WO1998039017A1

WO1998039017A1 - Agent immunotherapeutique indique pour le cancer contenant un composant nucleoide de bacterie comme principe actif

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Publication number: WO1998039017A1
Application number: PCT/JP1997/001805
Authority: WO
Inventors: Akira Hayashi; Ichiro Azuma; Kumao Toyoshima
Original assignee: Akira Hayashi; Ichiro Azuma; Kumao Toyoshima
Priority date: 1997-03-07
Filing date: 1997-05-28
Publication date: 1998-09-11
Also published as: TW473391B; CA2283388A1; CN1248919A; EP0958826A1; US6593096B1; KR20000076018A; EP0958826A4

Description

明細書

細菌の菌体成分を有効成分とする癌免疫療法剤

発明の詳細な説明

発明の属する技術分野

本発明は、細菌の菌体成分を有効成分とする癌免疫療法剤であって、特に、免疫応答能のある患者に対して、単独療法用に用いられる新規な癌免疫療法剤である。さらに詳しくは、インターフヱロン一ァ ( I F N - r ) 等の誘導能を指標として免疫応答能が陽性の患者の術後の転移を含む再発、または 2次癌の発生を抑制することを特徴とする新規な癌免疫療法剤に関する。あるいは、 I F N—ァ等の誘導能を指標とする癌の単独免疫療法用の新規な免疫応答能の検定方法に関する。

従来の技術

癌の免疫療法剤の一つとして、細菌の菌体成分を有効成分とする癌免疫療法剤が知られており、特に B C G (Bacille Calmette-Guerin) 菌を用いての癌免疫療法剤に関しては今まで多くの治療成績が蓄積されてる。例えば、臨床における癌免疫療法に関しては特に 1960年代の後半から M athe等が急性リンパ性白血病で、 Molton等がメラノ一マで B C G免疫療法剤の効果を確認して以来、今日まで多くの報告が行われている。しかしその臨床成績として、推計学的に有意差検定（無作為割付け法による対照群との生存率）されるようになつてからは、 B C G癌免疫療法の無効例が増加している傾向にあるので、 B C G癌免疫療法そのものの有効性が疑問視され、使用されるとしても多くの場合化学療法剤等との併用で補助的に用いられるに過ぎなかった。また、 B C G以外の細菌としては、 C. parvum、 Hemolytic streptococcus、 0K432 が用いられている。し力、しな力ら、これらを用いた場合でも、 B C G同様、有効、無効の報告例に分かれ、これ CT/JP 7 5

らの評価もいまだ明確ではない。

そこで、近年になり B C G免疫療法剤においては菌体を磨砕して遠沈分画して得た細胞壁から調製された細胞骨格成分（cell wall skeleton, CW S)が使用され、副作用の回避や投与量、回数コントロールの改良が行われた。そして、阪大の山村らを中心に、 B C G— CW Sついで N. rubra- C W Sによる無作為割付け法による治験が肺癌、白血病、胃癌などで行われた。しかしながら、その結果は、推計学的有意差のある生存期間の延長が見られるものの、十分なものでなく、免疫療法としては否定的なものであつた。そして、現在では、次のような評価が定評となっていると考えられる。「その成果はすでに述べたように逆効果、無効、有意性なし、有効と免疫療法の有効性を確定しうるような一定の方向性がみられていないのが現状である。その原因はいろいろあろうが、免疫療法を補助療法として用いた群と用いなかった群とで推計学的有意差を行うことに大きな原因があり、いわば直接の抗腫瘍効果を示さない免疫療法の限界を暗示している。」（岩波講座、免疫科学 7、移植免疫と腫瘍免疫、 1984年 2/29発行、 p302) 本発明者らは、従来の B C G— CW Sの癌免疫療法の在り方に疑問を抱き、その療法の問題点を整理して、従来の療法が抗癌剤、放射線などの強力な免疫抑制効果を持つ治療法と併用されてきた点に着目した。 B C G— CW Sや N. rubra— CW S等を用いる免疫賦活療法に対して、免疫抑制効果を持つ化学療法を併用することは、それぞれの療法の特徴を相殺するものであり、治療方法として矛盾したものであると考えられた。そこで、 B C G— CW Sや N. rubra— CW S等を用いる癌免疫療法の有効性を明らかにするためには、免疫賦活を起こしやすい投与方法を確立すると共に、免疫応答能が適切に存在する患者を選択することが重要と考えられた。

