WO1998037757A1 - Cellules multipotentes comprenant des genes intrinseques dissocies - Google Patents

Cellules multipotentes comprenant des genes intrinseques dissocies Download PDF

Info

Publication number
WO1998037757A1
WO1998037757A1 PCT/JP1998/000860 JP9800860W WO9837757A1 WO 1998037757 A1 WO1998037757 A1 WO 1998037757A1 JP 9800860 W JP9800860 W JP 9800860W WO 9837757 A1 WO9837757 A1 WO 9837757A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
gene
human
cells
antibody
chromosome
Prior art date
Application number
PCT/JP1998/000860
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Kazuma Tomizuka
Hitoshi Yoshida
Kazunori Hanaoka
Mitsuo Oshimura
Isao Ishida
Original Assignee
Kirin Beer Kabushiki Kaisha
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kirin Beer Kabushiki Kaisha filed Critical Kirin Beer Kabushiki Kaisha
Priority to DE69835145T priority Critical patent/DE69835145T2/de
Priority to JP53752598A priority patent/JP4082740B2/ja
Priority to AU61189/98A priority patent/AU6118998A/en
Priority to EP98905731A priority patent/EP0972445B1/en
Publication of WO1998037757A1 publication Critical patent/WO1998037757A1/ja

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A01K67/0276—Knock-out vertebrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A01K67/0278—Knock-in vertebrates, e.g. humanised vertebrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2207/00—Modified animals
    • A01K2207/15—Humanized animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A01K2217/075—Animals genetically altered by homologous recombination inducing loss of function, i.e. knock out
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/01—Animal expressing industrially exogenous proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2517/00—Cells related to new breeds of animals
    • C12N2517/02—Cells from transgenic animals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/30—Vector systems comprising sequences for excision in presence of a recombinase, e.g. loxP or FRT

