WO1998047490A1

WO1998047490A1 - Stabile pharmazeutische darreichungsform für peptide, proteine und nukleinsäuren

Info

Publication number: WO1998047490A1
Application number: PCT/EP1998/002131
Authority: WO
Inventors: Wolfgang Rödel; Markus Mattern; Gerhard Winter
Original assignee: Roche Diagnostics Gmbh
Priority date: 1997-04-18
Filing date: 1998-04-11
Publication date: 1998-10-29
Also published as: EP0975335A1; AU744777B2; TR199902575T2; BR9809103A; KR20010006562A; JP2001524090A; DE19716154A1; CA2288649A1; CN1261271A; AU7758598A

Abstract

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind lagerstabile lyophilisierte pharmazeutische Zubereitungen von Biomolekülen, wobei die Biomoleküle ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Proteinen, Peptiden, Nukleinsäuren und Kohlehydraten, und ferner eine oder mehrere basische D- oder L-Aminosäuren und zusätzlich eine oder mehrere Aminodicarbonsäuren, Hydroxycarbonsäuren oder Dicarbonsäuren oder deren physiologisch verträgliche Salze enthalten sind. Die Hilfsstoffe liegen im Lyophilisat ganz oder teilweise in amorpher Form vor.

Description

Stabile pharmazeutische Darreichungsform für Peptide, Proteine und Nukleinsäuren

Die Erfindung betrifft stabile lyophilisierte Zusammensetzungen für pharmazeutische oder diagnostische Zwecke, die ein Protein, ein Peptid, eine Nukleinsaure oder ein Poly- saccharid enthalten, wobei die Hilfsstoffe derart ausgewählt sind, daß die Lyophilisate in amorpher oder teilamorpher Form vorliegen

Die Fortschritte in der Biotechnologie in den letzten 20 Jahren führten zu einem lmmen- sen Anwachsen der Zahl von Biomolekulen, die in größeren Mengen verfügbar sind Ein besonders aktives Feld für diese Produkte ist die Anwendung in pharmazeutischen Therapien So werden zum Beispiel bestimmte Proteine zur Regulation einzelner Zelltypen eingesetzt, Nukleinsäuren zur Regulation der Genexpression, Polysaccharide zur Vakzinierung. In der Praxis ist es von Vorteil, wenn die Präparate bei Raumtemperatur gelagert werden können, da der Lagerraum zur Kühlung oftmals begrenzt ist

Bei temperaturempfindlichen Präparaten ist zudem eine genaue Kontrolle der Lagerdauer zwischen Entnahme aus dem Kühlschrank und der therapeutischen Verabreichung (z B Injektion) notwendig, da sich durch Abbaureaktionen Nebenprodukte bilden können, die das Wirkungsspektrum verfalschen können Insbesondere in der Routine im Krankenhaus sowie bei der Verabreichung von Arzneimittelpraparaten, beispielsweise bei klinischen Studien am Menschen, ist es schwierig, eine durchgehende Kontrolle der Lagerbedingungen der Präparate zu gewährleisten

Samtliche Biomolekule können mehr oder weniger leicht hydrolysieren Die Hydrolyse ist Bestandteil des naturlichen Metabolismus und z B erforderlich, um die Akkumulation hohermolekularer toxischer Substanzen im Korper zu verhindern In der Literatur ist zudem eine Vielzahl von weiteren Abbaureaktionen beschrieben, die für Biomolekule in unterschiedlichem Maß zutreffen Im Fall von Peptiden oder Proteinen erfolgen derartige Abbaureaktion durch Aggregation, Denaturierung, Isomerisierung oder Redoxvorgange Im Fall von Nukleinsäuren führen beispielsweise Desaminierung oder Addition eines Nukleophils zum Abbau der Nukleinsäuren.

Bei der Entwicklung von stabilen Lyophilisaten, wie z B von pharmazeutischen oder diagnostischen Zubereitungen von Peptiden oder Proteinen, gibt es noch keine gesicherten kausalen Methoden, die es gestatten wurden, aus der Vielzahl der möglichen Hilfs- und Zusatzstoffe diejenigen Hilfsstoffe zuverlässig auszuwählen, die eine stabile Darreichungsform des jeweiligen Wirkstoffes gewahrleisten Die Auswahl geeigneter Hilfsstoffe zur Erzielung einer hinreichend stabilen Darreichungsform, die beispielsweise eine hinreichend lange Lagerstabilitat gewährleisten oder die die oben genannten Abbaureaktionen verzögern oder verhindern, geschieht meist empirisch

