JP2001524090A - ペプチド、タンパク質および核酸を投与するための安定製剤形態 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、生体分子の保存安定性凍結乾燥製剤調製物であって、生体分子がタンパク質、ペプチド、核酸および炭水化物から成る群から選択され、そして１個または数個のアミノジカルボン酸、ヒドロキシカルボン酸またはジカルボン酸あるいはそれらの生理学的適合性塩の他に、１個または数個の塩基性ＤまたはＬ−アミノ酸を付加的に含有する調製物に関する。補助物質は、完全にまたは部分的に非晶質形態で凍結乾燥物中に存在する。

Description

【発明の詳細な説明】 ペプチド、タンパク質および核酸を投与するための安定製剤形態 本発明は、タンパク質、ペプチド、核酸または多糖を含有する医薬としてまた は診断用に使用するための安定な凍結乾燥組成物に関し、ここで凍結乾燥物が非 晶質または部分的非晶質形態で存在するように補助物質が選択される。 過去２０年間のバイオテクノロジーの進歩は、大量に入手可能な生体分子の数 の莫大な増加をもたらした。これらの物質に関して特に活発な分野は、薬物療法 におけるそれらの使用である。したがって、例えばある種のタンパク質は個々の 種類の細胞を調節するために用いられ、核酸は遺伝子発現を調節するために用い られ、そして多糖はワクチン接種のために用いられる。冷蔵保存スペースがしば しば限られているために、調製物を室温で保存することができれば、実際的に有 益である。 さらに、感温性調製物は、それらの作用範囲を悪く変え得る分解反応の結果と して副産物を生成し得るために、冷蔵庫から取り出されそして治療的投与（例え ば注射）される間の保存期間の厳密なモニタリングを必要とする。特に病院の日 常的な、そして例えばヒトにおける臨床試験のために製剤調製物を投与する場合 の、調製物の保存状態の継続的監督を保証するのは難しい。 生体分子はすべて、多かれ少なかれ、容易に加水分解され得る。加水分解は自 然の代謝の一部であり、そして例えば身体中の高分子有毒物質の蓄積を防止する のに必要である。 さらに、多数のその他の分解反応が文献に記載されており、これは生体分子に 種々の程度に影響を及ぼす。ペプチドまたはタンパク 質の場合、このような分解反応は、凝集、変性、異性化または酸化還元過程によ り起こる。核酸の場合には、脱アミノ化または求核剤の付加は例えば核酸の分解 を引き起こす。 例えばペプチドまたはタンパク質の医薬または診断用調製物の安定な凍結乾燥 物の開発のためには、多数の考え得る補助物質および添加剤から、それぞれの活 性物質の投与の安定形態を保証する補助物質を確実に選択し得る因果的方法は未 だ確立されていない。例えば適切に長い保存安定性を保証する、あるいは前記の 分解反応を遅延または防止する適切に安定な投与形態を作製するのに適した補助 物質の選択は、通常は経験的に実施される。 多数のタンパク質調製物の保存安定性は水を除去することにより増大される、 ということが知られている。これに適した方法は、凍結乾燥および真空乾燥であ る。しかしながら、このような技法の使用は分解反応も引き起こし、例えば、凍 結乾燥においては冷凍段階が必要である。しかしながら、多数のタンパク質が冷 凍工程に十分に耐性でない。生体ポリマーの水性溶液を冷却すると、水の大半が 結晶化し、一方生体ポリマーは非晶質状態のままである。これは、生体ポリマー の空間的構造または立体配座の変化を引き起こす生体ポリマーの分子環境の変化 をもたらし得る。これは次に、例えば個々の官能基の反応性を増大することによ り、または隣接ポリマー分子のアンフォールド鎖セグメントの集合により分解反 応を後援し得る。さらに、乾燥段階におけるタンパク質の周囲を取り囲む水和物 外被の除去は、タンパク質鎖の酸化のような化学反応を起こさせる。適切な添加 剤の付加は、これらの分解反応の程度を阻止または低減し得る。 冷凍乾燥または真空乾燥の場合、補助物質の重要な機能は、さらに、冷却する とガラス状態に固化する生体ポリマーに安定化非晶質 環境を提供することである。