KR100392582B1 - 면역치료제및이의용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 종양의 성장 또는 확산을 지연시키거나 확산시키기 위해 Mycobacterium vaccae로 부터 유래된 항원 및/또는 면역조절 물질의 용도에 관한것이다.

Description

면역치료제 및 이의 용도 {IMMUNOTHERAPEUTIC AGENT AND ITS USE}

본 발명은 종양의 성장을 지연시키거나 막는데 유용한 면역제료제에 관한것이다.

면역 시스템은 적어도 몇몇 경우에서 종양의 성장을 막거나 지연시킬 수 있고, 이 목적을 지지하도록 몇몇 연구가 의도된다는 것이 제안되었다.

이리하여, Coley(W.B. 1894 "단독 독소 및 간제 프로디지오서스 (prodigiosus)를 갖는 수술이 불가능한 악성 종양의 치료")은 결핵에 대한 Koch's 면역치료법에 의해 유도된 것과 유사한 괴사 메카니즘을 유도하므로써, 제한된 범위의 중배엽 기원의 종양에 대해 효과적인 것으로 보이는 면역치료법을 서술했다. 이후로, 암에 대한 면역치료법에서의 대부분의 시도는 Coley에 의한 몇몇 경우에서 성취된 것과 유사한 급속한 조직 괴사를 유도하는 것을 목적으로 해왔다.

TH1및 TH2로 칭해지는 헬퍼 T 세포의 돌연변이의 적어도 2가지 패턴이 있다는 것이 공지되어 있다. 전자는 인터루킨 2(IL2), 감마 인터페론(), 세포독소 T 세포(CTLs)의 생성, 감소된 항체 생성 및 TH2 세포의 생성의 하향-조절과 연관된다. 후자는 IL4, IL5를 생성하고, 항체생성을 향상시키고, TH1 세포를 하향-조절한다. 아마도 콜레 독소에 의해 유발된 Koch 현상은 TH1+TH2 숙성된 세포의 혼합의 결과인 것으로 생각된다.

종양의 억제를 위해 이용될 수 있는 두 범주의 면역 반응성이 있고, 양쪽이 모두 바실루스 팔메트-구에린(Bacillus Calmette-Guerin) 백신(BCG)에 의해 유발될 수 있다는 것이 알려졌다. 한 메카니즘은 코호 및 콜레의 면역치료법 및 TNF α로의 종양 면역치료법에 의해 예증되는 바와 같이 조직-파괴적이고, 아마도 T 세포-의존 코호 현상에 의해 적당히 제조된 염증 자리에서 시토킨-매개된 조직 손상을 포함한다. 이 메카니즘은 중배엽 기원의 종양에 대해 효과적인 것으로 보인다. 종양 세포 자체의 면역 인식을 기초로한 제 2 메카니즘은 임의 기원의 종양에 대해 효과적일 수 있다. 비-특이적 TH1 기초 항종양 메카니즘의 존재에 대한 간접적인 증거는 실험적 암에서 재조합 인터루킨 12, 강력한 TH1 유도질의 성공으로 부터 유래한다.

코호 현상의 유발을 피하는 방식으로 사용된다면, 미코박테리아는 열 쇼크 단백질(HSP) 에피토프 및 매우 보존된 서열을 갖는 다른 단백질의 에피토프를 통헤 변형된 자지(自知) 세포의 인식을 준비해서 선택적인 종양 세포 파괴를 일으킬 수 있다는 것이 생각된다. 과거에 BCG 면역치료법의 다양한 효능은 결핵 및 나에 대한 보호에서의 효능의 연구로 부터 나타나는 바와 같이, BCG가 이미 준비된 반응 패턴을 밀어주는 경향이 있다는 것을 인식하지 못하는것에 기인한다는 결론이다.

