JPS6037120B2 - 抗腫瘍活性物質とその製剤 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はミコバクテリゥム属に属する微生物の菌体から
得られる抗腫場活性またはアジュバンド活性を有する活
性物質とこれを有効成分とする製剤に関する。

結核菌が強い免疫促進作用をもつことは、古くより知ら
れており、近年免疫療法剤の一つとして結核菌の生菌体
を担損患者に投与する試みもなされてきた。

しかし、結核菌の生菌を投与した場合感染の危険があり
、肝臓障害、腎臓障害、濃揚、発熱等の強い副作用がい
よいよみられる。そこでこれらの副作用をさげるため、
結核菌から抗腫場活性物質を抽出する試みもなされてき
た。現在までに調製された結核菌由来の活性物質として
は結核菌の熱水抽出物、水溶性アジュバント、ワックス
、リボ核酸、細胞壁骨格、有機溶媒抽出残笹等が挙げら
れる。しかし、これらの結核菌由来の抽出物にも未だ改
良を要する幾多の点が残されている。

すなわち、これらの抽出物は抗腫湯活性を有するものの
本体に投与した場合の副作用を除くことが困難であり、
必ずしも所期の目的を達しているとはいえない。本発明
者は結核菌またはその類縁菌の菌体より得られる抗腫傷
活性物質について鋭意研究の結果、意外にも極めて簡単
な処理方法により高い抗腫湯活性またはァジュバンド活
性を有ししかも毒性の低い活性物質を抽出することに成
功し、さきに特許出願した（昭和５３手特許磯第２６５
１叫号）。

この活性物質はミコバクテリゥム属に属する微生物の菌
体を破砕して得られる無細胞抽出液に凝集剤を加えるこ
とにより沈澱物として得られる抗腫場活性またはアジュ
バント活性を有する物質で以下Ｎ物質という。Ｎ物質は
その由来する微生物菌体に比して種々の勝れた点を有し
抗腫場剤またはアジュバント剤として有用な活性物質で
あるが、Ｎ物質は複雑な組成を有しているため、いまだ
Ｎ物質の抗腫傷活性の本体は明らかでない。

本発明者等は、Ｎ物質中の活性物質について種々検討し
たところ、Ｎ物質または加熱処理したＮ物質の水性溶媒
可溶画分を種々の方法で分画して、Ｎ物質よりも抗腫湯
滑性の高い函分を得ることに成功し、本発明を完成する
に至った。

本発明によって得られる物質は、水性溶媒に可溶であり
、Ｎ物質よりもより高い抗腫湯活性を示すこと、Ｎ物質
よりも簡素な組成を有し、毒性も低いと推定されること
から医薬品として好適である。

即ち本発明はミコバクテリウム （Ｍｙｃｏ舷ｃｔｅｒｍｍ）に属する微生物の菌体を破
砕して得られる無細胞抽出液に凝集剤を加えることによ
り生成する沈澱物の水性溶媒可溶画分を分画して得られ
る活性物質および該活性物質を有効成分とする抗自重傷
剤またはアジュバント剤である。

以下該活性物質をＮＡ物質と略称し、該活性物質の製造
方法、性質、用途について詳述する。ＮＡ物質の製造に
使用する微生物はミコバクテリゥム属に属するものより
選定するが、特に好適なものとしてはウシ型結核菌（Ｍ
ｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｍめｖｉｓ）ＢＣＧ日本株、ヒト
型結核菌（Ｍｙｃｏ舷ｃｔｒｉ肌ｍ ｔｕ戊ｒｃのｏｓ
ｉｓ）青山Ｂ株、もしくは日３７ Ｒａ株または恥垢菌
（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｍｓｍｅｇｍａｔｉｓ）ＡＴ
ＣＣ６０７などが挙げられる。