遷移は、非常に狭い温度間隔内で段階的に起こり、 ガラス温度Ｔｇ‘により特性化される。分子運動性、したがって反応性も、この 温度以下で大幅に低減される。冷凍乾燥に非常に適した処方物では、Ｔｇ’はで きるだけ高く、典型的には−４０℃より高い。非晶質構造の存在は、例えば示差 走査熱量測定（ＤＳＣ）により、Ｘ線回析検査により、または光学および電子顕 微鏡検査により実証し得る。 適切に安定な凍結乾燥製剤の投与形態を製造するためには、凍結中に結晶化し ないかまたはせいぜい一部結晶化するだけである補助物質を選択する必要がある 。凍結工程中に生体分子を保護するこのような補助物質は、「氷結保護剤」と呼 ばれる。主乾燥段階では、氷結晶は昇華し、一方、後乾燥段階では、非晶質段階 および生体ポリマー中の結合した水の一部が除去されるが、これは通常はより激 しい条件（高温または強真空）を要する。Ｔｇ‘は、凍結乾燥物質中の水含量が 低減すると増大する。乾燥工程の時間を短縮するために、凍結乾燥室のプレート の温度を上げるとうまく行くが、しかし、凍結乾燥物質の温度はＴｇ’を超えて はならない。 乾燥段階中、補助物質は、ポリマーが埋め込まれるガラス状態を保持する。さ らに、後乾燥段階での水分子の除去は、生体ポリマー中の水素結合のための自由 原子価の形成を引き起こす。これは、生体ポリマーの反応性を増大する。適切に 安定化する補助物質の付加は、生体ポリマーに対する水置換環境をつくるために 、水素架橋の形成を引き起こすよう意図される。 保存中の温度負荷に関する上限は、それを超えると分子移動度の顕著な増大が 認められるガラス転移温度により決定される。これはしばしば、結晶化工程（結 晶化温度Ｔｋにより説明される）または化学反応を引き起こす。肉眼的に観察す ると、これは、補助物質の 分子が互いに会合し、これは補助物質マトリックスの特定表面の低減を伴うため に、しばしば、いわゆる凍結乾燥物ケーキの潰れ（潰れ温度Ｔｃで記載される） を引き起こす。 凍結乾燥物中に存在する水は、Ｔｇを低下せしめる。良好な処方物中では、凍 結乾燥後の残留含水量は３％より低い。しかしながら、それは長期保存中に多少 増大し得る。適切に安全な縁を有するために、ガラス状態の凍結乾燥物の保存温 度は最大でもＴｇより２０℃低い必要がある。 ＷＯ９３／００８０７は、凍結乾燥中の安定化のための氷結保護剤（例えばポ リエチレングリコール、ＰＶＰまたはデンプン）あるいは凍結保護剤（例えば、 糖、ポリヒドロキシアルコールまたはアミノ酸）から成る二成分系を記載する。 ガラス形成傾向は、分子量と供に増大する、ということは周知である。したが って、ポリマー、例えばＰＶＰ、タンパク質（特に血清アルブミン）または多糖 （デキストラン）を用いて安定ガラス物質が生成される。 しかしながら、保護タンパク質様血清アルブミンは、それらが非経口的調製物 のためのその使用を損なう抗体の形成を誘導し得るために、注射後は不利益であ り得る、ということが知られている。さらに、保護タンパク質の原料バッチにお ける差は、これが処理加工能力に、そしてその結果生じる製品バッチの質に悪影 響を及ぼし得るため、不確定性を生じ得る。 さらに、補助物質として用いられる多糖は、血液循環中で発熱作用を有する。 多糖のさらに別の欠点は、それらがしばしば膨潤を必要とし、したがって凍結乾 燥物が再構成される場合にそれらがしばしば透明溶液の迅速な形成を妨げること である。さらに、本物質は、通常はバッチ一貫性を達成するのをより難しくする 異なる鎖長か ら成る分画で構成される。後者は、合成ポリマー、例えばＰＶＰ（ポリビニルピ ロリドン）にも妥当する。 従来のポリヒドロキシ化合物、例えば糖類（スクロース、トレハロース、グル コース）または糖アルコール（マンニトール）は、ほとんど専ら、生体分子に関 する凍結乾燥物中のガラス形成のための低分子物質として用いられてきた。しか しながら、マンニトールを付加すると、保存中に後結晶化し得る準安定性ガラス 状態を生じるだけである。 