Definitions

  • the present invention relates to a chimeric non-human animal, a method for producing the same, and a method for using the same.
  • the use of the chimeric non-human animal of the present invention makes it possible to retain and express a foreign large DNA fragment of 1 Mb (million base pairs) or more, which has been impossible so far, in an animal individual. Therefore, by using this,
  • -Can be used to create animal models for human dominant genetic diseases and chromosomal disorders.
  • the present invention relates to a pluripotent carrier having a disrupted endogenous gene and use thereof, a method for producing a chimeric animal using a microcell method, and use of the chimeric animal.
  • a foreign chromosome or a fragment thereof containing a gene encoding the same or homologous gene product as the disrupted endogenous gene is transferred to a cell of the present invention as a recipient cell, and the desired functional cell or chimeric non-chimeric cell is transferred from the cell. If a human animal is produced, the transgene can be expressed efficiently without causing the pluripotent cells to differentiate into germline cells.
  • the technology for expressing a foreign gene in an animal individual is not only useful for obtaining information on the in vivo function of the gene, but also for identifying a DNA sequence that regulates gene expression (for example, Magram Et al., Nature, 315: 338, 1985); Development of human disease model animals (Yamamura et al., Manual disease model mouse, Nakayama Shoten, 1994); and breeding of livestock (eg, Muiler et al., Experien tia, 47: 923). , 1991), and has been used for producing useful substances using the same (eg, Velander et al., PNAS, 89: 12003, 1992). Mice have been most frequently used for gene transfer.
  • mice that have been studied in detail as experimental animals and have established embryo manipulation techniques can be said to be the most suitable mammals for this purpose.
  • ES cells embryonic stem cells
  • the transgene in the chimeric mouse, the transgene is retained in all cells and tissues only in the cells and tissues that contributed the ES cells, and in the progeny obtained through the germ cells derived from the ES cells. Many transgenic mice have been produced using these techniques.
  • mice Useful and interesting human genes to be introduced into mice: antibodies (eg, Cook et al., Nature Genetics, 7: 162, 1994), T cell receptors (Hood et al., Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology) , Vol. LVI 11, 339, 1993), histocompatibility antigens (Carrol et al., PNAS, 84: 8535, 1987), dystrophin (Den Dunnen et al., Supra), and the like have large coding regions of more than 1 Mb.
  • G-bands obtained by Giemsa staining of metaphase chromosomes usually have a size of several Mb to 10 Mb or more. Therefore, even if it is clear that a certain causative gene exists on a specific G band, chromosomal fragments (several Mb or more) around the causative gene must be derived in order to introduce these abnormal traits into mice. Man However, this is not possible with current technology.
  • a DNA having a size exceeding the above-mentioned limit In a cultured animal cell, it is possible to introduce a DNA having a size exceeding the above-mentioned limit by a conventional technique. This is mainly done using chromosomes (having a size of about 50-300 Mb in humans) as media. Although several methods for transferring chromosomes into cells have been reported (eg, McBride et al., PNAS, 70: 1258, 1973), among them, it is considered to be the best method for introducing only one desired chromosome. This is the microcell method (Koi et al., Jpn. J. Cancer Res., 80: 413, 1989). A structure called a microcell is one in which one or several chromosomes are enveloped in the nuclear membrane and plasma membrane.
  • chromosomes it is possible to introduce a small number (often one) of chromosomes by isolating microcells induced by drugs that inhibit pituitary formation in certain cells and fusing them with recipient cells.
  • a library of hybrid cells containing a single human chromosome obtained by this method is used to map known genes and identify chromosomes containing unknown tumor suppressor genes, cell senescence genes, etc. (Eg, Saxon et al., EMBO J., 5: 3461, 1986).
  • fragment a chromosome and introduce a part of it by irradiating a microcell with gamma rays (Koi et al., Science, 260: 361, 1993). That is, the microcell method is considered to be suitable as a method for introducing DNA exceeding 1 Mb into cultured animal cells.
  • mice cells that stably maintain totipotency (Evans et al., Nature, 292: 154, 1981). Introduced into the ES cells are foreign genes, various mutations, and mutations by target gene recombination, and genetic modification at the mouse individual level has become possible (for example, Mansou'r Et al., Nature, 336: 348, 1988). Using such ES cells, a mouse in which the target gene has been disrupted by gene targeting can be produced and crossed with a transgenic mouse into which the target gene has been introduced, thereby producing a mouse that efficiently expresses the target gene. .
  • a mouse in which a mouse antibody gene has been disrupted and a mouse in which a human antibody gene has been introduced can be bred to efficiently express a human antibody gene.
  • Normal diploid cells Has alleles.
  • the concentration of human antibody in the mouse serum increases, and in mice in which both alleles have been disrupted by mating, the antibody concentration further increases.
  • ES cells may lose the ability to differentiate and proliferate depending on the culture conditions.Two times of gene targeting do not lose the ability to differentiate into germ cells of chimeric mice, but the frequency of homologous recombination in the second stage is low. Because of extremely low levels (Katsuki et al., Experimental Medicine Vol. 11 No. 20 special edition 1993), target gene deletion When obtaining homozygotes, especially when there are two or more target genes, each target gene is hetero-deleted In many cases, mice that have been bred and then crossed to produce mice deficient in two or more genes are homozygous (N. Longber et al., Nature, 368: 856-859, 1994).
  • the human chromosomes we can obtain are usually those of finitely growing normal fibroblasts or differentiated somatic cells such as cancer cells, and the chromosomes derived from such somatic cells are undifferentiated ES cells. When introduced into cells, it was thought that ES cells might differentiate (Muller et al., Nature, 311: 438, 1984) or age (Sugawara, Science, 247: 707, 1990).
  • somatic cell-derived chromosomes when introduced into early embryos, can function properly during embryonic development, as do germ cell-derived chromosomes, and are responsible for specific gene expression in diverse tissues and cells There are very few studies on.
  • One of the major differences between the two is presumed to be the methylation status of the chromosomal DNA. This changes with cell differentiation, suggesting an important role in tissue-specific gene expression (Ceder, Cell, 53: 3, 1988).
  • a site-specific DNA recombination reaction essential for antibody gene activation when a methylated substrate is introduced into B cells, the methylation state is maintained after replication, inhibiting the recombination reaction.
  • the present invention provides a chimeric non-human animal that holds a foreign chromosome or a fragment thereof and expresses a gene on the chromosome or a fragment thereof, a progeny thereof, and a method for producing the chimeric non-human animal.
  • the purpose is to:
  • Another object of the present invention is to provide tissues and cells derived from the chimeric non-human animal and its progeny.
  • the present invention provides a method for producing a biologically active substance which is an expression product of a gene on a foreign chromosome or a fragment thereof using an individual, tissue or cell of a non-human animal.
  • the purpose is to do.
  • the present invention is used as a recipient cell for transferring a foreign chromosome or a fragment thereof in preparing a chimeric non-human animal that retains a foreign chromosome or a fragment thereof and expresses a gene on the chromosome or a fragment thereof.
  • Cells that retain possible pluripotency The purpose is to provide.
  • Another object of the present invention is to provide a method for utilizing the cells having pluripotency. Disclosure of the invention
  • the present inventors have conducted intensive studies to solve the above-mentioned problems, and as a result, obtained a chromosome derived from human normal fibroblasts or a partial fragment thereof into mouse ES cells by a microcell method, and obtained a strain stably retaining the cells. succeeded in. Furthermore, from this ES cell line, a chimeric mouse was obtained which retained human chromosomes in its normal tissue and expressed a plurality of human genes including a human antibody heavy chain gene. With this series of methods, we have made it possible to retain large DNA fragments in individuals and to express genes on the DNA fragments, which were not possible before. Furthermore, the inventors have also succeeded in obtaining embryonic stem cells in which both the antibody heavy chain gene and the antibody light chain gene have been knocked out.
  • the gist of the present invention is as follows.
  • a microcell containing one or more foreign chromosomes or fragments thereof is prepared, and the single or plural foreign chromosomes or fragments thereof are transferred to cells having pluripotency by fusing with the microcells.
  • a method for producing a chimeric non-human animal is described.
  • the single or multiple foreign chromosomes or fragments thereof may exceed 670 kb and may be 1 Mb (million base pairs) or more.
  • the foreign chromosome or a fragment thereof may include a region encoding an antibody.
  • Microcells containing single or multiple foreign chromosomes or fragments thereof can be obtained from hybrid cells prepared by fusing cells containing single or multiple foreign chromosomes or fragments thereof with cells having high microcell-forming ability. It may be induced.
  • microcells containing one or more foreign chromosomes or fragments thereof The cell may be derived from a cell produced by fusing a microcell derived from the hybrid cell with a cell having a higher ability to form a microcell.
  • Cells containing one or more foreign chromosomes or fragments thereof may be human normal diploid cells.
  • the cells having a high ability to form microcells may be mouse A9 cells.
  • Cells that retain pluripotency can be selected from the group consisting of embryonic carcinoma cells, embryonic stem cells, embryonic germ cells and variants thereof.
  • the foreign chromosome or a fragment thereof contains the gene of interest, and the cell that retains pluripotency has its endogenous gene identical or homologous to the gene of interest on the foreign chromosome or fragment thereof destroyed. Good to be.
  • the foreign chromosome or a fragment thereof contains at least two types of target genes, and the cell having pluripotency has the same or homologous endogenous gene as the target gene on the foreign chromosome or a fragment thereof. It may be destroyed. In a cell that retains pluripotency, alleles on both sides or one side of an endogenous gene that is the same or homologous to the target gene may be disrupted.
  • the gene of interest may be an antibody gene.
  • the antibody gene may be an antibody heavy chain gene and an antibody light chain gene.
  • the foreign chromosome or a fragment thereof contains the gene of interest, and an endogenous gene identical or homologous to the gene of interest on the foreign chromosome or a fragment thereof is disrupted.
  • the strain of a strain deficient in the cell and an endogenous gene identical or homologous to the gene of interest is deleted.
  • Chimeras with non-human animal embryos may be produced.
  • a non-human animal of a strain deficient in an endogenous gene which is the same as or homologous to the gene of interest can be prepared by the target gene homologous recombination method.
  • a chimeric non-human animal can carry one or more foreign chromosomes or fragments thereof, express a gene on the foreign chromosome or fragments thereof, and transmit the foreign chromosome or fragments thereof to progeny.
  • the chimeric non-human animal is preferably a mammal, more preferably a mouse.
  • Single or multiple foreign chromosomes or fragments thereof may be larger than 670 kb.
  • the foreign chromosome or a fragment thereof contains the target gene, and in the cells retaining pluripotency, the same or homologous endogenous as the target gene on the foreign chromosome or fragment thereof The gene may be disrupted.
  • a foreign chromosome or a fragment thereof contains at least two types of target genes, and in a cell that retains pluripotency, the same or the same as the target gene on the foreign chromosome or a fragment thereof.
  • a homologous endogenous gene may be disrupted.
  • a cell that retains pluripotency it is preferable that alleles on both sides or one side of the same or homologous endogenous gene as the target gene are disrupted.
  • the foreign chromosome or a fragment thereof may contain an antibody gene.
  • the antibody gene may be an antibody heavy chain gene and an antibody light chain gene.
  • Cells that retain pluripotency can be selected from the group consisting of embryonic carcinoma cells, embryonic stem cells, embryonic germ cells and variants thereof. The three cells can be used to create chimeric non-human animals.
  • a chimeric non-human animal that retains one or more foreign chromosomes or fragments thereof and expresses a gene on the foreign chromosome or fragment thereof, or the above-mentioned single or multiple foreign chromosomes or A progeny that retains the fragment and expresses the gene on the foreign chromosome or fragment thereof.
  • the foreign chromosome or a fragment thereof may contain the target gene, and an endogenous gene identical or homologous to the target gene may be disrupted.
  • the foreign chromosome or its fragment contains at least two types of target genes, and an endogenous gene identical or homologous to the target gene may be disrupted. Alleles on both sides or one side of the endogenous gene which is the same as or homologous to the target gene may be disrupted.
  • the target gene may be an antibody gene.
  • the antibody gene may be an antibody heavy chain gene and an antibody light chain gene.
  • a chimeric non-human animal or a non-human animal that retains one or more foreign chromosomes or fragments thereof obtained by crossing the offspring thereof and expresses a gene on the foreign chromosome or fragments thereof; Or a progeny that retains one or more foreign chromosomes or fragments thereof and expresses a gene on the foreign chromosomes or fragments thereof 6.
  • a non-human animal produced by crossing a progeny with a non-human animal of a strain deficient in the same or homologous gene as the gene, or the above-mentioned single or plural foreign chromosomes or fragments thereof A progeny thereof that retains and expresses the gene on the foreign chromosome or fragment thereof.
  • the cells may be B cells or primary cells derived from animal tissues or cells fused with established cells.
  • a hybridoma produced by fusion of the above B cell and myeloma cell 9.
  • a method for producing a biologically active substance comprising expressing a gene on a fragment and recovering a biologically active substance as a product thereof.
  • the cells of the chimeric non-human animal may be B cells.
  • B cells may be immortalized by fusion with myeloma cells.
  • the cell of the chimeric non-human animal may be a primary cultured cell derived from animal tissue or a cell fused with a cell line.
  • the biologically active substance may be an antibody.
  • the antibody is preferably a mammalian antibody, more preferably a human antibody.
  • a non-human animal that retains and expresses at least one human antibody gene over 670 kb.
  • Non-human animals should retain and express at least one human antibody gene of 1 Mb or more.
  • Human antibody genes include human heavy chain gene, human light chain / c gene, and human It may be the light chain l gene or a combination thereof. Further, in the 12 non-human animals, it is preferable that the same or homologous non-human animal antibody gene as the human antibody gene is deleted. Deletion of the non-human animal antibody gene that is the same or homologous to the human antibody gene may be due to the disruption of the non-human animal gene by homologous recombination.
  • Non-human animals expressing at least one class or subclass of human antibody c In non-human animals of c15, endogenous homologous or homologous to the gene of the class or subclass of human antibody expressed The gene may be deleted.
  • the class or subclass of the human antibody may be IgM, IgG, IgE, IgA, IgD and subclasses thereof, or a combination thereof.
  • a non-human animal that retains one or more foreign DNAs exceeding 670 kb and expresses a gene on the foreign DNAs.
  • the same or similar endogenous gene as the gene on the foreign DNA to be expressed may be deleted.
  • the 16 non-human animals may carry one or more foreign DNAs of 1 Mb or more and express the gene on the foreign DNAs.
  • An endogenous gene that is the same as or homologous to the expressed foreign DNA gene may be deleted.
  • a method for producing a transgenic non-human animal comprising transferring the cell and transplanting it into an unfertilized egg in which the nucleus of the cell has been enucleated.
  • the disrupted endogenous gene may be an antibody gene.
  • the disrupted antibody gene may be an antibody heavy chain gene and an antibody light chain gene.
  • Cells that retain pluripotency include embryonic carcinoma cells, embryonic stem cells, and embryos It can be selected from the group consisting of sexual germ cells and variants thereof.
  • one allele of an endogenous gene of a cell retaining pluripotency is disrupted by homologous recombination using a drug resistance marker gene, and the cell is cultured in the presence of the drug
  • the method may include the step of selecting strains that have become drug-resistant and screening these strains to obtain strains in which alleles on both sides of the endogenous gene have been disrupted.
  • Homologous recombination using a drug resistance marker gene disrupts one allele of the endogenous gene of a cell that retains pluripotency, and uses the drug resistance marker gene for the other allele of the endogenous gene. It may be destroyed by homologous recombination.
  • the drug resistance marker gene used in homologous recombination to destroy one allele of the endogenous gene is the same type as the drug resistance marker gene used in homologous recombination to destroy the other allele. You may.
  • the drug resistance marker gene used for homologous recombination to destroy one allele of the endogenous gene is different from the drug resistance marker gene used for homologous recombination to destroy the other allele. There may be.
  • the present invention provides a method for using the cell having pluripotency as described above as a recipient cell for transferring a single or multiple foreign genes or fragments thereof or a single or multiple foreign chromosomes or fragments thereof.
  • Single or multiple foreign genes or fragments thereof may be integrated into a vector such as plasmid, cosmid, YAC, etc.Single or multiple foreign chromosomes or fragments thereof may be contained in a microcell.
  • the single or multiple foreign chromosomes or fragments thereof to be transferred may contain the same or homologous genes as the endogenous genes disrupted in cells that retain pluripotency, but are not particularly limited. Absent.
  • “homologous gene” refers to a gene that encodes a protein having the same or similar properties between or within species.
  • the present invention provides a method for using the above-mentioned cell retaining pluripotency for producing a chimeric non-human animal.
  • the present invention provides a microcell containing a single or a plurality of foreign chromosomes or a fragment thereof, and by fusion with the microcell, at least two of the above-mentioned types. Transferring the single or multiple foreign chromosomes or fragments thereof to cells having pluripotency in which an inducible gene has been disrupted, characterized in that the differentiation includes single or multiple foreign chromosomes or fragments thereof.
  • a method for producing a cell that retains pluripotency, and a microcell containing one or more foreign chromosomes or a fragment thereof is produced, and the fusion with the microcell is used to produce at least the two endogenous genes described above.
  • a method for producing a chimeric non-human animal which comprises transferring the single or plural foreign chromosomes or fragments thereof to cells having pluripotency in which the cells have been disrupted.
  • One or more foreign chromosomes or fragments thereof may have a size of more than 1 Mb (million bases).
  • the foreign chromosome or a fragment thereof may include a region encoding an antibody.
  • Microcells containing single or multiple foreign chromosomes or fragments thereof are hybrids prepared by fusing cells containing single or multiple foreign chromosomes or fragments thereof with cells having high microcell-forming ability. It may be derived from cells.
  • Microcells containing one or more foreign chromosomes or fragments thereof were derived from cells produced by fusing the microcells derived from the hybrid cells with cells having higher microcell-forming ability. It may be something. Cells containing one or more foreign chromosomes or fragments thereof may be human normal diploid cells. The cells having high microcell forming ability may be mouse A9 cells. In the above-described method for producing a chimeric non-human animal, at least two types of endogenous genes are disrupted into cells having pluripotency, and the same or the same as the endogenous genes disrupted in the cells.
  • Non-human animals of a strain deficient in the same or homologous gene as the disrupted endogenous gene in cells retaining pluripotency in which at least two endogenous genes have been disrupted are targeted It may be produced by the gene homologous recombination method.
  • a chimeric non-human animal has one or more foreign chromosomes or a fragment thereof, expresses a gene on the foreign chromosome or a fragment thereof, and is capable of transmitting the foreign chromosome or a fragment thereof to progeny. Good to be.
  • the chimeric non-human animal is often a mammal, more preferably a mouse.
  • the present invention also provides a microcell containing one or more foreign chromosomes or fragments thereof, and at least two of the above-mentioned endogenous genes have been destroyed by fusion with the microcell.
  • Transferring the single or multiple foreign chromosomes or fragments thereof to cells that retain pluripotency by a method for producing a chimeric non-human animal Provided is a cell containing a plurality of foreign chromosomes or fragments thereof and having pluripotency.
  • the present invention further provides a method for using the above-mentioned cells for producing a chimeric non-human animal.
  • the present invention can be produced by the above-described method for producing a chimeric non-human animal, comprising one or more foreign chromosomes or fragments thereof, and expressing a gene on the foreign chromosome or fragments thereof. Or an offspring that retains the above-mentioned single or plural foreign chromosomes or fragments thereof and expresses a gene on the foreign chromosomes or fragments thereof.
  • the present invention provides a non-human animal which retains one or more foreign chromosomes or fragments thereof obtained by crossing the chimeric non-human animal or progeny thereof and expresses a gene on the foreign chromosome or fragments thereof.
  • the present invention provides an animal or one or more foreign chromosomes or a fragment thereof, and provides a progeny thereof expressing the gene on the foreign chromosome or the fragment thereof. Further, the present invention provides a tissue and a cell derived from the chimeric non-human animal or progeny thereof, or the non-human animal or progeny thereof. The cell may be a B cell. The present invention also provides a hybridoma produced by fusing a myeloma cell with a cell derived from the chimeric non-human animal or progeny thereof or a non-human animal or progeny thereof.
  • the present invention relates to the above-mentioned chimeric non-human animal or its progeny or the above-mentioned non-human animal, which retains one or more foreign chromosomes or fragments thereof and expresses the gene on the foreign chromosome or fragment thereof.
  • a non-human animal produced by crossing a progeny thereof with a non-human animal of a strain deficient in the same or a similar gene as the gene, or the above-mentioned single or plural foreign chromosomes or The present invention provides a progeny that retains the fragment and expresses the foreign chromosome or a gene on the fragment.
  • the present invention provides a method for expressing a gene on a single or plural foreign chromosomes or fragments thereof in an individual, tissue or cell of the chimeric non-human animal or progeny thereof or the non-human animal or progeny thereof. And recovering the biologically active substance as a product thereof.
  • the cells of the non-human animal or its progeny or the cells of the non-human animal or its progeny may be B cells.
  • B cells may be immortalized by fusion with myeloma cells.
  • the biologically active substance may be an antibody, and the antibody may be a mammalian antibody, more preferably a human antibody.
  • the present invention provides a chimeric non-human animal or its progeny or a non-human animal which holds the above-mentioned single or plural foreign chromosomes or fragments thereof and expresses a gene on the foreign chromosome or fragments thereof.
  • the offspring is bred to a non-human animal of a strain deficient in the same or homologous gene as the gene, and the above-mentioned single or multiple foreign chromosomes are obtained in a born offspring individual, tissue or cell.
  • the present invention provides a method for producing a biologically active substance, which comprises expressing a gene on a fragment thereof and collecting a biologically active substance as a product thereof.
  • the present invention also provides a vector for introducing a gene into a non-human animal and a non-human animal cell comprising a foreign chromosome.
  • the foreign chromosome is preferably derived from human, and is more preferably a human chromosome 14 fragment.
  • the non-human animal is preferably a mouse.
  • allele is hereinafter referred to as “allele”.
  • homologous gene refers to a gene that encodes a protein having the same or similar properties between or within biological species.
  • Fig. 1 shows the results of analysis (PCR analysis) of A9 cells carrying human chromosome 2 (fragment).
  • Figure 2 shows that the E14 resistant strain retains human chromosome 22 (fragment). (PCR analysis).
  • FIG. 3 is an electrophoretic photograph showing that the human L1 sequence is retained in the ES cell-derived chimeric mouse into which chromosome 22 has been introduced (Southern analysis).
  • FIG. 4 is an electrophoresis photograph showing the appearance of human chromosome retention in the human chromosome 22-introduced chimeric mouse organ (PCR analysis).
  • FIG. 5 is an electrophoresis photograph showing the results of human gene expression (RT-PCR) in a human chromosome 22-introduced chimeric mouse.
  • FIG. 6 is an electrophoresis photograph showing the results of human gene expression (RT-PCR) in the chimeric mouse organ into which the chromosome 22 was introduced.
  • FIG. 7 shows that the E14 resistant strain retains human chromosome 4 (fragment) (PCR analysis).
  • FIG. 8 is an electrophoretic photograph showing the results of detection (Southern analysis) of the human L1 sequence in the E14 cell line into which human chromosome 4 has been introduced.
  • FIG. 9 is an electrophoretic photograph showing that the human L1 sequence is retained in the ES cell-derived chimeric mouse into which human chromosome 4 has been introduced (Southern analysis).
  • FIG. 10 shows that chromosome 14 (fragment) of human is retained in the TT2-resistant strain (PCR analysis).
  • FIG. 11 is an electrophoresis photograph showing the state of retention of the human chromosome in the chimeric mouse organ derived from human chromosome 14-introduced ES cells (PCR analysis).
  • FIG. 12 shows the results of the G418 resistance test of fibroblasts derived from the tail.
  • FIG. 13 shows the human antibody IgM concentration (ELISA) in the serum of human serum albumin-immunized chimeric mice.
  • FIG. 14 shows the human antibody IgG concentration (ELISA) in the serum of human serum albumin-immunized chimeric mice.
  • FIG. 15 shows the results of an analysis (ELISA) of the human IgM-producing hybridoma clone H4B7.
  • FIG. 16 is a photograph of a chromosome morphology showing the results of FISH analysis of a mouse ES cell line (TT2 cell line PG15) that has a human chromosome 2 partial fragment and a chromosome 14 partial fragment.
  • Figure 17 shows anti-human serum albumin in the serum of human serum albumin-immunized chimeric mice. An increase in human IgG antibody titers is shown.
  • FIG. 18 shows the increase in anti-human serum albumin human Ig / antibody titer in the serum of human serum albumin-immunized chimeric mice.
  • FIG. 19 is an electrophoresis photograph showing the result of detection (Southern analysis) of the human L1 sequence in the human chromosome 22-transfected TT2 cell line.
  • FIG. 20 shows an increase in the anti-human serum albumin human IgA antibody titer in the serum of the human serum albumin-immunized chimeric mouse.
  • FIG. 21 is a photograph showing that the human chromosome 2 partial fragment was retained in the offspring of the chimeric mouse into which the human chromosome 2 partial fragment was introduced (PCR analysis).
  • FIG. 22 shows the presence of cells that strongly express human chains on the cell surface in the spleen of a human chimeric chromosome 14 chimeric mouse (flow cytometry analysis).
  • FIG. 23 shows the structure of pLoxP-STneo plasmid DNA.
  • FIG. 24 shows the structure of the genomic DNA of the mouse antibody heavy chain Cz.
  • FIG. 25 shows the structure of the mouse antibody light chain / genomic DNA.
  • FIG. 26 shows the mouse antibody heavy chain C targeting vector, the probe used for the Southern blot of the genomic DNA of the transformant TT2F cell, and the DNA fragment detected by the homologous recombinant.
  • FIG. 27 shows a mouse antibody light chain targeting vector, a probe used for Southern blotting of genomic DNA of a transformant TT2F cell, and a DNA fragment detected by a homologous recombinant.
  • FIG. 28 is an electrophoretic photograph showing the results of Southern analysis of a mouse antibody heavy chain homologous recombinant and a high concentration G418-resistant strain derived from the homologous recombinant.
  • FIG. 29 is an electrophoresis photograph C showing the results of Southern analysis of a mouse antibody light chain homologous recombinant.
  • FIG. 30 shows the structure of pLoxP-PGKPuro plasmid DNA.
  • Figure 31 shows that the mouse antibody light chain / c targeting vector and the probe used for the Southern blot of the transformant TT2F cell genomic DNA and the homologous recombinant should be detected.
  • Figure 32 shows the results of Southern analysis of a high-concentration G418-resistant strain derived from a mouse antibody light chain homologous recombinant. It is an electrophoresis photograph showing a result.
  • FIG. 33 shows the increase in anti-HSA human IgH antibody titer in the serum of HSA-immunized chimeric mice.
  • FIG. 34 is a photograph showing the results of FISH analysis of mouse ES cells deficient in an antibody heavy chain and an antibody light chain retaining human chromosome 14 and human chromosome 2 fragments.
  • FIG. 35 shows an increase in the titer of anti-HSA human Ig antibody in the serum of the HSA-immunized chimeric mouse.
  • FIG. 36 is a photograph showing the result of FISH analysis (human centrosome sequence probe) of mouse A9 cells containing a human chromosome 14 fragment.
  • FIG. 37 is a photograph showing a result of FISH analysis (human chromosome-specific probe) of mouse A9 cells containing a human chromosome 14 fragment.
  • FIG. 38 shows the results of a stability test of human chromosome fragments (No. 14: SC20, No. 2: W23) in mouse ES cells.
  • FIG. 39 shows the results of stability analysis of a human chromosome 14 fragment in a mouse individual.
  • FIG. 40 shows the results of PCR analysis of G418-resistant hybrid cells carrying human chromosome 22 (fragment).
  • FIG. 41 is a photograph showing a result of FISH analysis of A9 cells retaining fragmented human chromosome 22.
  • FIG. 42 shows the results of analysis of a mouse strain that produces intact human antibodies established by crossing.
  • FIG. 43 shows the results of measurement of the concentration of the human antibody / c chain in the serum of a mouse carrying the human chromosome 2 fragment W23.
  • FIG. 44 shows the results of measuring serum mouse / c chain and ⁇ chain concentrations.
  • Figure 45 shows the structure of pBS-TEL / LIFPuro.
  • FIG. 46 shows the retention of human chromosome 22 in the DT40 cell line.
  • FIG. 47 shows the identification of homologous recombinants at the LIF locus.
  • FIG. 48 shows the fragmentation of human chromosome 22 in the DT40 / ii22neo cell line.
  • FIG. 49 is a photograph showing a DT40 cell line possessing full length and fragmented human chromosome 22.
  • a mouse individual carrying a human chromosome or a fragment thereof and expressing a gene on the chromosome or a fragment thereof,
  • a mouse is taken as an example of a non-human animal that retains a human chromosome or a fragment thereof and expresses a gene on the chromosome or a fragment thereof (hereinafter, this mouse is referred to as a “human chromosome”). Introduced mouse ”.)
  • human chromosome refers to a complex of natural DNA and protein derived from human cells. There are 23 normal human chromosomes (24 males) and 46 normal human chromosomes, each containing about 50-300 Mb of DNA. In the present invention, stable replication and distribution are possible as independent chromosomes. And partial fragments that are translocated and stably retained on the mouse chromosome. The size of the DNA is usually greater than 1 Mb, but can be less.
  • a feature of the present invention is that a human gene is retained and expressed in a mouse individual using a chromosome itself as a medium without performing cloning in Escherichia coli, yeast, or the like or extracting DNA from cells.
  • the human chromosome-introduced mouse refers to a mouse that retains one or more human chromosomes or fragments thereof in all or a part of the normal somatic cells. Further, it refers to one in which one or more human genes on human chromosomes are expressed in all or a part of the normal somatic cells.
  • a chromosome donor cell holding a labeled human chromosome or a fragment thereof As the chromosome donor cell, 1) a human chromosome labeled with a marker that can be selected by a recipient cell, 2) other 3) Microcell formation without human chromosome High performance cells are desirable.
  • any cell line derived from human, cancer cells, or primary cultured cells can be used, but the possibility of abnormalities such as chromosome deletion or amplification is low and culture is easy. Considering this point, normal fibroblasts are suitable.
  • human cells can be transformed by a vector that expresses marker genes such as drug (G418, puromycin, dygromycin, blasticidin) resistance.
  • marker genes such as drug (G418, puromycin, dygromycin, blasticidin) resistance.
  • G418, puromycin, dygromycin, blasticidin As a promoter for controlling the expression of a marker used herein, one that works efficiently not only on human cells but also on recipient cells such as mouse ES cells is desirable.
  • the SV40 enhancer was linked to the simple virus thymidine kinase promoter (Katoh et al., Cell Struct. Funct., 12: 575, 1987), the mouse PGK-1 promoter (Soriano et al., Cell , 64: 693, 1991).
  • the above transformants can be transformed into cells having high microcell forming ability, for example, mouse A9 cells (Oshimura, M., Environ. Health Perspect). , 93:57, 1991) to form cells. It is known that the human chromosome is selectively lost in mouse-human hybrid cells, but the fusion strain obtained here is selected by using the above-mentioned marker to select the masked human. Maintaining chromosomes stably comes out of the United States.
  • microcells were obtained from this cell fusion strain.
  • FI SH fluorescence in situ hybridization, Lawrence et al., Cell, 52:51, 1988. Can be done. If a specific chromosome transfer is desired, the above process is repeated for many human cell transformant clones to search for a clone in which the target chromosome is masked. Alternatively, the above-described process can be performed on a mixture of human cell transformant clones, and human chromosomes can be identified from a large number of obtained mouse-human monochromosomal hybrid cells.
  • homologous recombination targeting the DNA sequence on the chromosome desired to be introduced can be used to introduce a gene into a specific site. .
  • the masked human chromosome By irradiating gamma rays to a microcell prepared from a mouse-human hybrid cell, the masked human chromosome can be fragmented and introduced into mouse A9 cells. Even when the microcells are not gamma-irradiated, a certain percentage of partially fragmented human chromosomes may be transferred. In these cases, the resulting microcell fusion strain retains the partially fragmented human chromosome. These can be used when it is desired to introduce a chromosome partial fragment into a recipient cell.
  • Human chromosomes to be introduced into ES cells can be modified such as deletion, translocation, or substitution. These are specifically achieved by the following method.
  • mouse-human hybrid cells Preparation of mouse-human hybrid cells as described above, induction of microcells from mouse-human hybrid cells, re-fusion of the microcells with mouse A9 cells, induction of microcells from the re-fused cells, In each process of fusion of mouse ES cells, human chromosomes may be deleted or translocated. Cells containing these mutant chromosomes are appropriately selected by microscopic observation of chromosomes, PCR, Southern analysis and the like.
  • chromosome fragmentation can be increased by gamma irradiation (Koi et al., Science, 260: 361, 1993).
  • a targeting vector holding a 10 Xp sequence which is a recognition sequence of the Cre enzyme, is constructed, and the 10 Xp sequence is placed at a desired position on the chromosome by homologous recombination.
  • the Cre enzyme is expressed in the cell.
  • a mutant such as a chromosome deletion or translocation is obtained by site-specific recombination. See W097 / 49804 and Smith et al., Nature Genetics, 9: 376, 1995.
  • a cell having a high frequency of homologous recombination such as DT40 cell (Dieken et al., Nature Genetics, 12: 174, 1996) can be used as a host cell for introducing the targeting vector.
  • a targeting vector retaining a human telomere sequence is constructed, and after obtaining a clone having a telomere sequence inserted at a desired position on the chromosome by homologous recombination.
  • telomere truncation Itzhaki et al., Ature Genet., 2, 283-287, 1992; and Brown et al., P.
  • DT40 cells Dieken et al., Supra
  • DT40 cells Human chromosome telomere truncation in DT40 cells was first disclosed in the present invention. The disclosure of Brown et al. Discloses that the vector insertion is for a repeat sequence on a chromosome and cannot target a specific position.
  • the introduced chromosome By the modification of the introduced chromosome disclosed above, it is possible to eliminate genes that are not desired to be expressed in human chromosome-bred mice. Also, the size of the chromosome to be introduced Thus, the introduced chromosome fragment can be transmitted to the offspring of a human chromosome-introduced mouse. Furthermore, by translocating and replacing chromosomes, expressing genes from multiple chromosomes on the same chromosome fragment, replacing a part of the multiple genes on the chromosome fragment with different genes, It can be used as a vector for gene transfer into mouse individuals and mouse cells.
  • ES and EG cells have a particularly high ability, and in many cases also contribute to germ cells, and can produce progeny derived from the cells.
  • EC cells are mainly from germ cell carcinomas, ES cells are from the inner cell mass of blastocysts,
  • EG cells are obtained from primordial germ cells that appear early in development.
  • these cell lines and mutants thereof, and all undifferentiated cells capable of differentiating all or some normal somatic cells in a mouse individual may be used. Can be.
  • these recipient cells include, for example, mouse genes homologous to the human gene to be introduced. Single or multiple genes can be destroyed using methods such as target gene homologous recombination (Joyner et al., Gene Targeting, 1993, IRL PRESS).
  • a microcell prepared from the human chromosome donor cell obtained in (1) or a microcell irradiated with gamma rays can be used. Transferring cells to recipient cells Seiko Higashi, Cell Engineering Handbook, Yodosha,
  • microcell donor cells certain human chromosomes or fragments thereof carry selectable markers in recipient cells.
  • the gene or chromosome to be introduced is obtained by PCR, Southern blot analysis, FISH analysis, etc. as in (1).
  • any human chromosome or a fragment thereof can be introduced.
  • by sequentially introducing a plurality of chromosomes holding different selection markers or fragments thereof it is possible to obtain a recipient cell holding these at the same time.
  • the recipient cells selected by markers on the human chromosome retained all or part of the human chromosome retained by the donor cell as follows.
  • the chimeric mouse is prepared from the ES cell line obtained in (2) according to the method described in Shin-ichi Aizawa, Biomanual Series 8 Gene Targeting, Yodosha, 1995>. It is desirable to use the conditions already examined for each ES cell line in selecting the stage of development and strain of the host embryo for efficient chimeric mouse production. For example, for TTAX cells derived from CBAXC57BL / 6F1 (wild color, Yagi et al., Analytical Biochemistry, 214: 70, 1993), 8 cells derived from Balb / c (white, CLEA Japan) or ICR (white, CLEA Japan) were used. It is desirable to use cell-stage embryos as host embryos.
  • Gene expression on the transfected human chromosome is confirmed as follows. Expression of human chromosome-derived mRNA is detected by RT-PCR using RNA from each tissue (Kawasaki et al., PNAS, 85: 5698, 1988) and Northern blot method (Ausubel et al., Supra). . The expression of protein levels was determined by enzyme immunoassay using anti-human protein antibodies that minimized cross-reactivity with mouse homologous proteins (EL!
  • human immunoglobulin heavy chain For a chimeric mouse prepared from ES cells carrying human chromosome 14 in which a human immunoglobulin heavy chain is present, human IgM, IgG, IgA, etc. in the chimeric mouse serum are used as mouse antibodies. Can be detected by an enzyme immunoassay using an anti-human ig antibody that minimizes cross-reactivity.
  • this chimeric mouse is immunized with a human-derived antigen (eg, human serum albumin), and the spleen cells are fused with a mouse myeloma to obtain a hybrid doroma (Ando-Chiba, monoclonal antibody).
  • a hybridoma producing a human immunoglobulin heavy chain can be obtained by screening experimental procedures (Kodansha Sentific, 1991) by ELISA.
  • a method for producing a chimeric non-human animal that holds a human chromosome or a fragment thereof and expresses a gene on the chromosome or a fragment thereof has been described using a mouse as an example.
  • the chromosome or its fragment to be transferred to a human animal is not limited to a human-derived chromosome, and it is possible to widely transfer a foreign chromosome or a fragment thereof and express a gene on the chromosome or its fragment.
  • the “foreign chromosome” is characterized in that the gene on the chromosome or a fragment thereof is expressed in a chimeric non-human animal after being transferred to a cell having pluripotency.
  • mice In addition to mice, other chimeric animals, for example, mammals such as rats and pigs, and other chimeric animals can be produced.
  • Rat Iron et al., Dev. Biol., 163, 288-, 1994
  • Buehler Wood et al., Reprod. Ferti 1. Dev., 6, 563-, 1994
  • Sims et al. Protoatl. Acad. Sci. USA, 91, 6143-6147, 1994, and also tried in medaka, chickens, etc.
  • the cells retaining the pluripotency to which the foreign chromosome or a fragment thereof is transferred are not limited to the ES cells, EC cells, and EG cells described above.
  • transgenic chromosomes or fragments are also observed in progeny obtained by reproduction, and the progeny are located on the introduced chromosome or fragment.
  • the gene is located on the introduced chromosome or fragment.
  • a biologically active substance is produced by expressing a gene on a foreign chromosome or a fragment thereof using the chimeric non-human animal or its progeny obtained as described above, and recovering the product.
  • a chimeric non-human animal or its progeny can be bred under conditions capable of expressing a gene on a foreign chromosome or a fragment thereof, and then the expression product can be recovered from the animal's blood, ascites, etc.
  • a gene on an exogenous chromosome or a fragment thereof such as a chimeric non-human animal or its progeny, a tissue, cell or immortalized tissue (eg, a hybridoma immortalized by fusion with myeloma cells).
  • a tissue, cell or immortalized tissue eg, a hybridoma immortalized by fusion with myeloma cells.
  • these chimeras Constituting a foreign chromosome or a fragment thereof, or a foreign chromosome or a fragment thereof, extracted from a tissue, cell, or immortalized tissue or cell of a human animal or its progeny
  • DNA, or cDNA or a DNA derived from a foreign chromosome or a fragment thereof retained in a tissue, cell, or immortalized tissue of a chimeric non-human animal or its progeny can be transferred to animal cells or insect cells (for example, the cells are introduced into CHO cells, BHK cells, liver cancer cells, myeloma cells, SF9 cells, etc.), and the cells are cultured under conditions capable of expressing a gene on a foreign chromosome or a fragment thereof. For example, a specific antigen-specific antibody protein, etc.) can be recovered from the culture.
  • the expression product can be recovered according to a known method such as centrifugation, and further, according to a known method such as ammonium sulfate fractionation, distribution chromatography, gel filtration chromatography, adsorption chromatography, preparative thin-layer chromatography, etc. It can be purified.
  • Biologically active substances include all substances encoded on foreign chromosomes, and include, for example, antibodies, particularly human antibodies.
  • a human antibody gene on the chromosome is cloned from immortalized cells, such as the obtained chimeric animal spleen cells or its hybridomas, and introduced into Chinese hamster ovary cells (CHO) or myeloma cells to obtain human antibody. (Lynette et al., Biotechnology, 10, 1121-, 1992; Bebbington et al., Biotechnology, 10, 169-, 1992).
  • the chimeric mice having the human chromosomes 2, 14, and 22 (fragments) and their progeny obtained by the present invention are composed of a human antibody heavy chain (on chromosome 14), a light chain / c (on chromosome 2).
  • Light chain I (on chromosome 22) Can retain most of the functional sequence of each gene. That is, a known transgenic mouse into which a part of a human antibody gene was introduced using a yeast artificial chromosome or the like (Green et al., Nature Genetics, 7, 13-, 1994; Lonberg et al., Nature, 368, 856-, It is possible to express a much more diverse human antibody repertoire, closer to that observed in humans compared to 1994).
  • mice and their progeny that simultaneously retain chromosomes (fragments) such as Nos. 2 + 14 and 22 + 14 obtained by the present invention, and No. 2 + 14 obtained by crossing them A mouse and its progeny that simultaneously carry a chromosome (fragment) such as No. +22 can produce a complete human antibody in which both heavy and light chains are derived from human. is there. These mice can generate an immune reaction against human-derived antigens by regarding them as foreign substances, and can produce antigen-specific human antibodies. This property is very useful for obtaining therapeutic human monoclonal antibodies or human polyclonal antibodies (Green et al., Supra, and shionberg et al., Supra).
  • Method I Method using mouse antibody-deficient ES cells and mouse antibody-deficient chimeric host embryo
  • Method B Obtaining offspring retaining human chromosomes from a human chromosome-introduced chimeric mouse and mating with a mouse strain lacking the mouse antibody gene How to do.
  • homologous recombination was performed using the G418 resistance gene
  • homologous recombination was performed using the puromycin resistance gene, and the antibody heavy chain gene was disrupted in both alleles. Get.
  • an enzyme gene that causes a site-specific recombination reaction between the recombination sequences inserted on both sides of the drug resistance gene in 1. Then, a drug-sensitive strain from which the drug resistance gene inserted into the target gene has been removed is selected.
  • the marker gene is inserted again by the target gene homologous recombination method to obtain a strain in which the target gene has been disrupted in both alleles (Seiji Takatsu, et al. , 1995, Yodosha).
  • 6.5 Human chromosome 2 containing a human antibody light chain gene marked with a different drug resistance marker (eg, puromycin resistance gene) by microcell fusion using the strain obtained in 6.5 as a recipient cell (Fragment) or chromosome 22 (fragment) or both.
  • a different drug resistance marker eg, puromycin resistance gene
  • This B-lymphocyte lacks the mouse heavy and chain chains, Thus, only human antibodies are produced from functional human antibody genes on the human chromosome. Specific steps for Method B
  • the above methods (1) and (2) can be used to efficiently obtain not only human antibodies but also products of all genes present on foreign chromosomes.
  • Plasmid pSTneoB containing the G418 resistance gene (Katoh et al., Cell Struct. Funct.,
  • HFL-1 obtained from RIKEN Cell Bank, RCB0251.
  • HFL-1 cells are trypsinized, suspended in Dulbecco's phosphate buffer (PBS) to a volume of 5 x 10 s Zml, and electroporated using Gene Pulser (BioRad) in the presence of 10 ⁇ g DNA.
  • PBS Dulbecco's phosphate buffer
  • BioRad Gene Pulser
  • the cells were seeded on 3 to 6 100 mm tissue culture plastic dishes (coning) containing Eagle's F12 medium (hereinafter referred to as F12) supplemented with 15% fetal bovine serum (FBS).
  • F12 Eagle's F12 medium
  • FBS fetal bovine serum
  • Mouse A9 cells (Osh imura, Environmental. Health Perspect., 93:57, 1991, JCRB0211) were added to a Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS). The cells were cultured in mm dishes. 52 groups of G418-resistant HF1 cells were cultured in F12 supplemented with 15% fetal bovine serum (FBS) and 200 g / ml G418, each in a 100 mm Petri dish.
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's medium
  • FBS fetal bovine serum
  • mouse A9 cells and HFL-1 cells were mixed with each other in a quarter to one-half volume, seeded in 100 petri dishes, and added with 10% fetal bovine serum (FBS) in DMEM and 15% fetal bovine serum (FBS). ) was cultivated for half to one day in an equal mixture with F12.
  • FBS fetal bovine serum
  • FBS fetal bovine serum
  • Cell fusion was performed according to the method described in (Shimizu et al., Cell Engineering Handbook, Yodosha, p. 127-, 1992). After washing the cell surface twice with DMEM, the cells were treated with 2 ml of a PEG (1: 1.4) solution for 1 minute, and further treated with a 2 ml PEG (1: 3) solution for 1 minute.
  • the PEG solution was aspirated, washed three times in serum-free medium (DMEM), and then cultured in normal medium (10% FBS, DMEM) for 1 day.
  • the cells were dispersed by trypsin treatment, Uwabain (1x10- 5 M, Sigma) and G418 (800 g / ml) double selective medium (10% FBS, DMEM) containing suspended in, seeded three 100 thigh dish did . After culturing for about 3 weeks, the resulting colonies were dispersed by trypsin treatment and cultured in a selection medium (10% FBS, DMEM) containing G418 (SOO ⁇ g / ml).
  • the isolated cells are cultured, and genomic DNA is extracted from the cells using a Puregene DNA Isolation kit (Gentra System), and the genomic DMA is transformed into a type II, using a human chromosome-specific primer. Clones containing human chromosomes 2, 4, 14, and 22 were selected by PCR. PCR amplification was performed using about 0.1 lg of genomic DNA (Innis et al., PCR Experiment Manual, HBJ Press, 1991, thermal cycler using GeneAmp 9600, Perkin-Elmer).
  • Taq polymerase was manufactured by Perkin-Elmer, and the reaction conditions were as follows: one cycle of 94 ° C for 5 minutes, followed by denaturation at 94 ° C for 15 seconds, annealing at 54 to 57 ° C for 15 seconds (appropriate changes depending on the primer), 35 cycles of extension at 72 ° C for 20 seconds were performed.
  • Primers are genes present on each chromosome (O'Brien, Genetic Maps, 6th edition, Book 5, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1993) and polymorphic STS Primer Pair, BIOS; Weissenbach et al. Nature 359: 794, 1992; Walter et al., Nature Genetics, 7:22, 1994).
  • Gene primers were prepared based on base sequences manually prepared from databases such as GenBank and EMBL.
  • the names of the polymorphic primers and the sequences of the gene primers are shown for each chromosome in the following examples (No. 2: Example 1, No. 4: Example 6, No. 14: Example 9, No. 22: No. Example 2)
  • the following genetic marker and polymorphic marker Polymorphic STS Primer Pair, BIOS: D2S207, D2S177, D2S156, D2S159 BIOS
  • C c immunoglobulin kappa constant: 5 '-TGGAAGGTGGATAACGCCCT (SEQ ID NO: 1), 5, -TCATTCTCCTCCAACATTAGCA (SEQ ID NO: 2)
  • FABP1 fatty acid binding protein-1 liver: 5'-GCAATCGGTCTGCCGGAAGA (SEQ ID NO: 3), 5'-TTGGATCACTTTGGACCCAG (SEQ ID NO: 4)
  • Vk3-2 immunoglobulin kappa variable: 5'-CTCTCCTGCAGGGCCAGTCA (SEQ ID NO: 5), 5'-TGCTGATGGTGAGAGTGAACTC (SEQ ID NO: 6)
  • Vkl-2 immunoglobulin kappa variable: 5'-AGTCAGGGCATTAGCAGTGC (SEQ ID NO: 7), 5'-GCTGCTGATGGTGAGAGTGA (SEQ ID NO: 8)
  • the FISH analysis was performed according to the method described in (Matsubara et al., FISH Experimental Protocol, Shujunsha, 1994), and a chromosome-specific probe for human chromosomes 2, 4, 14, and 22 (CHROMOSOME PAINT IG SYSTEM, Cambio) ).
  • clones retaining chromosome 2 yielded one or more clones in 10 groups out of 26 groups (745 clones). Of these, 5 clones tested positive for all of the chromosome 2 specific primers used. These clones were subjected to FISH analysis. FISH analysis was performed using a human chromosome 2 specific probe (CHROMOSOME PAINTING SYSTEM, CANBI) according to the method described in (Matsubara et al., FISH Experimental Protocol, Shujunsha, 1994). Nearly complete human chromosome 2 was observed in all primer-positive cells, and some of the only primer-positive clones had independent chromosomes smaller than human chromosome 2.
  • CHROMOSOME PAINTING SYSTEM CANBI
  • FIG. 1 Some cells had chromosomes that were observed or fused to chromosomes other than human chromosome 2 (Fig. 1).
  • the row indicates the clone name, and the column indicates the primer used for PCR.
  • Qin was positive and X was negative.
  • the bottom line shows the form of human chromosome 2 observed by FISH. Those not described were not implemented.
  • A9 cells carrying human chromosomes 4, 14, and 22 were obtained.
  • a mouse A9 cell line (hereinafter, referred to as A9 / # 22) having human chromosome 22 obtained in (Example 1) was used.
  • Mouse as a chromosome recipient cell a mouse A9 cell line (hereinafter, referred to as A9 / # 22) having human chromosome 22 obtained in (Example 1) was used.
  • Mouse as a chromosome recipient cell a mouse A9 cell line (hereinafter, referred to as A9 / # 22) having human chromosome 22 obtained in (Example 1) was used.
  • ES cell line E14 obtained from Martin L. Hooper, Hooper et al., Nature, 326: 292, 1987
  • tissue culture plastic dishes pre-seeded with vegetative cells. did. Twenty-four hours later, the medium was replaced with a medium containing 300 g / ml G418 (GENETIC IN, Sigma), and then the medium was replaced daily. After 1 week to 10 days, drug resistant colonies appear. The frequency of appearance was 0-5 per 10 7 E14 cells.
  • the colonies were picked up and grown, suspended in a lml storage medium (5 ⁇ 10 6 cells) in a storage medium (ES cell culture medium—103 ⁇ 4DMS [K Sigma]), and stored frozen at -80 ° C. At the same time, genomic DNA from 10 6 to 10 7 cells for each drug-resistant strain
  • Fragmentation of human chromosome 22 was performed by irradiating the microcells with gamma rays.
  • the non-irradiated microcell drug-resistant strains E14 / # 22-9 and E14 / # 22-10, and gamma-irradiated microcell drug-resistant strains E14 / # 22_14 and E14 / # 22-25 have the following retained chromosomes (1) ⁇ Confirmed by (3).
  • MB myoglobin: 5'-TCCAGGTTCTGCAGAGCAAG (SEQ ID NO: 11), 5'-TGTAGTTGGAGG CCATGTCC (SEQ ID NO: 12)
  • DIA1 (cytochrome b-5 reductase): 5'-CCCCACCCATGATCCAGTAC (SEQ ID NO: 13), 5'-GCCCTCAGAAGACGAAGCAG (SEQ ID NO: 14)
  • Ig immunoglobulin lambda: 5'-GAGAGTTGCAGAAGGGGTGACT (SEQ ID NO: 15), 5'-GGAGACCACCAAACCCTCCAAA (SEQ ID NO: 16)
  • ARSA arylsulfatase A: 5'-GGCTATGGGGACCTGGGCTG (SEQ ID NO: 17), 5'-CAGA GACACAGGCACGTAGAAG (SEQ ID NO: 18)
  • PCR amplification (innis et al., Supra) was performed on the above 10 kinds of primers using about 0.1 / g of genomic DNA as type III.
  • amplification products of the expected length were detected for all primers in the two non-irradiated strains and for some primers in the two gamma-irradiated strains.
  • Figure 2 shows the above results.
  • a schematic chromosome map based on the G-band image of human chromosome 22 is shown on the left, and which band is located for some markers whose positions are known ( 0 'Brien, GENETIC MAPS, 6th edition, BOOK 5, etc.).
  • the arrangement of genes and polymorphisms is described in the information available to date (Science, HUMAN GENETIC MAP, 1994, Nature
  • 22 is a chromosome donor cell.
  • the pattern and the ratio of human chromosomal DNA to mouse genomic DNA estimated from the concentration of each band were similar to those of A9 / # 22.
  • FISH analysis was performed using a probe specific to human chromosome 22 (CHROMOSOME PAINTING SYSTEM, Cambio) according to the method described in (Matsubara et al., FISH Experimental Protocol, Shujunsha, 1994).
  • CHROMOSOME PAINTING SYSTEM Cambio
  • E14 / 2-9 was translocated to the mouse chromosome, and the other three strains detected human chromosome 22 as an independent chromosome.
  • mouse ES cell line ⁇ 14 / ⁇ 22-9 carrying human chromosome 22 is chimeric
  • the retention of the introduced chromosome was confirmed by PCR analysis using genomic DNA prepared from the tail as type III.
  • the tail was obtained according to the method described in Motoya Katsuki, a mouse mouse more than three weeks after birth, Motoya Katsuki, Manual of Developmental Engineering, Kodansha Scientific, 1987>. Genomic DNA was extracted. The amplification product was confirmed using PVALB and D22S278 among the polymorphic primers used in (Example 2) with this genomic DNA as type III. Analysis was performed on 10 of the individuals contributing to coat color, and as a result, in all the individuals, amplification products by at least one of the primers were confirmed.
  • genomic DNA derived from the tail of chimeric mice K22-6, 7, 8, 9, 10, 11, 12: 9 are non-chimeras
  • control DNA C: C: E14 / # 22-9 and E14 genomes
  • the left side shows the DNA molecular weight
  • the right side shows the chimera rate of each chimera individual. (-: 0, +: ⁇ 10%,: 10-30)
  • a chimeric individual that contributed about 53 ⁇ 4 to the coat color was obtained from the brain, liver, muscle, heart, spleen, thymus, ovary, and kidney by ISOGEN (Nitsubon Gene). DNA was obtained, and PCR analysis was performed for each tissue using MB and DIA1 among the gene primers used in (Example 2). As a result, expected amplification products were confirmed in all tissues in both primers. The results from the D1A1 Braima are shown in ( Figure 4). The PCR products were electrophoresed on a 2% agarose gel, and then detected by bromide chromatography.
  • Each lane in Figure 4 is from left to right: B: brain, L: liver, SM: skeletal muscle, H: heart, Sp: spleen, Th: thymus, 0v: ovary, K: kidney, nc: non-chimeric mouse tail DNA ( Negative control), pc: Human fibroblast (HFL-1) DNA (positive control).
  • RNA was extracted using ISOGEN (Nippon Gene), and human myoglobin (MB) and human cytochrome b5 reductase (DIA1) mRNA were detected by RT-PCR. .
  • RT-PCR was performed according to the method described in Innis et al., PCR Experiment Manual, HBJ Publications, 1991>.
  • the primer for the reverse transcription reaction is a random hexamer-oligonucleotide. (Final concentration: 100 pmol, manufactured by Takara Shuzo) and reverse transcriptase from BRL (Superscript). The primers used for amplification using cDNA as type I are described.
  • DIA1 5′-CAAAAAGTCCAACCCTATCA (SEQ ID NO: 21), 5′-GCCCTCAGAAGACGAAGCAG (SEQ ID NO: 22)
  • RT-PCR products were electrophoresed on a 2 agarose gel and detected by bromide staining.
  • M is a marker (HindlH digestion; I DNA + HaeIII digestion 0X174 DNA, Takara Shuzo)
  • MB is human myoglobin
  • DIA1 indicates a cytochrome b5 reductor
  • WT indicates a wild-type C3H mouse.
  • expected amplification products were confirmed in DIA1 in all organs and in MB only in heart and skeletal muscle (Fig. 6). It is known that myoglobin is expressed in a muscle cell-specific manner (Bassel-Duby et al., MCB, 12: 5024, 1992). This indicates that expression can be controlled.
  • the PCR products were electrophoresed on a 2% agarose gel and then detected by bromide chromatography. In FIG.
  • each lane shows B: brain, H: heart, Th: thymus, L: liver, Sp: spleen, K: kidney, 0v: ovary, SM: skeletal muscle, M: marker (from the left) .
  • the lower band observed in the MB results is considered a non-specific product.
  • a mouse A9 cell line (hereinafter, referred to as A9 / # 4) carrying human chromosome 4 obtained in (Example 1) was used.
  • Mouse as a chromosome recipient cell (hereinafter, referred to as A9 / # 4) carrying human chromosome 4 obtained in (Example 1) was used.
  • Mouse as a chromosome recipient cell (hereinafter, referred to as A9 / # 4) carrying human chromosome 4 obtained in (Example 1) was used.
  • ES cell line E14 (same as in Example 2) was used. Microcell fusion experiments and G418 resistance Selection of the strain was performed in the same manner as in (Example 2). The frequency of drug-resistant strains was 1-2 per 10 E14 cells. Cryopreservation of the drug-resistant strain and acquisition of genomic DNA were performed in the same manner as in (Example 2). The retention of human chromosome 4 or a fragment thereof in the drug-resistant strains E14 / # 4-4, E14 / # 4-7, and E14 # 4-11 was confirmed by the following (1) to (3).
  • IL-2 (interleukin-2): 5'-ATGTACAGGATGCAACTCCTG (SEQ ID NO: 25), 5'-TCATCT GTAAATCCAGCAGT (SEQ ID NO: 26)
  • KIT (c-kit): 5'-GATCCCATCGCAGCTACCGC (SEQ ID NO: 27), 5'-TTCGCCGAGTAGTC GCACGG (SEQ ID NO: 28)
  • FABP2 fatty acid binding protein 2, intestinal
  • 5'-GATGAACTAGTCCAGG TGAGTT SEQ ID NO: 29
  • 5'-CCTTTTGGCTTCTACTCCTTCA SEQ ID NO: 30
  • FIG. 7 shows the results.
  • a schematic chromosome map based on the G-band image of human chromosome 4 is shown on the left side, and which band is located for some of the markers whose positions are known. See Example 2.
  • the arrangement of the genes and polymorphism markers shows a rough positional relationship based on the information available up to now (see Example 2), and the order is not always accurate.
  • Three G418 resistant E14 cell lines For, the marker in which the expected amplification product was detected by PCR was a garden, and the undetectable marker was indicated by ⁇ . The lower side shows the results of observation by FISH analysis.
  • A9 / # 4 indicates a chromosome donor cell.
  • each lane is from left to right: 1: ⁇ 9 / # 4 (chromosome donor cell), 2: A9 / # 4 + A9 (1: 2), 3: A9 / # 4 + A9 (1: 9) , 4: A9, 5: E14 / # 4-7, 6: E14 / # 4-4.
  • 2 and 3 are mixtures of two types of DNA at the ratios shown in parentheses. The DNA molecular weight is shown on the left.
  • FISH analysis was performed using a human chromosome 4 specific probe (CHR0M0S0 ME PAINTING SYSTEM, Cambio) as in (Example 2).
  • human chromosome 4 or a partial fragment thereof was detected in most of the division images of all three strains.
  • E14 / # 4-4 was translocated to the mouse chromosome, and the other two strains existed as independent chromosomes.
  • the relative size of the observed human chromosomes was consistent with that expected from PCR analysis.
  • mice ES cell lines E14 / # 4-4 and E14 / # 4-7 which retain the human chromosome 4 partial fragment, retain the ability to form chimeras, i.e., differentiate into normal tissues of mouse individuals. It was confirmed that he had the ability to do so.
  • Genomic DM was prepared from the tail in the same manner as in (Example 4). This was designated as ⁇ , and among the primers for chromosome 4 analysis shown in (Example 6), polymorphisms F11 detected at E14 / # 4-7 and E14 / # 4-4 PCR analysis was performed. As a result, the expected amplification products were detected in both individuals.
  • one animal derived from E14 / 4-7 (K-7-1: chimera rate about 53 ⁇ 4)
  • one animal derived from E14 / # 4-4 (K # 4-4-41: chimera rate about 5%) was prepared from the tail as follows. Similar to DNA preparation (Example 4), the tail of the chimeric mouse was 5m ⁇ ! Cut ⁇ 10mm, wash several times with PBS / lmM EDTA, make a cut with a scalpel, remove the epidermis, and finely chop the internal tissue with a scalpel. Transfer the tissue debris to a tube containing 5 ml of PBS / lmM EDTA and leave at room temperature for 30 minutes to 1 hour.
  • a mouse A9 cell line (hereinafter, referred to as A9 / # 14) having human chromosome 14 obtained in (Example 1) was used.
  • Mouse as chromosome recipient cell The ES cell line TT2 (purchased from Lifetech Oriental, Yagi et al., Analytical Biochem., 214: 70, 1993) was used.
  • the vegetative cells were G418 resistant treated with mitoma'isin C (Sigma).
  • Primary cultured cells (purchased from Life Tech Oriental) were used.
  • Microcell fusion experiments and selection of G418 resistant strains were performed as in (Example 2).
  • the frequency of drug-resistant strains was 3 to 6 per 10 ⁇ 2 cells.
  • Cryopreservation of the drug-resistant strain and acquisition of genomic DNA were performed in the same manner as in (Example 2).
  • Fragmentation of human chromosome 14 was performed by irradiating the microcells with gamma rays.
  • G418-resistant strains 1-4 and 1-5 by transfer of non-gamma-irradiated microcells
  • G418-resistant strains 3-1 and 3-2 by transfer of gamma-ray (30 Gy) -irradiated microcells Total of 14 chromosomes or part of human 4 in 4 strains
  • the retention of the fragment was confirmed by the following (1) and (2).
  • NP nucleoside phosphory lase: 5'-ATAGAGGGTACCCACTCTGG (SEQ ID NO: 31), 5'-AACCAGGTAGGTTGATATGG (SEQ ID NO: 32)
  • TCRA T-ceil receptor alpha: 5'-AAGTTCCTGTGATGTCAAGC (SEQ ID NO: 33), 5 '-TCATGAGCAGATTAAACCCG (SEQ ID NO: 34)
  • MYH6 myosin heavy chain cardiac: 5'-TGTGAAGGAGGACCAGGTGT (SEQ ID NO: 35), 5'-TGTAGGGGTTGACAGTGACA (SEQ ID NO: 36)
  • IGA2 immunoglobulin alpha-2 constant: 5'-CTGAGAGATGCCTCTGGTGC (SEQ ID NO: 37) .5'-GGCGGTTAGTGGGGTCTTCA (SEQ ID NO: 38)
  • IGG1 immunoglobulin gamma-1 constant: 5'-GGTGTCGTGGAACTCAGGCG (SEQ ID NO: 39), 5'-CTGGTGCAGGACGGTGAGGA (SEQ ID NO: 40)
  • IGM immunoglobulin mu constant: 5'-GCATCCTGACCGTGTCCGAA (SEQ ID NO: 41), 5'-GGGTCAGTAGCAGGTGCCAG (SEQ ID NO: 42)
  • IGVH3 immunoglobulin heavy variable-3: 5'-AGTGAGATAAGCAGTGGATG (SEQ ID NO: 4: 3), 5'-GTTGTGCTACTCCCATCACT (SEQ ID NO: 44)
  • Example 2 As a result of performing PCR amplification in the same manner, expected amplification products were confirmed for all or some of the primers.
  • the drug-resistant strains 3-1 and 3-2 obtained using gamma-irradiated microcells tended to lack a part of the chromosome 14 region. In addition, even when unirradiated microcells were used, some deletions were observed as in 1-4 strains.
  • Figure 10 shows the results. In Fig. 10, a schematic chromosome map based on the G-band image of human chromosome 14 is shown on the left side, and which band is located for some markers whose positions are known (see Fig. 10).
  • the arrangement of the genes and polymorphic markers shows a rough positional relationship based on the information that can be obtained up to now (see Example 2), and the order is not always accurate.
  • the marker in which the expected amplification product was detected by PCR was indicated by ⁇ , and the marker not detected was indicated by mouth.
  • Example 11 (1) is a chromosome donor cell. At the right end, the results of Example 11 (1) are shown.
  • FISH analysis was performed using a human chromosome 14-specific probe (CHROMOSOME PAINTING SYSTEM, Cambio) according to the method described in (Matsubara et al., FISH Experimental Protocol, Shujunsha, 1994). As a result, most mitotic figures for all four strains Chromosome 14 or a partial fragment thereof was observed as an independent chromosome. The observed relative size of the human chromosome was consistent with that estimated from the results of the PCR analysis.
  • Example 10 G418-resistant ES cell line obtained by producing chimeric mice from ES cells retaining human chromosome H fragment (Example 9) and confirmed to retain human chromosome 14 4 strains (1-4, 3-1, 3-2, 1-5) were set up from frozen stock, and 1CR or MCH (ICR) (CLEA Japan) 8 cells obtained by mating male and female mice Stage embryos were injected at 8-10 per embryo. After culturing overnight in ES medium (Example 9) to generate blastocysts, pseudopregnancy treatment 2.5 days after foster parent ICR mice (CLEA Japan) About 10 cells per uterus Were injected. The results are shown in Table 3. Table 3. Generation of chimeric mice from TT2 cell line carrying human chromosome 14 (fragment)
  • the determination is made based on whether or not a wild color (dark brown) derived from TT2 cells is found in white from the host embryo (ICR) in coat color. Of the 64 animals born, 8 had apparently wild color in their coat color, ie, ES cells contributed. The highest contribution rate was about 80% in one individual from 1-4.
  • Genomic DNA was prepared from the tail of i individuals derived from 3-1 (K3-1-1: chimera ratio about 25%) among chimeric mice in the same manner as in (Example 4). This was designated as type II, and PCR analysis was performed on all 14 species detected in 3-1 among the chromosome 14 analysis primers shown in (Example 9). As a result, expected amplification products were detected for all 14 species (Fig. 10).
  • genomic DNA was obtained from the brain, kidney, spleen, heart, liver, and thymus using the Puregene DNA Isolate Kit, and for each tissue, IGM primers ( PCR analysis using Example 9) was performed. As a result, expected amplification products were confirmed in all tissues (Fig. 11). The PCR product was electrophoresed on a 2 agarose gel, and then detected by bromide chromatography. In FIG.
  • each lane is from left to right: B: brain, K: kidney, Sp: spleen, H: heart, L: liver, Th: thymus, pc: human fibroblast (HFL-1) DNA (positive control) ), Nc: Non-chimeric mouse tail DNA (negative control), M: Marker 1 (Hind II ⁇ l:; i DNA + Hae H! Digestion 0 X174 DNA, Takara Shuzo).
  • Fibroblasts were prepared from the tail as follows. As in DNA preparation (Example 4), the tail of a 3-6 week-old chimeric mouse was cut from 5 mm to 10 inm, washed several times with PBS / lmM EDTA, cut with a scalpel and the epidermis was removed. Finely chop the tissue with a scalpel.
  • the presence of G418-resistant fibroblasts was observed in all three individuals.
  • the resistance ratio was obtained by averaging the values obtained from two sets of selected Z non-selected 35mni dishes for each individual. ICR indicates a wild type ICR mouse.
  • FISH analysis of the G418-resistant fibroblasts (derived from K3-2-2, K1-4-1) obtained in the above (2) was performed in the same manner as in (Example 2).
  • the probe used was FITC-labeled whole human DMA extracted from HF cells (Example 1) (Matsubara et al., FISH experimental protocol, Shujunsha, 1994). As a result, in both individuals, independent human-stained partial fragments were observed in most of the division images.
  • a mouse A9 cell W23 (hereinafter, referred to as A9 / # 2 W23) that retains the human chromosome 2 partial fragment obtained in (Example 1) was used.
  • the mouse ES cell line TT2 (Example 9) was used as a chromosome recipient cell.
  • Microcell fusion experiments and selection of G418 resistant strains were performed in the same manner as in (Example 2).
  • Frequency of drug-resistant strains is 10 'in TT2 cells One to three pieces. Cryopreservation of the drug-resistant strain and acquisition of genomic DNA were performed in the same manner as in (Example 2).
  • the retention of the human chromosome 2 partial fragment in the drug-resistant strains 5-1, 5-2, and 5-3 was confirmed by the following (1) and (2).
  • FISH analysis was performed in the same manner as in (Example 2) using a human chromosome 2 specific probe (CHR0S0E PAINTING SYSTEM, Cambio).
  • human chromosome 2 partial fragments were detected as independent chromosomes in almost all division images of all three strains. Its size was comparable to that observed for A9 / # 2 W23.
  • the G418-resistant ES cell line 5-1 obtained in (Example 12) and confirmed to retain a partial fragment of human chromosome 2 was started up from a frozen stock and subjected to ICR or MCH (ICR ) (CLEA Japan) 10-12 embryos per embryo were injected into 8-cell stage embryos obtained by mating male and female mice. After culturing overnight in ES medium (Example 9) to generate blastocysts, the uterus of the foster parent ICR mouse (CLEA Japan) 2.5 days after the pseudopregnancy treatment was applied to the uterus of about 10 cells per uterus. Implanted embryos were transplanted.
  • Implantation of a total of 264 injected embryos resulted in 51 offspring mice.
  • the chimeric individual is determined by whether or not a wild color (dark brown) derived from TT2 cells is found in white from the host embryo GCR) in coat color.
  • 18 had apparently wild color in the coat color, that is, 18 cells contributed by ES cells. The highest contribution was about 80%. 7
  • the reaction time and temperature were adjusted to 4 overnight, and other improvements were made.
  • the antibody or antigen against the human immunoglobulin to be measured is diluted to 0.5 to 10 zg / ml (100 to 5000 times), and ELISA is performed. Plates were coated at 4 ° C. Serum samples were measured using PBS supplemented with 5% mouse serum (Sigma, M5905) for blocking, dilution of samples and labeled antibodies, and PBS supplemented with 1% fetal bovine serum was used for measurement of hybridoma culture supernatants. Was. When diluting the chimeric mouse serum 20-fold, the dilution was performed using PBS. After washing the coated plate, blocking was performed for 1 hour or more.
  • the sample was added and incubated for 30 minutes or more. After washing the plate, an enzyme-labeled anti-human immunoglobulin antibody diluted 100 to 5000-fold was added and incubated for 1 hour or more. After that, the plate was washed and a substrate solution was added to develop color.
  • a biotin-labeled antibody washing the plate, adding an avidin-enzyme complex thereto, incubating, washing, and adding a substrate solution. The absorbance was measured with a microphone-mouth plate reader (Biotech, EL312e).
  • Anti-human IgM mouse monoclonal antibody (Sigma, 16385) diluted with 50 mM bicarbonate bicarbonate buffer (pH 9.6) was coated on a 96-well micro-tie plate, and mouse serum (Sigma, M5905) was added. Serum samples diluted in PBS were added.
  • a peroxidase-labeled anti-human IgM goat antibody (Tago, 2392) was added and incubated, and then the enzyme activity was evaluated by the absorbance at 405 nm by adding an ABTS substrate (Kirkegaard & Perry Laboratories Inc., 506200).
  • ABTS substrate Kirkegaard & Perry Laboratories Inc., 506200.
  • Purified human IgM antibody (Organon'Techniki, 6001-1590) or human IgG antibody (Sigma, 14506) was used as a standard. Standards were serially diluted in PBS supplemented with mouse serum.
  • mice Example 10, K3-1-1, K3-2-1) that retained the human chromosome 14 fragment three times on days 27, 34, and 41 after birth were dissolved in PBS.
  • Serum albumin Serum albumin
  • an anti-human HgM mouse monoclonal antibody (Sigma, 16385) was immobilized on a plate and the same procedure as in Example 14 was performed to obtain six positive clones.
  • HSA as an antigen, a solution having a concentration of 5 ⁇ g / ml was prepared in a 50 mM bicarbonate bicarbonate buffer at pH 9.6, and the solution was dispensed 100/1 into all the wells of an ELISA plate. Detection was carried out using an anti-human IgA + IgG + IgM goat antibody labeled with peroxidase (Kirkegaard & Perry Laboratories Inc., 04-10-17). One positive clone was confirmed in 10 plates.
  • This clone was one of the six human igM positive clones.
  • This clone (H4B7) was further cultured, and the culture supernatant was diluted.
  • ELISA was performed using a serum-labeled anti-human IgM goat antibody (Tago, 2392)
  • a decrease in absorbance was observed with an increase in the dilution ratio of the culture supernatant.
  • the absorbance was low in the sample in which human lg (organon 'techniki, 6001-1590) was diluted to 2 ⁇ g / ml with the medium regardless of the dilution ratio.
  • A9 cells (W23) carrying a human chromosome 2 fragment labeled with G418 resistance were cultured in an iOOnrni dish using G418 (800 zg / ml) in a selective medium (10% FBS, DMEM). ). Plasmid pPGKPuro containing puromycin resistance gene
  • Example 1 (Dispensed from WHITEHEAD I NSTITUTE, Dr. Peter W. Lai rd) was linearized with the restriction enzyme Sail (Takara Shuzo) before transfection.
  • the cells are treated with trypsin, suspended in Dulbecco's phosphate buffer (PBS) to a concentration of 5 x 10 s / ml, and then electroporated using Gene Pulser (BioRad) in the presence of 10 g DNA.
  • PBS Dulbecco's phosphate buffer
  • BioRad Gene Pulser
  • Example 1 was performed.
  • a voltage of 1000 V with a capacity of 25 / F was applied at room temperature using a 4 mm-long electroporation cell (Example 1).
  • the electroporated cells were seeded on 3 to 6 100 mm dishes.
  • the medium was replaced with a double selection medium containing 10 ⁇ g / ml of Pyuguchi mycin (Sigma, P-7255) and G418 (800 ⁇ g / ml). About 200 colonies formed after 2 to 3 weeks were collected as one group.
  • the cells were cultured in two or three 25 cm 2 flasks for each of the three populations to form microcells, which were fused with mouse A9 cells cultured in 25 cm 2 flasks in the same manner as in Example 1.
  • the cells were transferred to two 100-dish Petri dishes and cultured in the above double selection medium containing G418 and puromycin, and two double drug resistant clones were obtained from one of three populations. In this clone, it is highly probable that a Pyuguchi mycin resistance marker was introduced to the human chromosome 2 fragment.
  • ES cell line carrying human chromosome 14 fragment marked with G418 resistance gene ( E14 / # 14-36) was cultured in a medium supplemented with a high concentration of G418 to obtain clones of ES cells with doubled human chromosomes (Biomanual Series 8, Gene). Yuichi Getting, Yodosha, 1995).
  • G418-resistant mouse primary cells (purchased from Lifetech Oriental) were seeded into IOOIMI dishes without mitomycin treatment and used as vegetative cells. This 100 mm Petri dish was seeded with E14 / # 14-36, and half a day later, the medium was replaced with a medium having a G418 concentration of I 6 mg / ml.
  • the medium was changed every 1-2 days, and one week later, the culture was continued at a G418 concentration of 10 mg / ml, 15 of the resulting colonies were picked and cultured, and the chromosome was used as a human No. 14-specific probe (see Example 9). ) was used for FI SH analysis. As a result, the fragment of human chromosome 14 was doubled in 8 clones.
  • This PG1 cell line was used as a chromosome donor cell in order to obtain mouse ES cells that simultaneously retain the human chromosome 2 partial fragment and the chromosome 14 partial fragment.
  • a G418-resistant TT2 cell line 1-4 (Example 9), which already contains a partial fragment of human chromosome 14, was used.
