HU220858B1

HU220858B1 - Use of mycobacterium vaccae for the manufacture of a medicament useful in delaying or preventing the growth of tumours

Info

Publication number: HU220858B1
Application number: HU9602661A
Authority: HU
Inventors: Graham Arthur William Rook; John Lawson Stanford
Original assignee: Stanford Rook Ltd
Priority date: 1994-03-30
Filing date: 1995-03-29
Publication date: 2002-06-29
Also published as: CZ280196A3; FI963866A; ZA952644B; HU9602661D0; NZ282863A; ES2177638T3; ATE218355T1; NO964075L; BR9507338A; EP0752870A1; DE69526935T2; AP9600861A0; CA2186851A1; MX9604401A; EP0752870B1; KR100392582B1; PT752870E; AU699081B2; JPH09511737A; JP4135190B2

Description

A találmány tárgya Mycobacterium vaccae-ból származó antigén tulajdonságú és/vagy immunregulatív hatású anyag (a továbbiakban immunterápiás szer) alkalmazása rosszindulatú daganatok növekedésének vagy teijedésének késleltetésére vagy megakadályozására szolgáló gyógyszerkészítmény előállítására.

Felmerült az a gondolat, hogy az immunrendszer legalább néhány esetben képes megakadályozni vagy lassítani rosszindulatú daganatok növekedését, és néhány tanulmány megerősíteni látszik ezt a nézetet. így például Coley leírt egy immunterápiás módszert, amely hatásosnak mutatkozott a mezodermális tumorok szűk csoportja ellen (W. B., 1894: Treatment of Inoperable Malignant Tumours with Toxins of Erysipelas and the Bacillus prodigiosus). Coley egy szövetelhalást kiváltó mechanizmust indukált, amely hasonló Koch gümőkór elleni immunterápiájához. Azidőtől a legtöbb próbálkozás a rosszindulatú daganatok immunterápiájában arra irányult, hogy gyors szövetelhalást indukáljanak, hasonlót ahhoz, amilyent Coley ért el néhány esetben.

Ismert, hogy a helper T-sejtek (T_H1 és T_H2) érésének legalább két útja van. Az előbbieké az interleukin-2 (IL2), a gamma-interferon (IFN-γ), a citotoxikus T-sejtek (CTL) képződésével, csökkent antitesttermeléssel és a T_H2-sejtek képződésének elnyomásával jár. Az utóbbiak termelik az IL4-t és az IL5-t, fokozottan termelnek antitestet és elnyomják a TjJ-sejtek képződését. A Koch-jelenség - Coley toxinja valószínűleg ezt indukálja - vélhetőleg a T_H1- és T_H2-sejtek keverékének tulajdonítható.

Kimutatták, hogy kétféle immunválasz hasznosítható a rosszindulatú daganatok befolyásolására, és mindkettő kiváltható a Bacillus Calmette-Guérin (BCG) vakcinával. Az egyik mechanizmus szövetpusztító amint azt Koch és Coley immunterápiái és a TNFa-val (tumomekrotizáló faktor) végzett daganat-immunterápia példázza -, és valószínűleg egy citokin közvetítésű szövetkárosodás szerepel benne a gyulladásos területeken, amelyeket a T-sejt-föggő Koch-jelenség megfelelően előkészített. Ez a mechanizmus a mezodermális eredetű daganatok ellen tűnik hatásosnak. A másik mechanizmus, amely maguknak a daganatsejteknek az immunfelismerésén alapszik, bármilyen eredetű daganat ellen hatásos lehet. Közvetett bizonyítékok szólnak egy nem specifikus, T_H1 alapú daganatellenes mechanizmus létezése mellett, amelyek a rekombináns interleukin-12-nek - ami egy erős T_Hl-induktor - kísérletes daganatokon mutatott jó hatásán alapulnak.

Elfogadott, hogy a MycobacteriumoV - ha úgy használják, hogy ne indukálják a Koch-jelenséget - képesek lehetnek a stresszelt autológ sejtek felismerésének megindítására a hősokk-fehérje (HSP) és más, erősen konzervatív szekvenciájú fehérjék antigéndeterminánsain keresztül, és így a rosszindulatú daganatsejtek szelektív pusztulását okozzák. Arra következtetünk, hogy a BCG-vel végzett immunterápia változó eredményességét a múltban az okozta, hogy nem vették észre, hogy a BCG a már megindított válaszreakciót igyekszik fokozni, amint az kitűnik a gümőkór és a lepra elleni védekezésben mutatott hatásosságának vizsgálataiból.