還元糖、例えばグルコースまたはマルトースはラジカルまたは酸化還元反応を 引き起こし得るし、そして第一アミノ基（例えば、タンパク質中の）とともにア マドリ（Ａｍａｄｏｒｉ）物質も生成し得る。さらに、メイラード反応は、調製 物の褐色変色を引き起こし得る。非還元性二糖類または三糖類は加水分解し得る が、これは一方で還元糖の生成を生じ、しかし他方では補助物質マトリックスの 物理的特性を損傷する可能性もあり得る。糖アルコール様マンニトールは、例え ば酢酸塩の存在下で加水分解反応を触媒し得る、ということが知られている。さ らに、それらは結晶化する傾向を有する。それでも、マンニトール／グリシン／ （任意に、ホスフェート、洗剤）の組合せは、タンパク質を凍結乾燥するための 補助物質マトリックスとして高頻度に用いられる（欧州特許第０ ５９７ １０ １号、ＷＯ８９／０９６１４を比較）。 実際に十分に乾燥している保存安定性糖調製物を製造する場合のその他の欠点 または問題は、用いられる生物材料の安定性のために小入熱だけが可能であるた め、乾燥期間がかなり増大されることである。加工処理時間が長いことは経済的 に好ましくなく、さらに加工処理が長引くと、例えば真空室内に漏れが生じる危 険があり、冷却システムが壊れるおそれもある。 補助物質のあるい種の組合せは、生体分子の凍結乾燥のためのガラス形成剤と して適している、ということが意外にも判明した。それゆえ、本発明は、ａ）タ ンパク質、ペプチド、核酸および炭水化物からなる群から選択される生体分子、 ｂ）１個または数個の塩基性Ｄ−アミノ酸またはＬ−アミノ酸、ならびにｃ）１ 個または数個のアミノジカルボン酸、ヒドロキシカルボン酸、ヒドロキシジカル ボン酸またはジカルボン酸、あるいはその生理学的耐用化塩を含有する凍結乾燥 化調製物に関し、ここで、補助物質の少なくとも一部は非晶質形態で凍結乾燥物 中に存在する。１個または数個の天然アミノ酸も、乾燥を促進し、そして凍結乾 燥物ケーキの形態学的構造を改良するために任意に付加し得る。 補助物質の選択は、補助物質が完全に非晶質修飾でまたは少なくとも部分的非 晶質修飾で凍結乾燥物中に存在するという作用を有する。結晶組成物に対比して 、このような凍結乾燥物は、意図された保存温度を上回るガラス遷移温度（Ｔｇ ）を有する。補助物質の適切な組合せは、（Ａ）および（Ｂ）群の各々からの少 なくとも１つの物質を含有する混合物であり、ここで、（Ａ）は塩基性Ｄ−アミ ノ酸またはＬ−アミノ酸であり、（Ｂ）はアミノジカルボン酸、そして特に酸性 Ｄ−アミノ酸またはＬ−アミノ酸、アミノカルボン酸、モノカルボン酸、ジカル ボン酸またはヒドロキシジカルボン酸、あるいはその生理学的に許容される塩で ある。このような混合物は、生体分子の凍結乾燥のためのガラス形成剤として適 しており、その結果、この方法で調製される凍結乾燥物は、用いられる生体分子 の感受性によって長期間安定であり、それは好ましくは少なくとも１年間、特に 冷蔵温度または室温で１〜２年である。これにより前記のあまり適切でない群の 物質の使用が低減されるかまたは全く無くされ、したがって、製剤形態投与物を 製造すれば、前記の群の物 質を用いた場合の欠点が大幅に回避され得る。本発明により製造される凍結乾燥 物のさらに別の利点は、特に疎水性アミノ酸を用いる場合の乾燥時間の、３０時 間未満の、好ましくは２４時間未満の、特に１５時間未満という大幅な低減であ る。これは、凍結乾燥物が、しばしば数日をようする乾燥工程の代わりに、一夜 乾燥により製造され得る、ということを意味する。 製薬上安定な凍結乾燥物は、少なくとも部分的に非晶質であり、５０℃より高 い、好ましくは６５℃より高い、そして特に８０℃より高いガラス遷移温度を有 するマトリックスが凍結乾燥中に生成されるように、塩基性アミノ酸とｐＨを調 節するために必要な対イオンとから成る対が選択される場合に得られる。それは 、冷凍溶液が−４０℃より高いガラス遷移温度を有する場合の製造方法には有益 である。 ｐＨ値を調節するためには、生理学的に許容される酸または塩基ならびにそれ らの塩を付加的に用い得る。適切な酸は、無機または有機酸、例えばリン酸、酢 酸等である。