WO2018178593A1 - Composition d'immunoglobulines utiles pour traiter des infections virales - Google Patents

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WO2018178593A1
WO2018178593A1 PCT/FR2018/050794 FR2018050794W WO2018178593A1 WO 2018178593 A1 WO2018178593 A1 WO 2018178593A1 FR 2018050794 W FR2018050794 W FR 2018050794W WO 2018178593 A1 WO2018178593 A1 WO 2018178593A1
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immunoglobulin
human
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Abdessatar Chtourou
Gérald PERRET
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Laboratoire Francais Du Fractionnement Et Des Biotechnologies
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Definitions

  • composition of immunoglobulins useful for treating viral infections Composition of immunoglobulins useful for treating viral infections
  • the present invention relates to multivalent compositions hyper-enriched in at least two populations of immunoglobulins, each population consisting of immunoglobulins capable of recognizing, and advantageously neutralizing, a distinct virus.
  • the monoclonal antibody approach is limited by this risk.
  • the possibility of combining two or three monoclonal antibodies in order to increase the activity or to widen the tropism of the preparation has been explored but to date generates technological and regulatory challenges for a limited effect.
  • the experimental drug ZMapp comprising three monoclonal antibodies
  • hyper-immune polyclonal immunoglobulins obtained from hyperimmune human plasmas or from animal plasmas following the immunization of animals with a viral antigen are advantageous from the point of view of the risks of mutation but their action remains limited to one. only pathogen.
  • the titres of antibodies actually neutralizing remain moderate and require significant administration volumes. This administration of large amounts of foreign antibodies is not free of side effects for the patient, particularly when multi-therapy is desired.
  • the invention provides a multi-therapy that allows the treatment or prevention of infection by more than one virus (whether more than one viral strain or more than one viral species), by administering a composition antibodies that bind to each strain or species.
  • the invention more particularly provides a hyper-enriched immunoglobulin composition in at least two immunoglobulin populations, each population consisting of immunoglobulins directed specifically against a distinct virus.
  • Such a composition is useful as a pharmaceutical composition for use in the treatment of a viral infection, more specifically an infection by the viruses against which the immunoglobulins are directed.
  • the immunoglobulins used are directed preferentially against a surface protein of the targeted virus, which plays a role in the mechanisms of infection, especially during the recognition, the binding of the viral particle to its host cell, the fusion of the virus particle to its host cell or propagation of the host cell host cell virus.
  • the invention provides a composition in which one of said populations consists of immunoglobulins directed specifically against a virus selected from the influenzas virus, metapneumovirus (MPV), respiratory syncytial virus (RSV), parainfluenzas viruses. Zika virus, dengue virus, yellow fever virus, BK virus (BKV), B19 virus, PEstein-Barr virus (EBV) or cytomegalo virus (CMV).
  • a virus selected from the influenzas virus, metapneumovirus (MPV), respiratory syncytial virus (RSV), parainfluenzas viruses. Zika virus, dengue virus, yellow fever virus, BK virus (BKV), B19 virus, PEstein-Barr virus (EBV) or cytomegalo virus (CMV).
  • the immunoglobulin composition does not comprise more than 10, not more than 7, not more than 5, not more than 3 different infectious specificities.
  • the immunoglobulin composition according to the invention comprises three or four populations of immunoglobulins, each population consisting of immunoglobulins directed specifically against a distinct virus.
  • a first of said populations consists of immunoglobulins directed specifically against the human RSV virus
  • a second of said populations consists of immunoglobulins specifically directed against the human MPV virus
  • a third of said populations consists of directed immunoglobulins. specifically against human parainfluenza virus type 3.
  • Such a composition is particularly useful for the treatment of respiratory disorders caused by infection with at least one of these three viruses.
  • a first of said populations consists of immunoglobulins specifically directed against the Zika virus
  • a second of said populations consists of immunoglobulins directed specifically against the dengue virus
  • a third of said populations consists of directed immunoglobulins. specifically against the yellow fever virus.
  • Such a composition is particularly useful for the treatment of at least one symptom, such as fever or muscle or joint pain, caused by infection with at least one of these three viruses.
  • a composition is useful for the prophylactic treatment, in particular in subjects at risk and / or in the territories at risk.
  • a first of said populations consists of immunoglobulins directed specifically against the human RSV virus
  • a second of said populations consists of immunoglobulins directed specifically against the human BKV virus
  • a third of said populations consists of directed immunoglobulins. specifically against the CMV virus.
  • composition is particularly useful for the treatment of an infection by at least one of these three viruses, in particular for the treatment, especially by prophylaxis, of the major infectious causes of transplant rejection.
  • composition of hyper-enriched immunoglobulins Composition of hyper-enriched immunoglobulins
  • the immunoglobulin composition according to the invention comprises different populations of immunoglobulins.
  • immunoglobulin population is meant a group of antibodies that bind to the same viral immunogen (this is called a monovalent antibody population), or to several different immunogens of the same virus (we can then talk about polyvalent population of antibodies). Essentially, it is polyclonal antibodies.
  • immunoglobulins and “antibodies” may be interchangeable.
  • the immunoglobulin composition according to the invention essentially contains polyvalent human immunoglobulins which may be immunoglobulins A (IgA), immunoglobulin E (IgE), immunoglobulin M (IgM) or immunoglobulin G (IgG).
  • the immunoglobulin composition essentially contains IgG and / or IgM and / or IgA.
  • the immunoglobulin composition according to the invention essentially comprises IgG, regardless of their subclass (IgG1, IgG2, IgG3 and IgG4).
  • the composition may be adapted by those skilled in the art depending on the chosen route of administration and / or the desired mechanism of action.
  • the composition preferably contains predominantly IgG and / or IgM, and is advantageously depleted in IgA.
  • the composition in other routes of administration such as the local route, the composition preferably contains mainly IgG and / or IgA, IgA allowing the recruitment of cells such as mucosal cells with alfa receptors.
  • hyper-enriched composition in at least two populations of immunoglobulins is advantageously meant an immunoglobulin composition, comprising at least 10%, preferably at least 20%, at least 30%>, at least 40%>, by weight of each of said populations.
  • the composition comprises an equal proportion of each population of immunoglobulins.
  • hyper-enriched immunoglobulin compositions are a subset of hyperimmune immunoglobulin compositions.
  • hyper-enriched immunoglobulin compositions are obtained from hyperimmune immunoglobulin compositions.
  • the hyperimmune immunoglobulin compositions are similar to intravenous immunoglobulins (IVIG) except that they are derived from plasma of donors with high immunoglobulin titres directed against a specific antigen.
  • hyperimmune immunoglobulin compositions contain an immunoglobulin titer binding the pathogen at least four times higher than the average titre observed in a normal polyvalent immunoglobulin from the same species (in particular human, rabbit, goat, bovine or equine). Nevertheless, they comprise less than 10% by weight of immunoglobulin populations specific for the same antigen.
  • Viral viruses and immunogens contain an immunoglobulin titer binding the pathogen at least four times higher than the average titre observed in a normal polyvalent immunoglobulin from the same species (in particular human, rabbit, goat, bovine or equine). Nevertheless, they comprise less than 10% by weight of immunoglobulin populations specific for the same antigen.