微生物の培養方法や菌体を破砕して活性物質を抽出する
方法は特に限定の必要はなく使用する微生物に応じこれ
に通した通常の方法に従って差支えない。たとえばゥシ
型結核菌の場合にはソートン培地、肉エキスーグリセリ
ン塔地などを用いる３７℃程度の温度で１なし、し８週
間培養することにより良好な培養物が得られ、これを遠
心分離または炉遇して菌体を得ることが出来る。なお培
養型式は静暦培養、振糧培養あるいは渡枠培養等のいず
れでも良い。得られた菌体を水、好ましくは適当な緩衝
液（たとえば１皿Ｍリン酸緩衝液（ＰＨ７．０））と十
分混合し氷冷しながらダィノミル（Ｄ飢ｏ−Ｍｍ）ある
いはフレンチ（Ｆｒｅｎｃｈ）プレスなどにより菌体を
破砕菌体して破砕懸濁液を得る。次いでこの液を炉過ま
たは遠心分離して無細胞抽出液を得ることが出来る。本
発明における無細胞抽出液とは破砕菌体懸濁液から炉過
または遠０分離等により未破砕菌体、部分的に破砕され
た菌体、細胞壁画分等を出来るだけ除いた画分のことで
ある。

無細胞抽出液より活性物質を沈澱させる目的で使用する
凝集剤はかなり広い範囲において選定することができる
。

たとえば、硫酸アルミニウム、塩化マンガン等の無機塩
、ストレプトマイシン、カナマイシンなどの抗生物質ま
たはその塩などが好適である。凝集剤の使用量はその種
類により適宜選択できるが、たとえば無機塩では０．１
〜１０％、好ましくは０．１〜３％、抗生物質では０．
０１〜１０％、好ましくは０．１〜１％を抽出液に対し
て使用するのが適当である。これらの凝集剤を抽出液に
加えＮ物質を沈澱せしめる。

操作方法としてはたとえば前記凝集剤の所定量を要すれ
ば水溶液として抽出液に加え十分にかきまぜた後、室温
以下、好ましくは０００なし・しｌｏｏ０で３０分以上
静遣して沈澱を生成せしめる。この沈澱（Ｎ物質）から
本発明のＮＡ物質を得るには、まず炉過または遠心分離
により勤澱を母液から分離する。得られた沈澱を水性溶
媒に懸濁し、要すれば透析、ゲル炉過、限外炉過等によ
り凝集剤を除去した後、適当な濃度に調製して、炉過ま
たは遠心分離等により不溶物を除去すればＮＡ物質を含
む溶液を得る。またＮＡ物質を含む溶液を分離するまえ
にＮ物質の水性溶媒懸濁液を５０〜１５０ｑ○、望まし
くは６０〜１２０ｏｏで５〜１２０分間加熱しても良い
。

特にこの場合、水性溶媒に小量の無機塩を含ませると、
加熱冷却後の不溶物除去の際にＮＡ物質を含む溶液の分
離効率が良く、清澄なＮＡ物質を含む溶液が得られる。
本発明における水性溶媒とは水または適当な種類の電解
質の水溶液である。

水または適当な種類の緩衝液は、その好適なものとして
挙げられ、そのｐＨは中性附近が良い。

ＮＡ物質を含む溶液が分子節効果をもつ坦体あるいは、
イオン交換能を有する担体を用いたカラムクロマトグラ
フィーまたは、塩基性の沈澱剤を用いた分別沈澱法等に
よりＮＡ物質は、活性画分として効率良く分離出来る。
これらの方法によって分離した活性画分を要すれば透析
もしくは有機溶剤処理等によって混在する無機塩または
沈澱剤を除去すればＮＡ物質が得られ、さらに要すれば
、この溶液を凍結乾燥すればＮＡ物質の固体が得られる
。ＮＡ物質は主として核酸、多糖類よりなる抗腫湯活怪
物質である。

ＮＡ物質は、単独にもしくは抗原物質とともに動物に投
与されるが、その投与形態は水に溶解した水溶液あるい
は油に懸濁した乳濁物のいずれの形態でも用いることが
出来る。

例えばＮＡ物質は生理食塩水に溶解した溶液、あるいは
この溶液をさらに植物油もしくは鉱物油に懸濁した懸濁
液（油中水型）あるいはＮＡ物質を直接植物油もしくは
鉱物油に懸濁した後さらにこの懸濁液を生理食塩水に懸
濁した懸濁液（水中油型）として用いられる。