凍結乾燥物中でのできるだけ低い塩濃度を達成するためには、好ま しくは、遊離酸または塩基が用いられる。いくつかのペプチドおよびタンパク質 の場合は、タンパク質凝集体の形成は、リン酸塩含量が５ｍＭより大きい場合に 凍結乾燥される溶液を調製する場合のリン酸アルギニン中に観察された。同様の 挙動は、クエン酸アルギニン（ｃ＝１０ｍＭ）を用いた場合に見出された。意外 にも、凝集体の形成は、モノカルボン酸またはジカルボン酸がアミノ酸アルギニ ンのリン酸塩の代わりに対イオンとして用いられる場合に、低減されるかまたは 大いに回避され得る。特に、アミノジカルボン酸（例えば酸性Ｄ−アミノ酸また はＬ−アミノ酸）またはジカルボン酸が用いられる場合には、安定ガラス状態を 有する凍結乾燥物が得られた。任意に、塩基性アミノ 酸を用いる場合には、リン酸が、５ｍＭ未満の濃度で、５〜７の範囲のｐＨの微 調整のために用いられる。 さらに、本発明の投与形態は、ガラス転移温度ならびに凍結乾燥物ケーキの外 観が、それが部分的に結晶化している場合でも、特に天然アミノ酸がさらに付加 された場合にはさらに改良された、というさらに別の利点を有するこのアミノ酸 の量は、広い限度内で変わり得る（補助物質の総量の５〜５０％）。 本発明の投与形態は、それらが室温で長期間保存された場合に安定である、と いう利点を有する。したがって、コールドチェインが壊れた場合でも、製剤調製 物としての安全使用が保証される。 本発明の意味での適切な添加剤または補助物質は、好ましい実施態様における 塩基性、酸性、そして少なくとも１つは中性のアミノ酸の組合せである。これら の組合せは、生理学的に十分耐容され、良好な冷凍乾燥特性を有し、そして凍結 乾燥化生体ポリマーの熱安定性を改良する。さらに、水で凍結乾燥物を溶解する と、容易に透明溶液が得られる。 本発明の意味で適切である塩基性アミノ酸は、塩基性側基を有するすべての生 理学的に許容されるアミノ酸、例えばヒスチジン、リシン、アルギニン、オルニ チンまたはシトルリンである。対応する適切な中性アミノ酸は、疎水性または親 水性側基を有する生理学的に許容されるアミノ酸、例えばフェニルアラニン、グ リシン、ロイシンまたはイソロイシンである。適切な酸は、対応するアミノジカ ルボン酸、ヒドロキシカルボン酸、ヒドロキシジカルボン酸、ジカルボン酸また はそれらの生理学的に許容される塩、例えばアスパラギン酸または物多民酸であ る。これらの酸がキラル中心を有する場合には、ラセミ体または任意に活性誘導 体をさえ用い得る。 本発明の添加剤の量は、好ましくはｃ）群に挙げた酸（アミノジ カルボン酸、ヒドロキシカルボン酸またはジカルボン酸）対ａ）群の塩基性Ｄ− アミノ酸またはＬ−アミノ酸の重量比が凍結乾燥物中で０．０１：１〜２：１の 範囲であるように、選択される。０．１：１〜１：１の範囲、特に灼く０．５： １が特に有益である。 多数のペプチドまたはタンパク質が、本発明の製剤投与形態の製造のための活 性物質として本発明の意味内で考慮に入れられている。それらの例としては、免 疫調節剤、リンフォカイン、モノカイン、サイトカイン、酵素、抗体、成長因子 、成長阻害因子、血中タンパク質、ホルモン、ワクチン、血液凝固因子および対 応する前駆体タンパク質、ムテインまたはその断片が挙げられる。ペプチドまた はタンパク質は、０．５〜５００ｋＤ、好ましくは２．０〜２００ｋＤの分子量 を有する。以下のペプチドまたはタンパク質が例として挙げられる：心房ナトリ ウム排泄増加因子またはＡＮＰ（ＷＯ８５／３３７６８ｊ比較）、ウロジラチン またはウラリチド（ＷＯ８８／０６５９６、ＷＯ９５／３３７６８比較）、カル ジオジラチン（ＷＯ８５／０２８５０比較）、ＢＮＰ（脳ナトリウム排泄増加性 ペプチド）、アウリクリン、インターフェロン、コロニー刺激因子、インターロ イキン（ＩＬ−１、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４等 ）、マクロファージ活性因子、Ｂ−細胞因子、ウロキナーゼ、プラスミノーゲン 活性剤、ＴＮＦ、ＮＧＦ；エリスロポイエチン、ＥＧＦ、ｈＧＨ、ＢＭＰ（骨形 態形成タンパク質）、カルシトニン、インスリンまたはレラキシン。 