  • Each population consists of immunoglobulins specifically directed against a distinct virus. Immunoglobulin populations bind to different viral immunogens.
  • the viral immunogens come from different viral strains (within the same species), or from different viral species.
  • the term "specific" means that the immunoglobulins recognize and bind to an immunogen of said virus, substantially without cross-reacting with another virus (or possibly another strain).
  • composition may further comprise, and preferably be enriched, at least one other population consisting of immunoglobulins specifically directed against an antigen different from the same virus.
  • viruses capable of infecting a subject, human or non-human, preferably a mammal, are included.
  • viruses for example the viruses of the family Flaviviridiae, including for example the Japanese encephalitis virus, the West Nile virus, the dengue virus, the yellow fever virus, the Zika virus, the virus hepatitis. Mention may also be made of viruses which cause a respiratory disorder, in particular bronchiolitis or pneumonia, in particular parainfluenza virus, synvemic virus (RSV), adenovirus, rhinovirus, metapneumovirus, enterovirus, and coronavirus.
  • RSV synvemic virus
  • the invention provides a composition in which one of said populations consists of immunoglobulins directed specifically against a virus selected from parainfluenza virus, in particular parainfluenza virus type 3, metapneumovirus (MPV), Zika virus. , the dengue virus, the yellow fever virus, or the cytomegalovirus (CMV).
  • the composition according to the invention is enriched in a population of immunoglobulins directed specifically against the RSV virus.
  • the invention provides a composition in which one of said populations consists of immunoglobulins directed specifically against a virus selected from the parainfluenza virus, including parainfluenza virus type 3, metapneumovirus (MPV), the virus.
  • the composition Zika, the dengue virus, the yellow fever virus, or cytomegalovirus (CMV), said composition being further enriched in a population of immunoglobulins directed specifically against the RSV virus.
  • the immunoglobulin composition on the contrary, is not enriched in a population of immunoglobulins directed specifically against RSV virus.
  • the composition does not substantially comprise, or comprises less than 5%, immunoglobulins recognizing the RSV virus.
  • the immunoglobulins directed specifically against the targeted viruses can bind to any of the proteins of the virus, preferably a surface protein, playing a role in the mechanisms of infection, especially during the recognition, binding of the virus particle to its host cell, from the fusion of the viral particle to its host cell and from the propagation of the host cell host cell virus.
  • RSV and metapneumovirus belonging to the paramyxoviridae family mention may be made in particular of SH protein, M protein, G protein or F protein.
  • HN hemagglutinine-neuraminidase
  • the antigens B In the case of the CMV virus, mention may be made of the antigens B, gH, gL, gO, gM, gN UL128, UL130 and UL131.
  • influenza virus of the family of orthomyxoviridae
  • HA hemagglutinin
  • NA neuraminidase
  • compositions of the invention are possible. The main methods are described below.
  • the virus of interest is a human virus against which an adult human is generally immunized (by prior contact with the virus, often asymptomatic) and this immunity is considered protective
  • a method for preparing immunoglobulins from plasma pools preferably human plasma. This is for example the case of RSV or CMV.
  • Such a method involves concentration steps of the plasma preparations, typically by a factor of 100 to 1000.
  • the human being is generally not immunized (as for example when the targeted virus is a flavivirus), it will be possible for example to produce the antibodies in a transgenic animal (non-human).
  • preparations of immunoglobulins derived from human plasma or from blood plasma fractions are subjected to affinity chromatography using a viral protein as an affinity ligand, to obtain a preparation of immunoglobulin hyper-enriched immunoglobulins. capable of recognizing, and advantageously of neutralizing, said virus.
  • the hyper-enriched immunoglobulin immunoglobulin preparations of interest are then combined to form the composition according to the invention.
  • immunoglobulin preparations derived from human plasma or blood plasma fractions are subjected to one or more affinity chromatography (s), sequentially or in a mixed-bed step, using several distinct viral proteins as ligands. affinity, to obtain a preparation of immunoglobulin hyper-enriched immunoglobulins capable of recognizing, and advantageously to neutralize, said viruses.
  • affinity chromatography supports on which are grafted one or more viral proteins, or antigenic fragments thereof.
  • viral proteins useful as ligands there may be mentioned, for example, the proteins described above, or preferentially surface proteins, which play a role in the mechanisms of infection, especially during the recognition, of the binding of the viral particle. to its host cell, from the fusion of the virus particle to its host cell and from the propagation of the host cell host cell virus.
  • the chromatography uses a matrix comprising a support based on polymer particles, and is preferably in the form of a gel or a resin. These polymer particles are preferably of spherical or oblong shape, it may be in particular beads.
  • the polymer may be natural or non-natural, organic or inorganic, crosslinked or uncrosslinked.
  • the polymer is preferably an organic polymer, preferably crosslinked.
  • the polymer is cellulose, and the particles are preferably porous cellulose beads.
  • Other types of possible polymers include agarose, dextran, polyacrylates, polystyrene, polyacrylamide, polymethacrylamide, copolymers of styrene and divinylbenzene, or mixtures of these polymers.
  • the particles can provide a chromatography medium that can be used to fill a column, for example.
  • a viral protein or an antigenic fragment thereof, either directly or via a spacer, which covalently binds the ligand to the particles of the chromatographic medium.
  • the grafted support has several different ligands.
  • the support can then be grafted with several different proteins and / or several different antigenic fragments belonging to different viruses or viral strains, in order to obtain an immunoglobulin concentrate having different antigenic targets.
  • the specific ligands of each virus or viral strain may be in the form of a mixture of antigenic targets, consisting of several different proteins and / or several different antigenic fragments belonging to the same virus or viral strain.
  • a particle can carry several spacers.
  • the bond between the ligand and the spacer may be, for example, an amide bond.
  • the spacer typically comprises at least one C, O, N, or S atom.
  • the ligands are chemically immobilized by covalent bonds between the particles and the spacer, and between the spacer and the ligand. This immobilization can be carried out in a conventional manner by those skilled in the art.
  • the particle carries an -NH-R1-COOH arm.
  • it is alpha-aminocaproic acid (where R1 is a pentyl group).
  • the particle can be activated using bifunctional reagents such as epichlorohydrin, epibromohydrin, dibromo and dichloropropanol, dibromobutane, ethylene glycol diglycidyl ether, butanediol diglycidyl ether, divinyl sulfone, allyl glycidyl ether, and the like. allyl bromide.
  • the bifunctional reagent is capable of reacting with both the particles and the -NH-R1-COOH arm. Allyl hetero functional compounds, such as allyl bromide, are preferred bifunctional reagents and provide an activated matrix.
  • the gel matrix is prepared by conventional addition of a buffer to the ligand-carrying polymer particles, as known to those skilled in the art, so as to obtain a gel matrix suitable for chromatography. affinity.
  • the matrix as defined herein is useful in affinity chromatography binding immunoglobulins.
  • the matrix is particularly useful in mixed bed affinity chromatography.