ＮＡ物質は皮下、皮内、腹腔内、静脈、経口等いずれの
投与経路によっても投与可能である。

ＮＡ物質の用量は動物種および投与経路および投与計画
により適宜選択されるが、マウスに対して腹腔内投与の
場合は１〜２５０のｃ／ｋ９、皮下では１〜５００の９
／ｋ９、モルモットに対しては腹腔内技与の場合は１〜
１００雌／Ｘ９、皮下では０．０５〜１００雌／【９で
ある。ＮＡ物質は各種腫場系に対してＮ物質とほぼ同量
もしくはより少い量で同程度の抗腫場効果を示す。

ＮＡ物質の有効なガン種としては、たとえば、エールリ
ッヒ腹水瞳傷または固型腫場、ザルコーマ１８０腹水腫
場または固型腫湯、Ｂ−１６メラノーマなどが挙げられ
、さらにモルモット、ストレィン２ーライン１０へパト
ーマの腫傷系に対しては原発腫湯の増殖を抑制するだけ
でなく、所属リンパ節への腫傷の転移も抑制し治癒に至
らしめる。

ＮＡ物質は、結核菌を含まないのでＮＡ物質からの感染
の危険は全くない。またＮＡ物質はツベルクリン感作動
物に対してアレルギー反応をほとんど示さない。またＮ
Ａ物質は抗腫場活性物質としては、かなり精製されてい
るので、ＢＣＧ生菌、死菌に比較して、ＮＡ物質の毒性
は極めて低いものと考えられる。

さらにＮＡ物質は、優れたアジュバント活性を示すが、
ＮＡ物質のこの性質は担ガン動物の腫場特異免疫を高め
る上においてＮＡ物質の低毒性と相まって極めて有用で
ある。

この場合、ＮＡ物質はガン生細胞もしくは非増殖性ガン
細胞もしくは種場特異抗原等とともに担ガン動物に投与
される。以下にＮＡ物質の調製法とＮＡ物質を抗腫傷剤
として用いる場合の製剤法を実施例により、さらにＮＡ
物質の有用性を試験例により説明する。

実施例 １ウシ型結核菌ＢＣＧ由来ＮＨＳ物質 ウシ型結核菌（Ｍｙｃｏ舷ｃｔｅｒｉｍｍ奴ｖｉｓ）Ｂ
ＣＧ日本株（予研より分譲）を下記組成の肉エキスーグ
リセリン塔地、すなわち肉エキスーグリセリン塔地（単
位夕） 肉エキス ２０．０リン酸
二カリウム ０．５クエン酸
２．０クエン酸鉄アンモニウム
０．０５硫酸マグネシウム
０．５グリセリン
６０．０水を加えて全量を１〆としたもの、を用
い３７ｑ０で４週間静置培養して得た培養物を、チーズ
クロスを用い炉遇して菌体を採取し、蒸溜水で２回洗縦
して線菌体を得た。

この湿菌体３ｋ９に肌ｈＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）
３〆を加え氷冷下ワーリングプレンダーで懸濁した。

この懸濁液に１皿Ｍリン酸緩衝液を加えて全量を２１夕
にした後ダィノミルにより氷冷しながら菌体を破砕し、
得られた菌体破砕物を冷却下で遠心分離（１００００×
夕、２０分、２回）して無細胞抽出液１６そを得た。こ
の抽出液に４８夕のストレプトマイシン硫酸塩を加え、
十分に縄拝した後０〜４℃で１夜静暦し、生成した凝集
物を冷却下で遠心分離（１００００×夕、２０分）して
採取した。

得られた沈澱を０．８Ｍ食塩含有１仇ｈＭリン酸緩衝液
（ｐＨ７．０）に懸濁して全量を３夕とした、この懸濁
液をセロハン製透析チューブに詰めｏ．卵１食塩含有１
価Ｍリン酸緩衝液３０のこ対して０〜４℃で３回透析し
、次いで蒸溜水３０のこ対して０〜４００で３回透析し
て、Ｎ物質懸濁液を得た。この懸濁液のうち、１れまそ
のまま凍結乾燥して本発明の原料であるＮ物質２０夕を
得た。