例えばプラスミド、ＤＮＡ断片またはＲＮＡ鎖のような核酸も本発明の投与形 態に適している。 本発明の投与の凍結乾燥化製剤形態は、液体形態での非経口投与に特に適して いる。 以下の実施例および比較例により本発明を説明し、以下で明らか にする。処方物は、生体分子の凍結乾燥におけるガラス形成剤として、ガラス遷 移温度をかなり増大し、生体分子の凝集を大幅に防止し、凍結乾燥物ケーキの外 観を改良し、そして凍結乾燥化生体分子の熱安定化に適している。列挙した処方 物は、本発明の混合物だけが所望の結果をもたらすことを、即ち、それらは完全 または部分的非晶質構造として短凍結乾燥工程で生成される安定タンパク質処方 物を安定にし得る。 以下の実施例の処方物で記述する濃度は、凍結乾燥前の溶液に関する。 実施例１． Ｈ₃ＰＯ₄を用いて、溶液のｐＨ値をｐＨ７．４に調整する。 ２ｇのＬ−アルギニンおよび１ｇのＬ−アスパラギン酸塩を５０ｍｌの水に溶 解した。３５ｍｇのＧ−ＣＳＦ（１０ｍＭリン酸緩衝液３０ｍｌ中に溶解した） をピペットでこの溶液に付加し、５分間攪拌した。その後、１００μｌのトゥイ ーン８０（１０％水性溶液として）をピペットで付加し、それをさらに２０分間 攪拌した。リン酸を付加してｐＨを７．４に調整し、全容量を１００ｍｌとした 。この溶液を膜（ＰＶＤＦフィルター０．２２μｍ）を通して濾過し、１ｍｌア リコートをガラスバイアル中に分取した。適切な停止剤を加えた後、それらを冷 凍乾燥し、合計で４０時間乾燥を実施し た。その後、分析までバイアルを密封し、異なる温度で保存した。ケーキのガラ ス遷移温度は９５℃であるということが、ＤＳＣにより判明した。２６週間後、 異なる条件下で保存したこの凍結乾燥物の試料から、Ｘ線回析スペクトルを記録 した。これらのスペクトルは、＋６０℃の温度で保存後でさえ、それが非晶質で あることを示す。 実施例２．（比較例） ＮａＯＨを用いて、溶液のｐＨ値をｐＨ７．４に調整する。 ２ｇのＬ−バリンおよび２ｇのグリシンを５０ｍｌの水に溶解した。１００μ ｌのトゥイーン８０（１０％水性溶液として）をピペットで付加し、それをさら に２０分間攪拌した。その後、ＮａＯＨを付加してｐＨを７．４に調整した。３ ５ｍｇのＧ−ＣＳＦ（１０ｍＭリン酸緩衝液３０ｍｌ中に溶解）をピペットでこ の溶液に付加し、５分間攪拌した。ｐＨを確認し、全容量を１００ｍｌとした。 バイアルに充填後、実施例１と同様にこの溶液から凍結乾燥物を調製した。ガラ ス遷移は、調製直後のこの凍結乾燥物のＤＳＣでは観察されない。Ｘ線回析スペ クトルおよび走査電子顕微鏡での画像は、ケーキが完全に結晶状であることを示 した。非晶質または部分的非晶質構造は検出されない。実施例３．（比較例） ＮａＯＨを用いて、溶液のｐＨ値をｐＨ７．４に調整する。１ｇのＬ−バリン および２ｇのグリシンを７０ｍｌの水に溶解し、１００μｌのトゥイーン８０（ １０％水性溶液として）を付加し、それを２０分間攪拌した。その後、ＮａＯＨ を付加してｐＨを７．０に調整した。３５ｍｇ（１５ｋＵ）のＬＤＨ（ブタ筋肉 から。２０ｍＭリン酸緩衝液２０ｍｌ中に溶解）をピペットでこの溶液に付加し 、５分間攪拌した。ｐＨを確認し、全容量を１００ｍｌとした。実施例１と同様 に、バイアルに充填後、この溶液から凍結乾燥物を調製した。この処方物も完全 に結晶状である。非晶質構造は全く検出されない。 実施例４． Ｈ₃ＰＯ₄を用いて、溶液のｐＨ値をｐＨ７．４に調整する。 ２ｇのＬ−アルギニン、１ｇのアスパラギン酸および１ｇのＬ−フェニルアラ ニンを７０ｍｌの水に溶解し、１００μｌのトゥイーン８０（１０％水性溶液と して）を付加し、それを２０分間攪拌した。その後、リン酸を付加してｐＨを７ ．４に調整した。５０ｍｇ（１５ｋＵ）のＬＤＨ（ブタ筋肉から。１００ｍＭリ ン酸緩衝液３０ｍｌ中に溶解）をピペットでこの溶液に付加し、５分間攪拌した 。ｐＨを確認し、全容量を１００ｍｌとした。実施例１と同様に、バイアルに充 填後、この溶液から凍結乾燥物を調製した。分析物は、多少のフェニルアラニン が結晶形態で存在することを示した。