  • Such a matrix advantageously comprises several different antigens specific for the same virus and is therefore capable of binding immunoglobulins directed against several different epitopes of the same virus.
  • Such a matrix may also advantageously comprise several different antigens from different viruses, and is therefore capable of binding both immunoglobulins specific for a first virus and immunoglobulins directed against another selected virus.
  • the anti-virus immunoglobulins present in the plasma or the plasma fraction bind to the matrix, and the adsorbed product is eluted and recovered, enriched with anti-virus immunoglobulins.
  • the conditions of implementation of the affinity chromatography according to the invention are adapted by those skilled in the art to guarantee the reuse of the matrix according to the invention while maintaining non-degrading elution conditions for the product of interest.
  • the plasma or plasma fraction at the start of the enrichment process consists of plasma from blood plasma or pools of blood plasma from mammalian subjects (human or non-human) or a fraction of that plasma, being any part or part of the plasma, having been subjected to one or more purification steps.
  • the starting plasma or plasma fraction subjected to the enrichment process of the invention advantageously consists of plasma from pools of blood plasmas of normal human subjects or a fraction thereof. plasma, or any part or subpart of the plasma, having been subjected to one or more purification steps.
  • the plasma fractions that can be used include the cryoprecipitated plasma supernatant, the plasma cryoprecipitate (resuspended), the fractions I to V obtained by ethanolic fractionation (according to the Cohn or Kistler & Nitschmann method), the supernatant and the precipitate obtained. after precipitation with caprylic acid and / or caprylate, the chromatographic eluates and the non-adsorbed fractions of the chromatography columns, and the filtrates.
  • the plasma or the initial plasma fraction subjected to the enrichment process come from blood plasma pools of subjects normal human, without prior selection of donors, in particular, without selection of donors on the basis of their possible plasma anti-virus immunoglobulin levels of interest.
  • the plasma or the starting plasma fraction subjected to the enrichment process thus advantageously comprises an anti-virus immunoglobulin level similar to or equal to the anti-virus immunoglobulin level of a plasma derived from the pool of at least 1000 human donors. Normal randomly chosen.
  • the plasma or the starting plasma fraction subjected to the enrichment process of the invention is advantageously not enriched with anti-virus immunoglobulins of interest compared to the anti-virus immunoglobulin level of a plasma from the pool of at least 1000 donors chosen randomly.
  • the plasma or the initial plasma fraction subjected to the enrichment process contains polyvalent human immunoglobulins which may be immunoglobulin A (IgA), immunoglobulin E (IgE), immunoglobulin M (IgM) or immunoglobulin G (IgG).
  • polyvalent human immunoglobulins which may be immunoglobulin A (IgA), immunoglobulin E (IgE), immunoglobulin M (IgM) or immunoglobulin G (IgG).
  • the plasma or the initial plasma fraction essentially contains IgG irrespective of their subclass (IgG1, IgG2, IgG3 and IgG4) and / or IgM.
  • the method preferably uses as a starting sample a plasma or a plasma fraction originating from blood plasma pools of normal human subjects, without prior selection of the donors, in particular, without selection of the donors on the basis of their possible plasma immunoglobulin levels. virus.
  • the method may typically be an independent method, dedicated to the purification of anti-virus immunoglobulins only, and is then advantageously performed from plasma or a plasma fraction.
  • the method advantageously comprises the following steps: providing a plasma sample or a plasma fraction,
  • the method may further comprise, after the step of capture on anti-virus affinity chromatography, a dedicated depletion step of certain immunoglobulins, in particular immunoglobulins E (IgE) and / or immunoglobulins M
  • the method advantageously further comprises a subsequent step of subjecting the hyper-enriched immunoglobulin anti-virus immunoglobulin composition to at least one inactivation and / or viral elimination step.
  • the process for obtaining the anti-virus immunoglobulins is coupled to a process for obtaining polyvalent immunoglobulin G in order to obtain, from the same starting plasma pool, both a polyvalent G immunoglobulin concentrate and a hyper-enriched anti-virus immunoglobulin concentrate.
  • the process of the invention then typically comprises a preliminary step of obtaining the plasma fraction, by ethanolic fractionation and / or caprylic fractionation and / or chromatographic separation.
  • the method according to the invention advantageously comprises the following steps:
  • chromatographic separation is meant any chromatography step, whether it is ion exchange chromatography (anion exchange and / or cation exchange), mixed mode, or affinity chromatography (using ligands chemical type, antibodies, antibody fragments, aptamers).
  • chromatographic separation is meant both a single chromatography column, or a set of chromatography columns, using or not the same type of support, in series (multicolumn mode for example) or in parallel.
  • the plasma fraction can be obtained by an ethanol fractionation originally developed by Cohn et al (Cohn et al, 1946. J. Am Chem Soc 68, 459, Oncley et al, 1949, J. Am. Soc 71, 541), or by chromatographic separation, as described, for example, in EP 0 703 922 and WO 99/64462, or by caprylic fractionation as described by Steinbuch et al 1969, Arch Biochem. Biophys. 134 (2): 279-84).
  • the methods developed by the Applicant in the patent applications WO 94/29334 and WO 02/092632, and particularly that described in WO, are particularly preferred. 02/092632.
  • a blood plasma, or an Ig-enriched blood plasma fraction is subjected to caprylic fractionation (prepurification by precipitation of non-immunoglobulin contaminants), and a single chromatography on an anion exchange resin carrier carried out at pH. alkaline.
  • Viral inactivation treatment can be carried out, preferably carried out by solvent-detergent, as described by Horowitz in US Pat. No. 4,764,369, optionally supplemented by a step of viral elimination by nanofiltration on a 75N, 35N pore size filter. , 20N and / or 15N.
  • the Ig fraction thus harvested is already concentrated, but can then undergo additional concentration steps by ultrafiltration, and sterilizing filtration.
  • This concentrate is then subjected to an immunoaffinity chromatographic step on the matrix as described above.
  • the method may furthermore comprise, preferably after the step of capture on anti-virus affinity chromatography, a dedicated stage of depletion of certain immunoglobulins, in particular immunoglobulins A (IgA), and / or immunoglobulins. E (IgE) and / or immunoglobulin M (IgM), which may be involved in mechanisms of deleterious side effects in patients.
  • the immunoglobulins to be depleted are advantageously selected in particular according to the route of administration chosen for the anti-virus immunoglobulin hyper-enriched immunoglobulin concentrate and / or according to the content of the plasma sample or the starting plasma fraction.
  • the method may further comprise the subsequent steps of adding one or more pharmaceutically acceptable stabilizers; and optionally freeze or lyophilize the concentrate thus obtained.
  • non-human mammals are immunized with at least two viral immunogens to produce antibody populations that bind to the viral immunogens.
  • hyper-enriched immunoglobulins are obtained from a library of recombinant polyvalent immunoglobulins generated via the sequencing of the lymphocyte repertoire of at least 50 donors.
  • the principle of this technology is described for example in US Patent 9,412,547.
  • transgenic non-human mammals are immunized with at least two viral immunogens to produce antibody populations that bind to viral immunogens.