미코박테리아 질병(결핵 및 나 모두)에 대한 백신으로서의 BCG는 매우 다양하여, 다른 연구에서 80% 보호 내지 0% 보호을 제공한다. 그러므로, 출생시 제공된 BCG는 일반적으로 그것이 결핵에 대해 보호하는 지리적인 위치에서만 유년 백혈병을 막는것으로 보인다는 것은 중요하다(Grange JM, Stanford JL. BCG vaccination and cancer, Tubercle. (1990); 71; 61-64). 즉, 그것은 조직 괴사가 아니고 코호 현상이 아닌 미코박테리아 항원에 대한 반응을 일으키는 장소에서 양 상태를 보호한다.

많은 종양 세포는 그들의 표면 의태박테리아, 탄수화물, 항원 및 변형 단백질의 에피토프 및 부류 1 및 부류 2 주요 조직적합성 복합체(MHC)와 관련된 다른 매우 보존된 단백질상에 존재할 수 있다. 높은 항체 생성의 환경하에, 박테리아 당에 대해 원래 상승된 항-탄수화물 항체 및 아마도 IgA 유형은 종양 세로를 덮고, 세포 면역 공격으로 부터 그들의 표면 성분을 차단할 수 있었다.

국제 출원 PCT/GB93/00463에서 보여지는 바와 같이, M. vaccae로의 면역 치료법은에 의한 마크로파아지 활성으로의 반응의 주요 TH1 패턴을 유발하고, 항체는 거의 생성하지 않는다. 상기 TH1 반응은 CTL의 생성을 일으키는 것으로 공지된다. 증가된 수의 CTL와 결합된 항체의 생성에서 주목되는 감소는 종양 세포가 종양 세포 표면상에서 의태박테리아 당에 결합된 후에 활성화된 마크로파아지에 의해, 및 CTL 인식 변형 단백질 및 부류 1 MHC에 의해 제공된 다른 매우 보존된 단백질 에피토프에 의해 종양 세포가 공격받도록 개방되게 할 것이다. 코호 현상에 의해 조직 괴사 메카니즘은 M. vaccae 유도된 제조법의 사용에 의해 대개 억압된다는것이 생각된다.

그러므로, M. vaccae로의 면역치료법은 가슴 및 기관지 종양을 포함하는 중배엽, 내배엽 및 외배엽 기원의 종양의 성장 또는 확산를 막거나 지연시키므로써 상기 종양에 대해 효과적인 것으로 예상될 수 있다.

본 발명은 따라서 종양의 성장 및 확산을 지연하거나 막는데 유용한 약제의 제조를 위해 Mycobacterium vaccae로 부터 유래된 항원 및/또는 면역조절 물질의 사용을 제공한다. 상기 물질은 종양의 성장 및 확산을 적어도 지연시키거나 막기에 충분한 양으로 피험자에게 투여될 수 있다.

본 발명의 치료제는 편리하게, 따라서 바람직하게, M. vaccae의 죽은 세포, 가장 바람직하게 오토클래이빙에 의해 사멸된 세포를 포함한다. 면역치료제는 표준적으로 희석제 ㎖당 10⁸이상의 미생물, 및 바람직하게 희석제 ㎖당 10⁸내지 10¹¹의 사멸된 M. vaccae 미생물을 포함한다. 본 발명은 그 범위내에 종양의 성장 또는 확산을 지연시키거나 막기위한 치료법에서 사용하기 위해 M. vaccae로 부터의 항원 및/또는 면역조절 물질을 포함한다.

희석제는 주사만을 위해 발열물질이 없는 살린, 또는 pH 8.0의 붕산염 완충액일 수 있다. 희석제는 멸균이어야 한다. 적합한 붕산염 완충액은 하기이다:

M. vaccae의 바람직한 균주는 중앙 우간다의 Lango 지역으로 부터의 진흙 표본으로 부터 분리된 R877R로 표시되는 것이다(J.L. Stanford and R.C. Paul, Ann. Soc. Belge Med, Trop. 1973, 53, 141-389). 균주는 안정한 거친 변이체이고, 생화학 및 항원 기준에 의해 M. vaccae에 속하는 것으로 확인 될 수 있다(R. Bonicke, S.E. Juhasz., Zentr albl. Bakteriol. Parasitenkd. Infection skr. Hgy. Abt. 1, Orig., 1964, 192, 133).