Es ist bekannt, daß die Lagerstabilitat vieler Proteinpraparate durch Entzug des Wassers erhöht wird Geeignete Methoden hierzu sind Gefriertrocknung und Vakuumtrocknung Die Anwendung solcher technischer Prozesse kann jedoch ebenfalls Abbaureaktionen hervorrufen, z.B ist in der Gefriertrocknung eine Einfrierphase notwendig Viele Proteine sind aber nicht hinreichend stabil gegen Einfrierprozesse Beim Abkühlen der wäßrigen Losung eines Biopolymers kristallisiert der überwiegende Teil des Wassers aus, wahrend das Biopolymer in amorphem Zustand verbleibt Dadurch kann es zu einer Veränderung der molekularen Umgebung des Biopolymers kommen, wodurch sich auch die raumliche Struktur bzw Konformation des Biopolymers selbst andern kann Dies wiederum kann Abbaureaktionen begünstigen, indem beispielsweise die Reaktivität einzelner fünktioneller Gruppen zunimmt oder aufgefaltete Kettensegmente benachbarter Polymermolekule aggregieren Ebenso kann in der Trocknungsphase der Entzug der das Protein umgebenden Hydrathulle chemische Reaktionen wie Oxidation in der Proteinkette zur Folge haben. Durch den Zusatz von geeigneten Zusatzstoffen können diese Abbaureaktionen vermieden oder zumindest im Ausmaß verringert werden Bei der Gefriertrocknung oder Vakuumtrocknung besteht eine wesentliche Funktion der Hilfsstoffe darin, eine stabilisierende amorphe Umgebung für das Biopolymer zu schaffen, die bei weiterer Abkühlung im Glaszustand erstarrt Der Übergang geschieht sprungartig innerhalb eines sehr engen Temperaturintervalls und laßt sich durch die Glastempe- ratur Tg' charakterisieren Unterhalb dieser Temperatur ist die molekulare Beweglichkeit und damit auch die Reaktivität stark herabgesetzt In einer für die Gefriertrocknung gut geeigneten Rezeptur liegt Tg' möglichst hoch, typischerweise oberhalb von -40°C Das Vorhandensein amorpher Strukturen kann beispielsweise durch Differential Scanning Calorimetrie (DSC), durch Rontgenbeugungsuntersuchungen oder durch optische und elektronenmikroskopische Untersuchungen belegt werden

Um hinreichend stabile lyophilisierte pharmazeutische Darreichungsformen herstellen zu können, ist es erforderlich, solche Hilfsstoffe auszuwählen, die wahrend des Einfrierens nicht oder höchstens teilweise auskristallisieren Derartige Hilfsstoffe, die das Biomolekul beim Einfπervorgang schützen, werden auch als 'Cryoprotectants' bezeichnet In der Haupttrocknungsphase sublimieren die Eiskristalle, wahrend in der Nachtrocknungsphase ein Teil des in der amorphen Phase und im Biopolymer gebundenen Wassers abgezogen wird, was in der Regel drastischere Bedingungen erfordert (höhere Temperatur oder stärkeres Vakuum) Mit der Abnahme des Wassergehalts im Gefriertrocknungsgut steigt Tg' Um die Zeit für den Trocknungsprozeß zu verkurzen, wird die Temperatur der Platten der Gefriertrocknungs-Kammer sukzessive erhöht, die Temperatur im Gefriertrocknungsgut darf Tg' jedoch nie überschreiten

In der Trocknungsphase bewirken die Hilfsstoffe die Aufrechterhaltung des Glaszustandes, in den das Polymer eingebettet ist In der Nachtrocknungsphase entstehen zudem durch Entzug von Wassermolekulen im Biopolymer freie Valenzen für Wasserstoffbruk- kenbindungen Hierdurch erhöht sich die Reaktivität des Biopolymers Durch den Zusatz von geeigneten stabilisierend wirkenden Hilfsstoffen soll die Ausbildung von Wasserstofϊbrucken bewirkt werden, um für das Biopolymer eine Umgebung aus Wasserersatz zu schaffen Hierfür wurde der Begriff 'Lyoprotectants' geprägt Die Obergrenze für die Temperaturbelastung beim Lagern wird durch die Glasubergangstemperatur Tg bestimmt, oberhalb derer die molekulare Beweglichkeit stark zunimmt Als Folge dessen treten oft Kristallisationsprozesse (beschrieben durch die Kristallisationstemperatur Tk) oder chemische Reaktionen auf Makroskopisch gesehen kommt es dabei oft zum sog Kollaps des Lyophilisatkuchens (beschrieben durch die Kollapstemperatur Tc), da die Hilfsstoffmolekule untereinander assoziieren, was von einer Verringerung der spezifischen Oberflache der Hilfssto-rmatrix begleitet wird

Das im Lyophilisat vorhandene Wasser senkt Tg, in einer guten Rezeptur liegt die Rest- feuchte nach Gefriertrocknung unter 3% Im Laufe längerer Lagerung kann sie allerdings etwas ansteigen Um einen genugenden Sicherheitsabstand zu haben, sollte die Lagertemperatur des Lyophilisates im Glaszustand maximal 20 °C unterhalb von Tg liegen.

WO 93/00807 beschreibt ein Zweikomponentensystem, bestehend aus einem Cryo- protectant (wie Polyethylenglykol, PVP oder Starke) und einem Lyoprotectant (wie Zucker, Polyhydroxyalkohol oder Aminosäure) zur Stabilisierung wahrend der Lyophili- sation

Bekanntlich steigt die Tendenz zur Glasbildung mit dem Molekulargewicht Zur Bildung stabiler Glasmatrices werden daher Polymere wie PVP, Proteine (insbesondere Serumalbumin) oder Polysaccharide (Dextran) eingesetzt

Es ist jedoch bekannt, daß Schutzproteine wie Serumalbumin nach Injektion nachteilig sein können, da sie die Bildung von Antikörpern hervorrufen können, was den Einsatz für parenterale Präparate beeinträchtigt Weiterhin können Unterschiede in den Rohstoffchargen der Schutzproteine Unsicherheiten mit sich bringen, da hierdurch die Prozeßfahigkeit und die Qualität der resultierenden Produktchargen negativ beeinflußt werden kann