  • transgenic animal or “mammal transgenic "is used interchangeably herein to refer to a non-human mammal that has been genetically engineered to encode an exogenous nucleic acid sequence in its genome.
  • the transgenic mammal has been genetically engineered to produce xenogeneic antibodies in response to an immunogen.
  • the transgenic mammal has been genetically engineered to produce human antibodies in response to an immunogen.
  • the non-human mammal is an ungulate.
  • the non-human mammal is a cow, goat, sheep, bison, camel, pig, rabbit, buffalo, horse, rat, mouse or llama.
  • the transgenic non-human mammals have been modified to encode a human artificial chromosome in its genome; these mammals are then called transchromosomal.
  • transchromosomal nonhuman mammals have been engineered to encode a human artificial chromosome into the genome of a particular cell type (e.g., B cells). See, for example, Macnab et al. Gene Therapy (2009) 16: 1180-1188; Kazuki et al. Mol. Ther. (201 1) 19 (9): 1591-1601, incorporated herein by reference.
  • transgenic or transchromosomal animals described herein may be genetically engineered to contain all or part of the exogenous germ line immunoglobulin gene locus such that immunization of transgenic or transchromosomal animals leads to the production of exogenous antibodies (eg example, humans) against the immunogen of interest.
  • the gene in question typically comprises one or more nucleic acids encoding all or part of a xenogeneic antibody gene that is capable of rearrangement and expressing one or more xenogeneic antibodies in B cells.
  • a genetic locus capable of "rearrangement” refers to an antibody locus that has not undergone V (D) J recombination but is capable of rearrangement and expression of exogenous (eg, human) antibodies in response to immunization with an immunogen.
  • the animals are modified to contain all nucleic acid segments encoding a V gene segment of an antibody light chain separated from all nucleic acid segments encoding a J gene segment. by one or more nucleotides.
  • all nucleic acid segments encoding a V gene segment of an antibody heavy chain are separated from all nucleic acid segments encoding a D gene segment by one or more nucleotides.
  • / or all nucleic acid segments encoding a D segment of a heavy chain antibodies are separated from all nucleic acid segments encoding a J gene segment by one or more nucleotides.
  • the immunoglobulin gene locus comprises one or more human immunoglobulin heavy chain loci.
  • human immunoglobulin heavy chain loci comprise a heavy chain V-segment, a heavy-chain D-segment and / or a heavy-chain J-segment. In some embodiments, the human immunoglobulin heavy chain loci comprise at least one heavy chain constant region segment. In some embodiments, the human immunoglobulin heavy chain loci comprise a heavy chain V-segment, a heavy-chain D-segment and / or a heavy-chain J-segment and at least one heavy-chain constant region segment. In some embodiments, the immunoglobulin gene locus comprises one or more human immunoglobulin light chain loci.
  • human immunoglobulin light chain loci comprise a light chain VL segment and / or a light chain JL segment. In some embodiments, the human immunoglobulin light chain loci comprise at least one light chain constant region segment. In some embodiments, the human immunoglobulin light chain loci comprise a light chain VL segment, a light chain JL segment, and a light chain constant region segment.
  • the germline immunoglobulin gene locus is a human immunoglobulin gene locus. In some embodiments, the germ line immunoglobulin gene locus is at least 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99, or 100% identical to the corresponding region of a naturally occurring nucleic acid. from a human being.
  • the transgenic or preferably transchromosomal animals are genetically modified so that they produce reduced levels of endogenous antibodies (e.g., cattle) or do not produce endogenous antibodies (e.g., cattle).
  • the transgenic or preferably transchromosomal animals have a mutation that reduces or eliminates the expression of endogenous antibodies or a particular isotype of endogenous antibodies.
  • the mutation reduces or eliminates the expression of the functional IgM heavy chain.
  • the transgenic or preferably transchromosomal animals have a mutation that reduces or eliminates the expression of the functional antibody light chain.
  • the transgenic animal has a mutation that reduces or eliminates the expression of functional IgM heavy chain and Ig functional light chain.
  • Transchromosomal animals that can be used in the methods described herein as well as methods for producing such transchromosomal animals using artificial chromosomes are known in the art. See, for example, US Patents 7,074,983; US 7,652,192 and US 9,315,824.
  • Antibody populations that bind to any of the immunogens described herein may be combined in a composition provided that the populations are different (not identical).
  • the antibody populations are human antibodies, such as human antibodies that are transgenically produced in a non-human mammal, as described herein.
  • isolated antibody populations are prepared by immunizing a non-human (eg, bovine) mammal with at least two or three different viral immunogens. Populations can then be isolated from a sample (for example, a body fluid, such as blood, urine, milk) collected from the non-human mammal. In some embodiments, more than one transgenic non-human mammal is immunized with a viral immunogen. In some embodiments, at least two or three transgenic non-human mammals are each immunized with a different viral immunogen, so that each transgenic non-human mammal produces an antibody population that binds to a viral immunogen. The populations can then be isolated from samples collected from each of the non-human mammals and then combined to form a combination composition.
  • a sample for example, a body fluid, such as blood, urine, milk
  • more than one transgenic non-human mammal is immunized with a viral immunogen.
  • at least two or three transgenic non-human mammals are each immunized with a different viral immuno
  • the isolation of immunoglobulin populations directed specifically against the viruses of interest can be achieved by using immunoaffinity chromatography, as described above.
  • a matrix is used for this purpose on which at least one viral protein, or an antigenic fragment thereof, is fixed.
  • the invention also provides a pharmaceutical composition comprising an immunoglobulin composition as described above, in association with at least one pharmaceutically acceptable excipient.
  • the pharmaceutical composition may be administered by any route of administration, for example: ocular, nasal, intra-auricular, oral, sublingual, pulmonary, intraperitoneal, intravenous, percutaneous, subcutaneous , intramuscular, transmucosal, vaginal, rectal.
  • the composition is generally concentrated in that it comprises immunoglobulins at concentrations of between 50 and 100 g / l.
  • These concentrates are intended for clinical use and may in particular be injected intravenously. For this purpose, they must be safe and, where appropriate, contain excipients, such as stabilizers, compatible with this clinical use.
  • the invention provides "multi-therapy” by treating or preventing infection with more than one virus by providing immunoglobulin populations that bind to different viral immunogens.
  • the methods of treatment involve the administration within the same composition of at least two or three antibody populations that bind to different viral immunogens, which can be used to treat or prevent an infection. infection by at least two or three, viruses or viral strains.
  • the subject or patient is preferably a human, but it can also be an animal, preferably a mammal, for example a pet (dog or cat for example), a horse, a cow, a sheep, etc. It may still be an animal that represents a host for the virus, for example a monkey.
  • the term “treatment” means relieving or ameliorating at least one symptom associated with an infection, or slowing or reversing the progression of the infection.
  • the term “treatment” may mean eliminating or reducing the viral load, or inhibiting or reducing one or more symptoms of the infection.
