TW473391B - Pharmaceutical compositions for cancer immunotherapy containing BCG-CWS as an active ingredient - Google Patents

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Α7 Β7 五、發明説明（Ί 本發明所屬之技術領域 本發明係一種以細菌之菌體成分作為有效成分之癌免疫 療法劑；特言之，得、一種針對具有免疫反應能力之患者且 係用於單獨療法之新穎癌免疫療法劑。更詳細言之，本發 明係關於一種新穎的癌免疫療法劑，其特徵在於係以對^ 擾素-7* (IFN- 丫）等之誘導能力作為指標，且其所引發之免 疫反應能力可抑制包括陽性患者手術後之轉移作用在内之 再發現象，或抑制2次癌症之發生。另一方面，本發明亦 ，於一種以對IFN_T等之誘導能力為指標且係用於癌症之 單獨免疫療法之新穎免疫反應能力檢定方法。 技術背景 在癌症之免疫療法劑中，已知有以細菌的菌體成分作為 有效成分之癌免疫療法劑’特別是在利用Bcg菌（卡介氏芽 孢杯菌，Bacille Calmette-Guerin)作為癌免疫療法劑方面， 到目前為止已累積許多治療成績。 例如，在臨床上的癌症免疫療法方面，特別是自196〇年 代後期’ Mathe等人以急性淋巴性白血病、M〇it〇n等人以惡 性黑色素腫瘤確認了 BCG免疫療法劑之效果以來，迄今已 有多篇相關報告發表。然而’作為其臨床成績而言，自從 漸採用統計學上的顯著性差異檢定（即與隨機分組法所取樣 之對照组間之存活率差異）之後，BCG癌症免疫療法之無效 案例漸有增加的趨勢’使得BCG癌症免疫療法本身之有效 性因而受到質疑，即使決定採用之，在多數情況下亦只不 過是與化學療法劑等併用，僅為補助性的手段罷了。另 -4- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) ^ 9ί ,. A7 • B7 五、發明説明（2 ) 夕卜，也有C. parvum 、溶血性鏈球菌（Hemolytic streptococcus)及OK432等被作為BCG以外的細菌使用。然 而在使用此些細菌之案例中，與BCG同樣地亦知存在著有 效及無效之報告，因此對其等之評價亦尚未明確。 近年於BCG免疫療法劑方面，係使用將菌體磨碎、離心 沉澱分層後所得到之細胞壁加以調製而成之細胞壁骨架成 分（cell wall skeleton, CWS)，在副作用之避免上，以及投 予量與次數控制上進行改良。然後，以阪大之山村等人為 中心，就BCG-CWS方面以肺癌、白血病及胃癌等為對象， 由隨機分組法進行N. rubra-CWS之療效試驗。然而，雖由 其結果可見到其存活期間之延長確已具統計學上之顯著差 異，但此等延長卻非十分足夠，因此其能否作為免疫療法 之用，答案仍為否定的。此外，目前一般已漸將下述之看 法視為定論：「其成果既如所述，係屬於尚未見到有『一 定方向性』存在之情況，亦即能確定該免疫療法之有效性 究為逆效果、無效、無意義、或是確實有效之一定結論。 原因應有很多，但由以往之檢定法皆係利用以免疫療法作 為補助療法來使用或不使用之二組進行統計學上之顯著性 差異檢定，可知此等檢定法在其原因中應占有極大之地 位，可以說其暗示著未表現直接抗腫瘤效果之免疫療法之 界限。」（岩波講座，免疫科學7，移植免疫與腫瘤免疫， 1984年2月29日發行，第302頁）。 本案之發明人等對於以往的BCG-CWS癌免疫療法究應有 何效果抱持著疑問，而將該等療法之問題點加以整理，並 -5- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐） “乃、9ί 、. A7 - B7 五、發明説明（3 ) 著眼於將以往療法與抗癌劑及放射線等具有強力免疫抑制 效果之治療法予以併用所造成之問題。對於以BCG-CWS或 N. rubra-CWS等進行之免疫活化療法，發明人認為，其與 具免疫抑制效果之化學療法的併用，將使各種療法之特徵 相互抵消，就作為治療方法而言，實屬矛盾之舉。由此， 為使利用BCG-CWS或N. rubra-CWS等之癌症免疫療法的有 效性得以明確，發明人認為，如何確立易於引起免疫活化 之投予方法，以及如何選擇具有適當免疫反應能力之患 者，應為極重要之課題。 因此，本案之發明人等在初次治療後，不併用化學療法 等治療手段，而嘗試僅以BCG-CWS進行單獨治療，竟發現 從未有過之優異療效（Pro. Japan Acad.，70, Ser. B 205-209 (1 994))。接著，由對接受治療之患者的末梢血液所作之分 析，而確認其IFN- r已因BCG-CWS之皮内投予而受到顯著 誘導之患者，乃是以健康的狀態（包括完全治療之案例）存 活；但未見IFN- r之謗導現象的患者，卻在短時間内即告 死亡。本案之發明人等針對此種伴隨著BCG-CWS接種而發 生之IFN- r謗導現象與抗癌效果間的關係進一步進行研 究，發現其間確存在有直接關聯（第5 4次癌學會總會記 事，No. 241 1，1995 年）° 本案之發明人等即基於前述識見，以確立將細菌菌體成 分作為有效成分之癌免疫療法的單獨療法為目的，作了十 分深入之探討。結果發現，若要辨別何種患者為保有適於 本療法之免疫反應能力者，以IFN- r或G-CSF等、以及 -6- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 9( . Α7 ‘ Β7 五、發明説明（4 ) CD28作為接種細菌菌體成分後之免疫反應能力指標，最為 恰當。此外，亦發現若要維持適當的免疫反應能力，則因 其係受到知次治療之療法極大的影響，故而此等初次治.療 之療法的選擇實具有重要意義。由此而完成本發明。 以下茲說明由本發明而確立之癌免疫療法的概要内容： 以BCG-CWS等進行之免疫療法，無庸置疑地乃是僅對具 有免疫反應能力之患者有效。此外，由於免疫反應能力會 因初次治療之療法而受到極大的影響，因此應儘可能在以 外科手術等取出癌細胞後，停止與一切被認為會降低免疫 反應能力之藥劑及放射線等之併用療程，而僅以BCG-CWS 等所進行之單獨治療為原則。 伴隨著BCG-CWS等之接種，可發現其末梢血之構成成分 將有一時性之一連串變化。此等變化如下所述，係與本發 明免疫療法之有效性具有極密切之關聯： (1)免疫療法有效之患者的末梢血構成成分變化 接種後，以約1 5 - 1 8小時為高峰，可見其細胞組成中白 血球增加，特別是顆粒球增加，與淋巴球減少（持續約2 4 小時）之現象。 在細胞動素方面，可見其IFN- T增加（持續約3 0小時）及 G-CSF增加（持續約卜〗、時）之現象。 在T細胞表面之標記方面，可見CD28強陽性之淋巴球群 有增加現象（持續約4-6週）。 (2 )免疫療法無效之患者的末梢血構成成分變化 前述的細胞组成、細胞動素及T細胞表面標記，無一見 -7- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 4 乃、9ί . A7 * B7 五、發明説明（5 ) 到有任何變化。 此外，在.對免疫療法有效之患者中，於前述構成成分項 目之CD28方面，發現有3例未見增加現象之患者。在治療 當初，此等患者皆順利地恢復並癒後，但過了二年之後， 其中二名出現腦轉移現象，而相繼死亡。 由上所述，發明人等認為，就作為可預測治療結果之免 疫反應能力指標而言，IFN- r與CD28係前述末梢血構成成 分之變化中較為有效者。因此，包括初次治療在内的前治 療，對於此等免疫反應能力究能發揮多大影響，利用特別 是IFN- 7之謗導力對該等影響加以確認後，可得到如下見 解： (1)在尚未接受會影響免疫反應力之化學療法或放射線療 法等前治療手續之患者中，約有90%之患者可因BCG-CWS 單獨療法而見到IFN- r之誘導現象。 (2 )在已接受會影響免疫反應力之化學療法或放射線癆法 等前治療手續之患者中，即使施以BCG-CWS之單獨療法， 亦只能見到約30%之患者有IFN- r誘導現象。 (3 )另外，即使在存活率方面亦可見到如下之巨大差異： 於IFN- 7經謗導、屬陽性之患者中，約有90%在BCG-CWS 治療開始後仍可存活6個月以上。然而IFN- r未受誘導、屬 陰性之患者中，卻只見約20%者在BCG-CWS治療開始後可 存活6個月以上。 由以上可知，採用BCG-CWS等癌症免疫療法時，的確應 儘可能在以外科手術等取出癌細胞後，避免與一切被認為 -8 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐）