そこで本発明者らは、初回治療後、化学療法等の治療と併用するのでなく、 BCG— CWSによる単独治療を試み、従来にない優れた成績が得られることを見出した（Pro. Japan Acad. , 70, Ser. Β 205-209(1994))。そして、治療を受けた患者の末梢血の分析から、 B C G— C W Sの皮内投与により、明確な I FN—ァの誘導の見られた患者は、完全治癒例を含む健康な状態で生存するが、 I FN—ァの誘導のない患者は短期間で死亡することが分かった。さらに、本発明者らは、 BCG— CWSの接種に伴う I FN—ァの誘導と抗癌効果の関係を検討し、直接に関係することを見出している（第 54回癌学会総会記事、 No.2411, 1995年) 。

発明者らは、これらの知見に基づき、細菌の菌体成分を有効成分とする癌免疫療法の単独療法を確立することを目的として鋭意検討を行った。その結果、本療法に好適な免疫応答能を保有する患者の識別のためには、細菌の菌体成分の接種後の免疫応答能の指標として I FN—ァゃ G— CSF と共に CD 28が適切であることを見出した。また、好適な免疫応答能を維持するためには、初回治療の療法によって大きい影響を受け、この初回治療の療法選択が大きな意味を持つことを見出し、これらのことより、本発明を完成した。

本発明で明らかとなった癌免疫療法の概要を以下に説明する。

B CG— CWS等を用いる免疫療法は、当然のことではあるが免疫応答能のある患者にのみ有効である。また、免疫応答能は初回治療の療法によつて大きい影響を受けることから、なるべく外科手術などにより出来るだけ癌細胞を取り除いた後、免疫応答能を低下させると考えられるあらゆる薬剤、放射線などとの併用を止め、 BCG— CWS等の単独治療が原則である o

B CG— CWS等の接種に伴い、その末梢血の構成成分には、一過性の一連の変化が見出される。その変化は次のように本免疫療法の有効性と密接に関連している。

(1) 免疫療法が有効であった患者の末梢血の構成成分変化

接種後、約 15〜約 18時間をピークとして、細胞成分としては白血球の増加、特に顆粒球の増加、リンパ球の減少（約 24時間持続）が見られる o

サイトカインとしては、 I FN—ァの増加（約 30時間持続）、 G— C SFの増加（約 1週間持続）が見られる。

T細胞表面マーカーとしては、 CD 28強陽性のリンパ球群の増加（約 4〜 6週間持続）が見られた。

(2) 免疫療法が無効であった患者の末梢血の構成成分変化

上記の細胞成分、サイトカインおよび T細胞表面マ一カーはいずれにも変化が見られなかった。

また、免疫療法が有効であった患者の中で、上記の構成成分の項目内、 CD 28について増加が見られなかった患者 3例が見出された。治療当初には、これらの患者は順調に回復、経過したが、 2年を過ぎた頃より 2名に脳転移が出現し、ともに死亡した。

このように、治療結果を予測させる免疫応答能の指標としては、末梢血の構成成分の上記変化の中で、 I FN—ァと CD 28が有効なものであると考えられる。そこで、この免疫応答能に初回治療を含めた前治療がいかに大きな影響を与えているかを、特に、 I FN—ァの誘導能で確認し、次の知見を得た。

( 1 ) 化学療法や放射線療法などの免疫応答能に影響を与える前治療を受けていない患者では、 BCG— CWS単独療法により約 90%の患者に I FN—ァの誘導が見られた。

( 2 ) 化学療法や放射線療法などの免疫応答能に影響を与える前治療を受けた患者では、 BCG— CWSの単独療法を行っても、約 30%の患者に I FN—ァの誘導が見られるにとどまった。

(3) さらに、生存率に関しても次のように大差が見られた。 I FN—ァが誘導され、陽性であった患者の約 90%が BCG— CWS治療開始後 6 力月以上生存している。一方、 I FN—ァが誘導されなかった、陰性の患者では、約 20 %が B C G— C W S治療開始後 6力月以上生存するにとどまつた。