  • prevention includes administration of a composition to a subject to reduce or delay the onset of clinical or subclinical symptoms, complications, pathologies or biochemical disorders of a disease or infection, or to reduce or inhibit the spread / transmission of a virus. Such administration before infection, exposure or risk of exposure to the virus may be referred to as prophylactic administration.
  • the subject is a human who has been diagnosed with infection with any of the viruses described herein. In some embodiments, the subject present at least one of the clinical symptoms associated with the infection with any of the viruses described herein. In some embodiments, the subject is a human who is at risk of infection, for example, the subject may have been exposed to a virus or inhabit or have traveled to a geographical area in which the virus is endemic. In some embodiments, the subject is considered to be at risk of infection or may be infected, for example because the subject is immunocompromised or immunologically immature.
  • compositions of the invention may in particular be used for immunoprophylaxis in uninfected but at risk patients: children, infants, hospitalized persons, immunocompromised persons, the elderly.
  • compositions according to the invention allow the significant reduction of the viral load, normalized with respect to a known reference, in the treated patient.
  • They can also advantageously cause the destruction of the infected cells via the recruitment of effector cells by means of the ADCC functions of the immunoglobulins of the composition.
  • the compositions of the invention are useful for treating or preventing flavivirus infection (e.g., Zika virus, yellow fever virus, dengue virus).
  • flavivirus infection e.g., Zika virus, yellow fever virus, dengue virus.
  • Flaviviruses can cause a variety of symptoms during the infection of a subject, including malaise; slight fever; rash (exanthem) on the face, neck, arms; headache; sensitivity to light; non-inflammatory joint pain; conjunctivitis; lack of appetite; diarrhea; abdominal pain; and / or vertigo.
  • the severity and duration of symptoms associated with flavivirus infection may vary, for example, depending on the specific flavivirus causing infection and any one of a large number of host factors. Infection with Zika virus during pregnancy has been associated with microcephaly in the fetus / newborn.
  • Dengue virus the causative agent of dengue fever and dengue haemorrhagic fever, can cause high fever, severe headache, severe joint and muscle pain, fatigue, nausea, vomiting, rash, shocks, bleeding.
  • Yellow fever transmitted by the yellow fever virus, also causes symptoms that can be serious, including fever, headache, muscle aches, nausea, vomiting, jaundice, decreased urination, delirium, arrhythmias, bleeding, convulsions and / or a coma.
  • the diagnosis of flavivirus infection in subjects exposed to a flavivirus suspected to be infected or susceptible to exposure to a flavivirus may involve the detection of presence of virus-specific antibodies and / or molecular tests detecting the virus, such as real-time PCR or PCR, for example from blood or saliva samples of a subject.
  • the compositions described herein are used to treat or prevent infection with a respiratory virus.
  • Infection with a respiratory virus can include any of a number of symptoms based, for example, on the part of the respiratory tract that is affected by the infection (viral infection and / or immune response to viral infection).
  • respiratory virus infection can affect the upper respiratory tract, lower respiratory tract, or both.
  • compositions of the invention comprising immunoglobulins directed against at least one respiratory virus, are useful for treating or preventing a respiratory viral infection such as bronchiolitis, pneumonia, influenza, croup (laryngeal - acute tracheitis) and / or bronchitis. They can be particularly useful in curative treatment by early administration. Advantageously, they can slow down and / or prevent the spread of infection from the upper respiratory tract to the lower respiratory tract. Respiratory infection of the virus may include symptoms such as congestion, runny nose, coughing, sneezing, fever, sore throat, difficulty breathing, and general fatigue and discomfort. The respiratory infection of the virus is usually diagnosed by observing the presentation of symptoms, pulmonary function tests, virus detection, for example from nasopharyngeal samples, throat swabs and / or sputum .
  • a respiratory viral infection such as bronchiolitis, pneumonia, influenza, croup (laryngeal - acute tracheitis) and / or bronchitis
  • the composition further comprises an adjuvant, or is administered in combination with an adjuvant, simultaneously or sequentially.
  • the dosage may be adjusted appropriately to achieve the desired levels of each of the local or systemic immunoglobulin populations, depending on the mode of administration.
  • the sample used is a plasma fraction obtained from the immunoglobulin purification process as described in the application WO02092632.
  • the purification process comprises the following steps:
  • the eluate of the basic pH anion exchange chromatography is then subjected to immunoaffinity chromatography as described below.
  • F Protein Anti-hRSV Affinity Chromatography
  • F protein Two versions of the RSV-F protein were used as the affinity ligand; on the one hand, the F protein in post-fusion conformation 11049-V08B (Sino Biological Inc), a synthetic protein derived from a hRNA sequence from the Met 1 to Thr 529 hRSV (RSS-2), containing 518 amino acids after cleavage of the propeptide and whose predicted molecular mass is 58 kDa and secondly the same protein but stabilized in pre-fusion conformation described in McLellan et al., SCIENCE, 2013, 342 (6158): 592-8 and produced in HEK293F cell whose apparent mass in SDS PAGE-Western Blot is 58 Kda.
  • the coupled gel is washed with an alternation of 3 volumes of basic and then acidic buffers: 0.1M Tris-HCl pH 8.4 and 0.1M acetate, 0.5M NaCl pH 4, this cycle being repeated three times.
  • the gel is then stored in 10 mM citrate buffer, 0.5 M NaCl, 0.1 g of sodium azide pH 6.6.
  • the coupling was evaluated at 98%, corresponding to a ligand density of 0.89 mg / ml of grafted gel.
  • the sample is equilibrated in the injection buffer by adding a concentrated solution of NaCl buffer and trisodium citrate qs 0.05M NaCl and 0.01M trisodium citrate.
  • the product is then passed on the column during 33min (contact time).
  • the elution is carried out in 0.1M glycine buffer, 30% propylene glycol at pH 2.57.
  • the eluate is immediately neutralized with 1M Tris-HCl pH 9 buffer to raise the pH to about 6.
  • the gel is then regenerated in order to remove the non-eluted Ig with a 6M guanidine buffer pH 6.
  • the fraction recovered is also neutralized by the addition of 1M Tris-HCl pH9 to raise the pH to 6.
  • the RSV-G strain A protein (ref 11070-V08H2, SB) is used as affinity ligands, a synthetic protein derived from a DNA sequence of hRSV (strain rsbl734) from Asn 66 to Arg 297, containing 242 amino acids after cleavage of the propeptide and with a predicted molecular weight of 26.3 kDa.
  • the apparent molecular weight is included because of a high glycosylation between 60 kDa and 90 kDa.
  • strain B (ref 13029-VO8H, SB), a synthetic protein derived from a hRSV DNA sequence (strain 036633-1) from His 67 to Ala 299, containing 244 amino acids after cleavage of the propeptide and whose mass predicted molecular is 27kDa.
  • strain 036633-1 a synthetic protein derived from a hRSV DNA sequence from His 67 to Ala 299, containing 244 amino acids after cleavage of the propeptide and whose mass predicted molecular is 27kDa.
  • the apparent molecular weight is included because of a high glycosylation between 80 kDa and 90 kDa.
  • the coupling is performed according to the same protocol as that used in section 1.1.