Die als Hilfsstoffe eingesetzten Polysaccharide können im Blutkreislauf daruberhinaus pyrogen wirken Außerdem haben Polysaccharide den Nachteil, daß sie oft ein Anquellen erfordern, so daß sie bei der Rekonstitution eines Lyophilisats die schnelle Bildung einer klaren Losung behindern Außerdem besteht das Material in der Regel aus einer Fraktion mit unterschiedlichen Kettenlangen, was die Chargenkonsistenz erschwert Letzteres gilt auch für synthetische Polymere wie PVP (Polyvinylpyrrolidon)

Als niedermolekulare Substanzen zur Glasbildung in Lyophilisaten für Biomolekule werden bisher fast ausschließlich Polyhydroxyverbindungen wie Saccharide (Saccharose, Trehalose, Glucose) oder Zuckeralkohole (Mannit) verwendet Der Zusatz von Mannit ergibt aber nur metastabile Glaszustande, die bei Lagerung nachkristallisieren können

Reduzierende Zucker wie Glucose oder Maltose können Radikal- oder Redoxreaktionen verursachen, aber auch mit primären Aminogruppen (z B in Proteinen) Amadori- Produkte bilden Zusatzlich kann sich das Präparat durch die Maillard-Reaktion braunlich verfärben Nichtreduzierende Di- oder Trisaccharide können hydrolysieren, wobei sich einerseits reduzierende Zucker bilden können, andererseits werden möglicherweise die physikalischen Eigenschaften der Hilfsstoffmatrix beeinträchtigt Von Zuckeralkoholen wie Mannit ist bekannt, daß sie z B. in Gegenwart von Acetat Hydrolysereaktionen katalysieren Zudem neigen sie zum Auskristallisieren Dennoch wird häufig die Kombination Mannit/Glycin/(evtl Phosphat, Detergens) als Hilfsstoffmatrix zur Lyophilisation von Proteinen eingesetzt (vgl EP 0 597 101, WO 89/09614 )

Weitere Nachteile bzw Probleme bei der Herstellung von wirklich ausreichend trockenen, lagerstabilen Zuckerzubereitungen sind drastisch verlängerte Trocknungszeiten, da wegen der Stabilität der eingesetzen biologischen Materialien nur eine geringe Wärmezufuhr möglich ist. Lange Prozeßzeiten sind ökonomisch ungunstig, zudem besteht ein erhöhtes Prozeßrisiko, z.B können Undichtigkeiten an der Vakuumkammer auftreten, das Kuhlaggregat ausfallen, etc

Überraschenderweise wurde gefunden, daß bestimmte Kombinationen von Hilfsstoffen als Glasbildner bei der Lyophilisation von Biomolekulen geeignet sind Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind daher lyophilisierte Zubereitungen enthaltend a) Biomolekule ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Proteinen, Peptiden, Nukleinsäuren und Kohlehydraten und b) eine oder mehrere basische D- oder L-Aminosäuren und c) eine oder mehrere Aminodicarbonsäuren, Hydroxycarbonsäuren, Hydroxydicarbonsauren oder Dicarbonauren, oder deren physiologisch vertragliche Salze, wobei die Hilfsstoffe im Lyophilisat zumindest teilweise in amorpher Form vorliegen. Zur leichteren Trocknung und zur Verbesserung der morphologischen Struktur des Lyophilisatkuchens können gegebenenfalls auch noch eine oder mehrere neutrale Aminosäuren zugesetzt werden.

Die Auswahl der Hilfsstoffe führt dazu, daß die Hilfsstoffe in den Lyophilisaten entweder vollkommen amorph oder zumindest in teilamorpher Modifikation vorliegen Derartige Lyophilisate weisen im Gegensatz zu kristallinen Zusammensetzungen eine Glas- ubergangstemperatur (Tg) auf, die oberhalb der angestrebten Lagertemperatur liegt Geeignete Kombinationen von Hilfsstoffen sind Mischungen enthaltend mindestens je eine Substanz aus den Gruppen (A) und (B), wobei (A) eine basische D- oder L-Amino- saure ist, und (B) eine Aminodicarbonsäure, insbesondere eine saure D- oder L- Aminosäure, Aminocarbonsaure, Monocarbonsaure, Dicarbonsaure oder Hydroxydicarbonsaure ist, oder deren physiologisch verträglichen Salze. Derartige Mischungen eignen sich als Glasbildner bei der Lyophilisation von Biomolekülen und haben dadurch den Vorteil, daß die so hergestellten Lyophilisate über einen längeren Zeitraum, je nach Empfindlichkeit des eingesetzten Biomoleküls vorzugsweise mindestens ein Jahr, insbesondere 1 - 2 Jahre bei Kühlschranktemperatur oder Raumtemperatur hinweg stabil sind. Dies ermöglicht die Reduzierung oder die völlige Vermeidung der oben erwähnten weniger geeigneten Substanzgruppen, so daß die Nachteile bei der Verwendung der genannten Substanzgruppen bei der Herstellung von pharmazeutischen Darreichungsformen weitgehend vermieden werden können. Ein weiterer Vorteil der erfindungsgemäß hergestellten Lyophilisate ist ein starke Verkürzung der Trocknungszeiten, insbesondere bei Einsatz einer hydrophoben Aminosäure von weniger als 30 Stunden, vorzugsweise weniger als 24 Stunden, insbesondere von weniger als 15 Stunden. Dies bedeutet, daß anstelle der oft mehrere Tage dauernden Trocknung die Lyophilisate durch Trocknung über Nacht hergestellt werden können. Pharmazeutisch stabile Lyophilisate können dann erhalten werden, wenn das Paar aus der basischen Aminosäure und dem zur pH-Einstellung notwendigem Gegenion so gewählt wird, daß bei der Lyophilisation eine Matrix entsteht, die mindestens teilweise amorph ist und eine Glasubergangstemperatur von mehr als 50 °C, vorzugsweise mehr als 65 °C, insbesondere mehr als 80 °C aufweist Für das Herstellungsverfahren ist von Vorteil, wenn die gefrorene Losung eine Glasubergangstemperatur von mehr als -40°C aufweist