以上のことから、 BCG— CWS等の癌免疫療法としては、なるべく外科手術などにより出来るだけ癌細胞を取り除いた後、免疫応答能を低下させると考えられるあらゆる薬剤、放射線などとの併用を止め、 BCG— C WS等の単独治療が望ましいことが明らかとなった。

これらの知見に基づき、本発明の要旨は、次のように示される。

(1)皮内投与により、癌患者に血中 I FN—ァおよび CD28強陽性のリンパ球群の増加を指標とする免疫応答能を誘導し得る細菌の菌体成分を有効成分とする、単独療法用の癌免疫療法剤。

(2) 次の患者に投与され、再発または 2次癌の発生を抑制することを特徴とする上記（1)記載の癌免疫療法剤。

(a)免疫能の低下を起こしていない患者であり、

(b)脳、肝臓、骨を含む遠隔転移を有しない患者。

( 3 ) 初回治療によつて寬解導入または原発巣除去手術を受けた癌患者に投与することを特徴とする上記（2)記載の癌免疫療法剤。

(4)癌患者が固形癌を有する患者であり、初回治療が外科手術であることを特徴とする、上記（3)記載の癌免疫療法剤。

(5)癌患者が非固形癌を有する患者であり、初回治療が化学療法であることを特徴とする、上記（3)記載の癌免疫療法剤。 (6) 癌のリンパ節転移を治療することを特徴とする、上記（1) 記載の癌免疫療法剤。

(7) 患者が肺癌患者であることを特徴とする、上記（1) 記載の癌免疫療法剤。

(8) 細菌の菌体成分を皮内投与された癌患者由来の血液に含まれる I F N—ァおよび CD 28マーカーを測定することからなる単独免疫療法の免疫応答能の検定方法。

本発明の第 1の態様は、細菌の菌体成分を有効成分とする、単独療法用癌免疫療法剤であって、細菌の菌体成分としては、公知の抗腫瘍免疫アジュバント（岩波講座免疫科学 7、 265頁表 5.2、 1984年発行）であれば適用可能であり、例えば、好ましいものとしては B CG— CWS、 N. rubra - CWS等が挙げられる。なお、より好ましいものとしては、 BCG— CW Sが挙げられる。

本発明の単独療法用の癌免疫療法剤は、好ましくは皮内投与により血中 I FN— 7および CD28マーカーの上昇を指標とする免疫応答能を誘導された患者に投与される。

本発明の単独療法用癌免疫療法剤は非特異的免疫療法剤であるため、ほとんどあらゆる癌に対応し得ることができる。例えば、肺癌、胃癌、大腸癌、乳癌、舌癌、咽頭癌、急性骨髄性白血病、脖臓癌、卵巣癌等の癌の免疫療法剤として使用することができる。

現在までに 181例の癌患者に本発明の単独療法用癌免疫療法剤を使用したが、肺癌が最も多く Ί 5例であった。それ以外に胃癌、大腸癌、乳癌などほとんどあらゆる癌を含んでいた。

本発明の第 2の態様は、癌患者の中でも本発明の癌免疫療法剤の好適な対象としては、次の患者であることを示している。 CT JP 01805

(a) 免疫能の低下を起こしていない患者であり、

(b) 脳、肝臓、骨を含む遠隔転移を有しない患者。

さらに、本発明の癌免疫療法剤を癌継続維持療法として使用することにより、癌の転移を含む再発または 2次癌の発生を抑制できることを示している。

本発明の第 3の態様は、初回治療によつて寬解導入された急性骨髄性白血病等の患者や外科手術により癌の原発巣の除去手術を受けた癌患者に本発明の癌免疫療法剤を投与することが好ましいことを示している。

本発明の第 4の態様は、固形癌を持つ患者に対して、外科手術により癌の原発巣をできるだけ削除し、しかる後に本発明の癌免疫療法剤を単独で投与することが好ましいことを示している。固形癌としては、肺癌、胃癌、大腸癌等の癌を挙げることができる。好ましいものとしては、肺癌を挙げることができる。

本発明の第 5の態様は、非固形癌を持つ患者に対して、初回治療として化学療法を用いて、寛解導入したのち本発明の癌免疫療法剤を投与することが好ましいことを示している。非固形癌としては、白血病等が挙げられる。好ましいものとしては、急性骨髄性白血病が挙げられる。