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可降低免疫反應力之藥劑及放射”之併用療程，而 以BCG-CWS進行單獨治療為佳。 基於此等見解，茲將本發明之要旨敘述如下： ⑴-種用於單獨療法之癌免疫療法劑，其係以細菌之菌 體成分作為有效成分’·該細菌菌體成分可因皮内投予而對 癌症患者誘導以血中IFN· r與CD28強陽性淋巴球群之増加 為指標之免疫反應能力。 61 (2)上述（1)所載之癌免疫療法劑，其特徵在於+ 列患者時，可抑制再發或2次癌之發生： 、 (a) 尚未引起免疫能力低下之患者；及 (b) 典腦、肝臟及骨等器官遠距轉移現象之患者。 ()上t ( 2 )所載之癌免疫療法劑，其特徵在於係投予因 初次治療而緩冑之患纟或是投予接受過原發病少土除去手術 之癌患者。 (4)上述（3)所載之癌免疫療法劑，其特徵在於所謂之癌 患者係指罹患固形癌者；而所謂之初次治療則係指外科手 術。 (5)上述（3)所載之癌免疫療法劑，其特徵在於所謂之癌 …者係& U非固形癌纟：而所謂之初次治療則係指化學 療法。 (6 )上述（1 )所載之癌免疫療法劑，其特徵在於係用於治 療癌之淋巴結轉移作用。 (7)上述（1 )所栽之癌免疫療法劑，其特徵在於該癌症患 者為肺癌患者。 •9· 10X297 公釐） 4 乃、9( A7 I----J__B7 五、發明説明（7 ) (8) —種單獨免疫療法之免疫反應能力檢定方法，此方法 係由敎取自經皮内投予細菌菌體成分之患者的血液中所 含的IFN-γ及CD28標記所構成。 本發明之第丨種態樣係以細菌之菌體成分作為有效成分， 且係用於單獨療法的免疫療法劑；其中適於作為細菌菌體 成分者如習知之抗腫瘤免疫佐藥（岩波講座免疫科學7，265 頁表 52，1984年發行），例如BCG-CWS、N. rubra-CWS 等 S為較佳的選擇。而更佳者則有BCG_Cws等。 本發明 < 單獨療法用癌免疫療法劑，較佳係投予可經皮 内投予而i秀導以血中IFN_r及⑽以票言己之上 疫反應能力的患者。 免 由於本發明之單獨療法用癌免疫療法劑係屬非特異性之 免疫療法劑，因此可適用於所有癌症。例如，可作為肺 癌、胃癌 '大腸癌、乳癌、舌癌、咽頭癌、急性骨髓性白 血病、胰臟癌及卵巢癌等癌症之免疫療法劑。 込今已有1 81例之癌患者接受過本發明之單獨療法用癌免 疫療法劑之施用，其中以肺癌最多，達75例。而肺癌以外 之pj癌、大腸癌、乳癌等各種癌症亦全部包括在内。 就本發明之第2種態樣而言，癌患者中較適於作為本發明 之癌免疫療法劑的施用對象者如下·· (a)尚未引起免疫能力低下之患者； (b )典|自、肝及骨等器官遠距轉移現象之患者。 此外，當以本發明之癌免疫療法劑用於癌症之持續療法 時，其結果顯示可對癌轉移作用等再發現象及2次癌之發 -10-