A BCG, mint a Mycobacteriumók. által okozott betegségek (a gümőkór és a lepra) vakcinája, igen változó hatékonyságú, így a 80%-os védettségtől a 0%-os védettségig bármilyen eredményt adhat a különböző vizsgálatokban. Ennélfogva lényeges, hogy a születéskor adott BCG csak azokon a földrajzi területeken látszik általában védettséget biztosítani a gyermekkori fehérvérűség ellen, ahol a gümőkór ellen is védettséget ad [Grange, J. M., Stanford, J. L.: BCG vaccination and cancer. Tubercle 71, 61-64 (1990)]. Azaz, mindkét betegség ellen védelmet ad azokon a helyeken, ahol a mikobakteriális antigénnel kiváltott válaszreakció nem okoz szövetelhalást, és nem a Koch-jelenség.

Számos daganatsejt felszínén lehetnek bakteriomimetikus szénhidrátok, antigének, valamint stresszfehérjék és más, a fő hisztokompatibilitási komplex (MHC)

1. és 2. osztályába tartozó, erősen konzervatív fehérjék antigéndeterminánsai (epitópok). Fokozott antitesttermelés esetén az eredetileg a bakteriális szénhidrátok ellen termelődő, antiszénhidrát antitestek, amelyek esetleg IgA típusúak, beburkolhatják a daganatsejteket és megvédhetik felszíni alkotórészeiket a celluláris immuntámadástól.

Amint azt a PCT/GB93/00463 számú nemzetközi szabadalmi bejelentésünkben leírtuk, a Mycobacterium vaccae-val végzett immunterápia T_H1 reakciómintát indukálja a makrofágok IFN-γ aktiválásával és csekély antitesttermeléssel. Tudott, hogy az ilyen T_Hl-válasz a citotoxikus T-sejtek megjelenéséhez vezet. Az antitesttermelés kifejezett csökkenése a citotoxikus T-sejtek számának fokozódásával együtt a daganatsejteket megtámadhatóvá teszi mind a makrofágok által, amelyek aktiválódnak a daganatsejtek felszínén lévő bakteriomimetikus szénhidrátokhoz való kötődésük után, mind a citotoxikus T-sejtek által, amelyek a stresszfehérjék és más, MHC-1 osztályú, erősen konzervatív fehérjék epitópjait ismerik fel. Úgy gondoljuk, a Koch-jelenség szövetelhalást kiváltó mechanizmusa a M. vaccae készítmények használatával jórészt elnyomható.

így tehát a M. vaccae-val folytatott immunterápiától várható, hogy hatásos lesz a mezodermális, endodermális és ektodermális rosszindulatú daganatok ellen, köztük emlőrák és a légúti tumorok ellen úgy, hogy megelőzi vagy megakadályozza az ilyen rosszindulatú daganatok növekedését vagy terjedését.

A fentiek alapján a találmány tárgya Mycobacterium vaccae-ból származó antigén tulajdonságú és/vagy immunregulatív hatású anyag alkalmazása rosszindulatú daganatok növekedésének és terjedésének késleltetésére vagy megakadályozására alkalmas gyógyszerkészítmény előállítására. Az ilyen gyógyszerkészítmények a fenti immunterápiás szert egy rosszindulatú daganat növekedésének vagy teqedésének legalább a késleltetéséhez vagy megakadályozásához elégséges mennyiségben tartalmazzák.

Az ilyen gyógyszerkészítmények alkalmasan, ennélfogva előnyösen a M. vaccae élettelen sejtjeit, legelőnyösebben autoklávozással elölt sejtjeit tartalmazzák. Az immunterápiás gyógyszerkészítmény általában több mint 10⁸ mikroorganizmust, előnyösen 10⁸-10¹¹ elölt

HU 220 858 Bl

M. vaccae mikroorganizmust tartalmaz a hígítószer

I ml-ében.

A hígítószer pirogénmentes, fiziológiás, injektálható nátrium-klorid-oldat lehet önmagában, vagy egy pH = 8-as borátpuffer. A hígítószemek sterilnek kell lennie. Egy alkalmas borátpuffer a következő:

dinátrium-tetraborát - víz (1/10) 3,63 g bórsav 5,25 g nátrium-klorid 6,19 g

Tween 0,0005% desztillált víz kiegészítve 1 literre.

A M. vaccae előnyös törzse az R877R jelzésű, amelyet Közép-Uganda Lango járásában egy iszapmintából izoláltak [Stanford, J. L. és Paul, R. C., Ann. Soc. Belge Med. Trop. 53, 141-389 (1973)]. A törzs egy stabil R-variáns, amely biokémiai és antigéntulajdonságai alapján a M. vaccae fajhoz tartozóként határozható meg [Bonicke, R. és Juhasz, S. E., Zentralbl. Bakteriol. Parasitenkr., Hyg. Abt. 1, Őrig., 192, 133 (1964)].