  • Microcell fusion experiments and selection of puromycin-resistant strains were carried out in the same manner as in the selection of G418-resistant strains (Example 9) at a puromycin concentration of 0.75 g / ml.
  • the frequency of emergence of the Pyuguchi mycin-resistant strain was 3 to 7 per 107 i-4 cells.
  • chromosome 2 (Example 12; A9 / S2 W23)
  • chromosome 14 (Example 9; TT2 / # 14 1-4) PCR amplification was performed on each of the primers confirmed to be present. An amplification product was confirmed.
  • the chromosome with low brightness is derived from a mouse, and two large and small chromosome fragments (indicated by arrows) whose brightness is high due to the fluorescence of FITC are derived from human. Considered a fragment. From the above experiments, it was confirmed that the obtained double-resistant ES cell line simultaneously retains the human chromosome 2 partial fragment and the chromosome 14 partial fragment.
  • PG16 223 32 12 As a result of transplanting a total of 551 injected embryos, 73 offspring mice were born. Chimeric individuals are judged by whether or not wild color (dark brown) derived from TT2 cells is found in white derived from host embryo OCR) in coat color. Out of the 73 births, 23 had an apparent wild-colored coat color, that is, 23 cells contributed to ES cells. These results indicate that ES cell lines (PG5, PG15, PG16) that retain human chromosome 2 and 14 have chimera-forming ability, that is, they differentiate into normal mouse tissues. It was confirmed that he had the ability.
  • HSA Human serum albumin
  • Anti-human antibody chain antibody (VECTOR LABORATORIES, INC. AI-3060) diluted in 50 mM bicarbonate bicarbonate buffer pH 9.6 was coated on a 96-well microtiter plate, and a serum sample was added. Then, a biotin-labeled anti-human antibody c-chain goat antibody (VECTOR LABORATORIES, INC. BA-3060) was added, and the mixture was incubated. Then, a complex of biotinylated ⁇ sabiperoxidase and avidin DH (VECTOR LABOR) was added.
  • a chimeric mouse (K9, Kll; both derived from ⁇ 2 cell line 3-2, chimera rates of 50 ⁇ and 30 ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ , respectively) carrying the human chromosome 14 fragment prepared in the same manner as in (Example 10) , 79 days, 93 days, 107 days, 133 days 4 times ( ⁇ 9), or 74 days, 88 days,
  • HSA was immunized three times on 111 days (K11) in the same manner as in (Example 20). This texture An antibody containing a human chain to human serum albumin in the serum of the la mouse was detected by the EL1SA method (see Example 14).
  • HSA (Sigma, A 3782) diluted in 50 mM bicarbonate bicarbonate buffer, pH 9.6, was coated on a 96-well microplate and the sample was added, followed by peroxidase labeled anti-human IgG mouse. After adding the antibody (Pharmindin, 08007E) and incubating, the enzyme activity was evaluated by the absorbance at 490 nm by adding 0-phenylenediamine (0PD, Sumitomo Bakelite, Mt.
  • mice harboring human chromosome 2 fragments (Examples 13, ⁇ 2-3, and ⁇ 2
  • HSA was immunized three times at 66 days, 80 days, and 102 days after birth in the same manner as in (Example 20).
  • human antibody / chain against HSA in the serum of the chimeric mouse ( ⁇ 2-12) was detected four times at 63 days, 77 days, 91 days and 116 days after birth (Example 2). 14).
  • Example 24 Obtaining a hybridoma producing a human antibody heavy chain (chain or ⁇ chain) from human chromosome 14 guide chimeric mouse
  • the spleen was removed from the chimeric mouse K9 immunized with HSA in (Example 21) and fused with myeloma cells to produce a hybridoma.
  • the method for preparing hybridomas was according to the method described in Kudou Ando, Chiba, Monoclonal Antibody Experiment Operator, Kodansha Scientific, 1991>. Sp-2 / 0-Agl4 (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) , 05-554).
  • HCF HCF, Boxy * Brown
  • an anti-human mouse monoclonal antibody (Sigma, Model 6260) was coated on a 96-well microtiter plate, a sample diluted with PBS was added, and then a peroxidase-labeled anti-human mouse antibody (Sigma) was added. (Pharmindin, 08007E), and incubated with ABTS (Kirkegaard & Perry Labora tories Inc., 04-10-17). Was.
  • the spleen was removed from the chimeric mouse K2-3 immunized with HSA in (Example 23), and the cell was fused with myeloma cells to prepare a hybridoma.
  • the method for producing the hybridoma was as described in ⁇ Ando Chiba, Monoclonal Antibody Experiment Operator, Kodansha Sentifik, 1991>, and P3X6 3Ag8.653 (Dainippon Pharmaceutical, 05-565) was used.
  • HCF HCF
  • G418 3 mg / ml of G418
  • the ELISA method was performed in the same manner as in (Example 23), and two clones positive for the human antibody / c chain were obtained.
  • A9 cells carrying human chromosome 22 labeled with G418 resistance (A9 / # 2272; Example
  • iSOGEN Flutan Gene
  • CM1 human IgM constant region: 5'-TTGTATTTCCAGGAGAAAGTG (SEQ ID NO: 45)
  • CM2 (same as above): 5'-GGAGACGAGGGGGAAAAGGG (SEQ ID NO: 46)
  • HS1 human heavy chain variable region: 5'-ATGGACTGGACCTGGAGG (AG) TC (CT) TCT (GT) C (SEQ ID NO: 47) (mixture of 8 types)
  • HS2 5'-ATGGAG (CT) TTGGGCTGA (GC) CTGG (GC) TTT (CT) T (SEQ ID NO: 48) (a mixture of 16 species)
  • CT CT
  • SEQ ID NO: 49 mixture of 6144 species
  • the first PCR was performed using HS1XCM1, HS2XCMK and HS3XCM1.
  • H4B7 For the amplified plasmids of the inserted plasmids, # 2, 3, # 4 (H4B7), 1K # 13, and # 14 (H8F9), the bases of the amplified products were analyzed using an automated fluorescent sequencer (Applyed Bio System). The sequence was determined. The obtained nucleotide sequence and predicted amino acid sequence have been reported for the human antibody VH region (Marks et al., Eur. J. Immunol. 21, 985-, 1991) and the JH region (Ravetch et al., Cell, 27 , 583-, 1981), it was found that both H4B7 and H8 F9 consist of a combination of the VH4 family and JH2. This result indicates that a fully functional human antibody heavy chain protein was produced in the chimeric mouse carrying the human chromosome 14 partial fragment.
  • KC2 human Ig c chain constant region: 5
  • -CAGAGGCAGTTCCAGATTTC SEQ ID NO: 50
  • KC3 (same as above): 5'-TGGGATAGAAGTTATTCAGC (SEQ ID NO: 51)
  • KVMIX human Ig / c chain variable region
  • PCR was performed using the combination of primers KVlIXxKC2 and KVMIXxKC3 under the conditions of 94 ° C for 15 seconds, 55 ° C for 15 seconds, 72 ° C for 20 seconds, and 40 cycles (using PerkinElmer and Samarucycler-9600). .
  • the amplification product was detected by 1.5-agarose electrophoresis followed by staining with bromide chidium.
  • the expected amplification products of about 420bps (KC2) and about 450bps (KC3) were detected in both combinations.
  • no specific amplification product was detected in the two negative controls.
  • the cloned amplification product encodes a functional human Ig / chain variable region.
  • the nucleotides of the human antibody V region (Klein et al., Eur. J. Immunol., 23, 3248-, 1993) and the J / c region (Whehurst et al., Supra) which have already been reported.
  • the V / c3 family was composed of a combination of J / c4. This result indicates that a fully functional human antibody chain protein is produced in the chimeric mouse carrying the human chromosome 2 partial fragment.
  • Anti-human IgG4 antibody (Sigma, 1-7635) was diluted with 100 mM glycine hydrochloride buffer, pH 2.5, allowed to stand at room temperature for 5 minutes, and then diluted with 100 mM phosphate buffer, pH 7. The solution was diluted 10-fold with 0, and a 96-well microtiter plate was coated. After adding a serum sample, and then adding a peroxidase-labeled anti-human IgG antibody (Pharmindin, 08007E) and incubating, the enzyme activity was increased to 450 nm by the addition of TMBZ (Sumitomo Bei-Crate, M1120T). Evaluation was made by absorbance. The purified human IgG4 (Sigma, Model 4639) with a known concentration was used as a standard and serially diluted with PBS supplemented with mouse serum.
  • TMBZ Suditomo Bei-Cryte, M1120T
  • the enzyme activity was evaluated by absorbance at 450 nm, and human IgM with a purified chain of known concentration (organic technic force, 6001-1590) ) was used as a standard, and serially diluted with PBS supplemented with mouse serum (Sigma, M5905).
  • Table 10 shows the results. All subclasses of IgGl, IgG2, IgG3, and IgG4 and IgM were detected in two chimeric mice, K15A and K16A. Table 10. Human antibody IgG subclass and IgM concentration in chimeric mice (ELISA) Chimera mouse IgGl IG2 IG3 IgG4 IgM (mg / 1) 15A 2.25 1.96 0.17 0.43 7.09
  • Example 30 Acquisition of mouse ES cell line (TT2) carrying human chromosome 22 To obtain mouse ES cell (TT2) carrying human chromosome 22, the cells were used as chromosome donor cells (Example 26). The obtained 6-1 (A9 / # 22, G418, puromycin resistant) cell strain was used. A wild-type TT2 cell line (Example 9) was used as a chromosome recipient cell. Microcell fusion experiments and selection of puromycin-resistant strains were carried out in the same manner as in the selection of G418-resistant strains (Example 9) except for a puromycin concentration of 0.75 ⁇ g / ml.
  • a pure mouth-resistant ⁇ 2 cell line PG22-1 obtained in (Example 30) and confirmed to retain human chromosome 22 was set up from a frozen stock, and was subjected to ICR or MCH.
  • ICR ICR
  • CLA Japan 10 to 8 cells per embryo were injected into 8-cell embryos obtained by mating male and female mice. After culturing in ES cell culture medium (Example 9) to generate blastocysts, pseudopregnancy treatment 2.5 days after foster parent ICR mice (CLEA Japan) Approximately 10 fusion embryos were transferred.
  • the human antibody concentration in the serum of the chimeric mouse KPG22-1 to 3 of (Example 31) was quantified using the EL1SA method according to (Example 14).
  • Blood was collected from two-month-old chimeric mice, and human antibodies in the serum; I chains were detected by ELISA.
  • a chimeric mouse (Example 31, KPG22-3) was immunized with HSA three times at 79 days, 94 days, and 110 days after birth (Example 20).
  • Human antibody in serum; I-chain was detected using the ELISA method according to (Example 14).
  • HSA Sigma, A 3782
  • diluted to 50 ⁇ g / ml in 50 mM bicarbonate bicarbonate buffer pH 9.6 was coated on a 96-well microtiter plate, serum samples were added, and then labeled with biotin.
  • Anti-human immunoglobulin lambda chain antibody (VECTOR LABORATOR IES, INC., BA-3070) is added, incubated, and then biotinylated.
  • Example 34 Obtaining a human antibody light chain-producing hybrid from a human chimeric chromosome 22 chimeric mouse At 113 days after birth, the spleen was removed from the chimeric mouse KPG22-3 immunized with human albumin in (Example 25) in the same manner as in (Example 25), and the cell was fused with myeloma cells to produce a hybridoma.
  • the method of preparing the hybridoma was based on the method described in ⁇ Ando 'Chiba, Introduction to Monoclonal Antibody Experimental Procedures, Kodansha Sentific, 1991>. 05-554).
  • mice ES cells that simultaneously retain human chromosome 22 and a partial fragment of chromosome 14, 6-1 (A9 / # 22, G418, puromycin resistance) obtained in Example 26 as chromosome donor cells A cell line was used.
  • G418-resistant TT2 cell line 4 As a chromosome recipient cell, G418-resistant TT2 cell line 4 (Example 9), which already retains the human chromosome 14 partial fragment, was used.
  • Microcell fusion experiments and selection of puromycin-resistant strains were carried out in the same manner as in the selection of G418-resistant strains (Example 9) except for a puromycin concentration of 0.75 ng / ml.
  • the frequency of appearance of the result emerging puromycin resistant strain was found to be 1-2 Bok 4 cells per 10 7.
  • chromosome 22 is described in Examples (A9 / # 22).
  • chromosome 14 PCR amplification was performed for each primer whose presence was confirmed in (Example 9; ⁇ 2 / # 14 1-4).
  • three markers D22S275, D22S315, Ig
  • chromosome No. 14 were all detected in TT2 / 14 1-4.
  • the double-resistant TT2 cell line obtained was a partial fragment of human chromosome 22 and chromosome 14 It was confirmed that partial fragments were simultaneously retained.
  • Example 36 Production of a chimeric mouse from a mouse ES cell line simultaneously retaining a human chromosome 22 partial fragment and a chromosome 14 partial fragment
  • the G418 and puromycin double-resistant TT2 cell line PG22-5 obtained in (Example 35) and confirmed to retain the human chromosome 22 partial fragment and the chromosome 14 partial fragment were frozen stocked.
  • ICR or MCH (ICR) (CLEA Japan) was injected into an 8-cell stage embryo obtained by mating male and female mice at 10-12 cells per embryo. After culturing overnight in an ES cell culture medium (Example 9) to generate blastocysts, pseudopregnancy treatment 2.5 days after the uterus of the foster parent ICR mouse (CLEA Japan) Individual injection embryos were transferred.
  • Example 37 Human antibody in ES cell-derived quinula mouse serum simultaneously retaining human chromosome 22 partial fragment and chromosome 14 partial fragment; detection of I chain and human antibody chain
  • the chimeric mice (KPG22-9, 10, and 12) of (Example 36) were immunized with HSA.
  • KPG22-9 and KPG22-10 were immunized at 11 weeks of age, and blood was collected two weeks later.
  • KPG22-12 was immunized twice at 7 and 9 weeks of age, and blood was collected 2 weeks after the second immunization.
  • a human antibody // chain and a human antibody in the serum; an antibody having an I chain, a human chain, and a human // chain were detected using the ELISA method according to (Example 14).
  • anti-human immunoglobulin ⁇ chain antibody (Kirkegaard & Perry Laboratories Inc., 01-10-11) diluted in PBS is coated on a 96-well microtiter plate. Then, a serum sample was added, followed by addition of a peroxidase-labeled anti-human immunoglobulin / chain antibody (TheBinding Site Limited, MP008), followed by incubation.
  • TMBZ Suditomo Bei-Cryte, M1120T
  • the enzyme activity was evaluated at an absorbance of 450 nm, and the concentration of human IgM with a purified I chain of known concentration (Dainippon Pharmaceutical, U13200 ) was compared stepwise with PBS supplemented with mouse serum to determine the human antibody concentration in the serum.
  • Human antibody // chain and human antibody; I chain was detected and quantified using the EUSA method in the same manner as in (Example 29) and (Example 32). Table 14 shows the results. In the chimeric mouse; both the I and / chains were detected. An antibody having a human antibody // chain and a ⁇ chain was also detected.
  • a chimeric mouse ( ⁇ 9) having only human chromosome 14 (Example 10) and a chimeric mouse ( ⁇ G22-2) having only human chromosome 22 (Example 31) were measured.
  • Human antibody in serum; concentration of antibody with I chain and / or chain is at background level, and the detection system here may detect only complete antibody with human ⁇ chain and chain confirmed.
  • Table 14 Human antibody concentration in chimeric mice (EL A)
  • the chimeric mouse KPG-15 (derived from TT2ES clone PG5, chimera rate 105) prepared in (Example 19) was compared with human chimeric serum 105 (HSA ⁇ ) dissolved in PBS between 2 and 3 months of age. Sigma, A3782) and adjuvant (MPL + TDM Emulsion, RIBI Immunochem Reseach Inc.) were mixed to prepare a 0.25 mg / ml HSA solution, 0.2 ml was immunized three times, and blood was collected. Blood was collected from aged (Example 19) chimeric mouse KPG-26 (derived from TT2ES clone PG6, chimera rate 40%).
  • the concentration of complete human antibody in serum was detected by ELISA according to (Example 14).
  • Anti-human immunoglobulin chain antibody (Kirkegaard & Perry Laboratories Inc., 01-10-10) diluted in PBS was coated on a 96-well microtiter plate, and mouse serum (Sigma, M5905) was added. Serum samples diluted in PBS were added, followed by peroxidase-labeled anti-human After incubating with Blind // chain antibody (The Binding Site Limited, MP008), the enzyme activity was evaluated at 450 nm absorbance by adding TMBZ (Sumitomo Bei-Cryte, M1120T) as a peroxidase substrate.
  • TMBZ Quantitomo Bei-Cryte, M1120T
  • Example 15 shows the results.
  • Chimeric mouse (K9) which retains only human chromosome 14 as a control (Example 10), retains only human chromosome 2
  • concentration of the human antibody in the serum of the chimeric mouse (K2-9) obtained in Example 13 was / chain and / or had a / chain, which was at the background level at 0.002 mg / ml or less.
  • mice In order to obtain mouse ES cells (X0) having a partial fragment of human chromosome 2, the PG1 cell line obtained in (Example 16) was used as a chromosome donor cell. It has been reported that chromosome recipient cells have a (39, X0) chromosome composition and efficiently differentiate into egg cells in chimeric mice (Shinichi Aizawa, Bio Manual Series 8, Gene Evening, Yodosha) , 1995) TT2F cell line (purchased from Lifetech Oriental) was used.
  • the microcell fusion experiment and the selection of puromycin-resistant strains were carried out at the puromycin concentration of 0.75 g / ml in the same manner as in the selection of the G418-resistant strains described in (Example 9).
  • the frequency of emerged puromycin-resistant strains was TT2F cells 5 out of 10 7 pieces. Cryopreservation of these puromycin-resistant strains and acquisition of genomic DNA were performed in the same manner as in (Example 2). Retention of the human chromosome 2 partial fragment was confirmed for the drug-resistant strains P-20 and P-21 by the following PCR analysis.
  • Example 40 Production of chimeric mouse from mouse ES cell line (TT2F, X0) retaining human chromosome 2 partial fragment
  • the puromycin-resistant TT2F cell line P-21 obtained in Example 39 and confirmed to retain a partial fragment of human chromosome 2 was set up from a frozen stock, and R or MCH (ICR ) (CLEA Japan) 10 to 12 embryos were injected per embryo into 8-cell stage embryos obtained by mating male and female mice. After culturing overnight in ES cell culture medium (Example 9) to develop into blastocysts, pseudopregnancy treatment 2.5 days after transfer to the uterus of the foster parent ICR mouse (CLEA Japan) About 10 embryos were transferred.
  • R or MCH ICR
  • mice After transplanting a total of 141 injected embryos, 20 offspring mice were born. Chimeric individuals are judged by whether or not the wild color (dark brown) derived from TT2 cells is found in the white derived from the host embryo (ICR) in coat color. The results of chimera production are shown in (Table 16). Of the 20 births, 9 had an apparent wild-colored coat color, ie, the contribution of ES cells was observed. Four of them were chimeric mice with completely wild coat color (derived from ES cells).
  • Table 17 shows the results. It was confirmed that the human antibody / c chain gene functions in the chimeric mouse even when the ES cell used is TT2F.
  • the right side shows the molecular weight of DNA (0 X174, Hae lil fragment, tsubon gene) and the DNA of the main band
  • the left side shows the length of the amplification product expected by each primer on the left side.
  • the results obtained using the DNA derived from the tail of the parent chimeras K2-1F and K2-4F as the positive control are also shown.
  • These results indicate that the TT2F cell line P-21, which retains the human chromosome 2 partial fragment, differentiated into a functional egg in chimeric mice, and that the offspring derived from the egg contained the human chromosome 2 partial fragment. Indicates that it was transmitted.
  • TT2 cells have a (40, XY) chromosome structure, they may have differentiated into functional spermatozoa in male chimera K2-18. In that case, wild-colored offspring are born from eggs derived from ICR (white: recessive) fertilized by sperm from TT 2 cells (wild-color, dominant) in the chimeric mice.
  • Example 44 Detection and quantification of human antibody chains in the serum of chimeric mouse progeny (Example 42) Chimeric mouse progeny K2-1F-1 to 10 and K2-4F-1 to 5 in human serum Antibody / chain concentration was quantified using the EUSA method. Blood was collected from mice about 4 to 6 weeks old after birth, and the human antibody / c chain in the serum was detected by ELISA in the same manner as in (Example 20). The results are shown in Table 18 together with the results of chromosome retention obtained in (Example 42). It was confirmed that the human antibody / c chain gene also functions in progeny born from chimeric mice.
  • Example 45 Analysis of chimeric mouse spleen cells transfected with a partial fragment of human chromosome 14 Analysis by flow cytometry followed the method described in the following literature. Japanese Society of Biochemistry, New Chemistry Laboratory Course 12 Molecular Immunology 1 Immune Cell ⁇ Sitekine 1989, Tokyo Chemical Dojin; Cancer Research Division, Institute of Medical Science, The University of Tokyo, Cell Engineering Separate Volume 8 New Cell Engineering Experimental Protocol 1 1991, Shujunsha; A. Doyle and JB Griffiths, "Cell &
  • Chimeric mouse K15A (derived from strain 1-4), which was confirmed to express human antibody heavy chain, / c chain, and ⁇ chain in (Example 29), (Example 23) and (Example 32), respectively.
  • spleen-derived cDNA obtained from non-chimeric mouse ICR was used. Primers without reference were prepared based on nucleotide sequences obtained from databases such as Genbank.
  • HIGMEX1-2 5'-CCAAGCTTCAGGAGAAAGTGATGGAGTC (SEQ ID NO: 53)
  • HIGMEX1-1 5'-CCAAGCTTAGGCAGCCAACGGCCACGCT (used for 2nd PCR of VH3BACK) (SEQ ID NO: 54)
  • VH1 / 5BACK (59 ° C, 35cycles, Marks et al., Eur. J. Immnol., 21, 985-, 1991)
  • VH4BACK (59 ° C, 35cycles, Marks et al., Supra)
  • VH3BAC (IstP CR: 59 ° C, 35 cycles
  • 2nd PCR 59. C, 35 cycles, Marks et al., Supra)
  • KC2H for constant region: 5'-CCAAGCTTCAGAGGCAGTTCCAGATTTC (SEQ ID NO: 55)
  • Vkl / 4BACK 55 ° C, 40cydes, Marks et al., Eur. J. Immnol., 21, 985-, 1991
  • Vk2BACK 55 ° C, 40cycles, Marks et al., Supra
  • Vk3BACK 55 ° C, 40cycles, Marks et al., Supra
  • CAMIX (The following three primers are mixed in equimolar ratio)
  • IGL1-CR 5'-GGGAATTCGGGTAGAAGTCACTGATCAG (SEQ ID NO: 56)
  • IGL2-CR 5'-GGGAATTCGGGTAGAAGTCACTTATGAG (SEQ ID NO: 57)
  • IGL7-CR 5'-GGGAATTCGGGTAGAAGTCACTTACGAG (SEQ ID NO: 58)
  • variable region 1LEA1 (55 ° C, 40cycles, Williams et al., Eur. J. Immunol., 23, 1456-, 1993), VA2MIX (55 ° C, 40cycles, V11 in the report of Wi 11 iams et al.
  • the amplification product of IstPCR was re-amplified with a combination of primers (HIGMEX1-1XVH3BACK). All amplification products were detected by 1.5% agarose electrophoresis followed by staining with bromide chidium. As a result, amplification products of the expected length (heavy chain: around 470 bp, light chain / c: around 400 bp, light chain ⁇ : around 510 bp) were detected in all combinations. On the other hand, no specific amplification product was detected at the same position in all of the negative controls.
  • the base sequence of the amplification products was determined using an automatic fluorescent sequencer (Applyed Bio System) '.
  • CAMIXxVA3 IX 5 clones
  • VH1 VH1-8 VRS SSWYEYYYYGMDV J6CDN1) VH BACK K4-10
  • VH1-46 ERYYGSGSYQDYYYYYGMDV J6 (DXP'l) VH1 / 5BACK Kl-2
  • VH3-33 EGGYGSVGDYYYYGMDV Jo (DXP 1) VH1 / 5BAC Hl-9
  • VH3-33 GGYSYGYDYYYYGMDV TA ⁇ " ⁇ VH3BACK H3-5
  • TT2 (or TT2F) cells in which the mouse antibody genes (heavy chain, light chain / c) have been disrupted are labeled with the G418 resistance gene and the chromosome 14 fragment of the human (Example 9) and with the Pyuguchi mycin resistance gene Human # 2 (Example 18) or chromosome 22
  • Example 35 can be introduced.
  • a mouse antibody (heavy chain, light chain / c) gene transfected with human chromosome 14 + 2 or human chromosome 14 + 22, (heavy chain + / c chain: Example 19, heavy chain + lambda chain: chimeric mice created by the method of Example 36) are expected to produce human antibodies with mainly heavy and light chains derived from human Is done.
  • Abbreviations and the like of restriction enzymes in FIGS. 23 to 27 shown below are as follows.
  • Kp KpnU B: BamH and Bg2: BgllU RI: EcoRI, RV: EcoRV, N ': Not, SI: Sal K Sea: Seal, Sfi: SfiI, Sm: SmaU X: Xhol, (X) : Xhol cleavage site from lambda vector,
  • Dotted line pBluescript S II (I) or pUC18 plasmid DNA
  • Cre recombinase (Sauer et al., Pro) was inserted at both ends of the G418 resistance gene (Example 1) to remove the G418 resistance gene.
  • TT2 (or TT2F) cells are derived from F1 mice of C57BL / 6 and CBA mice, it is necessary to prepare antibody gene knockout vectors using genomic DNA clones derived from C57BL / 6 mice. I made it.
  • genomic DNA library a lambda DNA library derived from Clontech's aduit C57BL / 6N male 1 iver was used.
  • the heavy chain C probe using the following synthetic DNA sequence (60 mer) as a probe for screening: 5'-ACC TTC ATC GTC CTC TTC CTC CTG AGC CTC TTC TAC AGC ACC ACC GTC ACC CTG TTC AAG- 3 '(SEQ ID NO: 59)
  • Light chain Probe 5'-TGA TGC TGC ACC AAC TGT ATC CAT CTT CCC ACC ATC CAG T GA GCA GTT AAC ATC TGG AGG-3 '(SEQ ID NO: 60)
  • a DNA fragment containing the light chain J-C / c was subcloned into pBluescript SKIK +) plasmid (Stratagene) (heavy chain: FIG. 24; light chain J / C-C / c: FIG. 25).
  • a targeting vector for mouse antibody gene disruption in TT2 (or TT2F) ES cells was prepared as follows.
  • a DNA fragment (BamHl to Xhol) containing the 2nd to 4th exons in the C-encoding region of the genomic DNA containing the mouse antibody heavy chain constant region prepared in 2 was prepared in 1 and oxP-STneo The gene was replaced (Fig. 26).
  • the transcription direction of STneo is the same as the transcription direction of the antibody heavy chain gene.
  • DT DT
  • DT -A cassette A (Pro Natl. Acad. Sci. USA, 87, 9918-9922, 1990, Oriental A purchaser from yeast) [hereinafter referred to as DT] was obtained by converting the Apal and SaU sites into Not I sites.
  • the transcription direction of the DT gene was selected to be the same as the transcription direction of the heavy chain gene.
  • This plasmid DNA was amplified using Escherichia coli DH5 and purified by cesium chloride flat mouth centrifugation (Introduction to Cell Engineering Experiment Operation, published by Kodansha in 1992). The purified plasmid DNA was cut at a single site with the restriction enzyme SacII and used for transfection into TT2F ES cells.
  • Antibody heavy chain is present upstream of C ⁇ ⁇ ⁇ as a probe for Southern blot of genomic DNA of transformant to detect clones in which homologous recombination has occurred with the targeting vector from transformant TT2F ES cells
  • the DNA fragment (about 500 base pairs) of the switch region to be used was used. This DNA fragment was obtained by PCR amplification of 129 mouse genomic DNA under the following conditions.
  • Sense primer 5'-CTG GGG TGA GCC GGA TGT TTT G 3 '(SEQ ID NO: 61)
  • Antisense primer 5'-CCA ACC CAG CTC AGC CCA GTT C-3' (SEQ ID NO: 62)
  • Template DNA EcoRI digestion 129 mouse genomic DNA 1 ⁇ g
  • reaction buffer deoxynucleotide mix, and Taq DNA polymerase were from Takara.
  • Reaction conditions 94 degrees C, 3 minutes, 1 time ⁇ 94 degrees (;, 1 minute; 55 degrees 2 minutes; 72 degrees C, 2 minutes; 3 times ⁇ 94 degrees C, 45 seconds; 55 degrees 1 minute; 72 degrees C, 1 minute; 36 times
  • the amplified DNA was confirmed to be cut at a single site with the restriction enzyme Hind III as shown in the Genbank database, and subcloned into the EcoRV cleavage site of pBluescript plasmid.
  • TT2F ES cells transformed with the targeting vector Genomic DNA was digested with restriction enzymes EcoRI and Xhol, separated by agarose gel electrophoresis, subjected to Southern blotting, and detected with the above probe.
  • the direction of transcription of the DT gene is the same as the direction of transcription of the light gene / gene.
  • This plasmid was amplified using Escherichia coli DH5 and purified by cesium chloride equilibrium centrifugation. The purified plasmid DNA was cut at one site with the restriction enzyme Kpnl and used for transfection into TT2F ES cells.
  • Transformant TT2F Light chain J / c- as a probe for genomic DNA Southern blot to detect clones in which the antibody light chain portion has homologous recombination with the targeting vector from TT2F ES cells A DNA fragment at the 3 ′ end of C / genomic DNA (see FIG.
  • the genomic DNA of the TT2F ES cells transformed with the targeting vector was digested with the restriction enzyme EcoRI, separated by agarose gel electrophoresis, subjected to Southern blotting, and detected with the above probe.
  • the antibody heavy chain targeting vector created in Example 48-3 was linearized with the restriction enzyme SacII (Takara Shuzo), and then (Shinichi Aizawa, Biomanual Series 8, Gene The cells were introduced into mouse ES cells TT2F according to the method of targeting, Yodosha, 1995).
  • TT2F cells are treated with trypsin, suspended in HBS to a concentration of 2.5 ⁇ 10 7 cells / ml, 5 ⁇ g DNA is added, and electroporation is performed using Gene Pulser (biorad, without connecting resistor unit). Performed. 960 ⁇
  • the antibody heavy chain homologous recombinant TT2F cell line # 131 obtained in (Example 49) was set up from a frozen stock, and ICR or MCH (ICR) (CLEA Japan) was crossed with male and female mice.
  • the resulting 8-cell stage embryos were injected 10-12 per embryo.
  • ES cell culture medium Example 9
  • pseudopregnancy treatment 2.5 days after the uterus of foster parent R mouse (CLEA JAPAN)
  • One fusion embryo was transferred.
  • Chimeric individuals are judged by whether or not the wild color (dark brown) derived from TT2F cells is found in the white derived from the host embryo (ICR) in coat color. Out of the 22 births, 18 had an apparent wild-colored coat color, that is, 18 individuals contributed to ES cells. home Sixteen individuals were female chimeric mice with wild color (derived from ES cells) with 80% or more of their coat color. From this result, it was confirmed that the antibody heavy chain homologous recombinant ES cell line 31 retains chimera-forming ability. Since many of the chimeric mice obtained are females that make a very high contribution, it is highly possible that the ES cells have differentiated into functional germ cells (eggs). Two female chimeras showing 100% contribution rate among chimeric mice
  • the G418-resistant marker gene of the antibody heavy chain bilateral allele-disrupted strain obtained in Example 51 was removed by the following procedure.
  • a voltage of 250 V with a capacity of 0 ⁇ F was applied using a 4 imn-length electroporation cell (165-2088, BioRad).
  • the cells subjected to electrification were suspended in 5 ml of an ES medium, and seeded on a plastic dish (60 cm) for tissue culture in which seed cells were sowed in advance. Two days later, the cells were treated with trypsin, and seeded cells were sown in three lOOmnr tubes, 100 per petri dish each.
  • the cells were seeded again to have 200 and 300 cells. The same procedure was performed under the condition that only the settings of the Gene Pulser (resistor unit connection, infinite resistance value) were changed. Pick up a total of 96 colonies generated 7 days later, trypsinize them, divide them into two, and feed them
  • the remaining 1/5 is seeded on a 12-well gelatin-coated plate, cultured for 2 days, and genomic DNA is extracted from 10 6 to 10 7 cells.
  • Pure gene DNA Isolate Kit (Centra System) Prepared by The genomic DNA of these G418-sensitive TT2F cell lines was digested with the restriction enzyme EcoRI (Takara Shuzo), separated by agarose gel electrophoresis, and subjected to Southern blotting. The removal of the G418 resistance gene was confirmed with the probe A). As a result, the band hybridized with probe A observed in # 131-3 was not detected at all in the susceptible strain. From these results, it was confirmed that the G418-resistant marker gene was definitely removed from the obtained G418-sensitive strain.
  • the mouse ES cell line (TT2F-derived, G418-sensitive) deficient in the endogenous antibody heavy chain obtained in (Example 52) was marked by the G418 resistance gene as shown in (Example 9).
  • the human chromosome 14 (including the antibody heavy chain gene) is guided by the microcell method.
  • retention of human chromosome 14 (fragment) containing the human antibody heavy chain gene is confirmed by PCR analysis and the like (Example 9).
  • chromosome 2 fragment introduction of chromosome 22 (Example 53)
  • the puromycin resistance gene was added to the antibody heavy chain-deficient mouse ES cell line (G418 resistance) retaining the human chromosome 14 fragment obtained as described in (Examples 18 and 35).
  • the human chromosome 2 fragment (including the antibody light chain / C gene) or the human chromosome 22 (antibody light chain; including the I gene) marked by the above method is introduced by the microcell method.
  • retention of human chromosome 14 (fragment) and chromosome 2 fragment or chromosome 22 (fragment) was confirmed by PCR analysis (Examples 18 and 35). It is confirmed.
  • a chimeric mouse was prepared from an endogenous antibody heavy chain gene-deficient mouse ES cell line that retains chromosome 14 (fragment) containing the human antibody heavy chain gene obtained in (Example 53) (Example 10). This is performed by the method shown in FIG. In the chimeric mouse obtained here, the heavy chain of the human antibody produced in the B cell derived from the ES cell line is detected by the method described in (Example 14). In addition, since the antibody heavy chain gene functional in the ES cell-derived B cells is only derived from the human on the transchromosome, most ES cell line-derived B cells produce human antibody heavy chains.
  • a chimeric mouse was prepared from an endogenous antibody heavy chain gene-deficient mouse ES cell line carrying the chromosomes 14 + 2 and 14 + 22 obtained from (Example 54) (Example 19). , 36) etc.
  • the human antibody heavy chain and light chain / c or light chain ⁇ are detected in the B cells derived from the ES cell line by the method shown in (Examples 14, 23, 32).
  • the antibody heavy chain gene functional in the ES cell-derived ⁇ cells is only derived from the human on the transchromosome, most of the ES cell-derived ⁇ cells Produces human antibody heavy chains.
  • Example 57 Endogenous antibody retaining human chromosomes 14 + 2, 14 + 22 (fragment) Obtaining human antibody-producing hybridoma from chimeric mouse derived from ES cell derived from heavy chain-deficient mouse
  • the chimeric mouse prepared in (Example 56) is immunized with the target antigen in the same manner as in (Examples 15, 25, and 34), the spleen is removed, and the cell is fused with myeloma cells to prepare a hybridoma. After culturing for 1 to 3 weeks, the culture supernatant is analyzed by the ELISA method.
  • the EL1SA method was performed by the method described in (Examples 14, 15, 21, 24, 25, 33, 34, 37, and 38), and human antibody positive and human antibody positive and immunized antigen-specific clones were obtained. obtain.
  • Example 48 The antibody light chain targeting vector prepared in Example 4-4 was linearized with the restriction enzyme ⁇ (Takara Shuzo), and the method of (Shinichi Aizawa, Biomanual Series 8, Gene Targeting, Yodosha, 1995) was used. And introduced into the above TT2F cell line (G418 sensitive) in the same manner as in Example 49. That is, cells were suspended in HBS to obtain a suspension of 2.5 ⁇ 10 7 cells / ml, and then 5 ⁇ g of DNA was added to 0.5 ml of the cell suspension, followed by electrophoresis. At 96
  • a voltage of 0 F and 250 V was applied. Colonies formed 7 to 9 days later were picked up, cryopreserved by the method described in Example 49, and genomic DNA was obtained.
  • the G418 resistant strain genomic DNA was digested with restriction enzyme EcoRl (Takara Shuzo), separated by agarose gel electrophoresis, subjected to Southern blot analysis, and a homologous recombinant was detected with the probe shown in Example 48-4. The results are shown in FIG.
  • One band (a) was detected in the parental antibody heavy chain-deficient homozygous TT2F cells by EcoRI digestion. In the case of the homologous recombinant, it is expected that a band (b) will newly appear at the bottom in addition to this band.
  • band (b) appears in transformed strains 2 and 5.
  • the left side shows the size of DNA. That is, in these clones, one allele of the antibody light chain gene was destroyed by homologous recombination. 28 homologous recombinants out of 120 analyzed were obtained. Under normal culture conditions, these clones showed no change in growth rate and morphology as compared to the TT2F strain before gene disruption, suggesting that they retain the ability to form chimeric mice.
  • TT2F antibody light chain homologous recombinant obtained in Example 58 (and antibody heavy chain deficient homozygote) ) was obtained by the following procedure.
  • a high concentration G418 resistant strain was obtained in the same manner as in Example 51. After culturing for 5 to 7 days at a G418 concentration of 9 to 14 mg / ml, the culture was reduced to a G418 concentration of 4 mg / ml, and the colonies that grew 10 to 13 days after the start of the culture were picked up. Cryopreservation and DNA acquisition were performed in the same manner as in 51.
  • High-density resistant strains obtained from three independent allele-disrupted strains were analyzed, and 36 out of 59 strains, 2 out of 43 strains, and 1 out of 49 strains destroyed the alleles on both sides of the antibody light chain gene, respectively.
  • the clone obtained was obtained. Under normal culture conditions, these clones showed no change in growth rate and morphology compared to the TT2F strain before gene disruption, suggesting that they retain the ability to form chimeric mice.
  • the G418 resistance marker gene of the antibody light chain bilateral allele-disrupted strain (high-concentration G418-resistant strain) obtained in Example 59 was removed by the procedure shown in Example 52.
  • the G418-sensitive strain obtained in the same manner as in Example 52 was grown to confluence in a 35 ⁇ dish, and 4/5 thereof was 0.5 ml of a storage medium.
  • a mouse ES cell line (TT2F-derived, G418, puromycin-sensitive) HKD31 deficient in both the endogenous antibody heavy chain and / c chain obtained in (Example 78) was used (see Example 68- (2)).
  • human chromosome 14 fragment SC20 (including the human antibody heavy chain gene) was introduced by the microcell method. Microcell fusion and selection of G418-resistant strains were performed in the same manner as in (Example 2).
  • PCR analysis Example 68
  • IgM and D14S543 primer for eight of the obtained G418 resistant strains both were detected in eight out of seven strains. Therefore, it was confirmed that these antibody heavy chain and chain deficient ES cell lines retain human chromosome 14 fragment SC20.
  • Example 61-Blood was collected from the chimeric mouse (derived from HKD31-8) prepared in (2) at the age of 12 weeks (# 1) or 7 weeks old (# 2-4) after birth, and human antibody concentration in serum. was quantified by the ELISA method according to (Example 14).
  • Anti-human immunoglobulin ⁇ chain antibody (Sigma, 16385) diluted with PBS, or anti-human immunoglobulin chain antibody (Sigma, 13382) or anti-human immunoglobulin chain antibody (Pharmingen, 08091D) ) was coated on a 96-well microtiter plate, a serum sample diluted with PBS containing mouse serum (Sigma, M5905) was added, and then peroxidase-labeled anti-human immunoglobulin chain antibody (The Binding Site Limited, MP008) or a peroxidase-labeled anti-human immunoglobulin chain antibody (Sigma, ⁇ 0 ⁇ 0) was added and the cells were incubated.
  • T Enzyme activity was evaluated at 450 nm absorbance by adding TMBZ (Sumitomo Bei-Client, M1120T) as a lucokinase substrate, and purified // immunoglobulin I with a known concentration containing // chain, ⁇ chain, and chain gM (CAPPE, 6001-1590), IgG (Sigma, 14506), and IgA (Sigma, 12636) were compared with serial dilutions in PBS supplemented with mouse serum. I asked. The results are shown in Table 20. A chimeric mouse individual was confirmed in which the concentration of the human antibody and / or ⁇ chain was almost as high as the antibody concentration in the normal mouse serum.
  • a chimeric mouse individual expressing the human ⁇ chain was confirmed. Furthermore, according to the method of (Example 29), the human immunoglobulin a chain subclass was detected, and all four subclasses (ai, a2, a3, and a4) were detected.
  • the antibody was detected by ELISA according to the procedure described in 14) HSA-coated, peroxidase-labeled anti-human Ig antibody (The Binding Site, MP008), anti-human IgA antibody (Sigma, A1070), anti-human antibody Detection was performed using the Iga antibody (Kirkegaard & Perry Labolatories Inc, 14-10-01) The results are shown in Figure 33. According to the method described in Kuandou, Introduction to Monoclonal Antibody Experimental Procedures, Kodansha Scientific, 1991>, SP-2 / 0-Agl4 (Dainippon Pharmaceutical) was used as myeloma cells.
  • the serum of the chimera mouse # 3 contained 920 mg / l of ⁇ 1 force, 520 mg / l of ⁇ 2 force, 140 mg / l of ⁇ 3 force img / i and ⁇ 4.
  • HCF Air'Brown
  • HAT Densippon Pharmaceutical Co., Ltd., o.16-808-49
  • Judgment was made based on the absorbance at least about three times that of the negative control, and 74 positive cells from chimeric mouse # 3 and 29 positive cells from chimeric mouse # 4 were obtained.
  • the HSA solution was coated, and an anti-HSA antibody having a human chain was screened using a peroxidase-labeled anti-human immunoglobulin chain antibody (Tago, # 2392).
  • the culture supernatant of four plates on which G418 was selected was screened out of fifteen 96-well plates seeded with the fusion-treated cells of chimeric mouse # 3, and five positive wells were obtained. There were 74 and 29 colonies that appeared in colonies by selection with HAT or lmg / ml G418, respectively, per plate.
  • anti-human IgG3 ELISA was performed using an antibody (Zymed labolatories, Inc., 05-3622) and an anti-human IgG4 antibody (Zymed labolatories, Inc., 05-3822) in accordance with (Example 14) to determine.
  • Positive clones were 27 for human IgGl, 11 for IgG2, 2 for IgG3 and 13 for IgG4.
  • the fusion-treated cells of chimeric mouse # 4 were similarly determined, and four clones with a large number of cells were determined to obtain human IgGl-producing clones.
  • the endogenous antibody heavy chain and light chain deficient mouse that retains the partial fragment of chromosome 14 including the human antibody gene (heavy chain) can be used for ES cell-derived chimeric mice derived from human protein (HSA).
  • KH13 was subjected to FISH analysis using a human chromosome-specific probe (Examples 9, 12). The results are shown in FIG. In KH13, two independent small chromosomal fragments hybridizing to the probe were observed. These results indicated that KH13 simultaneously retained a chromosome 14 fragment and a chromosome 2 fragment.
  • Example 61-A mouse ES cell line HKD31-8 obtained in (1), which lacks the endogenous antibody heavy chain and / or c chain and has the human chromosome 14 fragment (including the antibody heavy chain gene)
  • human chromosome 22 marked with the puromycin resistance gene (antibody light chain; including the I gene) was led by the microcell method.
  • the resulting puromycin and 12 G418 double resistant strains were subjected to PCR analysis (Example 35).
  • the primers used were I and D14S543 for the chromosome ⁇ fragment, and Ig A for the chromosome 22 fragment, D22S315.
  • D22S274 (Example 2). As a result, all 10 species The presence of the car was confirmed. In the LH13 strain out of the remaining two strains, only five markers of lg ⁇ 'l, D14S543, Igl, D22S275, and D22S274 were confirmed out of the eight strains. It is thought to contain chromosome no. Further, for LH13, F 1 SH analysis was performed using a human chromosome 22 specific probe and a human chromosome specific probe. As a result, independent chromosome fragments that hybridized to each probe were observed. In other words, this strain was shown to simultaneously retain the chromosome 14 and chromosome 22 fragments.
  • human chromosome 2 or chromosome 22 was blasticidin-resistant (Izumi et al., Exp. Cell. Res., 197, 229). , 1991), and hygromycin resistance (Wind et al., Cell, 82, 321-, 1995). This is performed by the method described in (Examples 16 and 26).
  • a mouse ES cell line (derived from TT 2F, G418 resistant) which is deficient in the endogenous antibody heavy chain and light chain, and retains human chromosome 14 (fragment) and a partial fragment of chromosome 2 obtained in (Example 62).
  • chromosome 22 (including human antibody light chain; I gene) marked with blasticidin resistance or hygromycin resistance in the same manner as described in (Example 9).
  • I do Use feeder cells for ES cell culture that are suitable for each selection marker.
  • the hygromycin resistance marker is used, primary cultured fibroblasts obtained from a transgenic mouse strain that retains and expresses its ability (Johnson et al., Nucleic Acids Research, vol. 23, No. 7, 1273-, 1995).
  • the obtained triple resistant strain of G418, puromycin, hygromycin (or blasticidin) retains the above three types of human chromosomes (fragments). ⁇ PCR analysis etc. (Examples 9, 18, 35) It is confirmed.
  • a mouse ES cell line (derived from TT2F, G418 resistant) lacking the endogenous antibody heavy and light chains obtained in (Example 63) and carrying human chromosome 14 (fragment) and chromosome 22 (fragment). Hygromycin or puromycin resistance) Perform the same procedure for the human chromosome 2 fragment marked with the blasticidin resistance gene.
  • mice from endogenous antibody heavy chain and light chain gene deficient mouse ES cell lines that retain the chromosome (fragment) containing the human antibody gene obtained in (Examples 61, 62, 63, 64) Example 10) Performed by the method shown in etc.
  • mouse antibodies produced by B cells derived from the host embryo and human antibodies produced mainly by B cells derived from the ES cell line were obtained (Examples 14, 23, 32). It is detected by the method indicated by.
  • the functional antibody heavy chain and light chain / c gene in B cells derived from ES cells are only derived from humans on the transchromosome, most B cells derived from ES cells are human antibody heavy chains. (Lonberg et al., Nature, 368, 856-, 1994).
  • a complete human antibody molecule in which both the heavy and light chains are derived from human is detected by the method described in (Examples 37 and 38).
  • Endogenous antibody heavy chain, / c chain which simultaneously retains human chromosome 14 fragment (including the antibody heavy chain gene) and human chromosome 2 fragment (including the light chain / c gene) obtained in Example 62
  • Gene-deficient mice Chimeric mice were prepared from the ES cell line KH13 by the method described in (Example 10) and the like. As a result of transplanting a total of 176 injected embryos, 20 offspring mice were born. Chimeric individuals are judged by whether or not wild color (dark brown) derived from TT2 cells is found in white from the host embryo (ICR) in coat color. Out of the 20 animals born, 7 had an apparent wild color in the coat color, that is, the contribution of ES cells was observed.
  • Endogenous antibody heavy chain, chain gene deficient that simultaneously retains human chromosome 14 fragment (including the antibody heavy chain gene) and human chromosome 22 fragment (including the light gene; I gene) obtained in Example 63
  • a chimeric mouse was prepared from the mouse ES cell line LH13 by the method described in (Example 10) and the like. As a result of transplanting a total of 114 injected embryos, 22 offspring mice were born. Chimeric individuals are judged by whether or not wild color (dark brown) derived from TT2 cells is found in white from the host embryo (ICR) in coat color. Out of the 22 births, there were clearly wild-colored portions in the hair color, that is, 5 individuals were able to contribute ES cells.
  • Blood was collected from the chimeric mouse (derived from KH13) prepared in Example 65- (1) 40 days after birth, and the concentration of human antibody in the serum was detected by ELISA according to (Example 14).
  • Anti-human immunoglobulin chain antibody diluted with PBS (Kirkegaard & Perry Labolatories Inc.
  • mice were found to have a complete human antibody concentration at least 10 times higher than that of chimeric mice produced from ES cells that do not disrupt the endogenous gene. In addition, a complete antibody containing the human chain was confirmed in the serum of the chimeric mouse.
  • the culture supernatant was analyzed by EL1SA according to the method described in (Example 65- (4)), and the presence of a complete human antibody with human Ig // and ig ⁇ of 0.09-llmg / inl in 16 wells was analyzed. Was confirmed.
  • the antibody titer of anti-HSA human ⁇ chain was measured to obtain one positive gel.
  • Cells with complete human antibody positive and anti-HSA human ⁇ chain positive cells were cloned using the limiting dilution method according to the method described in Kandou, Introduction to Monoclonal Antibody Experimental Procedures, Kodansha Scientific, 1991>. Two clones of anti-HSA human chain positive hybridoma were obtained.
  • chimeric mice were prepared from chimeric mice prepared by transferring endogenous antibody heavy chain and light chain deficient mouse ES cells carrying human chromosome 14 and human chromosome 22 partial fragments into immunodeficient mouse host embryos. It was confirmed that hybridomas producing antibody were obtained. In addition, it was confirmed that the antibody titers of antigen-specific human lg and Ig; i increased in response to HSA antigen stimulation. Furthermore, it was confirmed that a hybridoma producing an HSA-specific antibody consisting of human lg ⁇ and ⁇ was obtained from this chimeric mouse.
  • the chromosome has a drug resistance marker, it was possible to select hybridomas using G418 without adding HAT. As a result, only cells having the human chromosome proliferate, so that hybridomas can be selectively obtained. It can also be expected to prevent human chromosomes from falling out of the cells after fusion.
  • the HGPRT enzyme hypoxanthine-guanine-phosphor ibosy 1 trasf er It is expected that cells that are not suitable for HAT selection, such as those that have ase), can be used.
  • mice having the defective allele are selected by Southern analysis (Example 49) for those showing a wild color. (The expected probability is 1/2).
  • Southern mice see Example 49), production of antibody heavy chains in serum (Kitamura et al., Nature, 350, 423-) were performed on offspring born by mating male and female individuals of these antibody heavy chain-deficient heterozygotes. 1991), it is possible to obtain an antibody heavy chain-deficient homozygote in which both alleles are deleted and almost no functional antibody of its own can be produced (the expected probability is 1/4).
  • the results in mice lacking the membrane-type chain are shown in! U tamura et al., Nature, 350,
  • the antibody heavy chain knockout mouse strain was able to be established from the TT2F cell line deficient in the antibody heavy chain unilateral allele.
  • Embryos obtained by mating homozygous males and females reared in a clean environment can be used as hosts for the production of chimeric mice. In this case functional in chimeric mice
  • B cells are mostly derived from injected ES cells.
  • RAG-2 deficient mice (Shinka i et al.,
  • mice 62, 63 Use a mouse ES cell line that lacks the heavy and light chains of the endogenous antibody obtained in step 64) and contains the human chromosome 14 + 2 or 14 + 22 or 14 + 2 + 22 (fragment). Then, a chimeric mouse is prepared by the method shown in (Example 10). In the resulting chimeric mouse, the human antibody heavy chain (on chromosome 14), light chain / c (on chromosome 2), and light chain functional in B cells derived from ES cells; It mainly produces human antibodies.
  • the ES cell line KH10 obtained in (Example 62) was injected into embryos obtained by male and female mating of the antibody heavy chain knockout mouse established in Example 67- (1).
  • a chimeric mouse was prepared in the same manner as in (1). Blood was collected from 7-week-old chimeric mice, and the concentration of human antibody in the serum was detected by ELISA according to (Example 14) (Example 65- (3)). The results are shown in Table 23. Complete antibodies containing human / c and / z or a chains were identified in the serum of the chimeric mice.
  • Example 67- (1) Chimera mice were prepared by injection into embryos obtained by mating of heavy chain knockout mice (by the same method as in Example 65- (2)). Blood was collected from the born chimeric mice at the age of 5 weeks of age, and the concentration of human antibody in the serum was detected by ELISA according to (Example 14) (Example 65- (4)). The results are shown in Table 24. Human; Complete antibody containing I chain and "chain or a chain” was confirmed in the serum of chimeric mice. Table 24 Human antibody concentration in chimeric mice (EL 1 SA)
  • the SC20 fragment was subjected to FISH analysis using a human chromosome-specific probe (Tomi zuka. Et al., Nature Genet, vol 16, 133-143 (1997)). As a result, it was observed that the size of the chromosome that hybridized to the probe was smaller in this clone than in the control (including the intact chromosome 14). That is, it was confirmed that A9 / SC20 contained the fragmented human chromosome 14.
  • Stable maintenance of the human chromosome in the mouse is important for efficient expression of the transgene and efficient transfer of the human chromosome to offspring. Since selection by drug addition cannot be performed after injection of the ES embryo into the host embryo, it is desirable that the transfected human chromosome be stably maintained even under non-selection conditions.
  • the TT2F (SC20) -21 strain containing the SC20 fragment was cultured for a long time in a G418-free medium, and the retention of the SC20 fragment under these conditions was examined.
  • the TT2F (SC20) -21 strain was cultured in a selective medium (G418, 300 zg / ml) for one week, and then subcultured in a non-selective medium for 45 days (subcultured every other day by 8-fold dilution). On days 0, 15, 30, and 45, 300-1000 cells were seeded on six 35-plate dishes, three of which were cultured in a selective medium and three were cultured in a non-selective medium for about one week to obtain colonies. I counted.
  • the chromosome retention rate (A / B) was calculated from the total number of colonies of three petri dishes under selection conditions (A) and the total number of colonies of three petri dishes under non-selection conditions (B).
  • C14m-16 and C14m_lT both chimeric ratios of hair color 100%
  • male ICR mice to produce ES cell-derived progeny. I thought about what to do.
  • TT2F cells wild color: dominant
  • TT2F cells wild color: dominant
  • ICR male mouse albino, recessive
  • sperm produce wild-colored ova
  • ICR-derived ova produce white pups I do.
  • All 30 viable offspring mice obtained by this cross showed wild color, which is the hair color derived from ES cells, indicating efficient transfer of ES cells to the germ line.
  • Genomic DNA prepared from the tail of these offspring mice was examined for the retention of human chromosome fragments by PCR.
  • TT2F (SC20) -21 As a result of PCR amplification of three primers (IGVH3, IM, D14S543) confirmed to exist in TT2F (SC20) -21, TT2F (SC20) -21 was detected in 10 out of 30 (333 ⁇ 4) The presence of the three markers was confirmed. That is, the TT2F cell line TT2F (SC20) -21, which retains the human chromosome 14 fragment, differentiates into a functional egg in chimeric mice, and the human chromosome 14 fragment is transmitted to F1 progeny derived from the egg. It was shown that.
  • mice 16-5, 17-8, 17-23) were used for analysis of SC20 fragment retention rate in mouse individuals.
  • the mice were injected intraperitoneally with 0.3 ml of colcemid (100 zg / ml), euthanized by cervical dislocation, and the brain, liver, spleen, testis, and bone marrow were removed.
  • PB all tissues except bone marrow
  • FISH analysis was performed using a human chromosome-specific probe (Human COT-1 DNA) and described in a reference (Tomizuka et al., Nature Genetics, 16, 133-143). Performed according to method. For brain, spleen, liver, and bone marrow, count and maintain the number of signals that are detected (+ in Figure 39) and those that are not detected (-in Figure 39) for more than 30 randomly selected interphase nuclei The rate was calculated.
  • Testes were classified into first meiotic stage images, second meiotic stage images, and spermatozoa, and counting was performed for at least 10 each to calculate the retention. As a result, the brain and liver showed a retention rate of nearly 100% for all three individuals. In bone marrow and spleen, a decrease in retention was observed. In the testis, 80-100% of the first meiotic image and 30-50% of the sperm were obtained. Assuming that the SC20 fragment is stably retained, it is theoretically 100% in the first meiosis and 50% in the second meiosis and sperm. Therefore, it was considered that the SC20 fragment was stably retained in the testis.
  • fibroblasts were prepared from the tail, and the retention of SC20 fragments was examined in the same manner as in Example 79.
  • the results were 16-5: 98 17-8: 963 ⁇ 4 and 1-23-23: 983 ⁇ 4 (tested on 50 nuclear plates each).
  • mice deficient in antibody production by using a human chromosome 14 fragment (including the antibody heavy chain gene) as a guide
  • the antibody cannot be produced due to the deletion of the endogenous heavy chain gene (B-lymphocyte deficiency: Ref. Kitamura et al., Nature, 350, 4.23-, 1991). It was treated by introducing fragment SC20 (including the antibody heavy chain gene) to produce antibody and B-lin '. Indicates that sphere production ability has been restored
  • Human chromosome 22 (fragment) introduced Human chromosome retention in chimeric mouse progeny derived from ES cells
  • Genomic DNA was prepared from the obtained clone and screened by PCR using the primer (Example 2).
  • 67 clones carrying the human Ig; i gene eight markers on chromosome 22 (D22S315, D22S275, D22S280, D22S278, D22S283, D22S272, D22S282, D22S274; order on chromosome 22) For details, see Nature, vol 377, 367-379, (1995).
  • the nucleotide sequence of the primer is obtained from a database such as Genbank.) PCR analysis was performed using a specific primer. As a result, part of the marker was lost in 25 clones, indicating that chromosome 22 was fragmented in these clones (FIG. 40). Above all, clone 22 is considered to be a rather small fragment due to the disappearance of markers other than Igs for ⁇ £ ⁇ and D22S315 and # 28 (Fig. 40).
  • FIG. 41 shows the result of FISH analysis (Example 18) of clone # 28 using a human chromosome-specific probe.
  • the size of the chromosome hybridizing to the probe is smaller than that of the control (including the intact chromosome 22). That is, due to chromosome fragmentation occurring during microcell fusion, a human chromosome 22 fragment containing the antibody I gene could be obtained.
  • Microcell transfer of chromosome 22 (fragment) to TT2F cells was performed by the method described in Example 2.
  • # 22, # 28, and 6-1 were used as chromosome donor cells.
  • Puromycin (0.75 g / ml) was selected for clone # 22 and A9 / # 22 (6_l), and G418 (225 g / ml) was selected for clone # 28, and 13 strains each (clone # 22), 5 strains (from 6-1) and 3 strains (from clone # 28).
  • G418 225 g / ml
  • a chimeric mouse carrying human chromosome 22 (fragment) and an ICR mouse are mixed and crossed.
  • the retention of the chromosome 22 fragment of human is examined by PCR (see Examples 30, 42 and 43).
  • the mouse ES cell line carrying human chromosome 22 or a partial fragment thereof differentiates into a functional egg or sperm in a chimeric mouse as shown in (Example 42) and (Example 43), and Human chromosome 22 (fragment) can be transmitted to offspring. That is, it is possible to establish a subcultureable mouse strain that retains chromosome 22 (fragment) containing the human antibody light chain I gene.
  • Example 70 Creation by crossing mouse individuals that simultaneously hold a human chromosome 2 fragment and a chromosome 14 (fragment)
  • mice harboring the human chromosome 2 fragment obtained in (Example 42) or (Example 43) and the mouse strain harboring the human chromosome 14 (fragment) obtained in (Example 68) were Genomic DNA prepared from the tail of the offspring born by crossing is analyzed by the PCR method or the like (Examples 9, 42 and 43), and the human chromosome 2 partial fragment and human chromosome 14 (fragment) are analyzed. Obtain an individual to keep at the same time.
  • Genomic DNA prepared from the tail of the offspring mouse is analyzed by PCR, etc. (Examples 30, 42 and 43), and individuals that simultaneously retain human chromosome 22 (fragment) and human chromosome 14 (fragment) Get. (Example 72) Preparation by crossing of mouse individuals simultaneously retaining human chromosome 2 fragment, chromosome 14 (fragment) and chromosome 22 (fragment)
  • a mouse strain carrying the human chromosome 22 (fragment) obtained in (Example 71) and the human chromosome 14 (fragment) was used to carry the human chromosome 2 fragment obtained in (Examples 42 and 43).
  • Genomic DNA prepared from the tail of the offspring mouse born by crossing with a mouse strain that is bred with the mouse strain is analyzed by PCR and the like (Examples 9, 30, 42, and 43), and human chromosome 22 (fragment) and human are analyzed.
  • An individual is obtained that simultaneously retains three human chromosomes, chromosome 14 (fragment) and a partial fragment of human chromosome 2.
  • a mouse strain containing the chromosome 2 (fragment) of human chromosome 2 obtained in (Example 70) and the chromosome 14 (fragment) of human and a fragment of chromosome 22 of human obtained in (Example 69) Similarly, by crossing with a mouse strain, a mouse individual simultaneously retaining three types of human chromosomes is obtained.
  • Example 73 Preparation by crossing mouse strains that mainly produce intact human antibodies No. 2 + 14 (Example 70), No. 14 + 22 (Example 71), No. 2 + 14 + No. 22 (Example 72)
  • a mouse strain retaining the chromosome was repeatedly crossed with a mouse strain lacking the endogenous antibody heavy chain / light chain / c gene, and the human No. 2 + 14, No. 14 + 22 Or a mouse strain that retains chromosomes 2 + 14 + 22 and is homozygous for the endogenous antibody heavy chain gene and light chain / c gene deletions by PCR analysis (Examples 9, 30, 42, 43). ).
  • predominantly intact human antibodies are produced (Green et al., Nature Genetics, 7, 13-, 1994; Shionberg et al., Nature, 368, 856-, 1994).
  • mice that retains the human chromosome 2 fragment and the human chromosome 14 fragment and is homozygous for deletion of the endogenous antibody heavy chain gene and antibody chain gene is described below.
  • the four strains used for crossing and the test methods for genotypes of each strain are as follows.
  • Example 42 Mouse strain harboring the human chromosome 2 fragment obtained in Example 42: PCR analysis of the tail DNA shown in Example 42 and human antibody No. 2 using the expression of human antibody / c chain in serum as an index Test chromosome fragment retention
  • Example 67- (1) Southern analysis of the tail DNA shown in Example 67- ⁇ ) and the presence or absence of mouse antibody chain expression in serum (Example 75 ) To test homo or hetero individuals with heavy chain deletion
  • Example 80 c-chain-deficient homozygous or heterozygous individual was tested by Southern analysis of tail DNA shown in Example 80
  • FIG. 42 shows the serum antibody concentration and genotype.
  • a complete human antibody consisting of a human chain and a human c chain was detected in the serum of HK23 at a concentration of 18 mg / l (Example 38).
  • a mouse individual having a human chromosome containing a human antibody gene obtained in (Examples 42, 43, 68, 69, 70, 71, 7.2, 73) can be treated with an antigen of interest.
  • the spleen is removed, fused with myeloma cells, and cultured for 1-3 weeks to produce a hybridoma.
  • the culture supernatant is analyzed by ELISA.
  • the EL1SA method is performed by the method described in (Examples 14, 15, 21, 22, 25, 33, 34, 37, 38) to obtain human antibody-positive and human antibody-positive and immunized antigen-specific clones.
  • mice The chimeric ratios of the offspring born from the mouse antibody heavy chain bilateral allele disrupted TT2F cell line (131-3) obtained in (Example 51) by the method shown in (Example 40) were 0% and 50%, respectively. Detection and quantification of mouse IgM in serum was performed on 99% of 3 individuals. Blood was collected from chimeric mice about 2 weeks old after birth, and the mouse IgM concentration in the serum was quantified using the ELISA method of Example 14. An anti-mouse IgM antibody (Kirkegaard & Perry Laboratories Inc., 01-18-03) diluted with PBS was immobilized, and then a serum sample diluted with PBS supplemented with 53 ⁇ 4FBS was added.
  • mice derived from TT2F cells in which alleles of both sides of the mouse antibody heavy chain have been disrupted those with a chimera rate of 99% have low mouse IgM concentrations, confirming that the mouse heavy chain gene of ES cells hardly functions. .
  • Table 2859 Mouse IgM concentration in oo 9 chimeric mice (ELISA) Chimera rate% I giVI (mg / I)
  • Example 48-1 a LoxP-PGKPuro plasmid containing oxP sequences on both sides of the purex-mycin resistance gene was prepared.
  • pPGKPuro plasmid DNA (Watanabe et al., Biochem Biophys Res Com 213: 130-137 (1995), Peter W. Laird, Whitehead Institute for Biochemical Research and Massachusetts institute of technology, Dept. of Biology, Cambrige, MA
  • the puromycin-resistant cassette PGKPuro was cut out with the restriction enzyme Sal 1 and smoothed.
  • PGKPuro was inserted into the Smal and EcoRV cleavage sites of the plasmid containing the LoxP sequence to obtain the plasmid pLoxP-PGKPuro ( Figure 30). Furthermore, the DNA fragment containing the constant region of the genomic DNA containing the mouse antibody light chain / J region and the constant region was replaced with the LoxP-PGKPuro gene in the same manner as in Example 48 (FIG. 31).
  • Example 58 The antibody light chain-deficient heterozygous TT2F cell line (HD43) obtained in Example 58 was further obtained by insertion of the puemycin-resistant gene into which both alleles were destroyed.
  • Example 76 Use the antibody light chain targeting vector prepared in Example 76 as a restriction enzyme! After linearization with pnl, the HD43 strain was transformed in the same manner as in Example 58. Puromycin concentration 0.75 / g / nil The colonies formed after 7 to 9 days were picked up, cryopreserved by the method described in Example 49, and genomic DNA was obtained. The puromycin-resistant strain genomic DNA was digested with the restriction enzyme EcoRl (Takara Shuzo), separated by agarose gel electrophoresis, subjected to Southern analysis, and homologous recombinants were detected with the probe shown in Example 48-4 (Example 58, 59).
  • the antibody light chain double allele-disrupted strain TT2F cell strain HD43P-10 obtained in (Example 77- (1)) was set up from a frozen stock, and ICR (CLEA Japan) was crossed with male and female mice. The resulting 8-cell stage embryos were injected with 10 to 12 embryos per embryo. After culturing overnight in ES cell culture medium (Example 9) to generate blastocysts, pseudopregnancy treatment 2.5 days after the uterus of a foster parent ICR mouse (Clea Japan) About 10 embryos were transferred. As a result of transplanting a total of 161 injected embryos, 37 offspring mice were born.
  • the chimeric individual is determined by whether or not the wild color (dark brown) derived from TT2 cells is found in the white derived from the host embryo (ICR) in coat color. Out of the 37 births, 9 had apparently wild color in the coat color, that is, the contribution of ES cells was observed. Of these, four of them were chimeric mice (derived from ES cells) that had wild color for over 80% of their coat color.
  • Puromycin and G418 resistance marker gene of the antibody light chain bilateral allele-disrupted strain HD43P-10 obtained in (Example 77) and confirmed to have high chimera-forming ability Is removed by the procedure shown in (Example 52). did.
  • Expression vector PBS185 (BRL) containing Cre recombinase gene that causes site-specific recombination between loxP sequences inserted on both sides of the G418-resistant gene (Example 48-1) (Example 52) Puromycin (0.75 zg / nil) -sensitive strain (6 strains) obtained in the same manner as in c (Example 52) introduced into the above strain according to the method described above, was grown on a 35-dish petri dish until confluent. 3/5 of the suspension was suspended in 0.5 ml of a storage medium (ES medium + 10? DMSO Sigma>) and stored frozen at -80 ° C.
  • ES medium + 10? DMSO Sigma> storage medium
  • the genetic background of chimera mouse progeny (hereinafter Fl (chimera x MCH)) carrying the human chromosome 2 fragment (hereinafter W23 fragment) shown in (Examples 43 and 44) was derived from TT2F cells (Example 39). This is a mixture of the CBA mouse strain and C57BL / 6 mouse strain, and the MCH (ICR) mouse strain used for crossing with the chimeric mouse. In order to observe the behavior of the W23 fragment in a genetic background as homogeneous as possible, we first backcrossed with MCH (ICR).
  • FIG. 43 shows the results of measuring the concentration of human antibody / c chain in serum by the same method as in (Example 44). Human antibodies / chains were detected in the sera of all individuals holding the W23 fragment. On the other hand, in F2 (F1 x MCH) and F3 (F2 x MCH), the variation in the / c chain concentration was large, and the average value was lower than that in chimera and FKchimera x MCH).
  • F3 F2 x VICH
  • F3 F2 x C57BL / 6
  • F2 x C57BL / 6 have exactly the same F2 (Fi x MCH) population as a parent
  • the difference between them is considered to be only the genetic background. That is, it was shown that the difference in genetic background affects the expression level of the human antibody c-chain. It was found that the genetic background of C57BL / 6 was more desirable than MCH (ICR) for efficient expression of human antibody / c chain. Similar experiments also showed that the genetic background of the C3H HeN strain (purchased from CLEA Japan) is more than or equal to that of C57BL / 6 and is desirable for efficient expression of human antibody / c chain.
  • Chromosome 14 fragment is also considered desirable for efficient expression of the above gene.
  • a FKchimera x MCH which retains the human chromosome 14 fragment (hereinafter referred to as SC20 fragment) obtained in (Example 68) and expresses a human antibody heavy chain in serum # Crossing of 17-7 with MCH (ICR) and C57BL / 6 was performed.
  • F2 F1 ⁇ MCH
  • F2 F1 x C57BL / 6
  • human serum chain concentration Example 68
  • tail-derived fibers The retention rate of the SC20 fragment in the metaphase chromosome sample prepared from the blast cells was measured in the same manner as in the case of the W23 fragment.
  • F2 Fl X C57BL / 6
  • concentration of chain of F2 F 1 X MCH: il. 0 mg / l, 1.
  • the antibody heavy chain-deficient and antibody ⁇ -chain homologous recombinant ES cell line HD43 obtained in (Example 58) was set up from a frozen stock, and the 8-cell stage obtained by mating male and female ICR (CLEA Japan) mice Embryos were injected 10-12 per embryo.
  • the cells were cultured in ES cell culture medium (Example 9) to generate blastocysts, and after about pseudopregnancy treatment, the uterus of the foster parent ICR mouse (CLEA Japan) was about 10 cells per uterus. Injection embryos were implanted. As a result of transplanting a total of 314 injected embryos, 51 offspring mice were born.
  • the chimeric individual is determined by whether or not a wild color (dark brown) derived from TT2 cells is found among whites derived from the host embryo (ICR) in coat color. Of the 51 births, 26 had apparently wild color in the coat color, ie, the ES cells contributed. Two of them were female chimeric mice with 100% coat color of wild color (derived from ES cells).
  • FIG. 44 shows the results of detection and quantification of mouse antibody c-chain and s-chain in serum.
  • an antibody / c-chain knockout mouse strain could be established from the antibody / chain homologous recombinant ES cell line HD43.
  • the human telomere sequence was inserted by homologous recombination on chromosome 22 where the human antibody light chain I gene (hereinafter referred to as IgA gene) was present, and fragmented (JE zhaki et al., Natl Gene Gene., 2, 283-287, 1992). Specifically, an evening get- ing vector for inserting a human telomere sequence into the LIF locus located in the immediate vicinity (telomere side) of the lg; i gene was prepared.
  • the human telomere was synthesized by PCR according to JJ Harrington et al. (Ature Genet .. 15, 345-355, 1997).
  • the PCR product was purified by agarose gel electrophoresis and blunted using DNA blunting Kit (Takara Shuzo). This blunted PCR product was introduced into the Eco RV site of pBluescript SK II (t) (Toyobo) by ligation (DNA Ligation Kit, Takara Shuzo) (pBS-TE.
  • the plasmid pBS-TEL was sequenced. As a result, it was introduced in the direction of Hindill-(TTAGGG) n-Eco RI.
  • the LIF gene region on human chromosome 22 used for homologous recombination was amplified by PCR and cloned into plasmid pBS-TEL as follows.
  • the sequence of the primer used for PCR is as follows.
  • the composition of the PCR reaction solution is 10 X LA PCR buffer II (Mg 2 — free) (Takara Shuzo) 5 n 1, 25 mM MgCl 2 5 ⁇ 1, dNTPmixture (2.5 mM each) (Takara Shuzo) 8 / Sense Primer lOpmol Antisense primer lOpmol, template DNA (HFL1, human primary fibroblast genome) lOOng, LA Taq (5u / l) (Takara Shuzo) 0.51, and sterilized distilled water was added to make the total volume 501.
  • reaction solutions were prepared on ice, and the reaction tubes were set in a thermocycler (PCR system 9600, PerkinElmer) set at 85 ° C in advance. After heating at 94 ° C for 1 minute, a cycle of 98 ° C for 10 seconds and 65 ° C for 5 minutes was performed 35 times.
  • the PCR product was purified by agarose gel electrophoresis, cut with Spe1 (the SpeI site was present in the primer), and inserted into the SpeI site of pBS-TEL.
  • LIF genes whose orientation was opposite to that of the human telomeric sequence (TTAGGG) n were selected (M. Giovannini et al., Cytogenet Cell Genet 64, 240-244, 1993) [pBS-TEL / LIF].
  • the plasmid pGKPuro containing the puromycin resistance gene (S. Watanabe et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 213, 130-137, 1995) was cut with EcoRI, blunted, and NotI linkers were removed. People.
  • the puromycin resistance gene was excised by NotI digestion and inserted into the NotI site of pBS-TEL / LIF. Puromycin resistance gene transcription direction force The same direction as the IF gene direction was selected (pBS-TEL / LIFPu ro, Figure 45).
  • This plasmid was amplified using Escherichia coli DH5, purified using a QIAGEN column (Funakoshi), and used for transfection (described later).
  • mice # 9 cells having human chromosome 22 marked with the G418 resistance gene (Tomitsuka et al., Ature Gene t. 16, 133-143, 1997; hereinafter, referred to as A9 / # 22neo) was performed at 10%
  • the test was performed in Dulbecco's modified Eagle's medium (hereinafter referred to as DMEM) supplemented with fetal serum (hereinafter referred to as FBS) and G418 (800 / g / ml).
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's medium
  • FBS fetal serum
  • G418 800 / g / ml
  • Avian DT40 cells were cultured in DME 1 supplemented with 10 10 FBS, 13 ⁇ 4 chicken serum, and 10 ′ M 2-mercaptoethanol.
  • Microcells were obtained as follows (for details, see Shimizu et al., Cell Engineering Handbook).
  • A9 / # 22neo cells were cultured in twelve 25 cm 2 centrifugal flasks (course evening, 3025) until the cell density reached about 90% saturation.
  • the medium was replaced with a medium (DMEM + 203 ⁇ 4FBS) supplemented with colcemide (0.07 g / ml, demecorsin, Wako Pure Chemical), and the cells were further cultured for 2.5-3 days to form microcells.
  • the culture solution was removed, the cytochalasin B (10 g / ml, Sigma) solution, which had been kept at 37 ° C in advance, was filled in a centrifugation flask, and centrifuged at 8,000 rpm for 1 hour at 34 ° C.
  • the microcell was suspended in DMEM and purified by filter filtration. After purification, the mixture was centrifuged at 1500 rpm for 10 minutes and suspended in 5 ml of DMEM. Centrifuge 2 ⁇ 10 7 DT40s at 1000 rpm for 5 minutes, wash twice with DMEM,
  • the microcell was centrifuged again at 1500 rpm for 10 minutes, and 5 ml of the DT40 suspension was gently overlaid without removing the supernatant. 1300 rpm, after 5 minutes centrifugation, the supernatant was removed, PHA- P (100 g / ml , Dafuko) was suspended in 2 ml, and allowed to stand 37 ° C, 5% C0 2 Lee Nkyu in better 15 minutes. The mixture was centrifuged at 1700 rpm for 7 minutes, the supernatant was removed, and the cell mass was loosened by tapping.
  • Genomic DMA was extracted from these clones using the Puregene DNA Isolation Kit (Gentra System), transformed into type III, and subjected to PCR using a human lg; i gene-specific primer.
  • a clone having human chromosome 22 containing the gene was identified.
  • the human igA gene-specific primers used are as follows.
  • the composition of the PCR reaction solution is 10 X Ex Taq buffer (Takara Shuzo) 5 n1, dNTPmixture (2.5 mM each) (Takara Shuzo) 8 1, each primer lOpmol, genomic DNA100ng, Ex Taq (5u / H1) (Takara Shuzo) 0.5 In ⁇ , sterile distilled water was added to make the total volume 50 1. All reaction solutions were prepared on ice, and the reaction tubes were set in wells of a thermal cycler (PCR system 9600, PerkinElmer) preset at 85 ° C.
  • ⁇ indicates that the marker was detected, and X indicates that it was not detected.
  • the left side shows the position of each key on chromosome 22 based on the physical map.
  • Human COT-1 DNA (rhodamine label) was used as the probe. Observation of 20 to 30 division images confirmed that almost the entire length of human chromosome 22 was present independently as shown in the PCR results ( Figure 50). Human chromosome 22 is stained red. ' ⁇
  • DT40 / i 22neo avian DT40 cell line 52-18
  • the plasmid pBS-TE / LI FPuro prepared in (Example 81) was transfected with the DT40 / # 22neo obtained in (Example 82), and human chromosome 22 was placed on the LIF locus. Attempted to specifically fragment the DNA.
  • the culture of DT40 / 22neo cells was performed under the same conditions as in the case where G418 (lmg / ml) was added (Example 82).
  • the 10 cells were washed once with cold PBS, suspended in 0.5 nii of PBS, and placed on ice. 25-30 g of pBS-TEL / LI FPuro linearized with Eco RI is added to the cells, mixed with a pipette, transferred to an electroporation cuvette (BioRad), and placed on ice. For 10 minutes.
  • the cuvette was set on a Gene Pulser (Biorad) and a voltage was applied at 550 V, 25 / F. After standing on ice for 10 minutes, the cells were transferred to a 75 cm 2 culture flask containing a medium (described above) and cultured for 24 hours. 24 hours later, G418
  • Genomic DNA was extracted from these cells in the same manner as described above, and PCR was performed to identify a homologous recombinant in which the human telomere sequence was inserted into the UF locus.
  • One of the primers was designed in the LIF gene region not contained in the vector, and the other primer was designed in the puromycin resistance gene contained in the vector (FIG. 47).
  • the sequences of the primers are as follows.
  • the composition of the PCR reaction solution is 10 X LA PCR buffer II ( 2 to free) (Takara Shuzo) 51, 25 mg gCl ⁇ 5a1, dNTPmixture (2.5 mM each) (Takara Shuzo) 81, 1 lOpmol of each primer, template DNA lOOng, LA Taq (5u / l) (Takara Shuzo) was 0.51, and sterilized distilled water was added to make the total volume 50/1. All the reaction solutions were prepared on ice, and the reaction tubes were set in the wells of a thermal cycler (PCR system 9600, Perkin-Elmer) preset at 85 ° C.
  • chromosome 22 IgA, IF, MB, IL2RB, CYP2D6, DIAL ECGF1, ARSA, J. E. Collins et al. Nature 377 suppl: 367, 1995
  • polymorphic markers D22S315, D22S2 75, D22S280, D22S281, D22S277, D22S278, D22S283, D22S272, D22S282, D22S2 74, JE Collins et al., Nature 377 suppl: 367, 1995.
  • the presence was checked by detecting by PCR.
  • Antisense primer 5'-TCTGCTGTGAGTGAACCTGC-3 '(SEQ ID NO: 72)
  • Antisense primer 5'-TCACTCTGACCCACGATACAGC-3 '(SEQ ID NO: 74)
  • the composition of the PCR reaction solution was 10 X Ex Taq buffer (Takara Shuzo) 51, dNTPmixture (2.5 mM each) (Takara Shuzo) 81, lOpmol of each primer, 100 ng of genomic DNA, Ex Taq (5 u /
  • clones 67, 68, 328 and 343 are at the telomere side from the LIF locus where the human telomere sequence is inserted. It can be seen that none of the genes and markers were detected in at least these four clones.
  • chromosome 22 was actually fragmented was analyzed by FISH.
  • the experimental method was the same as described above, and the probe used was human C0T1 DNA (rhodamine-labeled) and plasmid pGKPuro (FITC-labeled).
  • C0T1 staining it is possible to visually determine whether or not fragmentation has occurred, as compared to DT40 / # 22neo, which has a nearly full-length human No. 22 chromosome.
  • a signal derived from the Puro probe should be able to be detected at the telomere-end of the chromosome 22 fragment.