即ちケーキは一部結晶で且つ一部非晶質で ある。結晶の割合は保存中は一定のままであった。 実施例５． 室温（ＲＴ）でバイアルを保存後、処方物１および２中の非変化Ｇ−ＣＳＦの 含量をＲＰ−ＨＰＬＣにより確定した。 バイアルをＲＴで保存後（５または１３週間後）、連結光学検定で、処方物３ および４の酵素活性を確定した。 実施例６． 処方物４と同様の方法で凍結乾燥物を調製したが、しかしアルギニンを同一モ ル量の他の塩基性アミノカルボン酸に置き換えた。室温（ＲＴ）で５週間保存後 、凍結乾燥物中のＬＤＨの酵素活性を確定した。 実施例７． 酸（下記参照）を用いて溶液のｐＨ値をｐＨ６．３に調整する。 ２ｇのＬ−アルギニンを５０ｍｌの水に溶解し、酸を付加してｐＨを６．３に 調整した。１ｇのイソロイシンおよび１ｍｇのｒｈＮＧＦを付加し、全容量を１ ００ｍＬとした。この溶液を膜（ＰＶＤＦフィルター０．２２μｍ）を通して濾 過し、１ｍｌアリコートをガラスバイアル中に分取した。適切な停止剤を加えた 後、合計で４０時間の乾燥期間後に冷凍乾燥を実施した。その後、凍結乾燥物を ＤＳＣを用いて測定した。 結果： 実施例８．（比較例） Ｈ₃ＰＯ₄を用いて溶液のｐＨ値をｐＨ６．０に調整する。 ２ｇのＬ−アルギニンを５０ｍｌの水に溶解し、リン酸を付加し てｐＨを６．０に調整した。１００ｍｇのウラリチド（３０ｍｌのＨ₂Ｏに溶解 ）をピペットでこの溶液に付加し、それを１０分間攪拌した。溶液は６０分後に 濁ってきて、タンパク質が凝集した。その後、実験を終結させた。 実施例９．（比較例） クエン酸を用いて溶液のｐＨ値をｐＨ６．０に調整する。 ２ｇのＬ−アルギニンを５０ｍｌの水に溶解し、クエン酸を付加してｐＨを６ ．０に調整した。１００ｍｇのウラリチド（３０ｍｌのＨ₂Ｏに溶解）をピペッ トでこの溶液に付加し、それを１０分間攪拌した。溶液は２時間後に濁ってきて 、タンパク質が凝集した。その後、実験を終結させた。 実施例１０． バイアル当たりの以下の組成物を用いて、実施例７からの方法により、活性物 質ウラリチドを含有する凍結乾燥物を調製した。 ａ）処方物１９（比較例） １ｍｇのウラリチド １０ｍｇのマンニトール 酢酸でｐＨ６．３に調整 Ｘ線回析パターンの分析は、凍結乾燥物が完全に結晶状構造を有することを示 した。非晶質または一部非晶質構造は検出されなかった。 ｂ）処方物２０ １ｍｇのウラリチド ２０ｍｇのＬ−アルギニン １０ｍｇのＬ−イソロイシン アスパラギン酸でｐＨ６．３に調整 ＤＳＣでの評価 処方物１９： ガラス遷移は検出されない。完全に結晶状。 処方物２０： Ｔｇ＝８５．１℃。部分的非晶質構造。 処方物１９および２０はともに、室温で１年間保存した。その後のゲル電気泳 動の結果を以下に示す： 処方物１９： 二量体＞１％および可溶性凝集体。 処方物２０： １００％単量体。 実施例１１． バイアル当たりで以下の処方物組成を有する凍結乾燥物を、実施例７からの方 法を用いて調製した。 ａ）処方物２１（比較例） １ｍｇのウラリチド ５０ｍｇのスクロース １０ｍｇのグリシン アスパラギン酸でｐＨ６．３に調整 ｂ）処方物２２ １ｍｇのウラリチド ２０ｍｇのＬ−アルギニン １０ｍｇのＬ−イソロイシン アスパラギン酸でｐＨ６．３に調整 ｂ）処方物２３ ４ｍｇのウラリチド ２０ｍｇのＬ−アルギニン １０ｍｇのＬ−イソロイシン アスパラギン酸でｐＨ６．３に調整 ｂ）処方物２４ １ｍｇのウラリチド ２０ｍｇのＬ−アルギニン １０ｍｇのＬ−イソロイシン アスパラギン酸でｐＨ６．３に調整 ｂ）処方物２５（比較例） １ｍｇのウラリチド ２５ｍｇのスクロース ２０ｍｇのグリシン 処方物２１〜２５はすべて、異なる温度でのストレス試験で保存し、その後、 内容物をＲＰ−ＨＰＬＣを用いて確定した。 実施例１０および１１の結果は、本発明の処方物が、従来技術のスクロースま たはスクロース／ＰＥＧを基礎にした対応する処方物よりも温度ストレスに対し て良好にペプチドを安定化することを示す。多数の処方物中に用いられるマンニ トールは、適切に安定な処 方物をもたらさない。 