Az R877R jelzésű törzset letétbe helyeztük a National Collection of Type Cultures (NCTC)-nél (Central Public Health Laboratory, Colindale Avenue, London, NW9 5HT, GB), 1984. február 13-án, NCTC

II 659 szám alatt.

Az immunterápiás gyógyszerkészítmény előállításához a M. vaccae mikroorganizmust egy alkalmas szilárd táptalajon lehet tenyészteni. Előnyös egy módosított, folyékony Sauton-táptalaj [Boyden, S. V. és Sorkin, E., J. Immunoi. 75, 15 (1955)], agarral szilárdítva. A szilárd táptalaj előnyösen 1,3 tömeg% agart tartalmaz.

A mikroorganizmussal beoltott táptalajt aerob körülmények között inkubáljuk általában 32 °C hőmérsékleten, 10 napon át. A mikroorganizmust lemossuk, majd leméijük és egy hígítószerben elszuszpendáljuk. A hígítószer lehet nem puffereit fiziológiás nátrium-kloridoldat, de előnyösen borátpuffert és egy felületaktív anyagot, például Tween-80-at tartalmaz, amint azt fent leírtuk. A szuszpenziót úgy hígítjuk, hogy 100 mg mikroorganizmust tartalmazzon ml-enként. A további hígításhoz előnyösen puffereit fiziológiás nátrium-kloridoldatot használunk úgy, hogy a szuszpenzió 10 mg nedves tömegű mikroorganizmust tartalmazzon ml-enként. A szuszpenziót ezután 5 ml-es, gumidugós fiolákba osztjuk szét. Bár a mikroorganizmusok a fiolákban elölhetők lennének besugárzással, például ⁶⁰Co-tal,

2,5 x1ο⁴ Gy (2,5 megárad) sugáradaggal, vagy bármilyen más módon, például kémiai módszerekkel, előnyös a mikroorganizmusokat autoklávozással elölni, például 68,8 kPa nyomás alatt (115-125 °C). Azt találtuk, hogy az autoklávozás hatásosabb készítményt eredményez, mint a besugárzás.

Az immunterápiás szert általában injekcióban, 0,1-0,2 ml-es térfogatban, előnyösen 0,1 ml-ben, intradermálisan adjuk be. Egy egyszeri dózis általában ΙΟ⁷—10¹⁰ elölt M. vaccae mikroorganizmust tartalmaz. Előnyös a betegeknek egy egyszeri, 10⁸-10⁹ elölt M. vaccae-t tartalmazó dózist adni. A dózis azonban a beteg állapotától függően megismételhető.

Bár az immunterápiás szert tartalmazó gyógyszerkészítményt általában intradermális injekcióban alkalmazzuk, azonban más adagolási mód, például orális adagolás is használható.

Előnyös lehet és találmányunk oltalmi körén belül van a M. vaccae egynél több törzsének használata, és/vagy más mikobakteriális antigének alkalmazása a gyógyszerkészítményben. Ezek közé tartozhat a tuberkulin is.

A gyógyszerkészítmény tartalmazhat BCG (Bacillus Calmette-Guérin) vakcinát is, különösen a vakcina fagyasztva szárított alakját, a hatás fokozása céljából.

A gyógyszerkészítmény tartalmazhat további összetevőket, például adjuvánsokat, tartósítószereket, stabilizátorokat, és a többi. Kiszolgáltatható steril, injektálható folyadék formájában, vagy steril, fagyasztva szárított formában, amely a használat előtt helyreállítható.

A M. vaccae a találmány szerinti gyógyszerkészítmény elkészítéséhez használható mint olyan, vagy mint a mikroorganizmus kivonata vagy frakcionált része.

Találmányunkat a következő példákkal illusztráljuk, amelyek nem korlátozzák semmi módon az oltalmi kört.

1. példa

M. vaccae-t tenyésztünk 1,3 tömeg% agarral szilárdított, módosított Sauton-táptalajon. A táptalajra oltjuk a mikroorganizmust, és 10 napon át inkubáljuk 32 °C hőmérsékleten, hogy a mikroorganizmus benője a táptalajt. A mikroorganizmust lemossuk, tömegét lemérjük és egy hígítószerben szuszpendáljuk, hogy 100 mg mikroorganizmus legyen 1 ml hígítószerben. A szuszpenziót ezután tovább hígítjuk puffereit fiziológiás nátrium-klorid-oldattal úgy, hogy 10 mg nedves tömegű mikroorganizmust tartalmazzon ml-enként, és szétosztjuk 5 ml-es, gumidugós fiolákba. Ezután az élő mikroorganizmusokat tartalmazó fiolákat 10 percig autoklávozzuk 68,8 kPa nyomáson, hogy elöljük a mikroorganizmusokat és megkapjuk a találmány szerinti immunterápiás szert, amely (kívánt esetben) tovább hígítható a felhasználáshoz.