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Ultra Sonic Daignosis Equipment (AREA)
  • Measuring Pulse, Heart Rate, Blood Pressure Or Blood Flow (AREA)

Description

明 細 書 内因性遺伝子が破壊されている分化多能性保持細胞 技術分野
本発明は、 キメラ非ヒ ト動物、 その作製法およびその利用法に関する。 本発明 のキメラ非ヒ ト動物を用いれば、 これまで不可能であった 1Mb (百万塩基対） 以 上の外来巨大 DNA断片を動物個体で保持発現させることが可能になる。 従って、 これを利用することにより、
•生物学的に活性な物質をコードする遺伝子の全長、 例えば、 ヒ 卜抗体遺伝子 全長を保持し、 発現する動物個体の作製が可能になる。 この動物から得られる生 物学的に活性な物質、 例えば、 ヒ ト抗体は医薬品としての利用価値がある。
• ヒ ト巨大遺伝子 （組織適合性抗原、 ジス 卜ロフィ ン等） の動物個体における 機能解析が可能になる。
- ヒ ト優性遺伝病及び染色体異常症のモデル動物作製に利用できる。
また、 本発明は、 内因性遺伝子が破壊されている分化多能性保持細胞およびそ の使用、 ならびにミクロセル法を用いたキメラ動物の作製法および該キメラ動物 の使用に関する。 破壊された内因性遺伝子と同じまたは相同の遺伝子産物をコー ドする遺伝子を含む外来染色体またはその断片を受容細胞としての本発明の細胞 に移入させて、 その細胞から目的とする機能細胞やキメラ非ヒ ト動物を作製すれ ば、 分化多能性細胞を生殖系列細胞へ分化させなく とも、 導入遺伝子を効率良く 発現させることが可能になる。 これは内因性遺伝子の破壊あるいは導入遺伝子に よって、 非ヒ ト動物の生殖細胞に影響を与えるかあるいは生殖細胞への分化を不 可能にするような場合にも、 分化多能性細胞から目的とする機能細胞ゃ非ヒ 卜動 物を作製することによって、 内因性遺伝子を欠損し内因性遺伝子産物を低減した 状態で、 これまで不可能であった 1 M b (百万塩基） を超える外来巨大 D N A断 片をかかる機能細胞やキメラ非ヒ 卜動物の個体、 組織または細胞において保持発 現させることが可能になる。 背景技術
外来遺伝子を動物個体において発現させる技術、 すなわち トランスジェニック 動物作製技術は、 その遺伝子の生体内機能に関する情報を得るために有用なばか りでなく、 遺伝子発現を制御する DNA配列の同定 （例えば、 Magramら， Nature, 315:338, 1985) 、 ヒ 卜疾患モデル動物の開発 （山村ら， マニュアル疾患モデル マウス， 中山書店， 1994) 、 さらには家畜の育種 （例えば、 Muilerら， Experien tia, 47:923, 1991) 、 それを用いた有用物質の生産に利用されてきた （例えば 、 Velanderら， P. N. A. S.， 89:12003, 1992) 。 遺伝子導入の対象としてはこれ までマウスが最も多く用いられてきた。 実験動物として詳細に研究され、 胚操作 技術も確立されているマウスはこの目的に最も適した哺乳動物であるといえる。 マウス個体への外来遺伝子導人法は大きく分けて 2つ知られている。 1っは受 精卵前核に DNAを注入する方法 （Gordonら， P. N. A. S.， 77:7380, 1980) であり 、 もう一つは分化全能性を保持した胚幹細胞 （以下 ES細胞、 という） に DNAを導 入し、 キメラマウスを作製する方法 （Takahashiら， Development, 102:259, 19 88) である。 後者の場合、 キメラマウスにおいては、 ES細胞の貢献した細胞、 組 織においてのみ、 ES細胞由来の生殖細胞を経て得られる子孫においてはすべての 細胞、 組織で導入遺伝子が保持される。 これらの技術を利用して現在までに数多 くのトランスジヱニックマウスが作製されてきた。
しかし、 現状では導入可能な DNAの大きさに限界があり、 それがこの技術の利 用範囲を大きく制限している。 その限界はクローン化可能な DNAの大きさに依存 し、 これまで最も大きな DNA断片を導入した例の一つは、 酵母人工染色体 （YAC ) にクローニングされた約 670kbの DNA断片である （Jakobov sら， Nature, 36 2:255, 1993) 。 さらに最近になってヒ ト抗体重鎖遺伝子の可変領域の約 8割及 び定常領域の一部 （C 、 C (5、 Cァ 2) を含む約 1 Mbの YACの導入も報告 された （Mendezら、 Nature Genetics, 15:146， 1997)。 これらの実験は、 YACを 保持する酵母とマウス ES細胞を融合することにより行なわれた。 YACにおいては 、 約 2Mbまでの外来 DNAをクローニングできるとされているが （Den Dunnenら， Hum. ol. Genet., 1:19， 1992 ) 、 出芽酵母細胞中では、 相同 DNA配列同士の組 換え頻度が高いことが知られており、 反復配列を多く有するヒ ト DNA断片を完全 な形で安定に保持することが困難な場合がある。 事実、 ヒ トゲノム DNAを含む YA Cライブラリーでは、 その？り〜^ が何らかの組換えを起こしている （Greenら ， Genomics, 11:584, 1991) 。
もう 1つの方法として、 ヒ ト培養細胞から得られる中期染色体を顕微切断し、 その断片 （10Mb以上と推定される） をマウス受精卵に注入することが試みられた (Richaら， Science, 245:175, 1989) 。 この結果得られたマウス個体において ヒ ト特異的 DNA配列 （Alu 配列） が検出されたが、 ヒ 卜遺伝子発現については確 認されていない。 また、 ここで用いられた染色体調製法では染色体をスライ ドグ ラスに固定する際、 酢酸メ タノールを使用するために、 DNA自体が小さく断片化 してしまうことが避けられず、 注入した DNAがー続きの DNAとして存在している 可能性は低い。
いずれにせよ、 現在まで 1Mbを超える一続きの外来 DNA断片をマウス個体へ導 入、 発現させた例はないといえる。
マウスに導入することが望まれる、 有用かつ興味深いヒ 卜遺伝子：抗体 （例え ば、 Cookら， Nature Genetics, 7:162, 1994) 、 T細胞受容体 （Hoodら， Cold S pring Harbor Symposia on Quantitative Biology, Vol. LVI 11, 339， 1993 ) 、 組織適合性抗原 （Carrolら， P. N. A. S.， 84:8535, 1987) 、 ジストロフィ ン （ Den Dunnenら， 前記） 等は、 そのコー ド領域自体が 1Mbを超える大きさを持つこ とが知られている。 とりわけ、 ヒ ト型抗体の医薬品としての重要性から、 ヒ トの 免疫グロブリ ン重鎖 （〜1.5Mb、 Cookら， 前記） 、 軽鎖/ (〜3Mb、 Zachau, Ge ne， 135:167, 1993)、 軽鎖； I (〜1.5Mb、 Frippiatら， Hum. Mol. Genet. , 4:98 3, 1995)の遺伝子全長を保持し、 発現するようなマウスの作製が望まれているが それは現状の技術では不可能である （日経バイオテク， 1993.7.5.) 。
また、 ヒ 卜の優性遺伝疾患、 先天異常を引き起こす染色体異常症 （ダウン症等 ) の原因遺伝子の多くはクローン化されておらず、 染色体上の大まかな位置情報 のみ利用可能である。 例えば、 中期染色体をギムザ染色することによって得られ る Gバン ドは、 通常数 Mb〜10Mb以上の大きさを有している。 従って、 ある原因遺 伝子が特定の Gバンド上に存在することが明らかとなっても、 これらの異常形質 をマウスに導入するためには、 原因遺伝子周辺の染色体断片 （数 Mb以上） を導人 することが必要であるが、 これも現状の技術では不可能である。
ここに従来技術の限界である 1Mbを超える外来 DNAをマウス個体に導入し、 発 現させる技術の開発が望まれている。
動物培養細胞においては、 従来技術により上述の限界を越える大きさの DNAを 導入することが可能である。 これは主に、 染色体 （ヒ 卜の場合約 50〜300Mbの大 きさを持つ） を媒体として行なわれる。 細胞への染色体移入法はいくつか報告さ れているが （例えば、 McBr i deら， P. N. A. S. , 70： 1258， 1973) 、 その中でも望み の染色体を 1本だけ導入する方法として最適と考えられているのがミ クロセル法 である （Ko iら， Jpn. J. Cancer Res. , 80 : 413, 1989) 。 ミ クロセルと呼ばれ る構造体は 1本〜数本の染色体が核膜、 形質膜に包まれたものである。 ある種の 細胞において紡垂体形成を阻害する薬剤により誘導されるミ クロセルを分離し、 受容細胞と融合することにより、 少数 （多くの場合は 1本） の染色体を導入する ことが可能である。 この方法により得られた、 ヒ ト染色体を 1本だけ保持するモ ノク口モソ一ム雑種細胞のライブラリ一は既知遺伝子のマッビングや、 未知の癌 抑制遺伝子、 細胞老化遺伝子等の存在する染色体を特定するために利用されてき た （例えば、 Saxonら， EMBO J. , 5 : 3461， 1986 ) 。 さらに、 ミクロセルにガン マ線を照射することにより、 染色体を断片化しその一部を導入することも可能で ある （Ko iら， Sc i ence, 260 : 361, 1993) 。 すなわち、 ミ クロセル法は、 1Mbを 超える DNAを動物培養細胞に導入する方法として適していると考えられる。
培養細胞からマウス個体を作り出すことができないかという期待は、 分化全能 性を安定に保持する ES細胞の発見 （Evansら， Nature, 292 : 154, 1981) により 確実に現実のものとなった。 この ES細胞には外来遺伝子、 種々の突然変異、 さら には、 標的遺伝子組換えによる変異が導入可能となり、 マウス個体レベルの遺伝 的改変が自在に行なえるようになった （例えば、 Mansou'rら， Nature, 336 : 348, 1988) 。 このような ES細胞で、 ジーンターゲッティ ングによって標的遺伝子を 破壊したマウスを作製し、 目的遺伝子を導入したトランスジエニックマウスとを 交配させ、 目的遺伝子を効率良く発現するマウスを作製することができる。 例え ば、 マウスの抗体遺伝子を破壊したマウスとヒ 卜抗体遺伝子を導入したマウスを 交配させ、 ヒ ト抗体遺伝子を効率良く発現させることができる。 正常二倍体細胞 には対立遺伝子 （アレル） が存在する。 マウスの片側のアレルの抗体重鎖遺伝子 を破壊したトランスジヱニックマウスでは、 マウス血清中のヒ ト抗体濃度が上昇 し、 さらに交配によって両側のァレルとも破壊したマウスではさらにヒ ト抗体濃 度が顕著に上昇する' （S. D. Wagnerら， Genomi cs, 35 : 405-414, 1996) 。
また片側のアレルの標的遺伝子を破壊した後、 選択薬剤を高濃度にし、 両側の アレルとも標的遺伝子を欠損させること （ダブルノ ックアウ ト） も行われてきた しかし高濃度選択培養法で得られた標的遺伝子欠損細胞は i n v i vo での培養が 長期にわたること、 薬剤による選択圧がきついことなどの理由から生殖細胞への 分化能が低下しているおそれがあった （高津 ·瀧、 実験医学別冊 バイオマニュ アル U Pシリーズ 免疫研究の基礎技術、 羊土社、 1995) 。 あるいは、 2種類の 選択薬剤、 例えばネオマイシン耐性細胞に対してハイグロマイシンを用いてダブ ルノ ックァゥ 卜をした場合には、 その二重耐性 ES細胞が変異マウスとなる例は少 ない （渡部ら、 組織培養 21、 42-45 、 1995) 。 また、 ES細胞は培養条件によって 分化能や増殖能を失うおそれがあり、 2回のジーンターゲッティ ングではキメラ マウスの生殖細胞への分化能を失わないが、 第 2段階の相同組換え頻度が極めて 低いなどから （勝木ら、 実験医学 Vol. 11 No. 20 増刊 1993)、 標的遺伝子欠損 ホモ接合体を得る場合、 とりわけ標的遺伝子が 2つ以上の場合には、 それぞれの 標的遺伝子をへテロ欠損させたマウスを作製したのち交配して 2つ以上の遺伝子 をホモに欠損したマウスを作製することが多かった （N. Longber ら， Nature, 368 : 856-859, 1994)。 破壊するべき遺伝子が近接して存在し、 交配によって 2つ 以上の遺伝子を欠損したマウスが得られない場合には、 ES細胞において、 2つの 標的遺伝子をへテロに欠損させたマウスを作製し、 交配によってホモ欠損マウス を作製することが行われてきた （J. H. van Reeら， Hum Mo l Gene t 4 : 1403-1409, 1995)。
分化多能性を持つ ES細胞を、 i n V roで機能細胞に分化させることが試みられ ている （T. Nakano ら， Sc i ence, 265 : 1098-1101, 1994, A. J. Po tocn i k ら， Th e EMBO Journal, 13 : 5274-5283, 1994) 。 このような培養システム、 例えば成熟 B細胞まで分化を誘導できるシステムは、 B細胞の発生 ·分化過程において機能 する未知の増殖 ·分化因子の同定への利用が期待されている。 一方、 巨大 DNAの導入という意味では前述の YACべクターにクローニング可能 な外来 DNA断片の大きさが限界と考えられてきた。 その大きさを越える DNAを培 養細胞に導入可能な染色体移人という従来技術がマウス個体レベルへの遺伝子導 入に利用されたことはなく、 またその達成は困難であると考えられてきた （村松 ら， トランスジエニックバイオロジー， 講談社サイェンティ フイ ク， ρ143- , 198 9) 。
理由としては、 以下のようなものが挙げられる。
•受容細胞を正常核型のマウス ES細胞としてこれにヒ ト染色体導入を行なう場 合、 それは染色体異常そのものを導入することである。 これまで、 顕微鏡によつ て識別可能な染色体レベルの大きな遺伝子異常はマウスの発生にとって多くの場 合致死的であると考えられてきた （Groppら， J.Exp.Zool., 228:253, 1983; 相 沢慎一， バイオマニュアルシリーズ 8 ジーンターゲティ ング， 羊土社， 1995)
•我々が得ることのできるヒ ト染色体は通常、 有限増殖の正常繊維芽細胞、 あ るいは癌細胞等の分化した体細胞のものであり、 そのような体細胞由来の染色体 が未分化な ES細胞に導入された場合、 ES細胞を分化させたり （Mullerら， Nature ， 311:438, 1984) 、 老化させてしまうのではないか （Sugawara, Science, 247 :707, 1990) と考えられた。
•体細胞由来の染色体が初期胚に導入された場合、 胚発生過程で生殖細胞由来 のそれと同様に正しく機能し、 多様な組織、 細胞における特異的遺伝子発現を担 'うことができるかという問題についての研究は非常に少ない。 この 2者における 大きな違いの一つは染色体 DNAのメチル化状態と想像される。 これは細胞の分化 に伴って変化し、 組織特異的な遺伝子発現における重要な役割が示唆されている (Ceder, Cell, 53:3, 1988) 。 例えば、 抗体遺伝子の活性化に不可欠な部位特 異的 DNA組換え反応について、 メチル化した基質を B細胞に導入した場合、 メチ ル化の状態は複製後も保持され、 組換え反応を阻害するという報告がある （Hsie hら， EMBO J., 11:315, 1992) 。 また、 株化された細胞中では生体内と比較し て、 de novoのメチル化が起こりやすいとされている （Antequeraら， Cell, 62 :503， 1990) 。 よってこれまでの研究から、 繊維芽細胞や、 ヒ トーマウス雑種細 胞のおそらく高度にメチル化されているであろう抗体遺伝子がマウスの B細胞で 正常に発現すると想像することは容易ではなかった。
ここで、 関連するものとして I Umenseeらの 2つの報告 （P. N. A. S.， 75； 1914, 1978 ; P. N. A. S. , 76'：· 879, 1979 ) に注目しなければならない。 1っはヒ ト肉腫 細胞とマウス EC細胞、 もう 1つはラッ ト肝癌細胞とマウス EC細胞の全細胞融合に より得られた融合株からキメラマウスを作製したという報告である。 これらの報 告においてはその実験結果に数多くの疑問点が指摘され、 その信憑性は低いと考 えられている （野口ら， マウスのテラ トーマ， 理工学社， 5節， 1987) 。 また 、 1 日も早い追試が望まれていたにも関わらず、 報告から 18年を経た現在までこ の実験を再現できたという報告は存在しない。 従って、 これらの報告によっては
、 マウス個体において外来染色体を保持させ、 該染色体上の遺伝子を発現させ得 たということはできないと考えられてきた。
こう した状況において、 染色体断片ほどの巨大 DNAをマウスをはじめとする動 物個体に導入し、 発現させることは困難とされ、 実際この問題について検討がな されたことは上記の 1 1 lmenseeらの報告以来ない。
従って、 本発明は、 外来染色体またはその断片を保持し、 該染色体またはその 断片上の遺伝子を発現するキメラ非ヒ 卜動物およびその子孫、 並びに前記のキメ ラ非ヒ 卜動物の作製法を提供することを目的とする。
また、 本発明は、 前記のキメラ非ヒ ト動物およびその子孫に由来する組織およ び細胞を提供することを目的とする。
さらに、 本発明は、 前記のキメラ非ヒ ト動物およびその子孫に由来する細胞と ミエローマ細胞との融合により作製されたハイプリ ドーマを提供することも目的 とする。
さらにまた、 本発明は、 非ヒ ト動物の個体、 組織または細胞を用いて、 外来染 色体またはその断片上の遺伝子の発現産物である生物学的に活性な物質を製造す る方法を提供することを目的とする。
また、 本発明は、 外来染色体またはその断片を保持し、 該染色体またはその断 片上の遺伝子を発現するキメラ非ヒ 卜動物を作製するにあたって、 外来染色体ま たはその断片を移入させる受容細胞として利用可能な分化多能性を保持する細胞 を提供することを目的とする。
また、 本発明は、 前記の分化多能性を保持する細胞の利用方法を提供すること も目的とする。 発明の開示
発明者は前記課題を解決するために鋭意研究を行なった結果、 ヒ ト正常繊維芽 細胞由来染色体あるいはその部分断片をミクロセル法によりマウス ES細胞に導入 し、 それを安定に保持する株を得ることに成功した。 さらにこの ES細胞株から、 その正常組織においてヒ ト染色体を保持し、 ヒ ト抗体重鎖遺伝子を含む複数のヒ 卜遺伝子を発現するキメラマウスを得た。 我々はこの一連の方法により、 これま で不可能であった巨大 DNA断片の個体における保持、 及び該 DNA 断片上の遺伝子 の発現を可能にした。 さらに、 発明者は、 抗体重鎖遺伝子および抗体軽鎖遺伝子 が共にノ ックァゥ 卜された胚性幹細胞を得ることにも成功した。
本発明の要旨は以下の通りである。
1 . 単一または複数の外来染色体あるいはその断片を含むミ クロセルを作製し、 該ミ クロセルとの融合により、 分化多能性を保持する細胞へ前記単一または複数 の外来染色体あるいはその断片を移入させることを特徴とする、 キメラ非ヒ ト動 物の作製法。
2. 単一または複数の外来染色体あるいはその断片を含むミ クロセルを作製し、 該ミクロセルとの融合により、 分化多能性を保持する細胞へ前記単一または複数 の外来染色体あるいはその断片を移入させることを特徴とする、 単一または複数 の外来染色体あるいはその断片を含む分化多能性を保持する細胞の作製方法。
1 または 2の方法においては、 単一または複数の外来染色体あるいはその断片 が 6 7 0 k bを越えてもよく、 さらに、 1 M b (百万塩基対） 以上であつてもよ い。 外来染色体あるいはその断片は抗体をコードする領域を含むものであっても よい。 単一または複数の外来染色体あるいはその断片を含むミ ク ロセルは、 単一 または複数の外来染色体あるいはその断片を含む細胞とミクロセル形成能の高い 細胞とを融合させて作製されたハイプリ ッ ド細胞から誘導されたものであっても よい。 さらに、 単一または複数の外来染色体あるいはその断片を含むミ クロセル は、 前記ハイブリ ツ ド細胞から誘導されたミ クロセルをさらにミ クロセル形成能 の高い細胞と融合させて作製された細胞から誘導されたものであってもよい。 単 一または複数の外来染色体あるいはその断片を含む細胞はヒ ト正常 2倍体細胞で あってもよい。 ミ グロセル形成能の高い細胞はマウス A 9細胞であってもよい。 分化多能性を保持する細胞は、 胚性癌腫細胞、 胚性幹細胞、 胚性生殖細胞および それらの変異体から成る群より選択することができる。 外来染色体あるいはその 断片が目的の遺伝子を含むものであり、 分化多能性を保持する細胞がその外来染 色体あるいはその断片上の該目的の遺伝子と同じあるいは相同の内因性遺伝子が 破壊されているとよい。 外来染色体あるいはその断片が少なく とも 2種の目的の 遺伝子を含むものであり、 分化多能性を保持する細胞がその外来染色体あるいは その断片上の該目的の遺伝子と同じあるいは相同の内因性遺伝子が破壊されてい てもよい。 分化多能性を保持する細胞において、 前記目的の遺伝子と同じあるい は相同の内因性遺伝子の両側または片側の対立遺伝子が破壊されているとよい。 目的の遺伝子は抗体遺伝子であつてもよい。 抗体遺伝子は抗体重鎖遺伝子および 抗体軽鎖遺伝子であってもよい。 1および 2の方法においては、 外来染色体ある いはその断片が目的の遺伝子を含むものであり、 その外来染色体あるいはその断 片上の前記目的の遺伝子と同じあるいは相同の内因性遺伝子が破壊されている分 化多能性を保持する細胞に、 該目的の遺伝子を含む外来染色体あるいはその断片 を移人した後、 該細胞と前記目的の遺伝子と同じあるいは相同の内因性遺伝子が 欠損している系統の非ヒ ト動物の胚とのキメラを作製してもよい。 前記目的の遺 伝子と同じあるいは相同の内因性遺伝子が欠損している系統の非ヒ ト動物が標的 遺伝子相同組み換え法により作製することができる。 キメラ非ヒ ト動物は、 単一 または複数の外来染色体あるいはその断片を保持し、 該外来染色体あるいはその 断片上の遺伝子を発現し、 該外来染色体あるいはその断片を子孫に伝達可能なも のであるとよい。 キメラ非ヒ ト動物は、 好ましくは哺乳動物であり、 より好まし くはマウスである。
3 . 単一または複数の外来染色体あるいはその断片を含む分化多能性を保持する 細胞。
単一または複数の外来染色体あるいはその断片は 6 7 0 k bを越えてもよい。 3の細胞においては、 外来染色体あるいはその断片が目的の遺伝子を含むもので あり、 分化多能性を保持する細胞においてはその外来染色体あるいはその断片上 の該目的の遺伝子と同じあるいは相同の内因性遺伝子が破壊されていてもよい。 また、 外来染色体あ'るいはその断片が少なく とも 2種の目的の遺伝子を含むもの であり、 分化多能性を保持する細胞においてはその外来染色体あるいはその断片 上の該目的の遺伝子と同じあるいは相同の内因性遺伝子が破壊されていてもよい 。 さらに、 分化多能性を保持する細胞において、 前記目的の遺伝子と同じあるい は相同の内因性遺伝子の両側または片側の対立遺伝子が破壊されているとよい。 外来染色体あるいはその断片は抗体遺伝子を含んでもよい。 抗体遺伝子は抗体重 鎖遺伝子および抗体軽鎖遺伝子であつてもよい。 分化多能性を保持する細胞は、 胚性癌腫細胞、 胚性幹細胞、 胚性生殖細胞およびそれらの変異体から成る群より 選択することができる。 3の細胞は、 キメラ非ヒ ト動物を作製するために使用す ることができる。
4 . 単一または複数の外来染色体あるいはその断片を保持し、 該外来染色体ある いはその断片上の遺伝子を発現するキメラ非ヒ ト動物、 または、 前記の単一もし くは複数の外来染色体あるいはその断片を保持し、 該外来染色体あるいはその断 片上の遺伝子を発現するその子孫。
単一または複数の外来染色体あるいはその断片は 6 7 O k bを越えてもよい。 外来染色体あるいはその断片が目的の遺伝子を含むものであり、 該目的の遺伝子 と同じあるいは相同の内因性遺伝子が破壊されていてもよい。 外来染色体あるい はその断片が少なく とも 2種の目的の遺伝子を含むものであり、 該目的の遺伝子 と同じあるいは相同の内因性遺伝子が破壊されていてもよい。 前記目的の遺伝子 と同じあるいは相同の内因性遺伝子の両側または片側の対立遺伝子が破壊されて いてもよい。 前記目的の遺伝子は抗体遺伝子であってもよい。 抗体遺伝子は抗体 重鎖遺伝子および抗体軽鎖遺伝子であつてもよい。
5 . 4のキメラ非ヒ ト動物またはその子孫の交配により得られる単一または複数 の外来染色体あるいはその断片を保持し、 該外来染色体あるいはその断片上の遺 伝子を発現する非ヒ ト動物、 または、 単一もしくは複数の外来染色体あるいはそ の断片を保持し、 該外来染色体あるいはその断片上の遺伝子を発現するその子孫 6 . 単一または複数の外来染色体あるいはその断片を保持し、 該外来染色体ある いはその断片上の遺伝子を発現する 4のキメラ非ヒ ト動物もしくはその子孫また は 5の非ヒ ト動物もしくはその子孫を、 該遺伝子と同じあるいは相同の遺伝子が 欠損している系統の非ヒ 卜動物と交配させることにより作製された非ヒ ト動物、 または、 前記の単一もしくは複数の外来染色体あるいはその断片を保持し、 該外 来染色体あるいはその断片上の遺伝子を発現するその子孫。
7 . 4のキメラ非ヒ ト動物もしくはその子孫、 5の非ヒ ト動物もしくはその子孫 、 または 6の非ヒ ト動物もしくはその子孫に由来する組織。
8 . 4のキメラ非ヒ ト動物もしくはその子孫、 5の非ヒ 卜動物もしくはその子孫 、 または 6の非ヒ ト動物もしくはその子孫に由来する細胞。
細胞は、 B細胞であってもよいし、 動物の組織由来の初代培養細胞あるいは株 化細胞との融合細胞であってもよい。
9 . 上記の B細胞とミエローマ細胞との融合により作製されたハイプリ ドーマ。
10. 4のキメラ非ヒ ト動物もしくはその子孫、 5の非ヒ ト動物もしくはその子孫 、 または 6の非ヒ 卜動物もしくはその子孫の個体、 組織または細胞において、 単 一または複数の外来染色体あるいはその断片上の遺伝子を発現させ、 その産物と しての生物学的に活性な物質を回収することを特徴とする、 生物学的に活性な物 質の製造法。
キメラ非ヒ ト動物の細胞は B細胞であってもよい。 B細胞はミエローマ細胞と 融合して、 不死化されていてもよい。 また、 キメラ非ヒ 卜動物の細胞は、 動物の 組織由来の初代培養細胞あるいは株化細胞との融合細胞であってもよい。 生物学 的に活性な物質は抗体であってもよい。 抗体は、 好ましくは哺乳動物の抗体であ り、 より好ましくはヒ ト抗体である。
1 1. 10の方法により製造できる生物学的に活性な物質。
12. 6 7 0 k bを越えるヒ ト抗体遺伝子の少なくとも一つを保持し、 発現する非 ヒ 卜動物。
12の非ヒ 卜動物は、 1 M b以上のヒ ト抗体遺伝子の少なく とも一つを保持し、 発現するとよい。 ヒ ト抗体遺伝子は、 ヒ ト重鎖遺伝子、 ヒ ト軽鎖/ c遺伝子、 ヒ ト 軽鎖 l遺伝子またはそれらの組み合わせであってもよい。 さらに、 12の非ヒ 卜動 物においては、 そのヒ ト抗体遺伝子と同じあるいは相同の非ヒ 卜動物抗体遺伝子 が欠損しているとよい。 そのヒ ト抗体遺伝子と同じあるいは相同の非ヒ ト動物抗 体遺伝子の欠損は、 '遺伝子相同組換えによる該非ヒ ト動物抗体遺伝子の破壊によ るものであってもよい。
13. 12の非ヒ ト動物の脾臓細胞とミエローマ細胞との融合により得られるハイブ リ ドーマ。
14. 13のハイプリ ドーマにより産生される抗体。
15. ヒ ト抗体の少なく とも一つのクラスまたはサブクラスを発現する非ヒ 卜動物 c 15の非ヒ ト動物においては、 発現するヒ ト抗体のクラスまたはサブクラスの遺 伝子と同じあるいは相同の内因性遺伝子が欠損していてもよい。 ヒ ト抗体のクラ スまたはサブクラスは、 I g M、 I g G、 I g E、 I g A、 I g Dおよびそれら のサブクラス、 またはそれらの組み合わせであってもよい。
16. 6 7 0 k bを越える単一または複数の外来 D N Aを保持し、 該外来 D N A上 の遺伝子を発現する非ヒ 卜動物。
16の非ヒ ト動物においては、 発現する外来 D N A上の遺伝子と同じあるいは相 同の内因性遺伝子が欠損していてもよい。 16の非ヒ ト動物は、 1 M b以上の単一 または複数の外来 D N Aを保持し、 該外来 D N A上の遺伝子を発現してもよい。 発現する外来 D N A上の遺伝子と同じあるいは相同の内因性遺伝子は欠損してい てもよい。
17. 単一または複数の外来染色体あるいはその断片を含むミ クロセルを作製し、 該ミ クロセルとの融合により、 前記単一または複数の外来染色体あるいはその断 片を胚盤胞に由来する培養細胞へ移入し、 該細胞の核を除核した未受精卵に移植 することを特徴とする、 トランスジヱニック非ヒ 卜動物の作製法。
18. 少なく とも 2種の内因性遺伝子が破壊されている分化多能性を保持する細胞 c 18の細胞においては、 少なく とも 2種の内因性遺伝子の両側または片側の対立 遺伝子が破壊されていてもよい。 破壊されている内因性遺伝子は抗体遺伝子であ つてもよい。 破壊されている抗体遺伝子は抗体重鎖遺伝子および抗体軽鎖遺伝子 であってもよい。 分化多能性を保持する細胞は、 胚性癌腫細胞、 胚性幹細胞、 胚 性生殖細胞およびそれらの変異体から成る群より選択することができる。
19. 少なく とも 2回の相同組換えにより、 18の細胞を作製する方法。
19の方法においては、 薬剤耐性マーカ一遺伝子を用いる相同組換えにより分化 多能性を保持する細胞の内因性遺伝子の片側の対立遺伝子を破壊し、 該細胞を該 薬剤の存在下で培養し、 薬剤耐性となった株を選択し、 これらの株をスク リ一二 ングすることにより内因性遺伝子の両側の対立遺伝子が破壊された株を得る工程 を含んでもよい。 薬剤耐性マーカー遺伝子を用いる相同組換えにより分化多能性 を保持する細胞の内因性遺伝子の片側の対立遺伝子を破壊し、 さらに内因性遺伝 子の他方の側の対立遺伝子も薬剤耐性マーカー遺伝子を用いる相同組換えにより 破壊してもよい。 内因性遺伝子の片側の対立遺伝子を破壊するための相同組換え に用いる薬剤耐性マーカー遺伝子が、 他方の側の対立遺伝子を破壊するための相 同組換えに用いる薬剤耐性マーカー遺伝子と同じ種類であってもよい。 内因性遺 伝子の片側の対立遺伝子を破壊するための相同組換えに用いる薬剤耐性マーカー 遺伝子が、 他方の側の対立遺伝子を破壊するための相同組換えに用いる薬剤耐性 マーカー遺伝子と異なる種類であってもよい。
また、 本発明は、 単一または複数の外来遺伝子あるいはその断片ないしは単一 または複数の外来染色体あるいはその断片を移入させる受容細胞としての、 前記 の分化多能性を保持する細胞の利用方法を提供する。 単一または複数の外来遺伝 子あるいはその断片は、 プラスミ ド、 コスミ ド、 Y A C等のベクタ一に組み込ま れていてもよく、 単一または複数の外来染色体あるいはその断片はミクロセルに 含まれていてもよい。 移入させる単一または複数の外来染色体あるいはその断片 は、 分化多能性を保持する細胞において破壊されている内因性遺伝子と同じまた は相同の遺伝子を含むものであるとよいが、 特に限定されるものではない。 本明 細書において、 「相同の遺伝子」 とは、 生物種間または種内において、 同種また は近似の性質を持つタンパク質をコードする遺伝子をいうものとする。
さらに、 本発明は、 キメラ非ヒ ト動物を作製するための、 前記の分化多能性を 保持する細胞の利用方法を提供する。
さらにまた、 本発明は、 単一または複数の外来染色体あるいはその断片を含む ミ クロセルを作製し、 該ミ クロセルとの融合により、 前記の少なく とも 2種の内 因性遺伝子が破壊されている分化多能性を保持する細胞へ前記単一または複数の 外来染色体あるいはその断片を移入させることを特徴とする、 単一または複数の 外来染色体あるいはその断片を含む分化多能性を保持する細胞の作製方法、 およ び単一または複数の外来染色体あるいはその断片を含むミ クロセルを作製し、 該 ミ クロセルとの融合により、 前記の少なく とも 2種の内因性遺伝子が破壊されて いる分化多能性を保持する細胞へ前記単一または複数の外来染色体あるいはその 断片を移入させることを特徴とする、 キメラ非ヒ 卜動物の作製法を提供する。 単 一または複数の外来染色体あるいはその断片は 1 M b (百万塩基） を超える大き さを有するものであってもよい。 外来染色体あるいはその断片は抗体をコー ドす る領域を含むものであってもよい。 単一または複数の外来染色体あるいはその断 片を含むミ クロセルは、 単一または複数の外来染色体あるいはその断片を含む細 胞とミ クロセル形成能の高い細胞とを融合させて作製されたハイプリ ッ ド細胞か ら誘導されてもよい。 また、 単一または複数の外来染色体あるいはその断片を含 むミクロセルは、 前記ハイプリ ッ ド細胞から誘導されたミ クロセルをさらにミク ロセル形成能の高い細胞と融合させて作製された細胞から誘導されたものであつ てもよい。 単一または複数の外来染色体あるいはその断片を含む細胞はヒ 卜正常 2倍体細胞であってもよい。 ミクロセル形成能の高い細胞はマウス A 9細胞であ つてもよい。 上記のキメラ非ヒ ト動物の作製法においては、 少なく とも 2種の内 因性遺伝子が破壊されている分化多能性を保持する細胞に、 該細胞において破壊 されている内因性遺伝子と同じあるいは相同の遺伝子を含む外来染色体あるいは その断片を移入した後、 該細胞と前記内因性遺伝子と同じあるいは相同の遺伝子 が欠損している系統の非ヒ ト動物の胚とのキメラを作製してもよい。 少なく とも 2種の内因性遺伝子が破壊されている分化多能性を保持する細胞において破壊さ れている内因性遺伝子と同じあるいは相同の遺伝子が欠損している系統の非ヒ ト 動物は、 標的遺伝子相同組み換え法により作製されたものであってもよい。 キメ ラ非ヒ ト動物は、 単一または複数の外来染色体あるいはその断片を保持し、 該外 来染色体あるいはその断片上の遺伝子を発現し、 該外来染色体あるいはその断片 を子孫に伝達可能なものであるとよい。 キメラ非ヒ ト動物は哺乳動物であるとよ く、 より好ましくは、 マウスである。 また、 本発明は、 単一または複数の外来染色体あるいはその断片を含むミ クロ セルを作製し、 該ミ クロセルとの融合により、 前記の少なく とも 2種の内因性遺 伝子が破壊されている分化多能性を保持する細胞へ前記単一または複数の外来染 色体あるいはその断片を移人させることを特徴とする、 キメラ非ヒ ト動物の作製 法により作製することができ、 単一または複数の外来染色体あるいはその断片を 含む分化多能性を保持する細胞を提供する。 本発明は、 さらに、 キメラ非ヒ 卜動 物を作製するための上記細胞の利用方法も提供する。
本発明は、 上記のキメラ非ヒ ト動物の作製法により作製することができ、 単一 または複数の外来染色体あるいはその断片を保持し、 該外来染色体あるいはその 断片上の遺伝子を発現するキメラ非ヒ ト動物、 または、 前記の単一もしくは複数 の外来染色体あるいはその断片を保持し、 該外来染色体あるいはその断片上の遺 伝子を発現するその子孫を提供する。 また、 本発明は、 上記のキメラ非ヒ 卜動物 またはその子孫の交配により得られる単一または複数の外来染色体あるいはその 断片を保持し、 該外来染色体あるいはその断片上の遺伝子を発現する非ヒ 卜動物 、 または、 単一もしくは複数の外来染色体あるいはその断片を保持し、 該外来染 色体あるいはその断片上の遺伝子を発現するその子孫を提供する。 さらに、 本発 明は、 上記のキメラ非ヒ 卜動物もしくはその子孫または非ヒ 卜動物もしくはその 子孫に由来する組織および細胞を提供する。 この細胞は B細胞であってもよい。 また、 本発明は、 上記のキメラ非ヒ ト動物もしくはその子孫または非ヒ ト動物 もしくはその子孫に由来する細胞とミエローマ細胞との融合により作製されたハ イブリ ドーマを提供する。
本発明は、 単一または複数の外来染色体あるいはその断片を保持し、 該外来染 色体あるいはその断片上の遺伝子を発現する上記のキメラ非ヒ 卜動物もしくはそ の子孫または上記の非ヒ 卜動物もしくはその子孫を、 該遺伝子と同じあるいは相 同の遺伝子が欠損している系統の非ヒ 卜動物と交配させることにより作製された 非ヒ ト動物、 または、 前記の単一もしくは複数の外来染色体あるいはその断片を 保持し、 該外来染色体あるいはその断片上の遺伝子を発現するその子孫を提供す る。 さらに、 本発明は、 上記のキメラ非ヒ 卜動物もしくはその子孫または非ヒ ト動 物もしくはその子孫の個体、 組織または細胞において、 単一または複数の外来染 色体あるいはその断片上の遺伝子を発現させ、 その産物としての生物学的に活性 な物質を回収するこ.とを特徴とする、 生物学的に活性な物質の製造法を提供する 。 上記のキヌラ非ヒ ト動物もしくはその子孫または非ヒ ト動物もしくはその子孫 の細胞は B細胞であってもよい。 B細胞はミエローマ細胞と融合して、 不死化さ れていてもよい。 生物学的に活性な物質は抗体であってもよく、 抗体は哺乳動物 の抗体であるとよく、 より好ましくは、 ヒ ト抗体である。
さらにまた、 本発明は、 上記の単一または複数の外来染色体あるいはその断片 を保持し、 該外来染色体あるいはその断片上の遺伝子を発現するキメラ非ヒ ト動 物もしくはその子孫または非ヒ 卜動物もしくはその子孫を、 該遺伝子と同じある いは相同の遺伝子が欠損している系統の非ヒ 卜動物と交配させ、 誕生した子動物 の個体、 組織または細胞において、 前記の単一または複数の外来染色体あるいは その断片上の遺伝子を発現させ、 その産物としての生物学的に活性な物質を回収 することを特徴とする、 生物学的に活性な物質の製造法を提供する。
本発明はまた、 外来染色体からなる非ヒ ト動物及び非ヒ ト動物細胞への遺伝子 導入用ベクターを提供する。 外来染色体は、 好ましくはヒ トに由来するものであ り、 より好ましくはヒ ト 1 4番染色体断片である。 非ヒ 卜動物は、 好ましくはマ ゥスである。
本明細書においては、 対立遺伝子 （al l el e) を以下 「アレル」 ということとす る。
また、 本明細書において、 「相同の遺伝子」 とは、 生物種間または種内におい て、 同種または近似の性質を持つタンパク質をコ一ドする遺伝子をいうものとす る 図面の簡単な説明
図 1は、 ヒ ト 2番染色体 （断片） を保持する A9細胞の解析 （PCR解析） の結果 が示されている。
図 2は、 E14耐性株においてヒ ト 22番染色体 （断片） が保持されていることが る （PCR解析） 。
図 3は、 22番染色体導入 ES細胞由来キメラマウスにおいてヒ ト L1配列が保持さ れていることを示す電気泳動写真である （サザン解析） 。
図 4は、 ヒ ト 22番染色体導入キメラ'マウス臓器におけるヒ 卜染色体の保持の様 子を示す電気泳動写真である （PCR解析） 。
図 5は、 ヒ ト 22番染色体導入キメラマウスにおけるヒ ト遺伝子発現 （RT- PCR) の 結果を示す電気泳動写真である。
図 6は、 ヒ 卜 22番染色体導入キメラマウス臓器におけるヒ ト遺伝子発現 （RT - P CR) の結果を示す電気泳動写真である。
図 7は、 E14耐性株においてヒ 卜 4番染色体 （断片） が保持されていることが 示されている （PCR解析） 。
図 8は、 ヒ 卜 4番染色体導入 E14細胞株におけるヒ ト L1配列の検出 （サザン解 析） の結果を示す電気泳動写真である。
図 9は、 ヒ ト 4番染色体導入 ES細胞由来キメラマウスにおいてヒ 卜 L1配列が保 持されていることを示す電気泳動写真である （サザン解析） 。
図 10は、 TT2耐性株においてヒ 卜 14番染色体 （断片） が保持されていることが 示されている （PCR解析） 。
図 11は、 ヒ ト 14番染色体導入 ES細胞由来キメラマウス臓器におけるヒ ト染色体 の保持の様子を示す電気泳動写真である （PCR解析） 。
図 12は、 尻尾由来繊維芽細胞 G418耐性テス卜の結果が示されている。
図 13は、 ヒ ト血清アルブミ ン免疫キメラマウス血清中のヒ 卜抗体 I gM濃度 （EL I SA) が示されている。
図 14は、 ヒ ト血清アルブミ ン免疫キメラマウス血清中のヒ 卜抗体 I gG濃度 （EL I SA) が示されている。
図 15は、 ヒ ト I gM産生ハイプリ ドーマクローン H4B7の解析 （EL ISA) の結果が 示されている。
図 16は、 ヒ 卜 2番染色体部分断片及び 14番染色体部分断片を保持するマウス ES 細胞株 （TT2細胞株 PG15) の FI SH解析の結果を示す染色体の形態の写真である。 図 17は、 ヒ ト血清アルブミ ン免疫キメラマウス血清中の抗ヒ ト血清アルブミ ン ヒ ト i gG抗体価の増加が示されている。
図 18は、 ヒ 卜血清アルブミ ン免疫キメラマウス血清中の抗ヒ 卜血清アルブミ ン ヒ ト I g / 抗体価の増加が示されている。
図 19は、 ヒ ト 22番染色体導入 TT2細胞株におけるヒ ト L1配列の検出 （サザン解 析） の結果を示す電気泳動写真である。
図 20は、 ヒ 卜血清アルブミ ン免疫キメラマウス血清中の抗ヒ 卜血清アルブミ ン ヒ ト i g A抗体価の増加が示されている。
図 21は、 ヒ ト 2番染色体部分断片導入キメラマウスの子孫においてヒ 卜 2番染 色体部分断片が保持されていることが示されている写真である （PCR解析） 。 図 22は、 ヒ ト 14番染色体導人キメラマウス脾臓において細胞表面にヒ ト 鎖力く 発現している細胞の存在を示している （フローサイ トメ トリ一解析） 。
図 23は、 pLoxP- STneo プラスミ ド DNA の構造を示している。
図 24は、 マウス抗体重鎖 C zのゲノム DNAの構造を示している。
図 25は、 マウス抗体軽鎖/ のゲノム DNAの構造を示している。
図 26は、 マウス抗体重鎖 C ターゲッティ ングベクターと形質転換体 TT2F細胞 ゲノム DNA のサザンブロッ 卜に使用するプローブと相同組換え体で検出される DN A断片について示している。
図 27は、 マウス抗体軽鎖 ターゲッティ ングベクタ一と形質転換体 TT2F細胞ゲ ノム DNA のサザンブロッ 卜に使用するプローブと相同組換え体で検出される DNA 断片について示している。
図 28は、 マウス抗体重鎖相同組換え体及び相同組換え体由来高濃度 G418耐性株 のサザン解析の結果を示す電気泳動写真である。
図 29は、 マウス抗体軽鎖相同組換え体のサザン解析の結果を示す電気泳動写真 C、あ <o。
図 30は、 pLoxP- PGKPuro プラスミ ド DNA の構造を示している。
図 31は、 マウス抗体軽鎖/ cターゲッティ ングベクタ一と形質転換体 TT2F細胞ゲ ノム DNA のサザンブロッ 卜に使用するプローブと相同組換え体で検出されるべき
DNA断片について示している。
図 32は、 マウス抗体軽鎖相同組換え体由来高濃度 G418耐性株のサザン解析の結 果を示す電気泳動写真である。
図 33は、 HSA免疫キメラマウス血清中の抗 HSAヒ ト I gH抗体価の増加を示して いる。
図 34は、 ヒ ト 14番染色体断片及び、 ヒ ト 2番染色体断片を保持する抗体重鎖、 抗体軽鎖欠損マウス ES細胞の F ISH解析の結果を示す写真である。
図 35は、 HSA免疫キメラマウス血清中の抗 HSAヒ 卜 i g抗体価の増加を示してい る。
図 36は、 ヒ ト 14番染色体断片を含むマウス A9細胞の F I SH解析 （ヒ トセン トロメ ァ配列プローブ） の結果を示す写真である。
図 37は、 ヒ ト 14番染色体断片を含むマウス A9細胞の F I SH解析 （ヒ ト染色体特異 的プローブ） の結果を示す写真である。
図 38は、 ヒ ト染色体断片 （14番： SC20、 2番： W23)のマウス ES細胞における安 定性テス 卜の結果を示している。
図 39は、 ヒ ト 14番染色体断片のマウス個体における安定性解析の結果を示して いる。
図 40は、 ヒ ト 22番染色体 （断片） を保持する G418耐性雑種細胞の PCR解析の結 果を示している。
図 41は、 断片化ヒ ト 22番染色体を保持する A9細胞の F I SH解析の結果を示す写真 である。
図 42は、 交配により確立された完全なヒ ト抗体を産生するマウス系統の解析結 果を示している。
図 43は、 ヒ ト 2番染色体断片 W23を保持するマウス血清中のヒ 卜抗体/ c鎖濃度 測定の結果を示している。
図 44は、 血清マウス / c鎖、 λ鎖濃度測定の結果を示している。
図 45は、 pBS-TEL/L IFPuro の構造を示す。
図 46は、 DT40細胞株におけるヒ 卜 22番染色体の保持を示す。
図 47は、 L I F遺伝子座における相同組み換え体の同定を示す。
図 48は、 DT40/ii22neo細胞株におけるヒ ト 22番染色体の断片化を示す。
図 49は、 全長及び断片化ヒ ト 22番染色体を保有する DT40細胞株を示す写真であ る' 発明を実施するための最良の形態
ヒ 卜染色体またはその断片を保持し、 該染色体またはその断片上の遺伝子を発 現するマウス個体は、
( 1) 標識されたヒ ト染色体またはその断片を保持する染色体供与細胞の作製
(2) 分化多能性を保持するマウス細胞へのミ クロセル法によるヒ 卜染色体また はその断片の移入
(3) 上記マウス細胞を用いたキメラマウスの作製
(4) キメラマウスにおけるヒ ト染色体保持及び、 ヒ ト遺伝子発現確認
の過程を経ることにより得ることができる。 なお、 ここでは、 ヒ ト染色体または その断片を保持し、 該染色体またはその断片上の遺伝子を発現する非ヒ ト動物と して、 マウスを例にとった （以下、 このマウスを 「ヒ ト染色体導入マウス」 と称 する。 ） 。
ここでヒ ト染色体とは、 ヒ ト細胞由来の天然の DNAと蛋白質の複合体のことを 指す。 正常なヒ ト染色体は 23種 （雄は 24種） 46本存在し、 それぞれ約 50〜300Mb の長さの DNAを含むとされるが、 本発明においては独立染色体として安定に複製 、 分配が可能な部分断片、 およびマウス染色体上に転座し、 安定に保持されてい る部分断片も含まれる。 その DNAの大きさは通常 1Mb以上だが、 それ以下の場合 もある。 本発明の特徴は大腸菌、 酵母等でのクローニングあるいは細胞からの DN A抽出処理等を行なわず、 染色体そのものを媒体としてマウス個体でヒ ト遺伝子 を保持、 発現させることにある。
また、 ヒ 卜染色体導入マウスとは、 その正常体細胞の全てまたは一部において 、 単一あるいは複数のヒ ト染色体あるいはその断片を保持するものを指す。 さら には、 その正常体細胞の全てまたは一部において、 ヒ ト染色体上の単一あるいは 複数のヒ ト遺伝子を発現しているものを指す。
(1) 標識されたヒ ト染色体またはその断片を保持する染色体供与細胞の作製 染色体供与細胞としては、 1) 受容細胞で選別可能なマーカーで標識されたヒ ト染色体を保持し、 2) それ以外のヒ 卜染色体を含まない、 3 ) ミ クロセル形成 能が高い細胞、 が望ましい。
ヒ 卜染色体提供の材料としては、 ヒ ト由来のあらゆる細胞株、 癌細胞、 初代培 養細胞を用いることが出来るが、 染色体の欠失、 増幅等の異常の可能性が低く、 また培養が容易な点.を考慮すると正常繊維芽細胞が適している。
まず 1) について、 ヒ ト細胞は薬剤 （G418, ピューロマイシン，ノヽィグロマイ シン， ブラス トサイジン） 耐性等のマーカー遺伝子を発現するべクタ一により形 質転換することができる。 ここで用いるマーカー発現制御のためのプロモーダ一 としては、 ヒ ト細胞のみならず、 マウス ES細胞のような受容細胞で効率よく働く ものが望ましい。 この目的には SV40ェンハンサ一と単純へルぺスウィルスチミ ジ ンキナーゼプロモーターの連結したもの （Katohら， Cell Struct. Funct. , 12:5 75, 1987) 、 マウス PGK- 1プロモータ一 （Sorianoら， Cell, 64:693, 1991) 等を用いることが出来る。 エレク トロボレ一シヨ ン （石田ら， 細胞工学実験操作 入門， 講談社， 1992) 等による形質転換を実施し、 選択することにより、 導入さ れたマーカー遺伝子が、 23種 46本あるヒ 卜染色体上にランダムに挿入されたよう なヒ ト細胞形質転換体のライブラリーを得ることが出来る。
3) については、 多くのヒ ト正常細胞がミ クロセル形成能が非常に低いので、 上記の形質転換体をミクロセル形成能の高い細胞例えば、 マウス A9細胞 （Oshimu ra, M. , Environ. Health Perspect. , 93:57, 1991) と全細胞融合することにより 、 形成能を付与することが出来る。 マウスーヒ ト雑種細胞では、 ヒ 卜染色体が選 択的に消失することが知られているが、 ここで得られた融合株は、 先述のマーカ —で選択することにより、 マ一キングされたヒ ト染色体を安定に保持することが 出米る。
さらに、 2) の条件を満たすために、 この細胞融合株からミクロセルを取得し
、 マウス A9細胞と再度融合することが望ましい。 この場合も、 ヒ ト染色体上のマ
—カーで選択することにより、 得られるミクロセル融合株の多くは、 1) 、 2)
、 3) の条件を満たしたものであると考えられる。 マーキングされたヒ 卜染色体 の同定は、 最終段階で得られるマウス—ヒ トモノクロモソ一ム雑種細胞において
、 PCR (ポリメラーゼチヱイ ンリアクショ ン、 Saikiら， Science, 239:487, 19
88) 、 サケンブロッ ト解析 (Ausubelら， Current protocols in molecular bio
2 l l ogy, John W i l ey Sons, I nc. , 1994) 、 F I SH (フルォレツセンスイ ンサイチ ュ一ハイブリダィゼーシヨ ン、 Lawrenceら， Ce l l , 52 : 51, 1988) 解析等により 調べることが出来る。 ある特定の染色体導入を望む場合には、 多くのヒ ト細胞形 質転換体クローンに—ついて、 それぞれ上記の過程を繰り返して、 目的染色体がマ 一キングされたものを探す。 あるいは、 ヒ ト細胞形質転換体クローンの混合物に ついて上記の過程を実施し、 得られる多数のマウスーヒ 卜モノクロモソ一厶雑種 細胞についてヒ ト染色体の同定を行なうことが可能である。
さらに、 導入を望む染色体上の DNA配列を標的とした相同組換え（Thomas ら， Ce l l , 51 : 503, 1987) により、 特定の部位にマ一力一遺伝子を揷入することも 可能である。
マウスーヒ ト雑種細胞から調製したミ クロセルにガンマ線照射することにより 、 マ一キングされたヒ ト染色体を断片化してマウス A9細胞に導入することも出来 る。 また、 ミ ク ロセルにガンマ線照射しない場合でも、 ある割合で部分断片化し たヒ ト染色体が移人されることがある。 これらの場合、 得られるミ クロセル融合 株は、 マ一キングされたヒ ト染色体の部分断片を保持している。 これらは、 受容 細胞に染色体部分断片を導入したい場合に用いることができる。
E S細胞に導入されるヒ ト染色体には欠失、 転座、 置換等の改変を施しうる。 これらは具体的には以下の方法で達成される。
1 ) 上記に既述のマウスーヒ ト雑種細胞の作製、 マウス—ヒ ト雑種細胞からのミ クロセル誘導、 該ミクロセルとマウス A 9細胞の再融合、 該再融合細胞からのミ クロセル誘導、 該ミクロセルとマウス E S細胞の融合の各過程において、 ヒ 卜染 色体の欠失、 転座が起こる場合がある。 これらの変異染色体を保持する細胞を、 染色体の顕微鏡観察、 P C R、 サザン解析等により適宜選抜する。 種々のヒ ト染 色体を保持するマウス A 9細胞ライブラリから所望の変異染色体を保持するクロ ーンを選抜することも可能であり、 特定のヒ ト染色体を保持するマウス A 9細胞 からミ クロセルを誘導し、 A 9細胞あるいは E S細胞に融合したもののなかから 所望の変異染色体を保持するクローンを選抜することも可能である。 また、 染色 体の断片化はガンマ線照射によりその発生頻度をあげることができる （Ko iら、 Sc i ence, 260 : 361 , 1993) 。 2 ) ヒ ト染色体を保持する細胞において、 C r e酵素の認識配列である 1 0 X p 配列を保持するターゲティ ングベクターを構築し、 相同組換えにより染色体上の 所望の位置に 1 0 X p配列の挿入されたクローンを取得の後、 C r e酵素を細胞 内で発現させること.により、 部位特異的組換えにより染色体の欠失 ·転座等の変 異体を得る。 W097/49804および Smithら、 Nature Genetics, 9:376, 1995を参 照のこと。 また、 ターゲティ ングベクタ一の導入に際しての宿主細胞として、 D T 4 0細胞 （Diekenら、 Nature Genetics, 12:174, 1996 ) のような相同組換え 頻度の高い細胞を用いることもできる。
3 ) ヒ 卜染色体を保持する細胞において、 ヒ トテロメァ配列を保持するターゲテ ィ ングべクタ一を構築し、 相同組換えにより染色体上の所望の位置にテロメァ配 列の挿入されたクローンを取得の後、 テロメァ ' トランケ一シヨンによる欠失変 異体を得る。 Itzhakiら、 ature Genet., 2, 283-287, 1992;及び Brownら、 P.
N. A. S.， 93:7125, 1996を参照のこと。 また、 タ一ゲティ ングベクターの導入 に際しての宿主細胞として、 DT 4 0細胞 （ Diekenら、 前記） のような相同組 換え頻度の高い細胞を用いることもできる。 DT 4 0細胞におけるヒ ト染色体の テロメァ ' トランケ一シヨンは本発明において初めて開示された。 前記 Brownら の開示はべクタ一の揷入が染色体上のリ ピート配列に対するものであり、 特定の 位置をターゲッ トできるものではない。 Itzhakiらの開示によれば、 ヒ トテロメ ァ配列を導人した腫瘍細胞の一種である HT 1 0 8 0細胞株を 1 1 0 0 0株に渡 つて解析した結果 8個の相同組換え体を取得し、 そのうちわずか 1株においてテ ロメァ配列による欠失を見出したに過ぎない。 また、 細胞によってはテロメァ配 列が揷人されても トランケーション体が全く得られないという結果も報告されて いるが （Barnettら、 Nucleic Acids Res. , 21:27, 1993) 、 発明者らはトラ ン ケ一ション体を得るためにはともかく も相同組換え体の絶対数を増やすことが必 要と考え、 DT 4 0細胞を宿主としたテロメァ · トランケ一ションを試みた。 そ の結果、 予想外のことに取得された 8個の相同組換え体のすべてにおいて、 トラ ンケ一ションが起こっていることを見出した。
以上に開示された導入染色体の改変により、 ヒ ト染色体導人マウスにおいて発 現させたくない遺伝子を排除することができる。 また、 導入される染色体のサイ ズの縮小化により、 導入される染色体断片をヒ ト染色体導入マウスの子孫に伝達 することが可能となる。 さらに、 染色体の転座、 置換により、 複数の染色体由来 の遺伝子を同一の染色体断片上において発現させること、 染色体断片上の複数の 遺伝子の一部を異なる遺伝子に置き換えること、 すなわち、 外来染色体断片をマ ウス個体及びマウス細胞への遺伝子導入用のベクターとして用いることが可能と なる。
(2) 分化多能性を保持するマウス細胞へのヒ ト染色体またはその断片の移人 . これまでに、 種々の系統のマウス由来の胚性癌腫細胞 （EC細胞、 Hanaokaら，
D i f f eren t i a t i on, 48 : 83, 1991 ) 、 胚性幹細胞 （ES細胞、 Evansら， Nature,
292 : 154, 1981 ) 、 胚性生殖細胞 ( EG細胞、 Ma tsu iら， Ce l l , 70 : 841, 1992) が マウス初期胚に注入あるいは共培養することによりその正常体細胞に寄与する、 すなわちキメラマウス作製可能であることが報告されている。 ES、 EG細胞はその 能力が特に高く、 多くの場合生殖細胞にも寄与し、 その細胞由来の子孫を作るこ とができる。 EC細胞は主に生殖細胞癌から、 ES細胞は胚盤胞の内部細胞塊から、
EG細胞は発生初期に出現する始原生殖細胞から得られる。 本発明におけるヒ 卜染 色体移人の受容細胞としてはこれらの細胞株及びその変異株、 さらにはマウス個 体において全て、 あるいは一部の正常体細胞に分化可能なあらゆる未分化細胞を 用いることができる。 これらの受容細胞は、 キメラマウス、 キメラマウス由来の 組織あるいは細胞において、 導入されるヒ ト遺伝子の発現を好適なものとするた め、 導人されるヒ ト遺伝子に相同なマウス遺伝子等の、 単一あるいは複数の遺伝 子を標的遺伝子相同組換え法 （Joynerら， Gene Targe t i ng, 1993, I RL PRESS)等 の方法を用いて破壊することも可能である。
受容細胞へのヒ 卜染色体移入の材料としては （1) で得られたヒ ト染色体供与 細胞から調製されるミクロセルあるいはガンマ線照射したミクロセルを用いるこ とができる。 受容細胞への移人はく清水素行， 細胞工学ハンドブック， 羊土社，
1992>等に記された方法で受容細胞とミクロセルを融合することにより行なう。 ミクロセル供与細胞においてはあるヒ ト染色体またはその断片が受容細胞におい て選別可能なマーカーを保持している。 この中から、 （1) と同様 PCR、 サザン ブロッ ト解析、 FISH解析等により、 導入を目的とする遺伝子あるいは染色体ある いはその断片を保持する株を選択すれば、 あらゆるヒ ト染色体、 あるいはその断 片を導入することが可能である。 また、 異なる選択マーカ一を保持する複数の染 色体、 あるいはその断片を逐次導入することにより、 これらを同時に保持する受 容細胞を得ることも-できる。 さらに、 すでにあるヒ ト染色体を導入した細胞株の 中から、 導入染色体数が増加したものを選抜することも可能である。 これは通常 、 培養液中に添加する選択薬剤の濃度を高めることにより達成される。
ヒ ト染色体上のマーカー （G418耐性等） により選抜された受容細胞が、 供与細 胞の保持していたヒ ト染色体の全部あるいは一部を保持していることは、 以下の ようにして確認される。 選抜された受容細胞から抽出したゲノム DNAを用い、 ブ ローブとしてヒ ト特異的繰り返し配列 （Ll、 Alu等、 Korenbergら， Cell, 53:3 91， 1988) 、 ヒ 卜遺伝子等を用いたサザン解析により検出される。 また、 ヒ ト 遺伝子特異的プライマ一による PCR法、 及びヒ 卜染色体特異的プローブ （Lichte rら， Human Genetics, 80:224, 1988) を用いたフルォレツセンスイ ンサイチュ 一ハイブリダィゼ一シヨン （FISH) 等の染色体解析により確認することができる
(3) ヒ ト染色体導入 ES細胞からのキメラマウス作製
(2) で得られた ES細胞株からのキメラマウス作製は、 く 相沢慎一， バイオマ ニュアルシリーズ 8 ジーンタ一ゲティ ング， 羊土社， 1995>等に記された方法 で行なう。 効率的なキメラマウス作製を行なうための宿主胚の発生時期、 系統等 の選択については、 それぞれの ES細胞株につし、てすでに検討された条件を用 、る ことが望ましい。 例えば、 CBAXC57BL/6 F1 由来の TT2細胞 （野生色、 Yagiら ， Analytical Biochemistry, 214:70， 1993) については Balb/c (白色、 日本 クレア社） あるいは ICR (白色、 日本クレア社） 由来の 8細胞期胚を宿主胚とし て用いるのが望ましい。
(4) キメラマウスにおけるヒ 卜染色体の保持及びヒ ト遺伝子発現
ES細胞株を注入した胚から誕生したマウスにおける ES細胞の貢献率は、 その毛 色によりおおまかに判定することができる。 但し、 毛色に全く貢献が見られない からといって他の組織で貢献がないとは断定できない。 より詳細な、 キメラマウ ス各組織におけるヒ ト染色体の保持は各組織より抽出されたゲノム DNAを用いた サザン解析、 PCR等によって確認することができる。
導入ヒ 卜染色体上の遺伝子発現は以下のようにして確認される。 ヒ 卜染色体由 来 mRNAの発現は各組織由来 RNAを用いた RT- PCR法 （Kawasak iら， P. N. A. S. , 85 : 5 698, 1988) 、 ノーザンブロッ 卜法 （Ausube lら， 前記） により検出される。 蛋 白質レベルの発現は、 マウスの相同蛋白質との交差反応性を最小にした抗ヒ ト蛋 白質抗体による酵素免疫測定法 （EL !SA、 富山 ·安東， 単クローン抗体実験マ二 ュアル， 講談社サイェンティフイ ク， 1987 ; 石川， 超高感度酵素免疫測定法， 学 会出版センタ一， 1993) 、 ウェスタンブロッ 卜法 （Ausube lら， 前記） あるいは 、 電気泳動度の違いを利用したアイソザィム分析 （Κο ί ら， Jpn. J. Cancer Res .， 80 : 413, 1989)等により検出される。 さらに、 キメラマウス細胞中でのヒ ト染 色体の保持及び該染色体上の遺伝子の発現が、 キメラマウス由来初代培養細胞で の薬剤耐性マーカー遺伝子発現による耐性細胞の出現より確認できる。
例えば、 ヒ ト免疫グロプリ ン重鎖の存在するヒ ト 14番染色体を保持する ES細胞 から作製されたキメラマウスについて、 キメラマウス血清中のヒ ト I gM、 I gG、 I gA等をマウス抗体との交差反応性を最小にした抗ヒ 卜 i g抗体による酵素免疫測 定法により検出することができる。 また、 このキメラマウスをヒ ト由来抗原 （例 えばヒ ト血清アルブミ ン） により免疫し、 その脾臓細胞とマウスミエ口一マを融 合することにより得られる、 ハイプリ ドーマ （安東 ·千葉， 単クローン抗体実験 操作入門， 講談社サイェンティフイ ク， 1991) を EL I SAによりスクリーニングす ることにより、 ヒ ト免疫グロブリ ン重鎖を産生するハイプリ ドーマを得ることが できる。
以上、 マウスを例にとり、 ヒ ト染色体またはその断片を保持し、 該染色体また はその断片上の遺伝子を発現するキメラ非ヒ 卜動物の作製法を説明したが、 本発 明において、 キメラ非ヒ ト動物へ移入される染色体またはその断片は、 ヒ ト由来 のものに限られず、 広く外来染色体またはその断片を移入し、 該染色体またはそ の断片上の遺伝子を発現させることが可能である。 ここで、 「外来染色体」 とは、 分化多能性を保持する細胞へ移入され、 キメラ非ヒ ト動物において、 該染色体ま たはその断片上の遺伝子が発現することを特徴とするものであり、 その由来とす る生物種は特に限定されるものではない。 また、 本発明の方法により、 キメラマ ウスのみならず、 他のキメラ動物、 例えば、 ラッ ト、 ブタ等の哺乳類その他のキ メラ動物も作製することができる。 マウス以外の動物種における ES細胞あるいは ES様細胞の樹立はラッ ト （I annacconeら， Dev. B i o l . , 163, 288-, 1994) 、 ブ 夕 （Whee l er ら， Reprod. Fer t i 1. Dev.， 6， 563-, 1994) 、 ゥシ （S imsら， Pr o a t l . Acad. Sc i . USA, 91， 6143-6147, 1994) において報告され、 さらに メダカ、 ニヮ トリ等でも試みられている （トランスジヱニック動物， 蛋白質核酸 酵素， 1995年 10月号増刊， 共立出版） 。 また、 ヒッジにおいては ES様細胞 （ED細 胞） さらにはそれを 10代以上継代して得られる上皮様細胞由来の核を移植された 未受精卵が正常に発生することが知られている （Campbe l lら， Na t ure, 380, 64- . 1996) 。 これら ESあるいは ES様細胞を受容細胞とした外来染色体移入によって マウスの場合と同様に外来染色体あるいはその断片を保持し、 該染色体またはそ の断片上の遺伝子を発現するキメラ非ヒ 卜動物が作製可能である。
また、 本発明において、 外来染色体あるいはその断片が移人される、 分化多能 性を保持する細胞は、 前述の E S細胞、 E C細胞、 E G細胞に限られるものでは ない。 例えば、 骨髄幹細胞に外来染色体あるいはその断片を移人することが可能 であり、 該骨髄幹細胞の生体への移植により、 遺伝病等の治療を行うことが可能 である。
キメラ非ヒ ト動物において、 外来染色体を保持する ES細胞がその生殖細胞に分 化した場合、 生殖により得られる子孫にも導入染色体または断片が認められ、 そ の子孫は導入された染色体または断片上の遺伝子を発現する。
上記のようにして得られるキメラ非ヒ ト動物またはその子孫を利用して、 外来 染色体またはその断片上の遺伝子を発現させ、 その産物を回収することにより、 生物学的に活性な物質を製造することができる。 具体的には、 キメラ非ヒ ト動物 またはその子孫の個体を外来染色体またはその断片上の遺伝子を発現しうる条件 下で飼育し、 その後発現産物を動物の血液、 腹水などから回収することができる c あるいはまた、 キメラ非ヒ ト動物またはその子孫の組織、 細胞あるいはそれを不 死化したもの （例えば、 ミエローマ細胞との融合により不死化したハイプリ ドー マ） などを外来染色体またはその断片上の遺伝子を発現しうる条件下で培養し、 その後発現産物を培養物から回収することができる。 さらには、 これらキメラ非 ヒ ト動物またはその子孫の組織、 細胞、 あるいはそれを不死化したものから抽出 した外来染色体あるいはその断片、 または外来染色体またはその断片を構成する
DNA、 さらにはまた、 キメラ非ヒ ト動物またはその子孫の組織、 細胞、 あるい はそれを不死化したものに保持された外来染色体あるいはその断片に由来する c DN Aを動物細胞あるいは昆虫細胞 （例えば、 CHO細胞、 BHK細胞、 肝ガン 細胞、 ミエローマ細胞、 S F 9細胞等） に導入し、 該細胞を外来染色体またはそ の断片上の遺伝子を発現しうる条件下で培養し、 その後発現産物 （例えば、 特定 の抗原特異的な抗体蛋白質等） を培養物から回収することができる。 発現産物は 遠心分離などの公知の方法に従って回収することができ、 さらに、 硫安分画、 分 配クロマトグラフィー、 ゲル濾過クロマトグラフィー、 吸着クロマトグラフィー、 分取薄層クロマ トグラフィ一などの公知の方法に従って精製することができる。 生物学的に活性な物質は、 外来染色体上にコードされているあらゆる物質を含み、 例えば、 抗体、 特にヒ ト抗体などを挙げることができる。 例えば、 得られたキメ ラ動物の脾細胞あるいはそのハイプリ ドーマなどの不死化細胞から該染色体上の ヒ 卜抗体遺伝子をクローニングし、 チャイニーズハムスター卵巣細胞 （CHO) やミエローマ細胞に導入してヒ ト抗体を生産することができる （Lynette ら， Bi otechnology, 10， 1121-, 1992; Bebbingtonら, Biotechnology, 10， 169-, 199 2)。
本発明により得られるヒ ト 2番、 14番、 22番染色体 （断片） を保持するキメラ マウス及びその子孫は、 ヒ ト抗体重鎖 （14番染色体上） 、 軽鎖/ c (2番染色体上） 軽鎖 I (22番染色体上） それぞれの遺伝子の機能的配列の大部分を保持し得る。 すなわち、 酵母人工染色体等を用いてヒ 卜抗体遺伝子の一部を導入した既知の卜 ランスジエニックマウス （Greenら， Nature Genetics, 7， 13-, 1994， Lonberg ら， Nature, 368, 856-, 1994等） と比較して、 ヒ トにおいて観察されるものに より近い、 非常に多様なヒ ト抗体レパートリーを発現することが可能である。 ま た、 本発明により得られる 2番 +14番、 22番 +14番等の染色体 （断片） を同時に 保持するキメラマウス及びその子孫、 並びに、 それらを交配することにより得ら れる 2番 +14番 +22番等の染色体 （断片） を同時に保持するマウス及びその子孫 は、 重鎖、 軽鎖の両者がヒ ト由来である完全なヒ ト抗体を産生することが可能で ある。 これらのマウスはヒ ト由来抗原に対してそれを異物とみなして免疫反応を 起こし、 抗原特異的ヒ ト抗体を産生することができる。 この性質は治療用のヒ ト モノクローナル抗体、 あるいはヒ トポリク口一ナル抗体を得るために非常に有用 である （Gr e enら、 前記、 し onbe rgら、 前記） 。 一方、 特定の抗原に対して親和 性の高いヒ ト抗体を得る効率を上げるためには、 マウス抗体を産生せず、 ヒ ト抗 体のみを産生するマウスを作成することが望まれる （G r eenら、 前記、 Lonbe rg ら、 前記） 。 本発明において、 これは典型的には以下の方法 Aあるいは Bにより 達成される。
方法 Α： マウス抗体欠損 ES細胞およびマウス抗体欠損キメラ宿主胚を用いる方法 方法 B： ヒ ト染色体導入キメラマウスよりヒ ト染色体を保持する子孫を得てマウ ス抗体遺伝子を欠損するマウス系統との交配を行う方法。
以下に A, Bそれぞれの方法の典型的な例について以下に具体的に記す。
方法 Aの具体的手順
1 . マウス ES細胞に 2コピー存在するマウス抗体重鎖遺伝子の片側のアレルを標 的遺伝子相同組み換え法 （J oynerら， Gene Targe t i ng, 1993, I RL PRESS) を用 いて破壊する。 遺伝子破壊箇所には後に部位特異的組換えにより除去可能な配列 、 例えば Ι οχΡ配列 （Creレコンビナ一ゼにより組み換え、 Saue rら、 前記、 他に FLPレコンビナ一ゼ- FRT配列を用いた 0' Go rmanら， S c i en c e, 251 , 1351 -, 1991 の例がある） にはさまれた G418耐性遺伝子等のマーカー遺伝子を揷人する。
2 . 抗体重鎖遺伝子の片側のァレルが破壊された上記薬剤耐性マウス ES細胞を高 濃度の薬剤存在下で培養し、 高濃度薬剤耐性となった株を選抜する。 これらの株 をスク リーニングすることにより抗体重鎖遺伝子の両側のァレルが破壊された株 が得られる （相沢慎一、 前記） 。 あるいは、 抗体重鎖遺伝子の片側のアレルが破 壊された上記薬剤耐性マウス ES細胞のもう一方の側のァレルの標的遺伝子も相同 組み換え法を用いて破壊する。 予め挿入されたマーカー遺伝子とは別のマーカー 遺伝子を使用することによって、 同様な操作を繰り返すことができる。 例えば、 G418耐性遺伝子を用いて相同組み換えを行つた後、 ピューロマイシン耐性遺伝子 を用いて相同組み換えを行い、 両側のァレルとも抗体重鎖遺伝子が破壊された株 を得る。 予め挿入されたマーカー遺伝子と同じマーカー遺伝子を使用する場合に は、 1 . で薬剤耐性遺伝子の両側に挿入した組み換え配列の間で、 部位特異的組 み換え反応を起こす酵素遺伝子を一時的に導入し、 標的遺伝子に挿入されていた 薬剤耐性遺伝子を除—去された薬剤感受性株を選抜する。 その後、 再度標的遺伝子 相同組み換え法によって、 マーカ一遺伝子を挿入し、 両側のアレルとも標的遺伝 子が破壊された株を得る （高津聖志ら、 実験医学別冊、 免疫研究の基礎技術、 P. 255-, 1995、 羊土社） 。
3 . 2 . で得られた抗体重鎖遺伝子の両側のアレルが破壊されたマウス ES細胞に 1 . で薬剤耐性遺伝子の両側に挿入した組換え配列の間で部位特異的組み換え反 応を起こす酵素遺伝子、 例えば Creレコンビナ一ゼ遺伝子 （Sauerら、 前記） を 一時的に導入し、 Ι οχΡ配列の間で組み換え反応が起こって両方の抗体重鎖遺伝子 に揷入された薬剤耐性遺伝子が除去された薬剤感受性株を選抜する （高津聖志ら 、 実験医学別冊、 免疫研究の基礎技術、 p255-、 1995、 羊土社） 。
4 . マウス抗体軽鎖/ c遺伝子について上記 1〜 3の過程を繰り返し、 最終的に抗 体重鎖及び / 鎖を完全に欠損した薬剤感受性株を取得する。
5 . 4の株 （抗体重鎖、 / 鎖欠損マウス ES細胞） を受容細胞としたミクロセル融 合により、 薬剤耐性マーカ一 （例えば G418耐性遺伝子） でマ一キングされたヒ ト 抗体重鎖遺伝子を含むヒ ト 14番染色体 （断片） を導入する。
6 . 5で得られた株を受容細胞としたミクロセル融合により、 5 とは異なる薬剤 耐性マーカ一 （例えばピューロマイシン耐性遺伝子） でマーキングされたヒ ト抗 体軽鎖遺伝子を含むヒ ト 2番染色体 （断片） あるいは 22番染色体 （断片） または その両者を導入する。
7 . 自らの抗体を産生することができないマウス系統 （例えば RAG- 2ノ ックァゥ トマウス、 Sh i nkaiら， Cel l, 68， 855 -， 1992、 膜型〃鎖ノ ックアウ トマウス、
Ki tamuraら， Nature, 350， 423-, 1991) から得た胚を宿主胚として 6で得られた
ES細胞とのキメラマウスを作成する。
8 . 得られるキメラマウスにおいてほとんどの機能的な Bリ ンパ球は ES細胞に由 来する （高津聖志ら、 実験医学別冊、 免疫研究の基礎技術、 p234-、 羊土社、 19
95) 。 この Bリ ンパ球においてはマウス重鎖、 鎖が欠損しているため、 主とし て導人染色体上の機能的なヒ 卜抗体遺伝子よりヒ 卜の抗体のみが産生される。 方法 Bの具体的手順
1. ヒ ト抗体重鎖、 軽鎖 または軽鎖 λを含むヒ ト染色体あるいはその断片を保 持するキメラマウスからそれらを安定に保持する継代可能な子孫を得る。
2. 1. で得られたヒ ト抗体重鎖または軽鎖を発現するマウス系統あるいはそれ らの交配により得られたヒ ト抗体重鎖および軽鎖の両者を発現するマウス系統と 自らの抗体遺伝子が欠損しているマウス系統 （例えば膜型//鎖ノ ックァゥ トマゥ ス、 前記、 軽鎖/ ノ ックアウ トマウス、 Chenら， EMBO J. , 3, 821-, 1993) との 交配により、 マウス抗体重鎖、 及び軽鎖 の欠損についてホモ接合体であり、 な おかつヒ ト抗体重鎖 （14番） +軽鎖/ c (2番） 、 抗体重鎖 （14番） +軽鎖； I (22 番） あるいはヒ ト抗体重鎖 （14番） +軽鎖/ c (2番） +軽鎖 λ (22番） を含むヒ 卜染色体を保持するマウス系統を得る。 このマウス系統においてはマウス抗体重 鎖、 軽鎖 c遺伝子が欠損しているため、 主として導入染色体上の機能的なヒ ト抗 体遺伝子よりヒ 卜の抗体のみが産生される。
なお、 上記の Αおよび Βの方法は、 ヒ 卜抗体のみならず、 外来染色体上に存在 するあらゆる遺伝子の産物を効率的に得るために、 用いることができる。
以下に実施例を示して具体的に説明するが、 本発明はこれらの実施例に限定さ れるものでない。
(実施例 1 ) G418耐性標識されたヒ 卜染色体 （断片） を保持する染色体供与細胞 の作製
G418耐性遺伝子を含むプラスミ ド pSTneoB (Katohら、 Cell Struct. Funct.,
12:575, 1987; Japanese Col lection of Research Biologicals (JCRB), Depos it Number: VE039) を制限酵素 Sal I (宝酒造） で線状化し、 ヒ ト正常繊維芽細胞
HFL-1 (RIKEN Cell Bankより入手、 RCB0251)へ導人した。 HFL- 1細胞をトリプ シン処理し、 5x10s個 Zmlとなるようにダルベッコのリン酸バッファー （PBS) に懸濁してから 10〃gDNA存在下でジーンパルサ一 （バイオラッ ド） を用いてエレ ク トロポレーシヨンを行なった （石田ら， 細胞工学実験操作人門， 講談社， 1992 25〃 Fの容量で 1000Vの電圧を 4mm長のエレク ト口ポレーシヨンセル （165 -
2088、 バイオラッ ド ）を用いて室温で印加した。 エレク 卜口ポレーシヨンした細 胞を 15%牛胎児血清 （FBS) を添加したイーグル F12培地 （以下 F12、 という） を含む 100mm組織培養用プラスチックシャーレ （コ一ニング） 3〜 6枚に播種し た。 1 日後に 200 g/mlの G418 (GENETI C IN，シグマ） を含む 15,¾FBSを添加した F1 2培地と置き換えた。 · 2〜 3週間後に生じたコロニー 100個程度を一つの集団と して 52グループにそれぞれまとめ、 100 讓シャーレに再び播種し培養した。
マウス A9細胞 （Osh imura, Env i ron. Heal th Perspec t. , 93 : 57, 1991， JCRB0211 ) を 10%牛胎児血清 （FBS) を添加したダルベッコ改変イーグル培地 （以下 DMEM 、 という） 中、 100 mm シャーレで培養した。 52グループの G418耐性 HFい 1 細胞 を 15%牛胎児血清（FBS) と 200 g/mlの G418を添加した F12中で、 それぞれ 100m mシャーレで培養した。 マウス A9細胞と HFL- 1 細胞をトリプシン処理後それぞれ 四分の一から半分量ずつ混合し、 100誦シャーレに播種し 10%牛胎児血清 （FBS ) を添加した DMEMと 15%牛胎児血清 （FBS) を添加した F12との等量混合物中で 半日から一日培養した。 細胞融合は （清水ら， 細胞工学ハン ドブック， 羊土社， P. 127-， 1992) に記述されている方法に従った。 DMEMで細胞表面を 2回洗った後 、 2ml の PEG ( 1 ： 1. 4) 溶液で 1分間処理し、 さらに、 2mlの PEG ( 1 ： 3) 溶液に換え 1分間処理した。 PEG溶液を吸い取り、 無血清培地 （DMEM) で 3回洗 つた後、 通常の培地 （10% FBS、 DMEM) で 1 日間培養した。 細胞をトリプシン処 理により分散し、 ゥヮバイン （1x10— 5M， シグマ） および G418 (800 g/ml ) を 含む二重選択培地 （10% FBS、 DMEM) に懸濁し、 100腿シャーレ 3枚に播種した 。 約 3週間培養した後、 生じたコロニーをトリブシン処理により細胞を分散し G4 18 (SOO ^ g/ml ) を含む選択培地 （10% FBS、 DMEM) で培養した。
トリプシン処理により細胞を分散し 2グループを一つにまとめて、 6本の 25cm
2遠心用フラスコ （コースター、 3025) にて細胞密度が 70〜80%飽和程度まで培 養した。 コルセミ ド （0. 05 g/ml， デメコルシン， 和光純薬） を含む培養液 （20
% FBS、 DMEM) に交換し、 2 日間培養しミクロセルを形成させた。 培養液を除去 し、 予め保温 （37°C) しておいたサイ トカラシン B (lO ^ g/ml , シグマ） 溶液を 遠心用フラスコに満たし、 アクリル製遠心容器に遠心用フラスコを挿人し、 34°C
、 8000rpm ， 1時間の遠心を行なった。 ミクロセルを無血清培地に懸濁し、 フィル ターで濾過し精製した。 マウス A9細胞を 80%飽和の状態まで培養した 25cm: フラ スコに精製した微小核を加え PEG溶液で融合させた。 G418を含む選択培地で培養 しコロニーを単離した。 各クローンが保持するヒ 卜染色体 （2番、 4番、 14番、 22番） は以下の通り同定した。 上記以外のすべての実験操作及び試薬等は く清水 ら、 細胞工学ハン ドブック、 羊土社、 P.127-〉 に従った。
(1) PCR解析
単離した細胞を培養し、 細胞から Puregene DNA Isolation kit (Gentra Syste m社） を用いてゲノム DNAを抽出し、 このゲノム DMAを铸型とし、 ヒ 卜染色体特 . 異的なプライマ一を用いて PCR法で 2、 4、 14、 22番ヒ ト染色体を保持するクロ —ンを選抜した。 PCR増幅は約 0. l〃gのゲノム DNAを使用し （Innisら， PCR 実験マニュアル， HBJ出版局， 1991， サーマルサイクラ一は GeneAmp 9600， Perk in- Elmer社を使用） に従い行なつた。 Taqポリメラーゼは Perkin-Elmer社製を用 い、 反応条件は、 94°C5分を 1サイクル行なった後、 変性 94°C15秒、 ァニーリ ン グ 54〜57°C15秒 （プライマ—により適宜変更） 、 伸長 72°C20秒を 35サイクル行な つた。 プライマーは各染色体上に存在する遺伝子 （O'Brien, Genetic Maps, 6th edition, Book 5, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1993 ) 及び多型性 マ一力一 (Polymorphic STS Primer Pair, BIOS 社； Weissenbach ら， Nature 359:794, 1992; Walterら， Nature Genetics, 7:22, 1994等） を用いた。 遺伝 子プライマ一は GenBank、 EMBL等のデ一タベースより人手した塩基配列をもとに 作製した。 多型性プライマーの名称及び、 遺伝子プライマーの配列はそれぞれの 染色体について以下の実施例で示した （2番：実施例 1、 4番：実施例 6、 14番 ：実施例 9、 22番：実施例 2) 。 2番染色体の同定には以下に示す遺伝子マーカ 一及び多型性マーカー （Polymorphic STS Primer Pair, BIOS社： D2S207, D2S1 77, D2S156, D2S159 BIOS社) を用いた。
C c (immunoglobulin kappa constant) ： 5' -TGGAAGGTGGATAACGCCCT (配列 番号 1 )， 5， -TCATTCTCCTCCAACATTAGCA (配列番号 2 )
FABP1 (fatty acid binding protein - 1 liver) ： 5' -GCAATCGGTCTGCCGGAAGA (配列番号 3 )， 5' -TTGGATCACTTTGGACCCAG (配列番号 4 )
Vk3-2 (immunoglobulin kappa variable) ： 5' -CTCTCCTGCAGGGCCAGTCA (配 列番号 5 )， 5' -TGCTGATGGTGAGAGTGAACTC (配列番号 6 ) Vkl-2 (immunoglobulin kappa variable) ： 5' -AGTCAGGGCATTAGCAGTGC ( 配列番号 7 )， 5' -GCTGCTGATGGTGAGAGTGA (配列番号 8 )
☆
(2) フルォレツセ—ンス インサイチューハイブリダィゼーシヨ ン （FISH)
FISH解析は （松原ら， FISH実験プロ トコール， 秀潤社， 1994) に記された方法 に従い、 ヒ 卜 2番、 4番、 14番、 22番染色体特異的プローブ （CHROMOSOME PAINT I G SYSTEM, Cambio社） を用いて行なった。
例えば、 2番染色体を保持するクローンは 26グループ（745クローン）中 10グル —プに 1個以上のクローンを得た。 このうち用いた 2番染色体特異的なプライマ 一すべてに陽性であつたのは 5クローンだった。 これらのクローンを FI SH解析し た。 FISH解析は （松原ら， FISH実験プロ トコール、 秀潤社、 1994) に記された方 法に従い、 ヒ ト 2番染色体特異的プローブ （CHROMOSOME PAINTING SYSTEM, CANBI ◦社） を用いて行なった。 すべてのプライマ一に陽性な細胞ではヒ ト 2番染色体 がほぼ完全な形で観察され、 1部のプライマ一のみ陽性なクローンのうちいくつ かのクローンではヒ ト 2番染色体よりも小さな独立染色体が観察され、 あるいは ヒ 卜 2番染色体以外の染色体と融合しているような形の染色体を持つ細胞も観察 された （図 1 ) 。 図 1において、 横列がクローン名、 縦列は PCRに使用したブラ イマ一を示す。 秦は陽性を、 Xは陰性を示した。 また、 FISHにより観察されたヒ ト 2番染色体の存在形態を最下行に示した。 記載のないものは実施していない。 同様にして、 ヒ ト 4番、 14番、 22番染色体を保持する A9細胞を得た。
(実施例 2) マウス ES細胞へのミ クロセル法によるヒ ト 22番染色体導入
染色体供与細胞として、 （実施例 1) で得られたヒ ト 22番染色体を保持するマ ウス A9細胞株 （以下 A9/#22、 という） を用いた。 染色体受容細胞としてはマウス
ES細胞株 E14 (Martin L. Hooperより入手、 Hooperら， Nature, 326 :292, 1987
) を用いた。 E14の培養法はく相沢慎一， バイオマニュアルシリーズ 8， ジーン タ一ゲティ ング， 羊土社， 1995>に記された方法に従い、 栄養細胞としては、 マ イ トマイシン C (シグマ） 処理した G418耐性 ST0細胞株 （大阪大学、 近藤寿人教 授より人手） を用いた 。 まず清水ら （細胞工学ハンドブック、 羊土社、 1992) の報告した方法に従い、 約 108個の A9/S22からミクロセルを調製した。 得られた ミ クロセルは全量を 5mlの DMEMに懸濁した。 約 107個の E14を卜リプシンで分散 させた後、 DMEMで 3回洗浄し、 5mlの DMEMに懸濁した後、 ミ クロセルとあわせ、 丄 250rpni、 10分間遠心して上清を除いた。 沈殿をタッピングによりょくほぐし、 1:1.4PEG溶液 （5g PEG1000，く和光純薬〉， lml DMS0<シグマ〉を 6mlDMEMに溶解) 0.5mlを加えて室温で 1分 30秒静置した後、 lOmlの DMEMをゆっく りと加えた。 直 ちに 1250rpm、 10分間遠心して上清を除き、 沈殿を 30mlの ES細胞用培地に懸濁し 、 あらかじめ栄養細胞をまいた直径 100mmの組織培養用プラスチックシャーレ （ コ一二ング） 3枚に播種した。 24時間後に 300 g/mlの G418 (GENETIC IN, シグ マ） を加えた培地と交換し、 その後毎日培地交換を行なった。 1週間〜 10日後に は薬剤耐性コロニーが出現する。 その出現頻度は E14細胞 107個あたり 0〜5個 であった。 そのコロニーをピックアップし増殖させ、 5x 106個あたり lmlの保 存用培地 （ES細胞用培地十 10¾DMS[Kシグマ〉） に懸濁し、 - 80°Cにて凍結保存し た。 同時に各薬剤耐性株について 106〜107個の細胞からゲノム DNAを Puregene
DNA Isolation Kit (Gentra System社） により調製した。
ヒ 卜 22番染色体の断片化はミクロセルにガンマ線照射することにより行なった
(Koiら， Science, 260:361， 1993) 。 約 108個の A9/#22より取得したミ クロセ ルを 5mlの DMEMに懸濁し、 ガンマセル 40 (カナダ原子力公社製） により、 氷上で 60Gyのガンマ線を照射した （1.2Gy/分 x 50分） 。 ガンマ線照射したミ クロセル は未照射ミ クロセルと同様に融合、 薬剤耐性株選抜を行なった結果、 薬剤耐性株 の出現頻度は E14細胞 107個あたり 1〜7個であった。 薬剤耐性株については未 照射の場合と同様にして凍結保存、 DNA取得を行なった。
未照射ミクロセル薬剤耐性株 E14/#22-9 、 E14/#22-10 、 ガンマ線照射ミ クロ セル薬剤耐性株 E14/#22_14、 E14/#22-25における導入染色体の保持は以下の （1) 〜 （3)により確認した。
(1) PCR解析 （図 2 )
薬剤耐性株ゲノム DNAを铸型としてヒ ト 22番染色体上に存在する遺伝子 （Gene tic Maps, 前記） 及び多型性マーカ一 （Polymorphic STS Primer Pair, BIOS社
： D22S315, D22S275, D22S278, D22S272, D22S274; Nature 359:794, 1992) の 存在を PCR法により検出した。 GenBank、 EMBL等のデータベースより入手した塩 基配列をもとに作製した遺伝子プライマーォリゴヌクレオチドの配列を記す。 PVALB (parvalbumin) ： 5' -TGGTGGCTGAAAGCTAAGAA (配列番号 9 )， 5' -CCAGAA GAATGGTGTCATTA (配列番号 10)
MB (myoglobin) ： 5' -TCCAGGTTCTGCAGAGCAAG (配列番号 11)， 5' -TGTAGTTGGAGG CCATGTCC (配列番号 12)
DIA1 (cytochrome b- 5 reductase) ： 5' -CCCCACCCATGATCCAGTAC (配列番号 13 )， 5' -GCCCTCAGAAGACGAAGCAG (配列番号 14)
Ig (immunoglobulin lambda) ： 5' -GAGAGTTGCAGAAGGGGTGACT (配列番号 15 )， 5' -GGAGACCACCAAACCCTCCAAA (配列番号 16)
ARSA (arylsulfatase A) ： 5' - GGCTATGGGGACCTGGGCTG (配列番号 17)， 5' -CAGA GACACAGGCACGTAGAAG (配列番号 18)
☆