Zur Einstellung des pH-Wertes können ferner physiologisch vertragliche Sauren oder Basen sowie deren Salze eingesetzt werden Geeignete Sauren sind anorganische oder organische Sauren, wie beispielsweise Phosphorsaure, Essigsaure, etc Vorzugsweise werden freie Sauren oder Basen eingesetzt, um eine möglichst niedrige Salzkonzentration im Lyophilisat zu erreichen Mit einigen Peptiden und Proteinen wurde in Arginin-Phosphat die Bildung von Protein-Aggregaten bei der Herstellung der zu lyophilisierenden Losung beobachtet, sofern der Phosphatgehalt hoher als 5 mM lag Ahnliches Verhalten wurde bei Verwendung von Arginin-Citrat (c = 10 mM) festgestellt Überraschenderweise kann die Bildung von Aggregaten reduziert oder weitgehend vermieden werden, wenn anstelle des Phosphatsalzes der Aminosäure Arginin als Gegenion Mono- oder Dicarbonsäuren eingesetzt werden Lyophilisate mit stabilem Glaszustand wurden insbesondere dann erhalten, wenn Aminodicarbonauren (z B saure D- oder L-Aminosauren) oder Dicarbonsäuren eingesetzt werden Gegebenenfalls kann zur Feineinstellung des pH im Bereich 5 - 7 bei Verwendung einer basischen Aminosäure Phosphorsaure in Konzentrationen kleiner als 5 mM eingesetzt werden

Daruberhinaus weisen die erfindungsgemaßen Darreichungsformen den weiteren Vorteil auf, daß die Glasubergangstemperatur wie auch das Erscheinungsbild des Lyophilisat- kuchens weiter verbessert wurde, insbesondere dann, wenn zusatzlich eine neutrale Aminosäure zugegeben wurde, selbst wenn diese teilweise auskristallisiert Die Menge kann dabei in weiten Grenzen variiert werden (5 - 50 % der gesamten Hilfsstoffmenge)

Die erfindungsgemaßen Darreichungsformen haben den Voπeil, daß sie über längere Zeit bei Raumtemperatur lagerstabil sind Damit ist auch bei Unterbrechung der Kuhlkette die sichere Anwendung als Arzneimittel gewahrleistet Als geeignete Zusatz- oder Hilfsstoffe im Sinne der vorliegenden Erfindung kommen als bevorzugte Ausführungsform eine Kombination aus einer basischen, einer sauren und mindestens einer neutralen Aminosäure in Frage Diese Kombinationen sind physio- logisch gut vertraglich, besitzen gute Gefriertrocknungseigenschaften und verbessern die thermische Stabilisitat lyophilisierter Biopolymere Außerdem führt das Auflosen des Lyophilisats mit Wasser schnell zu einer klaren Losung

Als basische Aminosäuren kommen im Sinne der vorliegenden Erfindung alle physiologisch vertraglichen Aminosäuren mit einer basischen Seitengruppe in Frage, beispielsweise Histidin, Lysin, Arginin, Ornithin oder Citrullin Als neutrale Aminosäuren kommen entsprechend die physiologisch vertraglichen Aminosäuren mit hydrophoben oder hydrophilen Seitengruppen in Frage, beispielsweise Phenylalanin, Glycin, Leucin oder Isoleucm Als Sauren kommen entsprechend Aminodicarbonsäuren, Hydroxycarbonsäuren, Hydroxydicarbonsauren, Dicarbonsäuren oder deren physiologisch vertraglichen Salze in Frage, beispielsweise Asparagin- oder Glutaminsäure Sofern diese Sauren über ein chirales Zentrum verfügen, können die Racemate oder auch die optisch aktiven Derivate eingesetzt werden

Die Menge der erfindungsgemaßen Zusatzstoffe werden bevorzugt derart ausgewählt, daß das Gewichtsverhaltnis der in Gruppe c) genannten Sauren (Aminodicarbonsäuren. Hydroxycarbonsäuren oder Dicarbonsäuren) zu den basischen D- oder L-Aminosauren der Gruppe a) im Lyophilisat im Bereich von 0,01 1 bis 2 1 betragt Besonders vorteilhaft ist ein Bereich von 0,1 1 bis 1 1, insbesondere etwa 0,5 1