Ez az immunterápiás szer intradermális injekcióban adható be a már leírt módon.

2. példa

M. vaccae injekciókat adtunk számos daganatos betegnek. Néhány eredményről az alábbiakban számolunk be:

Emlődaganatok

1. Az Országos Közegészségügyi és Járványtant Intézetben (Hanoi, Vietnam), ahol egy sor vizsgálatot folytatunk a Mycobacterium vaccae immunterápiás alkalmazásával kapcsolatban, a személyzet egy tagjánál emlődaganat alakult ki hónaljt áttételekkel. A daganat műtéti eltávolítása után BCG-immunterápiát ajánlottunk fel. Mivel ezt a kezelést már másoknál látta, a beteg nem aggódott elfogadni a BCG-t, és kérte a M. vaccaeval való kezelést. Egy szabályos injekciót kapott 10⁹ elölt M. vaccae-val, és a beteg legalább 3 év óta jól van és nincs jele nála újabb daganatnak.

2. Pár héttel azután, hogy perzisztens pityriasisának kezelésére egy M. vaccae injekciót kapott, egy 50 éves nő3

HU 220 858 Bl nél emlődaganatot találtak mammográfiás szűrővizsgálaton. Biopsziával megállapították, hogy a daganat rosszindulatú, ezért kimetszéssel eltávolították. A szövettani vizsgálat kifejezett hisztiocita-szaporulatot mutatott ki a hónalji nyirokcsomók körül, amelyek daganatmentesek voltak. Körülbelül 9 hónappal később a beteg pityriasisa kiújult, ezért egy második adag M. vaccae-t kapott, amire a pityriasis csaknem azonnal javult. Huszonegy hónappal a daganat eltávolítása után áttételeknek semmi jele nincs.

3. Hetvenes éveinek elején járó nőnek emlődaganatát sok évvel korábban eltávolították. Mivel évek óta fájt a háta arthritise miatt, ennek enyhítésére tett kísérletként egy injekció M. vaccae-t kapott. Közvetlenül ezután a gerincoszlop röntgenvizsgálatával egy sor léziót találtak, amelyeket a daganat áttételeinek tartva a betegnek sugárterápiát javasoltak. Nyolc hét késlekedés után a beteg megjelent a sugárterápián, ahol a megismételt radiográfiás vizsgálattal már nem találták meg az áttételekre utaló jeleket; a sugárterápiától elálltak. Két és fél évvel később a beteg jól van és daganatai nem újultak ki.

4. Egy 55 éves orvosnő, két napos kórelőzménnyel, akut emlőtályognak tartott tünetekkel jelentkezett. A feltárás egy igen gyorsan növekedő emlődaganatot talált, amelynek áttételei már megjelentek a hónaljban. Az eltávolítást azonnal elvégezték, majd egy M. vaccae injekciót kapott közvetlenül a kórház elhagyása után. Ezt két további injekció követte 3 hónapos szünetekkel. A műtéti seb jól gyógyult és egy év után nem volt jele áttételeknek annál a betegnél, akit a betegség gyors súlyosbodása fenyegetett.

5. Ápolónő, 50 éves, évek óta tartó csípőfájdalmait egy kis emlődaganat csontáttételei okozták. Egy kezdő M. vaccae injekció után szép javulást mutatott, nagyon jól viselte a kemoterápiát, majd egy második M. vaccae injekciót kapott. Most is jól van.

Tüdődaganatok

1. Ötvenöt éves nőbetegnél légzési nehézség alakult ki 1993 októberében, aminek okaként számos inoperabilis daganatot találtak a tüdejében. Ezeket egy ismeretlen elsődleges daganat áttételeinek tartották. A beteg az onkológus egyetértésével egy M. vaccae injekciót kapott, és kemo- és radioterápiás kezelést kezdtek meg nála. Ezeket a beteg figyelemre méltóan kevés mellékhatással viselte el és nem kívánt egy második M. vaccae injekciót kapni, amit hat hónap után ajánlottunk fel. Tíz hónap múlva állapota rosszabbodott, a kemoterápiát megváltoztatták, de a betegség prognózisa igen rossz volt. A második M. vaccae injekciót így 1994 október elején kapta, ezután állapota javult és két további injekciót kapott 1994. decemberében és 1995. március 1-én. A beteg nemcsak a várakozáson felül jobban lett, de ezután 20 kemoterápiás kezelést viselt el kellemetlenségek nélkül.