本発明の第 6の態様は、本発明の癌免疫療法剤が癌の原発巣から癌が転移することを抑制すると共に、特にリンパ節に転移した癌については特に有効であることを示している。免疫応答能のある患者、即ち、 I F N—ァの誘導陽性の患者では明らかに効果が顕著であり、かなり大きなリンパ節転移でも消失することが認められた。なお、転移の中でも、肝臓、脳、骨などにおいて、免疫療法開始前にすでに、そこに転移しているものでは、例え I F N— 7の誘導陽性の患者でも効果は乏しいことが示されている。また、本発明の癌免疫療法剤、特に B C G— CW S免疫療法剤がリンパ節転移に有効な理由は、 CTL (Cytotoxic T lymphocyte. 各癌特異的に作用）の活性化と CD28が直接関係するからであると考えられる。すなわち、 CD28量の上昇は、 CD 28強陽性のリンパ球群の増加、すなわち癌特異的 C T Lの活性化を意味する。

本発明の第 7の態様は、本発明の癌免疫療法剤が肺癌患者に対して用いられることを示している。後述するように、最も症例数の多い肺癌患者について最も詳細に本発明の癌免疫療法剤の効果が解析されている。

本発明の第 8の態様は、本発明の癌免疫療法剤を投与するに好適な患者の末梢血の検定方法である。具体的な検定方法としては、例えば、 I FN 一 7の誘導能の測定法としては、 BCG— CWSを 100ァあるいは 20 0ァ接種前および接種後の 18時間目に採血し、末梢血中の I FN—ァの量を測定し、 I FN—ァの誘導能が陽性か陰性かを判定する。なお、測定の時期としては、 B C G— CWSに対する免疫応答が誘発される感作期の第 4回目と治療期の第 1回目が適切で、それにより免疫療法の継続の当否を早期に判定することもできる。また、末梢血中のリンパ球のうち CD 2 8強陽性のリンパ球群は、公知の方法、例えばフローサイトメトリ一法によって測定することができる。

さらに、本態様は、単に、初回治療に引き続いて実施する癌継続維持療法として、単独免疫療法を受けるにふさわしい担癌患者の検定方法にとどまらず、免疫療法が不適切で他の治療法の必要性を評価検定する方法ともなり得るものである。従って、 I FN—ァの誘導能の高い患者には、外科的手術と BCG— CWSを用いる単独免疫療法が好適であり、 I FN—ァの誘導能のない患者には他の治療法を早期に実施することができる。このようにして、初回治療に引き続き患者の免疫能に応じた適切な治療計画が実施可能となる。 BCG— CWS接種液の調製

BCG— CWSは、文献記載の方法（Azumaら， J. Natl. Cancer Inst. 52: 95-101 (1974)) に従って調製できる。

BCG— CWS接種液は、文献記載の方法（Hayashi, A.； Pro Japan Acad. , 70, Ser. Β (1994))に準じて調製できる。

すなわち、 B CG— CWS粉末を 5mlグラインダ一チューブ (grinder t ube)に入れ、これに 26G注射針を用いて BCG— CWS lmgに対して 1 滴の割合で鉱物油（Drakeol-6VR; Pennsylvania Refining Co. , Butler, U.S.A.) を加え、その後むらなくペースト状になるまでホモゲナイズする。これに、 1.1% Twe e n 80加生理的食塩水を加え、ホモゲナイズする。 BCG— CWSを含む小油滴の均一懸濁液は最終濃度 1 mg/mlである。この Oil attached B C G— CWS懸濁液を 60 °Cで 30分間殺菌する。接種スケジュール

8〇0—じ 3は、常に単独接種が原則である。

接種スケジュールは、感作期と治療期に分けられる。感作期には通常 2 007の BCG— CWSを週 1回、計 4回上腕外側皮内に左右交互に接種する。次いで治療期には 4週おきに左右交互に接種を反復する。この治療期の投与量は、患者の生体反応により、 10から 250 Ί 好ましくは 2 5から 200ァの範囲で決められる。

投与量決定の指標となる生体反応

投与量決定の指標となる生体反応は局所的生体反応と全身的生体反応に分けられる。

(1) 局所的生体反応

主に注射局所の皮膚反応が挙げられる。具体的には発赤、硬結、さらには潰瘍形成である。また、局所リンパ節の腫脹、すなわち注射局所から所属リンパ節に至るリンパ管炎およびリンパ節炎も局所的生体反応として希に起こることがあるが、いずれも一過性である。