  • gel G-A corresponding to a density of Protein G strain A of 1 mg / ml of grafted gel
  • gel GB corresponding to a density of Protein G strain B of 1 mg / ml of grafted gel
  • G-AB gel corresponding 50%> GA gel and 50%> GB gel.
  • a high proportion of the anti-RSV immunoglobulins bind to the hRSV-G affinity chromatography medium, regardless of the strain, which represents at least 6 ⁇ g in this assay. of anti-RSV immunoglobulins per mL of gel.
  • the unadsorbed fraction and the wash fraction are depleted of anti-RSV immunoglobulins.
  • the immunoglobulin fraction eluted from the acidic pH support and in the presence of Propylene glycol shows a minimum enrichment of 109 times in anti-RSV immunoglobulins.
  • the assay shows that affinity chromatography using a G protein ligand of A or B strains grafted via NHS chemistry allows the purification of anti-RSV immunoglobulins with a yield of at least 26.2% under the conditions tested, corresponding to a minimum enrichment factor of 109 times.
  • the composition obtained after G protein ligand affinity chromatography therefore comprises at least 30% by weight of immunoglobulins directed specifically against at least one epitope of the G protein.
  • the F protein (Genbank accession number: Q6WB98) produced in HEK293F cell with the required post-translational modifications or alternatively an inactivated whole hMPV DAG201 virus produced in the form of a cell lysate is used as the affinity ligand.
  • 2mL of activated sepharose gel (“NHS activated sepharose 4 fast flow") are set up in a 1.1cm diameter chromatography column and the buffers used are those recommended by the supplier of the gel. After washing (1% HCl at 4 ° C.) and equilibration in coupling buffer, 1.98 mg of protein F or 5 mg of inactivated virus to be grafted are added to the gel and the whole is stirred.
  • the blocking of the reactive groups on the gel is carried out by adding 6 ml of 0.5M ethanolamine buffer, 0.5M NaCl, pH 8.3 (6mL), and the gel is stirred for 12h.
  • the coupled gel is washed with an alternation of 3 volumes of basic and then acidic buffers: 0.1M Tris-HCl pH 8.4 and 0.1M acetate, 0.5M NaCl pH 4, this cycle being repeated three times.
  • the gel is then stored in 10mM citrate buffer, 0.5M NaCl, 0.1 g / L sodium azide pH 6.6.
  • the sample is equilibrated in the injection buffer by adding a concentrated solution of NaCl buffer and trisodium citrate qs 0.05M NaCl and 0.01M trisodium citrate.
  • the product is then passed over the column during 3.3min (contact time).
  • the elution is carried out in 0.1M glycine buffer, 30% propylene glycol at pH 2.57.
  • the eluate is immediately neutralized with 1M Tris-HCl pH 9 buffer to raise the pH to about 6.
  • the gel is then regenerated in order to remove the non-eluted Ig with a 6M guanidine buffer pH 6.
  • the fraction recovered is also neutralized by the addition of 1M Tris-HCl pH9 to raise the pH to 6. 1.4.Anti-hPIV3 Affinity Chromatography
  • the affinity ligand used is either the hemagglutinin-neuraminidase (HN) protein (Genbank accession number: J7ENP1) produced in HEK293F cell with the requisite post-translational modifications, or an inactivated whole hPIV3 virus (DAG-H10373) produced under control. cellular lysate form.
  • HN hemagglutinin-neuraminidase
  • the coupled gel is washed with an alternation of 3 volumes of basic and then acidic buffers: 0.1M Tris-HCl pH 8.4 and 0.1M acetate, 0.5M NaCl pH 4, this cycle being repeated three times.
  • the gel is then stored in 10mM citrate buffer, 0.5M NaCl, O.Ig / L sodium azide pH 6.6.
  • the sample is equilibrated in the injection buffer by adding a concentrated solution of NaCl buffer and trisodium citrate qs 0.05M NaCl and 0.01M trisodium citrate.
  • the product is then passed over the column during 3.3min (contact time).
  • the elution is carried out in 0.1M glycine buffer, 30% propylene glycol at pH 2.57.
  • the eluate is immediately neutralized with 1M Tris-HCl pH 9 buffer to raise the pH to about 6.
  • the gel is then regenerated in order to remove the non-eluted Ig with a 6M guanidine buffer pH 6.
  • the fraction recovered is also neutralized by the addition of 1M Tris-HCl pH9 to raise the pH to 6.
  • anti-RSV antibodies are produced from transchromosomal animals.
  • Transchromosomal cows capable of producing human antibodies can be obtained by the human artificial chromosome (HAC) technique described for example in US Pat. No. 9,315,824, which itself refers to the methods described in US Pat. articles Kuroiwa et al., Nat. Biotechnol. 18: 1086-1090, 2000, Kuroiwa et al, Nat. Biotechnol. 20: 889-894, 2002 and Kuroiwa et al., Nat. Biotechnol. 27: 173-181, 2009.
  • HAC human artificial chromosome
  • HAC fragments comprising human immunoglobulin heavy and light chain genes are described in Tomizuka et al., Proceeding of the National Academy of Sciences, 97, 722-727, 2000, WO98 / 037757, Kuroiwa et al, Nature. Biotechnology, 18, 1086-1090, 2000, WO00 / 010383, Kuroiwa et al, Nature Biotechnology, 27, 173-181, 2009, WO09 / 111.086.
  • the transchromosomal cows produced are also unable to generate IgM heavy chains (KcHAC / IGHM cows "7" IGHML1 "7” ).
  • KcHAC / IGHM "7" IGHMLl "7” transchromosomal cows can then be immunized with RSV virus antigens (preferably F protein and / or G protein).
  • RSV virus antigens preferably F protein and / or G protein.
  • the human IgGs specific for the generated RSV antigens are purified using an immunoaffinity chromato graphy, according to the principle described in section 1 above, by fixing on the immunoaffinity matrix the same RSV antigens as those used for immunization. .
  • anti-RSV antibodies produced from transchromosomal animals can be used in combination with anti-hMPV, and anti-hPIV3 Ig as described below.
  • hMPV virus antigens either F protein or inactivated virus, as described in Kuroiwa et al., Nat. Biotechnol. 27: 173-181, 2009.
  • the human IgGs specific for the generated hMPV antigens are purified from cow blood samples, and using immunoaffinity chromatography, according to the principle described in section 1.
  • KcHAC / IGHM "7" IGHML1 "7” transchromosomal cows were immunized with PIV3 virus antigens.
  • the human IgGs specific for the generated PIV3 antigens are purified using immunoaffinity chromatography, according to the principle described in section 1, by fixing on the immunoaffinity matrix the same PIV3 antigens as those used for the immunization.
  • human RSV-specific human Ig as prepared in Example 1.1.1 or 1.1.2 are mixed with human anti-CMV and anti-BKV Ig. These are obtained as described in Example 1, Section 1, but replacing the RSV antigen by a CMV or BKV antigen.