生等發揮抑制功效。 本發明之.第三種態樣顯示，#將太菸 係將本發明又癌免疫療法劑 投予因初次治療而緩解之急性骨髓性白血病等患者，或是 透過外科手術而接受過癌症原發病灶除去手術之癌症 為佳。 本發明之第4種態樣，係針對羅患固形癌之患者，先儘可 能以外科手術除去癌症原發病灶所在，然後再單獨投予本 發明之癌免疫療法劑為佳。固形癌之例包括肺癌、胃癌、 大腸癌等；較適合者如肺癌等。 本發明之第5種態樣，係針對罹患非固形癌之患者，先用 化學療法進行初次治療接受緩解後，再投予本發明之癌免 疫療法劑為佳。非固形癌之例如白血病等；其中較適合者 則為急性骨髓性白血病等。 本發明之第6種態樣顯示，本發明之癌免疫療法劑可抑制 癌自其原發病灶處轉移，特別是針對轉移至淋巴結之癌症 尤為有效。由本發明已確認：具有免疫反應能力之患者-亦 即IFN-r之誘導為陽性之患者_其效果極為顯著；而。即使是 相當大的淋巴結轉移現象亦能令之消失。此外，在轉移現 象中，於肝、腦、骨等處，若在免疫療法開始前即已轉移 至此些部位，（即使是如IFN_ r之誘導呈現陽性之患者）則 無任何效果。至於本發明之癌免疫療法劑（特別是bcg_ CWS免疫療法劑）何以對淋巴結轉移特別有效，其理由應是 CTL(細胞毒性τ淋巴球；對各種癌症之特異性作用）之活化 與CD28間有直接關係的緣故。換言之，CD28量之上昇乃 -11 -本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 x 297公釐) 4 乃、 A7 * B7 五、發明説明（9 ) 意味著CD28強陽性淋巴球群之增加，亦即意味著對癌有特 異性的CTL之活化。 本發明之第7種態樣，係將本發明之癌免疫療法劑用於肺 癌患者。後面將針對病例最多的肺癌患者，以最詳細的方 式解析本發明癌免疫療法劑之效果。 本發明之第8種態樣為適於投予本發明癌免疫療法劑之患 者的末梢血檢定方法。具體的檢定方法（如IFN-T之謗導能 力的檢定方法）係於接種100 r或200 γ BCG-CWS之前及接 種後第1 8小時進行採血，測定末梢血中之IFN- 7量，並判 定其IFN- r之誘導能力為陽或陰性。而其測定時期，係以 可謗發對BCG-CWS免疫反應之敏化期的第4次，以及治療 期的第一次為妥；同時亦可由此而早期判斷免疫療法應否 繼續。另外，末梢血所含的淋巴球中，CD28強陽性之淋巴 球群可用習知方法，如流動細胞計數法測定。 此外，本態樣並非單只限於彼等適合接受單獨免疫療法 作為接續初次治療之後所實施之癌症持續療法的罹癌患者 之檢定方法，亦可作為當免疫療法不適切時用以評定其它 療法之必要性的方法。由此，對於IFN- r之誘導力高的患 者而言，係以實施外科手術與用及BCG-CWS之單獨免疫療 法較為適宜；而對不具IFN- 7之誘導能力的患者而言，即 可早期實施它種療法。如上，則接續初次治療，且依患者 之免疫能而定之適當治療計畫，即有實現之可能。 BCG-CWS接種液之調配 BCG-CWS可依文獻戶斤載方法（Azuma等，J. Natl. Cancer -12 - 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐） A7 B7 五、發明説明（10 ) Inst. 52 ·· 95-101 (1974))而調製。 BCG-CW3接種液亦可根據文獻所載方法（Hayashi, A.; Proc. Japan Acad·, 70, Ser. B (1994))而配製。 亦即，將BCG-CWS粉末裝入5毫升研磨管中，再用26G注 射針，以1毫克BCG-CWS對1滴礦物油之比例，於其中添加 石廣物油（Drakeol-6VR ; Pennsylvania Refining Co., Butler, U.S.A.);然後使之勾相化，直到無不勾現象，呈糊狀為 止。接著再添加1.1% Tween 80與生理食鹽水並令其呈勻 相。最後，此含有BCG-CWS之小油滴狀均勻懸浮液的最終 濃度為1毫克/毫升。於6 0 °C下將此附有油之BCG-CWS懸浮 液殺菌3 0分鐘即成。 接種程序 BCG-CWS —般係以單獨接種為原貝丨J。 接種程序可分為敏化期與治療期。在敏化期中，通常係 於上臂外侧皮内左右交互接種200 r之BCG-CWS，每週一 次，共接種4次。然後在治療期中，則每隔4週，反覆左右 交互進行接種。此治療期之投予量可依患者之活體反應狀 況而決定，係在1 0至250 γ，較佳為25至200 7之範圍内。 作為投予量決定指標之活體反應 作為投予量決定指標之活體反應可分為局部性的活體反 應與全身性的活體反應： (1 )局部性活體反應 主要為注射部位之皮膚反應。具體言之，包括發紅 '硬 塊，及潰瘍之形成等。此外，局部淋巴結之腫脹，亦即由 -13-