R877R로 표시된 균주는 번호 NCTC 11659하에 1984년 2월 13일에 National Collection of Type Cultures(NCTC) Central Public Health Laboratory, Colindale Avenue, London NW9 5HT, United Kingdom에서 기탁되었다.

면역치료제의 제조를 위해, 미생물 M. vaccae는 적합한 고체 배지상에서 성장될 수 있다. 한천으로 고형화된 변형된 Sauton's 액체 배지가 바람직하다(S.V. Boyden and E. Sorkin., J. Immunol, 1955, 75, 15). 바람직하게 고체 배지는 1.3% 한천을 함유한다.

미생물로 접종된 배지는 일반적으로 10일 동안 32℃에서 미생물의 성장이 일어날 수 있도록 호기성으로 항온처리된다. 유기체가 수확되고나서, 무게재어지고, 희석제내에서 현탁된다. 희석제는 완충되지 않는 살린일 수 있으나, 바람직하게 붕산염-완충되고, 상기 서술된 바와 같이 Tween 80같은 계면활성제를 함유한다. 현탁액은 희석되어, 100mg의 미생물/㎖를 얻는다. 부가의 희석을 위해, 붕산염-완충된 살린은 바람직하게 현탁액이 희석제의 ㎖당 10㎎ 습식 중량의 미생물을 함유하도록 사용된다. 그리고나서, 현탁액은 5㎖ 다중투여 바이알내로 분배될 수 있다.

바이알내 미생물이 예컨대 2.5 메가래드의 투여량에서⁶⁰Cobalt로 부터의 조사를 사용하여, 또는 임의 다른 방식에 의해, 예컨대 화학적으로 사멸될 수 있다하더라도, 예컨대 10분동안 10 psi에서 (115-125℃) 오토클래이빙에 의해 미생물을 사멸시키는 것이 바람직하다. 오토클래이빙은 조사보다 더 효과적인 제조를 일으킨다는 것이 발견되었다.

면역치료제는 일반적으로 피내로 제공되는 0.1-0.2㎖, 바람직하게 0.1 ㎖ 범위내의 부피로 주사에 의해 투여된다. 단일 투여량은 일반적으로 10⁷내지 10¹⁰의 사멸된 M. vaccae 미생물을 함유할 것이다. 10⁸내지 10⁹사멸된 M. vaccae 을 함유하는 단일 투여량을 환자에게 투여하는 것이 바람직하다. 그러나, 투여는 환자의 상태에 의존하여 반복될 수 있다.

면역치료제가 일반적으로 피내 주사에 의해 투여될지라도, 다른 방법, 예컨대 경구 투여가 또한 사용될 수 있다.

본 발명은 종양의 성장 또는 확산을 지연시키거나 박는데 효과적인 면역 반응을 일으키기에 충분한 양으로 Mycobacterium vaccae로 부터 유래된 항원 및/또는 면역조절 물질을 종양으로 고통받는 피험자에게 투여하는 것으로 구성되는 종양의 성장 또는 확산을 지연시키거나 막기위한 방법을 본 발명의 범위내에 포함한다.

하나 이상의 M. vaccae을 사용하고/하거나 다른 미코박테리아 항원을 치료제내에 포함하는 것이 유리할 수 있고, 본 발명의 범위내이다. 투베르쿨린이 또한 포함될 수 있다.

치료제는 또한 그의 효과를 촉진시키기 위해 BCG(Bacillus Calmette-Guerin) 백신, 특히 동결-건조된 형태의 백신을 함유한 수 있다.