Im Sinne der vorliegenden Erfindung kommen zahlreiche Peptide oder Proteine als Wirkstoffe zur Herstellung der erfindungsgemaßen pharmazeutischen Darreichnungsformen in Frage, wie z B Immunmodulatoren, Lymphokine, Monokine, Cytokine, Enzyme, Anti- korper, Wachstumsfaktoren, wachstumshemmende Faktoren, Blutproteine, Hormone, Vakzine, Blutkoagulationsfaktoren, sowie entsprechende Vorlauferproteine, Muteine oder Fragmente hiervon Die Peptide oder Proteine besitzen ein Molekulargewicht von 0 5 - 500 kD, bevorzugt 2 0-200 kD Beispielhaft seien folgende Peptide oder Proteine genannt Atrial naturetischer Faktor bzw ANP (s a WO 85/33768), Urodilatin bzw Ularitide (s a WO 88/06596, WO 95/33768), Cardiodilatin (s a WO 85/02850), BNP (brain natπuretic peptides), Auriculin, Interferone, Kolonie-stimulierende Faktoren, Interleukine (IL- 1, IL-lα, IL-l ß, IL-2, IL-3, IL-4, etc ) Makrophagen aktivierende Faktoren, B-Zell Faktoren, Urokinase, Plasminogenaktivatoren, TNF, NGF, Erythropoietin, EGF, hGH, BMP (bone morphogenic proteins), Calcitonin, Insulin oder Relaxin

Auch Nukleinsäuren wie Plasmide, DNA-Fragmente oder RNA-Strange eignen sich für die erfindungsgemaßen Darreichungsform

Die erfindungsgemaßen lyophilisierten pharmazeutischen Darreichungsformen eignen sich besonders gut zur parenteralen Verabreichung in flussiger Form

In den nachfolgenden Beispielen und Vergleichsbeispielen ist die Erfindung exemplarisch dargelegt und wird nachfolgend erläutert Dabei wurden Formulierungen gefunden, die als Glasbildner bei der Lyophilisation von Biomolekulen, die Glasubergangstemperatur drastisch erhohen, eine Aggregation der Biomolekule weitgehend verhindern, das Erscheinungsbild des Lyophilisatkuchens verbessern und zur thermischen Stabilisierung lyophilisierter Biomolekule geeignet sind An den aufgeführten Formulierungen wurde gezeigt, daß nur die erfindungsgemaßen Mischungen zum gewünschten Ergebnis führen, d h diese ermöglichen es, in einem kurzen Lyophilisationsprozeß stabile Proteinformulierungen in ganz oder teilamorphen Strukturen zu erhalten

Die in den Rezepturen der folgenden Beispiele angegebenen Konzentrationen beziehen sich auf die Losung vor der Lyophilisation Beispiel 1

Der pH-Wert der Losung wird mit H,PO₄ auf pH 7,4 eingestellt

2 g L-Arginin und 1 g L-Aspartat wurden in 50 ml Wasser gelost Zu dieser Losung wurden 35 mg G-CSF (gelost in 30 ml 10 mM Phosphat-Puffer) zupipettiert und 5 min gerührt Anschließend wurden 100 μl Tween 80 (als 10% wassπge Losung) zupipettiert und weitere 20 min gerührt Der pH wurde durch Zugabe von Phosphorsaure auf 7,4 eingestellt und das Volumen auf 100 ml aufgefüllt Diese Losung wurde membranfiltriert (PVDF-Filter 0,22 μm) und jeweils 1 ml in Glasvials abgefüllt Nach Aufsetzen eines geeigneten Stopfens wurde eine Gefriertrocknung durchgeführt, wobei die Trocknung über einen Zeitraum von insgesamt 40 Stunden erfolgt. Die Vials wurden anschließend verschlossen und bis zur Analyse bei unterschiedlichen Temperaturen gelagert Mit DSC wurde festgestellt, daß die Glasubergangstemperatur des Kuchens bei 95°C liegt Nach 26 Wochen wurden von unterschiedlich gelagerten Proben dieses Lyophilisats Rontgenbeugungsspektren aufgenommen Diese zeigen, daß es auch nach Lagerung bei einer Temperatur von +60°C amorph ist Beispiel 2 (Vergleichsbeispiel)

Der pH-Wert der Losung wird mit NaOH auf pH 7,4 eingestellt

2 g L-Valin und 2 g Glycin wurden in 50 ml Wasser gelost. 100 μl Tween 80 (als 10% wassrige Losung) zupipettiert und 20 min gerührt Anschließend wurde der pH durch Zugabe von NaOH auf 7,4 eingestellt Zu dieser Losung wurden 35 mg G-CSF (gelost in 30 ml 10 mM Phosphat-Puffer) zupipettiert und 5 min gerührt Der pH wurde kontrolliert und das Volumen auf 100 ml aufgefüllt Von dieser Losung wurde nach Abfüllung in Vials ein Lyophilisat wie unter Beispiel 1 hergestellt Im DSC dieses Lyophilisats unmittelbar nach Herstellung war kein Glasubergang zu erkennen Anhand von Rontgen- beugungsspektren und Aufnahmen im Rasterelektronenmikroskop war zu erkennen, daß der Kuchen vollkristallin ist Es sind keine amorphen oder teilamorphe Strukturen nachweisbar

Beispiel 3 (VergleichsbeispieO

Der pH-Wert der Losung wird mit NaOH auf pH 7,4 eingestellt 1 g L-Valin und 2 g Glycin wurden in 70 ml Wasser gelost, 100 μl Tween 80 (als 10% wassrige Losung) zugegeben und 20 min gerührt Anschließend wurde der pH durch Zugabe von NaOH auf 7,0 eingestellt Zu dieser Losung wurden 30 mg (15 kU) LDH (aus Schweinemuskel, gelost in 20 ml 20 mM Phosphat-Puffer) zupipettiert und 5 min gerührt Der pH wurde kontrolliert und das Volumen auf 100 ml aufgefüllt Von dieser Losung wurde nach Abfüllung in Vials ein Lyophilisat wie unter Beispiel 1 hergestellt Diese Rezeptur ist ebenfalls vollkristallin Es sind keine amorphen Strukturen nachweisbar