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本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210 X 297公釐） 4 乃、 A7 * B7 五、發明説明（11 ) 注射部位至所屬淋巴結之淋巴管炎與淋巴結炎，亦屬局部 性之生體反.應，但很少發生，二者皆為一時性之反應。 (2)全身性活體反應 由於患者自身之感受性與接種量間之關係，有時會發生 如下之一時性過剩反應，此時可予以減量以減輕其症狀： 臨床症狀：全身倦怠感、發熱、食慾不振、常感鳴心、 唱吐。 臨床檢驗：白血球增加症、C反應性蛋白（CRP)上昇、時 有輕度之GOT及GPT上昇現象。 若患者未能見到其有任何前述局部或全身性活體反應， 則將無法期待BCG-CWS之免疫療法能對其發生任何效果。 IFN- r謗導能力之測定 由IFN- 7謗導能力之測定，可預測以BCG-CWS所進行之 免疫療法的效果。 本測定係於敏化期之第4次（S 4 )及治療期之第1次（T 1)實 施，其皆是在BCG-CWS接種前及接種後第1 8小時進行採 血，再測定末梢血中之IFN- τ。當因接種BCG-CWS而使 IFN- 了之量增加35微微克/毫升以上時，即可判斷其IFN- 丫 誘導能力為陽性。 CD28誘導能力之測定 與前述相同，由CD28誘導能力之測定，可預測以BCG-CWS所進行之免疫療法的效果。於BCG-CWS接種前及接種 •後第1 8小時採血，再測定末梢血之淋巴球中，CD28強陽性 淋巴球群之增加情況。 -14- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐） A7 B7 五、發明説明（12 圖式簡要說明 圖1所示為接受了 BCG-CWS單獨免疫療法之急性前骨髓 性白血病患之臨床經過。 圖2所示為皮内接種100 T tBcG-CWS後，其生物學指標 隨時間變化的情形。測定時期為接種前與接種後丨8小時、 42小時、7日、15日、21EJ及28Θ。圖2A顯示末梢血中 細胞動素（G-CSF ' IL-12、IFN- T )之量；圖2B顯示末梢血 中血球細胞數（白血球、紅血球、血小板）；圖2 c則表末梢 血中之白血球數（顆粒球、淋巴球、單核球）。 圖3係針對原發性肺癌（非小細胞肺癌），將可接受外科手 術而在進行手術後復接受BCG_CWS單獨免疫療法之患者的 存活曲線，與1988年至1989年間在大阪府立成人病中心接 受外科手術之歷史性控制組患者的存活曲線作一比較。其 顯著性差異檢定結果，在第一期方面，以—法則 p=0.2287，而以Wilcoxon法則p = 0 23 13 ;在第二期方面，以 Log-Rank 法則 Ρ=0·230_7，而以 WilC0X0n 法則 p = 〇2U5 ;至於 第三期方面，以Log-Rank法則p=0.0009,而以Wilc〇x〇n法則 ρ=0·0012 〇 圖4為-於頸部淋巴結有轉移;見象之肺癌（大細胞癌）患者 病例，對此淋巴結轉移實施放射線療法之後，且在進行 BCG-CWS癌免疫療法前的頸部CT掃描照片複製圖。 圖5為一於頸部-淋巴結有轉移現象之肺癌（大細胞癌）患者 病例，在開始BCG-CWS癌免疫療法約！年半後，其頸部 掃描照片複製圖。 a a -15- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) 格(210X 297公爱0 4 乃、9( A7 ___B7 五、發明説明（13 ) 圖6為對BCG-CWS免疫療法有效、且現仍以健康狀態存 活之患者’.在皮内接種100T 之BCG_CWS後，其末梢血之 構成成分隨時間之變化，尤其是共刺激性訊號（co_ stimulatory signal)-CD28-隨時間之變化圖。測定時期係在 接種前及接種後1 8小時、42小時、；！、2、3、4、5及6 週。圖9A顯示淋巴球表面之標記量（CD28及CD46);而圖 9C則顯示末梢血中之白血球數（顆粒球、淋巴球、單核 球）。 圖7為對BCG-CWS免疫療法有效之7個患者，在皮内接種 1〇〇γ之BCG-CWS後，其共刺激性訊號cD28標記之變化情 形。測定時期為接種前及接種後丨8小時。其中有4例 (S.H.、Sa.H. ' Ε.Τ_、Κ.Ο.)可確認其⑶以標記之上昇。 實施例 以下兹以實施例作為本發明之一例證，以更詳盡地說明 本發明’但本發明不因此等實施例而受到任何之限定。 實例1 長期存活病例 (第1例） 長期存活病例中之第1例為典型的急性前骨髓性白血病患 者’其係大阪大學第3内科之外來患者，在經完全缓解後 為開始單獨免疫療法而移至大阪府立成人病中心。如圖1 所不’雖曾以化學療法進行過較為簡易之入緩解療程，但 由於尚夹雜著PSK(夕b只千y )之治療效果等問題，因此 c WS之早獨免疫療法便無法正規化，病人在约1年半