치료제는 보조제, 방부제, 안정화제등같은 부가의 성분을 함유할 수 있다. 그것은 사용전에 재구성되는 멸균의 주사가능한 액체 형태 또는 멸균의 동결-건조된 형태로 공급될 수 있다.

M. vaccae는 본 발명에 따른 치료제를 제조하기 위해 상기와 같이 또는 유기체의 추출 또는 분별 부분으로서 사용될 수 있다.

본 발명은 하기 실시예에 의해 한층 더 설명된다.

실 시 예 1

M. vaccae를 1.3% 한천으로 고형화된 변형된 Sauton's 배지로 구성되는 고체 배지상에서 성장시킨다. 배지를 미생물로 접종시키고, 미생물의 성장을 일으킬 수 있게 하기 위해 32℃에서 10일 동안 항온처리시킨다.

그리고나서, 미생물을 수확하고, 무게달고, 희석제에서 현탁시켜, 희석제의 ㎖당 100mg의 미생물을 얻는다. 그리고나서, 현탁액을 완충된 살린으로 한층 더 희석시켜, 희석제의 ㎖당 10mg 습식 중량의 미생물을 함유하는 현탁액을 얻고, 5㎖ 다중투여 바이알로 분배한다. 그리고나서, 살아있는 미생물을 함유하는 바이알을 10 psi에서 10 분동안 오토클래이빙시켜 미생물을 사멸시켜, 본 발명의 치료제를 얻고, 이는 (원한다면) 사용을 위해 한층더 희석될 수 있다.

이 면역치료제는 이미 서술된 방식으로 피내 주사에 의해 투여될 수 있다.

실 시 예 2

M. vaccae 의 주입물을 여러 종양 환자에 투여했다. 얻어진 결과들의 몇몇을 하기 보고한다.

가 슴 의 암

1) 면역치료법으로서 Mycobacterium vaccae를 사용하는 많은 연구가 진전되는 Hygiene and Epidemiology in Hanoi, Vietnam의 National Institute 에서, 많은 스탭은 가슴의 암을 액 제 2종양(secondary)으로 전개되었다.

수술 제거후에, 그녀에게 BCG 면역치료를 받을 것을 충고했다. 다른 사람에 있어서 상기 치료 상황을 보여주었기 때문에, 환자는 BCG를 수용하는데 불안해 하지 않았고, M. vaccae로의 치료를 요구했다. 10⁹사멸된 M. vaccae의 표준 주입물을 제공하고, 적어도 3년동안 환자는 건강하고, 부가의 종양의 증거가 없었다.

2) 계속되는 비강진의 치료를 위해 M. vaccae를 주입한 몇 주내에, 50 살의여자는 일상적 유방조영법에서 가슴 종양을 가진것이 발견되었다. 생검으로, 종양이 악성인 것을 알았고, 그것을 덩어리절제술에 의해 제거했다. 조직병리학으로, 종양이 없는 액 임파선주위에 주목할만한 동(洞) 조직구증식증을 보였다. 약 9 달후에, 비강진이 재발되고, M. vaccae의 제 2 투여를 제공하여, 비강진이 거의 즉시로 경감되었다. 종양의 제거 21달후에 제 2 종양의 사인은 없었다.

3) 70대 초반의 여성은 수년전에 가슴의 종양을 제거했다. 그녀는 많은 해동안 관절염때문에 등의 진통이 있었고, 이를 덜기위해 M. vaccae의 주입을 수용했다. 척주의 X-선 바로 후에, 종양의 제 2 침착물로 고려되는 많은 병소를 보였고, 그녀는 방사선치료를 위탁했다. 8주의 지연후에, 그녀는 방사선치료를 받았고, 반복적인 X-선 사진술로, 제 2 침착물의 사인이 없음을 알았고, 방사선치료를 그만두었다. 2년 반후에, 그녀는 종양의 재발없이 건강하다.