Beispiel 4

Der pH-Wert der Losung wird mit H₃PO₄ auf pH 7,4 eingestellt

2 g L-Arginin, 1 g Asparaginsaure und 1 g L-Phenylalanin wurden in 70 ml Wasser gelost, 100 μl Tween 80 zugegeben (als 10% wassrige Losung) und 20 min gerührt Anschließend wurde der pH durch Zugabe von Phosphorsaure auf 7,4 eingestellt Zu dieser Losung wurden 50 mg (15 kU) LDH (aus Schweinemuskel, gelost in 30 ml 100 mM Phosphat-Puffer) zupipettiert und 5 min gerührt Der pH wurde kontrolliert und das Volumen auf 100 ml aufgefüllt Von dieser Losung wurde nach Abfüllung in Vials ein Lyophilisat wie unter Beispiel 1 hergestellt Die Analyse ergab, daß ein Teil des Phenylalanins in kristalliner Form vorliegt, der Kuchen also teilweise kristallin, teilweise amorph ist Wahrend der Lagerung blieb der kristalline Anteil konstant Beispiel 5

Von den Rezepturen 1 und 2 wurde nach Lagerung der Vials bei Raumtemperatur (RT) der Gehalt an unverändertem G-CSF mit RP-HPLC bestimmt

Von den Rezepturen 3 und 4 wurde nach Lagerung der Vials bei RT (nach 5 bzw 13 Wochen) die enzymatische Aktivität im gekoppelten optischen Test bestimmt.

Beispiel 6 Analog zu Rezeptur 4 wurden Lyophilisate hergestellt, Arginin wurde jedoch durch dieselbe molare Menge anderer basischer Aminocarbonsauren ersetzt Es wurde die Enzym- aktivitat von LDH im Lyophilisat nach 5 Wochen nach Lagerung bei Raumtemperatur (RT) bestimmt

Beispiel 7

Der pH-Wert der Losung wird mit Saure (s u ) auf pH 6,3 eingestellt

Jeweils 2 g L-Arginin wurden in 50 ml Wasser gelost und durch Zugabe einer Saure ein pH von 6,3 eingestellt lg Isoleucin sowie 1 mg rhNGF wurden zugegeben und mit Wasser auf ein Volumen von 100 ml aufgefüllt Diese Losung wurde membranfiltπert (PVDF-Filter 0,22 μm) und jeweils 1 ml in Glasvials abgefüllt Nach Aufsetzen eines geeigneten Stopfens wurde eine Gefriertrocknung nach einer Gesamttrocknungszeit von etwa 40 Stunden durchgeführt Die Lyophilisate wurden anschließend mit DSC vermes- sen Ergebnis

Beispiel 8 (Nergleichsbeispiel)

Der pH-Wert der Lösung wird mit H₃PO₄ auf pH 6,0 eingestellt.

2 g L-Arginin wurden in 50 ml Wasser gelöst und durch Zugabe von Phosphorsaure ein pH von 6,0 eingestellt. Zu dieser Lösung wurden 100 mg Ularitide (gelöst in 30 ml H₂O) zupipettiert und 10 min. gerührt. Nach 60 Minuten wurde die Lösung trüb und das Protein flockte aus Der 'Versuch wurde daraufhin abgebrochen Beispiel 9 (Vergleichsbeispiel)

Der pH- Wert der Losung wird mit Citronensaure auf pH 6,0 eingestellt

2 g L-Argininwurden in 50 ml Wasser gelost und durch Zugabe von Citronensaure ein pH von 6,0 eingestellt Zu dieser Losung wurden 100 mg Ularitide (gelost in 30 ml H₂0) zupipettiert und 10 min gerührt Nach 2 Stunden wurde die Losung trüb und das Protein flockte aus Der Versuch wurde daraufhin abgebrochen

Beispiel 10

Nach dem Verfahren aus Beispiel 7 wurden Lyophilisate mit dem Wirkstoff Ularitide hergestellt mit folgender Zusammensetzung pro Vial

a) Rezeptur 19 (Vergleichsbeispiel) 1 mg Ularitide

10 mg Mannit mit Essigsaure ad pH 6,3

Nach Analyse im Rontgenbeugungsmuster zeigt sich, daß das Lyophilisat eine vollkristalline Struktur aufweist. Es sind keine amorphen oder teilamorphe Strukturen nachweisbar b) Rezeptur 20

1 mg Ularitide 20 mg L-Arginin 10 mg L-Isoleucin mit Asparaginsaure ad pH 6,3

Bewertung im DSC.