(2)全身的生体反応

患者自身の感受性と接種量との関係で、以下のごとき一過性の過剰反応を訴えることがあるが、減量により症状を軽減することができる。

臨床症状：全身倦怠感、発熱、食思不振、時に悪心、嘔吐である。臨床検査：白血球増加症、 C反応性タンパク（CRP)上昇、時に軽度の GOT、 GPT上昇である。

上記局所的、全身的生体反応のみられない患者には、 8じ0— 0"\ 3による免疫療法の効果は期待できない。

I FN— y誘導能の測定

I FN— 7誘導能を測定することによって、 B CG—CWSによる免疫療法の効果を予測することができる。

本測定は、感作期の 4回目（S4) と治療期の 1回目（T1) に実施する。それぞれ、 BCG— CWS接種前および接種後 18時間目に採血し、末梢血中の I FN—ァを測定する。 BCG— CWS接種により、 I FN— 7量が 35pg/ml以上増加した場合、 I FN—ァ誘導能は陽性と判断される。

CD 28誘導能の測定

上記と同様に CD 28誘導能を測定することによって、 BCG— CWS による免疫療法の効果を予測することができる。 B C G— CWS接種前および接種後 18時間目に採血し、末梢血中のリンパ球のうち CD28強陽性のリンパ球群の増加を測定する。

図面の簡単な説明

図 1は、 B C G— CWSの単独免疫療法を受けた急性前骨髄性白血病患 5

者の臨床経過を示す図である。

図 2は、 100ァの BCG— CWSを皮内接種した後の生物学的指標の経時変化を示す。測定時期は、接種前及び接種後 18時間、 42時間、 7 日、 15日、 21日、 28日である。図 2 Aは末梢血サイトカイン量（G 一 CSF、 I L— 12、 I FN—ァ）を示し、図 2 Bは末梢血中の血液細胞数（白血球、赤血球、血小板）を示し、図 2 Cは末梢血中の白血球数（顆粒球、リンパ球、単球）を示す。

図 3は、 BCG— CWS単独で治療された患者の I FN—ァ誘導試験および予後に対する免疫抑制療法の影響を示す。図中の「免疫抑制治療」とは、 B C G— C W S免疫療法前の化学療法およびノまたは放射線療法である。 I FN— y誘導試験の結果は、感作期の 4回目（S 4) あるいは治療期の 1回目（T1) に得られた結果である。生存あるいは死亡は、 BCG 一 CWS免疫療法開始後、 6力月の時点で判定した。

図 4は、 BCG— CWS単独免疫療法により治療した癌患者数を癌の種類別に示したものである。

図 5は、原発性肺癌（非小細胞肺癌）について、外科手術可能で外科手術後 BCG—CWSによる単独免疫療法を受けた患者の生存曲線と、 19 88年から 1989年に大阪府立成人病センターで外科手術を受けた歴史的コントロールの生存曲線とを比較した図である。有意差検定の結果は、進行度 Iでは、 Log-Rank法で p=0.2287、 Wilcoxon法で p=0.2313、進行度 I Iでは、 Log-Rank法で p=0.2037、 Wilcoxon法で p=0.2115であり、進行度 I I Iでは、 Log-Rank法で p=0.0009、 Wilcoxon法で p==0.0012であつた。

図 6は、 BCG— CWSによる単独免疫療法を実施している原発性肺癌患者において、外科手術可能例と外科手術不能例を比較した図である。図 7は、頸部リンパ節に転移を有する、肺癌（大細胞癌）患者の症例において、このリンパ節転移に対し放射線療法を実施した後、かつ BCG— CWSによる癌免疫療法前の頸部 CTスキャンの写真の模写図である。図 8は、頸部リンパ節に転移を有する、肺癌（大細胞癌）患者の症例において、 BCG— CWSによる癌免疫療法を開始して約 1年半後の頸部 C Tスキャンの写真の模写図である。