4) 55살의 일반 개업 의사는 2일전 급성 가슴 농양이라고 생각되는 것을 발견했다. 절개로 덩어리가 매우 빠르게 성장하는 암이고, 제 2 침착물은 이미 액에 존재한다는 것을 알았다. 즉각적인 제거를 수행하고, M. vaccae의 주사를 병원을 떠난후에 바로 제공했다. 2개의 부가의 주입물을 3달 간격으로 주사했다. 수술 상처는 잘 고쳐졌고, 1년후에, 질병의 급속한 진진을 두려워하는 환자에게서 제 2 침착물의 증거가 없었다.

5) 1년동안 둔부의 통증을 호소하는 50 살의 간호사는 작은 가슴 종양으로 부터 제 2 종양을 갖는것으로 진단되었다. M. vaccae의 초기 주입 후에, 그녀는 우수한 경과를 보였고, 화학요법을 매두 잘 견디고, M. vaccae를 제 2 주입시켰다.그녀는 건강하다.

폐 의 종양

1) 55살의 여자는 폐에서 여러가지 수술이 불가능한 종양에 기인하는 것으로 발견되는 1993년 10월에 호흡곤란이 전개되었다. 이들은 불특정 주요 종양으로 부터 제 2 침착물인 것으로 생각되었다. 종양학자의 동의로, M. vaccae의 주입물을 제공하고, 화학치료법 및 방사선치료법의 과정을 시작했다. 환자는 주목할만하게 거의 부작용이 없이 이를 견뎌내었고, 이것이 6달후에 제안될때 M. vaccae의 제 2 주사를 원치않았다. 제공 10 달후에, 그내의 질병은 악화되었고, 화학요법을 바꾸었으나, 환자는 불량한 예후를 가졌다. M. vaccae의 제 2 주사를 환자의 상태가 개선된 후에 1994년 10월의 초순에 제공하고, 그녀는 하나는 1994년 11월에, 다른 하나는 1995년 3월 1일에 2개의 부가의 주입물을 제공받았다. 이 환자는 예상보다 훨씬 더 건강할뿐만아니라, 그녀는 불편함없이 화학요법의 20 경로를 견뎠다.

다른 악 성 종 양

1) 악성 기형종에 기인하는 말기 질병을 가진 30살의 치과의사에게 그가 임종을 위해 집으로 보내지기 바로 전에 M. vaccae의 주입물을 제공했다. 그는 1, 2일 내에 개선의 사인을 보였고, 3주 후에 보일만한 종양의 크기에 있어서의 감소를 보였고, 몇 주일후에 처음으로 다시 먹기 시작했다.

2) 36살의 여자는 Helicobactor pylori로의 감염으로 부터 초래되는 궤양주위에 위의 선암이 전개되었다. 그녀는 화학요법에도 불구하고 많은 확산되는 제 2 종양이 존재했다. 그녀는 M. vaccae의 제 1 주입물을 수용하고, 2달 간격으로 주입을 계속하고 있다.

HIV-수반 종양

1) 다중 Kaposi's 육종을 가진 AIDS 초기 상태의 환자는 1993년 11월에 M. vaccae의 주입물을 수용했다. 그는 부가의 종양을 전개시키지 않았고, 그의 존재하는 종양은 분해의 사인을 보였다. M. vaccae의 제 2 주입물을 그가 HIV-관련된 제 2 감염을 전개시킨후에 1994년 12일에 제공했다. 그는 2달마다 M. vaccae의 반복된 주사를 수용한다.

2) 거의 CD4 세포를 가지지 않으나, AIDS의 명백한 사인이 없는 환자에게 1994년 6월 M. vaccae의 주입물을 제공하고, 몇 주후에 대퇴부에 직경으로 약 0.5cm의 작은 KS 병소를 갖는것으로 발견되었다. M. vaccae의 부가의 주입물을 2달 간격으로 투여하고, 1995년 3월에 환자는 부가의 병소를 보이지 않았고, 그의 초기의 병소의 크기에 있어서의 증가를 보이지 않았다.