次にＮ物質懸濁液１００のとに３００叫の１３．２ｈＭ
リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を加えて燈拝した後、１時
間遠心（１０５０００×夕、０〜４℃）とし上清を得た
。この上清５０机上をセファローズの（ファルマシア会
社製）を詰めた直径５ｃの×長さ９０ｃｍのカラム上端
に負荷し、０．５ ＭＮａＣＩ溶液を用いて毎分２泌の
速度で溶出した。この溶出液をＵＶモニターで監視しな
がら２０の‘ずつ試験管に分画したところ２７本目から
５０本目までに本発明の活性物質のピークが出現したの
でこの画分を集め、セロフアンチュ−ブーに詰めて０〜
４℃で蒸溜水に対して透析した。これらの透析内液を濃
縮した後、凍結乾燥して本発明の活性物質３３の夕を得
た。以下のものをＮＡ−１と略称する。なお、上記カラ
ムの溶出液７０本目から９０本目までに第２のピークが
出現し、その他にピークがみられなかったのでこの画分
をＮＡ−１と同様に処理したところ３８の９の物質を得
た。

以下このものをＮＢ−１と略称する。実施例 ２ 実施例１で得たＮ物質の１０５０００×夕遠心上情２５
０の‘をＯＨ型のＥＣＴＥＯＬＡセルローズ（生化学工
業会社製）を詰めた直径６伽肌×長さ１３肌の力ラムの
上端に負荷し、１．２その他ｈＭリン酸緩衝液（ｐＨ７
．０）および１．２その０．３Ｍ ＮａＣＩ含有１仇ｈ
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で段階的にカラムを洗縦
した後０．８のＮａＣＩ含有１仇ｈＭリンン酸緩衝液（
ｐＨ７．０）を用いて毎分２の‘の速度で溶出した。

この溶出液を２０の‘ずつ試験管に分画して１５本目か
ら６０本目の画分を集め、セロハンチューブに詰めて０
〜４℃で蒸溜水に対して透析した。この透析内液を濃縮
した後、凍結乾燥して本発明の活性物質２７の９を得た
ｏ実施例 ３実施例１で得たＮ物質懸濁液１００の“こ
１／１５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）３００の‘を加
えて蝿拝した後１２０こ０で２０分間加熱して直ちに冷
却した。

この懸濁液を２０分間遠心（１００００×夕、０〜４℃
）して得た上清のうち５０の‘をセファローズ砥（ファ
ルマシア会社製）を詰めた直径５弧×長さ９０伽のカラ
ム上端に負荷して０．８ＭＮａＣＩ溶液を用いて毎分２
の上の速度で溶出した。この溶出液を２０の‘ずつ試験
管に分画して３０本目から６９本目までの画分を集め、
セロナンチューフに詰めて０〜４℃で蒸溜水に対して透
析した。

この透析内液を濃縮した後凍結乾燥して、本発明の活性
物質４２の９を得た。以下このものをＮＡ−２と略称す
る。実施例 ４ 実施例１で得たＮ物質懸濁液１００の‘に１００泌の蒸
溜水を加えて麓拝した後、１２０００で２０分間加熱し
た。

冷却後この懸濁液を１時間遠心（１０５，０００×夕、
０〜４００）して上清を得た。この上清１００叫に２．
３夕の食塩を加えて溶解し次に５％のセチルトリメチル
アンモニゥムプロマィド（東京化成工業会社製）含有０
．』Ｍ食塩溶液２７の‘を加えて濃梓した後静鷹すると
沈澱が生成したのでこの沈澱を１０分間遠心（３，００
仇ｐｍ、室温）して集め、適当量のヱタノールで２回洗
雛した後蒸溜水に懸濁し、蒸溜水に対して０〜４℃で透
析した。この透析内液を凍結乾燥して本発明の活性物質
９１服を得た。以下このものをＮＡ−３と略称する。実
施例 ５ ＮＡ物質製剤 実施例１で得たＮＡ−１ ５の９に生理食塩水１０の‘
を加えて溶解し、ＮＡ物質の生理食塩水溶液を得た。