約 0. l/ gのゲノム DNAを铸型として上記の 10種のブラィマーについて PCR増 幅 （innisら，前記） を行なった。 その結果、 未照射の 2株は全てのプライマ一 、 ガンマ線照射した 2株については一部のプライマ一について期待される長さの 増幅産物が検出された。 以上の結果を図 2に示す。 図 2において、 左側にヒ 卜 22 番染色体の Gバンド像に基づく模式的な染色体地図、 また、 位置が明らかになつ ているいくつかのマ一カーについてはどのバンドに位置するかを示した （0' Brie n, GENETIC MAPS, 6th edition, BOOK 5等） 。 遺伝子及び多型性マ一力一の並び 方は、 現在までに入手出来る情報 （Science, HUMAN GENETIC MAP, 1994， Nature
Genetics, 7:22, 1994， Nature 359:794, 1992等） を基に、 大まかな位置関係 を示したもので、 順序は必ずしも正確ではない。 4種の G418耐性 E14細胞株につ いて、 PCRにより期待される増幅産物が検出されたマーカ一は國で、 検出されな かったマーカ一を□で示した。 下側には FISH解析による観察結果を示した。
22は、 染色体供与細胞である。
(2) サザンプロッ ト解析
サザンブロッ ト解析はヒ ト特異的な繰り返し配列である L1配列 （ハプロイ ドゲ ノム当たり 104〜105コピー存在、 RIKEN DNA Bankより入手、 Nucleic acids re search, 13;7813, 1985, pUK19A由来 1.4kb EcoRI-BamHI 断片） をプローブとして 、 制限酵素 （Bglil、 宝酒造製） 処理を行なった約 2 zgのゲノム DNAに対して く Ausubelら， Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, 1 n ， 1994〉に記された方法に従い行なった。 その結果、 各薬剤耐性株 DNAにおい てヒ 卜し 1 配列とハイブリダィズするバン ドが多数検出された。 未照射の 2株に ついてはそのパターン及び、 各バン ドの濃度から推定できるヒ ト染色体 DNAのマ ウスゲノム DNAに対する量比は A9/#22のそれと同等であった。 ガンマ線照射株の 全体のシグナル強度は A9/#22と比較した場合、 PCR解析で示された欠失の程度と 相関していた。
( 3 ) フルォレツセンスイ ンサイチューハイブリダィゼ一シヨ ン （FISH)
FISH解析は （松原ら， FISH実験プロ トコール， 秀潤社， 1994) に記された方法 に従い、 ヒ 卜 22番染色体特異的プローブ （CHROMOSOME PAINTING SYSTEM, Cambio 社） を用いて行なった。 その結果、 観察した分裂像のほとんどにおいて、 E14/ 2-9 はマウス染色体に転座した形で、 他の 3株は独立した染色体としてヒ 卜 22番 染色体が検出された。
以上の実験により、 得られた G418耐性株 E14/#22-9 、 E14/#22-10 はヒ ト 22番 染色体の全てあるいは大部分を、 E14/#22- 14 、 E14/#22-25 はその部分断片を 保持することが確かめられた。
(実施例 3) ヒ ト 22番染色体を保持する ES細胞からのキメラマウス作製
一般的なマウス胚取得、 培養、 ES細胞の胚への注入、 仮親子宮への移植等の手 技については、 く相沢慎一， バイオマニュアルシリーズ 8， ジーンターゲティ ン グ， 羊土社， 1995〉に記された方法に従った。 （実施例 2) で得られ、 ヒ 卜 22番 染色体を保持していることが確認された G418耐性 ES細胞株 E14/ 22- 9を凍結スト ックより立ち上げ、 C57BL/6XC3H F1雌マウス （日本クレア社） を C3H雄マウス
(日本クレア社） と交配することにより取得した胚盤胞期胚に胚あたり 10〜15 個注人した。 偽妊娠処理後 2.5日の仮親 ICRマウス （日本クレア社） の子宫に片 側の子宮あたり約 10個の ES細胞注入胚を移植した。 その結果を （表 1 ) に示す。 表 1 . ヒ ト 22番染色体 （断片） を保持する E14 細胞株からのキメラマウス作製
ES細胞株/ G418耐性 ES細胞を注人し 子マウス キメラマウス 毛色への貢献率 ヒト染色体 株番号 - た胚盤胞期胚数 の数 の数 10¾ 10-30¾ 30,
E14/#22 9 166 29 16
計 166個の注入胚を移植した結果 29匹の子マウスが誕生した。 キメラ個体は、 毛色において宿主胚由来の野生色 （濃茶） の中に E14細胞由来の薄灰色が認めら れるかどうかにより判定される。 誕生した 29匹のうち毛色に明らかに薄灰色の部 分のある、 すなわち、 E14細胞の貢献の認められる個体は 16匹であった。 また、 最高の貢献率は K22- 22における約 40%であつた。
この結果より、 ヒ ト 22番染色体を保持するマウス ES細胞株 Ε14/ίί22- 9はキメラ
7
形成能、 すなわちマウス個体の正常組織に分化する能力を保持していることが確 認された。 3
(実施例 4) ヒ ト 22番染色体を保持する ES細胞由来キメラマウス各組織におけ
6 るヒ ト染色体 DNAの保持確認
(実施例 3) の毛色による判定に加えて、 尻尾より調製したゲノム DNAを铸型 とした PCR解析により、 導入染色体の保持を確認した。 誕生後 3週以上を経たキ メラマウスからく勝木元也， 発生工学実験マニュアル， 講談社サイェンティフィ ク， 1987>に記された方法に従い尻尾を取得し、 Puregene DNA I so l at i on Ki tを 用いてゲノム DNAを抽出した。 このゲノム DNAを铸型として （実施例 2) で使用 した多型性プライマーのうち PVALB、 D22S278を用いて増幅産物の確認を行なつ た。 毛色に貢献の見られた個体のうち 10匹について解析を行った結果、 全ての個 体において少なく ともいずれかのプライマーによる増幅産物が確認された。 サザン解析は （実施例 2) と同様に、 ヒ ト L1配列をプローブとして用い、 6個 体のキメラマウス、 1個体の非キメラマウスの 2〃gの尻尾ゲノム DNAに対して 行なった。 その結果、 全てのキメラ個体において多数のヒ 卜 L1配列の存在が認め られ、 そのパターンは E14/#22- 9と類似していた。 マウスゲノムに対する量比は 最も多いもので 10%程度であった （図 3 ) 。 図 3において、 各レーンとも、 Bgl l 肖化した 2 // gのゲノム DNAを使用した。 '一 ' P標識ヒ 卜 L1配列をプローブとし 、 シグナルはイメージアナライザー BAS2000 (富士写真フィルム社） により検出 した。 右より、 キメラマウス （K22- 6， 7， 8， 9， 10， 11， 12 ： 9は非キメラ） の尻尾 由来ゲノム DNAおよびコントロール DNA(C : C は、 E14/#22- 9 と E14ゲノム DNA を 1 : 9の重量比で混合したもの） のレーンである。 左側に DNA分子量、 右側に各 キメラ個体のキメラ率を示した。 （- ： 0 、 + ： 〜10%、 ： 10〜30 )
さらに、 毛色に 5,¾程度の貢献の見られたキメラ個体 （K22- 7) について脳、 肝 臓、 筋肉、 心臓、 脾臓、 胸腺、 卵巣、 腎臓から I SOGEN (二ツボンジーン社） によ りゲノム DNAを取得し、 それぞれの組織について、 （実施例 2) で使用した遺伝 子プライマ一のうち MB、 D IA1を用いて PCR解析を行なった。 その結果 2つのブラ イマ一とも全ての組織において期待される増幅産物が確認された。 D 1A1ブラィマ —による結果を （図 4 ) に示す。 PCR産物は 2%ァガロースゲルにて電気泳動した 後、 臭化工チジゥム染色して検出した。 図 4の各レーンは左から B：脳、 L :肝 臓、 SM：骨格筋、 H：心臓、 Sp：脾臓、 Th：胸腺、 0v：卵巣、 K： 腎臓、 nc：非 キメラマウス尻尾 DNA (陰性コン トロール）、 pc : ヒ ト繊維芽細胞 （HFL- 1) DNA( 陽性コントロール）を示す。
これらの結果より、 E14/#22-9はマウス個体において種々の正常組織に貢献し 、 かつヒ ト 22番染色体を保持していることが確かめられた。
(実施例 5) ヒ ト 22番染色体を保持する ES細胞由来キメラマウスにおけるヒ ト 遺伝子の発現
ヒ ト遺伝子発現確認のための試料としては、 毛色に 5¾程度の貢献の見られた個 体 （K22- 7) の尻尾を液体窒素にて凍結後粉碎したものを用いた。 これは皮膚、 骨、 筋肉、 血液等の組織の混合したものである。 これより ISOGEN (ニッボンジー ン） を使用して総 RNAを抽出し、 RT- PCR法により、 ヒ ト-ミオグロビン （MB) 、 ヒ ト-チトクローム b5 レダクタ一ゼ （D IA1) の mRNAの検出を行なった。 RT-PCR はく I nni sら， PCR実験マニュアル， HBJ出版局， 1991 >に記された方法に従つ て行なった。 逆転写反応用プライマーは、 ランダムへキサマ一オリゴヌクレオチ ド （終濃度 100pmol、 宝酒造製） を、 逆転写酵素は BRL社製 （スーパースク リブ ト） を使用した。 cDNAを铸型とした増幅に用いたプライマーを記す。
MB： 5' -TTAAGGGTCACCCAGAGACT (配列番号 19)， 5' -TGTAGTTGGAGGCCATGTCC (配列 番号 20) -
DIA1： 5' -CAAAAAGTCCAACCCTATCA (配列番号 21)， 5' -GCCCTCAGAAGACGAAGCAG (配 列番号 22) その結果、 両遺伝子の mRNAに特異的な増幅産物が検出された （図 5 ) 。 RT- PCR 産物は 2¾ァガロースゲルにて電気泳動した後、 臭化工チジゥム染色して検出した o 図 5において、 M はマーカー (HindlH消化； I DNA + HaeIII消化 0X174DNA, 宝酒造） 、 MBはヒ 卜 ミオグロビン、 DIA1はヒ トチ トクローム b5レダクタ一セ、 WT は野生型 C3Hマウスを示す。
さらに同じ個体（K22- 7) について、 脳、 心臓、 胸腺、 肝臓、 脾臓、 腎臓、 卵巣 、 骨格筋から IS0GENを使用して総 RNAを抽出し、 上記の 2種のプライマーにより 各臓器の RT- PCRを行った。 その結果、 DIA1は全ての臓器で、 MBは心臓と骨格筋の みで期待される増幅産物が確認された （図 6) 。 ミオグロビンは筋細胞特異的に 発現することが知られており（Bassel- Dubyら， MCB, 12:5024, 1992) 、 この結果 は導入したヒ ト染色体上の遺伝子がマウス個体で正常な組織特異的発現制御を受 け得ることを示している。 PCR産物は 2%ァガロースゲルにて電気泳動した後、 臭 化工チジゥム染色して検出した。 図 6において、 各レーンは左から B:脳、 H:心臓 、 Th:胸腺、 L:肝臓、 Sp: 脾臓、 K:腎臓、 0v: 卵巣、 SM: 骨格筋、 M:マーカー （ 上記） を示す。 MBの結果において観察される下方のバン ドは非特異的産物と考え られる。
すなわち、 導入されたヒ ト 22番染色体はキメラマウスの正常組織において機能 し得ることが確かめられた。
(実施例 6) ヒ ト 4番染色体またはその部分断片の ES細胞への導入
染色体供与細胞として、 （実施例 1) で得られたヒ 卜 4番染色体を保持するマ ウス A9細胞株 （以下 A9/#4、 という） を用いた。 染色体受容細胞としてはマウス
ES細胞株 E14 (実施例 2と同様） を用いた。 ミクロセル融合実験および G418耐性 株の選択は （実施例 2) と同様に行なった。 薬剤耐性株の出現頻度は E14細胞 10 固あたり 1〜2個であった。 薬剤耐性株の凍結保存、 ゲノム DNA取得は （実施 例 2) と同様に行なった。 薬剤耐性株 E14/#4 - 4 、 E14/#4-7 、 E14#4 - 11におけ るヒ ト 4番染色体またはその断片の保持は以下の （1) 〜 （3) により確認した
(1) PCR解析 (図 7)
薬剤耐性株ゲノム DNAを铸型としてヒ ト 4番染色体上に存在する遺伝子 （O'Br. ien, Genetic Maps, 6th edi tion, Book 5, Cold Spring Harbor Laboratory Pre ss， 1993) 及び多型性マーカ— （Polymorphic STS Primer Pair BIOS社： D4S395 ， D4S412, D4S422, D4S413, D4S418, D4S426, Fll; Nature 359:794, 1992 ) の 存在を PCR法により検出した。 GenBank、 EMBし等のデータベースより入手した塩 基配列をもとに作製した遺伝子プライマ一ォリゴヌクレオチドの配列を記す。 HD (huntington disease) ： 5' -TCGTTCCTGTCGAGGATGAA (配列番号 23)， 5， - TCAC TCCGAAGCTGCCTTTC (配列番号 24)
IL-2 (interleukin-2) ： 5' -ATGTACAGGATGCAACTCCTG (配列番号 25)， 5' -TCATCT GTAAATCCAGCAGT (配列番号 26)
KIT (c-kit) ： 5' -GATCCCATCGCAGCTACCGC (配列番号 27)， 5' -TTCGCCGAGTAGTC GCACGG (配列番号 28)
FABP2 (fatty acid binding protein 2， intestinal) ： 5' -GATGAACTAGTCCAGG TGAGTT (配列番号 29)， 5' -CCTTTTGGCTTCTACTCCTTCA (配列番号 30) 上記の 11種のプライマ一について PCR増幅を行なった結果、 3株共に、 全て、 あるいは一部のプライマーについて期待される増幅産物が確認された。 E14/#4 - 4
、 E14/#4-7 株のように一部領域に欠失がみられるものもあった。 以上の結果を 図 7に示す。 図 7において、 左側にヒ ト 4番染色体の Gバンド像に基づく模式的 な染色体地図、 また、 位置が明らかになっているいくつかのマーカ一については どのバンドに位置するかを示した （実施例 2参照） 。 遺伝子及び多型性マーカー の並び方は、 現在までに入手出来る情報 （実施例 2参照） を基に、 大まかな位置 関係を示したもので、 順序は必ずしも正確ではない。 3種の G418耐性 E14細胞株 について、 PCRにより期待される増幅産物が検出されたマーカーは園で、 検出さ れなかったマ一力一を□で示した。 下側には FISH解析による観察結果を示した。 A9/#4は染色体供与細胞を示す。
(2) サザンプロッ _ト解析 （図 8 )
サザンブロッ 卜解析は （実施例 2) と同様に、 E14/#4-4 、 E14/#4-7 より取 得したゲノム DNAについてヒ ト L1配列をプローブとして行なった。 その結果、 両 株 DNAにおいてヒ ト Li 配列とハイブリダィズするバン ドが多数検出された。 A9 ./#4と比較して、 全体のシグナル強度は PCR解析で示された欠失の程度と相関し ていた。 図 8において、 各レーンとも、 Bglll消化した 2〃gのゲノム DNAを使 用した。 32P標識ヒ ト L1配列をプローブとし、 シグナルはイメージアナライザ一 BAS2000 (富士写真フィルム社） により検出した。 図 8において、 各レーンは、 左から、 1:Α9/#4 (染色体供与細胞) 、 2:A9/#4+A9 (1:2) 、 3:A9/#4+A9 (1:9 ) 、 4:A9、 5:E14/#4- 7、 6 : E14/#4- 4を示す。 2、 3は 2 種の DNAを括弧内に示し た比率で混合したものである。 左側に DNA分子量を示した。
(3) フルォレツセンスイ ンサイチューハイブリダィゼ一シヨ ン （FISH)
FISH解析は （実施例 2) と同様に、 ヒ 卜 4番染色体特異的プローブ （CHR0M0S0 ME PAINTING SYSTEM, Cambio社） を用いて行なった。 その結果、 3株すベてのほ とんどの分裂像において、 ヒ ト 4番染色体あるいはその部分断片が検出された。 E14/#4- 4はマウス染色体に転座した形で、 他の 2株は独立した染色体として存在 していた。 観察されるヒ ト染色体の相対的な大きさは、 PCR解析の結果から推測 されるそれと一致していた。
以上の実験により、 得られた G418耐性株はヒ ト 4番染色体の全てあるいはその 部分断片を保持することが明かとなつた。
(実施例 7) ヒ 卜 4番染色体部分断片を保持する ES細胞からのキメラマウス作製 ヒ 卜 4番染色体部分断片を保持していることが確認された G418耐性 ES細胞株 E1
4/#4- 4、 E14/#4-7を凍結ストックより立ち上げ、 （実施例 3) と同様にして取得 した胚盤胞期胚に胚あたり 10〜15個注入した。 偽妊娠処理後 2.5日の仮親 ICRマ ウス （日本クレア社） の子宮に片側の子宮あたり約 10個の ES細胞注入胚を移植し た。 その結果を （表 2 ) に示す c 表 2 . ヒ ト 4番染色体 （断片） を保持する E14 細胞株からのキメラマウス作製
ES細胞株/ G418耐性 ES細胞を注入し 子マウス キメラマウス 毛色への貢献率 ヒ卜染色体 株番号 た胚盤胞期胚数 の数 の数 10¾ 10-30 30,V
E14/#4 4 160 8 5 5
7 80 5 2 1
計 240個の注入胚を移植した結果 13匹の子マウスが誕生した。 キメラ個体は、 毛色において宿主胚由来の野生色 （濃茶） の中に E14細胞由来の薄灰色が認めら れるかどうかにより判定される。 誕生した 13匹のうち毛色に明らかに薄灰色の部 分のある、 すなわち、 E14細胞の貢献の認められる個体は 7匹であった。 また、 最高の貢献率は E14/#4- 7由来の 1個体において約 15%であつた。
この結果より、 ヒ ト 4番染色体部分断片を保持するマウス ES細胞株 E14/#4- 4、 E14/#4- 7はキメラ形成能を保持している、 すなわちマウス個体の正常組織に分 化する能力を保持していることが確認された。
(実施例 8) ヒ 卜 4番染色体部分断片を保持する ES細胞由来キメラマウスにお けるヒ 卜染色体 DNAの保持及び、 G418耐性遺伝子の発現確認
( 1) PCR解析
(実施例 7) で得られたキメラマウスのうち E14/#4- 7由来の 1個体 （K#4-7-l ： キメラ率約 5%) 、 Ε14/#4- 4由来の 1個体 （Κ#4- 4- 41 ： キメラ率約 5 ) について (実施例 4) と同様に尻尾よりゲノム DMを調製した。 それを铸型とし、 （実施 例 6) で示した 4番染色体解析用プライマ一のうち E14/#4- 7、 E14/#4-4で検出さ れた多型性マ一力一 F11について PCR解析を行なった。 その結果、 2個体とも期 待される増幅産物が検出された。
(2) サザン解析 （図 9 ) サザン解析は （実施例 2) と同様、 E14/#4-7由来の 1個体 （K 4-7- 1 ： キメラ 率約 5» についてヒ ト L1配列をプローブとして用い、 2 gの尻尾由来ゲノム DN Aに対して行なった。 その結果、 多数のヒ 卜 L1配列の存在が認められ、 そのパ夕 —ンは E14/#4-7と類似していた。 マウスゲノムに対する量比は E14/#4- 7の約 10% 程度であった。 図 9において、 各レーンとも、 Bgl l l消化した 2〃gの尻尾由来 ゲノム DNAを使用した。 3 2 P標識ヒ ト L1配列をプローブとし、 シグナルはィメ一 ジアナライザ一 BAS2000 (富士写真フィルム社） により検出した。 左側に DNA分. 子量を示した。 各レーンは左から i ： K#4- 7- 1、 2： ブランク、 3 ： Ε14/#4-7 を示す。
(3) 尻尾由来繊維芽細胞の G418耐性試験
キメラマウスのうち、 E14/ 4- 7由来の 1個体 （K - 7 - 1 ： キメラ率約 5¾) 、 E1 4/#4-4由来の 1個体 （K#4- 4- 41 ： キメラ率約 5%) について尻尾から以下のように 繊維芽細胞を調製した。 DNA調製 （実施例 4) と同様にキメラマウスの尻尾を 5m π！〜 10mm切断し、 PBS/lmM EDTAで数回洗浄した後、 メスで切れ込みをいれて表 皮を除去し、 内部の組織をメスで細かく切り刻む。 組織細片を 5mlの PBS/lmM ED TAをいれたチューブに移し、 30分〜 1 時間室温静置する。 その後、 1mlの PBS/ED TAを残して上清を取り除き、 1mlの 0. 25%トリプシン/ PBSを加え、 5〜10分間室 温でタッビングあるいはピベッティ ングしながら組織をよくほぐす。 lOOOrpm, 10 分間遠心し、 沈殿を 2mlの DMEM ( 10¾FCS) に懸濁し、 35誦シャーレに播種する。 7〜10日の培養後、 トリプシン処理により細胞をシャーレからはがし、 シャーレ あたり約 10 '1個の細胞を 35誦シャーレ 2枚に播種し、 うち 1枚に終濃度 400 g/ mlの G418を加え、 5〜7日間培養し、 それぞれのシャーレの生細胞を観察する。 この条件で、 野生型 ICRマウス由来の繊維芽細胞は、 G418存在下でほぼ 100¾死滅 する。 この結果、 2個体共 G418耐性の繊維芽細胞の存在が認められた。
これらの結果より、 E14/#4- 7、 E14/#4- 4はマウス個体において種々の正常組織 に貢献し、 かつヒ ト 4番染色体部分断片を保持していることが確認された。
(実施例 9) マウス ES細胞へのヒ ト 14番染色体またはその断片の導入
染色体供与細胞として、 （実施例 1) で得られたヒ ト 14番染色体を保持するマ ウス A9細胞株 （以下 A9/#14、 という） を用いた。 染色体受容細胞としてはマウス ES細胞株 TT2 (ライフテッ クオリエンタル社より購入、 Yagiら， Analytical Bioc hem. , 214:70， 1993) を用いた。 ΤΤ2の培養法はく相沢慎一， バイオマ二ユア ルシリーズ 8， ジーンターゲティ ング， 羊土社， 1995>に記された方法に従い、 栄養細胞はマイ トマ'イ シン C (シグマ） 処理した G418耐性初代培養細胞 （ライフ テックオリエンタル社より購人） を用いた。 ミ クロセル融合実験および G418耐性 株の選択は （実施例 2) と同様に行なった。 薬剤耐性株の出現頻度は ΤΤ2細胞 10 固あたり 3〜6個であった。 薬剤耐性株の凍結保存、 ゲノム DNA取得は （実施 例 2) と同様に行なった。
ヒ 卜 14番染色体の断片化はミ クロセルにガンマ線照射することにより行なった
(Koiら， Science, 260:361, 1993) 。 約 108個の A9/#14より取得したミ クロセ ルを 5mlの DMEMに懸濁し、 ガンマセル 40 (前記） により、 氷上で 30Gyのガンマ線 を照射した （1.2Gy/分 X 25分） 。 ガンマ線照射したミ クロセルを未照射ミ クロセ ルと同様に融合、 薬剤耐性株選抜を行なった結果、 薬剤耐性株の出現頻度は TT2 細胞 10 個あたり 3個であった。 薬剤耐性株については （実施例 2) と同様にし て凍結保存、 DNA取得を行なった。
ガンマ線未照射ミ クロセル移人による G418耐性株 1-4、 1-5、 ガンマ線 （30Gy ) 照射ミ クロセル移入による G418耐性株 3-1、 3-2計 4株におけるヒ ト 14番染色 体または部分断片の保持は以下の （1) 、 (2) により確認した。
( 1 ) PCR解析 (図 10)
薬剤耐性株ゲノム DNAを铸型としてヒ ト 14番染色体上に存在する遺伝子 （O'Br ien, Genetic Maps, 6th edi tion, Book 5， Cold Spring Harbor Laboratory Pr ess, 1993 ) 及び多型性マーカー （Polymorphic STS Primer Pair BIOS社： D14 S43, D14S51, D14S62, D14S65, D14S66, D14S67, D14S72, D14S75, D14S78, Dl 4S81, PCI ； Nature 359:794, 1992； Nature Genetics, 7:22, 1994) の存在を PC R法により検出した。 GenBank、 EMBL等のデータベースより人手した塩基配列を もとに作製した遺伝子プライマ一ォリゴヌクレオチ ドの配列を記す。
NP (nucleoside phosphory lase) ： 5' -ATAGAGGGTACCCACTCTGG (配列番号 31), 5' -AACCAGGTAGGTTGATATGG (配列番号 32)
TCRA (T- ceil receptor alpha) ： 5' -AAGTTCCTGTGATGTCAAGC (配列番号 33)， 5 ' -TCATGAGCAGATTAAACCCG (配列番号 34)
MYH6 (myosin heavy chain cardiac) ： 5' -TGTGAAGGAGGACCAGGTGT (配列番号 35), 5' -TGTAGGGGTTGACAGTGACA (配列番号 36)
IGA2 (immunoglobulin alpha- 2 constant) ： 5' -CTGAGAGATGCCTCTGGTGC (配 列番号 37). 5' -GGCGGTTAGTGGGGTCTTCA (配列番号 38)
IGG1 (immunoglobulin gamma- 1 constant) : 5' - GGTGTCGTGGAACTCAGGCG (配 列番号 39)， 5' - CTGGTGCAGGACGGTGAGGA (配列番号 40)
IGM (immunoglobulin mu constant) ： 5' -GCATCCTGACCGTGTCCGAA (配列番号 41), 5' -GGGTCAGTAGCAGGTGCCAG (配列番号 42)
IGVH3 (immunoglobulin heavy variable- 3 ) ： 5' -AGTGAGATAAGCAGTGGATG ( 配列番号 4:3), 5' -GTTGTGCTACTCCCATCACT (配列番号 44)
☆
薬剤耐性株 4株のゲノム DNAを铸型として、 上記の 18種のプライマ一について
(実施例 2) 同様に PCR増幅を行なった結果、 全て、 あるいは一部のプライマ一 について期待される増幅産物が確認された。 ガンマ線照射したミ クロセルを用い て得られた薬剤耐性株 3-1、 3- 2は、 14番染色体の一部領域を欠失している傾向 が認められた。 また、 未照射ミ クロセルを用いた場合でも 1-4株のごとく欠失が みられるものもあった。 以上の結果を図 10に示す。 図 10において、 左側にヒ ト 14 番染色体の Gバン ド像に基づく模式的な染色体地図、 また、 位置が明らかになつ ているいくつかのマーカ一についてはどのバンドに位置するかを示した （実施例
2参照） 。 遺伝子及び多型性マ一カーの並び方は、 現在までに人手出来る情報 （ 実施例 2参照） を基に、 大まかな位置関係を示したもので、 順序は必ずしも正確 ではない。 4種の G418耐性 TT2細胞株について、 PCRにより期待される増幅産物 が検出されたマーカ一は酾で、 検出されなかったマーカーを口で示した。 A9/#l
4 は染色体供与細胞である。 右端には実施例 11 (1) の結果が示されている。
(2) フルォレツセンスインサイチューハイブリダィゼ一シヨン （FISH)
FISH解析は （松原ら， FISH実験プロ トコ一ル、 秀潤社、 1994) に記された方法 に従い、 ヒ ト 14番染色体特異的プローブ （CHROMOSOME PAINTING SYSTEM, Cambio 社） を用いて行なった。 その結果、 4株すべてについてほとんどの分裂像に、 ヒ 卜 14番染色体あるいはその部分断片が、 独立した染色体として観察された。 観察 されるヒ ト染色体の相対的な大きさは、 PCR解析の結果から推測されるそれと一 致していた。
以上の実験により、. 得られた G418耐性株 1 -4、 1 -5、 3- 1、 3- 2はヒ 卜 14番染色体 の全てあるいはその部分断片を保持することが確かめられた。
(実施例 10) ヒ 卜 H番染色体断片を保持する ES細胞からのキメラマウス作製 (実施例 9) で得られ、 ヒ 卜 14番染色体を保持していることが確認された G418 耐性 ES細胞株 4株 （1 -4、 3-1、 3-2、 1 -5) を凍結ストックより立ち上げ、 1 CRあるいは MCH( I CR) (日本クレア社） 雄雌マウスの交配により得られた 8細胞期 胚に胚あたり 8〜10個注人した。 E S培地 （実施例 9 ) で一晩培養して胚盤胞に 発生させた後、 偽妊娠処理後 2. 5日の仮親 I CRマウス （日本クレア社） の子宮に 片側の子宮あたり約 10個のインジェクション胚を移植した。 その結果を （表 3 ) に示す。 表 3 . ヒ 卜 14番染色体 （断片） を保持する TT2 細胞株からのキメラマウス作製
ES細胞株/ G418耐性 ES細胞を注入し 子マウス キメラマウス 毛色への貢献率 ヒト染色体 株番号 た 8細胞期胚数 の数 の数 〜20¾ 20- 50% 50- 80%
ΤΤ2/#14 1-4 98 20
1-5 110 14
3-1 103 11
3-2 183 19
計 494個の注入胚を移植した結果、 64匹の子マウスが誕生した。 キメラ個体は
、 毛色において宿主胚 （I CR) 由来の白色の中に TT2細胞由来の野生色 （濃茶） が認められるかどうかにより判定される。 誕生した 64匹のうち毛色に明らかに野 生色の部分のある、 すなわち、 ES細胞の貢献の認められる個体は 8匹であった。 また、 最高の貢献率は 1 -4由来の 1個体における約 80%であつた。
この結果より、 ヒ ト 14番染色体またはその断片を保持する G418耐性 ES細胞株 （ 卜 4、 1 -5, 3- 1、 3-2) はキメラ形成能を保持している、 すなわちマウス個体 の正常組織に分化する能力を保持していることが確認された。
(実施例 11) ヒ ト 14番染色体断片を保持する ES細胞由来キメラマウスにおける ヒ 卜 14番染色体断片の保持確認
(実施例 10) で得られたキメラマウスにおけるヒ 卜 14番染色体部分断片の保持 は以下の （1) 〜 （3) により確認した。
( 1) 各種組織由来 DNAを用いた PCR解析
キメラマウスのうち 3-1由来の i個体 （K3- 1- 1 ： キメラ率約 25%) について （ 実施例 4) と同様に尻尾よりゲノム DNAを調製した。 それを铸型とし、 （実施例 9) で示した 14番染色体解析用ブライマ一のうち 3-1で検出された 14種全てにつ いて PCR解析を行なった。 その結果、 14種すべてについて期待される増幅産物が 検出された （図 10) 。
さらに、 同じ個体 （K3- 1 - 1) について脳、 腎臓、 脾臓、 心臓、 肝臓、 胸腺から Puregene DNA I so lat i on Ki tによりゲノム DNAを取得し、 それぞれの組織につい て、 IGMプライマ一 （実施例 9) を用いた PCR解析を行なった。 その結果全ての 組織において期待される増幅産物が確認された （図 11) 。 PCR産物は 2¾ァガロー スゲルにて電気泳動した後、 臭化工チジゥム染色して検出した。 図 11において、 各レーンは左から B：脳、 K： 腎臓、 Sp：脾臓、 H：心臓、 L：肝臓、 Th：胸腺 、 pc : ヒ ト繊維芽細胞 （HFL-1) DNA (陽性コン トロール） 、 nc :非キメラマウ ス尻尾 DNA (陰性コン トロール） 、 M : マーカ一 （Hi nd I I ^^l: ;i DNA + Hae H ! 消化 0 X174DNA, 宝酒造） を示す。
(2) 尻尾由来繊維芽細胞の G418耐性試験
キメラマウスのうち、 3-2由来の 2個体 （K3- 2- 1 ： キメラ率約 25%, K3- 2- 3： キ メラ率約 50%) 、 1 -4由来の 1個体 （K1 - 4- 1 ： キメラ率約 80%) について尻尾か ら以下のように繊維芽細胞を調製した。 DNA調製 （実施例 4) と同様に 3〜6週 令のキメラマウスの尻尾を 5mm~ 10inm切断し、 PBS/lmM EDTAで数回洗浄した後、 メスで切れ込みをいれて表皮を除去し、 内部の組織をメスで細かく切り刻む。 組 織細片を 5miの PBS/lmM EDTAをいれたチューブに移し、 30分〜 1 時間室温静置す る。 その後、 1mlの PBS/EDTAを残して上清を取り除き、 1mlの 0. 25¾トリブシン ZPBSを加え、 5〜10分間室温でタッピングあるいはピベッティ ングしながら組織 をよくほぐす。 1000'rpm, 10分間遠心し、 沈殿を 2mlの DMEM ( 10¾FCS) に懸濁し、 35隱シャーレに播種する。 7〜10日の培養後、 トリプシン処理により細胞をシャ ーレからはがし、 シャーレあたり約 10 1個の細胞を 35MIシャーレ 4枚に播種し、 うち 2枚に 400 / g/mlの G418を加え、 5〜7日間培養し、 それぞれのシャーレの 生胞数をカウン トする。 この条件で、 野生型 I CRマウス由来の繊維芽細胞は、 G4 18存在下でほぼ 100¾死滅する。 非選択培地での生細胞数に対する選択培地での生 細胞数の割合は、 G418耐性繊維芽細胞の増殖速度が 2つの条件で同等であると仮 定すれば、 G418耐性 ES細胞株由来繊維芽細胞の繊維芽細胞集団における貢献率を 反映していると考えられる。 この結果、 （図 12) に示した通り、 3個体共 G418 耐性の繊維芽細胞の存在が認められた。 図 12において、 耐性率はそれぞれの個体 について 2組の選択 Z非選択 35mniシャーレから得られた値を平均した。 I CR は野 生型 ICRマウスを示す。
(3) 尻尾由来 G418耐性繊維芽細胞の F I SH解析
(実施例 2) と同様な方法で、 上記 （2) で得られた G418耐性繊維芽細胞 （K3 - 2 - 3，K1 - 4- 1由来） の F ISH解析を行なった。 プローブは HFい 1細胞 （実施例 1) より 抽出したヒ ト全 DMAを F ITC標識した （松原ら， F ISH実験プロ 卜コール， 秀潤社， 1 994) ものを用いた。 その結果、 2個体共、 ほとんどの分裂像に独立したヒ 卜染色 部分断片が観察された。
これらの結果より、 ヒ ト 14番染色体部分断片を保持した TT2細胞株はマウス個 体において種々の正常組織に貢献し、 かつヒ 卜 14番染色体部分断片を保持してい ることが確かめられた。
(実施例 12) ヒ ト 2番染色体部分断片の ES細胞への導入
染色体供与細胞として、 （実施例 1) で得られたヒ 卜 2番染色体部分断片を保持 するマウス A9細胞 W23 (以下 A9/#2 W23、 という） を用いた。 染色体受容細胞とし てはマウス ES細胞株 TT2 (実施例 9) を用いた。 ミ クロセル融合実験および G418耐 性株の選択は （実施例 2 ) と同様に行なった。 薬剤耐性株の出現頻度は TT2細胞 10 ' 個あたり 1〜3個であった。 薬剤耐性株の凍結保存、 ゲノム DNA取得は （実施例 2 ) と同様に行なった。 薬剤耐性株 5-1、 5-2、 5- 3におけるヒ 卜 2番染色体部分断片の 保持は以下の （1) 、 (2) により確認した。
(1) PCR解析 ―'
薬剤耐性株ゲノム DNAを鋅型としてヒ ト 2番染色体上に存在する遺伝子 （Gene tic Maps,前記） のうち、 染色体供与細胞 A9/#2 W23において検出された C Λ；、 FABP1の存在を PCR法により検出した。
各プライマ一について PCR増幅を行なった結果、 3株共に、 両方のプライマ— について期待される増幅産物が確認された。
(2) フルォレツセンス in situハイブリダィゼ一シヨ ン （FISH)
FISH解析は （実施例 2) と同様な方法で、 ヒ ト 2番染色体特異的プローブ （CH R0 0S0 E PAINTING SYSTEM, Cambio社） を用いて行なった。 その結果、 3株すベ てのほとんどの分裂像において、 ヒ ト 2番染色体部分断片が独立した染色体とし て検出された。 その大きさは A9/#2 W23で観察されたものと同等であった。
以上の実験により、 得られた G418耐性株はヒ ト 2番染色体部分断片を保持する ことが確かめられた。
(実施例 13) ヒ ト 2番染色体断片を保持する ES細胞からのキメラマウス作製
(実施例 12) で得られ、 ヒ ト 2番染色体部分断片を保持していることが確認さ れた G418耐性 ES細胞株 5- 1を凍結ス 卜ックより立ち上げ、 ICRあるいは MCH(ICR) (日本クレア社） 雄雌マウスの交配により得られた 8細胞期胚に胚あたり 10〜12 個注人した。 E S培地 （実施例 9) で一晩培養して胚盤胞に発生させた後、 偽妊 娠処理後 2.5日の仮親 ICRマウス （日本クレア社） の子宮に片側の子宮あたり約 10個のィ ンジヱクショ ン胚を移植した。
キメラ作製の結果を （表 4) に示す。 表 4. ヒ ト 2番染色体 （断片） を保持する TT2 細胞株からのキメラマウス作製
ES細胞株/ G418耐性 ES細胞を注入し 子マウス キメラマウス 毛色への貢献率 ヒ卜染色体 株番号 ' た 8細胞期胚数 の数 の数 〜20% 20- 50¾ 50- 80¾
TT2/#2 5-1 264 51 18
(W23)
計 264個の注入胚を移植した結果、 51匹の子マウスが誕生した。 キメラ個体は 、 毛色において宿主胚 GCR) 由来の白色の中に TT2細胞由来の野生色 （濃茶） が認められるかどうかにより判定される。 誕生した 51匹のうち毛色に明らかに野 生色の部分のある、 すなわち、 ES細胞の貢献の認められる個体は 18匹であった。 また、 最高の貢献率は約 80%であった。 7
この結果より、 ヒ ト 2番染色体部分断片を保持する G418耐性 ES細胞 （5-1) は
5
キメラ形成能を保持している、 すなわちマウス個体の正常組織に分化する能力を 保持していることが確認された。 6
(実施例 14) ヒ 卜 14番染色体断片導入キメラマウス血清におけるヒ ト抗体重鎖の 検出
血清中のヒ 卜抗体濃度をェンザィムリ ンク ドィ厶ノ ソルベン トァッセィ（EUSA ) を用いて測定した。 ELISA は以下に記載されている方法に従った。 富山 ·安東 、 単クローン抗体実験マニュアル、 講談社、 1987; 安東 ·千葉、 単クローン抗体 実験操作入門、 講談社、 1991; 石川、 超高感度酵素免疫測定法、 学会出版センタ 一、 1993； Ed Harlow and David Lane, Antibodies A Laboratory Manual, Col d Spring Harbor Laboratory, 1988; A. Doyle and J. B. Griffiths, Cell & Ti ssue Culture: Laboratory Procedures, John Wiley & Sons Ltd., 1996 0 これ らの文献に記載の方法を参考にして、 測定系によっては反応時間や温度を 4 で 終夜行うなどの改良を行つた。 測定しょうとするヒ ト免疫グ口ブリ ンに対する抗 体あるいは抗原を、 0.5 から 10 zg/ml程度に（100から 5000倍） に希釈し、 ELISA プレー トを 4 °Cで一晚コーティ ングした。 血清試料の測定では、 ブロッキング、 試料および標識抗体の希釈に 5%マウス血清 （シグマ、 M5905)を添加した PBSを、 ハイプリ ドーマ培養上清の測定には 1%牛胎児血清を添加した PBSを用いた。 20倍 にキメラマウス血清を希釈する場合には PBSを用いて希釈した。 コーティ ングし たプレー トを洗浄した後、 ブロッキングを 1時間以上行つた。 プレー 卜を洗浄後 、 試料を加え 30分以上インキュベートした。 プレー ト洗浄後 100 から 5000倍に希 釈した酵素標識抗ヒ 卜免疫グロプリ ン抗体を加えて、 1時間以上ィンキュベ一.ト した後、 プレートを洗浄し基質液を加えて発色させた。 また測定系によって、 基 本的には同じ操作で、 ピオチン標識した抗体を用い、 プレー ト洗浄後これにアビ ジン一酵素複合体を加えてィンキュベー トした後洗浄し基質液を加えた。 マイク 口プレー トリーダ一 （バイオテック、 EL312e) で吸光度を測定した。
生後 29日から 35日のキメラマウス （実施例 10、 K3-1-2, K3-2-2, K3-2-3) より 採血し EUSAで解析した。 50mMの炭酸一炭酸水素バッファ一 pH9.6で希釈した抗 ヒ ト IgMマウスモノクローナル抗体 （シグマ， 16385) を 96穴マイクロタイ夕ープ レー 卜にコーティ ングし、 マウス血清 （シグマ、 M5905) を加えた PBSで希釈し た血清試料を加えた。 次いでペルォキシダーゼ標識抗ヒ ト IgMャギ抗体 （Tago，2 392)を加えてインキュベートした後、 ABTS基質 （Kirkegaard & Perry Laborator ies Inc., 506200) の添加により酵素活性を 405nmの吸光度で評価した。 精製さ れたヒ ト IgM抗体 （オルガノ ン ' テク二力， 6001-1590 ) またはヒ ト IgG抗体 （ シグマ， 14506)を標準とした。 標準はマウス血清を添加した PBSで段階的に希釈 した。 またヒ 卜 IgG測定には抗ヒ ト IgGャギ抗体 （シグマ， 13382) をプレート に固定し、 ペルォキシダーゼ標識抗ヒ 卜 IgGャギ抗体 （シグマ， A0170) で検出 した。 その結果を （表 5 ) に示す。 ヒ ト IgMと IgGは共に検出された。
また生後 27日、 34日、 41日の 3回にわたりヒ ト 14番染色体断片を保持したキメ ラマウス （実施例 10、 K3-1-1, K3-2-1) に、 PBSに溶解したヒ ト血清アルブミ ン
(HSA， シグマ， A3782) 2mlをアジュバン ト （MPL+TDM Emulsion, RIBI Immunoche m Reseach Inc. ) と混合しその 0.25mg/ml を 0.2 mlを免疫した。 このキメラマ ウス血清も同様に EL1SAによって解析した。 その結果を （図 13、 図 14) に示す。 結果は、 HSAで免疫したキメラマウス血清中のヒ 卜抗体濃度は免疫後上昇し、 個 体 K3- 1-1ではヒ ト lgM18^g/mlと IgG2. が免疫後 17日目の血清中に検出 された。 ヒ ト染色体を導人していないマウスの血清ではヒ 卜抗体の力価は有意で はなかった。 表 5. キメラマウス血清中のヒ ト抗体濃度（EL1SA) キメラマウス I G (mg/1) IgM (mg/1)
Figure imgf000055_0001
(実施例 15) ヒ ト 14 番染色体導入キメラマウスからのヒ ト抗体重鎖産生ハイ プリ ドーマ取得
(実施例 14) においてヒ トアルブミ ンで免疫したキメラマウス（K3- 1-1， 実施 例 14) から生後 44日目に脾臓を取り出し、 ミエローマ細胞と細胞融合し、 ハイブ リ ド一マを作製した。 ハイプリ ドーマの作製法は く安東、 単クローン抗体実験操 作人門、 講談社サイェンティフイ ク， 1991〉 に記された方法に従い、 ミエ口一マ 細胞としては、 P3X63- Ag.8.653 (大日本製薬より購人、 05-565) を使用した。 96 穴プレート 10枚にまき込み、 1週間培養後培養上清を ELISA法で解析した。 EL1S
A法は抗ヒ HgMマウスモノクローナル抗体 （シグマ、 16385) をプレートに固 定化して実施例 14と同様に行ない、 陽性のクローンを 6個得た。 また HSAを抗原 とし 50mMの炭酸一炭酸水素バッファー pH9.6で濃度 5〃g/mlの溶液とし、 ELISA プレー卜の全ゥエルに 100/ 1づっ分注した。 ペルォキシダ一ゼで標識した抗ヒ ト IgA+IgG+IgMャギ抗体 (Kirkegaard & Perry Laboratories Inc. , 04-10-17) を用いて検出した。 プレー ト 10枚中陽性のクローンを 1つ確認した。 このクロ一 ンは 6個のヒ ト igM陽性クローンのうちの 1つであつた。 このクローン （H4B7) をさらに培養し、 培養上清を希釈し HSAを抗原として上述のようにペルォキシダ ーゼ標識抗ヒ 卜 I gMャギ抗体 （Tago, 2392) を用いて EL ISAを行なったところ 、 培養上清の希釈率の増加にともなって吸光度の減少が認められた。 一方ヒ ト l g (オルガノ ン ' テク二力， 6001 - 1590)を培地によって 2 ^ g/mlに希釈した試料 では希釈率によらず吸光度は低かった。 これはハイプリ ドーマ H4B7が生産する抗 体が HSAに特異性のある抗体であることを示唆するものである （図 15) = 図 15に おいて、 横軸は培養上清試料の希釈率を縦軸は 405nmにおける吸光度'
(実施例 16) G418耐性マーキングされたヒ ト 2番染色体断片のピューロマイシ ン耐性による再マーキング
G418耐性で標識されたヒ ト 2番染色体断片を保持する A9細胞 （W23) ( 実施例 1 、 図 1参照） を iOOnrniシャーレで G418 (800 z g/ml ) を含む選択培地 （10% FBS 、 DMEM) で培養した。 ピューロマイシン耐性遺伝子を含むプラスミ ド pPGKPuro
(WH ITEHEAD I NSTITUTE, Dr. Pe ter W. La i rd から分与） をトランスフヱクシヨン 前に制限酵素 Sai l (宝酒造） で線状化した。 細胞をトリプシン処理し、 5x10 s 個 /mlとなるようにダルベッコのリ ン酸バッファ一 （PBS) に懸濁してから 10 gD NA存在下でジーンパルサー （バイオラッ ド） を用いてエレク ト口ポレーシヨン （ 実施例 1参照） を行なった。 25 / Fの容量で 1000Vの電圧を 4 mm長のエレク トロ ポレーシヨンセル （実施例 1 ) を用いて室温で印加した。 エレク トロボレ一ショ ンした細胞を 100mmシャーレ 3〜6枚に播種した。 1 日後に 10〃 g/mlのピュー口 マイシン （シグマ， P- 7255) および G418 (800 ^ g/ml ) を含む二重選択培地と置 き換えた。 2〜3週間後に生じたコロニー 200個程度を一つの集団としてまとめ た。 この細胞を 3つの集団についてそれぞれ 25cm2フラスコ 2〜 3本中で培養し 、 ミ クロセルを形成させ 25cm2フラスコで培養したマウス A9細胞と実施例 1と同 様に融合した。 100議シャーレ 2枚に移し G418とピューロマイシンを含む上記の 二重選択培地で培養し、 3つの集団のうち 1つの集団から 2つの二重薬剤耐性ク ローンが得られた。 このクローンではヒ ト 2番染色体断片にピュー口マイシン耐 性マーカ一が導人された可能性が高い。
(実施例 17) ヒ ト染色体導入 ES細胞における導入ヒ ト染色体倍加
G418耐性遺伝子でマーキングされたヒ ト 14番染色体断片を保持する ES細胞株 ( E 14/# 14-36 ) を、 高濃度の G418を添加した培地中で培養することにより、 ヒ ト染 色体が倍化した ES細胞のクローンを取得した （バイオマニュアルシリーズ 8、 ジ —ン夕一ゲティ ング、 羊土社、 1995) 。 G418耐性マウス初代細胞 （ライフテッ ク オリエンタルより購—入） をマイ トマィシン処理することなく I OOIMIシャーレに播 種し栄養細胞とした。 この 100mmシャーレに E 14/# 14- 36 を播種し、 半日後 G418 濃度 I 6 m g/mlの培地と交換した。 1〜2日毎に培地交換し 1週間後に G418 濃度 を 10 m g/m lとして培養を続け、 生じたコロニーの中から 15個を取り出し培養し、 染色体をヒ 卜 14番特異的プローブ （実施例 9参照） を用いて F I SH解析した。 結果 として 8 クローンでヒ 卜 14番染色体断片が倍化していた。
(実施例 18) ヒ ト 2番染色体部分断片及び 14番染色体部分断片を同時に保持する マウス ES細胞株の取得
(実施例 16) において取得した二重薬剤耐性クローンのうち PG1をミクロセル 供与細胞、 野性型 A9細胞を受容細胞としたミ クロセル移入実験により、 PG 1が保 持するヒ ト 2番染色体部分断片がさらにピュー口マイシン耐性遺伝子によりマ一 キングされていることを確認した。 ミ クロセル取得及び A9細胞との融合は （実施 例 1 ) と同様に行なった。 その結果、 ミ クロセル融合 10曰後に計 59個の G418耐性 コロニーが出現した。 これらのコロニーについて 8〃 g/mlのピュー口マイシンを 含む培地に交換後、 さらに 3日間培養したところ、 45個 （76%) のコロニーが生 存した。 ミ クロセル法においては、 1つの受容細胞に、 多くの場合 1本あるいは 少数の染色体のみが移入されることから、 両耐性遺伝子が高率に同時に移入され ることは、 すなわち、 PG1が保持する G418耐性標識されたヒ ト 2番染色体部分断 片がピューロマイシン耐性遺伝子によりマ一キングされていることを示している 。 さらに、 ヒ ト 2番染色体部分断片上の各マーカー遺伝子検出のため、 A9/#2 W2 3 (G418耐性のみ ： 実施例 16) については pSTneoB (実施例 1 ) 、 PG 1について は pPGKPuro (実施例 16) をプローブとした F I SH解析を行なった （松原ら， F I SH実 験プロ トコ一ル， 秀潤社， 1994) 。 その結果、 A9/#2 W23では （実施例 12) で確 認されたヒ ト 2番染色体部分断片のそれぞれの姉妹染色分体上に 1個づつ、 計 2 個のシグナルが観察された。 これは、 ヒ ト 2番染色体部分断片上の 1箇所に pSTn eoBが挿入されていることを示す。 また、 PG1では同等の大きさの染色体断片上 に計 4個のシグナルが観察された。 pSTneoBと pPGKPuroはべクター部分で相同の 配列を持つので、 pPGKPuroプローブでは pSTneoBも検出される。 すなわち、 PG1 で観察された 4個のシグナルのうち、 2個は pSTneoB、 一方の 2個は pPGKPuro由 来のシグナルと考えられる。 この結果より、 PG1が保持するヒ ト 2番染色体部分 断片は、 G418耐性、 ピューロマイ シン耐性両者によりマ一キングされていること が確認された。
ヒ 卜 2番染色体部分断片、 14番染色体部分断片を同時に保持するマウス ES細胞 取得のため、 染色体供与細胞としてこの PG1細胞株を用いた。 染色体受容細胞と してはすでにヒ 卜 14番染色体部分断片を保持している G418耐性 TT2細胞株 1 -4 ( 実施例 9) を用いた。 ミ クロセル融合実験およびピューロマイシン耐性株の選択 は 0. 75 g/mlのピューロマイシン濃度で他は （実施例 9) の G418耐性株選択の場 合と同様に行なった。 この結果出現したピュー口マイシン耐性株の出現頻度は i - 4細胞 107個あたり 3〜7個であった。 これらのピュー口マイシン耐性株は 300 g/mlの G418存在下でも増殖することから G418耐性も同時に保持していることが 確認された。 二重薬剤耐性株の凍結保存、 ゲノム DNA取得は （実施例 2) と同様 に行なった。 ヒ ト 2番染色体部分断片及び、 ヒ ト 14番染色体部分断片の保持は二 重薬剤耐性株 PG5、 PG15、 PG16については以下の （1) により、 PG15については さらに （2) により確認した。
( 1) PCR解析
二重薬剤耐性株ゲノム DNAを铸型としてヒ ト 2番、 14番染色体上に存在する遺 伝子 （Gene t i c Maps,前記） のうち、 2番染色体については （実施例 12 ； A9/S2 W23) 、 14番染色体については （実施例 9 ； TT2/#14 1-4) で存在が確認されて いる各プライマ一について PCR増幅を行なった結果、 3株共に、 全てのプライマ 一について期待される増幅産物が確認された。
(2) フルォレツセンス i n s Uuハイブリダィゼーシヨ ン （F ISH)
F ISH解析は （実施例 11) と同様に、 ヒ ト全 DNAを F 1TC標識したものをプローブ として用いて行なった。 その結果、 ほとんどの分裂像において、 大小 2つのヒ 卜 染色体断片が確認された。 大きい方は （実施例 9； TT2/#14 1 -4) でヒ 卜 14番染 色体特異的プローブにより確認された部分断片と、 小さい方は （実施例 12 ; ΤΤ2/ =2 5- 1 ) でヒ 卜 2番染色体特異的プローブにより確認された部分断片と同等の大 きさであった。 （図 16) にその結果を示す。 図中輝度の低い染色体はマウス由来 のもの、 F ITCの蛍光により輝度の高い大小 2つの染色体断片 （矢印にて指示） は ヒ ト由来のものであり、 それぞれヒ ト 14番、 2番染色体部分断片と考えられる。 以上の実験により、 得られた二重耐性 ES細胞株はヒ ト 2番染色体部分断片、 14 番染色体部分断片を同時に保持することが確かめられた。
(実施例 19) ヒ 卜 2番染色体部分断片及び 14番染色体部分断片を同時に保持する マウス ES細胞株からのキメラマウス作製
(実施例 18) で得られ、 ヒ ト 2番染色体部分断片及び 14番染色体部分断片を保 持していることが確認された G418、 ピューロマイシン二重耐性 TT2細胞株 PG5、 PG15、 PG16を凍結ストックより立ち上げ、 I CRまたは MCH ( R) (日本クレア社） 雄雌マウスの交配により得られた 8細胞期胚に胚あたり 10〜12個注人した。 ES細 胞用培地 （実施例 9) で一晩培養して胚盤胞に発生させた後、 偽妊娠処理後 2. 5 日の仮親 I CRマウス （日本クレア社） の子宮に片側の子宮あたり約 10個のイ ンジ ヱクション胚を移植した。
キメラ作製の結果を （表 6 ) に示す。 表 6 . ヒ 卜 2番染色体部分断片及び 14番染色体部分断片を同時に保持するマウス ES細胞株からのキメラマウス作製
ES細胞株/ 2重耐性 ES細胞を注入し 子マウス キメラマウス 毛色への貢献率 ヒト染色体 株番号 た 8細胞期胚数 の数 の数 〜10% 10- 50% 50 〜
TT2/ PG5 160 26 8
#14+#2 PG15 168 15 3
PG16 223 32 12 計 551個の注入胚を移植した結果、 73匹の子マウスが誕生した。 キメラ個体は、 毛色において宿主胚 OCR) 由来の白色の中に TT2細胞由来の野生色 （濃茶） が 認められるかどうかにより判定される。 誕生した 73匹のうち毛色に明らかに野生 色の部分のある、 すなわち、 ES細胞の貢献の認められる個体は 23匹であった。 この結果より、 ヒ ト 2番染色体部分断片及び 14番染色体部分断片を保持する ES 細胞株 （PG5、 PG15、 PG16) はキメラ形成能を保持している、 すなわちマウス個 体の正常組織に分化する能力を保持していることが確認された。
(実施例 20) ヒ ト 2番染色体部分断片及び 14番染色体部分断片を同時に保持する
ES細胞由来キメラマウス血清におけるヒ ト抗体の検出
(実施例 19) で作製したキメラマウスのうち、 KPG- 15 (9週齢； PG5由来、 キ メラ率 10 ) 、 KPG-18 (5週齢： PG5由来、 キメラ率 10%) の 2匹に対して、 PB
Sに溶解したヒ ト血清アルブミ ン （HSA、 シグマ、 A3782) とアジュバント （MP
L!TDM Emulsion, RIBI Immunochem Reseach Inc. ) とを混合して 0.25mg/mlの HS
A溶液を調整し 0.2mlを免疫した。 免疫直前、 及び 8日後のキメラマウスより採 血し、 血清中のヒ 卜抗体 鎖およびヒ ト抗体/ 鎖を ELISA法を用いて検出した （ 実施例 14参照） 。 50mMの炭酸一炭酸水素バッファー pH9.6で希釈した抗ヒ ト抗体 鎖ャギ抗体 （VECTOR LABORATORIES, INC.. AI-3060) を 96穴マイクロタイタ一 プレー トにコーティ ングし、 血清試料を加え、 次いでピオチン標識抗ヒ ト抗体 c 鎖ャギ抗体 （VECTOR LABORATORIES, INC.. BA-3060) を加えてインキュベー トし さらにピオチン化ヮサビペルォキシダ一ゼとアビジン DHの複合体 （VECTOR LABOR
ATORIES, INC. , Vectastain ABCキッ 卜 PK4000) を加えてインキュベートした後、 ペルォキシダ一ゼ基質として 3, 3',5, 5'-テトラメチルベンチジン （TMBZ、 住友べ 一クライ ト、 Mい 1120T) の添加により酵素活性を 450nmの吸光度で評価した。 精 製された /c鎖を持つ濃度既知のヒ 卜 igG (シグマ、 卜 3889) を標準としマウス血 清を添加した PBSで段階的に希釈した。 鎖については 50mMの炭酸一炭酸水素バ ッファー ρΗ9· 6で希釈した抗ヒ ト //鎖マウスモノクローナル抗体 （シグマ、 1-63
85) を 96穴マイクロタイ夕一プレートにコ一ティ ングし、 血清試料を加え、 次い でペルォキシダ一ゼ標識抗ヒ 卜 鎖マウス抗体 （The Binding Si te Limited, M
P008) を加えてインキュベー トした後、 TMBZ (住友べ一クライ ト、 Mい 1120T) の 添加により酵素活性を 450nmの吸光度で評価した。 精製された//鎖を持つ濃度既 知のヒ ト IgM (オルガノン ·テク二力、 600卜 1590) を標準としマウス血清 （シ グマ、 ： V15905) を添加した PBSで段階的に希釈した。 その結果、 2個体とも免疫 前においてヒ ト抗体 /鎖、 /c鎖両者が検出され、 その血清中濃度は、 免疫後上昇 した （表 7、 表 8 ) 。 表 7. キメラマウス K P G 1 5中のヒ ト抗体濃度 （E L I S A)
I gM (m gZ l ) I g κ (m g/ 1 ) 免疫前 0. 1 9 1. 6
免疫後 8日目 0. 7 5 1. 7
表 8. キメラマウス K P G 1 8中のヒ ト抗体濃度 （ E L I S A )
I g M (m g/ 1 ) I g K (mg/ 1 ) 免疫前 0. 2 9 0. 5 7 免疫後 8日目 3. 4 0. 8 7
この結果より、 ヒ ト 2番染色体部分断片及び 14番染色体部分断片を保持する ES 細胞由来キメラマウスにおいてヒ ト抗体重鎖、 軽鎖遺伝子は機能することが確認 された。
(実施例 21) ヒ 卜 14番染色体断片導入キメラマウス血清における抗 HSAヒ ト抗体 ァ鎖の検出
(実施例 10) と同様にして作製したヒ ト 14番染色体断片を保持したキメラマウ ス （K9、 Kll；共に ΤΤ2細胞株 3-2由来、 キメラ率はそれぞれ 50?ό、 30¾) に対 して、 生後 79日、 93日、 107日、 133日の 4回 （Κ9) 、 または生後 74日、 88日、
111日 （K11) の 3回にわたり （実施例 20) と同様に HSAを免疫した。 このキメ ラマウス血清中のヒ 卜血清アルブミ ンに対するヒ トァ鎖を含む抗体を EL 1 SA法に よって検出した （実施例 14参照） 。 50mMの炭酸一炭酸水素バッファー pH9. 6で希 釈した HSA (シグマ、 A 3782) を 96穴マイクロ夕イタ一プレー トにコ一ティ ング し、 試料を加え、 次いでペルォキシダーゼ標識抗ヒ 卜 I gGマウス抗体 （ファーミ ンジヱン、 08007E) を加えてインキュベートした後、 ペルォキシダ一ゼ基質とし て 0—フヱニレンジァミ ン （0PD、 住友ベークライ ト、 Mい 11300) の添加により 酵素活性を 490nmの吸光度で評価した。 HSAで免疫したキメラマウス血清中の抗. HSAヒ ト I gGの力価は免疫後上昇した。 対照 ICRマウスでは、 HSA免疫後の抗 HS Aヒ ト I gGの力価はバックグランドレベルであった。 結果を （図 17) に示した。 図 17において横軸はキメラマウスに HSAを免疫してからの日数を、 縦軸は 490nm における吸光度を示した。 この結果より、 ヒ ト 14番染色体部分断片を保持するキ メラマウスにおいて、 HSA抗原刺激に対して抗原特異的ヒ ト I gGの抗体価上昇が 起こることが確認された。
(実施例 22) ヒ 卜 22番染色体断片導入キメラマウス血清におけるヒ ト抗体； I鎖の 検出
9ヶ月齢のキヌラマウス （実施例 3、 K22-7； キメラ率 10%) より採血し、 血 清中のヒ ト抗体； 鎖を EL 1 SA法を用いて検出した （実施例 14参照） 。 50mMの炭酸 炭酸水素バッファ一 pH9. 6で希釈した抗ヒ 卜抗体 λ鎖ャギ抗体 （VECTOR LABOR ATOR I ES, INC. , A I -3070) を 96穴マイクロタイタープレー トにコーティ ングし、 血清試料を加え、 次いでピオチン標識抗ヒ ト抗体； I鎖ャギ抗体 （VECTOR LAB0RAT OR I ES, INC. , ΒΑ-3070) を加えてインキュベートしさらにピオチン化ヮサビペル ォキシダ一ゼとアビジン DHとの複合体 （VECTOR LABORATOR I ES, INC. , Vec tas tai n ABCキッ ト ΡΚ4000) を加えてインキュベー トした後、 ペルォキシダ一ゼ基質とし て TMBZ (住友べ一クライ 卜、 Mい 1120T) の添加により酵素活性を 450nmの吸光度 で評価した。 精製された； I鎖を持つ濃度既知のヒ ト I gG (シグマ、 1 -4014) を標 準としマウス血清を添加した PBSで段階的に希釈した。 180ng/mlのヒ ト I gGに相 当する濃度のヒ ト抗体； I鎖がキメラマウス中に検出された。 この結果より、 ヒ ト 22番染色体を保持するキメラマウスにおいてヒ ト抗体; I鎖遺伝子が機能すること が確認された。 (実施例 23) ヒ ト 2番染色体断片導入キメラマウス血清におけるヒ ト抗体/ 鎖の 検出
5週齢のキメラマウス （実施例 13、 1(2-8、 キメラ率は 70¾) および 9週齢のキ メラマウス （実施例 13、 K2- 3、 K2-4、 K2-12, キメラ率はそれぞれ 50¾、 20¾, 80¾) より採血し、 血清中のヒ ト抗体/ c鎖を ELISA法を用いて検出した （実施例 14) 。 50πιΜの炭酸一炭酸水素バッファー ρΗ9.6で希釈した抗ヒ 卜抗体 鎖ャギ抗 体 （VECTOR LABORATORIES, INC. , ΑΙ-3060) を 96穴マイクロタイタープレートに コ一ティ ングし、 血清試料を加え、 次いでピオチン標識抗ヒ ト抗体/ c鎖ャギ抗体 (VECTOR LABORATORIES, INC. , ΒΑ-3060) を加えてインキュベー トしさらにピオ チン化ヮサビペルォキシダ一ゼとアビジン DHの複合体 （VECTOR LABORATORIES, IN 、 Vectastain ABCキッ ト） を加えてインキュベートした後、 TMBZ (住友べ一ク ライ ト、 Mい 1120T) の添加により酵素活性を 450nmの吸光度で評価した。 精製さ れた 鎖を持つ濃度既知のヒ ト IgG (シグマ、 1-3889) を標準としマウス血清を 添加した PBSで段階的に希釈した。 結果を （表 9) に示した。 表 9. キメラマウス中のヒ ト抗体/ c鎖濃度 （E L I SA)
キメラマウス Ig c (m gZ 1 )
K 2 - 3 1 2 4
Κ 2 - 4 8 5
Κ 2 - 8 2 5
Κ 2 - 1 2 5 6
またヒ ト 2番染色体断片を保持したキメラマウス （実施例 13、 Κ2- 3、 および Κ2
-4) に生後 66日、 80日、 102日の 3回にわたり （実施例 20) と同様に HSAを免疫 した。 またキメラマウス （Κ2- 12) に生後 63日、 77日、 91日、 116日の 4回にわ たり、 このキメラマウス血清中の HSAに対するヒ ト抗体/ 鎖を ELISA法によって 検出した （実施例 14参照） 。 50mMの炭酸一炭酸水素バッファー ρΗ9.6で希釈した HSA (シグマ、 A 3782) を 96穴マイクロタイ夕一プレー 卜にコ一ティ ングし、 試 料を加え、 次いでビォチン標識抗ヒ 卜抗体/ 鎖ャギ抗体 （VECTOR LABORATORIES, INC.、 BA-3060) を加えてインキュベートしさらにピオチン化ヮサビペルォキシ ダ一ゼとアビジン DHの複合体 (VECTOR LABORATORIES, INC. , Vectastain ABCキッ ト） を加えてインキュベー トした後、 ペルォキシダ一ゼ基質として 0PD (庄友べ —クライ ト、 ML - 11300) の添加により酵素活性を 490nmの吸光度で評価した。 HS Aで免疫したキメラマウス血清中の抗 HSAヒ ト / c鎖の力価は免疫後上昇した 3 — 方対照 ICRマウスでは、 HSA免疫後の抗 HSAヒ ト抗体/ 鎖の力価はバックグラン ドレベルであった。 結果を （図 18) に示した。 図 18において横軸はキメラマウス に HSAを初めて免疫してからの日数を、 縦軸は 490nmにおける吸光度を示した。 これらの結果より、 ヒ 卜 2番染色体部分断片を保持するキメラマウスにおいてヒ 卜抗体/ c鎖遺伝子が機能し、 さらには HSA抗原刺激に対して抗原特異的ヒ 卜 ig の抗体価上昇が起こることが確認された。
(実施例 24) ヒ ト 14番染色体導人キメラマウスからのヒ 卜抗体重鎖 （ 鎖もしく は Ί鎖） 産生ハィブリ ド一マ取得
(実施例 21) において HSAで免疫したキメラマウス K9から生後 136日目に脾臓 を取り出し、 ミエローマ細胞と細胞融合し、 ハイプリ ドーマを作製した。 ハイブ リ ドーマの作製法は く安東 ·千葉、 単クローン抗体実験操作人門、 講談社サイェ ンティフイ ク， 1991〉 に記された方法に従い、 ミエローマ細胞としては、 Sp- 2/0 -Agl4 (大日本製薬、 05-554) を使用した。 培養液に ORIGEN Hybridoma Cloning
Factor (HCF、 ボクスィ * ブラウン） を 10%添加し 96穴プレー卜 8枚にまき込 み、 3日後に培養液中に G418を lmg/ml添加した。 1〜3週間培養後の培養上清を
ELISA法で解析した （実施例 14参照） 。 鎖は 50mMの炭酸一炭酸水素バッファー pH9.6で希釈した抗ヒ ト〃鎖マウスモノクローナル抗体 （シグマ、 卜 6385) を 96 穴マイクロタイタープレー 卜にコーティ ングし、 PBSで希釈した試料を加え、 次 いでペルォキシダーゼ標識抗ヒ ト〃鎖マウス抗体 （The Binding Site Limited, P008) を加えてインキュベートした後、 基質として 2， 2—アジノジ一 （3—ェ チルベンズチアゾリ ン- 6-スルホン酸） ジアンモニゥム塩 （ABTS、 Kirkegaard&P erry Laboratories Inc.、 04-10-17) を用いて検出し 7個の陽性ゥヱルを得た。 ァ鎖については抗ヒ 卜 ァ鎖マウスモノクローナル抗体 （シグマ、 卜 6260) を 96穴 マイクロタイタープレートにコーティ ングし、 PBSで希釈した試料を加え、 次い でペルォキシダーゼ標識抗ヒ ト ァ鎖マウス抗体 （ファーミ ンジヱン、 08007E) を加えてインキュベートした後、 ABTS (K i rkegaard & Perry Labora tor i es I nc. 、 04-10-17) を用いて検出し 2個のヒ ト抗体ァ鎖陽性ゥエルを得た。
(実施例 25) ヒ 卜 2 番染色体導入キメラマウスからのヒ 卜抗体軽鎖産生ハイプリ ド一マ取得
(実施例 23) において HSAで免疫したキメラマウス K2- 3から生後 105日目に脾 臓を取り出し、 ミエローマ細胞と細胞融合し、 ハイプリ ドーマを作製した。 ハイ プリ ドーマの作製法は 〈安東 ·千葉、 単クローン抗体実験操作人門、 講談社サイ ェンティフイク， 1991〉 に記された方法に従い、 ミエ口一マ細胞としては、 P3X6 3Ag8. 653 (大日本製薬、 05-565) を使用した。 培養液に HCF (ポクスィ ， ブラウ ン） を 10¾添加し 96穴プレート 10枚にまき込み、 3日後培養液中に G418を lmg/ml 添加し、 1〜3週間培養しコロニーが出現したゥヱルの培養上清を EL ISA法で解 折した。 EL ISA法は （実施例 23) と同様に行ない、 ヒ ト抗体/ c鎖陽性のクローン を 2個得た。
(実施例 26) G418耐性マーキングされたヒ 卜 22番染色体のピューロマイ シン耐性 による再マーキング
G418耐性で標識されたヒ ト 22番染色体を保持する A9細胞 （A9/#22 7 2；実施例
1で取得） について、 （実施例 16) と同様な方法でヒ 卜 22番染色体のピューロマ イシン耐性による再マーキングを行った。 ァ 2細胞に pPGKPuroをエレク 卜ロボレ
—シヨ ンして得られた二重薬剤耐性株コロニー 200個程度を一つの集団とし、 3 つの集団 （Pl、 P2、 P3) を供与細胞として野生型マウス A9細胞へのミクロセル移 入を行なった。 その結果、 P1より 6個、 P2より 1個、 P3より 3個の二重薬剤耐性 クローンが得られた。 取得した二重薬剤耐性クローンのうち P3由来の 6 - 1をミ ク ロセル供与細胞、 野性型 A9細胞を受容細胞としたミ クロセル移入実験により、 ヒ 卜 22番染色体がさらにピュー口マイシン耐性遺伝子によりマ一キングされている ことを確認した （実施例 18) 。 ミ クロセル取得及び A9細胞との融合は （実施例 1) と同様に行なった。 その結果、 ミ クロセル移入 11日後に 28個の G418耐性コロニー が出現した。 これらのコロニーについて 8 ig/mlのピュー口マイシンを含む培地 に交換した後、 さらに 3日間培養したところ、 21個 （75» のコロニーが生存し た。 ミ クロセル法においては、 iつの供与細胞に、 多くの場合 1本あるいは少数 の染色体のみが移入されることから、 両耐性遺伝子が高率に同時に移入されるこ とは、 すなわち、 6-1が保持する G418耐性標識されたヒ ト 22番染色体がさらにピ ユーロマイシン耐性遺伝子によりマ一キングされていることを示している。
(実施例 27) ヒ ト抗体重鎖を産生するハイプリ ドーマからのヒ ト抗体重鎖可変領 域 cDNAの取得及び塩基配列決定
(実施例 15) において取得されたヒ ト抗体重鎖 （I ） を産生するハイプリ ド 一マのうち、 H4B7 (HSA特異的） 及び H8F9 (非特異的） より、 iSOGEN (二ツボン ジーン） を使用して、 総 RNAを取得した。 cDNAの合成は、 Ready- To-Go T- primed
1st strandキッ ト （Pharmacia社） を用い各々 5 gの総 RNAを使用した。 得 られた cDNAについて下記に示したプライマー （Larrickら， BIO/TECHNOLOGY, 7，
934 -， 1989、 Wordら, Int. Immunol. , 1， 296-, 1989を参考に作製) により PC Rを行ない、 ヒ ト抗体重鎖可変領域を増幅した。
CM1 (ヒ ト IgM定常領域） ： 5' -TTGTATTTCCAGGAGAAAGTG (配列番号 4 5 )
CM2 (同上) ： 5' -GGAGACGAGGGGGAAAAGGG (配列番号 4 6 )
HS1 (ヒ ト重鎖可変領域） ： 5' -ATGGACTGGACCTGGAGG(AG)TC(CT)TCT(GT)C (配列 番号 4 7 ) (8種の混合物）
HS2 (同上) ： 5' -ATGGAG(CT)TTGGGCTGA(GC)CTGG(GC)TTT(CT)T (配列番号 4 8 ) (16種の混合物）
C)CT(CT)CTG (配列番号 4 9 ) (6144種の混合物)
* ( )はその位置の塩基が（ ）内のいずれかからなる混合物であることを示す。
H4B7、 H8F9共に、 1回目の PCRは HS1 X CM1、 HS2XCMK HS3XCM1の 3種
のプライマーの組み合わせについて行い （94°C 1分、 50°C 2分、 72°C 3分、 40サ ィクル、 パーキンエルマ一社、 サ一マルサイクラ一 140使用） 、 その PCR産物を それぞれ HS1XCM2、 HS2 x CM2N HS3 x CM2のプライマ一で再度増幅した （温 度条件は前記同様、 30サイクル） 。 増幅産物は 1.5%ァガロース電気泳動後、 臭化 ェチジゥム染色することにより検出した。 その結果、 H4B7については HS3X 12 のプライマ一で約 490bpの增幅産物が確認された。 また、 H8F9については、 HS3 X CM2プライマ一で微かなバンドが同様の位置に確認されたのでこのプライマ一 で再度増幅した （温度条件は前記同様、 30サイクル） 。 その結果、 増幅産物は非 常に強いシグナルとして検出された。 これらの PCR産物は、 石田ら （遺伝子発現 実験マニュアル、 講談社サイェンティフイ ク、 1995) の方法に従い、 pBlueScrip tl I SK+ (Stratagene社） ベクタ一の Smal部位にクローニングした。 増幅産物の 挿人されたプラスミ ドのうち #2、 3、 #4 (H4B7) 、 1K #13、 #14 (H8F9) に ついて、 自動蛍光シーケンサー （Applyed Bio System社） により、 増幅産物の塩 基配列を決定した。 得られた塩基配列及び予想されるァミノ酸配列をすでに報告 されているヒ ト抗体 VH領域 （Marksら、 Eur. J. Immunol. 21, 985-, 1991) 、 JH領域 （Ravetchら， Cell, 27， 583 -， 1981) の配列と比較した結果、 H4B7、 H8 F9共に、 VH4ファ ミ リー、 JH2の組み合わせからなることが判明した。 この結果 は、 ヒ ト 14番染色体部分断片を保持するキメラマウスにおいて、 完全な機能的ヒ 卜抗体重鎖蛋白質が産生されていることを示している。
(実施例 28) ヒ ト抗体/ c鎖を発現するキメラマウス脾臓からのヒ ト抗体 鎖 cDNA の取得と塩基配列決定
(実施例 13) において取得され、 （実施例 23) においてヒ ト抗体/ c鎖を発現す ることが確認されたキメラマウス K2- 8の脾臓より （実施例 5) と同様な方法で合 成した cDNAについて、 下記のプライマー （Larrickら， BIO/TECHNOLOGY, 7, 934 -， 1989、 Whitehurstら， Nucleic Acids Res.， 20, 4929-, 1992 を参考に作製） により PCRを行ない、 ヒ ト / 鎖可変領域を増幅した。 陰性コントロールとして K2 -8より取得した肝臓由来 cDNA及び、 （実施例 10) の TT2/U4 3- 2由来キメラマウ ス K3-2- 2より取得した脾臓由来 cDNAを用いた。
KC2 (ヒ ト Ig c鎖定常領域) ： 5， -CAGAGGCAGTTCCAGATTTC (配列番号 5 0 )
KC3 (同上) ： 5' -TGGGATAGAAGTTATTCAGC (配列番号 5 1 )
KVMIX (ヒ ト Ig/c鎖可変領域） ：
5' - . T (配列番号 5 2 ) (3456種の混合物）
*( )はその位置の塩基が（ ）内のいずれかからなる混合物であることを示す。
PCRは KVlIXxKC2. KVMIX x KC3プライマーの組み合わせで 94°C 15秒、 55°C 15秒、 72°C20秒、 40サイクル （パーキンエルマ一社、 サ一マルサイ クラ一 9600使 用） の条件で行なった。 増幅産物は 1.5¾ァガロース電気泳動後、 臭化工チジゥム 染色することにより検出した。 その結果、 両者の組み合わせ共に、 期待される約 420bps (KC2) 、 約 450bps (KC3) の長さの増幅産物が検出された。 一方、 2種 の陰性コン トロールでは特異的増幅産物は検出されなかった。 これらの増幅産物 は、 石田ら （遺伝子発現実験マニュアル、 講談社サイェンティフイ ク、 1995) の 方法に従い、 pBlueScriptll SKI (Stratagene社） ベクターの Smalあるいは EcoR V部位にクローニングした。 増幅産物の揷人されたプラスミ ドのうち KVMiXxKC 2由来の VK- #1クローン 1種類について、 自動蛍光シーケンサ一 （Applyed Bio System社） により、 増幅産物の塩基配列を決定した。 得られた塩基配列はヒ ト lg 鎖の開始コ ドンから定常領域に至るまで終始コ ドンを含まないので、 クロー二 ングされた増幅産物は機能的ヒ ト Ig/ 鎖可変領域をコ一ドしていると考えられる c また、 すでに報告されているヒ ト抗体 V 領域 （Kleinら， Eur. J. Immunol. , 23, 3248-, 1993) 、 J /c領域 （Wh ehurstら， 前記） の塩基配列と比較した結 果、 V/c3ファ ミ リー、 J /c 4の組み合わせからなることが判明した。 この結果 は、 ヒ ト 2番染色体部分断片を保持するキメラマウスにおいて、 完全な機能的ヒ ト抗体 鎖蛋白質が産生されていることを示している。
(実施例 29) ヒ ト 14番染色体断片を保持するキメラマウスの血清中のヒ ト抗体 ァ鎖サブクラスおよび 鎖の検出、 および定量
(実施例 10) の生後 11週齢のキメラマウス （K15Aおよび K16A； 1-4由来、 キメ ラ率 70、 50%) より採血し、 血清中のヒ ト抗体ァ鎖サブクラス濃度を （実施例 14) に従い ELISA法を用いて検出した。
[ヒ 卜 IgGlの測定] 抗ヒ ト IgG抗体（シグマ、 卜 6260) を PBSで希釈し、 96穴マ イクロタイタ一プレートをコーティ ングした。 血清試料を加え、 次いでペルォキ シダーゼ標識した抗ヒ ト IgGl抗体 （ファーミ ンジヱン、 08027E) を加えてイ ンキ ュべ一 卜した後、 T1BZ (住友べ一クライ ト、 Mい 1120T) の添加により酵素活性を 450隱の吸光度で評価した。 精製された濃度既知のヒ 卜 IgGl (シグマ、 卜 3889) を標準としマウス血清を添加した PBSで段階的に希釈した。
[ヒ ト lgG2の測定] '抗ヒ ト lgG2抗体 （シグマ、 卜 9513) を PBSで希釈し、 96穴マ イク口タイタープレー トをコ一ティ ングした。 血清試料を加え、 次いでペルォキ シダーゼ標識した抗ヒ ト IgG抗体 （シグマ、 A- 0170) を加えてインキュベートし た後、 TMBZ (住友べ一クライ ト、 Mい 1120T) の添加により酵素活性を 450 の吸 光度で評価した。 精製された濃度既知のヒ ト IgG2 (シグマ、 1-4139) を標準とし マゥス血清を添加した PBSで段階的に希釈した。
[ヒ ト IgG3の測定] 抗ヒ ト lgG3抗体 （シグマ、 卜 7260) を 100mMグリ シン塩酸バ ッファ一 pH2.5で希釈し 5分間室温で放置した後、 100mMリ ン酸バッファ 一 pH7. 0で 10倍に希釈し、 96穴マイクロタイタープレー トをコーティ ングした。 血清試 料を加え、 次いでペルォキシダーゼ標識した抗ヒ 卜 IgG抗体 （ファーミ ンジヱン、 08007E) を加えてインキュベートした後、 TMBZ (住友べ一クライ ト、 1い 1120T) の添加により酵素活性を 450nmの吸光度で評価した。 精製された濃度既知のヒ 卜 IgG3 (シグマ、 1-4389) を標準としマウス血清を添加した PBSで段階的に希釈し た。
[ヒ ト igG4の測定] 抗ヒ ト IgG4抗体 （シグマ、 1-7635) を 100mMグリ シン塩酸バ ッファー pH2.5で希釈し 5分間室温で放置した後、 lOOmMリ ン酸ノく ッファ一 pH7. 0で 10倍に希釈し、 96穴マイクロタイタープレー トをコーティ ングした。 血清試 料を加え、 次いでペルォキシダ一ゼ標識した抗ヒ ト IgG抗体 （ファーミ ンジヱン、 08007E) を加えてインキュベートした後、 TMBZ (住友べ一クライ 卜、 Mい 1120T) の添加により酵素活性を 450nmの吸光度で評価した。 精製された濃度既知のヒ 卜 IgG4 (シグマ、 卜 4639) を標準としマウス血清を添加した PBSで段階的に希釈し た。
[ヒ ト IgMの測定] 鎖については PBSで希釈した抗ヒ 卜 鎖マウスモノクロー ナル抗体 （シグマ、 1-6385) を 96穴マイクロタイ夕一プレー 卜にコーティ ングし、 血清試料を加え、 次いでペルォキシダ一ゼ標識抗ヒ 卜 鎖マウス抗体 （The Bind ing Site Limited, P008) を加えてインキュベー トした後、 ペルォキシダ一ゼ 基質として TMBZ (住友べ一クライ 卜、 Mい 1120T) の添加により酵素活性を 450nm の吸光度で評価し、 精製された 鎖を持つ濃度既知のヒ ト IgM (オルガノ ン · テ クニ力、 6001-1590) を標準としマウス血清 （シグマ、 M5905) を添加した PBS で段階的に希釈した。 ·
結果を表 10に示す。 キメラマウス K15Aと K16Aの 2個体で IgGl, IgG2, IgG3， IgG4 のすベてのサブクラスおよび IgMが検出された。 表 10. キメラマウス中のヒ ト抗体 IgGサブクラスおよび IgM濃度 （ELISA) キメ ラマウス IgGl I G2 I G3 IgG4 IgM (mg/1) 15A 2.25 1.96 0.17 0.43 7.09
K16A 0.30 0.69 0.10 0.07 0.87
(実施例 30) ヒ ト 22番染色体を保持するマウス ES細胞株 （TT2) の取得 ヒ 卜 22番染色体を保持するマウス ES細胞 （TT2) 取得のため、 染色体供与細胞 として （実施例 26) で取得した 6-1 (A9/#22, G418, ピューロマイシン耐性） 細 胞株を用いた。 染色体受容細胞としては野生型 TT2細胞株 （実施例 9) を用いた。 ミ クロセル融合実験およびピュー口マイシン耐性株の選択は 0.75〃g/mlのピュー ロマイシン濃度で他は （実施例 9) の G418耐性株選択の場合と同様に行なった。 この結果出現したピュー口マイシン耐性株の出現頻度は TT2細胞 10 固あたり 1 〜2個であった。 ピュ一ロマイシン耐性株の凍結保存、 ゲノム DNA取得は （実施 例 2) と同様に行なった。 ヒ ト 22番染色体の保持はピューロマイシン耐性株 PG22 - 1について以下の （ 1 ) 、 （2) により確認した。
( 1 ) PCR解析
ピュー口マイシン耐性株ゲノム DNAを铸型としてヒ ト 22番染色体上に存在する 遺伝子 （Genetic Maps，前記） のうち、 （実施例 2 ； A9/S22) で存在が確認され ている 10種のプライマーについて PCR增幅を行なった結果、 （実施例 2 ； A9/#22) に存在した全てのマーカーが検出された。
( 2 ) サザンブロッ ト解析 （実施例 2) で示した方法に従い、 ヒ 卜 L1配列をプロ ーブとして用い、 陰性コン トロール野生型 TT2、 染色体供与細胞 6 し ピュー口 マイシン耐性 ΤΤ2細胞株 PG22- 1由来のゲノム DNAについて行った。 その結果を （ 図 19) に示す。 図中左側に DNA分子量を示した。 PG22- 1におけるバン ドパターン は 6- 1のそれと一致し、 シグナル強度も同程度であることから、 6-1細胞株中の 22番染色体は確かに PG22-1に移入されたことが確認された。
以上の実験によりピューロマイシン耐性 ΤΤ2細胞株 PG22- 1はヒ 卜 22番染色体の 全てあるいは大部分を保持することが確認された。
(実施例 31 ) ヒ ト 22番染色体を保持するマウス ES細胞株 （ΤΤ2) からのキメラ マウス作製
(実施例 30) で得られ、 ヒ ト 22番染色体を保持していることが確認されたピュ —口マイシン耐性 ΤΤ2細胞株 PG22-1を凍結ス 卜ックより立ち上げ、 I CRまたは MC H( I CR) (日本クレア社） 雄雌マウスの交配により得られた 8細胞期胚に胚あたり 10〜 個注入した。 ES細胞用培地 （実施例 9) でー晚培養して胚盤胞に発生させ た後、 偽妊娠処理後 2. 5日の仮親 I CRマウス （日本クレア社） の子宮に片側の子 宮あたり約 10個のィンジヱクション胚を移植した。
キメラ作製の結果を （表 11) に示す。 計 266個の注入胚を移植した結果、 36匹 の子マウスが誕生した。 キメラ個体は、 毛色において宿主胚 （I CR) 由来の白色 の中に TT2細胞由来の野生色 （濃茶） が認められるかどうかにより判定される。 誕 生した 36匹のうち毛色に明らかに野生色の部分のある、 すなわち、 ES細胞の貢献 の認められる個体は 8匹であつた。
この結果より、 ヒ ト 22番染色体を保持する ES細胞株 （TT2由来、 PG22-1) はキ メラ形成能を保持している、 すなわちマウス個体の正常組織に分化する能力を保 持していることが確認された。 表 11. ヒ ト 22番染色体を保持する TT2細胞株からのキメラマウス作製
ES細胞株/ ビュ-ロマイシン ES細胞を注入し 子マウス キメラ 毛色への貢献率 ヒト染色体 耐性株番号 た 8細胞期胚数 の数 7ウスの数 〜20¾ 20-50¾ 50-805
ΤΤ2/#2ί PG22- 1 266 36
(実施例 32) ヒ ト 22番染色体を保持するキメラマウスの血清中のヒ 卜抗体 λ鎖 の検出、 および定量
(実施例 31) のキメラマウス KPG22- 1〜3の血清中のヒ ト抗体濃度を （実施例 14) に従い EL 1 SA法を用いて定量した。 生後 2 ヶ月のキメラマウスより採血し、 血清中のヒ 卜抗体； I鎖を EL ISA法を用いて検出した。 PBSで希釈した抗ヒ 卜免疫 グロブリ ン； I鎖抗体 （VECTOR LABORATOR I ES, INC. . IA - 3070) を 96穴マイクロタ イタ一プレー 卜にコーティ ングし、 血清試料を加え、 次いでピオチン標識した抗 ヒ ト免疫グロプリ ン I鎖抗体 （VECTOR LABORATOR I ES, INC.、 BA-3070) を加えて ィンキュベ一トしさらにピオチン化ヮサビペルォキシダ一ゼとアビジン DHの複合 体 （VECTOR LABORATOR IES, INC. . Vec tas ta i n ABCキッ ト） を加えてインキュベー 卜した後、 TMBZ (住友べ一クライ ト，Μい 1120T) の添加により酵素活性を 450nm の吸光度で評価し、 精製された； I鎖を持つ濃度既知のヒ ト I gM (大日本製薬、 U1 3200) を標準としマウス血清を添加した PBSで段階的に希釈した。 結果を表 12に 示す。 この結果より 22番染色体を保持するキメラマウスにおいてヒ 卜抗体； I鎖遺 伝子が機能することが確認された。 表 12. キメラマウス中のヒ 卜抗体； l鎖濃度 （EUSA) キメラマウス キメラ率％ I g X (mg/1 )
KPG22- 1 50 12
PG22-2 50 18
KPG22-3 20 24
(実施例 33) ヒ ト 22番染色体導入キメラマウス血清における抗ヒ 卜 HSAヒ ト体 λ鎖の検出
キメラマウス （実施例 31、 KPG22-3) に生後 79日、 94日、 110日の 3回にわた り （実施例 20) と同様に HSAを免疫した。 血清中のヒ ト抗体； I鎖を （実施例 14) に従い EL I SA法を用いて検出した。 50mMの炭酸一炭酸水素バッファ一 pH9. 6で 5 〃g/mlに希釈した HSA (シグマ、 A 3782) を 96穴マイクロタイタープレー トにコ —ティ ングし、 血清試料を加え、 次いでピオチン標識した抗ヒ ト免疫グロブリ ン λ鎖抗体 （VECTOR LABORATOR I ES, INC.、 BA-3070) を加えてインキュベートしさ らにピオチン化ヮサビペルォキシダ一ゼとアビジン DHの複合体 （VECTOR LAB0RAT 0R I ES， INC.、 Vectas tai n ABCキッ 卜） を加えてインキュベートした後、 TMBZ (住 友べ一クライ ト、 Mい 1120T) の添加により酵素活性を 450nmの吸光度で評価した。
HSAで免疫したキメラマウス血清中の抗 HSAヒ ト λ鎖の力価は免疫後上昇した。 —方対照とした ICRマウスでは、 HSA免疫後の抗 HSAヒ ト抗体； I鎖の力価はバッ クグランドレベルであった。 結果を （図 20) に示す。 図 20において横軸はキメラ マウスに初めて HSAを免疫してからの日数を、 縦軸は 450nmにおける吸光度を示 した。 これらの結果より、 ヒ ト 22番染色体を保持するキメラマウスにおいてヒ ト 抗体; I鎖遺伝子が機能し、 さらには HSA抗原刺激に対して抗原特異的ヒ 卜 I g Aの 抗体価上昇が起こることが確認された。
(実施例 34) ヒ ト 22番染色体導人キメラマウスからのヒ ト抗体軽鎖産生ハイブ リ ド一マ取得 (実施例 25) と同様に （実施例 33) においてヒ トアルブミ ンで免疫したキメラ マウス KPG22-3から生後 113日目に脾臓を取り出し、 ミエローマ細胞と細胞融合 し、 ハイプリ ドーマを作製した。 ハイプリ ドーマの作製法は 〈安東 '千葉、 単ク ローン抗体実験操作入門、 講談社サイェンティフイ ク， 1991〉 に記された方法に 従い、 ミエローマ細胞としては、 SP- 2/0- Agi4 (大日本製薬、 05-554) を使用し た。 培養液に HCF (エア ' ブラウン） を 10%添加し 96穴プレート 5枚にまき込み、 1〜3週間培養しコロニーが出現したゥヱルの培養上清を EL 1 SA法で解析した。 . EU SA法は （実施例 33) と同様に行ない、 ヒ ト抗体ス鎖陽性のクローンを 4個得 た。
(実施例 35) ヒ ト 22番染色体部分断片及び、 14番染色体部分断片を同時に保持 するマウス ES細胞株の取得