3) 다중 재발 구강인두 암을 가진 48살의 남자에게 1994년 6월에 M. vaccae의 주입물을 제공하고, 2달 간격으로 부가의 주입물을 제공했다. 1995년 3월까지, 종양의 재발이 없었다.

상기 서술된 일화는 M. vaccae로의 종양의 치료를 위한 지지를 제공한다. M. vaccae의 사용은 임의 역 부작용과 연관되지 않고, 사실 그것은 적어도 2명의 환자에게 화학요법의 독성 효과를 감소시키는 것을 도울 수 있었다. 이들 초기 실제적 관찰은 이론적 예상을 지지하고, 가치 있는 항종양 활성의 제 1 지침을 제공한다.

실 시 예 3

예비 실험을 마우스 유방 암 균주 MM3로 도전된 Balb/c 마우스를 사용하여 수행했다.

10마리의 마우스의 세 그룹을 10⁷MM3 세포로 도전시켰다. 1주일 후에, 제 1 그룹을 10⁷M. vaccae로 주사하고, 제 2 그룹에 10⁹M. vaccae를 넣고, 제 3 그룹을 대조군으로서 작용시킨다. 동물을 도전 40일 후에 죽이고, 종양 전개에 대해 실험했다.

Claims (15)

1. 종양의 성장 또는 확산을 지연시키거나 막는데 유용한, Mycobacterium vaccae의 사멸된 세포를 함유하는 면역치료제.
2. 제 1 항에 있어서, M. vaccae의 세포가 오토클래이빙에 의해 사멸된 면역치료제.
3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, M. vaccae는 번호 NCTS 11659하에 1984년 2월 13일에 National Collection of Type Cultures (NCTC) Central Public Health Laboratory, Colindale Avenue, London NW9 5HT, United Kingdom에 기탁된 균주로부터 유래되는 면역치료제.
4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 투여당 10⁷내지 10¹⁰개의 M. vaccae 미생물을 포함하는 약제내에 함유되는 면역치료제.
5. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 종양이 가슴 또는 기관지 종양인 면역치료제.
6. 종양의 성장 또는 확산을 적어도 지연시키거나 막는데 충분한 양으로 M. vaccae의 사멸된 세포를 투여하는 것을 포함하는 인간이외의 동물내 종양의 성장 또는 확산을 지연시키거나 막는 방법.
7. 제 6 항에 있어서, 종양이 가슴 종양인 방법.
8. 제 6 항에 있어서, M. vaccae의 세포는 오토클레이빙에 의해 사멸된 방법.
9. 종양의 성장 또는 확산을 지연시키거나 막는데 유용한, M. vaccae의 사멸된 세포를 포함하는 생성물.
10. 제 9 항에 있어서, M. vaccae의 세포는 오토클레이빙에 의해 사멸된 생성물.
11. 제 9 항 또는 제 10 항에 있어서, M. vaccae가 번호 NCTC 11659하에 1984년 2월 13일에 National Collection of Type Cultures (NCTC) Central Public Health Laboratory, Colindale Avenue, London NW9 5HT, United Kingdom에 기탁된 균주로부터 유래되는 생성물.
12. 제 9 항 또는 제 10 항에 있어서, 투여 당 10⁷내지 10¹⁰개의 M. vaccae 미생물을 포함하는 약제인 생성물.
13. 제 6 항 또는 제 7 항에 있어서, M. vaccae가 번호 NCTC 11659하에 1984년 2월 13일에 National Collection of Type Cultures (NCTC) Central Public Health Laboratory, Colindale Avenue, London NW9 5HT, United Kingdom에 기탁된 균주로부터 유래되는 방법.
14. 제 6 항 또는 제 7 항에 있어서, 투여되는 일회양 당 10⁷내지 10¹⁰개의 M. vaccae 미생물을 포함하는 방법.
15. 제 9 항 또는 제 10 항에 있어서, 종양이 가슴 또는 기관지 종양인 면역치료제.