Rezeptur 19 kein Glasubergang erkennbar, ist vollkristallin Rezeptur 20' Tg = 85, 1°C, teilamorphe Struktur

Beide Rezepturen 19 und 20 wurden 1 Jahr bei Raumtemperatur gelagert Die anschließende Gelelektrophorese ergab folgende Resultate Rez. 19 Dimere > 1% und lösliche Aggregate Rez. 20 100 % Monomer,

Beispiel 11

Nach dem Verfahren aus Beispiel 7 wurden mit dem Wirkstoff Ularitide Lyophilisate mit folgenden Rezepturzusammensetzungen pro Vial hergestellt:

a) Rez. 21 (Vergleichsbeispiel) 1 mg Ularitide

50 mg Saccharose

10 mg Glycin

6 mg Polyethylenglycol 6000 b) Rez 22

1 mg Ularitide 20 mg L-Arginin 10 mg L-Isoleucin mit Asparaginsaure ad pH 6,3

c) Rez 23

4 mg Ularitide 20 mg L-Arginin

10 mg L-Isoleucin mit Asparaginsaure ad pH 6,3

d) Rez 24 1 mg Ularitide

20 mg L-Arginin 10 mg L-Leucin mit Asparaginsaure ad pH 6,3

e) Rez 25 (Vergleichsbeispiel) 1 mg Ularitide 25 mg Saccharose 20 mg Glycin

Alle Rezepturen 21 - 25 wurden in einem Belastungstest bei unterschiedlichen Temperaturen gelagert und anschließen mit RP-HPLC der Gehalt bestimmt

Die Ergebnisse der Beispiele 10 und 1 1 zeigen, daß die erfindungsgemaßen Rezepturen das Peptid besser gegen Temperaturbelastung stabilisieren, als die dem Stand der Technik entsprechenden Rezepturen auf Basis Saccharose oder Saccharose/PEG Auch das in vielen Rezepturen eingesetzte Mannit führt nicht zu ausreichend stabiler Formulierung

Die Beispiele 8 und 9 zeigen, daß die oft in Puffer- Systemen verwendeten Sauren bei bestimmten Peptiden zu Ausflockungen führen Bei den in den erfindungsgemaßen Rezepturen verwendeten Sauren (bevorzugt Asparaginsaure und Glutaminsäure) wurde dies nicht beobachtet

Beispiel 12

a) Rez 26 (Vergleichsbeispiel)

1 mg Ularitide 15 mg Glycin

2 mg L-Isoleucin 10 mg Harnstoff 0,5 mg Polysorbat mit Na-Acetat-Puffer ad pH 6,8, vollständig kristallin b) Rez 27

1 mg Ularitide 20 mg D-Arginin 10 mg D-Isoleucin mit D- Asparaginsaure ad pH 6,8

c) Rez 28

1 mg Ularitide 20 mg L-Arginin 10 mg L-Isoleucin mit L- Asparaginsaure ad pH 6,8

d) Rez 29 (Vergleichsbeispiel) 1 mg Ularitide 20 mg L-Threonin

10 mg L-Isoleucin

e) Rez 30 (Vergleichsbeispiel) 1 mg Ularitide 15 mg Polyethylenglykol 6000

5 mg Phenylalanin

Die Rezepturen wurden in einem Belastungstest bei unterschiedlichen Temperaturen gelagert und anschließend mit RP-HPLC die Menge des Hauptabbauprodukts bestimmt ('Peak XI)

In den erfindungsgemaßen Rezepturen entsteht deutlich weniger Abbauprodukt des Peptids Rezeptur 29 ergibt zwar einen amorphen Lyophilisat-Kuchen, der sich jedoch nicht ausreichend zur Stabilisierung des Proteins eignet

Beispiel 13 Nach dem Verfahren aus Beispiel 7 wurden Lyophilisate mit dem Wirkstoff Ularitide hergestellt mit folgender Zusammensetzung pro Vial

a Rez 31

1 mg Ularitide

70 mg Saccharose

10 mg L-Phenylalanin b) Rez 32

1 mg Ularitide

85 mg Saccharose

c) Rez 33

1 mg Ularitide

46 mg Raffinose

10 mg L-Phenylalanin d) Rez 34

1 mg Ularitide 20 mg L-Arginin 5 mg L-Phenylalanin mit L- Asparaginsaure ad pH 6,3

Alle Rezepturen 31 - 34 wurden in einem Belastungstest bei unterschiedlichen Temperaturen gelagert, anschließend das Lyophilisat in jeweils 1 ml Wasser gelost und die Trübung der rekonstituierten Losung nach 1 Std in einem Nephelometer (Marke Hach) bestimmt Trubungswerte über 1,0 gelten als bedenklich Da die Hilfsstoffe gut loslich sind, ist die Ursache für die in einigen Rezepturen beobachtete Eintrübung eine Aggregation des Peptids

Ergebnisse

KS = Kuhlschranktemperatur -8 °C RT = Raumtemperatur 20-22 °C

Nur die erfindungsgemaßen Rezepturen zeigen nach Temperaturbelastung keine Überschreitung des Trubungsgrenzwertes von 1,0

Beispiel 14

Ularitide wurde in verschiedene Rezepturen nach Lagerung wie in Beispiel 1 1 rekonstituiert und die Losung nach 3 Stunden mit einem Lichtstreumeßgerat (PMS) auf Partikel hin untersucht Ergebnisse (angegeben sind jeweils Mittelwerte aus der Zahlung von 5 Vials)

Die erfindungsgemaßen Rezepturen zeigen keine kritische Erhöhung der Partikelzahlen nach Lagerung bei erhöhter Temperatur

Beispiel 15 Mit dem Protein rhNGF wurden Lyophilisate folgender Rezepturen hergestellt:

a) Rez. 35

0,025 mg rhNGF 20 mg L-Arginin 10 mg L- Asparaginsaure mit Essigsaure ad pH 6,3

b) Rez. 36

0,025 mg rhNGF 20 mg L-Arginin

10 mg L- Asparaginsaure 10 mg L-Isoleucin mit Essigsaure ad pH 6,3 c Rez 37 (Vergleichsbeispiel)