ヒ 卜 22番染色体、 14番染色体部分断片を同時に保持するマウス ES細胞取得のた め、 染色体供与細胞として （実施例 26) で取得した 6-1 (A9/#22, G418, ピュー ロマイシン耐性） 細胞株を用いた。 染色体受容細胞としてはすでにヒ 卜 14番染色 体部分断片を保持している G418耐性 TT2細胞株卜 4 (実施例 9) を用いた。 ミ ク ロセル融合実験およびピューロマイシン耐性株の選択は 0. 75 n g/mlのピュ一ロマ イシン濃度で他は （実施例 9) の G418耐性株選択の場合と同様に行なった。 この 結果出現したピューロマイシン耐性株の出現頻度は卜 4細胞 107個あたり 1〜2 個であつた。 これらのピューロマイシン耐性株は 300 g/mlの G418存在下でも增 殖することから G418耐性も同時に保持していることが確認された。 二重薬剤耐性 株の凍結保存、 ゲノム DNA取得は （実施例 2) と同様に行なった。 ヒ 卜 22番染色 体及び、 ヒ ト 14番染色体部分断片の保持は二重薬剤耐性株 PG22- 5について以下の
PCR解析により確認した。 二重薬剤耐性株ゲノム DNAを铸型としてヒ ト 22番、 14 番染色体上に存在する遺伝子 （Gene t i c Maps，前記） のうち、 22番染色体につい ては （実施例 ； A9/#22) 、 14番染色体については （実施例 9； ΤΤ2/#14 1-4) で存在が確認されている各プライマーにつし、て PCR増幅を行なつた結果、 22番染 色体については 10種のうち 3種のマーカ一 （D22S275, D22S315, I g ) 、 14番染 色体については TT2/ 14 1-4に存在した全てのマ一カーが検出された。 以上の実 験により、 得られた二重耐性 TT2細胞株はヒ ト 22番染色体部分断片、 14番染色体 部分断片を同時に保持することが確かめられた。
(実施例 36) ヒ ト 22番染色体部分断片及び、 14番染色体部分断片を同時に保持 するマウス ES細胞株からのキメラマウス作製
(実施例 35) で得られ、 ヒ ト 22番染色体部分断片及び 14番染色体部分断片を保 持していることが確認された G418、 ピューロマイシン二重耐性 TT2細胞株 PG22 - 5 を凍結ス トックより立ち上げ、 I CRまたは MCH( I CR) (日本クレア社） 雄雌マウス の交配により得られた 8細胞期胚に胚あたり 10〜12個注入した。 ES細胞用培地 （ 実施例 9) で一晩培養して胚盤胞に発生させた後、 偽妊娠処理後 2. 5日の仮親 I C Rマウス （日本クレア社） の子宮に片側の子宮あたり約 10個のインジヱクシヨン 胚を移植した。
キメラ作製の結果を （表 13) に示す。 計 302個の注入胚を移植した結果、 16匹 の子マウスが誕生した。 キメラ個体は、 毛色において宿主胚 （I CR) 由来の白色 の中に TT2細胞由来の野生色 （濃茶） が認められるかどうかにより判定される。 誕 生した 16匹のうち毛色に明らかに野生色の部分のある、 すなわち、 ES細胞の貢献 の認められる個体は 5匹であった。
この結果より、 ヒ 卜 22番染色体部分断片及び 14番染色体部分断片を保持する ES 細胞株 （PG22- 5) はキメラ形成能を保持している、 すなわちマウス個体の正常組 織に分化する能力を保持していることが確認された。 表 13. ヒ 卜 22番染色体と 14番染色体を保持する TT2細胞株からのキメラマウス 作製
ES細胞株/ 二重耐性 ES細胞を注入し 子マウス キメラ 毛色への貢献率 ヒ ト染色体 株番号 た 8細胞期胚数 の数 マウスの数 -20% 20-50% 50 - 80¾
TT2/#22+?14 PG22-5 302 16
(実施例 37) ヒ ト 22番染色体部分断片及び、 14番染色体部分断片を同時に保持 する ES細胞由来キヌラマウス血清中のヒ 卜抗体； I鎖およびヒ ト抗体 鎖の検出 · (実施例 36) のキメラマウス （KPG22- 9、 10、 および 12) に対して、 HSAを免 疫した。 KPG22-9と KPG22- 10には生後 11週齢で免疫し、 その 2週間後に採血した。 KPG22- 12には生後 7週齢と 9週齢の 2度免疫し、 2度目の免疫の 2週間後に採血 した。
血清中のヒ 卜抗体//鎖およびヒ 卜抗体； I鎖さらにヒ 卜ス鎖かつヒ 卜 //鎖を有す る抗体を （実施例 14) に従い EL I SA法を用いて検出した。
完全ヒ 卜抗体の検出には PBSで希釈した抗ヒ ト免疫グロブリ ン λ鎖抗体 （Ki rk egaard & Perry Laborator i es I nc.、 01 - 10- 11) を 96穴マイクロタイタープレー 卜にコーティ ングし、 血清試料を加え、 次いでペルォキシダ一ゼ標識抗ヒ 卜免疫 グロプリ ン /鎖抗体 （The B i nd i ng S i te L i mi ted, MP008) を加えてイ ンキュべ — 卜した後、 ペルォキシダ一ゼ基質として TMBZ (住友べ一クライ ト、 Mい 1120T) の添加により酵素活性を 450nmの吸光度で評価し、 精製された I鎖を持つ濃度既 知のヒ 卜 I gM (大日本製薬、 U13200) をマウス血清を添加した PBSで段階的に希 釈したものと比較し血清中のヒ ト抗体濃度を求めた。 ヒ ト抗体//鎖およびヒ ト抗 体; I鎖を EUSA法を用いて （実施例 29) および （実施例 32) と同様に検出 '定量 した。 結果を表 14に示す。 キメラマウスでは； I鎖と / 鎖がともに検出された。 ヒ ト抗体//鎖かつ λ鎖を持つ抗体も検出された。 この結果より、 ヒ ト 22番染色体部 分断片及び 14番染色体部分断片を保持する ES細胞由来キメラマウスにおいてヒ ト 抗体; 鎖遺伝子とヒ ト抗体/ /鎖遺伝子は同時に機能し、 一部の Β細胞では重鎖と 軽鎖がともにヒ トである完全抗体が産生されることが確認された。
また対照として測定したヒ ト 14番染色体のみを保持する （実施例 10) のキメラ マウス （Κ9) 、 ヒ 卜 22番染色体のみを保持する （実施例 31) のキメラマウス （ΚΡ G22-2) の血清中のヒ 卜抗体； I鎖かつ//鎖を持つ抗体濃度はバックグラン ドレべ ルであり、 ここでの検出系はヒ ト λ鎖かつ 鎖を持つ完全抗体のみを検出してい ることが確認された。 表 14. キメラマウス中のヒ ト抗体濃度（EL A)
ESクロ-ン キメラマウス キメラ 率％ IgM(mg/l) I A (mg I , λ (mg/1)
PG22-5 KPG22-9 30 2.54 9.9 0.043
PG22-5 KPG22-10 5 4.96 21.5 0.333
PG22-5 PG22-12 40 3.71 7.0 0.048
3-2 9 50 6.66 <0.003
PG22-1 PG22-2 50 17.6 <0.003
(実施例 38) ヒ 卜 2番染色体部分断片及び、 14番染色体部分断片を同時に保持 する ES細胞由来キメラマウス血清におけるヒ ト抗体の検出 （ヒ 卜 /c鎖かつヒ ト 鎖を有する抗体）
(実施例 19) で作製したキメラマウス KPG- 15 (TT2ES クローン PG5由来、 キメ ラ率 105 に対して、 生後 2から 3ヶ月齢の間に、 PBSに溶解したヒ ト血清アル ブミ ン （HSAヽ シグマ、 A3782) とアジュバン ト （MPL+TDM Emulsion, RIBI Imm unochem Reseach Inc. ) とを混合して 0.25mg/mlの HSA溶液を調整し 0.2mlを 3 回免疫し、 採血した。 また生後 6週齢の （実施例 19) のキメラマウス KPG-26 (TT 2ES クローン PG6由来、 キメラ率 40%) から採血した。 血清中の完全ヒ ト抗体濃 度を （実施例 14) に従い ELISA法で検出した。 PBSで希釈した抗ヒ 卜免疫グロブ リ ン 鎖抗体 （Kirkegaard & Perry Laboratories Inc.、 01-10-10) を 96穴マイ クロタイタープレートにコ一ティ ングし、 マウス血清 （シグマ、 M5905) を加え た PBSで希釈した血清試料を加え、 次いでペルォキシダーゼ標識抗ヒ ト免疫グロ ブリ ン//鎖抗体 （The Binding Site Limited, MP008) を加えてインキュベート した後、 ペルォキシダーゼ基質として TMBZ (住友べ一クライ 卜、 Mい 1120T) の添 加により酵素活性を 450nmの吸光度で評価し、 精製された /c鎖を持つ濃度既知の ヒ 卜 IgM (オルガノン · テク二力、 6001-1590) を標準としマウス血清を添加し た PBSで段階的に希釈した。 /c鎖、 鎖については （実施例 20) と同様にして濃 度を求めた。 結果を表 15に示す。 ヒ 卜抗体//鎖かつ /c鎖を持つ抗体が検出された また対照としたヒ ト 14番染色体のみを保持する （実施例 10) のキメラマウス （ K9) 、 ヒ ト 2番染色体のみを保持する （実施例 13) のキメラマウス （K2-9) 血清 中のヒ 卜抗体で/ 鎖かつ/ 鎖を持つ抗体濃度は 0. 002mg/ml以下でバックグラン ド レベルであった。 この結果より、 ヒ 卜 2番染色体部分断片及び 14番染色体部分断 片を保持する ES細胞由来キメラマウスにおいてヒ 卜抗体/ 鎖遺伝子とヒ ト抗体 鎖遺伝子は同時に機能し、 一部の B細胞では重鎖と軽鎖がともにヒ トである完全 抗体が産生されることが確認された。 表 15. キメラマウス中のヒ 卜抗体濃度（EL I SA)
ESクロ-ン キメラマウス キメラ 率％ I gM(mg/ l ) I g c (mg/ 1 ) I gM, κ (mg/ 1 )
PG-5 KPG15 10 0. 18 1. 01 0. 075
PG-6 PG26 40 1. 52 1. 26 0. 018
3-2 K9 50 6. 66 0. 002以下
5- 1 K2-9 40 135 0. 002以下
(実施例 39) ヒ ト 2番染色体部分断片を保持するマウス ES細胞株 （TT2F， X0) の取得
ヒ 卜 2番染色体部分断片を保持するマウス ES細胞 （X0) 取得のため、 染色体供 与細胞として （実施例 16) で取得した PG1細胞株を用いた。 染色体受容細胞とし ては （39， X0) の染色体構成を持ち、 キメラマウスにおいて効率よく卵細胞に分 化することが報告されている （相沢慎一、 バイオマニュアルシリーズ 8， ジーン夕 ーゲティ ング， 羊土社， 1995) TT2F細胞株 （ライフテックオリエンタル社より購 人） を用いた。 ミ クロセル融合実験およびピューロマイシン耐性株の選択は 0. 75 g/mlのピューロマイ シン濃度で他は （実施例 9) の G418耐性株選択の場合と同 様に行なった。 この結果出現したピューロマイシン耐性株の出現頻度は TT2F細胞 107個あたり 5個であった。 これらのピューロマイシン耐性株の凍結保存、 ゲノ ム DNA取得は （実施例 2) と同様に行なった。 ヒ ト 2番染色体部分断片の保持は 薬剤耐性株 P-20, P- 21について以下の PCR解析により確認した。 薬剤耐性株ゲノ 厶 DNAを铸型としてヒ ト 2番染色体上に存在する遺伝子 （Gene t i c Maps，前記） のうち、 （実施例 1 ； A9/#2 w23) で存在が確認されているプライマ一C /c、 FA BP1、 V 1 -2の 3種について PCR増幅を行なった結果、 2株共に、 3種全ての ブライマ一について期待される増幅産物が確認された。
以上の実験により、 得られたピューロマイ シン耐性 ES細胞株 （TT2F， X0) はヒ 卜 2番染色体部分断片を保持することが確かめられた。
(実施例 40) ヒ ト 2番染色体部分断片を保持するマウス ES細胞株 （TT2F, X0) からのキメラマウス作製
(実施例 39) で得られ、 ヒ ト 2番染色体部分断片を保持していることが確認さ れたピューロマイシン耐性 TT2F細胞株 P- 21を凍結ストツクより立ち上げ、 Rま たは MCH( ICR) (日本クレア社） 雄雌マウスの交配により得られた 8細胞期胚に胚 あたり 10〜12個注人した。 ES細胞用培地 （実施例 9) で一晩培養して胚盤胞に発 生させた後、 偽妊娠処理後 2. 5日の仮親 ICRマウス （日本クレア社） の子宮に片 側の子宮あたり約 10個のィンジ クション胚を移植した。
計 141個の注入胚を移植した結果、 20匹の子マウスが誕生した。 キメラ個体は、 毛色において宿主胚 （I CR) 由来の白色の中に TT2細胞由来の野生色 （濃茶） が 認められるかどうかにより判定される。 キメラ作製の結果を （表 16) に示す。 誕 生した 20匹のうち毛色に明らかに野生色の部分のある、 すなわち、 ES細胞の貢献 の認められる個体は 9匹であった。 うち 4個体は毛色が完全に野生色の （ES細胞 に由来する） キメラマウスであった。
この結果より、 ヒ ト 2番染色体部分断片を保持する ES細胞株 （P- 21) はキメラ 形成能を保持している、 すなわちマウス個体の正常組織に分化する能力を保持し ていることが確認された。 表 16. ヒ 卜 2番染色体部分断片を保持する TT2F細胞株からのキメラマウス作製
ES細胞株/ ビュ-ロマイシン ES細胞を注入 子マウス キメラ 毛色への貢献率 ヒト染色体 耐性株 -' した 8細胞期 の数 マウスの数 〜20% 20-50% 50- 90¾ 100¾
番号 胚数
TT2F/#2fg. P-21 141 20 9 0 2 3 4
(実施例 41) ヒ ト 2番染色体部分断片を保持する TT2F由来キメラマウスの血清 中のヒ 卜抗体 鎖の検出、 および定量
(実施例 40) の生後約 1ヶ月齢のキメラマウス （P-21由来、 キメラ率 100¾、 K2
- 1F〜4F) より採血し血清中のヒ 卜抗体 鎖濃度を （実施例 20) と同様に EL1SA 法を用いて定量した。
結果を表 17に示す。 使用する ES細胞を TT2Fとしてもヒ ト抗体/ c鎖遺伝子がキメ ラマウス中で機能することが確認された。
表 17. キメラマウス中のヒ ト抗体 κ鎖濃度 （ELISA) キメラマウス キメラ率％ Ig/c (mg/1)
K2-1F 100 66
K2-2F 100 156
K2-3F 100 99
2-4F 100 20
(実施例 42) ヒ ト 2番染色体部分断片を保持するマウス ES細胞 （TT2F, X0) 由 来キメラマウスの子孫におけるヒ ト染色体保持の検出 (実施例 40) で得られた雌キメラマウスのうち K2- 1 F, K2 -4F (共に毛色のキメ ラ率 100¾) について雄 I CRマウスとの交配により ES細胞由来の子孫が誕生するか を検討した。 この交配において R雄マウス （アルビノ、 劣性） 由来精子により 受精したキメラマウス中の TT2F細胞 （野生色：優性） 由来の卵子からは野生色、 I CR由来卵子からは白色の子マウスが誕生する。 それぞれ 1回の交配によって得 られた生存可能な子マウス （K2- 1 F ： 10匹、 K2- 4F ： 5匹） のすべてが ES細胞由 来の毛色である野生色を示した。 これらの子マウスの尻尾より調製したゲノム DN Aについてヒ ト染色体断片の保持を PCR法により検討した。 P-21 (実施例 39) で 存在が確認されている 3種のプライマーについて PCR増幅を行なつた結果、 10匹 中 4匹 （K2 - 1 F) 、 5匹中 2匹 （K2- 4F) において P- 21で検出された 3種のマー 力一の存在が確認された。 15匹の子マウスの PCRの結果を （図 21 ) に示す。 図中 右側にマ一力一 （0 X174， Hae l i l断片， 二ツボンジーン） および主なバン ドの DN A分子量を、 左側にそれぞれのプライマ一によって期待される増幅産物の長さを 矢印で示した。 右側に陽性コン トロールとして親キメラ K2- 1 F、 K2- 4Fの尻尾由 来 DNAを用いた結果も示す。 これらの結果は、 ヒ 卜 2番染色体部分断片を保持す る TT2F細胞株 P-21がキメラマウス中で機能的な卵子に分化し、 その卵子由来の子 孫にヒ ト 2番染色体部分断片が伝達されたことを示している。
(実施例 43) ヒ ト 2番染色体部分断片を保持するマウス ES細胞 （TT2， XY) 由 来キメラマウスの子孫におけるヒ ト染色体保持の検出
(実施例 13) で得られたキメラマウスのうち K2- 18 (雄、 キメラ率 70¾) と K2 - 19 (雌、 キメラ率 60%) 及び同腹の非キメラ雌を混合して交配し、 ES細胞由来 の子孫が誕生するかを検討した。 TT2細胞は （40， XY) の染色体構成を持つので 雄キメラ K2- 18において機能的な精子に分化している可能性がある。 その場合キ メラマウス中の TT2細胞 （野生色、 優性） 由来精子により受精した I CR (白色： 劣性） 由来の卵子からは野生色の子マウスが誕生する。 交配によって得られた生 存可能な子マゥス計 1 10匹のうち 10匹が ES細胞由来の毛色である野生色を示した。 これらの野生色子マウス 10匹のうち 7匹の尻尾より調製したゲノム DNAについて ヒ ト染色体断片の保持を PCR法により検討した。 5- 1株 （TT2/#2 f g.，実施例 12) で存在が確認されている 2種のプライマ一 （C A：、 FABP 1 ) 及び、 （実施例 1 ) で示した V /c l - 2 ブライマ一について PCR増幅を行なった結果、 7匹中 2匹にお いて 3種のマーカ一全ての存在が確認された。 この結果は、 ヒ ト 2番染色体部分 断片を保持する TT2細胞株 5-1がキメラマウス中で機能的な精子に分化し、 その 精子由来の子孫にヒ—ト 2番染色体部分断片が伝達されたことを示している。
(実施例 44) キメラマウス子孫の血清中のヒ ト抗体 鎖の検出、 および定量 (実施例 42) のキメラマウス子孫 K2- 1F-1〜10および K2- 4F- 1〜5の血清中の ヒ 卜抗体/ 鎖濃度を EU SA法を用いて定量した。 生後約 4〜6週齢のマウスより . 採血し、 血清中のヒ ト抗体/ c鎖を （実施例 20) と同様に EL ISA法を用いて検出し た。 結果を （実施例 42) で得られた染色体保持の結果と共に表 18に示す。 キメラ マウスから生まれた子孫においてもヒ ト抗体/ c鎖遺伝子が機能することが確認さ れた。
表 18. キメラマウス子孫中のヒ 卜抗体 /c鎖濃度 （ELISA) 親キメラマウス マウス個体番号 ヒ ト 2番染色体断片 Ig c (mg/1) 2-1F 0.58
ft
K2-1F 44789023523561 1 84.1
K2-1F 12.8
2-1F 15.1
K2-1F 0.52
K2-1F 0.58
K2-1F I.30
K2-1F 0.90
K2-1F 0.56
K2-1F 28.8
K2-4F 0.04以下
K2-4F 23.3
K2-4F II.8
K2-4F 0.08
K2-4F 0.06
(実施例 45) ヒ ト 14番染色体部分断片導入キメラマウス脾臓細胞の解析 フローサイ トメ トリーによる解析は下記の文献に記載の方法に従った。 日本生 化学会編、 新生化学実験講座 12分子免疫学 1一免疫細胞 · サイ トカインー 1989、 東京化学同人；東京大学医科学研究所 制癌研究部編、 細胞工学別冊 8 新細胞 工学実験プロ トコ一ル、 1991、 秀潤社； A. Doyle and J. B. Griffiths, "Cell &
Tissue Culture: Laboratory Procedures", published by John Wiley & Sons L td.， 1996 。 （実施例 19) の生後 6ヶ月齢のキメラマウス （KPG06； PG16由来、 キメラ率 30%) から脾臓をとりだし、 塩化アンモニゥム水溶液で処理した後ラッ ト血清を 1%含む PBS中で、 フルォレツセインイソチオシァネー ト （FITC) 標識 抗マウス CD45R(B220)抗体 （ファーミ ンジヱン、 0U24A) で細胞を染色した。 洗 浄後 5 %マウス血清を含む PBS中でピオチン標識抗ヒ ト IgM 抗体 （ファーミ ンジ ェン、 08072D) または対照としてビォチン標識抗ヒ トス鎖抗体 （ファーミ ンジ ェン、 08152D) と反応させた後、 ス 卜 レブ トァビジンフィ コエリスリ ン （ファ —ミ ンジ ェ ン、 13025D) で染色し、 フローサイ トメ ト リ一 （べク トンデッキンソ ン、 FACSort) で解析した。 また対照としてヒ ト染色体を保持しない Rマウス も同様に解析した。 図 22に結果を示す。 図中横軸はヒ ト IgM 、 縦軸は CD45R(B220 ) を示す。 B細胞マ一カー CD45R陽性 （FITC) でかつヒ ト IgM陽性 （PE) である 細胞集団が 4%増加しており、 これによつてキメラマウスではヒ ト抗体//鎖を細 胞表面に発現している細胞の存在が確認された。
(実施例 46) ヒ ト抗体重鎖、 c鎖、 ス鎖をそれぞれ発現するキメラマウス脾臓 由来 cDNAからのヒ 卜抗体遺伝子可変領域クローニングと塩基配列決定
(実施例 29) 、 （実施例 23) 、 （実施例 32) においてヒ ト抗体重鎖、 /c鎖、 λ 鎖をそれぞれ発現することが確認されたキメラマウス K15A (1-4株由来、 実施例 10に示した方法で作製） 、 Κ2- 8 (実施例 13で作製） 、 KPG22- 2(実施例 31で作製） の脾臓由来 RNAより （実施例 5) と同様な方法で合成した cDNAについて、 下記の プライマーにより PCRを行ない、 それぞれのヒ 卜抗体遺伝子可変領域を増幅した。 陰性コントロールとして非キメラマウス ICRより取得した脾臓由来 cDNAを用いた。 参考文献の記載のないプライマ一は Genbank等のデータベースより入手した塩基 配列をもとに作製した。
• K15A (重鎖）
定常領域用 ： HIGMEX1-2： 5' -CCAAGCTTCAGGAGAAAGTGATGGAGTC (配列番号 53)
HIGMEX1-1： 5' -CCAAGCTTAGGCAGCCAACGGCCACGCT (VH3BACKの 2ndP CRに使用） （配列番号 54)
可変領域用 ： VH1/5BACK (59°C, 35cycles, Marksら， Eur. J. Immnol. , 21, 9 85-, 1991) ， VH4BACK (59°C, 35cycles, Marksら， 前記） ， VH3BAC (IstP CR:59°C, 35cycles, 2ndPCR:59。C， 35cycles, Marksら， 前記）
☆ • K2-8 (軽鎖 )
定常領域用 KC2H： 5' -CCAAGCTTCAGAGGCAGTTCCAGATTTC (配列番号 55)
可変領域用 ： Vkl/4BACK (55°C， 40cydes， Marksら， Eur. J. Immnol. , 21, 985 -, 1991) ， Vk2BACK. (55°C, 40cycles, Marksら， 前記） ， Vk3BACK (55°C, 40cycles， Marksら. 前記)
. KPG2212 (軽鎖 λ )
定常領域用 ： CAMIX (以下の 3種のプライマ一を等モル比で混合したもの）
IGL1-CR： 5' -GGGAATTCGGGTAGAAGTCACTGATCAG (配列番号 56)
IGL2-CR ： 5' -GGGAATTCGGGTAGAAGTCACTTATGAG (配列番号 57)
IGL7-CR ： 5' -GGGAATTCGGGTAGAAGTCACTTACGAG (配列番号 58)
可変領域用 ： 1LEA1 (55°C, 40cycles, Williamsら， Eur. J. Immunol. , 23， 1456-， 1993) ， VA 2MIX (55°C, 40cycles，前記の Wi 11 iamsらの報告にある V A2LEA1, VA2JLEAD を等モル比で混合したもの） ， V i3MIX (55°C， 40 cycle s，前記の Williamsらの報告にある V;i3LEAl， VA3JLEAD, Vス 3BACK4を等モル比 で混合したもの） それぞれ定常領域用 X可変領域用 （重鎖 3種、 /c鎖 3種、 λ鎖 3種） の組み合 わせで 94°C15秒、 それぞれの可変領域プライマーに示したァニーリ ング温度 15秒、
72°C20秒、 それぞれの可変領域プライマーに示したサイクル数 （パーキンエルマ
—社、 サーマルサイクラ一 9600使用） の条件で行なった。 VH3BACKにおける 2ndP
CRは IstPCRの増幅産物を （HIGMEX1- 1XVH3BACK) のプライマ一の組み合わせで 再度増幅した。 全ての増幅産物は 1.5%ァガロース電気泳動後、 臭化工チジゥム染 色することにより検出した。 その結果、 全て組み合わせにおいて、 期待される長 さ （重鎖： 470bp付近、 軽鎖/ c ： 400bp付近、 軽鎖 λ ： 510bp付近） の増幅産物 が検出された。 一方、 陰性コントロールでは全てにおいて同じ位置に特異的増幅 産物は検出されなかった。 これらの増幅産物は、 ァガロースゲルより prep.A.gen e (バイオラッ ド） により抽出した後、 制限酵素処理 （重鎖： Hindlll- Pstl、 軽 鎖/ ： Hindlll-PvuIU 軽鎖； I ： Hindll I-EcoRI) し、 pUC119 (宝酒造） ベクタ —の Hindlll, Pstl 部位 （重鎖） 、 Hindlll, Hindi部位 （ 鎖） 、 Hindlll, E coRI部位 （ス鎖） にクローニングした。 増幅産物の挿入されたプラスミ ドのうち 以下のもの （右側に示したクローン数） について、 自動蛍光シーケンサ一 （Appl yed Bio System社） 'により、 増幅産物の塩基配列を決定した。
• HIG EX1- XVH1/5BACK： 10クローン、
• HIGMEX1-2XVH4BACK： 8クローン、
- HIG EXl-2(2nd PCR, H IGMEX1 - 1) x VH3BACK： 5クローン
• KC2HXV 1/4BACK： 6クローン、
• KC2HXV C2BACK： 7クローン、
. C2HXV 3BACK : 4 ク ローン、
• CAMIXxVA 1LEA1 ： 5クローン、
• CAMIXXVA2MIX： 6クローン、
• CAMIXxVA3 IX： 5クローン 得られた塩基配列を DNASIS(Hitachi Software Engneering) により解析した結 果、 全てがヒ ト由来配列であり、 /c鎖、 ス鎖の全て、 重鎖の計 23種中 21種が開始 コ ドンから定常領域に至るまで終始コ ドンを含まない機能的配列であった。 決定 された配列からお互いに同一なものを除く と重鎖 17種、 / 鎖 11種、 λ鎖 12種のそ れぞれ異なる可変領域配列が同定された。
(実施例 47) ヒ ト抗体重鎖、 Λ;鎖、 ス鎖をそれぞれ発現するキメラマウス脾臓 由来 cDNAからのヒ ト抗体遺伝子可変領域塩基配列の解析
(実施例 46) において決定された塩基配列 （重鎖 Πクローン、 /c鎖 11クローン、 λ鎖 12クローン） について以下の点について解析を行った。
1. 各可変領域配列において使用されている既知の生殖系列 V遺伝子断片を特定
2. 各可変領域配列において使用されている既知の生殖系列 J遺伝子断片を特定
3. 重鎖可変領域において使用されている既知の生殖系列 D断片を特定
4. 1、 2、 3の結果をもとにした重鎖可変領域における N領域の付加の同定
5. 各可変領域塩基配列から導かれるアミノ酸配列の決定
その結果を （表 19) に示す。 1、 2については Genbankに登録されている生殖 系列 V及び J断片とのホモロジ一検索を DNASISにより行い特定した。 VH断片は （ Cookら， Nature gentics, 7, 162-, 1994) 、 V 断片は （Kleinら， Eur. J. Immunol, 23, 3248-, 1993) 、 V;i断片は （Williamsら， 前記） の表記法に従い 、 各 V断片ファ ミ リ一名と共に表中に記した。 3については （Ichiharaら， The E BO J. , 7, 13, 4141-， 1988) の報告に記された生殖系列 D断片とのホモロジ —検索を DNASISにより行い、 連続して 8bp以上一致することを指標として決定し 表中に記した。 DN*については （Greenら， Nature Genetics, 7, 13-, 1994) で報告された新しい DNファ ミ リ一断片と考えられる。 4については 1 (V) 、 2 (J) 、 3 (D) の結果をもとに、 いずれの生殖系列断片にも見いだされない塩 基配列を N領域とみなした。 その結果、 D領域の特定された 13種中 11種に N領域 が観察され、 その平均の長さは 8.7bpであった。 5については各塩基配列を DNAS ISを使用して 1文字表記のアミ ノ酸配列に変換した。 表中には CDR3領域のみ示し た。 表中右側に各可変領域のクローニングに使用したプライマー名及び各クロー ン名を記した。
表 19
V segment J(D) pi lone
K15A
VH1 VH1-8 VRS SSWYEYYYYGMDV J6CDN1) VH BACK K4-10
VH1-18 GGITTvfVRGLIITD YPDL I2CDXP'l) VH1/5BAC Kl-7
VH1-24 APYSGRFDY VH1/5BACK HI -6
VH1-46 ERYYGSGSYQDYYYYYGMDV J6(DXP'l) VH1/5BACK Kl-2
GGYSGYEDYYYYGMDV J6(DK1) VH1/5BAC Kl-10
VH2 VH2-5 SYFDWPDFDY J4 (DXP1) VH4BACK
VH3 VH3-21 EGCSGGSCLPGYYYYGMDV J6 CDし R2) VH1/53AC Hl-4
VH3-23 AHGDPYFDY J4 VH1/5BAC HI.3
VH3-23 DADAFDI J3 VH1/5BACK Hl-8
VH3-23 SGWDY J4 (DN1*) VH3BACK K3-3 w¾ TGFDL J2 VH4B八 CK
VH3-33 EGGYGSVGDYYYYGMDV Jo (DXP 1) VH1/5BAC Hl-9
VH3-33 GGYSYGYDYYYYGMDV TA ΓΠΥΡΊ "\ VH3BACK H3-5
VH3-33 GYSSGWYDY J4 (DM1*) VH4BACK H4-9
VH4 VH4-34 RYSSGWYYFDY J4 (DNl*) VH4BACK H4-15
VH4-59 GRIAVASFDY J4 (DN1*) VH4BACK H4-2
VH4-5 GSGSYFHFDY J4 VH4BACK H4-6
' - _·
K2-8
1 018-8 ^^riiJi i^r^r J3 V 1 ΐ¾ V
018-8 00YDNLPIT J5 , V 1BACK l-3
018-8 00HDNLPFA J3 VK2BACK K2-2
LI OOYNSYPLT J4 V IB八 CK l-6
V 2 Al 1 MQGTHLLT J4 V 2BACK K2-1
A17 MQGTHWIT J3 V 2BACK K2-5
V/c3 A27 OOYGSSPTWT J 1 V 3BAC K3-1
A27 OOYGSSPFT J3 V 3BACK K3-4
A27 Jl 3 RACK K3-5
A27 Jl V tc 3 BACK 3-6
V A: 6 A26-10 HOSSSLPOT Jl V κ 2BACK K2-4
KPG22-2
V 1 DPL3 AAWDDSLDVV JC3 V 1し EA1
DPL5 JC2 V J IT FA 1
DPL5 GTWDSSLSAGVV JC3 Vス 1し EA1 Ll-6
DPL5 GTWDSSLSAVV JC2 Vス 1し EA1 Ll-9
DPL8 QSYDSSLSGW JC3 V 1LEA1 Ll-S
V 2 DPし 10 CSYAGSSTLV JC2 V 2MIX し 24
DPL11 SSYTSSSTVV JC2 Vス 2MIX L2-1
DPし 11 SSYTSSSTLV JC2 V 2 ΙΧ L2-3
DPL11 CSYTSSSTFV JC2 V 2ΜΙΧ L2-7
DPL12 SSYAGSNNLV JC3 V A 2MIX L2-5
DPし 12 SSYAGSNNP V JC3 V Λ 2MIX L2-6
V； 3 DPL16 NSRDSSGNLV JC2 V 3^ΠΧ L3-1 (実施例 48) TT2F ES細胞の抗体遺伝子 （重鎖、 軽鎖 /c) ノ ックアウ ト用のター ゲッティ ングべクターの作製
マウス抗体遺伝子 （重鎖、 軽鎖 /c) が破壊された TT2(または TT2F)細胞へ G418 耐性遺伝子でマーキングされたヒ 卜 14番染色体断片 （実施例 9 ) およびピュー口 マイシン耐性遺伝子でマーキングされたヒ ト 2番 （実施例 18) または 22番染色体
(実施例 35) を導入することが可能となる。 このようなヒ 卜 14番 +2番またはヒ ト 14番 +22番染色体を導入したマウス抗体 （重鎖、 軽鎖 /c) 遺伝子破壊 ΤΤ2(または TT2F)ES細胞を用いて、 （重鎖 + /c鎖：実施例 19、 重鎖 + λ鎖：実施例 36) の方 法によって作成されたキメラマウスでは、 主に重鎖と軽鎖がヒ ト由来の抗体が産 生されることが期待される。 以下に示す図 23〜図 27における制限酵素の略称等は 、 以下のとおりである。
制限酵素 ： Kp: KpnU B: BamHし Bg2: BgllU RI : EcoRI 、 RV: EcoRV 、 N': Not 、 SI: Sal K Sea: Seal 、 Sfi: Sf i I 、 Sm: SmaU X: Xhol 、 （X):ラムダべクタ 一由来の Xhol切断部位、
dK: Kpnl切断部位を消失、 dX: Xhol切断部位を消失、
(Sm/Sl): Sail 平滑後 Smal切断部位と結合、 （Sl/RV): Sail 平滑後 EcoRV 切断部 位と結合。
点線部分 ： pBluescript S II(I) または pUC18 プラスミ ド DNA
<^0： LoxP配列
1. G418耐性遺伝子の両側に LoxP配列を入れた pLoxP- STneo プラスミ ドの作製
TT2F細胞の抗体遺伝子をノ ックアウ トした後、 G418耐性遺伝子を除去するため に G418耐性遺伝子 （実施例 1 ) の両端に Creリコンビネース （Sauerら， Pro
Natl. Acad. Sci. USA, 85， 5166 -, 1988 ) の認識配列である LoxP配列 (Sauer ら、 前記） を同じ向きに入れる必要がある。 pSTneoBプラスミ ド DNA (実施例 1
、 Katohら、 Cell Struct. Funct. , 12:575， 1987; Japanese Collection of Re search Biologicals (JCRB), Deposit Number: VE039) より制限酵素 Xholで G418 耐性カセッ ト（STneo) を切り出し、 ァガロースゲル電気泳動により DNA断片を精 製したのち T4DNAポリメラーゼ （Takara社製 DNA Blunting Kit)により両端を平 滑化した。 LoxP配列が入ったプラスミ ド DNA pBS246 (Plasmid pBS246, 1οχΡ2 Ca ssette Vector, U.S. Patent 4959317) は、 GIBCO BRL社より購入した。 このプ ラスミ ドの EcoRI及び Spel切断部位へ Xholリ ンカー DNAを挿入することによって Xhol認識配列に変更したものを使用した。 この改変 PBS246の EcoRV切断部位へ上 記 STneo DNA 断片を揷入してプラスミ ド pLoxP- STneo を得た （図 23) 。
2. C57BL/6由来抗体重鎖 C （IgM定常領域） 、 軽鎖 J/c-C/c (Ig/c連結領域 および定常領域） を含むゲノム DNAクローンの単離
TT2(または TT2F)細胞は、 C57BL/6マウスと CBAマウスの F 1マウス由来であ ることから、 C57BL/6マウス由来のゲノム DNAクローンを用いて抗体遺伝子ノ ッ クアウ ト用ベクターを作製することにした。 ゲノム DNAライブラリ一は、 Clonte ch社 aduit C57BL/6N male 1 i ver由来ラムダ DNAライブラリーを使用した。 スク リーニングのためにプローブとしては、 以下の合成 DNA配列 （60 mer) を用いた 重鎖 C プローブ： 5' -ACC TTC ATC GTC CTC TTC CTC CTG AGC CTC TTC TAC AGC ACC ACC GTC ACC CTG TTC AAG-3' (配列番号 59)
軽鎖 プローブ： 5'-TGA TGC TGC ACC AAC TGT ATC CAT CTT CCC ACC ATC CAG T GA GCA GTT AAC ATC TGG AGG-3' (配列番号 60) 単離されたラムダクローンを解析して、 重鎖 C /または軽鎖 J - C/cを含む DN A断片を pBluescript SKIK+) プラスミ ド （Stratagene社） へサブクローニング した （重鎖 ： 図 24；軽鎖 J/C - C/c ： 図 25) 。 これらの DNA断片を用いて、 以 下のように TT2(または TT2F)ES細胞中のマウス抗体遺伝子破壊のためのターゲッ ティ ングベクタ一を作製した。
3. マウス抗体重鎖遺伝子破壊用べクタ一プラスミ ドの作製
2で調製したマウス抗体重鎖定常領域を含むゲノム DNAの C をコードする領 域の内で、 第 2〜第 4ェクソンが含まれる DNA断片 （BamHl〜Xhol) を 1で作製 したし oxP- STneo遺伝子と置き換えた （図 26) 。 STneoの転写方向は、 抗体重鎖遺 伝子の転写方向と同じ向きとなっている。 更にこのプラスミ ドの Notl部位に、 DT
- Aカセッ ト A(Pro Natl. Acad. Sci. USA, 87， 9918-9922, 1990，オリエンタル 酵母より購人） [以下、 DTと呼ぶ] の Apal、 SaU部位を Not I部位に変換したものを 揷入した。 DT遺伝子の転写方向は、 重鎖遺伝子の転写方向と同じ向きとなるもの を選択した。 このプラスミ ド DNAは、 大腸菌 DH5 を用いて増幅し、 セシウムクロ ライ ド平銜遠心により精製した （細胞工学実験操作入門、 1992年講談社刊） 。 精 製したプラスミ ド DNAは、 制限酵素 SacIIにより、 一箇所切断して TT2F ES 細胞 への トランスフエクシヨ ンに使用した。 形質転換体 TT2F ES細胞の中から抗体重 鎖部分がタ一ゲッティ ングベクターと相同組換えが起こつたクローンを検出する ための形質転換体ゲノム DNAサザンブロッ 卜用のプローブとして、 C〃の上流に 存在するスィ ッチ領域の DNA断片 （約 500塩基対） を用いた。 この DNA断片は以 下の条件で 129マウスゲノム DNAを PCR增幅して得た。
センスプライマ一 ： 5' - CTG GGG TGA GCC GGA TGT TTT G 3' (配列番号 61) アンチセンスプライマ— ： 5'-CCA ACC CAG CTC AGC CCA GTT C- 3' (配列番号 62) テンプレー ト DNA： EcoRI消化 129マウスゲノム DNA 1〃 g
反応バッファ一、 デォキシヌクレオチドミ ックス、 TaqDNAポリメラーゼは、 Taka ra社製のものを使用。
反応条件： 94度 C, 3分， 1回 → 94度 (；， 1分； 55度 2分； 72度 C， 2分； 3回 → 94度 C， 45秒 ； 55度 1分； 72度 C， 1分； 36回 増幅された DNAが Genbankのデータベースにあるとおり、 制限酵素 Hind IIIで 一箇所切断されることを確認して、 pBluescriptプラスミ ドの EcoRV切断部位へ サブクローニングした。 このプラスミ ド DNA (S8) を制限酵素 BamHIと Xholで切 断して、 ァガロースゲル電気泳動で PCR断片 （約 550塩基対） を精製したものを プローブとした。 タ一ゲッティ ングべクターで形質転換した TT2F ES細胞のゲノ ム DNAを制限酵素 EcoRIと Xholで消化し、 ァガロースゲル電気泳動で分離後サザ ンブロッ トを行ない、 上記プローブで検出した。
4. マウス抗体遺伝子軽鎖/ c破壊用べクタ一の作製
2で調製したマウス抗体軽鎖/ c J領域および定常 （C) 領域を含むゲノム DNA の C領域が含まれる DNA断片 （SacII〜BglIl ) を 1で作製した LoxP- STneo遺伝 子の Kpnl部位をつぶしたものと置き換えた （図 27) 。 STneo の転写方向は、 抗体 遺伝子の転写方向と逆向きとなっている。 このプラスミ ド DNAは以下のように構築 した。 pUC18 プラスミ ドのマルチクロ一ニング部位の配列 （EcoR卜 Hindlll)を DNA 化学合成によつて作製した配列：
5' -AATTCCCGCGGGTCGACGGATCCCTCGAGGGTACCA -3' (配列番号 6 3 )
3' - GGGCGCCCAGCTGCCTAGGGAGCTCCCATGGTTCGA-5' (配列番号 6 4 )
EcoRI SacII Sail BamHI Xhoi Kpnl Hindlll
に変換した。 このプラスミ ドの EcoRI 、 SacII 部位へ. J を含む EcoR 1 〜Sacli DNA 断片 （図 25) を挿入した。 次に、 できたプラスミ ドの BamHI 、 Xhoi部位へ 3' - 側 Bglll〜Bglll 〜BglII 〜Xhol DNA断片 （図 25) を揷入した。 このプラスミ ドの Xhoi部位、 Sail部位に順次、 DTを含む Xhoi〜SalI DNA断片、 Kpnl断片を潰し た LoxP- STneoを含む Xhoi DNA断片を挿入した。 DT遺伝子の転写方向は、 軽鎮/ 遺 伝子の転写方向と同じ向きとなる。 このプラスミ ド醒は、 大腸菌 DH5を用いて 増幅し、 セシウムクロライ ド平衡遠心により精製した。 精製したプラスミ ド DNA は、 制限酵素 Kpnlにより、 一箇所切断して TT2F ES細胞へのトランスフヱクショ ンに使用した。 形質転換体 TT2F ES細胞の中から抗体軽鎖部分がターゲッティ ン グベクタ一と相同組換えが起こったクローンを検出するための形質転換体ゲノム DNAサザンブロッ ト用のプローブとして、 軽鎖 J/c- C/ ゲノム DNA (図 25参照） の 3'端の DNA断片 （XhoI〜EcoRI ；約 1.4k塩基対） を用いた。 ターゲッティ ング べクターで形質転換した TT2F ES細胞のゲノム DNAを制限酵素 EcoRIで消化し、 ァガロースゲル電気泳動で分離後サザンブロッ 卜を行ない、 上記プローブで検出 した。
(実施例 49) マウス ES細胞抗体重鎖遺伝子破壊株の取得
抗体重鎖遺伝子相同組換え体取得の為、 実施例 48-3で作成した抗体重鎖ターゲ ッティ ングベクターを制限酵素 SacII (宝酒造） で線状化し、 （相沢慎一、 バイ ォマニュアルシリーズ 8,ジーンターゲティ ング， 羊土社， 1995) の方法に従いマ ウス ES細胞 TT2Fへ導入した。 TT2F細胞をト リプシン処理し、 2.5xl07個/ mlとな るように HBSに懸濁してから 5〃gDNAを加え、 ジーンパルサ一 （バイオラッ ド、 抵抗器ュニッ ト接続せず） を用いてエレク トロポレーシヨ ンを行なった。 960〃
Fの容量で 250Vの電圧を4 長のエレク トロポレーションセルを用いて室温で印 加した。 エレク トロポレーシヨンした細胞を 20mlの ES培地に懸濁し、 あらかじめ フィ一ダ一細胞をまいた 100mm組織培養用プラスチックシャーレ （コ一ニング） 2枚に播種した。 同様に 10， 15 / gDNAを用いた実験も行った。 1 日後に 300〃 g/ mlの G418 (GENETI C IN， シグマ） を含む培地と置き換えた。 7〜9日後に生じたコ ロニ一計 176個をピックアップし、 それぞれを 12穴プレー 卜でコンフル一ェント になるまで増殖させ、 その 4/5を 0. 2miの保存用培地 （ES培地 H0?0DMS0くシグマ >) に懸濁し、 -80°Cにて凍結保存した。 残りの 1/5は 12穴ゼラチンコー トプレ 一 卜に播種し、 2日間培養して、 106〜107個の細胞からゲノム DNAを Puregene
DNA I so lat i on Ki t (Gen t ra Sys tem社） により調製した。 これらの G418耐性 TT 2F細胞ゲノム DNAを制限酵素 EcoR iと Xho i (宝酒造） で消化し、 ァガロースゲル 電気泳動で分離後サザンブロッ 卜を行ない、 実施例 48- 3に示したプローブで相同 組換え体を検出した。 その結果 176株中 3株が相同組換え体であるという結果を 得た。 野生型 TT2F細胞及び相同組換え体 #131、 #141のサザンブロッ 卜解析の結果 を （図 28) 左側 3レーンに示す。 野生型 TT2F細胞では EcoR I、 Xho i消化により 2 本のバン ド （a、 b) が検出された。 相同組換え体においては、 これらのいずれ かのバンドが消失し、 新たに下部にバンド （c) が現われることが予想される。 図中 #131, #141において aのバンドが消失し、 新たに cのバンドが出現している 。 図中左側には DNAの大きさを示した。 すなわちこれらのクローンは抗体重鎖遺 伝子の片方のァレルが相同組換えにより破壊されたものである。
(実施例 50) 抗体重鎖相同組換え体 ES細胞からのキメラマウス作成
(実施例 49) で得られた抗体重鎖相同組換え体 TT2F細胞株 #131を凍結ス 卜ック より立ち上げ、 I CRまたは MCH( I CR) (日本クレア社） 雄雌マウスの交配により得 られた 8細胞期胚に胚あたり 10〜12個注入した。 ES細胞用培地 （実施例 9) で一 晚培養して胚盤胞に発生させた後、 偽妊娠処理後 2. 5日の仮親 Rマウス （日本 クレア社） の子宮に片側の子宮あたり約 10個のィンジ クション胚を移植した。 計 94個の注人胚を移植した結果、 22匹の子マウスが誕生した。 キメラ個体は、 毛 色において宿主胚 （I CR) 由来の白色の中に TT2F細胞由来の野生色 （濃茶） が認 められるかどうかにより判定される。 誕生した 22匹のうち毛色に明らかに野生色 の部分のある、 すなわち、 ES細胞の貢献の認められる個体は 18匹であった。 うち 16個体は毛色の 80%以上が野生色の （ES細胞に由来する） 雌キメラマウスであつ た。 この結果より、 抗体重鎖相同組換え体 ES細胞株 31はキメラ形成能を保持し ていることが確認された。 得られたキメラマウスのうち多くの個体は非常に高い 貢献率を示す雌であるので、 ES細胞が機能的な生殖細胞 （卵子） に分化している 可能性が高い。 キメラマウスのうち 100%の貢献率を示す雌キメラ 2個体を
R)雄マウスと交配した結果、 生まれた子マウスはすべて野性色を示した。 これら の子マウスは # 13 1由来であり （実施例 42参照）、 2匹に 1匹の割合で破壊された 抗体重鎖ァレルが伝達していると考えられる。
(実施例 51 ) 抗体重鎖相同組換え体からの 2重破壊株の取得
片側ァレルが G418耐性遺伝子の揷人により破壊された ES細胞株において、 培養 液中の G418濃度を上げて培養することにより得られる高濃度 G418耐性株をスクリ
—ニングすれば両側ァレル共に破壊された株を取得することが可能なことが報告 されている （相沢慎一ら、 バイオマニュアルシリーズ 8， ジーンターゲテイ ング， 羊土社， 1995) 。 これに基づき、 我々は TT2F抗体重鎖相同組換え体 # 131， # 141に ついて両側アレルの破壊株取得の為、 以下の実験を行った。 まず、 # 131， # 141両 株について致死 G418濃度検定のため 35mmシャーレ各 10枚 （この実施例においては 栄養細胞はマイ トマイシン処理をしていない G418耐性初代培養細胞 （ライフテツ クオリエンタル社より購人） を使用した。 実施例 9参照） に 1枚あたり約 100個 の細胞を播種し、 0， 0. 5， 1 , 2, 3, 5， 8, 10, 15, 20 mg/m l の G418 ( GENET I C I
N、 シグマ） をそれぞれ含む ES培地中で 10日間培養した。 その結果 3mg/mlの濃度 までは明らかなコロニーが認められたが、 5mg/m 1ではコロニー形成は認められな かった。 この結果をもとに最小致死濃度を 5mg/mlと決定し、 4, 5， 6， 7， 8mg/ml の各濃度で高濃度 G418耐性株の選抜を行った。 #131， # 141それぞれについて 100m mシャーレ計 10枚に 夂当たり約 106個の細胞を播種し、 上記の各濃度の G418を 含む ES培地 （5段階、 各濃度シャーレ 2枚づつ） により培養した。 培養開始 12曰 後に 7mg， 8mg/m lのシャーレにおいて明らかなコロニー （#131 ： 12株、 141 : 10 株） をピックアップし、 実施例 49と同様に凍結保存、 DNA取得を行った。 これら の高濃度 G418耐性株ゲノム DNAを制限酵素 EcoR Iと Xho l (宝酒造） で消化し、 ァ ガロースゲル電気泳動で分離後サザンブロッ トを行ない、 実施例 48- 3に示したプ ローブで両側アレルの破壊された株を検出した。 その結果 # 131株由来の 1株 （ ΐ 31 -3) が両側アレル破壊株であるという結果を得た。 ΐη31由来の 6株についての サザンブロッ ト解析の結果を （図 28) に示す。 野生型 TT2F細胞では EcoR I、 Xho l 消化により 2本の野生型バン ド （a、 b) が検出された。 片側アレル相同組換え 体 131， ί 141 ) においては、 上部のバン ド aが消失し、 新たにバン ド cが現わ れた （実施例 49) 。 さらに両側アレルが破壊されることにより、 もう一方の野生 型バン ド bが消失し、 破壊型バン ド cのみとなることが予想される。 図中 3 (# 1 31 -3) のクローンにおいてこのバン ドパターンが観察された。 すなわちこのクロ ーンは抗体重鎖遺伝子の両方のアレルが破壊されたものである。
(実施例 52) 抗体重鎖欠損ホモ接合体 TT2F細胞株からの G418耐性マーカー遺伝子 の除去
実施例 51で取得された抗体重鎖両側アレル破壊株 （高濃度 G418耐性株 #131 - 3) の G418耐性マーカ一遺伝子を以下の手順により除去した。 G418耐性マーカー遺伝 子の両側に挿入した l oxP配列 （実施例 48- 1 ) の間で部位特異的組換えを起こす Cr eレコンビナーゼ遺伝子を含む発現べクタ一 pBS185 ( BRL) を （相沢慎一、 バイ ォマニュアルシリーズ 8，ジーンターゲティ ング， 羊土社， 1995、 及び高津聖志ら
、 実験医学別冊、 免疫研究の基礎技術、 p255-、 1995、 羊土社） の方法に従い # 1
31 - 3株へ導入した。 #131 - 3細胞をトリプシン処理し、 2. 5x l07個/ mlとなるよう に HBSに懸濁してから 30〃gの pBS 185DNAを加え、 ジーンパルサ一 （バイオラッ ド、 抵抗器ュニッ 卜接続せず） を用いてエレク トロポレーシヨ ンを行なった。 96
0〃Fの容量で 250Vの電圧を 4imn長のエレク トロポレーシヨンセル （165-2088、 バイオラッ ド） を用いて印加した。 エレク トロボレ一シヨンした細胞を 5mlの ES 培地に懸濁し、 あらかじめフィ一ダ一細胞をまいた 60删組織培養用プラスチック シャーレ （コ一二ング） 夂に播種した。 2日後に細胞をトリブシン処理し、 フ ィ一ダ一細胞をまいた lOOmnrンャ一レ 3枚にそれぞれシャーレ 夂当たり 100、
200、 300細胞となるように再度播種した。 ジーンパルサ一の設定 （抵抗器ュニ ッ ト接続、 抵抗値無限大） のみ変更した条件でも同様に行った。 7日後に生じた コロニー計 96個をピックアップし、 ト リプシン処理した後 2つに分け、 フィーダ
—細胞をまいた 48穴プレー ト及びゼラチンコ一 ト処理のみを行った 48穴プレー 卜 2枚にそれぞれ播種した。 後者は 300 / mlの G418 (GENET I C IN, シグマ） を含 む培地で 3日間培養し、 その生存率で G418耐性を判定した。 その結果 6クローン が G418存在下で死滅した。 これらの G418感受性株を 35誦シャーレでコンフル一ェ ン 卜になるまで増殖させ、 その 4/5を 0. 5mlの保存用培地 （ES培地 + 10¾DMS0くシ グマ〉） に懸濁し、 - 80°Cにて凍結保存した。 残りの 1/5は 12穴ゼラチンコート プレートに播種し、 2日間培養して、 106〜107個の細胞からゲノム DNAを Pure gene DNA I so la t i on Ki t (Cen tra Sys tem社） により調製した。 これらの G418感 受性 TT2F細胞株ゲノム DNAを制限酵素 EcoR I (宝酒造） で消化し、 ァガロースゲ ル電気泳動で分離後サザンブロッ トを行ない、 G418耐性遺伝子を含む pSTneoB由 来 3. 2kb Xho l断片 （プローブ A ) で G418耐性遺伝子の除去を確認した。 その結果 、 #131 - 3において観察される、 プローブ Aとハイブリダィズするバン ドが、 感受 性株においては全く検出されなかった。 これらの結果より、 取得された G418感受 性株において確かに G418耐性マーカ一遺伝子が除去されていることが確認された 。 さらに上記と同様な方法で pBS 185DNAを EcoR I消化したプローブ Bを用いてサ ザン解析を行った結果、 これら G418感受性株にプローブ Bとハイプリダイズする 特異的なバン ドは検出されなかったことから、 Creレコンビナーゼを含む PBS185 は感受性株染色体に揷入されていないと考えられる。 すなわち、 これらの感受性 株は実施例 48 - 4に示した抗体軽鎖ノ ックァゥ トベクター （G418耐性遺伝子の両側 に Ι οχΡ配列が存在する） による形質転換を行うことができる。 この G418感受性株 #131 - 3- 5より実施例 40の方法に従って、 キメラマウスを作製した。 その結果、 毛 色のキメラ率 100¾のマウスが得られた。
(実施例 53) 抗体重鎖欠損 ES細胞株へのヒ ト 14番染色体 （抗体重鎖） の導入
(実施例 52) で得られた、 内在性の抗体重鎖を欠損するマウス ES細胞株 （TT2F 由来、 G418感受性） に （実施例 9) で示した通りに G418耐性遺伝子によりマ一キ ングされたヒ 卜 14番染色体 （抗体重鎖遺伝子を含む） をミクロセル法により導人 する。 得られる G418耐性株において PCR解析等 （実施例 9) によりヒ ト抗体重鎖 遺伝子を含むヒ ト 14番染色体 （断片） の保持が確認される。
(実施例 54) ヒ ト 14番染色体 （断片） を保持する抗体重鎖欠損 ES細胞株へのヒ ト
2番染色体断片ある 、は 22番染色体の導入 (実施例 53) ,で得られた、 ヒ ト 14番染色体断片を保持する抗体重鎖欠損マウス ES細胞株 （G418耐性） に （実施例 18、 35) で示した通りにピューロマイ シン耐性 遺伝子によりマ一キングされたヒ 卜 2番染色体断片 （抗体軽鎖 /C遺伝子を含む） あるいはヒ ト 22番染色体 （抗体軽鎖； I遺伝子を含む） をミ クロセル法により導入 する。 得られるピューロマイ シン、 G418二重薬剤耐性株において PCR解析等 （実 施例 18、 35) によりヒ ト 14番染色体 （断片） 及び 2番染色体断片あるいは 22番染 色体 （断片） の保持が確認される。
(実施例 55) ヒ 卜抗体重鎖遺伝子を含む 14番染色体 （断片） を保持する内在性抗 体重鎖欠損マウス ES細胞からのキメラマウス作成
(実施例 53) で取得されるヒ ト抗体重鎖遺伝子を含む 14番染色体 （断片） を保 持する内在性抗体重鎖遺伝子欠損マウス ES細胞株からのキメラマウス作成は （実 施例 10) で示した方法により行う。 ここで得られるキメラマウスにおいては、 ES 細胞株由来の B細胞で産生されるヒ ト抗体重鎖が （実施例 14) で示した方法によ り検出される。 また、 この ES細胞由来の B細胞において機能的な抗体重鎖遺伝子 は導入染色体上のヒ ト由来のもののみであるので、 ES細胞株由来 B細胞の多くは ヒ ト抗体重鎖を産生する。
(実施例 56) ヒ ト 14番 + 2番、 14番 + 22番染色体 （断片） を保持する内在性抗体 重鎖欠損マウス ES細胞からのキメラマウス作成
(実施例 54) で取得されるヒ ト 14番 + 2番、 14番 + 22番染色体 （断片） を保持 する内在性抗体重鎖遺伝子欠損マウス ES細胞株からのキメラマウス作成は （実施 例 19、 36) 等で示した方法により行う。 ここで得られるキメラマウスにおいては、 ES細胞株由来の B細胞でヒ ト抗体重鎖及び軽鎖/ cあるいは軽鎖 λが （実施例 14、 23、 32) で示した方法により検出される。 また、 （実施例 55) と同様にこの ES細 胞由来の Β細胞において機能的な抗体重鎖遺伝子は導入染色体上のヒ 卜由来のも ののみであるので、 ES細胞由来 Β細胞の多くはヒ ト抗体重鎖を産生する。 さらに、
(実施例 37、 38) で示したように重鎖、 軽鎖が共にヒ 卜由来である完全なヒ ト抗 体分子が検出される。
(実施例 57) ヒ ト 14番 + 2番、 14番 + 22番染色体 （断片） を保持する内在性抗体 重鎖欠損マウス ES細胞由来キメラマウスからのヒ ト抗体産生ハイプリ ドーマ取得 (実施例 15、 25、 34) と同様に （実施例 56) で作成されるキメラマウスに目的 とする抗原で免疫し、 脾臓を取り出し、 ミエローマ細胞と細胞融合し、 ハイプリ ドーマを作成する。 1〜3週間培養し培養上清を EL I SA法で解析する。 EL 1 SA法 は （実施例 14、 15、 21、 24、 25、 33、 34、 37、 38) に示した方法で行ない、 ヒ 卜 抗体陽性及びヒ ト抗体陽性かつ免疫した抗原特異的クローンを得る。
(実施例 58) 抗体重鎖欠損ホモ接合体マウス ES細胞からの抗体軽鎖遺伝子破壊株 の取得
実施例 52で取得した抗体重鎖欠損ホモ接合体 TT2F細胞株 （G418感受性） におい てさらに抗体軽鎖遺伝子を破壊した相同組換え体を以下の手順で取得した。 実施 例 48- 4で作製した抗体軽鎖ターゲッティ ングベクタ一を制限酵素 Κρη ί (宝酒造） で線状化し、 （相沢慎一、 バイオマニュアルシリーズ 8， ジーンターゲティ ング， 羊土社， 1995) の方法に従い実施例 49と同様に上記 TT2F細胞株 （G418感受性） へ 導入した。 すなわち、 細胞を HBSに懸濁し、 2. 5 X 107 ce l l s/mlの懸濁液とした 後、 DNA 5 〃g を 0. 5 mlの細胞懸濁液に加え、 エレトクロポレーシヨンセルに 96
0 F 、 250 V の電圧を印加した。 7〜9日後に生じたコロニーをピックアップ し、 実施例 49に示した方法で凍結保存、 ゲノム DNAを取得した。 G418耐性株ゲノ ム DNAを制限酵素 EcoR l (宝酒造） で消化し、 ァガロースゲル電気泳動で分離後 サザンプロッ ト解析を行ない、 実施例 48- 4に示したプローブで相同組換え体を検 出した。 結果を図 29に示す。 親株である抗体重鎖欠損ホモ接合体 TT2F細胞では Ec oR I 消化により 1本のバン ド（a) が検出された。 相同組み換え体においては、 こ のバン ドに加えて新たに下部にバン ド（b) が現れることが予想される。 図中、 形 質転換株 2 、 5 において（b) のバンドが出現している。 図中、 左側には DNA の大 きさを示した。 すなわち、 これらのクローンは抗体軽鎖遺伝子の片方のアレルが 相同組み換えによって破壊されたものである。 解析した 120 株中 28株の相同組み 換え体を得た。 これらのクローンは、 通常の培養条件において、 遺伝子破壊以前 の TT2F株と比較して、 増殖速度および形態に変化が見られず、 キメラマウス形成 能を保持していることが示唆される。
(実施例 59) 抗体軽鎖相同組換え体からの 2重破壊株の取得
実施例 58で得られた TT2F抗体軽鎖相同組換え体 （かつ抗体重鎖欠損ホモ接合体 ) について軽鎖両側アレルの破壊株を以下の手順により取得した。 実施例 51と同 様な方法で高濃度 G418耐性株を取得した。 G418濃度 9〜14 mg/mlの 5〜 7 日間培 養を行った後、 G418濃度を 4 mg/ml に下げ培養し、 培養開始から 10〜 13曰後に生 じたコロニーをピックアップし、 実施例 51と同様な方法で凍結保存、 DNA取得を 行なった。 高濃度 G418耐性株ゲノム DNAを制限酵素 EcoR Iと No t i (宝酒造） で消 化し、 ァガロースゲル電気泳動で分離後サザンブロッ トを行ない、 実施例 48- 4に 示したプローブで両側アレルの破壊された株を検出した。 サザンブロッ ト解析の 結果を図 32に示す。 2重破壊株では図 32の（a) のバンドが消失し、 バン ド（b) の みになることが予想される。 図中、 高濃度 G418耐性株 2 、 3 、 8 においてバン ド が消失している。 すなわち、 これらクローンは抗体軽鎖遺伝子の両側のアレルが 破壊されたものである。 それぞれ独立した片側ァレル破壊株 3株から得られた高 濃度耐性株を解析し、 それぞれ 59株中 36株、 43株中 2株、 49株中 1株の抗体軽鎖 遺伝子の両側のァレルが破壊されたクローンを取得した。 これらのクローンは、 通常の培養条件において、 遺伝子破壊以前の TT2F株と比較して、 増殖速度および 形態に変化が見られず、 キメラマウス形成能を保持していることが示唆される。
(実施例 60) 抗体軽鎖欠損ホモ接合体 （かつ抗体重鎖欠損ホモ接合体） TT2F細胞 株からの G418耐性マーカ一遺伝子の除去
実施例 59で取得された抗体軽鎖両側アレル破壊株 （高濃度 G418耐性株） の G418 耐性マーカ一遺伝子を実施例 52で示した手順により除去した。 G418耐性マーカ一 遺伝子の両側に挿入した Ι οχΡ配列 （実施例 48- 1) の間で部位特異的組換えを起こ す Creレコンビナーゼ遺伝子を含む発現ベクター pBS185 (BRL) を実施例 52の方 法に従い上記の株へ導人した。 実施例 52と同様に得られる G418感受性株を 35腳シ ヤーレでコンフル一ェン卜になるまで増殖させ、 その 4/5を 0. 5mlの保存用培地
(ES培地 H0¾DMS0くシグマ〉） に懸濁し、 -80°Cにて凍結保存した。 残りの 1/5 は 12穴ゼラチンコー トプレー トに播種し、 2日間培養して、 106〜107個の細胞 からゲノム DNAを Puregene DNA I so l at i on Ki t (Gen tra Sys tem社） により調製 した。 これらの G418感受性 TT2F細胞ゲノム DNAを制限酵素 EcoR l (宝酒造） で消 化し、 ァガロースゲル電気泳動で分離後サザンブロッ トを行ない、 G418耐性遺伝 子を含む pSTneoB由来 3. 2kbXho l断片をプローブとし、 G418耐性遺伝子の除去を 確認した。
(実施例 61)
( 1) 内在性抗体重鎖、 / 鎖欠損 ES細胞株へのヒ ト 14番染色体断片 （抗体重鎖遺 伝子を含む） の導入
(実施例 78 ) で得られた内在性の抗体重鎖及び /c鎖の両者を欠損するマウス E S 細胞株 （TT2F由来、 G418、 ピューロマイシン感受性） HKD31に （実施例 68- (2)) に示す通りヒ ト 14番染色体断片 SC20 (ヒ ト抗体重鎖遺伝子を含む） をミ クロセル 法により導入した。 ミ クロセル融合および G418耐性株の選択は （実施例 2) と同 様に行った。 得られた G418耐性株のうち 8株について I gM、 D14S543プライマ一 を用いた PCR解析 （実施例 68) を行った結果、 7株中 8株において両者が検出さ れた。 よってこれらの抗体重鎖、 鎖欠損 ES細胞株は、 ヒ ト 14番染色体断片 SC20 を保持していることが確認された。
(2) ヒ 卜 14番染色体断片 （抗体重鎖遺伝子を含む） を保持する内在性抗体重鎖 、 c鎖遺伝子欠損マウス ES細胞からのキメラマウス作成
実施例 61 - ( 1) で取得されたヒ ト 14番染色体断片 （抗体重鎖遺伝子を含む） を保持する内在性抗体重鎖、 Λ;鎖遺伝子欠損マウス ES細胞株 HKD31 -8からのキメ ラマウス作成は （実施例 10) 等で示した方法により行った。 計 188個の注人胚を 移植した結果、 25匹の子マウスが誕生した。 キメラ個体は、 毛色において宿主胚
( I CR) 由来の白色の中に TT2細胞由来の野生色 （濃茶） が認められるかどうか により判定される。 誕生した 25匹のうち毛色に明らかに野生色の部分のある、 す なわち、 ES細胞の貢献の認められる個体は 17匹であった。 うち 3個体は毛色がほ ぼ完全 （95%以上） に野生色の （ES細胞に由来する） キメラマウスであった。 この結果より、 ヒ ト 14番染色体断片 （抗体重鎖遺伝子を含む） を保持する内在 性抗体重鎖、 c鎖遺伝子欠損マウス ES細胞株はキメラ形成能を保持している、 す なわちマウス個体の正常組織に分化する能力を保持していることが確認された。
(3) ヒ ト 14番染色体断片 （抗体重鎖遺伝子を含む） を保持する内在性抗体】 、 鎖欠損マウス ES細胞由来キメラマウス血清におけるヒ ト抗体 （ヒ ト ^、 ァ、 α鎖を有する抗体） の検出
実施例 61 - (2) で作製したキメラマウス （HKD31- 8由来） から生後 12週齢 （ # 1 ) または生後— 7週齢 （# 2〜4) に採血し、 血清中のヒ ト抗体濃度を （実施 例 14) に従い EL I SA法で定量した。 PBSで希釈した抗ヒ 卜免疫グロプリ ン ^鎖抗 体 （シグマ、 16385) 、 あるいは抗ヒ 卜免疫グロブリ ンァ鎖抗体 （シグマ、 1338 2) あるいは抗ヒ ト免疫グロブリ ン 鎖抗体 （Pharmi ngen、 08091 D) を 96穴マイ クロタイ夕一プレー 卜にコ一ティ ングし、 マウス血清 （シグマ、 M5905) を加え た PBSで希釈した血清試料を加え、 次いでペルォキシダ一ゼ標識抗ヒ ト免疫グロ ブリ ン 鎖抗体 （The B i nd i ng S i te L imi ted, MP008) あるいはペルォキシダー ゼ標識抗ヒ ト免疫グロブリ ンァ鎖抗体 （シグマ、 Α0Π0) を加えてイ ンキュべ一 卜した。 あるいはピオチン標識抗ヒ 卜免疫グロブリ ン 鎖抗体 （Pharmi ngen、 08 092D) を加えてインキュベートした後、 プレー トを洗浄し、 アビジン一ペルォキ シダ一ゼ複合体 （Vector、 ABCキッ 卜 PK4000) を加えてインキュベートした。 ぺ ルォキンダーゼ基質として TMBZ (住友べ一クライ ト、 Mい 1120T) の添加により酵 素活性を 450nmの吸光度で評価し、 精製された //鎖、 ァ鎖、 鎖を持つ濃度既知 のヒ トイムノグロプリ ン I gM (CAPPEし、 6001-1590) 、 I gG (シグマ、 14506) 、 I gA (シグマ、 12636) をマウス血清を添加した PBSで段階的に希釈したもの と比較し血清中のヒ ト抗体濃度を求めた。 結果を表 20に示す。 ヒ ト抗体//および ァ鎖濃度が、 通常のマウス血清中の抗体濃度とほぼ同レベルに高い、 キメラマウ ス個体が確認された。 またヒ 卜 α鎖を発現するキメラマウス個体が確認された。 さらに （実施例 29) の方法に従い、 ヒ ト免疫グロブリンァ鎖サブクラスを検出し 、 4種のサブクラス （ァ i 、 ァ 2 、 ァ 3 、 ァ 4)すべてが検出された。
この結果からヒ ト 14番染色体断片 （抗体重鎖遺伝子を含む） を保持する内在性 抗体重鎖、 / 鎖欠損マウス ES細胞由来キメラマウスにおいてヒ ト抗体重鎖遺伝子 が効率良く発現し、 鎖さらにはクラススィツチによってすベてのァ鎖サブクラ スおよび α鎖も発現することが示された。 表 20 キメラマウス中のヒ 卜抗体濃度 （ELISA) キメラマウス キメラ率％ ヒ ト抗体 (mg/1)
I M IgG I A
Figure imgf000102_0001
(4) ヒ 卜 14番染色体断片 （抗体重鎖遺伝子を含む） を保持する内在性抗体重鎖 、 鎖欠損マウス ES細胞由来キメラマウスからのヒ ト 7鎖を含む抗 HSA抗体産生 ハイブリ ドーマの取得
実施例 61- (3) で血清中のヒ 卜抗体ァ鎖濃度が高いキメラマウス #3 (HKD31- 8由来、 キメラ率 99?0 および #4 (キメラ率 95%) に対して、 生後 16週齢から PB Sに溶解したヒ ト血清アルブミ ン （HSA、 シグマ、 A3782) とアジュバン ト （MP L+TDM Emulsion, RIBI Immunochem Reseach Inc. ) とを混合して 0· 25mg/mlの HS A溶液を調整し 0.2mlを 2週間おきに 2回腹腔に免疫し、 さらに 2週間後に PBS に溶解したヒ ト血清アルブミ ンを免疫し、 採血した。 血清中の抗 HSAヒ ト抗体濃 度を （実施例 14) に従い ELISA法で検出した。 HSAをコーティ ングし、 ペルォキ シダ一ゼ標識した抗ヒ ト Ig 抗体 （The Binding Site, MP008) 、 抗ヒ ト Igァ抗 体 （シグマ、 A1070) 、 抗ヒ ト Iga抗体 （Kirkegaard & Perry Labolatories In c, 14-10-01) を用いて検出した。 結果を図 33に示す。 ハイプリ ドーマの作製法 は く安東、 単クローン抗体実験操作入門、 講談社サイェンティ フイ ク， 1991〉 に 記された方法に従い、 ミエローマ細胞としては、 SP-2/0- Agl4 (大日本製薬） を 使用した。 最終免疫の 3日後に、 キメラマウスからひ臓を取り出し、 （実施例 24 ) に従い PEGにて細胞融合し、 ハイプリ ドーマを作製した。 同時に採血し、 （実 施例 29) の方法に従い、 血清中のヒ ト Igアサブクラスの定量を行った。 キメラマ ウス #3の血清中にはァ 1 力く 920mg/l 、 γ 2 力く 520mg/l 、 γ 3 力 img/i、 ァ 4 が 14 0mg/l 存在した。 融合後の細胞を、 ひ細胞数が 100万個/ mlとなるよう、 HCF (エア ' ブラウン ) を 5¾添加し、 HAT (大日本製薬、 o.16-808-49) あるいは lmg/mlの G418を添加 した培地 （三光純薬、 エス ' クローンクロ一ニングメデュー厶 CM- B) に希釈し、 各 wellに 100 1ずつ 96穴プレー ト分注し培養した。 培養 8日目に培養上清を採 取し、 （実施例 14) に従い ELISA法によってヒ ト抗体産生ハイブリ ド一マのスク リ一二ングを行った。 CBB緩衝液に溶解し 5 zg/mlとした HSA溶液をコ一ティ ン グし、 ペルォキシダーゼ標識抗ヒ 卜免疫グ口ブリ ン Ί鎖抗体 （シグマ、 A017.0) を用いて ΙΒΖ (住友べ一クライ 卜、 Mい 1120T) により検出した。 陰性対照の約 3 倍以上の吸光度を目安にして判定し、 キメラマウス #3より 74個、 キメラマウス #4より 29個の陽性ゥエルを得た。 また HSA溶液をコーティ ングし、 ペルォキシ ダ一ゼ標識抗ヒ 卜免疫グロプリ ン 鎖抗体 （Tago、 #2392) を用いてヒ 卜 鎖を 持つ抗 HSA扰体をスクリ一ニングした。 キメラマウス #3の融合処理細胞をまき こんだ 96穴プレー 卜 15枚の中で G418選択を行ったプレート 4枚の培養上清をスク リ一二ングし 5個の陽性ゥエルを得た。 HATあるいは lmg/mlの G418による選択で コロニー出現したゥエルはプレート 1枚あたり各々、 74個および 29個であった。 ヒ トァ鎖を持つ抗 HSA抗体陽性で、 細胞数が比較的多いゥエルの細胞を 48穴プレ 一 卜に移しさらに 4日間培養し、 培養上清中の抗体のアイソタイプを ELISAによ り決定した。 HSA溶液をコーティ ングし、 アルカリフォスファターゼ標識した抗 ヒ HgGl抗体 (Zymed labolator ies, Inc.. 05-3322) 、 抗ヒ ト IgG2抗体 (Zyme d labolatories, Inc. N 05-3522) 、 抗ヒ 卜 IgG3抗体 (Zymed labolatories, Inc .、 05-3622) 、 抗ヒ ト IgG4抗体 (Zymed labolatories, Inc. , 05-3822) を用 いて (実施例 14) に従い ELISAを行い判定した。 陽性クローンはヒ ト IgGlが 27、 IgG2が 11、 lgG3が 2、 IgG4が 13クローンあった。 キメラマウス # 4の融合処理細 胞も同様に判定し、 細胞数の多いクローン 4株を判定し、 ヒ ト IgGl産生クローン を得た。
この結果よりヒ 卜抗体遺伝子 （重鎖） を含む 14番染色体部分断片を保持する内 在性抗体重鎖、 軽鎖欠損マウス ES細胞由来キメラマウスにヒ トのタンパク （HSA
) を免疫することによって、 抗原特異的ヒ ト 、 ァおよび《抗体価の上昇が起 り、 鎖およびすベてのヒ トァ鎖サブクラスを含む抗 HSA抗体産生ハイプリ ドー マの取得が可能であることが示された。
(実施例 62) ヒ ト 14番染色体断片 （抗体重鎖遺伝子を含む） を保持する内在性抗 体重鎖、 /c鎖欠損マウス ES細胞へのヒ 卜 2番染色体 （軽鎖/ 遺伝子を含む） の導 入
実施例 61 - ( 1 ) で得られた、 内在性抗体重鎖及び c鎖欠損かつヒ ト 14番染色 体断片 （抗体重鎖遺伝子を含む） を保持するマウス ES細胞株 HKD31 - 8に （実施例 18) で示した通りにピューロマイシン耐性遺伝子でマ一キングされたヒ ト 2番染 色体断片 （抗体軽鎖 c遺伝子を含む） をミクロセル法により導入した。 その結果 得られたピューロマイシン、 G418二重耐性株 13株について PCR解析 （実施例 18) を行つた。 使用したプライマ一は 14番染色体断片については 1 および D 14S543 の 2種 （実施例 68) 、 2番染色体断片については V /c 1および FABP1の 2種 （実 施例 12) である。 その結果、 8株において 4種全てのマ一力一の存在が確認され た。 そのうち KH13株についてはヒ ト染色体特異的プローブを用いて F ISH解析を行 つた （実施例 9、 12) 。 その結果を図 34に示す。 KH13においてはプローブにハイ ブリダィズする独立した染色体小断片が 2本観察された。 これらの結果より、 KH 13は 14番染色体断片および 2番染色体断片を同時に保持することが示された。
(実施例 63) ヒ ト 14番染色体断片 （抗体重鎖遺伝子を含む） を保持する内在性抗 体重鎖、 Λ;鎖欠損マウス ES細胞へのヒ ト 22番染色体 （軽鎖 I遺伝子を含む） の導 入
実施例 61 - (1) で得られた、 内在性抗体重鎖及び/ c鎖欠損かつヒ ト 14番染色 体断片 （抗体重鎖遺伝子を含む） を保持するマウス ES細胞株 HKD31- 8に （実施例
35) で示した通りにピューロマイシン耐性遺伝子でマーキングされたヒ ト 22番染 色体 （抗体軽鎖； I遺伝子を含む） をミ クロセル法により導人した。 その結果得ら れたピューロマイシン、 G418二重耐性株 12株について PCR解析 （実施例 35) を行 つた。 使用したプライマ一は Μ番染色体断片については I および D14S543の 2 種、 22番染色体断片については I g A、 D22S315. D22S275、 D22S278, D22S272
、 D22S274の 6種 （実施例 2) である。 その結果、 10株において 8種全てのマ一 カーの存在が確認された。 残り 2株のうち LH13株においては 8種中 l g\'l， D 14S543 , I g l , D22S275, D22S274の 5種のマーカ一のみが確認されたので、 この株は断 片化されたヒ ト 22番染色体を含むと考えられる。 さらに LH13についてはヒ ト 22番 染色体特異的プ口一ブぉよびヒ ト 番染色体特異的プローブを各々用いて F 1 SH解 析を行った。 その結果、 それぞれのプローブにハイブリダィズする独立した染色 体断片が観察された。 すなわちこの株は 14番染色体断片および 22番染色体断片を 同時に保持することが示された。
(実施例 64) ヒ 卜 2番 （抗体軽鎖/ c ) 、 14番 （抗体重鎖） 、 22番 （抗体; I鎖） 染 色体あるいはその部分断片を同時に保持する内在性抗体重鎖、 軽鎖欠損マウス ES 細胞の取得
3種のヒ ト染色体を同時に保持するマウス ES細胞を得るために、 ヒ ト 2番ある いは 22番染色体をブラス トサイ ジン耐性 （I zumiら、 Exp. Ce l l . Res.， 197， 22 9， 1991 ) 、 ハイグロマイシン耐性 （Wi ndら、 Ce l l , 82, 321 -， 1995) 等のマー カー遺伝子の挿入によりマ一キングする。 これは （実施例 16、 26) に示した方法 により行う。 （実施例 62) で得られた、 内在性抗体重鎖及び軽鎖欠損でありかつ ヒ 卜 14番染色体 （断片） 及び 2番染色体部分断片を保持するマウス ES細胞株 （TT 2F由来、 G418耐性、 ピューロマイシン耐性） に （実施例 9) で示した方法と同様 にブラス 卜サイジン耐性あるいはハイグロマイシン耐性等でマーキングされたヒ ト 22番染色体 （ヒ ト抗体軽鎖; I遺伝子を含む） を導入する。 ES細胞培養用のフィ ーダ一細胞はそれぞれの選択マ一カーに適したものを使用する。 ハイグロマイシ ン耐性マーカーを使用する場合は、 そのマ一力一を保持し、 発現する トランスジ エニックマウス系統より得た初代培養繊維芽細胞 （Johnsonら、 Nuc i e i c Ac i ds Research, vo l . 23, No. 7, 1273-, 1995) を使用する。 得られる G418、 ピュー ロマイシン、 ハイグロマイシン （あるいはブラストサイジン） 三重耐性株は上記 3種のヒ ト染色体 （断片） を保持していること力 <PCR解析等 （実施例 9、 18、 35 ) により確認される。 （実施例 63) で得られた内在性抗体重鎖及び軽鎖欠損であ りかつヒ ト 14番染色体 （断片） 及び 22番染色体 （断片） を保持するマウス ES細胞 株 （TT2F由来、 G418耐性、 ピューロマイシン耐性） へのハイグロマイシンあるい はブラストサイジン耐性遺伝子でマ一キングされたヒ 卜 2番染色体断片の導人も 同様に行う。
(実施例 65) ヒ ト抗体重鎖および軽鎖遺伝子をそれぞれ含む複数の染色体 （断片 ) を同時に保持する内在性抗体重鎖、 軽鎖遺伝子欠損マウス ES細胞からのキメラ マウス作成
(実施例 61、 62、 63、 64) で取得されるヒ ト抗体遺伝子を含む染色体 （断片） を保持する内在性抗体重鎖、 軽鎖遺伝子欠損マウス ES細胞株からのキメラマウス 作成は （実施例 10) 等で示した方法により行う。 ここで得られるキメラマウスに おいては、 宿主胚由来の B細胞で産生されるマウス抗体と ES細胞株由来の B細胞 で主に産生されるヒ ト抗体が （実施例 14、 23、 32) で示した方法により検出され る。 また、 この ES細胞由来の B細胞において機能的な抗体重鎖及び軽鎖/ c遺伝子 は導入染色体上のヒ ト由来のもののみであるので、 ES細胞由来の B細胞の多くは ヒ ト抗体重鎖及び軽鎖/ を産生する （ Lonbergら， Nature, 368, 856-, 1994) 。 さらに、 （実施例 37、 38) で示した方法により重鎖、 軽鎖が共にヒ ト由来であ る完全なヒ ト抗体分子が検出される。
( 1) ヒ ト 14番染色体断片 （抗体重鎖遺伝子を含む） 及びヒ ト 2番染色体断片 （ 軽鎖/ c遺伝子を含む） を同時に保持する内在性抗体重鎖、 /c鎖遺伝子欠損マウス ES細胞からのキメラマウス作成
実施例 62で取得されたヒ ト 14番染色体断片 （抗体重鎖遺伝子を含む） 及びヒ ト 2番染色体断片 （軽鎖/ c遺伝子を含む） を同時に保持する内在性抗体重鎖、 /c鎖 遺伝子欠損マウス ES細胞株 KH13からのキメラマウス作成は （実施例 10) 等で示し た方法により行った。 計 176個の注入胚を移植した結果、 20匹の子マウスが誕生 した。 キメラ個体は、 毛色において宿主胚 （I CR) 由来の白色の中に TT2細胞由 来の野生色 （濃茶） が認められるかどうかにより判定される。 誕生した 20匹のう ち毛色に明らかに野生色の部分のある、 すなわち、 ES細胞の貢献の認められる個 体は 7匹であった。
この結果より、 ヒ ト 14番染色体断片 （抗体重鎖遺伝子を含む） 及びヒ 卜 2番染 色体断片 （軽鎖/ ί遺伝子を含む） を同時に保持する内在性抗体重鎖、 鎖遺伝子 欠損マウス ES細胞株はキメラ形成能を保持している、 すなわちマウス個体の正常 組織に分化する能力を保持していることが確認された。
(2) ヒ ト 14番染色体断片 （抗体重鎖遺伝子を含む） 及びヒ 卜 22番染色体断片 （ 軽鎖 I鎖遺伝子を含む） を同時に保持する内在性抗体重鎖、 c鎖遺伝子欠損マウ ス ES細胞からのキメラマウス作成
実施例 63で取得されたヒ 卜 14番染色体断片 （抗体重鎮遺伝子を含む） 及び.ヒ ト 22番染色体断片 （軽鎖； I遺伝子を含む） を同時に保持する内在性抗体重鎖、 鎖 遺伝子欠損マウス ES細胞株 LH13からのキメラマウス作成は （実施例 10) 等で示し た方法により行った。 計 114個の注入胚を移植した結果、 22匹の子マウスが誕生 した。 キメラ個体は、 毛色において宿主胚 （ICR) 由来の白色の中に TT2細胞由 来の野生色 （濃茶） が認められるかどうかにより判定される。 誕生した 22匹のう ち毛色に明らかに野生色の部分のある、 すなわち、 ES細胞の貢献の認められる個 体は 5匹であつた。
この結果より、 ヒ ト 14番染色体断片 （抗体重鎖遺伝子を含む） 及びヒ 卜 22番染 色体断片 （軽鎖 λ鎖遺伝子を含む） を同時に保持する内在性抗体重鎖、 c鎖遺伝 子欠損マウス ES細胞株はキメラ形成能を保持している、 すなわちマウス個体の正 常組織に分化する能力を保持していることが確認された。
(3) ヒ 卜 2番染色体部分断片及びヒ 卜 14番染色体部分断片を同時に保持する内 在性抗体重鎖、 / 鎖欠損マウス ES細胞由来キメラマウス血清における完全ヒ ト抗 体の検出 ·定量
実施例 65- (1) で作製したキメラマウス （KH13由来） から生後 40日目に採血 し、 血清中のヒ 卜抗体濃度を （実施例 14) に従い ELISA法で検出した。 PBSで希 釈した抗ヒ 卜免疫グロブリ ン 鎖抗体 （Kirkegaard & Perry Labolatories Inc.
、 01-10-10) あるいは抗ヒ ト免疫グロブリ ン/ c鎖抗体 （Vector、 AI-3060) をコ 一ティ ングし、 マウス血清 （シグマ、 M5905) を加えた PBSで希釈した血清試料 を加え、 次いでペルォキシダ一ゼ標識抗ヒ 卜免疫グロブリ ン /鎖抗体 （The Bind ing Site Limited, P008) あるいはペルォキシダ一ゼ標識抗ヒ ト免疫グロブリ ンァ鎖抗体 （シグマ、 A0170) を加えてインキュベー トした。 ペルォキシダーゼ 基質として TMBZ (住友べ一クライ ト、 Mい 1120T) の添加により酵素活性を 450nm の吸光度で評価し、 精製された 鎖と / 鎖を持つ濃度既知のヒ トイ厶ノグロプリ ン IgM (Caltag, 1-3000) 、 IgG (シグマ、 14506) をマウス血清を添加した PB Sで段階的に希釈したものと比較し血清中のヒ 卜抗体濃度を求めた。 結果を表 21 に示す。 完全ヒ 卜抗体濃度が内在性遺伝子を破壊しない ES細胞から作製されたキ メラマウスに比べて、 10倍以上高いキメラマウス個体が確認された。 またヒ.トァ 鎖を含む完全抗体がキメラマウス血清中に確認された。
この結果よりヒ 卜 14番染色体部分断片及びヒ ト 22番染色体部分断片を保持する 内在性抗体重鎖、 c鎖欠損マウス ES細胞由来キメラマウスにおいて、 重鎖と軽鎖 がともにヒ 卜である完全ヒ 卜抗体濃度が上昇することが確認された。 表 21 キメラマウス中のヒ ト抗体濃度（ELISA)
ESクローン キメラマウス キメラ率％ IgM, κ (mg/1) IgG, κ (mg/1) KH13 CKH13-1 95 0.1 0.07
KH13 CKH13-2 85 0.9 0.13
(4) ヒ ト 14番染色体部分断片及びヒ ト 22番染色体部分断片を保持する内在性抗 体重鎖、 鎖欠損マウス ES細胞由来キメラマウス血清における完全ヒ ト抗体の検 出 ·定量
実施例 65- (2) で作製したキメラマウス （LH13由来） からから生後 49日目に 採血し、 血清中のヒ ト抗体濃度を （実施例 14) に従い ELISA法で検出した。 PBS で希釈した抗ヒ 卜免疫グロブリ ン； I鎖抗体 （Kirkegaard & Perry Labolatories
Inc.、 01-10-11) あるいは抗ヒ ト免疫グロブリ ン； I鎖抗体 （Vector, AI-3070) をコーティ ングし、 マウス血清 （シグマ、 M5905) を加えた PBSで希釈した血清 試料を加え、 次いでペルォキシダ一ゼ標識抗ヒ 卜免疫グロプリ ン 鎖抗体 （The
Binding Site Limited, MP008) あるいはペルォキシダ一ゼ標識抗ヒ ト免疫グロ ブリ ンァ鎖抗体 （シグマ、 A0170) を加えてインキュベー トした。 ペルォキシダ ーゼ基質として TMBZ (住友べ一クライ ト、 Mい 1120T) の添加により酵素活性を 45 Onmの吸光度で評価し、 精製された//鎖と / c鎖を持つ濃度既知のヒ トイムノグロ ブリ ン IgM (Caltag, 13000) 、 IgG (シグマ、 14506) をマウス血清を添加し た PBSで段階的に希釈したものと比較し血清中のヒ ト抗体濃度を求めた。 結果を 表 22に示す。 完全.ヒ 卜抗体濃度が内在性遺伝子を破壊しない ES細胞から作製され たキメラマウスに比べて、 約 40倍高いキメラマウス個体が確認された。 またヒ ト 7鎖を含む完全抗体がキメラマウス血清中に確認された。
この結果よりヒ 卜 14番染色体部分断片及びヒ ト 22番染色体部分断片を保持する 内在性抗体重鎖、 c鎖欠損マウス ES細胞由来キメラマウスにおいて、 重鎖と軽鎖 がともにヒ トである完全ヒ ト抗体濃度が上昇することが確認された。 表 22 キメラマウス中のヒ 卜抗体濃度（ELISA)
ESクローン キメラマウス キメラ率％ IgM, λ (mg/1) I G, λ (mg/1) LH13 CLH13-1 95 13 2.6
LH13 CLH13-2 90 2.8 0.36
(実施例 66) ヒ 卜 14番染色体部分断片及びヒ ト 22番染色体部分断片を保持する内 在性抗体重鎖、 軽鎖欠損マウス ES細胞を免疫不全マウス宿主胚に移人して作製し たキメラマウスからの完全ヒ 卜抗体産生ハイブリ ドーマの取得
(実施例 67- (3)) で作製されたキメラマウス CLH13- 3 (TT2FESクローンし H13由 来、 キメラ率 35%) に対して、 生後 43日目から HSAによる免疫を開始した。 PBS に溶解したヒ ト血清アルブミ ン （HSA、 シグマ、 A3782) とアジュバン ト （MPL- TDM Emulsion, RIBI Immunochem Reseach Inc. ) とを混合して 0.25mg/mlの HSA 溶液を調整し、 その 0.2mlを 1週間おきに 2回腹腔に免疫した。 さらに 1週間後 に PBSに溶解したヒ ト血清アルブミ ンを免疫した。 1週間おきに採血し、 血清中 の抗 HSAヒ ト抗体濃度を （実施例 14) に従い EL1SA法で検出した。 結果を図 35に 示す。 最終免疫の 3日後に、 キメラマウスからひ臓を取り出し、 （実施例 24) に 従い PEGにて細胞融合し、 ハイプリ ドーマを作製した。 融合後の細胞を、 ひ細胞 数が 100万個/ miとなるよう、 HAT (大日本製薬、 No, 16 - 808- 49) あるいは lmg/ mlの G418を添加した培地 （三光純薬、 エス ' クローンクローニングメデューム 1 -B) に希釈し、 96穴プレートの各 weiiに 100 1ずつ分注し培養した。 どちらの 選択培地にも HCF (エア ' ブラウン） を 5 %添加した。 G418、 HAT選択のプレー 卜共に、 培養 6日目にはほぼ全 weliにコロニーが生じ、 合計約 770個のハイプリ ドーマ陽性ゥエルを得た。 培養上清を採取し、 （実施例 14) に従い EL1SA法によ つてヒ 卜抗体産生ハイプリ ドーマのスクリーニングを行った。 抗ヒ 卜免疫グロブ リ ン λ鎖抗体 （Vector Λ卜 3070) をコ一ティ ングし、 ピオチン標識抗ヒ ト免疫 グロブリ ン； I鎖抗体 （Vector、 BA-3070) さらにアビジン一ペル才キシダーゼ複 合体 （Vector、 ABCキッ ト PK4000) を用いて TMBZ (住友べ一クライ ト、 Mい 1120T ) により検出した。 陰性対照の約 2倍以上の吸光度を目安にして判定し、 17個の 陽性ゥエルを得た。 陽性ゥエルの細胞を 24穴プレー トに移し、 [MDMに 10¾FBSを添 加した培地を用いて培養した。 培養上清を （実施例 65- (4)) の方法に従い EL1SA で解析し、 16個のゥエルで 0.09〜llmg/inlの、 ヒ ト Ig//と ig λを持つ完全ヒ ト抗 体の存在が確認された。 （実施例 33) に従い、 抗 HSAヒ ト λ鎖の抗体価を測定し 、 1個の陽性ゥエルを得た。 完全ヒ ト抗体陽性かつ抗 HSAヒ ト λ鎖陽性ゥエルの 細胞を く安東、 単クローン抗体実験操作入門、 講談社サイェンティ フイ ク， 1991 > に記された方法に従い、 限界希釈法を用いてクローニングした。 抗 HSAヒ トス 鎖陽性ハイプリ ドーマを 2クローン得た。