図 9は、 BCG— CWS免疫療法が有効であり、現在健康な状態で生存している患者において、 100ァの BCG— CWSを皮内接種した後の末梢血の構成成分の経時変化、特に co— s t imu l a t o ry s i g n a 1 CD 28の経時変化を示す。測定時期は、接種前および接種後 1 8時間、 42時間、 1、 2、 3、 4、 5、および 6週間である。図 9 Aはリンパ球表面マーカー量（CD 28および CD 46) を示し、図 9 Cは末梢血中の白血球数（顆粒球、リンパ球、単球）を示す。

図 10は、 B CG— CWS免疫療法が有効であった患者 7例において、 100ァの B CG— CWSを皮内接種した後の c 0 - s t i mu 1 a t o r y s i gna l C D 28マーカーの変化を示す。測定時期は、接種前および接種後 18時間である。 4例（S. H. 、 S a. H. 、 E. T. 、 K. 0. ) に CD 28マーカ一の上昇が認められた。

実施例

以下、本発明の一例として実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例によりなんら限定されるものではない。

実施例 1

長期生存例

(第 1例）

長期生存例の第 1例は典型的な急性前骨髄性白血病患者である。大阪大学第 3内科の外来患者で、完全寛解導入後に単独免疫療法を始めるために大阪府立成人病センターに移された。図 1に示されるように、化学療法により比較的簡単に寛解導入されたが、 PSK (クレスチン）の治験に組み込まれていた等の問題があり、 BCG— CWS単独の免疫療法が不規則になり、約 1年半で再発した。その後、化学療法を反復することなく、本格的な BCG— CWS単独療法を開始したところ約 3週間でァゥエル小体（A uer body) は完全に消失し、その後、再発もなく 22年を経た現在、健康で普通の生活を送っている（図 1参照）。

B C G— CWS単独療法により、再発した急性前骨髄性白血病が完全に治癒した初めての例である。

(第 2例）

第 2例は、長期生存固形癌（大腸癌）患者の例で、 72才の女性であつた。腸閉塞で発病し、外科手術、術後の化学療法を実施しながら経過を見て居たところ、一旦順調に低下してきた CEA (癌胎児性抗原： carcinoe mbryonic antigen)が再び上昇し始め、同時に癌性腹膜炎を併発してきた。この患者に、 BCG— CWSによる単独免疫療法を始めたところ、腹水は消失し、 CE Aは完全に正常化し、 2度と出現することはなかった。この患者は、 15年生存し、 87才で死亡した。

(第 3例）

長期生存例の第 3例は急性骨髄性白血病患者である。寛解導入に成功後、すぐ BCG— CWSによる単独免疫療法を始めることができ、その後再発もなく、 20年になろうとしている現在、健康である。

(第 4例）

第 4例は、肺癌（大細胞癌）の女性患者である。外科手術が可能であつたので手術を実施し、 BCG— CWSの単独免疫療法により、 6年後の現在も健康であり、後に免疫療法の効果判定の指標である I FN—ァ発見のきっかけとなった患者である。

実施例 2

B C G— C W S接種に伴う生物学的指標の経時変化

BCG— CWS接種後の患者から血液を採取し、測定可能な約 12種類のサイトカインを通常の EL I S A法により、測定した。その結果、 G— CSF、 I L一 6および I FN—ァの 3種類が末梢血に出現することがわかった。

図 2は 100 yの BCG— CWSを皮内接種した後の生物学的指標の経時変化を示す。図 2 Aは末梢血中サイトカイン量（G— CSF、 I L一 1 2、 I FN-r) を示し、図 2 Bは末梢血中の血液細胞数（白血球、赤血球、血小板）を示し、図 2 Cは末梢血中の白血球数（顆粒球、リンパ球、単球）を示す。

8じ0—じ 3接種後、約 15〜約 18時間をピークに G— CSF、 I FN—ァが、特に I FN—ァが著明に誘導されたが I L— 12は出現しなかった。同時に、白血球増加症（leukocytosis)と血小板減少症 (thrombo cytopenia)、さらに顆粒球増加症（granulocytosis) とリンパ球減少症（1 ymphopenia)が出現した。印象的なことは、 I FN—ァが約 30時間でほどんど消失することであった（図 2参照）。