実施例８および９は、緩衝系にしばしば用いられる酸はある種のペプチドの凝 集を引き起こす。これは、本発明の処方物中に用いられる酸（特にアスパラギン 酸およびグルタミン酸）では観察されなかった。 実施例１２． バイアル当たりで以下の処方物組成を有する凍結乾燥物を、実施例７からの方 法を用いて調製した。 ａ）処方物２６（比較例） １ｍｇのウラリチド １５ｍｇのグリシン ２ｍｇのＬ−イソロイシン ０．５ｍｇのポリソルベート 酢酸ナトリウム緩衝液でｐＨ６．８に調整。完全に結晶状。 ｂ）処方物２７ １ｍｇのウラリチド ２０ｍｇのＤ−アルギニン １０ｍｇのＤ−イソロイシン Ｄ−アスパラギン酸でｐＨ６．８に調整 ｃ）処方物２８ １ｍｇのウラリチド ２０ｍｇのＬ−アルギニン １０ｍｇのＬ−イソロイシン Ｌ−アスパラギン酸でｐＨ６．８に調整 ｄ）処方物２９ １ｍｇのウラリチド ２０ｍｇのＬ−トレオニン １０ｍｇのＤ−イソロイシン ｅ）処方物３０（比較例） １ｍｇのウラリチド １５ｍｇのポリエチレングリコール６０００ ５ｍｇのフェニルアラニン 処方物は、異なる温度でのストレス試験で保存し、その後、主要分解生成物を ＲＰ−ＨＰＬＣ（ピークＸ１）により確定した。 本発明の処方物中に生成されるペプチドの分解生成物は、かなり少量である。 処方物２９は非晶質凍結乾燥物ケーキを生じたが、しかしそれはタンパク質を安 定化するのに十分ではない。 実施例１３． バイアル当たりで以下の処方物組成を有する凍結乾燥物を、実施例７からの方 法を用いて調製した。 ａ）処方物３１ １ｍｇのウラリチド ７０ｍｇのスクロース １０ｍｇのＬ−フェニルアラニン ｂ）処方物３２ １ｍｇのウラリチド ８５ｍｇのスクロース ｃ）処方物３３ １ｍｇのウラリチド ４６ｍｇのラフィノース １０ｍｇのＬ−フェニルアラニン ｄ）処方物３４ １ｍｇのウラリチド ２０ｍｇのＬ−アルギニン ５ｍｇのＬ−フェニルアラニン 処方物３１〜３４はすべて、異なる温度でのストレス試験で保存し、その後、 凍結乾燥物を各々、１ｍｌの水に溶解し、再構成溶液の濁度を比濁計（Ｈａｃｈ 型）で１時間後に確定した。１．０を上回る濁度値は、許容不可能であると評価 される。補助物質は容易に説けるため、いくつかの処方物で観察される濁りはペ プチドの凝集によるものである。 結果： ＫＳ＝冷蔵庫温度 −８℃ ＲＴ＝室温 ２０〜２２℃ 本発明の処方物だけが、熱ストレス後に１．０の濁度閾値を超えなかった。 実施例１４． 実施例１１と同様に貯蔵後に種々の処方物中でウラリチドを再構成させ、光散 乱測定計器（ＰＭＳ）を用いて粒子に関して溶液を調べた。 結果：（各々の場合において、５つのバイアルの計数からの平均を述べる） 本発明の処方物は、高温で保存後に、粒子の数の重大な増大を示さない。 実施例１５． タンパク質ｒＬＮＧＦを含有する凍結乾燥物を、以下の組成物を用いて調製し た。 ａ）処方物３５ ０．０２５ｍｇのｒｈＮＧＦ ２０ｍｇのＬ−アルギニン １０ｍｇのＬ−アスパラギン酸 酢酸でｐＨ６．３に調整 ｂ）処方物３６ ０．０２５ｍｇのｒｈＮＧＦ ２０ｍｇのＬ−アルギニン １０ｍｇのＬ−アスパラギン酸 １０ｍｇのＬ−イソロイシン 酢酸でｐＨ６．３に調整 ｃ）処方物３７（比較例） ０．０２５ｍｇのｒｈＮＧＦ ２０ｍｇのＬ−アルギニン ３０ｍｇのスクロース 酢酸でｐＨ６．３に調整 ｄ）処方物３８（比較例） ０．０２５ｍｇのｒｈＮＧＦ ２０ｍｇのＬ−アルギニン ３０ｍｇのラフィノース 酢酸でｐＨ６．３に調整 凍結乾燥プログラムは通常のプログラムに比してかなり短縮された。通常の４ ０〜５０時間の代わりに合計１５時間であった。その後、２つの別々の測定で凍 結乾燥物中の残留水分を確定した。 結果： 処方物３５ ４．７％／５．０％ 処方物３６ １．０％／０．９％ 処方物３７ ５．９％／６．６％ 処方物３８ ５．６％／５．６％ 実施例は、凍結乾燥期間の短縮が、第三成分として疎水性アミノ酸を用いる場 合に特に、本発明の処方物を用いてのみ可能であることを示す。 実施例１６． タンパク質ｒｈＮＧＦを含有する凍結乾燥物を、以下の処方物を用いて調製し た： ａ）処方物３９ ０．