この結果よりヒ 卜 14番染色体部分断片及びヒ ト 22番染色体部分断片を保持する 内在性抗体重鎖、 軽鎖欠損マウス ES細胞を免疫不全マウス宿主胚に移入して作製 したキメラマウスから完全ヒ ト抗体を生産するハイプリ ドーマが得られることが 確認された。 また HSA抗原刺激に対して、 抗原特異的ヒ ト lg および Ig;iの抗体 価上昇が起こることが確認された。 さらにこのキメラマウスからヒ ト lg〃と ^ス から成る HSA特異的抗体を生産するハイプリ ドーマが得られることが確認された
〇
また染色体が薬剤耐性マーカーを持っため、 HATを添加せず、 G418を用いてハ イブリ ドーマを選択することが可能であった。 このことによってヒ ト染色体を持 つ細胞のみが増殖するため、 ハイプリ ドーマを選択的に得ることができる。 また 融合後の細胞からヒ ト染色体の脱落を防ぐことが期待できる。 さらに融合に用い るミエロ一マ細胞力く HGPRT酵素 (hypoxanthine-guanine-phosphor ibosy 1 trasf er ase) を持っているような、 HAT選択に不向きな細胞であっても使用可能となる ことが期待される。
(実施例 67) 重鎖遺伝子欠損宿主胚とのキメラマウス作成
(実施例 49) で作成した内在性抗体重鎖片側ァレル欠損 TT2F細胞株由来キメラ マウスの子孫のうち野性色を示すものについてサザン解析 （実施例 49) 等により 欠損アレルを保持する個体を選抜する （期待される確率は 1/2である） 。 これら の抗体重鎖欠損へテロ接合体の雌雄個体の交配により生まれる子マウスについて サザン解析 （実施例 49参照） 、 血清中の抗体重鎖産生 （K i tamuraら， Na ture, 35 0, 423-, 1991 ) 等の解析を行い、 両側アレルが欠損し、 自身の機能的な抗体をほ とんど産生できない抗体重鎖欠損ホモ接合体を得ることができる （期待される確 率は 1/4である、 膜型 鎖欠損マウスにおける結果は !U tamuraら， Na ture, 350,
423-, 1991参照） 。
( 1) 抗体重鎖ノ ックァゥ 卜マウス系統の確立
(実施例 49) で作成した内在性抗体重鎖片側アレル欠損 TT2F細胞株由来キメラ マウスの子孫のうち野性色を示すものについてサザン解析を行ない欠損ァレルを 保持する個体を選抜した。 これらの抗体重鎖欠損へテロ接合体の雌雄個体の交配 により生まれる子マウスについてサザン解析 （実施例 49参照） 、 血清中の抗体^ 鎖産生 （マウス//鎖の EU SA解析は実施例 75参照、 lU tamuraら， Na ture, 350, 4 23-, 1991) 等の解析を行った結果、 両側アレルが欠損し、 自身の抗体をほとんど 産生できない抗体重鎖欠損ホモ接合体を得ることができた （膜型 鎖欠損マウス における結果は! ( amuraら， Na ture, 350, 423-， 1991参照） 。
すなわち、 抗体重鎖片側アレル欠損 TT2F細胞株より、 抗体重鎖ノ ックアウ トマ ウス系統を確立することができた。
清浄な環境で飼育したホモ接合体雌雄個体の交配により得られる胚をキメラマ ウス作成の際の宿主として利用できる。 この場合キメラマウスにおいて機能的な
B細胞はほとんど注入した ES細胞に由来する。 RAG- 2欠損マウス (Sh i nka iら，
Ce l l , 68, 855-, 1992) 等、 機能的な B細胞を自ら作ることができない他のマウ ス系統もこの目的に同様に利用できる。 このシステムにおいて （実施例 62、 63、 64) で得られる内在性抗体重鎖及び軽鎖欠損かつヒ ト 14番 + 2番あるいは 14番 + 22番あるいは 14番 + 2番 + 22番染色体 （断片） を保持するマウス ES細胞株を使用 し （実施例 10) 等に示した方法でキメラマウスを作成する。 得られるキメラマウ スでは ES細胞由来の B細胞において機能的なヒ 卜抗体重鎖 （14番染色体上） 、 軽 鎖/ c (2番染色体上） 、 軽鎖； I (22番染色体上） 遺伝子より主にヒ 卜抗体を生産 する。
(2) ヒ ト 2番染色体部分断片及びヒ ト 14番染色体部分断片を同時に保持する内 在性抗体重鎖、 鎖欠損マウス ES細胞を免疫不全マウス宿主胚に注人して作製し たキメラマウス血清における完全ヒ ト抗体の検出 ·定量
(実施例 62) で取得された ES細胞株 KH10を実施例 67- (1) で確立された抗体 重鎖ノ ックァゥ トマウスの雌雄交配により得られる胚に注人することにより実施 例 65- (1) と同様な方法でキメラマウスを作製した。 7週令のキメラマウスか ら採血し、 血清中のヒ ト抗体濃度を （実施例 14) (実施例 65- (3)) に従い ELISA 法で検出した。 結果を表 23に示す。 ヒ ト / c鎖と / z鎖またはァ鎖を含む完全抗体が キメラマウス血清中に確認された。 また免疫不全宿主胚に ES細胞を移入すること により、 B細胞は ES細胞からのみ分化するため、 たとえキメラ率が低く とも完全 抗体が得られることが確認された。 表 23 キメラマウス中のヒ ト抗体濃度（ELISA)
ESクローン キメラマウス キメラ率％ I M, κ (mg/1) I G, K (mg/1) KH10 CKHlO-1 6 6.1 0.17
KH10 CKH10-2 3 1.9 0.4
(3) ヒ 卜 14番染色体部分断片及びヒ 卜 22番染色体部分断片を保持する内在性抗 体重鎖、 /c鎖欠損マウス ES細胞を免疫不全マウス宿主胚に注入して作製したキメ ラマウス血清における完全ヒ ト抗体の検出 ·定量
(実施例 63) で取得された ES細胞株 LH13を実施例 67- (1) で確立された抗体 重鎖ノ ックァゥ トマウスの雌雄交配により得られる胚に注入することによりキメ ラマウスを作製した （実施例 65- (2) と同様な方法による） 。 誕生したキメラ マウスから生後 5週齢に採血し、 血清中のヒ ト抗体濃度を （実施例 14) (実施例 65- (4) ) に従い EL I SA法で検出した。 結果を表 24に示す。 ヒ ト； I鎖と ,"鎖または ァ鎖を含む完全抗体がキメラマウス血清中に確認された。 表 24 キメラマウス中のヒ ト抗体濃度（EL 1 SA)
ESクローン キメラマウス キメラ率％ I g , λ (mg/1 )
し H13 CLH13-3 35 51
し H13 CLH13-4 85 32
し H13 CLH13-4 30 27
(実施例 68) ヒ 卜 14番染色体断片 （抗体重鎖遺伝子を含む） 導人 ES細胞由来キメ ラマウス子孫におけるヒ ト染色体の保持
( 1) 抗体重鎖遺伝子を含むヒ ト 14番染色体断片を保持するヒ トーマウス雑種細 胞の単離
ヒ ト 2番染色体断片はマウスへの導入後、 子孫への伝達が観察された （実施例 42) ことから、 ヒ ト 14番染色体についても断片を用いることにより子孫への伝達 の可能性が高まることが予想される。 G418耐性遺伝子でマーキングされたィンタ ク トなヒ 卜 14番染色体を保持する A9/#14株 （実施例 9 ； Tomi zukaら， Na ture Gen e t. vo l 16, 133-143(1997)に記載されている A9/14-C11株) についてより詳細 な F ISH解析 （実施例 9) を行った結果、 10 程度の細胞集団が非常に小さく断片 化したヒ ト 14番染色体のみを含むことが観察された。 この染色体断片は 2番染色 体断片 （実施例 12) と同程度のサイズであり、 また G418耐性マーカーを含むと考 えられる。
断片化ヒ 卜 14番染色体を含む細胞クローンの単離のため、 A9/#14細胞約 300個 を 10cmシャ一レに播種して培養し、 10日後に出現したコロニーを 31個ピックアツ プした。 これらのクローンよりゲノ ミ ック DNAを調製し、 （実施例 9) と同様な 方法で 14番染色体特異的プライマー （実施例 9に示された 18種のうち PC 1、 NPを 除く 16種） を用いた PCR解析を行った。 その結果、 1株 （A9/SC20) において 16 種中 I gM、 I GG1、 IGA2、 1 GVH3のみが検出された。 また、 ヒ ト 14番染色体長腕部 ' テロメァ近傍のマ一カーである D14S543 (Sc i ence, HUMAN GENETI C MAP ( 1994), 塩基配列は Genbank等のデータベースより入手） も検出されたことから、 この断 片 （以後 SC20断片） は抗体重鎖遺伝子を含む 14番染色体テロメァ近傍部を含むと 考えられた。
SC20 断片についてヒ 卜染色体特異的プローブを用いた F I SH解析 （Tomi zuka.ら、 Nature Gene t, vo l 16， 133-143 (1997) ) を行った。 その結果このクロ一ンにお いて、 コン トロール （イ ンタク 卜な 14番染色体を含む） と比較してプロ一ブにハ ィプリダイズする染色体のサイズが小さくなっていることが観察された。 すなわ ち、 A9/SC20は断片化されたヒ 卜 14番染色体を含むことが確認された。
さらに SC20断片がヒ ト 14番染色体由来のセントロメァ配列を含むかについて調べ るため、 A9/SC20細胞の染色体標本と、 ジゴキシゲニン- 11- dUTPで標識したヒ 卜 14番、 22番セントロメァ特異的な αサテライ ト DNA (コスモバイオより購入） を プロ一ブとしハイブリダィズさせ、 参考文献 （Tomi zukaら， Nature Gene t i cs, 1 6, 133-143) に記載された方法に従って F ISH解析を行った。 その結果、 上記プロ ーブとハイブリダィズするシグナルが確認され、 SC20断片がヒ ト由来のセン ト口 メァ配列を有することが明らかとなった （図 36) 。
(2) 14番染色体 （断片） の TT2F細胞への導入及び TT2F細胞における安定保持 14 番染色体断片の TT2F細胞へのミクロセル移入は染色体供与細胞として A9/SC2 0を用い、 実施例 9に示した方法で行った。 G418 ( 300 β
Figure imgf000114_0001
選択の結果 5株 の耐性株を得た。 これらの ES細胞株についてと同様に PCR解析 （実施例 68- (1)) および F ISH解析 （ヒ ト染色体特異的プローブ使用， Tomi zukaら， 前記） によりヒ ト 14番染色体断片の保持を確認した。 F I SH解析の結果を図 37に示す。
マウス個体における導人ヒ 卜染色体の安定保持は導入遺伝子の効率的発現およ び導人染色体の効率的な子孫への伝達に重要である。 ES細胞株の宿主胚注入後は 薬剤添加による選択ができないため、 導入ヒ ト染色体が非選択条件でも安定に保 持されることが望ましい。 SC20 断片を含む TT2F(SC20) -21株について G418非添加培地で長期間培養を行い' 、 この条件における SC20断片の保持について検討した。
TT2F(SC20) -21株を選択培地 （G418 300 z g/ml ) で 1週間培養した後、 非選択 培地で 45日間継代培養した （1日おきに 8倍希釈で植え継ぎ） 。 継代 0、 15、 30 、 45日目に、 300- 1000個の細胞を 35隱シャーレ 6枚に播き、 そのうち 3枚を選択 培地、 3枚を非選択培地で約 1週間培養してコロニーを数えた。 選択条件の 3枚 分のシャーレのコロニー数の合計 （A) 、 非選択条件の 3枚分のシャーレのコロ ニー数の合計 （B) より染色体保持率 （A/B) を求めた。 比較のため、 ヒ ト 2番 染色体由来 W23断片を含む P-21 (実施例 40) についても同様 （選択培地は 0. 75 /2 g/ml puromyc i n入り） な実験を行い、 その結果を図 38に示した。 図 38に示した値 は 3回の独立した実験の平均値である。 その結果 SC20は 45日間の非選択条件での 培養後も 95¾以上という高い保持率を示した。 一方、 W23断片は同様の条件下で 14¾'の保持率であった。
これまでに、 ヒ 卜 Y染色体由来の人工染色体 （ヒ ト Y由来セントロメァを含む ) を CH0 (ハムスター線維芽細胞） や DT40 (ニヮ トリ Bリンパ球細胞） 、 マウス ES細胞に移入した報告がある （Shenら， Hum. o l. Gene t. 6, 1375-1382) 。 非 選択培養下において、 その人工染色体は CH0と DT40では安定に保持されていたが 、 マウス ES細胞中では再編成によりマウスのセント口メァを偶然に獲得した染色 体のみが、 安定に保持されていた。 このことから、 ヒ ト由来セン卜ロメァはマウ ス ES細胞中で不安定であるという意見が提出された （Shenら， 前記） 。
上記の結果は SC20の場合ヒ ト由来のセン トロメァでありながら （実施例 68-(1 ) ) 、 マウス ES細胞で非常に安定であることを示している。 同様にヒ 卜セン トロメ ァを含むことが示唆される W23断片 （Tomi zukaら， 前記） の場合不安定性が見ら れたことから ES細胞におけるヒ ト由来染色体の安定性は染色体の種類により異な ると考えられる。
以上の結果より、 SC20断片はマウス個体への遺伝子導入用のベクターとして非 常に有用であることが示された。
(3) ヒ ト 14番染色体 （断片） を保持する ES細胞株からのキメラマウス作製 実施例 68- (2) で取得され、 ヒ 卜 14番染色体断片の保持が確認された G418耐 性 ES細胞株 TT2F(SC20)-21を凍結ストックより立ち上げ、 ICR (日本クレア社） 雄雌マウスの交配により得られた 8細胞期胚に胚あたり 10〜12個注入した。 ES細 胞用培地 （実施例 ·9) で一晩培養して胚盤胞に発生させた後、 偽妊娠処理後 2.5 日の仮親 ICRマウス （日本クレア社） の子宮に片側の子宮あたり約 10個のイ ンジ ェクショ ン胚を移植した。
計 188個の注人胚を移植した結果、 22匹の子マウスが誕生した。 キメラ個体は 、 毛色において宿主胚 （ICR) 由来の白色の中に TT2細胞由来の野生色 （濃茶） が認められるかどうかにより判定される。 誕生した 22匹のうち毛色に明らかに野 生色の部分のある、 すなわち、 ES細胞の貢献の認められる個体は 20匹であった。 うち 2個体は毛色が完全に野生色の （ES細胞に由来する） キメラマウスであった この結果より、 ヒ ト 2番染色体部分断片を保持する ES細胞株 TT2F(SC20)- 21は キメラ形成能を保持している、 すなわちマウス個体の正常組織に分化する能力を 保持していることが確認された。
5 週齢のキメラマウス 2匹 （TT2F(SC20)- 21由来、 キメラ率 100%、 C14m-16， - 17) より採血し血清中のヒ ト抗体 IgM、 IgG濃度を （実施例 14) と同様に ELISA 法を用いて定量した。 結果を表 25に示す。 表 25 キメラマウス中のヒ ト抗体抗体重鎖濃度 （ELISA)
キメラマウス キメラ率％ IgM(mg/l) lgG(mg/l)
C14m-16 100 7.9 1.0
C14m-17 100 6.0 1.3 両方のキメラマウス血清中にヒ ト抗体 lgM、 IgGが検出された。 その値はより 大きなヒ ト 14番染色体断片を保持するキメラマウスの値 （実施例 14) と同等であ つた。 すなわち、 SC20断片に含まれるヒ ト抗体遺伝子は機能的であることが示さ れた。 (4) ヒ 卜 14番染色体断片を保持するマウス ES細胞 （TT2F, X0) 由来キメラマウ スの子孫におけるヒ ト染色体保持の検出および血清中ヒ 卜抗体 //鎖、 ァ鎖の検出 、 疋里
(実施例 68- (3)·) で得られた雌キメラマウスのうち C14m- 16， C14m_lT (共に毛 色のキメラ率 100¾) について雄 I CRマウスとの交配により ES細胞由来の子孫が誕 生するかを検討した。 この交配において I CR雄マウス （アルビノ、 劣性） 由来精 子により受精したキメラマウス中の TT2F細胞 （野生色：優性） 由来の卵子からは 野生色、 I CR由来卵子からは白色の子マウスが誕生する。 この交配によって得ら れた生存可能な子マウス計 30匹のすべてが ES細胞由来の毛色である野生色を示し ES細胞の効率的な生殖系列への伝達が示された。 これらの子マウスの尻尾より調 製したゲノム DNAについてヒ 卜染色体断片の保持を PCR法により検討した。 TT2F (SC20) -21で存在が確認されている 3種のプライマ一 （IGVH3, I M, D14S543 ) について PCR増幅を行なった結果、 30匹中 10匹 (33¾) において TT2F(SC20) - 21 で検出された 3種のマーカーの存在が確認された。 すなわち、 ヒ 卜 14番染色体断 片を保持する TT2F細胞株 TT2F(SC20) - 21がキメラマウス中で機能的な卵子に分化 し、 その卵子由来の F1子孫にヒ 卜 14番染色体断片が伝達されたことが示された。 ヒ 卜 14番染色体を保持することが確認された 10匹のキメラマウス子孫のうち 9 匹について血清中のヒ ト抗体 I gM、 I gGの検出、 および定量を以下の通り行った 。 生後約 4~8週齢のマウスより採血し、 血清中のヒ ト抗体//鎖およびァ鎖を （ 実施例 14) と同様に EL ISA法を用いて検出した。 その結果 （表 26) 、 調べた全て の個体の血清中においてヒ ト抗体 鎖およびァ鎖が検出された。 すなわち、 キメ ラマウスから生まれた F1子孫においてもヒ 卜抗体重鎖遺伝子が機能することが確 認された。 表 26 キメラマウス中のヒ 卜抗体 IgMおよび igG濃度 （EL1SA)
親キメ ラマウス マウス個体番号 IgM(mg/l) IgG(mg/l)
C14m-16 16 - 5 12.9 2.2
C14m-16 16-14 3.5 2.2
C14m-16 16-16 4.1 2.0
C14m - 16 16- 17 5.5 3.9
C14m-1 17 - 7 5.7 1.0
C14m-1 17- 8 3.6 1.2
C14m-1 17-19 3.5 0.75
C14m-1 17-22 2.4 1.4
C14m-1 17-23 5.3 1.9 さらに、 Fl子孫のうち雄 3個体、 雌 4個体について MCH(ICR)マウス （日本クレ ァより購入） と交配し、 誕生した F2子孫について上記に示した尻尾 DNAの PCR解 析及び、 ヒ ト抗体//鎖発現解析を行った。 その結果、 雄経由で 30% (142匹中 43 匹ポジティブ） 、 雌経由で 33% (60匹中 20匹ポジティブ） の F2子孫に SC20断片が 伝達したことが確認された。
これらの結果より、 14番染色体断片 （ヒ ト抗体重鎖遺伝子を含む） を保持し、 ヒ ト抗体重鎖を発現する継代可能なマウス系統を確立することができた。
(5) ヒ ト 14番染色体断片のマウス個体における安定保持
(実施例 68-(4)) において取得された SC20断片を保持する F1子孫 3匹 （表 26中
： 16-5、 17-8、 17-23) をマウス個体における SC20断片保持率解析に用いた。 マ ウスにコルセミ ド （100 zg/ml) を 0.3ml腹腔内注射し、 頸椎脱臼により安楽死 させ、 脳、 肝臓、 脾臓、 精巣、 骨髄を摘出した。 骨髄をのぞくすべての組織を PB
S (-) で洗浄した後、 組織を解剖用ハサミで細かく切り、 KC1 (0.075M) によ り 15分間の低調処理、 カルノア固定をした。 カルノア固定の上清を用いて通常通 り標本を作成した。 FISH解析はヒ ト染色体特異的プローブ （Human COT- 1 DNA) を用い、 参考文献 （Tomizukaら， Nature Genetics, 16, 133-143) に記載された 方法に従って行った。 脳、 脾臓、 肝臓、 骨髄については任意に選んだ 30個以上の 間期核についてシグナルの検出されるもの （図 39中 +) 、 検出されないもの （図 39中 -） の数をカウン ト し保持率を算出した。 精巣については、 第一減数分裂期 像、 第二減数分裂期像、 精子に分類し、 各 10個以上についてカウン ト し保持率を 算出した。 その結果、 脳、 肝臓では 3個体とも 100¾近い保持率を示した。 骨髄、 脾臓では、 保持率の低下が観察された。 精巣では、 第一減数分裂像で 80〜100% 、 精子で 30〜50 %の結果が得られた。 SC20断片が安定に保持されていると仮定す ると理論的には第一減数分裂で 100%、 第二減数分裂と精子で 50%となる。 した がって、 精巣で SC20断片は安定に保持されていると考えられた。
また、 同時に尻尾より繊維芽細胞を調製し （実施例 79) と同様に SC20断片の保 持率を検討した。 その結果は、 16-5 : 98 17- 8 : 96¾、 1了- 23 : 98,¾であった （各々 50核板についてテス卜） 。
(6) ヒ 卜 14番染色体断片 （抗体重鎖遺伝子を含む） の導人による、 抗体産生能 欠損マウスの遺伝的救済
B リ ンパ球の発生に必須な抗体//鎖遺伝子ノ ックァゥ トマウス （実施例 67- (1)
) は体液性免疫を担う成熟 Bリンパ球が欠損していることにより抗体を産生する ことができない。 この欠損を交配による SC20断片 （ヒ ト抗体重鎖遺伝子を含む） 導入により救済できるかを検討するため、 以下の実験を行った。
(実施例 49) で作成した内在性抗体重鎖片側アレル欠損 TT2F細胞株由来キメラ マウスと MCH( ICR)マウスとの交配により得られた子孫のうち野性色を示すものに ついてサザン解析を行ない欠損ァレルを保持する個体を選抜した。 得られた抗体 重鎖欠損へテロ接合体の雌個体と （実施例 68- (4) ) で得られた SC20断片を保持す る F1子孫雄個体 （17-7) を交配した。 その結果得られた 5匹の子マウスについて
SC20断片保持検定のための PCR解析、 血清中ヒ ト抗体 鎖、 ァ鎖測定を行った （ 実施例 68- (4) ) 結果、 #2, #3， #5の 3個体が SC20断片を保持することが確認され た （表 27) 。 また、 血清中マウス抗体/ z鎖発現解析 （実施例 75) の結果、 1、 #3 がマウス^鎖陰性すなわち内在性抗体重鎖欠損についてホモであることが示され た （表 27) 。 これは 5個体の尻尾より調製した DNAを用いたサザン解析 （実施例
49参照） の結果と一致した。 マウス、 ヒ ト抗体重鎖共に検出されない個体^と比 較して、 抗体重鎖欠損ホモかつ、 14番染色体保持の遺伝子型を持つ個体 #3におい ては非常に高濃度のヒ ト抗体//鎖 （310 mg/1) 、 ァ鎖 （860 mg/1) が検出された また、 （実施例 29) の方法に従い、 ヒ トァサブクラスの定量を行い、 4種のサ ブクラス （ァ 1 、 ァ 2· 、 ァ 3 、 ァ 4)をすベて検出した。 特にヒ ト〃鎖の濃度は野 性型マウスにおけるマウス/ 鎖の濃度 （Mendezら， Nature Genet. 15， 146-156 (1997)) に匹敵する。 すなわち、 この個体においては内在性重鎖遺伝子の欠損に よる抗体産生不能 （Bリ ンパ球の欠損：参考文献 Ki tamuraら， Nature, 350, 4. 23-, 1991) という症状がヒ ト 14染色体断片 SC20 (抗体重鎖遺伝子を含む） の導入 により治療され、 抗体産生能及び Bリ ン '、。球産生能が回復したことを示している
表 27
個体番号 SC20断片保持 マウス/ 鎖 ヒ ト IgM(mg/l) ヒ ト IgG(mg/l)
1 - - 検出限界以下 0.33
2 I + 8.4 5.3
3 + - 310 860
4 - + 測定せず 測定せず
5 + 十 4.8 0.86
(実施例 69) ヒ ト 22番染色体 （断片） 導入 ES細胞由来キメラマウス子孫における ヒ ト染色体の保持
(1) ミクロセル融合を利用したヒ ト 22番染色体の断片化
ヒ 卜 2番染色体断片 （実施例 42) 、 ヒ ト 14番染色体断片 （実施例 68- (4)) は共 にマウスへの導入後、 子孫への伝達が観察されたことから、 ヒ ト 22番染色体につ いても断片化することによりマウスにおける子孫への伝達の可能性が高まること が予想される。 ミクロセル融合による受容細胞へのヒ ト染色体移入の際、 40〜80 %の移入クローンは融合時に断片化されたヒ ト染色体を保持することが観察され ている （押村ら、 蛋白質 核酸 酵素 vol.35， No.14 1990) が、 この現象を利 用してヒ ト 22番染色体の断片化を試みた。 6- 1株 （実施例 35) を染色体供与細胞、 野性型マウス A9細胞を受容細胞とした ミ クロセル融合実験 （実施例 1 ) を行った結果、 73個の G418耐性クローンが得ら れた。 得られたクローンよりゲノ ミ ック DNAを調製し、 スプライマ一 （実施例 2) を用いた PCRによりスクリーニングした。 ヒ 卜 I g ;i遺伝子を保持していた 67 クローンについて、 22番染色体上の 8種のマーカー （D22S315, D22S275, D22S28 0， D22S278, D22S283, D22S272, D22S282, D22S274 ； 22番染色体上での順序は Na t ure, vo l 377, 367-379, ( 1995)を参照。 プライマーの塩基配列は Genbank等の データベースより入手） 特異的プライマ一を用いた PCR解析を行った。 その結果 25クローンにおいてマーカーの一部が消失していたことから、 これらのクローン において 22番染色体が断片化していると考えられた （図 40) 。 中でも、 クローン 22は ΐ £ λと D22S315、 #28は I gス以外のマ一カーが消失しているため、 かなり 小さな断片になっていると考えられる （図 40) 。 クローン #28についてヒ ト染色 体特異的プローブを用いた F I SH解析 （実施例 18) を行った結果を図 41に示す。 こ のクローンにおいて、 コントロール （インタク 卜な 22番染色体を含む） と比較し てプローブにハイプリダイズする染色体のサイズが小さくなっていることが観察 される。 すなわち、 ミクロセル融合時に起こる染色体の断片化により、 抗体 I遺 伝子を含むヒ ト 22番染色体断片を取得することができた。
(2) 22番染色体 （断片） の TT2F細胞への導人
22番染色体 （断片） の TT2F細胞へのミクロセル移入は実施例 2に示した方法で 行った。 染色体供与細胞としては #22、 #28、 および 6-1を用いた。 クローン #2 2、 A9/#22(6_l )についてはピューロマイシン （0. 75〃g/ml ) 選択、 ク ローン #2 8については G418 (225 g/ml ) 選択を行いそれぞれ 13株 （クローン #22より） 、 5株 （6- 1より） および 3株 （クローン #28より） の薬剤耐性株を得た。 これ らの ES細胞株について （実施例 69- (1 ) ) と同様に PCR解析および F I SH解析により ヒ ト 22番染色体 （断片） の保持を確認する。
(3) ヒ 卜 22番染色体 （断片） を保持する ES細胞株からのキメラマウス作製 実施例 69- (2) で取得され、 ヒ ト 22番染色体の保持が確認された薬剤耐性 ES 細胞株について （実施例 3) の方法によりキメラマウスを作製する。 キメラマウ スにおけるヒ 卜 22番染色体 （断片） 保持確認は （実施例 4) の方法により行う。
( 4) ヒ 卜 22番染色体 （断片） の子孫への伝達
ヒ ト 22番染色体 （断片） を保持するキメラマウスと I CRマウスを混合して交配 する。 誕生する野生色の子マウスの尻尾より調製したゲノム DN'Aについてヒ 卜 22 番染色体断片の保持を PCR法により検討する （実施例 30、 42、 43参照） 。 ヒ ト 22 番染色体あるいはその部分断片を保持するマウス ES細胞株は （実施例 42) 及び （ 実施例 43) で示した通りにキメラマウス中で機能的な卵子あるいは精子に分化し 、 それ由来の子孫にヒ ト 22番染色体 （断片） が伝達可能である。 すなわちヒ ト抗 体軽鎖 I遺伝子を含む 22番染色体 （断片） を保持する継代可能なマウス系統を確 立することができる。
(実施例 70) ヒ ト 2番染色体断片及び 14番染色体 （断片） を同時に保持するマウ ス個体の交配による作成
(実施例 42) あるいは （実施例 43) で得られたヒ 卜 2番染色体断片を保持する マウス系統と （実施例 68) で得られたヒ ト 14番染色体 （断片） を保持するマウス 系統を交配することにより生まれる子マウスの尻尾より調製したゲノム DNAを PC R法等 （実施例 9、 42、 43) により解析して、 ヒ ト 2番染色体部分断片及びヒ ト 14番染色体 （断片） を同時に保持する個体を得る。
(実施例 71) ヒ ト 22番染色体 （断片） 及び 14番染色体 （断片） を同時に保持する マウス個体の交配による作成
(実施例 69) で得られるヒ ト 22番染色体 （断片） を保持するマウス系統と （実 施例 68) で得られるヒ 卜 14番染色体 （断片） を保持するマウス系統を交配するこ とにより生まれる子マウスの尻尾より調製したゲノム DNAを PCR法等 （実施例 30 、 42、 43) により解析して、 ヒ ト 22番染色体 （断片） 及びヒ ト 14番染色体 （断片 ) を同時に保持する個体を得る。 (実施例 72) ヒ 卜 2番染色体断片、 14番染色体 （断片） 及び 22番染色体 （断片） を同時に保持するマウス個体の交配による作成
(実施例 71) で得られるヒ 卜 22番染色体 （断片） 及びヒ 卜 14番染色体 （断片） を保持するマウス系統を （実施例 42、 43) で得られたヒ 卜 2番染色体断片を保持 するマウス系統と交配することにより生まれる子マウスの尻尾より調製したゲノ ム DNAを PCR法等 （実施例 9、 30、 42、 43) により解析して、 ヒ ト 22番染色体 （ 断片） 及びヒ ト 14番染色体 （断片） 及びヒ ト 2番染色体部分断片の 3種のヒ 卜染 色体を同時に保持する個体を得る。 あるいは （実施例 70) で得られるヒ ト 2番染 色体 （断片） 及びヒ 卜 14番染色体 （断片） を保持するマウス系統と （実施例 69) で得られるヒ ト 22番染色体断片を保持するマウス系統と交配することによつても 同様に 3種のヒ ト染色体を同時に保持するマウス個体を得る。
(実施例 73) 完全なヒ 卜抗体を主として産生するマウス系統の交配による作成 ヒ ト 2番 + 14番 （実施例 70) 、 14番 + 22番 （実施例 71) 、 2番 + 14番 + 22番 （ 実施例 72) 染色体を保持するマウス系統を内在性抗体重鎖、 軽鎖/ c遺伝子を欠損 しているマウス系統と繰り返し交配し、 ヒ 卜 2番 + 14番、 14番 + 22番、 または 2 番 + 14番 + 22番染色体を保持し、 かつ内在性抗体重鎖遺伝子及び軽鎖/ c遺伝子欠 損についてホモであるマウス系統を PCR解析等 （実施例 9、 30、 42、 43) により 選抜する。 これらの系統においては、 主として完全なヒ 卜抗体が産生される （Gr eenら， Nature Gene t i cs, 7, 13-， 1994， し onbergら， Nature, 368, 856-, 199 4) 。
以下、 ヒ 卜 2番染色体断片及びヒ ト 14番染色体断片を保持し、 かつ内在性抗体 重鎖遺伝子及び抗体 鎖遺伝子欠損についてホモであるマウス系統の確立につい て示す。 交配に用いた 4つの系統及びそれぞれの系統の持つ遺伝子型の検定法は 以下の通りである。
( 1) 実施例 42で得られたヒ 卜 2番染色体断片を保持するマウス系統：実施例 42 に示した尻尾 DNAの PCR解析および血清中ヒ ト抗体/ c鎖発現を指標としてヒ ト 2 番染色体断片保持を検定
(2) 実施例 68- (4)で得られたヒ ト 14番染色体断片を保持するマウス系統：実施 例 68- (4)に示した尻尾 DNAの PCR解析および血清中ヒ ト抗体//鎖発現を指標とし てヒ ト 14番染色体断片保持を検定
(3) 実施例 67- ( 1)で得られた抗体重鎖ノ ックァゥ トマウス系統： 実施例 67- α) に示した尻尾 DNAのサザン解析及び、 血清中マウス抗体 鎖発現の有無 （実施例 75) により重鎖欠損ホモあるいはヘテロ個体を検定
(4) 実施例 80で得られた抗体/ c鎖ノ ックァゥ トマウス系統：実施例 80に示した 尻尾 DNAのサザン解析により c鎖欠損ホモあるいはヘテロ個体を検定
上記の 4系統を互いに交配することにより、 これら 4つの遺伝子型 （2番染色 体断片保持、 14番染色体断片保持、 抗体重鎖欠損ホモあるいはヘテロ、 抗体/ c鎖 欠損ホモあるいはヘテロ） を同時に保持する系統の確立を行った。 上記 4系統を 出発材料として数回の交配を経た後、 『14番染色体断片保持、 抗体重鎖欠損ホモ 、 抗体/ 鎖欠損へテロ』 の遺伝子型を持つ雄個体と 『2番染色体断片保持、 抗体 重鎖欠損ホモ、 抗体/ 鎖欠損ホモ』 あるいは 『2番染色体断片保持、 抗体重鎖欠 損ホモ、 抗体 鎖欠損へテロ』 あるいは 『2番染色体断片保持、 抗体重鎖欠損へ テロ、 抗体/ c鎖欠損ホモ』 のいずれかの遺伝子型を持つ雌個体の交配を行った。 その結果、 個体 HK23 『2番染色体断片保持、 14番染色体断片保持、 抗体重鎖欠損 ホモ、 抗体 c鎖欠損へテロ』 及び個体 HK29 『2番染色体断片保持、 14番染色体断 片保持、 抗体重鎖欠損へテロあるいは野生型、 抗体/ 鎖欠損へテロ』 を得た。 同 じ交配により得られた 『2番染色体断片保持、 14番染色体断片保持、 抗体重鎖欠 損へテロあるいは野生型、 抗体/ c鎖欠損野生型』 の遺伝子型の個体（HK28)も含め て図 42に血清中各抗体濃度及び遺伝子型を示す。 HK23の血清中にはヒ ト 鎖とヒ ト c鎖からなる完全なヒ ト抗体が 18mg/lの濃度で検出された （実施例 38) 。
ここで得られた個体同士を交配することにより、 『2番染色体断片保持、 14番 染色体断片保持、 抗体重鎖欠損ホモ、 抗体 /c鎖欠損ホモ』 の遺伝子型を持つ個体 を作製することができる。 この系統においては、 内在性/ c鎖遺伝子の欠損がヒ ト 2番染色体断片に含まれるヒ ト抗体/ c鎖遺伝子によって代替される （Lonbergら ， Nature, 368, 856-, 1994) ため、 HK23よりさらに高い濃度のヒ ト抗体 鎖が 発現すると考えられる。 また、 ヒ ト重鎖と /c鎖からなる完全なヒ ト抗体の濃度も さらに上昇すると考えられる。 (実施例 74) 交配により得られるヒ ト抗体遺伝子を含むヒ ト染色体を保持するマ ウス系統からのヒ ト抗体産生ハイプリ ドーマ取得
(実施例 25) と同様に （実施例 42、 43、 68、 69、 70、 71、 7.2、 73) で得られる ヒ ト抗体遺伝子を含むヒ 卜染色体を保持するマウス個体に目的とする抗原で免疫 し、 脾臓を取り出し、 ミエローマ細胞と細胞融合し、 ハイプリ ドーマを作成する 1〜3週間培養し培養上清を ELISA法で解析する。 EL1SA法は （実施例 14、 15 、 21、 22、 25、 33、 34、 37、 38) に示した方法で行ない、 ヒ ト抗体陽性及びヒ 卜 抗体陽性かつ免疫した抗原特異的クローンを得る。
(実施例了 5) マウス抗体重鎖両側ァレル破壊 TT2F細胞株由来キメラマウスの血清 中のマウス IgMの検出および定量
(実施例 51) で取得されたマウス抗体重鎖両側ァレル破壊 TT2F細胞株（ 131- 3) より （実施例 40) に示した方法で誕生した子マウスのうちキメラ率がそれぞれ 0¾ 、 50% 、 99% の 3個体について血清中のマウス IgMの検出および定量を行った。 生後約 2週齢のキメラマウスより採血し血清中のマウス IgM濃度を （実施例 14) の ELISA 法を用いて定量した。 PBSで希釈した抗マウス IgM抗体（Kirkegaard & Perry Laboratories Inc. , 01-18- 03)を固定し、 次いで 5¾FBSを添加した PBSで 希釈した血清試料を加えた。 ペルォキシダーゼ標識抗マゥス I gM抗体（K i rkegaar d & Perry Laboratories Inc. , 074- 1803)を加え、 TMBZを基質とし、 450 議の吸 光度を測定した。 精製されたマウス IgM (ファーミ ンジヱン、 03081D) を標準とし 段階的に FBS添加の PBSで希釈した。 結果を表 28に示す。 マウス抗体重鎖の両側 アレルが破壊された TT2F細胞由来のキメラマウスのうち、 キメラ率が 99% のもの はマウス IgM濃度が低く、 ES細胞のマウス重鎖遺伝子がほとんど機能しないこと が確認された。 表 2859. o o 9 キメラマウス中のマウス IgM濃度 （ELISA) キメラ率％ I giVI (mg/I)
5
(実施例 76) ES細胞の抗体遺伝子軽鎖 /cノ ックアウ ト用ターゲティ ングベクター の作製
実施例 48- 1と同様にしてピュー口マイシン耐性遺伝子の両側にし oxP配列を入れ た LoxP- PGKPuroプラスミ ドを作製した。 pPGKPuroブラスミ ド DNA (Watanabe ら， Biochem Biophys Res Com 213: 130-137 (1995)， Peter W. Laird, Whi tehea d Institute for Biochemical Research and Massachusetts institute of tech nology, Dept. of Biology, Cambrige, MAより分与） より制限酵素 Sal 1でピュー ロマイシン耐性カセッ ト PGKPuroを切り出し、 平滑化した。 LoxP配列を含むブラ スミ ドの Smalおよび EcoRV 切断部位へ PGKPuroを挿入し、 プラスミ ド pLoxP- PGKP uro を得た （図 30) 。 さらに、 実施例 48と同様にしてマウス抗体軽鎖/ J領域お よび定常領域を含むゲノム DNAの定常領域が含まれる DNA断片を LoxP- PGKPuro遺 伝子と置き換えた （図 31)
(実施例 77) 抗体軽鎖へテロ接合体 （かつ抗体重鎖欠損ホモ接合体） マウス ES細 胞からの抗体軽鎖遺伝子両ァレル破壊株の取得
(1) 実施例 58で取得した抗体軽鎖欠損へテロ接合体 TT2F細胞株 （HD43) につい てピュー口マイシン耐性遺伝子の挿人によって、 さらに両側アレルが共に破壊さ れた株を取得した。
実施例 76で作製した抗体軽鎖タ一ゲティ ングベクターを制限酵素！pnlで線状化 し、 実施例 58と同様に HD43株を形質転換した。 ピューロマイシン濃度 0.75 /g/nil で選択培養を行い、 7〜9日後に生じたコロニーをピックアップし、 実施例 49に 示した方法で凍結保存、 ゲノム DNAを取得した。 ピューロマイシン耐性株ゲノム DNAを制限酵素 EcoR l (宝酒造） で消化し、 ァガロースゲル電気泳動で分離後サ ザン解析を行い、 実施例 48- 4に示したプローブで相同組み換え体を検出した （実 施例 58, 59) 。 その結果、 解析した 74株中 4株の抗体軽鎖両アレル破壊株を得た これらのクローンは通常の培養条件において、 遺伝子破壊以前の TT2F株と比較 して、 増殖速度及び形態に変化が見られず、 キメラマウス形成能を保持している ことが示唆される。
(2) 抗体重鎖欠損ホモ接合体かつ抗体軽鎖遺伝子両アレル破壊株からのキメラ マウス作製
(実施例 77- ( 1) ) で得られた抗体軽鎖両ァレル破壊株 TT2F細胞株 HD43P-10を凍 結ス 卜ックより立ち上げ、 I CR (日本クレア社） 雄雌マウスの交配により得られ た 8細胞期胚に胚あたり 10〜12個注人した。 ES細胞用培地 （実施例 9) で一晩培 養して胚盤胞に発生させた後、 偽妊娠処理後 2. 5日の仮親 ICRマウス （日本クレ ァ社） の子宮に片側の子宮あたり約 10個のィンジ クション胚を移植した。 計 161個の注入胚を移植した結果、 37匹の子マウスが誕生した。 キメラ個体は 、 毛色において宿主胚 （I CR) 由来の白色の中に TT2細胞由来の野生色 （濃茶） が認められるかどうかにより判定される。 誕生した 37匹のうち毛色に明らかに野 生色の部分のある、 すなわち、 ES細胞の貢献の認められる個体は 9匹であった。 うち 4個体は毛色の 80%以上が野生色の （ES細胞に由来する） キメラマウスであ つた。
この結果より、 抗体軽鎖両ァレル破壊株 ES細胞株 HD43P- 10は高いキメラ形成能 を保持していることが確認された。
(実施例 78) 抗体軽鎖欠損ホモ接合体 （かつ抗体重鎖欠損ホモ接合体） TT2F細胞 株からの G418耐性及びピュー口マイシン耐性マ一カー遺伝子の除去
(実施例 77) で取得され、 高いキメラ形成能を保持していることが確認された 抗体軽鎖両側アレル破壊株 HD43P- 10 (ピューロマイシン、 G418耐性株） のピュー ロマイ シン及び G418耐性マーカー遺伝子を （実施例 52) で示した手順により除去 した。 G418耐性マ一力一遺伝子の両側に挿入した l oxP配列 （実施例 48- 1 ) の間で 部位特異的組換えを起こす Creレコンピナーゼ遺伝子を含む発現べクター PBS185 ( BRL) を （実施例 52) の方法に従い上記の株へ導入した c (実施例 52) と同様 に得られるピューロマイシン （0. 75 z g/nil ) 感受性株（6株）を 35議シャーレでコ ンフルーェン 卜になるまで増殖させ、 その 3/5を 0. 5mlの保存用培地 （ES培地 + 1 0? DMSOくシグマ >) に懸濁し、 - 80°Cにて凍結保存した。 残りの 2/5は 2分して 12穴ゼラチンコー トプレート 2ゥエルに播種し、 一方は非選択培地、 一方は 300 . g/mlの G418存在下で 2日間培養した。 その結果、 G418存在下で死滅する 5株の ピューロマイシン、 G418感受性株を得た。
(実施例 79) ヒ 卜 2番染色体断片を保持するマウス系統と C57BL/6系統との交配 による血清中ヒ 卜抗体 鎖発現の上昇
(実施例 43、 44) に示したヒ ト 2番染色体断片 （以後 W23断片） を保持するキ メラマウス子孫 （以後 Fl (chimera x MCH) ) の遺伝的背景は、 TT2F細胞 （実施例 39) 由来の CBAマウス系統及び C57BL/6マウス系統、 そしてキメラマウスとの交 配に用いた MCH ( I CR)マウス系統の混合したものである。 できるだけ均質な遺伝的 背景のもとで W23断片の挙動を観察するため、 まず MCH( I CR)との戻し交配を行つ た。 FKchimera x MCH) (任意に選んだ雄 8匹、 雌 6匹を使用） x MCH( i CR)の交 配の結果得られた子マウスにつき （実施例 43) の方法に従って、 W23断片保持を 検討した。 その結果雄経由で 8% (324匹中 25匹がポジティブ） 、 雌経由で 22% ( 148匹中 32匹がポジティブ） の子孫に W23断片が伝達することが確認された。 こ こで得られた F2(F1 X MCH) (任意に選んだ雄 8匹、 雌 8匹を使用） をさらに MCH( ICR)と交配した際の伝達率は雄経由 9% (346匹中 30匹がポジティブ） 、 雌経由 24 % (202匹中 48匹がポジティブ） と FKchimera x MCH) x MCH( I CR)の結果と同様 であった。 この交配により F3(F2 X MCH)が得られた。
4 週令〜 12週令のキメラマウス （図 43中 ： ch imera、 4個体） 、 FKch imera x MCH) ( 19個体） 、 F2(F1 x MCH) (39個体） 、 F3(F2 x MCH) (33個体） について (実施例 44) と同様の方法により血清中ヒ ト抗体/ c鎖濃度を測定した結果を図 43 に示す。 W23断片を保持する全ての個体の血清中にヒ 卜抗体/ 鎖が検出された。 一方、 F2(F1 x MCH)及び F3 (F2 x MCH)においては /c鎖濃度のばらつきが大きくな り、 その平均値が ch imera及び FKchimera x MCH)と比較して低下した。
CH( I CR) 以外の系統との交配の影響を調べるため、 MCH( I CR)との交配実験で使 用したものと同じ F2('F1 X MCH)個体を C57BL/6N (日本クレアより購入） 系統と交 配した。 その結果得られた W23断片を保持する個体 （F3(F2 X C57BL/6) ) の 26個 体について前記と同様な /c鎖濃度測定を行つたところ、 キメラマウス及び Fl (ch i mera x MCH)と同等な高い /ί鎖濃度を示した （図 43) 。 前述した通り、 F3 (F2 x VICH)と F3 (F2 x C57BL/6)はまったく同じ F2(Fi x MCH)個体群を親とすることから 、 両者の違いは遺伝的背景のみと考えられる。 すなわち、 遺伝的背景の違いがヒ 卜抗体 c鎖の発現量に影響を与えることが示された。 そしてヒ ト抗体 /c鎖の効率 的な発現には MCH( I CR)よりも C57BL/6の遺伝的背景がより望ましいことが明かと なった。 同様な実験から、 C3H HeN系統 （日本クレアより購入） の遺伝的背景も. C57BL/6と同等かそれ以上にヒ ト抗体/ c鎖の効率的な発現に望ましいことも示さ れた。
ここで観察された遺伝的背景の抗体 /c鎖濃度への影響が、 個体レベルでの染色 体保持率 （安定性） と関係しているかについて以下の実験を行い検討した。 FKc h imera x MCH)個体のうち 2F- 1 (血清中/ c鎖濃度： 84mg/l ) 、 1F-3 (血清中/ 鎖 濃度 ： 13mg/l ) の尻尾由来繊維芽細胞及び骨髄細胞から調製した中期染色体サン プルについて F ISH解析 （Tomi zukaら， Nature Gene t i cs, 16, 133-143) を行い、 観察した中期分裂像のうちヒ ト染色体特異的プローブとハイブリダイズする W23 断片を含むものの割合を検定した。 ここで得られる値は繊維芽細胞及び骨髄細胞 における W23断片の保持率を示していると考えられる。 その結果、 2F- 1において は繊維芽細胞： 51¾、 骨髄細胞： 34%、 1F-3においては繊維芽細胞： 23¾、 骨髄 細胞： 18¾という保持率であった （それぞれ 50個以上の核板を測定） 。 これらの 結果より、 血清中 /c鎖濃度と繊維芽細胞、 骨髄細胞における W23断片保持率の間 には相関があることが示唆された。 すなわち、 遺伝的背景は、 導入したヒ ト染色 体断片そのものの安定性に影響を与えている可能性が高く、 C57BL/6及び C3H系 統の遺伝的背景はここ示した 2番染色体断片だけでなく他の染色体断片 （例えば
14番染色体断片） 上の遺伝子の効率的発現にも望ましいものと考えられる。 この推察を検証するために （実施例 68) で得られたヒ ト 14番染色体断片 （以後 SC20断片） を保持し、 ヒ ト抗体重鎖を血清中に発現する FKchimera x MCH)雄個 体 #17- 7と MCH(ICR)及び C57BL/6との交配を行った。 得られた子孫のうち SC20断 片を保持する F2(F1 ·χ MCH) ： 2個体、 F2(F1 x C57BL/6) ： 2個体について血清中 ヒ 卜鎖濃度 （実施例 68) 及び尻尾由来繊維芽細胞より調製した中期染色体サンプ ルにおける SC20断片保持率を W23断片の場合と同様に測定した。 その結果、 F2(F 1 X MCH)の//鎖濃度： il.0mg/l， 1. lmg/K 染色体保持率： 74%， 54,¾に対して F2 (Fl X C57BL/6)の場合ヒ 卜 鎖濃度： 47mg/l， 54mg/l、 染色体保持率： 84¾， 88¾ であり、 ヒ ト 鎖濃度、 染色体保持率共に F2(F1 X C57BL/6)個体の方が高い値を 示した。 すなわち、 W23断片を保持するマウスを用いた結果より推察された通り 、 C57BL/6の遺伝的背景は導入ヒ ト染色体の安定保持及び当該染色体上の遺伝子 の効率的発現に望ましいことが明らかとなった。
(実施例 80) 抗体重鎖欠損かつ抗体 /c鎖相同組換え体 ES細胞株からのキメラマウ ス作成
(実施例 58) で得られた抗体重鎖欠損かつ抗体 κ鎖相同組換え体 ES細胞株 HD43 を凍結ストックより立ち上げ、 ICR (日本クレア社） 雄雌マウスの交配により得 られた 8細胞期胚に胚あたり 10〜12個注入した。 ES細胞用培地 （実施例 9) で一 晚培養して胚盤胞に発生させた後、 偽妊娠処理後 2.5日の仮親 ICRマウス （日本 クレア社） の子宮に片側の子宮あたり約 10個のィンジェクション胚を移植した。 計 314個の注入胚を移植した結果、 51匹の子マウスが誕生した。 キメラ個体は 、 毛色において宿主胚 （ICR) 由来の白色の中に TT2細胞由来の野生色 （濃茶） が認められるかどうかにより判定される。 誕生した 51匹のうち毛色に明らかに野 生色の部分のある、 すなわち、 ES細胞の貢献の認められる個体は 26匹であった。 うち 2個体は毛色の 100%が野生色の （ES細胞に由来する） 雌キメラマウスであつ た。
この結果より、 抗体重鎖欠損かつ抗体軽鎖鎖相同組換え体 ES細胞株 HD43はキメ ラ形成能を保持していることが確認された。 得られたキメラマウスのうち 100%の 貢献率を示す雌においては、 ES細胞が機能的な生殖細胞 （卵子） に分化している 可能性が高い。
雌キメラマウス （毛色のキメラ率^ )0 ) について雄 I CRマウスとの交配により ES細胞由来の子孫が誕生するかを検討した。 この交配において I CR雄マウス （ァ ルピノ、 劣性） 由来精子により受精したキメラマウス中の TT2F細胞 （野生色 ：優 性） 由来の卵子からは野生色、 I CR由来卵子からは白色の子マウスが誕生する。 それぞれ 1回の交配によって得られた生存可能な子マウスのすべてが ES細胞由来 の毛色である野生色を示した。 これらの子マウスの尻尾より調製したゲノム DNA について抗体 鎖破壊アレルの存在をサザン解析により検討した （実施例 58) 。 その結果抗体 鎖破壊ァレルを持つ個体が得られた。
抗体軽鎖欠損へテロ接合体の雌雄個体の交配により生まれた 27匹の子マウスに ついてサザン解析 （実施例 58) を行った。 その結果 7匹において抗体軽鎖野性型 アレルが消失し、 欠損アレルのみ観察されたことから、 これらの個体は抗体軽鎖 欠損ホモ個体であると考えられた。 また、 血清中におけるマウス抗体 c鎖および ス鎖の検出、 定量を行った結果を図 44に示す。
サザン解析の結果抗体 /c鎖欠損ホモと判定された個体 （図中 4， 6, 14， 22, 24 ， 25， 26) においては c鎖の濃度が大きく減少し （残存している / c鎖は母親由来 と考えられる） 、 代わりに； I鎖の濃度が大きく上昇している。 これらの結果はこ れまでに報告された抗体 c鎖ノ ックアウ トマウスの解析結果 （Yong-Ru i Zouら， E BO J. 12, 81 1 -820 (1993) ) と一致している。
すなわち、 抗体/ 鎖相同組換え体 ES細胞株 HD43より、 抗体/ c鎖ノ ックアウ トマウ ス系統を確立することができた。
(実施例 81 ) ヒ 卜 22番染色体上にヒ トテロメァ配列を揷人するためのターゲティ ングベクタ一の作製
ヒ ト抗体軽鎖 I遺伝子 （以下 I g A遺伝子と記す） が存在する 22番染色体上に相 同組み換えによりヒ トテロメァ配列を挿入し、 断片化 （J. E. zhak iら、 Na tu re Gene t. , 2， 283-287, 1992) することを試みた。 具体的には、 l g ;i遺伝子の 極近傍 （テロメァ側） に存在する L I F遺伝子座にヒ 卜テロメァ配列を挿入するた めの夕一ゲティ ングベクターを作製した。 ヒ トテロメァ酉己歹りは、 J. J. Harringtonら ( ature Genet.. 15, 345-355, 1 997) にならつて、 PCRにより合成した。 PCR産物をァガロースゲル電気泳動に より精製し、 DNA blunting Kit (宝酒造） を用いて平滑化した。 この平滑化 PCR 産物を pBluescript S.K I I(t) (東洋紡） の Eco RV部位にライゲーシヨン （DNA Li gat ion Kit, 宝酒造） により揷入した （ pBS-TEい 。 このプラスミ ド pBS- TELの シークェンスを行った結果、 Hin dill - (TTAGGG)n ― Eco RI の方向で揷入され ていた。
次に、 相同組み換えに用いるヒ ト 22番染色体上の LIF遺伝子領域を以下のよう にして、 PCRで増幅し、 プラスミ ド pBS- TELにクローニングした。 PCRに用いた プライマ一のシークエンスは以下のようである。
センスプライマー ； 5' -TCGAACTAGTAGGAGAAGTGAACTTGAGGAGGC-3' (配列番号 65) アンチセンスプライマ一 ； 5' -TCGAACTAGTGATTCAGTGATGCTGTGCAGG-3' (配列番号 66)
PCR反応液の組成は、 10 X LA PCR buffer II (Mg2— free) (宝酒造） 5 n 1 、 25m MgCl2 5 〃1 ， dNTPmixture(2.5mM each) (宝酒造） 8 / しセンスプライ マ一 lOpmol, アンチセンスプライマ一 lOpmol, テンプレー ト DNA (HFL1， ヒ ト初代 繊維芽細胞ゲノム） lOOng, LA Taq (5u/ l) (宝酒造） 0.5 1 で、 滅菌蒸留水 を足して全量 50 1にした。 反応液の調製は全て氷上で行い、 予め 85°Cにセッ ト してあるサ一マルサイクラ一 （PCR system 9600，パーキンエルマ一） のゥヱルに 反応チューブをセッ 卜した。 94°Cで 1分加熱後、 98° 10秒、 65°C, 5分のサイ クルを 35回行った。 PCR産物をァガロースゲル電気泳動により精製し、 Spe 1で 切断し （プライマー中に Spe I 部位が存在） 、 pBS- TELの Spe I 部位に揷入した 。 L IF遺伝子の方向がヒ トテロメァ配列（TTAGGG)nに対して逆方向に揷人されて いるものを選択した （M. Giovannini ら、 Cytogenet Cell Genet 64， 240-244, 1993) [pBS-TEL/LIF] 。
次に、 ピューロマイシン耐性遺伝子を含むプラスミ ド pGKPuro (S. Watanabe ら、 Biochem. Biophys. Res. Comm. , 213， 130-137, 1995) を Eco Rlで切断後、 平滑化し、 Not I リ ンカ一を揷人した。 Not I 切断によりピューロマイ シン耐性 遺伝子を切り出し、 pBS- TEL/LIFの Not I 部位に揷人した。 ピューロマイ シン耐 性遺伝子の転写方向力 IF遺伝子の方向と同じものを選択した （ pBS- TEL/LIFPu ro、 図 45) 。 このプラスミ ドは大腸菌 DH5を用いて増幅し、 Q IAGENカラム （フナ コシ） により精製し、 トランスフヱクシヨ ンに用いた （後記） 。
(実施例 82) ヒ 卜 22番染色体の卜リ DT40細胞への導人
G418耐性遺伝子でマーキングされたヒ ト 22番染色体を有するマウス Α9細胞 （富 塚ら、 a t ure Gene t. 16, 133-143, 1997、 以下 A9/#22neoと記す） の培養は、 10¾ゥシ胎児血清 （以下 FBSで記す） と G418 (800 / g/ml ) を添加したダルべッ . コ改変イーグル培地 （以下 DMEMと記す） 中で行った。 トリ DT40細胞の培養は、 10 ¾ FBS、 1 ¾ニヮ トリ血清、 10 ' M 2-メルカプトエタノールを添加した DME 1中で行 つた。
ミ クロセルは以下のようにして得た （詳細は、 清水ら、 細胞工学ハン ドブック
、 羊土社、 P127-) 。 A9/#22neo細胞を 12本の 25cm2遠心用フラスコ （コース夕 一、 3025) にて、 細胞密度が 90%飽和程度まで培養した。 コルセミ ド （0. 07 g/ml , デメコルシン、 和光純薬） を添加した培地 （DMEM + 20¾FBS ) に交換し、 さらに 2. 5- 3日間培養し、 ミクロセルを形成させた。 培養液を除去し、 予め 37°C で保温したサイ 卜カラシン B ( 10 g/ml, シグマ） 溶液を遠心用フラスコに満 たし、 34°C、 8000rpm, 1時間の遠心を行った。 ミクロセルを DMEMに懸濁し、 フ ィルターろ過により精製した。 精製後、 1500rpmで 1 0分間遠心し、 DMEM5mlに 懸濁した。 2 X 107個の DT40を 1000rpm， 5分間遠心し、 DMEMで 2回洗浄し、 D
ΜΕΜ5πι1に懸濁した。 再度、 ミクロセルを 1500rpmで 1 0分間遠心し、 上清を除か ずに、 先の DT40懸濁液 5mlを静かに重層した。 1300rpm， 5分間の遠心後、 上清を 除去し、 PHA- P ( 100 g/ml 、 ダフコ） 2mlに懸濁し、 37°C、 5%C02イ ンキュ ベター中に 15分間静置した。 1700rpm， 7分間遠心し、 上清を除去し、 細胞塊をタ ッビングでほぐした。 PEG1500 (ポリエチレングリコール、 ベーリ ンガー） 1ml を静かに加え、 撹拌しながら 1. 5- 2分間処理した。 処理後、 DMEMlmlを約 1分間 かけて加え、 さらに DMEM3mlを約 2分間かけて加え、 さらに DMEMを足して全量 11 mlにし、 撹拌した。 室温で 1 0分間静置した後、 1300rpm， 5分間遠心し、 上清を 除去して上記培溶液 10mlに懸濁し、 直径 100mmディ ッシュ中で 24時間培養した。
24時間後、 G418 ( lmg/ml ) を添加した培地に交換し、 24穴プレート （住友べーク ライ ト） 3枚に分注し、 約 2週間選択培養を行い、 G418耐性クローンを単離し た。
( 1 ) PCR解析
選択培養の結果、 '約 3 0個の G418耐性クローンが得られた。 これらのクローン から Puregene DNA Isolation Kit (Gentra System社） を用いてゲノム DMAを抽 出し、 これを铸型にしてヒ ト lg;i遺伝子特異的プライマ一を用いた PCRを行うこ とによって、 lg i遺伝子を含んだヒ ト 22番染色体を有するクローンを同定した 。 用いたヒ ト igA遺伝子特異的プライマーは以下のようである。
5* -GAGAGTTGCAGAAGGGGTGACT-3' (配列番号 67)
5' -GGAGACCACCAAACCCTCCAAA-3' (配列番号 68)
PCR反応液の組成は、 10 X Ex Taq buffer (宝酒造） 5 n 1, dNTPmixture(2.5 mM each) (宝酒造） 8 1，各プライマー lOpmol, ゲノム DNAlOOng, Ex Taq (5u/ H 1) (宝酒造） 0.5 \ で、 滅菌蒸留水を足して全量 50 1にした。 反応液 の調製は全て氷上で行い、 予め 85°Cにセッ 卜してあるサ一マルサイクラ一 （PCR system 9600，パーキンエルマ一） のゥエルに反応チューブをセッ 卜した。 94°Cで 1分加熱後、 98°C， 10秒、 56°C， 30秒、 72°C， 30秒のサイクルを 35回行った。 こ の結果、 ヒ ト IgA遺伝子を有するクローン力く 2個同定された。 この 2クローンに 対して、 ヒ 卜 22番染色体上の多型マ一力一 （D22S315, D22S280, D22S283, D22S2 74、 Polymorphic STS Primer Pair, BIOS社、 J. E. Col 1 insら、 Nature 377 sup pl:367, 1995) の存在を PCRによって検出した （図 46) 。 PCRの条件はヒ ト lg i 遺伝子の検出の条件と同じである。 〇はマーカ一が検出されたことを、 Xは検出 されなかったことを示す。 左側は物理的地図に基づく各マ一力一の 22番染色体上 での位置を示す。 この結果から、 この 2クローンはヒ ト 22番染色体のほぼ全長を 持つものと考えられた。 残りのクローンについては、 ヒ ト ig;i遺伝子は検出され ないが、 上記の 22番染色体多型マ一カーの幾つかが検出された。
(2 ) FISH解析
上記 2クローン中の 52- 18に対して、 実際にヒ ト 22番染色体が細胞中でどのよ うに存在しているかを FISHによって解析した。 染色体標本の作製、 ハイブリダィ ゼーシヨン、 検出などの基本操作は富塚ら （Nature Genet. 16， 133-143, 1997
l 3 2 ) に従い、 プローブはヒ ト COT- 1 DNA (ローダミ ン標識） を用いた。 20から 30の 分裂像を観察した結果、 PCRの結果のとおり、 ヒ ト 22番染色体のほぼ全長が独立 して存在していることが確認できた （図 50) 。 赤色に染まっているのがヒ ト 22番 染色体である。 ' ·
以上の解析結果より、 トリ DT40細胞株 52- 18 (以下 DT40/i 22neoと記す） はヒ ト 22番染色体のほぼ全長を有すると判断した。
(実施例 83) 卜 リ DT40細胞中でのヒ ト 22番染色体の特異的断片化
(実施例 82) で得た DT40/#22neoに対して、 （実施例 81) で作製したプラスミ ド pBS - TEし/ L I FPuroをトランスフエクシヨ ンし、 ヒ ト 22番染色体を L I F遺伝子座 上で特異的に断片化することを試みた。
DT40/ 22neo細胞の培養は、 G418 ( lmg/ml ) を添加した （実施例 82) と同じ条 件で行った。 10 固の細胞を冷 PBSで 1回洗浄し、 0. 5niiの PBSに懸濁し、 氷上 に置いた。 Eco R lで線状化した pBS-TEL/L I FPuro 25-30 gを細胞に加え、 ピぺ ッ 卜で混合し、 エレク トロポレーション用のキュべッ ト （バイオラッ ド） に移し 、 氷中で 10分間静置した。 キュべッ トをジーンパルサ一 （バイオラッ ド） にセッ 卜し、 550V, 25 / F の条件で電圧印加した。 氷中で 10分間静置後、 培地 （前記） を含んだ 75cm2培養フラスコに細胞を移し、 24時間培養した。 24時間後、 G418
( lmg/ml ) とピューロマイ シン（0. 3 / g/mi， シグマ） を添加した培地に交換し、 96穴培養プレー ト 5- 8枚に分注し、 約 2週間の選択培養を行い、 耐性クローンを 単離した。
( 1 ) PCR解析
選択培養の結果、 約 80個の耐性クローンが得られた。 これらの細胞から前記と 同様にゲノム DNAを抽出し、 PCRを行い、 ヒ トテロメァ配列が U F遺伝子座に揷 入された相同組み換え体を同定した。 プライマ一の一方をベクターには含まれな い L I F遺伝子領域中に設計し、 もう一方のプライマーはべクタ一に含まれるピュ —ロマイシン耐性遺伝子中に設計した （図 47)。 プライマーの配列は以下のよう である。
Puro. 1 ; 5' -GAGCTGCAAGAACTCTTCCTCACG-3' (配列番号 69) LIF1; a' -ATGACTCTAAGGCAGGAACATCTGTACC-3' (配列番号 70)
PCR 反応液の組成は、 10 X LA PCR buffer II ( 2 ~ free) (宝酒造） 5 1, 25m gCl^ 5 a 1 ， dNTPmixture(2.5mM each) (宝酒造） 8 1，各プライマ一 lOpmol, テンプレー十 DNA lOOng, LA Taq (5u/ l) (宝酒造） 0.5 1 で、 滅菌 蒸留水を足して全量 50/ 1にした。 反応液の調製は全て氷上で行い、 予め 85°Cに セッ トしてあるサーマルサイクラ一 （PCR system 9600，パーキンエルマ一） のゥ エルに反応チューブをセッ 卜した。 94°Cで 1分加熱後、 98°C， 10秒、 65°C， 10分 のサイクルを 35回行った。 目的の相同組み換え体においてのみ、 図 47に示した様 な 6.3kbの PCR産物が検出されるはずである。 PCRの結果、 8クローンにおいて この 6.3kbのバン ドが検出された （相同組み換え率；約 10%) 。 この PCR産物を Sal Iで切断した結果、 予想通りの切断パターンが得られ、 相同組み換え体であ ることが確認された。
次に、 これら 8クローンにおいて、 期待通りの断片化が起きているか否かを 22 番染色体上の遺伝子 （IgA, し IF， MB, IL2RB, CYP2D6, DIAL ECGF1, ARSA, J. E • Collinsら、 Nature 377 suppl:367, 1995) 及び多型マ一カー (D22S315, D22S2 75, D22S280, D22S281, D22S277, D22S278, D22S283, D22S272, D22S282, D22S2 74， J. E. Collinsら、 Nature 377 suppl:367, 1995) の存在を PCRで検出するこ とによって調べた。
用いたブライマ一配列の一部は以下のようである。 残りのプライマー配列に関 しては富塚ら （Nature Genet. 16， 133-143, 1997) が用いたものと同じである 。 LIFについては、 上記実験より存在していることは明らかである。
CYP2D6
センスプライマー ； 5' -CTGCGTGTGTAATCGTGTCC-3' (配列番号 71)
アンチセンスプライマ一 ； 5' - TCTGCTGTGAGTGAACCTGC-3' (配列番号 72)
ECGF1
センスプライマ一 ； 5' -AGGAGGCACCTTGGATAAGC-3' (配列番号 73)
アンチセンスプライマ一 ； 5' -TCACTCTGACCCACGATACAGC-3' (配列番号 74)
PCR反応液の組成は、 10 X Ex Taq buffer (宝酒造） 5 1, dNTPmixture(2.5 mM each) (宝酒造） 8 1，各プライマ一 lOpmol, ゲノム DNA100ng， Ex Taq (5u/
l 3 4 1 ) (宝酒造） 0. 5 1 で、 滅菌蒸留水を足して全量 50 z lにした。 反応液の 調製は全て氷上で行い、 予め 85°Cにセッ 卜してあるサ一マルサイクラ一 （PCR sy s tem 9600，パーキンエルマ一） のゥヱルに反応チューブをセッ トした。 94°Cで 1 分加熱後、 98° (：， 10秒、 56°C ( CYP2D6と ECGF1は 65°C ) ， 30秒、 72°C, 30秒の サイクルを 35回行った。 結果を図 48に示した。 〇、 Xの表記は前記と同じである 。 この図から明らかなように、 クローン 67， 68, 328, 343について、 ヒ トテロメ ァ配列が挿入されている L I F遺伝子座よりテロメァ側の遺伝子及びマーカ一は全 て検出されていないことが分かる。 少なく ともこの 4クローンに関しては、 予想 通りのテロメァ配列による断片化が起きていることが考えられる。
( 2 ) F I SH解析
実際にヒ 卜 22番染色体が断片化しているか否かを F I SHにより解析した。 実験方 法は前記と同様であり、 プローブはヒ ト C0T1 DNA (ローダミ ン標識） とプラスミ ド pGKPuro (F ITC標識） を用いた。 C0T1染色により、 ほぼ全長のヒ 卜 22番染色 体を持つ DT40/#22neoと比較して断片化しているかが視覚的に判断できる。 また 、 予想通りベクターが挿入された L IF遺伝子座で断片化していれば、 Puroプロ一 ブ由来のシグナルを 22番染色体断片のテロメァ- -端に認めることができるはずで ある。 結果の一部を図 49に示した。 全てのクローンにおいて、 20から 30の分裂像 を観察した結果、 驚くべきことに相同組み換え体 8クローンの全てにおいて、 P uroプローブ由来のシグナル （黄緑色） をテロメァ一端に持つヒ ト 22番染色体の 小断片 （赤色） が観察された。 上記の PCR解析の結果、 断片化が起きていないと 推察されたクローン （64， 212, 222, 305) に関しては、 ほぼ全長のヒ ト 22番染 色体を持つ細胞が全細胞の約 10 位混在していた。
以上の実験結果より、 トリ DT40/#22 neo細胞において、 U F遺伝子座にヒ トテ ロメァ配列が挿入された相同組み換え体が約 10%の効率で得られ、 その全てのク ローンにおいて （効率 100%) 、 その挿入部位でヒ ト 22番染色体の小断片化が起き ていることが分かった。 産業上の利用の可能性
本発明により、 単一または複数の外来染色体またはその断片を保持し、 該染色 体またはその断片上の遺伝子を発現するキメラ非ヒ ト動物が提供された。 本発明 のキメラ非ヒ 卜動物を利用して、 生物学的に活性な物質を製造することができる 本発明により、 単一または複数の外来染色体またはその断片を保持し、 該染色 体またはその断片上の遺伝子を発現する分化多能性を持つ細胞が提供された。 該 細胞を利用して、 骨髄移植等による遺伝病治療を行うことができる。
本発明により、 少なく とも 2種の内因性遺伝子が破壊されている分化多能性を 保持する細胞が提供された。 破壊された内因性遺伝子と同じまたは相同の遺伝子 を含む単一または複数の外来染色体あるいはその断片を移入させる受容細胞とし て本発明の細胞を利用することにより、 単一または複数の外来染色体あるいはそ の断片を保持し、 該外来染色体あるいはその断片上の遺伝子を発現する機能細胞 あるいはキメラ非ヒ 卜動物を作製することができる。 かかるキメラ非ヒ ト動物ま たはその子孫の個体、 組織または細胞において、 単一または複数の外来染色体あ るいはその断片上の遺伝子を発現させることにより、 その産物としての生物学的 に活性な物質を製造することができる。
配 列 表
配列番号： 1
配列の長さ ： 2 0
配列の型 ：核酸 · .
鎖の数： 一本鎖
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列
TGGAAGGTGG ATAACGCCCT 20 配列番号： 2
配列の長さ ： 2 2
配列の型 ：核酸
鎖の数： 一本鎖
卜ポロジ一 ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列
TCATTCTCCT CCAACATTAG CA 22 配列番号： 3
配列の長さ ： 2 0
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列
GCAATCGGTC TGCCGGAAGA 20 配列番号： 4 配列の長さ ： 2 0
配列の型：核酸
鎖の数 ：一本鎖
トポロジー ： 直鎖状- .
配列の種類： 他の核酸 合成 DNA
配列
TTGGATCACT TTGGACCCAG 20 配列番号： 5
配列の長さ ： 2 0
配列の型 ：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列
CTCTCCTGCA GGGCCAGTCA 20 配列番号： 6
配列の長さ ： 2 2
配列の型 ：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列
TGCTGATGGT GAGAGTGAAC TC 22 配列番号： 7
配列の長さ ： 2 0
配列の型 ：核酸 鎖の数： 一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列 ' ·
AGTCAGGGCA TTAGCAGTGC 20 配列番号： 8
配列の長さ ： 2 0
配列の型：核酸
鎖の数： 一本鎖
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成謂 A
配列
GCTGCTGATG GTGAGAGTGA 20 配列番号： 9
配列の長さ ： 2 0
配列の型 ：核酸
鎖の数： 一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列
TGGTGGCTGA AAGCTAAGAA 20
配列番号： 1 0
配列の長さ ： 2 0
配列の型 ：核酸
鎖の数： 一本鎖
トポロジー ：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列
CCAGAAGAAT GGTGTCATTA 20 配列番号： 1 1
配列の長さ ： 2 0
配列の型 ：核酸
鎖の数 ：一本鎖
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列
TCCAGGTTCT GCAGAGCAAG 20 配列番号： 1 2
配列の長さ ： 2 0
配列の型 ：核酸
鎖の数 ：一本鎖
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列
TGTAGTTGGA GGCCATGTCC 20 配列番号： 1 3
配列の長さ ： 2 0
配列の型：核酸
鎖の数 ： 一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列 CCCCACCCAT GATCCAGTAC 20 配列番号： 1 4
配列の長さ ： 2 0 .
配列の型 ：核酸
鎖の数 ： 一本鎖
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類： 他の核酸 合成 DNA
配列
GCCCTCAGAA GACGAAGCAG 20 配列番号： 1 5
配列の長さ ： 2 2
配列の型：核酸
鎖の数 ：一本鎖
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類： 他の核酸 合成 DNA
配列
GAGAGTTGCA GAAGGGGTGA CT 22 配列番号： 1 6
配列の長さ ： 2 2
配列の型：核酸
鎖の数 ：一本鎖
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列
GGAGACCACC AAACCCTCCA AA 22 l 4 l 配列番号： 1 7
配列の長さ ： 2 0
配列の型： 核酸
鎖の数 ：一本鎖 · .
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 A
配列
GGCTATGGGG ACCTGGGCTG 20 配列番号： 1 8
配列の長さ ： 2 2
配列の型 ：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ： 直鎖状 '
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列
CAGAGACACA GGCACGTAGA AG 22 配列番号： 1 9
配列の長さ ： 2 0
配列の型 ：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列
TTAAGGGTCA CCCAGAGACT 20 配列番号： 2 0
配列の長さ ： 2 0 配列の型 ：核酸
鎖の数 ：一本鎖
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列
TGTAGTTGGA GGCCATGTCC 0 配列番号： 2 1
配列の長さ ： 2 0
配列の型：核酸
鎖の数 ：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列
CAAAAAGTCC AACCCTATCA 20 配列番号： 2 2
配列の長さ ： 2 0
配列の型 ：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列
GCCCTCAGAA GACGAAGCAG 20 配列番号： 2 3
配列の長さ ： 2 0
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖 トポロジー ： 直鎖状
配列の種類： 他の核酸 合成 DNA
配列
TCGTTCCTGT CGAGGATGAA 20 配列番号： 2 4
配列の長さ ： 2 0
配列の型 ： 核酸
鎖の数： 一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列
TCACTCCGAA GCTGCCTTTC 20 配列番号： 2 5
配列の長さ ： 2 1
配列の型 ：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列
ATGTACAGGA TGCAACTCCT G 21
配列番号： 2 6
配列の長さ ： 2 0
配列の型 ：核酸
鎖の数： 一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA 配列
TCATCTGTAA ATCCAGCAGT 20 配列番号： 2 7 '
配列の長さ ： 2 0
配列の型 ：核酸
鎖の数： 一本鎖
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列
GATCCCATCG CAGCTACCGC 0 配列番号： 2 8
配列の長さ ： 2 0
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列
TTCGCCGAGT AGTCGCACGG 20 配列番号： 2 9
配列の長さ ： 2 2
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列
GATGAACTAG TCCAGGTGAG TT 22
l 5 配列番号： 3 0
配列の長さ ： 2 2
配列の型 ：核酸 · ·
鎖の数： 一本鎖
トポ口ジ一 ： 直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列
CCTTTTGGCT TCTACTCCTT CA 22 配列番号： 3 1 .
配列の長さ ： 2 0
配列の型：核酸
鎖の数： 一本鎖
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列
ATAGAGGGTA CCCACTCTGG 20 配列番号： 3 2
配列の長さ ： 2 0
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列
AACCAGGTAG GTTGATATGG 20 配列番号： 3 3 配列の長さ ： 2 0
配列の型 ：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジ一 ：直鎖状 '
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列
AAGTTCCTGT GATGTCAAGC 20 配列番号： 3 4
配列の長さ ： 2 0
配列の型 ：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列
TCATGAGCAG ATTAAACCCG 20 配列番号： 3 5
配列の長さ ： 2 0
配列の型 ：核酸
鎖の数 ：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列
TGTGAAGGAG GACCAGGTGT 20 配列番号： 3 6
配列の長さ ： 2 0
配列の型 ：核酸 鎖の数 ：一本鎖
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列
TGTAGGGGTT GACAGTGACA 20 配列番号： 3 7
配列の長さ ： 2 0
配列の型 ：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列
CTGAGAGATG CCTCTGGTGC 20 配列番号： 3 8
配列の長さ ： 2 0
配列の型 ：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列
GGCGGTTAGT GGGGTCTTCA 20 配列番号： 3 9
配列の長さ ： 2 0
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列
GGTGTCGTGG AACTCAGGCG 20 配列番号： 4 0
配列の長さ ： 2 0
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列
CTGGTGCAGG ACGGTGAGGA 20 配列番号 4 1
配列の長さ ： 2 0
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列
GCATCCTGAC CGTGTCCGAA 20 配列番号： 4 2
配列の長さ ： 2 0
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列 GGGTCAGTAG CAGGTGCCAG 20
配列番号 ： 4 3
配列の長さ ： 2 0 ' '
配列の型 ：核酸
鎖の数： 一本鎖
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列
AGTGAGATAA GCAGTGGATG 20
配列番号： 4 4
配列の長さ ： 2 0
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列
GTTGTGCTAC TCCCATCACT 20
配列番号： 4 5
配列の長さ ： 2 1
配列の型：核酸
鎖の数： 一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列
TTGTATTTCC AGGAGAAAGT G 21 l 5 0 配列番号： 4 6
配列の長さ ： 2 0
配列の型 ：核酸
鎖の数： 一本鎖 ' ·
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列
GGAGACGAGG GGGAAAAGGG 20 配列番号： 4 7
配列の長さ ： 2 7
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列
ATGGACTGGA CCTGGAGGRT CYTCTKC 27 配列番号： 4 8
配列の長さ ： 2 7
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列
ATGGAGYTTG GGCTGASCTG GSTTTYT 27 配列番号： 4 9
配列の長さ ： 2 7 配列の型 ： 核酸
鎖の数： 一本鎖
トポロジー ：直崖；|犬
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列
ATGRAMMWAC TKTGKWBCWY SCTYCTG 27 配列番号： 5 0
配列の長さ ： 2 0
配列の型 ： 核酸
鎖の数： 一本鎖
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列
CAGAGGCAGT TCCAGATTTC 20 配列番号： 5 1
配列の長さ ： 2 0
配列の型： 核酸
鎖の数： 一本鎖
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列
TGGGATAGAA GTTATTCAGC 20 配列番号： 5 2
配列の長さ ： 2 7
配列の型：核酸
鎖の数： 一本鎖 トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DMA
配列
ATGGACATGR RRDYCCHYGY KCASCTT 27 配列番号： 5 3
配列の長さ ： 2 8
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列
CCAAGCTTCA GGAGAAAGTG ATGGAGTC 28 配列番号： 5 4
配列の長さ ： 2 8
配列の型 ：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列
CCAAGCTTAG GCAGCCAACG GCCACGCT 28 配列番号： 5 5
配列の長さ ： 2 8
配列の型：核酸
鎖の数： 一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA 配列
CCAAGCTTCA GAGGCAGTTC CAGATTTC 28 配列番号： 5 6
配列の長さ ： 2 8
配列の型 ：核酸
鎖の数： 一本鎖
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列
GGGAATTCGG GTAGAAGTCA CTGATCAG 28 配列番号： 5 7
配列の長さ ： 2 8
配列の型：核酸
鎖の数 ：一本鎖
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類： 他の核酸 合成 DNA
配列
GGGAATTCGG GTAGAAGTCA CTTATGAG 28 配列番号： 5 8
配列の長さ ： 2 8
配列の型：核酸
鎖の数 ：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類： 他の核酸 合成 DNA
配列
GGGAATTCGG GTAGAAGTCA CTTACGAG 28
l 5 4 配列番号： 5 9
配列の長さ ： 6 0
配列の型：核酸 '
鎖の数 ： 一本鎖
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列
ACCTTCATCG TCCTCTTCCT CCTGAGCCTC TTCTACAGCA CCACCGTCAC CCTGTTCAAG 60 配列番号： 6 0
配列の長さ ： 6 0
配列の型：核酸
鎖の数： 一本鎖
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列
TGATGCTGCA CCAACTGTAT CCATCTTCCC ACCATCCAGT GAGCAGTTAA CATCTGGAGG 60
配列番号： 6 1
配列の長さ ： 2 2
配列の型：核酸
鎖の数： 一本鎖
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列
CTGGGGTGAG CCGGATGTTT TG 22 配列番号： 6 2 配列の長さ ： 2 2
配列の型：核酸
鎖の数： 一本鎖
トポロジー ：直鎖状'
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列
CCAACCCAGC TCAGCCCAGT TC 22
配列番号： 6 3
配列の長さ ： 3 6
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列
AATTCCCGCG GGTCGACGGA TCCCTCGAGG GTACCA 36
配列番号： 6 4
配列の長さ ： 3 6
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列
GGGCGCCCAG CTGCCTAGGG AGCTCCCATG GTTCGA 36
配列番号： 6 5
配列の長さ ： 3 3
配列の型：核酸 鎖の数 ： 一本鎖
トポ口ジー ： 直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列
TCGAACTAGT AGGAGAAGTG AACTTGAGGA GGC 33 配列番号： 6 6
配列の長さ ： 3 1
配列の型 ：核酸
鎖の数： 一本鎖
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列
TCGAACTAGT GATTCAGTGA TGCTGTGCAG G 31 配列番号： 6 7
配列の長さ ： 2 2
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポ口ジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列
GAGAGTTGCA GAAGGGGTGA CT 22 配列番号： 6 8
配列の長さ ： 2 2
配列の型：核酸
鎖の数： 一本鎖
トポロジー ：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列
GGAGACCACC AAACCCTCCA AA 22 配列番号： 6 9
配列の長さ ： 2 4
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列
GAGCTGCAAG AACTCTTCCT CACG 24 配列番号： 7 0
配列の長さ ： 2 8
配列の型 ：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列
ATGACTCTAA GGCAGGAACA TCTGTACC 28 配列番号： 7 1
配列の長さ ： 2 0
配列の型 ：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列 CTGCGTGTGT AATCGTGTCC 20 配列番号： 7 2
配列の長さ ： 2 0 ―'
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列
TCTGCTGTGA GTGAACCTGC 20 配列番号： 7 3
配列の長さ ： 2 0
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列
AGGAGGCACC TTGGATAAGC 20
配列番号： 7 4
配列の長さ ： 2 2
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列
TCACTCTGAC CCACGATACA GC 22