0,025 mg rhNGF 20 mg L-Arginin 30 mg Saccharose mit Essigsaure ad pH 6,3

d) Rez 38 (Vergleichsbeispiel^")

0,025 mg rhNGF 20 mg L-Arginin 30 mg Raffinose mit Essigsaure ad pH 6,3

Das Programm zur Lyophilisation wurde gegenüber den üblichen Programmen stark verkürzt insgesamt 15 Std statt üblicherweise 40-50 Std Anschließend wurde die Restfeuchte im Lyophilisat in zwei unabhängigen Bestimmungen ermittelt

Ergebnis

Rezeptur 35 4,7%/5,0%

Rezeptur 36 l,0%/0,9%

Rezeptur 37 5,9%/6,6%

Rezeptur 38 5,6%/5,6%

Das Beispiel belegt, daß eine Verkürzung der Lyophilisationsdauer nur bei den erfindungsgemaßen Rezepturen, insbesondere bei Einsatz einer hydrophoben Aminosäure als 3 Komponente möglich ist Beispiel 16

Mit dem Protein rhNGF wurden Lyophilisate folgender Rezepturen hergestellt

a) Rez 39

0,025 mg rhNGF 20 mg L-Arginin 10 mg ß- Alanin 10 mg L- Asparaginsaure mit Essigsaure ad pH 6,3

b) Rez 40

0,025 mg rhNGF 20 mg L- Arginin 8 mg L- Asparaginsaure

10 mg L-Isoleucin mit Essigsaure ad pH 8,7

c) Rez 41 0,025 mg rhNGF

20 mg L- Arginin 12 mg L- Asparaginsaure 10 mg L-Isoleucin mit Apfelsaure ad pH 4,5

Es wurde mit demselben Programm lyophilisiert wie in Beispiel 15 angegeben und anschließend die Restfeuchte bestimmt

Ergebnis

Rezeptur 39 1,2%/ 1,4%

Rezeptur 40 1 ,6%/1,9%

Rezeptur 41 0,8%/0,9%

Claims

Patentansprüche

Lyophilisierte Zubereitungen enthaltend a) Biomolekule ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Proteinen, Peptiden,

Nukleinsäuren und Kohlehydraten, b) eine oder mehrere basische D- oder L-Aminosaure und c) eine oder mehrere Aminodicarbonsaure, Hydroxycarbonsaure, Hydroxy- dicarbonsaure oder Dicarbonaure, oder deren physiologisch vertragliche Salze, wobei die Hilfsstoffe im Lyophilisat ganz oder teilweise in amorpher Form vorliegen

Lyophilisierte Zubereitungen gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Gewichtsverhaltnis der in c) genannten Zusatzstoffe zu den in b) genannten Zusatz- Stoffen im Bereich von 0,01 1 bis 2 1 liegt

Lyophilisierte Zubereitungen nach einem der Ansprüche 1 - 2, dadurch gekennzeichnet, daß sie als Hilfsstoffe Polymere (Verbindungen mit einem Molekulargewicht >1000 Da) in einer Menge von weniger als 10 Gew -% der gesamten Hilfsstoffmasse enthalten

Lyophilisierte Zubereitungen nach einem der Ansprüche 1 - 3, dadurch gekennzeichnet, daß sie als Hilfsstoffe Zucker in einer Menge von weniger als 10 Gew -% der gesamten Hilfsstoffmasse enthalten

Lyophilisierte Zubereitungen nach einem der Ansprüche 1 - 4, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Glasubergangstemperatur von >50°C aufweisen

Lyophilisierte Zubereitungen nach einem der Ansprüche 1 - 5, dadurch gekennzeichnet, daß die gefrorene Lösung vor der Lyophilisation eine Glasubergangstemperatur oberhalb von -40 °C aufweist Lyophilisierte Zubereitung nach einem der Ansprüche 1 - 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Aminocarbonsaure Asparaginsaure oder Glutaminsäure ist

Lyophilisierte Zubereitungen nach einem der Ansprüche 1 - 7, dadurch gekennzeichnet, daß sie zusatzlich eine oder mehrere Aminosäuren mit hydrophobem Rest enthalten

Lyophilisierte Zubereitungen nach Anspruch 8 enthaltend Leucin, Isoleucin, Valin oder Phenylalanin, insbesondere Isoleucin oder Phenylalanin

Lyophilisierte Zubereitungen nach einem der Ansprüche 1 - 9, dadurch gekennzeichnet, daß die mit Wasser rekonstituierte Losung einen pH-Wert zwischen etwa 3 und 9 aufweist

Lyophilisierte Zubereitungen nach einem der Ansprüche 1 - 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Massenverhaltnis Biomolekul zu Hilfsstoff kleiner als 1 10 ist

Lyophilisierte Zubereitung gemäß einem der Ansprüche 1 - 11, dadurch gekennzeichnet, daß das Biomolekul ein Peptid aus der Klasse der Atrialen

Natπureti sehen Peptide (ANP) ist

Verfahren zur Herstellung von lyophilisierten Zubereitungen nach einem der Ansprüche 1 - 12, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Losung oder Suspension des Biomolekuls in einem physiologisch vertraglichen Losungsmittel herstellt und a) eine oder mehrere basische D- oder L-Aminosauren, und b) mindestens eine oder mehrere Aminodicarbonsäuren oder organische oder anorganische Sauren hinzufügt, und anschließend die Losung lyophilisiert Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Lyophilisation ausgehend von einer wäßrigen Losung mit einem Phosphatgehalt von weniger als 5mM erfolgt