実施例 ６ Ｎ物質製剤 実施例１で得たＮＡ−１ １５の９に生理食塩水２．５
の‘を加えて溶解した後、１５％アーラセルＡ（〜ｌａ
ｃｅＩＡ、アトラスケミカルインダストリーズ会社）を
含む流動パラフィン２．５泌を加えホモジナィズして油
中水型のＮＡ物質製剤を得た。

試験例 １ＮＡ物質の組成 本発明のＮＡ物質の若干の例について、その組成を第１
表に示す。

組成分析は次の各方法による。｛１｝ 糖質 フェノー
ル硫酸法（ＭＤｕめｉｓｅｔａｌ．，Ａｎａｌれｉｃａ
ＩＣｈｅｍｉｓｔり２群蓋．３５０頁１９５６年）‘２
｝ タンパク費 ローリー法（Ｃ．Ｄ．Ｓｔａｕｆｆｅ
「，抑ａＭｉｃａＩ Ｂｊｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ６９巻
、６４６頁、１９７５３Ｅ）糊 脂質 ブラィ・ダイヤ
一法（日．Ｇ．Ｂ１ｉｇｈａｎｄＷ．Ｊ．Ｄｙｅｒ，Ｃ
ａｎ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈ侭ｉｏｌ．，３７巻、
９１１頁、１９５乎王）により抽出して秤量｛４）核酸
シュミット・タンハウザー・シュナィダー法（Ｗ．Ｃ
．Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１
６４巻、７４７頁、１９４６年）により分画し、ＤＮＡ
はジフェニルアミン反応（ＫＢｕｒｔｏｎ，Ｂｊｏｃｈ
ｅｍ．Ｊ．６２巻、３１５頁、１９５６年）により定量
し、ＲＮＡはオルシノール反応（Ｗ．Ｍｉ功ａｍ，Ｚ．
Ｐｈ＄ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８巻、１１刀頁、１９３
￥王）により定量第１表 ＮＡ物質の組成 試験例 ２ マウスザルコーマ固型種場に対する抗腫場作用１群８匹
のＩＣＲ系雌性マウスの皮内にザルコーマ（Ｓａｒｃｏ
ｍａ）１８０種場細胞２×１ぴケ／匹を接種し、種場径
が約５側に達した後、実施例５の方法により製剤した抗
腫場剤０．１の‘を週２回ずつ合計６回腫場内へ投与し
た。

腫傷接種後４週目における治癒動物の数を第２表に示す
。比較としてＮＡ物質に代えＮ物質を同量用いた製剤、
対照例として活性物質を含まない同様の組成の製剤を用
いた。

第２表 マウスザルコーマ１８０固型 瞳湯に対する抗腫場作用 試験例 ３ モルモット、ヘパトーマに対する抗腫賜作用一群３匹の
ストレイン（ｓｔｒａｉｎ）２モルモットに同系腫擬ラ
イン１０へパトーマ（Ｌｉｎｅ ｌｏｈｅｐａｔｏｍａ
）の腫湯細砲１×１び個／匹を皮内接種し、腹湯の直径
が約８．５〜１０側に達したとき、本発明の活性物質を
実施例６の方法で製剤した抗腫場剤０．１舷を種場内に
投与した。

腫陽細胞を接種して８週目までの生存例数および原発腫
場の退縮例数および所属リンパ節に転移した種場の退縮
例数を測定し、第３表の結果を得た。第３表 モルモッ
トへパトーマにヌ寸する抗腫場作用試験例 ４ツベルク
リン皮内反応活性 体重３５０タ前後のＢＣＧ感作モルモット（世Ｍｅｙ系
雌性）６頭を試験動物として用いた。