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五、發明説明（14 後即再發。其後在無反覆進行化學療法的情況下開始 的BCG-CW.S單獨療法，僅約3週則其Auer小體即完全^ 失。然後眾患者從未再發，於'經過22年的現^，過 而普通的生活（參見圖〗）。 完全治療已再發 本病例為第一個以BCG-CWS單獨療法 之急性前骨髓性白血病之案例。 (第2例） 第2例為長期存活之固形癌（大腸癌）患者，72歲，女 性。其因腸閉塞而發病，對其施以外科手術及術後之化學 療法，同時觀察其病況發展。然而，既已順利降下來的 CEA(癌胚胎性抗原，carcin〇embry〇nic卻又再度開 始上升，同時亦併發癌性腹膜炎。當對此患者開始施以 BCG-CWS之單獨免疫療法後，其腹水消失，且cea亦完全 正¥化，未再有2度出現之情事。該患者存活了丨5年，於 8 7歲死亡。 (第3例） 長期存活例中之第3例為急性骨髓性白血病患者。緩解療 法成功後’即可迅速開始BCG-CWS之單獨免疫療法。其後 從未有再發情事，在約已20年後之現在，仍十分健康。 (第4例） 弟4例為肺癌（大細胞癌）之女性患者。由於其可接受外科 手術而對之施行手術；再因BCG-CWS之單獨免疫療法，病 人即使在6年後之現在也十分健康。此患者成為後來發現 IFN- r可作為免疫療法之效果判定指標之開端。 -17- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Λ4規格(210X 297公釐) ^ 9ί A7 ‘ Β7 五、發明説明（15 ) 實例2 伴隨BCG-CWS接種之生物學指標之歷時變化情況 由接種過BCG-CWS後之患者採取血液，以一般之ELISA 法測定有測定可能性之約1 2種細胞動素。由結果可知：G-CSF、IL-6及IFN-r共3種細胞動素會出現於末梢血中。 圖2表示經皮内接種100 之BCG-CWS後，其生物學指標 隨時間變化情形。圖2 A顯示末梢血中細胞動素之量（G-CSF、IL-12及IFN- r );圖2B顯示末梢血中之血球細胞數 (白血球、紅血球及血小板）；而圖2 C則顯示末梢血中之白 血球數（顆粒球、淋巴球及單核球）。 在BCG-CWS接種後，約15-18小時為高峰，G-CSF及IFN-r (尤其是IFN- r )皆有顯著被誘導之現象，但IL-12則未出 現。同時也發生白血球增加症與血小板減少症，以及顆粒 球增加症與淋巴球減少症之現象。令人印象深刻的是， IFN- r在約3 0小時内即完全消失（參見圖2 )。 實例3 免疫抑制療法對於經BCG-CWS單獨治療之患者其IFN- T誘 導試驗及癒後之影響 迄今為止已對117名患者實施IFN- τ誘導試驗。茲將其結 果依BCG-CWS單獨免疫療法開始前是否接受過抗癌劑與放 射線之類、具有免疫抑制作用的療程，分別解析之。表1 所示為免疫抑制療法對於經BCG-CWS單獨治療之患者的 IFN- r誘導試驗及其癒後之影響。表中之「免疫抑制療 法」係指BCG-CWS免疫療法前之化學療法及/或放射線療 -18 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 五、發明説明（16