実施例 3

BCG-CWS単独で治療された患者の I F N—ァ誘導試験および予後に対する免疫抑制療法の影響

現在までに 117名の患者について I FN—ァ誘導テストを実施することができた。その結果を、 BCG— CWSの単独免疫療法を開始する前に抗癌剤や放射線のような免疫抑制的に働く治療を受けたか、受けていないかに分けて解析した。図 3のように、 I FN—ァ陽性率は免疫抑制治療を 7 805

受けたグループでは約 3割と低く、免疫抑制治療を受けないグループでは約 9割と高かった。これら I F N— y陽性者は免疫抑制治療とは関係なく、約 9割が BCG— CWS治療開始後 6ヶ月以上生存していた。一方、 I F N- 7陰性者は逆に生存者が少なく、約 2割が BCG— CWS治療開始後 6ヶ月以上生存するにとどまつた。

この結果は、患者の免疫力に対する抗癌剤や放射線の影響がいかに大きいかを示すものであって、 BCG— CWSを抗癌剤や放射線療法と併用せず単独で用いることが好ましいことを示すものである。

実施例 4

BCG-CWS単独免疫療法により治療した癌患者

現在までに 181例の患者に単独免疫療法を実施したが、図 4に示すように肺癌が最も多く 75例、以下胃癌、大腸癌、乳癌などはほとんどあらゆる癌を含んでいる。進行度（ステージ： stage)別では、 I V期が最も多い（図 4) 。

実施例 5

原発性肺癌患者に対する術後単独免疫療法の影響

最も症例数の多い原発性肺癌（非小細胞肺癌）について、外科手術後に BCG— CWSによる単独免疫療法を受けた患者と、 1988年から 19 89年に大阪府立成人病センターで外科手術を受けた歴史的（historical) コントロールの経過をそれぞれ K a 1 a n-Me y e r法により解析し、得られた生存曲線を比較した（図 5) 。その結果、 BCG— CWSによる単独免疫療法は進行度 I、 I I、 I I Iを通してすべて生存しており、特に進行度 I I Iでは、明らかにかって報告されたことのないほど大きな有意差が得られた (Log- Rank法で p=0.0009、 Wilcoxon法で p=0.0012)。

実施例 6 BCG— CWSによる単独免疫療法を実施している原発性肺癌患者肺癌患者の B C G— C W Sによる単独免疫療法例において、外科手術可能例と不能例を比較した（図 6)。手術可能例において、前述の進行度 I、 I I、 I I Iと比較して進行度 I Vで強いて手術した例は予後が悪く、約 8割が死亡した。さらに、手術不能例では、進行度 I I I、 I V、特に I Vが圧倒的に多く、予後も非常に悪かった。これらの患者の大部分は、抗癌剤や放射線療法のため免疫力が極端に低下した患者が多いため、免疫療法の対象にならないものが多く、また I FN—ァ誘導が認められた患者でも、脳、肝、骨などへの遠隔転移を有する患者ばかりであった。

実施例 7

リンパ節転移に対する治療効果例

肺癌（大細胞癌）患者の症例（男性）において、頸部リンパ節に転移したため、このリンパ節転移に対し放射線療法を実施したが大きな効果がなかった（図 7、放射線療法後、免疫療法前の CTスキャン写真の模写図参照）。

本患者に対し、 BCG— CWSによる癌免疫療法を実施したところ、治療開始してから 6ヶ月後に頸部リンパ節の腫大がほぼ消失した。治療開始後約 1年半においても頸部リンパ節の腫大は認められなかった（図 8、免疫療法後の CTスキャン写真の模写図参照）。

実施例 8

BCG— CWS接種に伴う末梢血構成成分の変化と免疫療法の有効性との関係

B CG— CWSの接種に伴い、その末梢血の構成成分には、一過性の一連の変化がみいだされた。その変化は次のように本免疫療法の有効性と密接に関連していた。 P TJP97/01805

(1) 免疫療法が有効であった患者の末梢血の構成成分変化

免疫療法が有効であり、現在健康な状態で生存している患者 6例において、 BCG— CWS接種後、約 15〜約 18時間をピークとして、細胞成分としては白血球の増加、特に、顆粒球の増加、リンパ球の減少（約 24 時間持続）がみられ、サイトカインとしては、 I FN—ァの増加（約 30 時間持続）、 G— CSFの増加（約 1週間持続）がみられた。 T細胞表面マーカーとしては、 CD28の増加（約 4〜約 6週間持続）がみられた。図 9には、 BCG— CWS免疫療法が有効であり、現在健康な状態で生存している患者のうち 1例の末梢血の c o— s t imu l a t o r y s i gn a 1 CD 28の経時変化が示されている。