Egyéb rosszindulatú daganatok

1. Harminc éves fogász, rosszindulatú teratómája miatt terminális állapotban egy M. vaccae injekciót kapott, mielőtt meghalni otthonába bocsátották. Egy-két napon belül a javulás jeleit mutatta, három héttel később a látható daganatok mérete csökkent és hetek óta először újra evett.

2. Harminchat éves nő gyomrában, a Helicobacter pylori fertőzés által okozott fekély kerületén adenocarcinóma alakult ki. A kemoterápia ellenére számos áttétel keletkezett testszerte. Megkapta az első M. vaccae injekciót, amit szándékunk szerint kéthavonta újabbak követnek.

A HIV-vírussal összefüggő daganatok

1. Egy beteg az AIDS korai szakaszában, többszörös Kaposi-szarkómával, egy injekció M. vaccae-t kapott 1993 novemberében. Újabb daganatai nem alakultak ki, és a meglévők is a feloldódás jeleit mutatták. Egy második M. vaccae injekciót kapott 1994 decemberében, amikor a HIV-sal összefüggő, másodlagos fertőzések kialakultak. Kéthavonta ismételt M. vaccae injekciókat kap.

2. Egy beteg, akinek már alig volt CD4+ sejtje, de nem mutatta az AIDS nyilvánvaló tüneteit, egy M. vaccae injekciót kapott 1994 januáijában, és néhány héttel később egy kis, körülbelül 0,5 cm átmérőjű Kaposiszarkóma léziót találtak az egyik combján. További M. vaccae injekciókat kapott 2 hónapos időközökben: több lézió nem keletkezett és az eredeti lézió mérete sem nagyobbodott.

3. Egy 48 éves férfibeteg kiújuló orofaringeális karcinómákkal egy M. vaccae injekciót kapott 1994 júniusában, majd továbbiakat 2 hónapos időközönként. 1995 márciusára a daganatok nem újultak ki.

A fent bemutatott kóresetek alapot szolgáltatnak a rosszindulatú daganatok M. vaccae-val végzett kezeléséhez. Az M. vaccae alkalmazása nem jár hátrányos mellékhatásokkal, sőt elősegíthette a kemoterápia toxikus hatásainak csökkenését legalább két beteg esetében. Ezek a korai klinikai megfigyelések alátámasztják az elméleti elvárást és első jelét mutatják az értékes daganatellenes hatásnak.

3. példa

Előkísérletet végeztünk Balb/c egereken az MM3 egér-emlőkarcinóma sejtvonallal.

Tíz-tíz egérből álló három állatcsoportot 10⁷MM3 sejttel fertőzünk. Egy héttel később az első csoportot 10⁷ M. vaccae-va\, a második csoportot 10⁹ M. vaccae-vai oltjuk, míg a harmadik csoport szolgál kontrollként. Az állatokat 40 nappal a fertőzés után elpusztítjuk és megvizsgáljuk a daganat fejlődését.

1. csoport	2. csoport	3. csoport
10⁷ M. vaccae	10⁹ M. vaccae	Kontroll
daganat fejlődött 1	2	5
nincs daganat 9	8	p=0,056 5

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

Claims

1. Mycobacterium vaccae-böl származó antigén tulajdonságú és/vagy immunregulatív hatású anyag alkalmazása rosszindulatú daganatok növekedésének vagy

HU 220 858 Bl terjedésének késleltetésére vagy megakadályozására szolgáló gyógyszerkészítmény előállítására.

2. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, amelyben az M. vaccae-ból származó antigén tulajdonságú és/vagy immunregulatív hatású anyag elölt M. vaccae sejtekből áll.

3. A 2. igénypont szerinti alkalmazás, amelyben az M. vaccae-ból származó anyag autoklávozással elölt M. vaccae sejtekből áll.

4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, amelyben az M. vaccae-ból származó anyag a

National Collection of Type Cultures-ben (NCTC, Central Public Health Laboratory, Colindale Avenue, London NW9 5HT, UK), 1984. február 13-án, NCTC 11 659 számon letétbe helyezett törzsből származik.

5 5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás dózisonként 10⁷-10¹⁰ M. vaccae mikroorganizmust tartalmazó gyógyszerkészítmény előállítására.

6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, amelyben a rosszindulatú daganat egy emlő10 vagy tüdődaganat.