法· ^ ^ 、 、，σ果為敏化期之第4次（S4)或治療 期之弟1次（Τ 1)所得者。至於生在十 、土丹或死亡，則係以BCG免 疫療法開始後6個月之時點為判定標準。如表i所示，跡 r為陽性之比例’纟曾受免疫抑制治療者方面，僅約3成 強；而未曾受免疫抑制治療者方面，則高達近9成之比 例。此等，r為陽性之患者，不論是否曾接受過免疫抑制 治療，有約9成病例可於BCG_CWS治療開始後存活6個月以 上。反之’圓-r為陰性者則存活者極少，只有約2成之病 例可在BCG-CWS治療開始後存活6個月以上。 由上述結果可知’抗癌劑及放射線等對患者免疫力之影 響實在極大’因此證明了 BCG_CWS不要與抗癌劑或放射線 療法併用，而應單獨使用為佳。 實例4 以BCG-CWS單獨免疫療法進行治療之患者 迄今已為181例之患者實施過單獨免疫療法如表2所示， 表2係將經BCG-CWS單獨免疫療法治療之癌患者數依癌症 種類分別列出’其中以肺癌最多，達7 $例；以下亦包含胃 癌、大腸癌、乳癌等各種一切的癌症。各病期（Stage)中以 第4期為最多（表2)。 實例5 手術後單獨免疫療法對原發性肺癌患者之影響 本實例係針對病例數最多之原發性肺癌（非小細胞肺 癌），以Kaplan-Meyer法分別對於在外科手術後接受BCG-CWS單獨免疫療法之患者，以及1988至1989年間於大阪府 -19- 本紙乐尺度適用中國國家標準(CNS) A4规格(210X 297公釐) A7 B7