  • human anti-Zika, anti-Dengue and anti-yellow fever polyclonal antibodies are prepared by immunizing KCHAC / IGHM ⁇ ⁇ IGHML1 ⁇ ⁇ transchromosomal cows with antigens from Zika virus, dengue fever and yellow fever, simultaneously, and recovering the antibodies produced, by purification on the same immunoaffinity column, on which are fixed the three viral antigens (respectively Zika virus, dengue, and yellow fever).
  • human anti-Zika, anti-Dengue and anti-yellow fever polyclonal antibodies are prepared by immunizing KcHAC / IGHM " / " IGHML1 " ⁇ transchromosomal cows with antigens from Zika virus, dengue fever and yellow fever, each cow being immunized with a single antigen
  • the antibodies produced are recovered by purification on an immunoaffinity column, to which each antigen (Zika virus, dengue, and yellow fever) is fixed.
  • the three populations of anti-Zika, anti-Dengue and anti-yellow fever antibodies purified separately are then mixed in equal proportions.
  • a mixture of antigens of hepatitis B virus is used as the affinity ligand:
  • the coupling is 75%, corresponding to a ligand density of 0.7 mg / ml of grafted gel and an estimated capacity of 63650 mIU of anti-HBV / ml.
  • the sample normal immunoglobulin at 50 g / L is dialyzed against PBS buffer.
  • the capture is performed in an open system, 40ml of sample is incubated with the resin for 30min.
  • the fraction of the non-retained sample is separated from the resin by centrifugation for 2 min at 500 g. This step is used for each wash and for elution.
  • the resin is then washed 3 times with 5 ml of PBS.
  • the hyper-enriched anti-HBV immunoglobulins are then eluted with 5 ml of 4M MgCl 2 buffer. Buffer exchange is then performed on PD10 (G25) in PBS and the sample is concentrated to 1 mg / ml on Amicon Ultra 10 cell.
  • anti-hRSV and anti-HBV antibodies obtained in sections 4.1 and 4.2 above are mixed in an equal proportion, and formulated in a pharmaceutical composition.
  • the RSV and HBV viruses can be verified with different neutralization tests for each of the viruses.
  • RSV For RSV: In order to measure the inhibition capacity of the viral infection by the fractions obtained, an hRSV (18) -cherry3 viral strain containing a reporter gene coding for a fluorescent protein is used on a Hep2 cell line. The intensity of the fluorescence is directly representative of the viral replication. The day before the test, the cells are subcultured in a 96-well plate at 0.5 ⁇ 10 6 cells / ml and incubated at 37 ° C. under 7% CO 2.
  • control monoclonal antibodies SynagisTM, solution of monoclonal antibodies directed against RSV
  • negative (solution of irrelevant monoclonal antibodies) and the fractions to be tested are diluted in MEM medium and ⁇ , are deposited in 96 well plate well.
  • the virus is similarly diluted in 1 / 25th MEM medium and 70 ⁇ l are deposited in the wells containing the antibody solutions. Homogenization is done by suction / discharge. The mixture is then incubated for 1 h at 37 ° C. under 7% CO 2.
  • the cellular supernatant is aspirated, ⁇ of the Ig / virus mixture is rapidly deposited and the incubation is carried out at 37 ° C.
  • Huh-106 cells are inoculated with the HBV virus (MOI: 500ge) in the presence of an anti-HBV concentration of between 0.5 / 5/50/500 and 5000 ng / ml.
  • the cell supernatant is recovered 9 days after inoculation.
  • the IC90 for 90% neutralization is calculated from the rate of virus assayed by Northern Blot.

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Abstract

L'invention a trait à une composition d'immunoglobulines hyper-enrichie en au moins deux populations d'immunoglobulines, chaque population consistant en des immunoglobulines dirigées spécifiquement contre un virus distinct.

Description

Composition d'immunoglobulines utiles pour traiter des infections virales
La présente invention concerne des compositions multivalentes hyper-enrichies en au moins deux populations d'immunoglobulines, chaque population consistant en des immunoglobulines capables de reconnaître, et avantageusement neutraliser, un virus distinct.
Arrière-plan technologique
De nombreuses infections virales restent non traitées, ou mal traitées. Des stratégies d'immunisation passive ont été développées, qui impliquent l'administration d'anticorps monoclonaux ou polyclonaux dirigés contre les virus. Les anticorps administrés peuvent lier les antigènes viraux, résultant en une neutralisation du virus et/ou en faisant du virus une cible pour la phagocytose et la présentation de l'antigène aux lymphocytes T CD4+. Dans le cas des anticorps monoclonaux, leur activité est réduite à une cible et un épitope sur cette cible. Cette approche ne permet donc pas de cibler plusieurs agents pathogènes communs à une même problématique (tels que les infections respiratoires saisonnières, les familles de virus émergents, le rejet infectieux de greffe). L'activité limitée à un épitope au sein d'une protéine du pathogène rend également le mécanisme d'action immédiatement sensible à une mutation ponctuelle. Les taux de mutations étant très élevés chez les virus, en particulier les virus à ARN, l'approche par anticorps monoclonal est de fait limitée par ce risque. La possibilité de combiner deux ou trois anticorps monoclonaux afin d'en augmenter l'activité ou d'élargir le tropisme de la préparation a été explorée mais génère à ce jour des défis technologiques et réglementaires pour un effet limité. Par exemple, le médicament expérimental ZMapp, comprenant trois anticorps monoclonaux, a été évalué dans le traitement de la maladie à virus Ebola, et les résultats restent partiels. Par ailleurs, les immunoglobulines polyclonales hyper-immunes obtenues à partir de plasmas humains hyper-immuns ou de plasmas animaux suite à l'immunisation des animaux avec un antigène viral sont avantageuses du point de vue des risques de mutation mais leur action reste limitée à un seul pathogène. Par ailleurs, les titres en anticorps réellement neutralisants restent modérés et requièrent des volumes d'administration importants. Cette administration de larges quantités d'anticorps étrangers n'est pas exempte d'effets secondaires pour le patient, en particulier lorsqu'une multi-thérapie est désirée.
Résumé de l'invention L'invention fournit une multi-thérapie qui permet le traitement ou la prévention d'une infection par plus d'un virus (que ce soit plus d'une souche virale ou plus d'une espèce virale), par administration d'une composition d'anticorps qui se lient à chaque souche ou espèce. L'invention fournit plus particulièrement une composition d'immunoglobulines hyper-enrichie en au moins deux populations d'immunoglobulines, chaque population consistant en des immunoglobulines dirigées spécifiquement contre un virus distinct.
Une telle composition est utile à titre de composition pharmaceutique, pour une utilisation dans le traitement d'une infection virale, plus précisément une infection par les virus contre lesquels les immunoglobulines sont dirigées.
Les immunoglobulines utilisées sont dirigées préférentiellement contre une protéine de surface du virus visé, qui joue un rôle dans les mécanismes d'infection, notamment au cours de la reconnaissance, de la liaison de la particule virale à sa cellule hôte, de la fusion de la particule virale à sa cellule hôte ou de la propagation du virus de cellule hôte à cellule hôte.