ＢＣＧ感作モルモットの背部を剃毛後１００一タノの‘
および１０００山夕／泌の検体および５０ｍ夕／泌の市
販の精製ツベルクリン（ＰＰＤ）を０．１泌ずつ皮内に
注射した。注射２独特間後に注射部位に生じた硬結の長
径および短径を計測しその平均値をツベルクリン皮内反
応値とした。検体およびＰＰＤの皮内反応値を第４表に
示した。第４表 ＢＣＧ感作モルモット に対する皮内反応活性 試験例 ５ ｉｎＶｒｔｒｏのマクロフアージ活性化作用１０％プロ
テオーズベプトン溶液１の‘を腹腔内に投与したＣ５７
ＢＬ／６マウスから４日後に腹腔浸出細胞を集め、この
細胞をマイクロプレートに２×１び細胞／ウェルづつ分
注した。

各ウェルには検体を所定濃度に分注して直ちに３７０の
Ｃ０２インキュベーターで４時間培養した後、培養上清
を棄て、さらに１回新鮮塔地で洗いゥェルに付着した細
胞のみとした。これに同系のＥＬ４瞳場細胞を２×１ぴ
細胞／ウヱルづつ新鮮培地とともに分注し３７ｏ０ Ｃ
０２ィンキュベータ一で培養した。培養２４時間後に細
‐ＴｄＲを０．０３〃Ｃ，／ゥェェルづっ添加しさらに
１曲時間培養して細胞を集めそれぞれのゥェルのＥＬ４
細胞に取り込まれた細‐Ｔ服の比放射能（ｃｐｍ）をシ
ンチレーションカランターで計測した。検体によるマク
ロフアージ活性化能は次式によつた。

検体を分注したウェルのＣＰｍ マクロフアージ活性化能（％）＝（１−検体を含まない
伐寸照）のウェルのＣｐｍ）×１００結果は第５表に示
した。

第５表 港ｎ性花ｉをｒ甫のマクロフア−ジ以上試験例
２，３，４及び５から明らかな通り発明の活性物質（Ｎ
Ａ−１〜４）は他に比較し優れた抗腫賜活性及びアジュ
バント活性が認められた。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ ミコバクテリウム属に属する微生物の菌体を破砕し
   て得られる無細胞抽出液に凝集剤を加えることにより生
   成する沈澱物の水性溶媒可溶画分を分画して得られ下記
   の性質を有する抗腫瘍活性及びアジユバンド活性物質。 （イ）ツベルクリン感作動物に対してアレルギー反応を
   ほとんど示さない。（ロ）糖質含有量１７．８〜２０．
   １％。 但し、グルコースを標準物質とするフエノール硫酸法に
   よる。（ハ）タンパク質含有量５．３〜１７．８％。但
   し、ウシ血清アルブミンを標準物質とするローリー法に
   よる。（ニ）脂質含有量０〜４．７％。 但し、ブライ・ダイヤー法による。（ホ）核酸含有量４
   ８．６〜８５．７％。 但し、仔牛胸線ＤＮＡを標純物質とするシユミツト・タ
   ンハウザー・シユナイダー法による。２ ミコバクテリ
   ウム属に属する微生物の菌体を破砕して得られる無細胞
   抽出液に凝集剤を加えることにより生成する沈澱物の水
   性溶媒可溶画分を分画して得られ下記の性質を有する活
   性物質を有効成分とする抗腫瘍剤またはアジユバンド剤
   。 （イ）ツベルクリン感作動物に対してアレルギー反応を
   ほとんど示さない。（ロ）糖質含有量１７．８〜２０．
   １％。 但し、グルコースを標準物質とするフエノール硫酸法に
   よる。（ハ）タンパク質含有量５．３〜１７．８％。但
   し、ウシ血清アルブミンを標準物質とするローリー法に
   よる。（ニ）脂質含有量０〜４．７％。 但し、ブライ・ダイヤー法による。（ホ）核酸含有量４
   ８．６〜８５．７％。 但し、仔牛胸線ＤＮＡを標準物質とするシユミツト・タ
   ンハウザー・シユナイダー法による。