五、發明説明（17 ^ ’人病中心接觉外科手術之歷史性（h^。士叫控制組病 Μ治療經過進行解析，並比較所得之存活曲線（圖3)。& 果為：經BCXM：WS單獨免疫療法之患者，不論係、屬第^ 或3期皆全部存活；尤其是第3期者獲得從未經揭露之 顯著…α〇㈣nk法所得^ p = 0.0012)。 乂 實例6 實施BCG-CWS單獨免疫療法之原 本實例係比較能接受與無法接受外科手;:肺癌 BC”WS單獨免疫療法之病例(表3)。表3係實施心 CWS早獨免疫療法之原發性肺癌患者中，可進行外科手 與不能進行外科手術之病例的比較表，在能接受手術的病 例万面’第4期之患者與前述之第！、2、3期相較之下，其 經手術後之癒後情況顯著尤為惡劣，約有8成患者死亡。 另外，在無法手術之病例方面’第3及4期，尤其是第4期 患者中有壓倒性的多數其癒後情況皆非常糟糕。此等患者 中之大部分都是因接受過抗癌劑或放射線療法造成免疫力 極端低下者，因此變得不適於作免疫療法之對象；或是雖 為已確認有IFN-T·誘導現象之患者，但亦發生向腦、肝或 骨等部位之遠距轉移作用之患者。 實例7 對淋巴結轉移之治療效果病例 於—肺癌（大細胞癌）病例（男性）中，由於已轉移至頭部 淋巴結’因此雖對此淋巴結轉移實施放射線療法，亦森法 -20- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐）

裝 訂

A7 B7 五 、發明説明（18 獲得較大之效果(參見圖4之放射線療法後、免疫療 CT掃描照片複製圖）。 ·、/則勺 再對該患者實施BCG-CWS之癌免庐旅、土 如” 6個a n 么m会，在治療開始後 6個月，頸邵淋巴結之腫大現象即已大致消失。 治療開始後約i年半時，亦無法見到其頸部淋巴結有任何 腫大（參見圖5之免疫療法後的（：1[掃描照片複製圖 實例8 伴隨BCG-CWS接種之末梢血構成成分變化與免疫療效 性間之關係 隨著BCG-CWS之接種，可發現患者末梢血之構成成分有 一時性的一連串變化。其變化與本發明免疫療法之有效性 間有如下之密切關係： (1)免疫療法有效之患者的末梢血構成成分變化 當6名對免疫療法有效且現以健康狀態生存之患者接種 BCG-CWS後，可發現其以約15_18小時為高學，而有細胞 組成中之白血球增加（特別是顆粒球增加）、淋巴球減少（約 持續24小時）；以及細胞動素中IFN-r增加（約持續30小時） 與G-CSF增加（約持續！星期）等現象。在丁細胞表面標記方 面，則可見CD28之增加（约持續4 _ 6週）現象。圖6所示即為 例對BCG-CWS免疫療法有效、且現以健康狀態存活之患 者，其末梢血中之共刺激性訊號_ CD28-之歷時變化情形。 别足含有CD28之T細胞表面標記所用的試料與方法如 下： 1 .試料 21 本紙張尺度勒中國國家標準(CNS) A4規格(咖χΐ97公董)_ 4 乃、 A7 ____ B7 五、發明説明（19 ) 淋巴球：依一般方法，將Fic〇u Plaque (Pharmacia公司製） 加入EDTA與全血中並純化之，在調製後2小時内使用。 抗體：自生化學工業公司購買對抗CD28之單株抗體；而 對k CD46之早株抗體則係使用大阪成人病中心研究所調製 者。 2 .流動細胞計數：將純化之淋巴球與上述單株抗體一同溫 育，以一般方法洗淨並固定後，用Epics Pr〇file n(r7—小夕 一公司製）進行解析》 圖7係表前述對免疫療法有效之6名患者中之4名（s. H、 Sa_H.、Ε.Τ.、Κ.Ο.)及3名其它的有效患者（Su η、H D、 N.U.)，在BCG-CWS接種前及接種後之CD28標記的比較結 果。在IFN- r增加等前述項目中，有3例如圖7所示未見 CD28標記增加之患者（Su η ' H D、N u )，其情況雖皆順 利，但當過了 2年後卻有2例出現腦轉移現象，2例皆死 亡。至於剩下之丨例，即使在經過3年後的現在，仍依然健 康。 (2 )免疫療法典效之患者的末梢血構成成分變化 在1名對免疫療法無效之患者身上，無論是前述之細胞组 成、細胞動素（特別是IFN-r )，或是T細胞表面標記（尤其 是CD28)方面，皆無法見到任何變化；其病況亦不佳。 發明之效果 本發明提供了一種與化學療法及放射線療法等迥然相 異，且具有下述優點之癌免疫療法劑： (1)治療效果之品質極優、能預期完全治療之希望濃厚， -22- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4规格(210X297公釐) A7