０２５ｍｇのｒｈＮＧＦ ２０ｍｇのＬ−アルギニン １０ｍｇのβ−アラニン １０ｍｇのＬ−アスパラギン酸 酢酸でｐＨ６．３に調整 ｂ）処方物４０ ０．０２５ｍｇのｒｈＮＧＦ ２０ｍｇのＬ−アルギニン ８ｍｇのＬ−アスパラギン酸 １０ｍｇのＬ−イソロイシン 酢酸でｐＨ６．３に調整 ｃ）処方物４１ ０．０２５ｍｇのｒｈＮＧＦ ２０ｍｇのＦ−アルギニン １２ｍｇのＬ−アスパラギン酸 １０ｍｇのＬ−イソロイシン リンゴ酸でｐＨ４．５に調整 実施例１５で述べたのと同じプログラムを用いて、凍結乾燥を実施し、その後 残留水分を確定した。 結果： 処方物３９ １．２％／１．４％ 処方物４０ １．６％／１．９％ 処方物４１ ０．８％／０．９％

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ， ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，Ｌ Ｓ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ， ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，Ｅ Ｅ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，Ｚ Ｗ (72)発明者 ビンター，ゲルハルト ドイツ連邦共和国，デー―69221 ドッセ ンハイム，ヤーンシュトラーセ ２ エー

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．下記の成分： ａ）タンパク質、ペプチド、核酸および炭水化物からなる群から選択され る生体分子、 ｂ）１個または数個の塩基性Ｄ−アミノ酸またはＬ−アミノ酸、ならびに ｃ）１個または数個のアミノジカルボン酸、ヒドロキシカルボン酸、ヒド ロキシジカルボン酸またはジカルボン酸、 あるいはそれらの生理的適合性塩、を含有する凍結乾燥調製物であって、補助物 質が完全にまたは一部非晶質形態で凍結乾燥物中に存在する調製物。 ２．ｃ）で言及した添加剤対ｂ）で言及した添加剤の重量比が０．０１：１〜 ２：１の範囲である請求項１記載の凍結乾燥調製物。 ３．補助物質の総質量の１０重量％未満の量で補助物質としてポリマー（＞１ ０００Ｄａの分子量を有する化合物）を含有する請求項１〜２のいずれかに記載 の凍結乾燥調製物。 ４．補助物質の総質量の１０重量％未満の量で補助物質として糖を含有する請 求項１〜３のいずれかに記載の凍結乾燥調製物。 ５．＞５０℃のガラス遷移温度を有する請求項１〜４のいずれかに記載の凍結 乾燥調製物。 ６．冷凍溶液が凍結乾燥前に−４０℃を超えるガラス遷移温度を有する請求項 １〜５のいずれかに記載の凍結乾燥調製物。 ７．アミノカルボン酸がアスパラギン酸またはグルタミン酸である請求項１〜 ６のいずれかに記載の凍結乾燥調製物。 ８．疎水性残基を有する１つまたは数個のアミノ酸をさらに含有する請求項１ 〜７のいずれかに記載の凍結乾燥調製物。 ９．ロイシン、イソロイシン、バリンまたはフェニルアラニン、特にイソロイ シンまたはフェニルアラニンを含有する請求項８に記載の凍結乾燥調製物。 １０．水を用いて再構成された溶液が約３〜９のｐＨを有する請求項１〜９の いずれかに記載の凍結乾燥調製物。 １１．生体分子対補助物質の質量比が１：１０未満である請求項１〜１０のい ずれかに記載の凍結乾燥調製物。 １２．生体分子が心房ナトリウム排泄増加ペプチド（ＡＮＰ）類からのペプチ ドである請求項１〜１１のいずれかに記載の凍結乾燥調製物。 １３．生体分子の溶液または懸濁液が生理的耐容性溶媒中に調製され、そして ａ）１個または数個の塩基性Ｄ−アミノ酸またはＬ−アミノ酸、およびｂ）少な くとも１個または数個のアミノジカルボン酸、あるいは有機または無機酸が付加 され、その後溶液が凍結乾燥される請求項１〜１２のいずれかに記載の凍結乾燥 調製物の製造方法。 １４．凍結乾燥が５ｍＭ未満のリン酸塩含量を有する水性溶液を用いて出発し て実施される請求項１３記載の方法。