CD 28を含む T細胞表面マーカーの測定に用いた試料および方法は次の通りである。

1. 試料：

リンパ球：通常の方法により、 £0丁八加全血に i c 01 1 P 1 a qu e (フアルマシア社製）を加えて精製し、調製後 2時間以内に使用した。

抗体； CD 28に対するモノクローナル抗体は生化学工業より購入し、 CD 46に対するモノクローナル抗体は、大阪成人病センター研究所で調製したものを使用した。

2. フローサイトメトリー：精製したリンパ球を該モノクローナル抗体とィンキュベートし、通常の方法で洗浄、固定後、 Ep i c s P r 0 f i

1 e I I (コールター社製）により解析した。

図 10は、前記の免疫療法が有効であった患者 6例のうち 4例（S. H. 、 Sa. H. 、 E. T. 、 K. 0. ) および他の有効例 3例（Su. H.. . H. D. 、 N. U. ) にっき、 B CG— CWS接種前および接種後の CD 28マーカーを比較した結果を示す。 I FN—ァの増加などの上記の項目のうち、図 10に示すように CD 28マーカ一の増加が認められなかった患者 3例（S u. H. 、 H. D. 、 N. U. ) はいずれも順調に経過したが、 2年を過ぎた頃 2例に脳転移が出現し、 2例ともに死亡した。残る 1 例は 3年を経た現在も健康である。

( 2 ) 免疫療法が無効であつた患者の末梢血の構成成分変化

免疫療法が無効であった患者 1例においては、上記の細胞成分、サイト力イン（特に I FN—ァ）および T細胞表面マ一カー（特に CD 28) のいずれにも変化がみられず、経過は良くない。

発明の効果

化学療法や放射線療法とは異なり、次のような利点を有する癌免疫療法剤が提供される。

(1) 治療効果の質が良く完全治癒が見込まれ、長期生存例でも転移を含む再発や 2次癌の発生がみられない。

(2) 何よりも経費が安い。

( 3 ) この治療法は分類すると識 -specific active immunotherapyになるが、ほとんどあらゆる癌に対応することができ、患者体内では癌に対して特異的に働くキラー細胞が作られていると考えられる。

(4)皮廣の傷を除いて QOL (quality of life) は高い。

(5) I FN—ァおよび CD 28をマーカーとして治療効果をかなり正確に評価することができ、効果が期待できなければ他の方法に転換が可能。

(6)操作はきわめて簡単で、計算上は 1人の医師が約 500人の癌患者と同時進行で治療することも可能。

(7)現在実用化されている膀胱癌に対する BCG生菌と違い、結核感染の心配が全くなく、注射局所への混合感染もない。

Claims

請求の範囲

1 . 皮内投与により、癌患者に血中 I F N—ァおよび C D 2 8強陽性のリンパ球群の増加を指標とする免疫応答能を誘導し得る細菌の菌体成分を有効成分とする、単独療法用の癌免疫療法剤。

2. 次の癌患者に投与され、再発または 2次癌の発生を抑制することを特徴とする請求項 1記載の癌免疫療法剤。

( a ) 免疫能の低下を起こしていない癌患者であり、

( b ) 脳、肝臓、骨を含む遠隔転移を有しない癌患者。

3. 初回治療によつて寛解導入または原発巣除去手術を受けた癌患者に投与することを特徴とする請求項 2記載の癌免疫療法剤。

4. 癌患者が固形癌を有する患者であり、初回治療が外科手術であることを特徴とする、請求項 3記載の癌免疫療法剤。

5. 癌患者が非固形癌を有する患者であり、初回治療が化学療法であることを特徵とする、請求項 3記載の癌免疫療法剤。

6. 癌のリンパ節転移を治療することを特徴とする、請求項 1記載の癌免疫療法剤。

7. 患者が肺癌患者であることを特徴とする、請求項 1記載の癌免疫療法剤。

8. 細菌の菌体成分を皮内投与された癌患者由来の血液に含まれる I F N—ァおよび C D 2 8マーカーを測定することからなる単独免疫療法の免疫応答能の検定方法。