Claims

請 求 の 範 囲
1 . 単一または複数の外来染色体あるいはその断片を含むミ クロセルを作製し、 該ミ クロセルとの融合により、 分化多能性を保持する細胞へ前記単一または複数 の外来染色体あるいはその断片を移人させることを特徴とする、 キメラ非ヒ ト動 物の作製法。
2. 単一または複数の外来染色体あるいはその断片を含むミ クロセルを作製し、 該ミ クロセルとの融合により、 分化多能性を保持する細胞へ前記単一または複数 の外来染色体あるいはその断片を移人させることを特徴とする、 単一または複数 の外来染色体あるいはその断片を含む分化多能性を保持する細胞の作製方法。
3 . 単一または複数の外来染色体あるいはその断片が 6 7 0 k bを越える請求の 範囲第 1項または第 2項記載の方法。
4 . 単一または複数の外来染色体あるいはその断片が 1 M b (百万塩基対） 以上 である請求の範囲第 3項記載の方法。
5. 外来染色体あるいはその断片が抗体をコー ドする領域を含むものである請求 の範囲第 1項または第 2項記載の方法。
6 . 単一または複数の外来染色体あるいはその断片を含むミ クロセルが、 単一ま たは複数の外来染色体あるいはその断片を含む細胞とミ クロセル形成能の高い細 胞とを融合させて作製されたハイプリ ッ ド細胞から誘導されたものである請求の 範囲第 1項または第 2項記載の方法。
7 . 単一または複数の外来染色体あるいはその断片を含むミクロセルが、 前記ハ イブリ ッ ド細胞から誘導されたミ クロセルをさらにミ クロセル形成能の高い細胞 と融合させて作製された細胞から誘導されたものである請求の範囲第 6項記載の 方法。
8 . 単一または複数の外来染色体あるいはその断片を含む細胞がヒ ト正常 2倍体 細胞である請求の範囲第 6項記載の方法。
9 . ミ クロセル形成能の高い細胞がマウス A 9細胞である請求の範囲第 6項〜第 8項のいずれか一項に記載の方法。
10. 分化多能性を保持する細胞が、 胚性癌腫細胞、 胚性幹細胞、 胚性生殖細胞お よびそれらの変異体から成る群より選択されるものである請求の範囲第 1項また は第 2項記載の方法。
1 1. 外来染色体あるいはその断片が目的の遺伝子を含むものであり、 分化多能性 を保持する細胞がその外来染色体あるいはその断片上の該目的の遺伝子と同じあ るいは相同の内因性遺伝子が破壊されているものである請求の範囲第 1項または 第 2項記載の方法。
12. 外来染色体あるいはその断片が少なく とも 2種の目的の遺伝子を含むもので あり、 分化多能性を保持する細胞がその外来染色体あるいはその断片上の該目的 の遺伝子と同じあるいは相同の内因性遺伝子が破壊されているものである請求の 範囲第 1 1項記載の方法。
13. 分化多能性を保持する細胞において、 前記目的の遺伝子と同じあるいは相同 の内因性遺伝子の両側または片側の対立遺伝子が破壊されている請求の範囲第 1 1 項記載の方法。
14. 前記目的の遺伝子が抗体遺伝子である請求の範囲第 1 1項項記載の方法。
15. 前記抗体遺伝子が抗体重鎖遺伝子および抗体軽鎖遺伝子である請求の範囲第 14項記載の方法。
16. 外来染色体あるいはその断片が目的の遺伝子を含むものであり、 その外来染 色体あるいはその断片上の前記目的の遺伝子と同じあるいは相同の内因性遺伝子 が破壊されている分化多能性を保持する細胞に、 該目的の遺伝子を含む外来染色 体あるいはその断片を移入した後、 該細胞と前記目的の遺伝子と同じあるいは相 同の内因性遺伝子が欠損している系統の非ヒ 卜動物の胚とのキメラを作製する請 求の範囲第 1項記載の方法。
17. 前記目的の遺伝子と同じあるいは相同の内因性遺伝子が欠損している系統の 非ヒ 卜動物が標的遺伝子相同組み換え法により作製されたものである請求の範囲 第 16項記載の方法。
18. キメラ非ヒ ト動物が、 単一または複数の外来染色体あるいはその断片を保持 し、 該外来染色体あるいはその断片上の遺伝子を発現し、 該外来染色体あるいは その断片を子孫に伝達可能なものである請求の範囲第 1項記載の方法。
19. キメラ非ヒ ト動物が哺乳動物である請求の範囲第 1項記載の方法。
20. 哺乳動物がマウスである請求の範囲第 19項記載の方法。
21. 単一または複数の外来染色体あるいはその断片を含む分化多能性を保持する 細胞。
22. 単一または複数の外来染色体あるいはその断片が 6 7 0 k bを越える請求の 範囲第 21項記載の細胞。
23. 外来染色体あるいはその断片が目的の遺伝子を含むものであり、 分化多能性 を保持する細胞においてはその外来染色体あるいはその断片上の該目的の遺伝子 と同じあるいは相同の内因性遺伝子が破壊されている請求の範囲第 21項記載の細 胞。
24. 外来染色体あるいはその断片が少なく とも 2種の目的の遺伝子を含むもので あり、 分化多能性を保持する細胞においてはその外来染色体あるいはその断片上 の該目的の遺伝子と同じあるいは相同の内因性遺伝子が破壊されている請求の範 囲第 23項記載の細胞。
25. 分化多能性を保持する細胞において、 前記目的の遺伝子と同じあるいは相同 の内因性遺伝子の両側または片側の対立遺伝子が破壊されている請求の範囲第 23 項記載の細胞。
26. 前記外来染色体あるいはその断片が抗体遺伝子を含むものである請求の範囲 第 21項項記載の細胞。
27. 前記抗体遺伝子が抗体重鎖遺伝子および抗体軽鎖遺伝子である請求の範囲第 26項記載の細胞。
28. 分化多能性を保持する細胞が、 胚性癌腫細胞、 胚性幹細胞、 胚性生殖細胞お よびそれらの変異体から成る群より選択されるものである請求の範囲第 21項記載 の細胞。
29. 単一または複数の外来染色体あるいはその断片を保持し、 該外来染色体ある いはその断片上の遺伝子を発現するキメラ非ヒ ト動物、 または、 前記の単一もし くは複数の外来染色体あるいはその断片を保持し、 該外来染色体あるいはその断 片上の遺伝子を発現するその子孫。
30. 単一または複数の外来染色体あるいはその断片が 6 7 0 k bを越える請求項
29記載のキメラ非ヒ ト動物またはその子孫。
31. 外来染色体あるいはその断片が目的の遺伝子を含むものであり、 該目的の遺 伝子と同じあるいは相同の内因性遺伝子が破壊されて 、る請求の範囲第 29項記載 のキメラ非ヒ ト動物またはその子孫。
32. 外来染色体ある'いはその断片が少なく とも 2種の目的の遺伝子を含むもので あり、 該目的の遺伝子と同じあるいは相同の内因性遺伝子が破壊されている請求 の範囲第 31項記載のキメラ非ヒ ト動物またはその子孫。
33. 前記目的の遺伝子と同じあるいは相同の内因性遺伝子の両側または片側の対 立遺伝子が破壊されている請求の範囲第 31項記載のキメラ非ヒ ト動物またはその 子孫。
34. 前記目的の遺伝子が抗体遺伝子である請求の範囲第 31項項記載のキメラ非ヒ ト動物またはその子孫。
35. 前記抗体遺伝子が抗体重鎖遺伝子および抗体軽鎖遺伝子である請求の範囲第 34項記載のキメラ非ヒ 卜動物またはその子孫。
36. 請求の範囲第 29項記載のキメラ非ヒ ト動物またはその子孫の交配により得ら れる単一または複数の外来染色体あるいはその断片を保持し、 該外来染色体ある いはその断片上の遺伝子を発現する非ヒ 卜動物、 または、 単一もしくは複数の外 来染色体あるいはその断片を保持し、 該外来染色体あるいはその断片上の遺伝子 を発現するその子孫。
37. 単一または複数の外来染色体あるいはその断片を保持し、 該外来染色体ある いはその断片上の遺伝子を発現する請求の範囲第 29項記載のキメラ非ヒ 卜動物も しくはその子孫または請求の範囲第 36項記載の非ヒ ト動物もしくはその子孫を、 該遺伝子と同じあるいは相同の遺伝子が欠損している系統の非ヒ 卜動物と交配さ せることにより作製された非ヒ ト動物、 または、 前記の単一もしくは複数の外来 染色体あるいはその断片を保持し、 該外来染色体あるいはその断片上の遺伝子を 発現するその子孫。
38. 請求の範囲第 29項記載のキメラ非ヒ ト動物もしくはその子孫、 請求の範囲第 36項記載の非ヒ ト動物もしくはその子孫、 または請求の範囲第 37項記載の非ヒ 卜 動物もしくはその子孫に由来する組織。
39. 請求の範囲第 29項記載のキメラ非ヒ ト動物もしくはその子孫、 請求の範囲第 36項記載の非ヒ ト動物もしくはその子孫、 または請求の範囲第 37項記載の非ヒ 卜 動物もしくはその子孫に由来する細胞。
40. B細胞である請求の範囲第 39項記載の細胞。
41. 請求の範囲第 40項記載の細胞とミエ口—マ細胞との融合により作製されたハ ィブリ ド一マ。
42. 請求の範囲第 29項記載のキメラ非ヒ ト動物もしくはその子孫、 請求の範囲第 36項記載の非ヒ 卜動物もしくはその子孫、 または請求の範囲第 37項記載の非ヒ ト 動物もしくはその子孫の個体、 組織または細胞において、 単一または複数の外来 染色体あるいはその断片上の遺伝子を発現させ、 その産物としての生物学的に活 性な物質を回収することを特徴とする、 生物学的に活性な物質の製造法。
43. キメラ非ヒ ト動物の細胞が B細胞である請求の範囲第 42項記載の方法。
44. B細胞がミエ口一マ細胞と融合して、 不死化されている請求項 43記載の方法 c
45. 生物学的に活性な物質が抗体である請求の範囲第 42項記載の方法。
46. 抗体が哺乳動物の抗体である請求の範囲第 45項記載の方法。
47. 哺乳動物の抗体がヒ ト抗体である請求の範囲第 46項記載の方法。
48. 請求の範囲第 42項記載の方法により製造できる生物学的に活性な物質。
49. 6 7 0 k bを越えるヒ ト抗体遺伝子の少なく とも一つを保持し、 発現する非 ヒ ト動物。
50. 1 M b以上のヒ ト抗体遺伝子の少なく とも一つを保持し、 発現する請求の範 囲第 49項記載の非ヒ 卜動物。
51. ヒ ト抗体遺伝子が、 ヒ ト重鎖遺伝子、 ヒ ト軽鎖 /c遺伝子、 ヒ ト軽鎖； I遺伝子 およびそれらの組み合わせから成る群より選択される請求の範囲第 49項記載の非 ヒ 卜動物。
52. そのヒ ト抗体遺伝子と同じあるいは相同の非ヒ ト動物抗体遺伝子が欠損して いる請求の範囲第 49項記載の非ヒ ト動物。
53. そのヒ 卜抗体遺伝子と同じあるいは相同の非ヒ 卜動物抗体遺伝子の欠損が、 遺伝子相同組換えによる該非ヒ ト動物抗体遺伝子の破壊によるものである請求の 範囲第 52項記載の非ヒ ト動物。
54. 請求の範囲第 49項記載の非ヒ 卜動物の脾臓細胞とミエローマ細胞との融合に より得られるハイプリ ドーマ。
55. 請求の範囲第 54項記載のハイプリ ドーマにより産生される抗体。
56. ヒ ト抗体の少なく とも一つのクラスまたはサブクラスを発現する非ヒ ト動物 c
57. 発現するヒ ト抗体のクラスまたはサブクラスの遺伝子と同じあるいは相同の 内因性遺伝子が欠損している請求の範囲第 56項記載の非ヒ ト動物。
58. ヒ ト抗体のクラスまたはサブクラスが、 I g M、 I g G、 I g E、 I g A、
I g Dおよびそれらのサブクラス、 ならびにそれらの組み合わせから選択される 請求の範囲第 56項記載の非ヒ ト動物。
59. 6 7 0 k bを越える単一または複数の外来 D N Aを保持し、 該外来 D N A上 の遺伝子を発現する非ヒ ト動物。
60. 発現する外来 D N A上の遺伝子と同じあるいは相同の内因性遺伝子が欠損し ている請求の範囲第 59項記載の非ヒ ト動物。
61. 1 M b以上の単一または複数の外来 D N Aを保持し、 該外来 D N A上の遺伝 子を発現する請求の範囲第 59項記載の非ヒ ト動物。
62. 発現する外来 D N A上の遺伝子と同じあるいは相同の内因性遺伝子が欠損し ている請求の範囲第 61項記載の非ヒ ト動物。
63. 単一または複数の外来染色体あるいはその断片を含むミクロセルを作製し、 該ミ クロセルとの融合により、 前記単一または複数の外来染色体あるいはその断 片を胚盤胞に由来する培養細胞へ移入し、 該細胞の核を除核した未受精卵に移植 することを特徴とする、 トランスジエニック非ヒ ト動物の作製法。
64. 少なくとも 2種の内因性遺伝子が破壊されている分化多能性を保持する細胞 c
65. 少なくとも 2種の内因性遺伝子の両側または片側の対立遺伝子が破壊されて いる請求の範囲第 64項記載の細胞。
66. 破壊されている内因性遺伝子が抗体遺伝子である請求の範囲第 64項記載の細 胞。
67. 破壊されている抗体遺伝子が抗体重鎖遺伝子および抗体軽鎖遺伝子である請 求の範囲第 66項記載の細胞。
68. 分化多能性を保持する細胞が、 胚性癌腫細胞、 胚性幹細胞、 胚性生殖細胞お よびそれらの変異体から成る群より選択されるものである請求の範囲第 64項記載 の細胞。
69. 少なく とも 2回の相同組換えにより、 請求の範囲第 64項記載の細胞を作製す る方法。
70. 薬剤耐性マーカ一遺伝子を用いる相同組換えにより分化多能性を保持する細 胞の内因性遺伝子の片側の対立遺伝子を破壊し、 該細胞を該薬剤の存在下で培養 し、 薬剤耐性となった株を選択し、 これらの株をスクリーニングすることにより 内因性遺伝子の両側の対立遺伝子が破壊された株を得る工程を含む請求の範囲第 69項記載の方法。
71. 薬剤耐性マーカ一遺伝子を用いる相同組換えにより分化多能性を保持する細 胞の内因性遺伝子の片側の対立遺伝子を破壊し、 さらに内因性遺伝子の他方の側 の対立遺伝子も薬剤耐性マーカー遺伝子を用いる相同組換えにより破壊する請求 の範囲第 69項記載の方法。
72. 内因性遺伝子の片側の対立遺伝子を破壊するための相同組換えに用いる薬剤 耐性マーカー遺伝子が、 他方の側の対立遺伝子を破壊するための相同組換えに用 いる薬剤耐性マーカー遺伝子と同じ種類である請求の範囲第 71項記載の方法。
73. 内因性遺伝子の片側の対立遺伝子を破壊するための相同組換えに用いる薬剤 耐性マーカー遺伝子が、 他方の側の対立遺伝子を破壊するための相同組換えに用 いる薬剤耐性マーカー遺伝子と異なる種類である請求の範囲第 71項記載の方法。
74. キメラ非ヒ ト動物を作製するための請求の範囲第 21項〜第 28項のいずれか一 項に記載の細胞の使用。
75. 単一または複数の外来遺伝子あるいはその断片ないしは単一または複数の外 来染色体あるいはその断片を移入させる受容細胞としての、 請求の範囲第 64項〜 第 68項のいずれか一項に記載の細胞の使用。
76. キメラ非ヒ ト動物を作製するための、 請求の範囲第 64項〜第 68項のいずれか 一項に記載の細胞の使用。
PCT/JP1998/000860 1997-02-28 1998-03-02 Cellules multipotentes comprenant des genes intrinseques dissocies WO1998037757A1 (fr)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE69835145T DE69835145T2 (de) 1997-02-28 1998-03-02 Transgene Mäuse die ein menschliches Antikörper exprimieren
JP53752598A JP4082740B2 (ja) 1997-02-28 1998-03-02 内因性遺伝子が破壊されている分化多能性保持細胞
AU61189/98A AU6118998A (en) 1997-02-28 1998-03-02 Pluripotent cells having disrupted intrinsic genes
EP98905731A EP0972445B1 (en) 1997-02-28 1998-03-02 Chimeric mice that express a human antibody

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP9/62309 1997-02-28
JP6230997 1997-02-28

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO1998037757A1 true WO1998037757A1 (fr) 1998-09-03

Family

ID=13196415

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP1998/000860 WO1998037757A1 (fr) 1997-02-28 1998-03-02 Cellules multipotentes comprenant des genes intrinseques dissocies

Country Status (7)

Country Link
EP (2) EP0972445B1 (ja)
JP (1) JP4082740B2 (ja)
AT (2) ATE332077T1 (ja)
AU (1) AU6118998A (ja)
DE (2) DE69835145T2 (ja)
DK (1) DK0972445T3 (ja)
WO (1) WO1998037757A1 (ja)

Cited By (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001011951A1 (en) * 1999-08-13 2001-02-22 Kirin Beer Kabushiki Kaisha Mouse having human cytochrome p450 transferred therein
WO2002088186A1 (en) * 2001-04-27 2002-11-07 Kirin Beer Kabushiki Kaisha Anti-cd40 monoclonal antibody
JP2003508029A (ja) * 1999-07-29 2003-03-04 メダレックス インク 前立腺特異性膜抗原に対するヒトモノクローナル抗体
WO2003037081A1 (fr) * 2001-10-30 2003-05-08 Tokyo Metropolitan Organization For Medical Research Animal transgenique a gene hcv
JP2004512005A (ja) * 1999-08-24 2004-04-22 メダレックス，　インコーポレイテッド ヒトｃｔｌａ−４抗体およびその使用
EP1632571A1 (en) 2001-05-11 2006-03-08 Kirin Beer Kabushiki Kaisha Human artificial chromosome containing human antibody Lambda light chain and non-human animal containing the human artificial chromosome capable of genetic transmission
US7452535B2 (en) 2002-04-12 2008-11-18 Medarex, Inc. Methods of treatment using CTLA-4 antibodies
US7537763B2 (en) 2000-04-28 2009-05-26 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Anti-CD40 monoclonal antibody
US7585961B2 (en) 2001-08-23 2009-09-08 Genmab A/S Nucleic acid encoding human antibodies specific for interleukin 15 (IL-15)
JP2009256354A (ja) * 2001-08-23 2009-11-05 Genmab As インターロイキン１５（ｉｌ−１５）に特異的なヒト抗体
JP2011500048A (ja) * 2007-10-19 2011-01-06 アイティーアイ・スコットランド・リミテッド Ｐ４５０遺伝子クラスターに関するノックアウトマウス
WO2011062207A1 (ja) 2009-11-17 2011-05-26 協和発酵キリン株式会社 ヒト人工染色体ベクター
WO2013042426A1 (ja) 2011-09-21 2013-03-28 富士レビオ株式会社 親和性複合体に対する抗体
US9062111B2 (en) 2005-12-07 2015-06-23 Medarex, L.L.C. CTLA-4 antibody dosage escalation regimens
JP2016514454A (ja) * 2013-03-15 2016-05-23 マックスサイト インコーポレーティッド 安定なトランスフェクトされた細胞を生成するための方法および組成物
WO2018079857A1 (ja) 2016-10-31 2018-05-03 国立大学法人鳥取大学 ヒト抗体産生非ヒト動物及びそれを用いたヒト抗体作製法
WO2018178593A1 (fr) 2017-03-31 2018-10-04 Laboratoire Francais Du Fractionnement Et Des Biotechnologies Composition d'immunoglobulines utiles pour traiter des infections virales
JP2019506897A (ja) * 2016-01-19 2019-03-14 セルジーン コーポレイション ヒトのセレブロンを発現するトランスジェニックマウス
WO2019177163A1 (ja) 2018-03-16 2019-09-19 国立大学法人鳥取大学 マウス人工染色体ベクター及びその使用
US11608511B2 (en) 2015-04-13 2023-03-21 Maxcyte, Inc. Methods for modifying genomic DNA

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7063845B2 (en) 2000-04-28 2006-06-20 Gemini Science, Inc. Human anti-CD40 antibodies
ES2405944T3 (es) 2000-11-30 2013-06-04 Medarex, Inc. Ácidos nucleicos que codifican las secuencias de inmunoglobulina humana reorganizadas a partir de ratones transcromoscómicos transgénicos zadas
EP2454939A1 (en) 2010-11-18 2012-05-23 Bayer CropScience AG Post-harvest treatment
EP4389895A1 (en) 2021-11-16 2024-06-26 National University Corporation Tottori University Mammalian artificial chromosomal vector having human immunoglobulin heavy chain locus containing modified d region, and cell or non-human animal holding said vector

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1989005308A1 (fr) * 1987-12-03 1989-06-15 Gesellschaft Für Biotechnologische Forschung Mbh ( Anticorps monoclonaux et lignees de cellules d'hybridomes utilisees pour les obtenir
JPH05328878A (ja) * 1992-05-26 1993-12-14 Rikagaku Kenkyusho 胚性未分化細胞
JPH0767629A (ja) * 1992-09-29 1995-03-14 Deinaade:Kk 標的遺伝子置換法

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2006011A1 (en) * 1988-12-21 1990-06-21 Cecilia Lo Transgenic organisms and cells and methods of producing transgenic organisms and cells
US5449604A (en) * 1992-10-21 1995-09-12 University Of Washington Chromosome 14 and familial Alzheimers disease genetic markers and assays
WO1994023049A2 (en) * 1993-04-02 1994-10-13 The Johns Hopkins University The introduction and expression of large genomic sequences in transgenic animals
CN101333516A (zh) * 1995-08-29 2008-12-31 麒麟医药株式会社 嵌合体动物及其制备方法
AU7057398A (en) * 1997-04-11 1998-11-11 Imperial College Of Science, Technology And Medicine Chromosome transfer (xmmct) to es cells, induced during the exposure of microcells to radiation

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1989005308A1 (fr) * 1987-12-03 1989-06-15 Gesellschaft Für Biotechnologische Forschung Mbh ( Anticorps monoclonaux et lignees de cellules d'hybridomes utilisees pour les obtenir
JPH05328878A (ja) * 1992-05-26 1993-12-14 Rikagaku Kenkyusho 胚性未分化細胞
JPH0767629A (ja) * 1992-09-29 1995-03-14 Deinaade:Kk 標的遺伝子置換法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BENHAM F. J., QUINTERO M. A., GOODFELLOW P. N.: "HUMAN-MOUSE HYBRIDS WITH AN EMBRYONAL CARCINOMA PHENOTYPE CONTINUE TO TRANSCRIBE HLA-A,B,C.", EMBO JOURNAL., OXFORD UNIVERSITY PRESS, SURREY., GB, vol. 02., no. 11., 1 January 1983 (1983-01-01), GB, pages 1963 - 1968., XP002916462, ISSN: 0261-4189 *
FOURNIER R. E. K., RUDDLE F. H.: "MICROCELL-MEDIATED TRANSFER OF MURINE CHROMOSOMES INTO MOUSE, CHINESE HAMSTER, AND HUMAN SOMATIC CELLS.", PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF THE USA, NEW YORK, NY, US, vol. 74., no. 01., 1 January 1977 (1977-01-01), US, pages 319 - 323., XP002916463 *
TOMIZUKA K., ET AL.: "FUNCTIONAL EXPRESSION AND GERMLINE TRANSMISSION OF A HUMAN CHROMOSOME FRAGMENT IN CHIMAERIC MICE.", NATURE GENETICS., NATURE PUBLISHING GROUP, NEW YORK, US, vol. 16., no. 02., 1 January 1997 (1997-01-01), NEW YORK, US, pages 133 - 143., XP002916461, ISSN: 1061-4036, DOI: 10.1038/ng0697-133 *

Cited By (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003508029A (ja) * 1999-07-29 2003-03-04 メダレックス インク 前立腺特異性膜抗原に対するヒトモノクローナル抗体
WO2001011951A1 (en) * 1999-08-13 2001-02-22 Kirin Beer Kabushiki Kaisha Mouse having human cytochrome p450 transferred therein
JP2004512005A (ja) * 1999-08-24 2004-04-22 メダレックス，　インコーポレイテッド ヒトｃｔｌａ−４抗体およびその使用
US6984720B1 (en) 1999-08-24 2006-01-10 Medarex, Inc. Human CTLA-4 antibodies
JP2006151993A (ja) * 1999-08-24 2006-06-15 Medarex Inc ヒトｃｔｌａ−４抗体およびその使用
JP2009213478A (ja) * 1999-08-24 2009-09-24 Medarex Inc ヒトｃｔｌａ−４抗体およびその使用
US7537763B2 (en) 2000-04-28 2009-05-26 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Anti-CD40 monoclonal antibody
WO2002088186A1 (en) * 2001-04-27 2002-11-07 Kirin Beer Kabushiki Kaisha Anti-cd40 monoclonal antibody
CN100430419C (zh) * 2001-04-27 2008-11-05 麒麟医药株式会社 抗cd40单克隆抗体
EP1632571A1 (en) 2001-05-11 2006-03-08 Kirin Beer Kabushiki Kaisha Human artificial chromosome containing human antibody Lambda light chain and non-human animal containing the human artificial chromosome capable of genetic transmission
EP1970448A1 (en) 2001-05-11 2008-09-17 Kirin Pharma Kabushiki Kaisha Human artificial chromosome containting human antibody lambda light chain and non-human animal containting the human artificial chromosome capable of genetic transmission
US7597892B2 (en) 2001-08-23 2009-10-06 Genmab A/S Method for treating psoriasis by administering human antibodies specific for Interleukin 15 (IL-15)
JP2009256354A (ja) * 2001-08-23 2009-11-05 Genmab As インターロイキン１５（ｉｌ−１５）に特異的なヒト抗体
US7585961B2 (en) 2001-08-23 2009-09-08 Genmab A/S Nucleic acid encoding human antibodies specific for interleukin 15 (IL-15)
WO2003037081A1 (fr) * 2001-10-30 2003-05-08 Tokyo Metropolitan Organization For Medical Research Animal transgenique a gene hcv
US7452535B2 (en) 2002-04-12 2008-11-18 Medarex, Inc. Methods of treatment using CTLA-4 antibodies
US9062111B2 (en) 2005-12-07 2015-06-23 Medarex, L.L.C. CTLA-4 antibody dosage escalation regimens
JP2011500048A (ja) * 2007-10-19 2011-01-06 アイティーアイ・スコットランド・リミテッド Ｐ４５０遺伝子クラスターに関するノックアウトマウス
US9775332B2 (en) 2009-11-17 2017-10-03 Sab, Llc Human artificial chromosome vector
WO2011062207A1 (ja) 2009-11-17 2011-05-26 協和発酵キリン株式会社 ヒト人工染色体ベクター
US9315824B2 (en) 2009-11-17 2016-04-19 Sab, Llc Human artificial chromosome vector
WO2011062206A1 (ja) 2009-11-17 2011-05-26 協和発酵キリン株式会社 ヒト人工染色体ベクター
WO2013042426A1 (ja) 2011-09-21 2013-03-28 富士レビオ株式会社 親和性複合体に対する抗体
US10316335B2 (en) 2013-03-15 2019-06-11 Maxcyte, Inc. Methods and compositions for generating stable transfected cells
JP2016514454A (ja) * 2013-03-15 2016-05-23 マックスサイト インコーポレーティッド 安定なトランスフェクトされた細胞を生成するための方法および組成物
US11608511B2 (en) 2015-04-13 2023-03-21 Maxcyte, Inc. Methods for modifying genomic DNA
JP2019506897A (ja) * 2016-01-19 2019-03-14 セルジーン コーポレイション ヒトのセレブロンを発現するトランスジェニックマウス
US11963520B2 (en) 2016-01-19 2024-04-23 Celgene Corporation Transgenic mouse expressing human cereblon
WO2018079857A1 (ja) 2016-10-31 2018-05-03 国立大学法人鳥取大学 ヒト抗体産生非ヒト動物及びそれを用いたヒト抗体作製法
WO2018178593A1 (fr) 2017-03-31 2018-10-04 Laboratoire Francais Du Fractionnement Et Des Biotechnologies Composition d'immunoglobulines utiles pour traiter des infections virales
WO2019177163A1 (ja) 2018-03-16 2019-09-19 国立大学法人鳥取大学 マウス人工染色体ベクター及びその使用

Also Published As

Publication number Publication date
EP0972445A4 (en) 2000-12-27
DK0972445T3 (da) 2006-10-23
DE69835145T2 (de) 2007-06-14
EP1707051B1 (en) 2010-01-13
DE69841452D1 (de) 2010-03-04
AU6118998A (en) 1998-09-18
ATE332077T1 (de) 2006-07-15
ATE455179T1 (de) 2010-01-15
EP1707051A3 (en) 2006-12-27
JP4082740B2 (ja) 2008-04-30
EP0972445B1 (en) 2006-07-05
EP1707051A2 (en) 2006-10-04
EP0972445A1 (en) 2000-01-19
DE69835145D1 (de) 2006-08-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP4318736B2 (ja) ヒト抗体遺伝子を発現する非ヒト動物とその利用
US8110671B2 (en) Isolated human chromosome 14 fragment encoding immunoglobulin genes
JP3732407B2 (ja) 染色体の改変方法
WO1998037757A1 (fr) Cellules multipotentes comprenant des genes intrinseques dissocies
KR100882029B1 (ko) 클로닝된 트랜스제닉 유제류에서 이종 (사람)면역글로블린의 발현
US20040250307A1 (en) Transgenic avian species for making human and chimeric antibodies
JP2005504507A5 (ja)
AU2001297523A1 (en) Expression of xenogenous (human) immunoglobulins in cloned, transgenic ungulates
US7074983B2 (en) Transgenic bovine comprising human immunoglobulin loci and producing human immunoglobulin
JP3030092B2 (ja) キメラ動物およびその作製法
JP2007312792A (ja) キメラ動物およびその作製法
TWI223585B (en) Chimeric animal and method for producing the same
JPH11313576A (ja) キメラ動物およびその作製法
JP2001231403A (ja) 改変された外来染色体あるいはその断片を保持する非ヒト動物
JPH1033087A (ja) グルタミン酸トランスポーター遺伝子機能欠損非ヒト動物

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BY CA CH CN CU CZ DE DK EE ES FI GB GE GH GM GW HU ID IL IS JP KE KG KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MD MG MK MN MW MX NO NZ PL PT RO RU SD SE SG SI SK SL TJ TM TR TT UA UG US UZ VN YU ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): GH GM KE LS MW SD SZ UG ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE CH DE DK ES FI FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE BF BJ CF CG CI CM GA GN ML MR NE SN TD TG

DFPE Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed before 20040101)
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 1998905731

Country of ref document: EP

REG Reference to national code

Ref country code: DE

Ref legal event code: 8642

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 1998905731

Country of ref document: EP

WWG Wipo information: grant in national office

Ref document number: 1998905731

Country of ref document: EP