von Antikörpern.
14. Verfahren zur Herstellung eines Proteins mit der Funktion einer pflanzlichen Mg-Chelatase Untereinheit CHLD in einer rekombinanten Wirtszelle, dadurch gekennzeichnet, daß diese Wirtszelle mit einem erfindungsgemäßen Nukleinsauremolekul kodierend für eine pflanzliche Mg-Chelatase Untereinheit CHLD oder ein aktives Fragment daraus transformiert wird, vorzugsweise eine DNA-Sequenz gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1-3 in eine für eine Wirtszelle geeignete Expressionskassette inseriert wird, die so erhaltene Expressionskassette in geeigneter Weise in einen für eine Wirtszelle geeigneten Vektor inseriert wird, eine geeignete Wirtszelle mit dem so erhaltenen Vektor transformiert wird; und die so transformierte Wirtszelle in einem geeigneten Medium kultiviert wird; und das von besagter Wirtszelle produzierte Protein mit der Funktion einer pflanzlichen Mg-Chelatase Untereinheit CHLD in geeigneter Weise aus dem Kulturmedium oder der Wirtszelle isoliert wird.
15. Verfahren zur Herstellung eines Proteins mit der Funktion einer pflanzlichen Mg-Chelatase in einer rekombinanten Wirtszelle, dadurch gekennzeichnet, daß daß diese Wirtszelle mit einem erfindungsgemäßen Nukleinsauremolekul kodierend für eine pflanzliche Mg-Chelatase oder ein aktives Fragment daraus transformiert wird, vorzugsweise eine DNA-Sequenz gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1-3 in eine für eine Wirtszelle, geeignete Expressionskassette inseriert wird; die so erhaltene Expressionskassette in geeigneter Weise in einen für eine Wirtszelle geeigneten Vektor inseriert wird, eine geeignete Wirtszelle mit dem so erhaltenen Vektor transformiert wird; und die so transformierte Wirtszelle in einem geeigneten Medium kultiviert wird; und das von besagter Wirtszelle produzierte Protein mit der Funktion einer pflanzlichen Mg-Chelatase in geeigneter Weise aus dem Kulturmedium oder der Wirtszelle isoliert wird.
16. Verfahren zur Bestimmung der Wechselwirkung pflanzlicher Mg- Chelatase Untereinheiten, dadurch gekennzeichnet, daß eine Wirtszelle mit einer DNA-Sequenz gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 3 sowie mindestens mit einer DNA-Sequenz kodierend für eine weitere Untereinheit der Mg-Chelatase in einer Weise transformiert wird, daß die Interaktion der Mg-Chelatase-Genprodukte zu einem direkt oder indirekt, qualitativ oder quantitativ meßbaren Signal führt, vorzugsweise durch die Aktivierung eines Markergens.
17. Verfahren zur Bestimmung der Aktivität pflanzlicher Mg-Chelatase, dadurch gekennzeichnet, daß ein Protein gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 10 und 11 mit den Genprodukten der DNA-Sequenzen kodierend für die Mg-Chelatase-Untereinheiten I und H in einer Weise zusammen gebracht wird, daß die enzymatische Aktivität der Mg- Chelatase-Genprodukte zu einem direkt oder indirekt, qualitativ oder quantitativ meßbaren Signal führt.
18. Verwendung eines Verfahrens gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 16 und 17 zur Identifizierung von Effektoren pflanzlicher Mg- Chelatase.
19. Effektor der enzymatischen Aktivität der Mg-Chelatase, identifizierbar nach einem oder mehreren der Ansprüche 16 bis 17, vorzugsweise Inhibitor oder Aktivator der Mg-Chelatase, besonders bevorzugt herbizid wirksamer Inhibitor oder phytosanitär und/oder wachstumsfördernd wirksamer Aktivator der Mg-Chelatase.
20. Verfahren zur Kontrolle von unerwünschen Pflanzenwuchs, dadurch gekennzeichnet, daß auf die Pflanzen, deren Samen und/oder die Anbaufläche von Pflanzen ein oder mehrere herbizid wirksame Inhibitoren der Mg-Chelatase, identifizierbar nach einem oder mehreren der Ansprüche 16 bis 17 appliziert werden.
21. Verfahren zur Wachstumförderung von Nutzpflanzenkulturen, dadurch gekennzeichnet, daß auf die Pflanzen, deren Samen und/oder die Anbaufläche von Pflanzen ein oder mehrere wachstumsfördernd wirksame Aktivatoren der Mg-Chelatase, identifizierbar nach einem oder mehreren der Ansprüche 16 bis 17 appliziert werden.
22. Verfahren zum Schutz von Nutzpflanzenkulturen gegen die phytotoxische Wirkung von Herbiziden, dadurch gekennzeichnet, daß auf die Pflanzen, deren Samen und/oder die Anbaufläche von Pflanzen ein oder mehrere phytosanitär wirksame Aktivatoren der Mg-Chelatase, identifizierbar nach einem oder mehreren der Ansprüche 16 bis 17 appliziert werden.
23. Verwendung von Effektoren gemäß Anspruch 19 im Pflanzenschutz zur Kontrolle von unerwünschten Pflanzenwuchs, zur Wachstumsförderung von Nutzpflanzenkulturen oder zum Schutz von Nutzpflanzenkulturen gegen die phytotoxische Wirkung von Herbiziden.
24. Nicht-natürlich vorkommendes chimäres Gen, enthaltend einen Promotor, der funktionell mit einem DNA-Molekül gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 6 fusioniert ist.
25. Vektor, enthaltend ein Nukleinsauremolekul gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 6.
26. Rekombinante Wirtszelle, dadurch gekennzeichnet, daß diese Wirtszelle ein Nukleinsauremolekul gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 6 exprimiert, vorzugsweise stabil mit einem Vektor gemäß Anspruch 25 transformiert ist.
27. Transgene Pflanze, transgene Pflanzenzellen, transgene Pflanzenteile, transgene Pflanzensamen, transgenes Vermehrungsgut, enthaltend ein Nukleinsauremolekul gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 6.
28. Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzen, transgener Pflanzenzellen, transgener Pflanzenteile, transgener Pflanzensamen, transgenen Vermehrungsguts mittels einer rekombinanten Wirtszelle gemäß Anspruch 26.
29. Verfahren zur Herstellung eines Nukieinsäuremoleküls gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß ein Nukleinsauremolekul gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 6 nach einem an sich bekannten Verfahren zur Herstellung von Nukleinsäuren hergestellt wird.
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