包括轉移等再發現象或是 即便是長期存活之病例也不會有 2次癌之發生。 (2 )比任何療法都要便宜。 ⑺若將此治療法分冑’則係屬非特異性活性免疫療法； 其可對應所有—切之癌症，故被認為是能夠作為患者體内 特異地對抗癌症之殺手細胞。 (4)除了皮膚損傷外，其Q〇L(生活品質）極高。 由於以IFN_r &CD28作為標記，故可相當正確地評 價治療效果；即使在無法期待有治療效果時，亦能轉換為 其它方法。 (6) 操作非常簡單；在計算上即使只有1位醫師亦能對500 名癌患者同時進行治療。 (7) 與現下已實用化之治療膀胱癌的BCG生菌不同，完全 不須擔心結核感染’也不會有注射部位之混合感染。 -23- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) 五、發明説明（21 ) A7 B7 表1 :免疫抑制療法對經BCG-CWS單獨治療之患者的 IFN-γ謗導試驗與癒後情況之影響 患者 117例

免疫抑制治療（+) 69例 (59¾)

免疫抑制治療（-) 48例 (4U)

1FH-7 (+) 22例 (32¾)

IFN-r (-) 47例 (卿）

IFN-r (+) 42例 (88¾)

生存 死亡 生存 死亡 生存. 死亡 生存 死亡 19例 3倒 9例 38例 40例 2例 1例 5例 (86%) (⑽） (19%) (815Q (95¾) (5%) (17X) (83¾) -24- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐）

^ V A7 B7 五、發明説明（22 ) 表2 :經B C G - C W S單獨免疫療法治療之患者 (1974-1996) 數數數數數數 期期期期期期 /V /V /1\ /V /IV /IV I： 14, Π: 9, m-26, IV: 26) 1:1, Π: 4, m：4, IV: 12) 1:1， Π : 5, m： ο, IV: 10) 1:1， Π： 〇, m： 2, IV: 4) 1:0， Π : 0, m: ο, IV: 7) 1:0， Π： 〇, 1 m： l, IV: 4) 師癌：75 胃癌：21 大腸癌：16 乳癌：7 舌癌：7 咽頭癌：5 急性骨聽性白血病：5 RAEB(伴隨過量芽細胞之嚴重貧血）：4 胰臟癌：4 卵巢癌：4 其它：惡性胸腺腫瘤3、肝癌3、子宮頸癌3、平滑肌腫瘤2、上顎癌2、 攝護腺癌2、網膜芽細胞腫瘤2 '食道癌2、膽道癌2、陰道癌2、 子宮癌2 '惡性淋巴腫瘤2、甲狀腺腫瘤1、膀胱癌1、 惡性絨毛上皮腫瘤I、腎細胞癌1、惡性中胚葉腫瘤i '惡性腸管膜腫瘤j 計181例 -25-本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐） A7 B7 五、發明説明（23 ) 表3 :實施BCG-CWS單獨免疫療法之發性肺癌患者 外科 手術 病例數 期數 (病例數） 存活率 (%) 死亡率 (%) IFN-，誘導率 (%) 1(12) 12(100) 〇( 〇) 11 (92) + 3S 11(5) 5(100) 〇( 〇) 5 (100) 111(14) 14(100) 〇( 〇) 13 ( 93) "(5) K 20) 4( 80) 3 ( 60) K 〇) — 23 ii( υ 1(100) 〇( 0) 1 (100) ΙΙ!( 6) 4( 67) 2( 33) 3 ( 50) 1 V(16) 2( 13) 14( 87) 4 ( 25) -26 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐）

Claims (1)

1. A8 B8 C8 ____ 秦-_ D8 六、申請專利範圍 -丨_ 一種用於誘導癌症患者免疫反應能力之單獨療法之癌免 疫療法之醫藥組成物，其係以卡介氏芽孢桿菌細胞壁骨 架成份（BCG-CWS)作為有效成分；該成分可因皮内投 予而對癌患者誘導以血中IFN- τ及CD28強陽性淋巴球群 之增加現象為指標之免疫反應能力。 2. 根據申請專利範圍第1項之醫藥組成物，其中在投予下 列癌患者時’可抑制再發作用或2次癌之發生·· ’ (a) 尚未引起免疫力低下之癌患者；及 (b) 無腦、肝、骨之遠距轉移現象之癌患者。 3. 根據申請專利範圍第2項之醫藥組成物，其中係投予因初 次治療而接受過緩解或原發病灶除去手術之癌患者。 4. 根據申請專利範圍第3項之醫藥组成物，其中該癌患者 係指罹患固形癌者，而該初次治療係指外科手術。 5. 根據申請專利範圍第3項之醫藥组成物，其中該癌患者 係指罹患非固形癌者，而該初次治療係指化學療法。 6. 根據申請專利範園第丨項之醫藥組成物，其中係用於治 療癌症之淋巴結轉移β 經濟中央棣隼局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本萸) 7. 根據申請專利範圍第丨項之醫藥组成物，其中該患者為 肺癌患者。 __ -27- 7紙狀家標準(CNS) A4g( 2ΐ〇χ2^