Dans un mode de réalisation préféré, l'invention fournit une composition dans laquelle une desdites populations consiste en des immunoglobulines dirigées spécifiquement contre un virus choisi parmi les virus influenzas, les metapneumovirus (MPV), le virus respiratoire syncitial (RSV), les virus parainfluenzas, le virus Zika, le virus de la dengue, le virus de la fièvre jaune, le virus BK (BKV), le virus B19, PEpstein-Barr virus (EBV) ou le cytomégalo virus (CMV).
Avantageusement, la composition d'immunoglobulines ne comprend pas plus de 10, pas plus de 7, pas plus de 5, pas plus de 3 spécificités infectieuses différentes.
Préférentiellement, la composition d'immunoglobulines selon l'invention comprend trois ou quatre populations d'immunoglobulines, chaque population consistant en des immunoglobulines dirigées spécifiquement contre un virus distinct. Dans un premier mode de réalisation particulier, une première desdites populations consiste en des immunoglobulines dirigées spécifiquement contre le virus RSV humain, une deuxième desdites populations consiste en des immunoglobulines dirigées spécifiquement contre le virus MPV humain, et une troisième desdites populations consiste en des immunoglobulines dirigées spécifiquement contre le virus parainfluenza de type 3 humain. Une telle composition est particulièrement utile pour le traitement de troubles respiratoires causés par une infection par au moins l'un de ces trois virus.
Dans un deuxième mode de réalisation particulier, une première desdites populations consiste en des immunoglobulines dirigées spécifiquement contre le virus Zika, une deuxième desdites populations consiste en des immunoglobulines dirigées spécifiquement contre le virus de la dengue, et une troisième desdites populations consiste en des immunoglobulines dirigées spécifiquement contre le virus de la fièvre jaune.
Une telle composition est particulièrement utile pour le traitement d'au moins un symptôme, comme la fièvre ou les douleurs musculaires ou articulaires, causé par une infection par au moins un de ces trois virus. En particulier une telle composition est utile pour le traitement prophylactique, en particulier chez des sujets à risque et/ou dans les territoires à risque.
Dans un troisième mode de réalisation particulier, une première desdites populations consiste en des immunoglobulines dirigées spécifiquement contre le virus RSV humain, une deuxième desdites populations consiste en des immunoglobulines dirigées spécifiquement contre le virus BKV humain, et une troisième desdites populations consiste en des immunoglobulines dirigées spécifiquement contre le virus CMV.
Une telle composition est particulièrement utile pour le traitement d'une infection par au moins un de ces trois virus, en particulier pour le traitement, notamment par prophylaxie, des causes infectieuses majeures de rejet de greffe.
Description détaillée de l'invention
Composition d' immunoglobulines hyper-enrichies
La composition d'immunoglobulines selon l'invention comprend différentes populations d'immunoglobulines. Par «population d'immunoglobulines », on entend un groupe d'anticorps qui se lient à un même immunogène viral (on parle alors de population monovalente d'anticorps), ou à plusieurs immunogènes différents d'un même virus (on pourra alors parler de population polyvalente d'anticorps). Essentiellement, il s'agit d'anticorps polyclonaux. Dans l'ensemble de la description, les termes « immunoglobulines » et « anticorps » peuvent être interchangeables.
La composition d'immunoglobulines selon l'invention contient essentiellement des immunoglobulines humaines polyvalentes qui peuvent être des immunoglobulines A (IgA), des immunoglobulines E (IgE), des immunoglobulines M (IgM) ou des immunoglobulines G (IgG). Avantageusement, la composition d'immunoglobulmes contient essentiellement des IgG et/ou des IgM et/ou des IgA.
Dans un mode de réalisation particulier, la composition d'immunoglobulmes selon l'invention comprend essentiellement des IgG, quelle que soit leur sous-classe (IgGl, IgG2, IgG3 et IgG4). La composition peut être adaptée par l'homme du métier selon la voie d'administration retenue et/ou le mécanisme d'action recherché. Pour une administration par voie intraveineuse par exemple, la composition contient préférentiellement essentiellement des IgG et/ou des IgM, et est avantageusement déplétée en IgA. En revanche, dans d'autres voies d'administration telle que la voie locale, la composition contient préférentiellement essentiellement des IgG et/ou des IgA, les IgA permettant le recrutement de cellules telles que des cellules mucosales présentant des alfa récepteurs.
Par « composition hyper-enrichie en au moins deux populations d'immunoglobulmes », on entend avantageusement une composition d'immunoglobulmes, comprenant au moins 10%, de préférence au moins 20%, au moins 30%>, au moins 40%>, en poids de chacune desdites populations. De préférence, la composition comprend une proportion égale de chaque population d'immunoglobulmes. Typiquement, les compositions d'immunoglobulmes hyper- enrichies sont un sous ensemble de compositions d'immunoglobulmes hyper-immunes. Dans certains modes de réalisation de l'invention, les compositions d'immunoglobulmes hyper- enrichies sont obtenues à partir de compositions d'immunoglobulmes hyper-immunes. Les compositions d'immunoglobulmes hyper-immunes sont similaires aux immunoglobulines intraveineuses (IVIG) excepté qu'elles sont issues de plasma de donneurs présentant des titres élevés d'immunoglobulmes dirigées contre un antigène spécifique. Ces compositions d'immunoglobulmes hyper-immunes contiennent un titre en immunoglobulines liant le pathogène au moins quatre fois supérieur au titre moyen observé dans une immunoglobuline polyvalente normale issue d'une même espèce (notamment humain, lapin, caprin, bovin ou équin). Néanmoins, elles comprennent moins de 10%> en poids de populations d'immunoglobulmes spécifiques du même antigène. Virus et immunogènes viraux
Chaque population consiste en des immunoglobulines dirigées spécifiquement contre un virus distinct. Les populations d'immunoglobulines se lient à différents immunogènes viraux. Dans certains modes de réalisation, les immunogènes viraux proviennent de souches virales différentes (au sein d'une même espèce), ou proviennent d'espèces virales différentes. Le terme « spécifique » signifie que les immunoglobulines reconnaissent et se lient à un immunogène dudit virus, substantiellement sans réaction croisée avec un autre virus (ou le cas échéant une autre souche).
Dans un mode de réalisation particulier, la composition peut en outre comprendre, et de préférence être enrichie, d'au moins une autre population consistant en des immunoglobulines dirigées spécifiquement contre un antigène différent d'un même virus.
Tous les virus susceptibles d'infecter un sujet, humain ou non-humain, de préférence un mammifère, sont compris.
Avantageusement, on cherche à traiter les infections les plus fréquentes, ou les infections qui touchent les sujets les plus sensibles (femmes enceintes, nouveaux-nés, sujets immunodéprimés), et/ou encore les infections pour lesquelles aucun traitement n'est disponible. Parmi les virus, on peut citer les virus de la famille des Flaviviridiae, dont par exemple le virus de l'encéphalite japonaise, le virus West Nile, le virus de la dengue, le virus de la fièvre jaune, le virus Zika, le virus de l'hépatite. On peut aussi citer les virus qui provoquent un trouble respiratoire, notamment une bronchiolite ou une pneumonie, notamment le virus parainfluenza, le virus syncitial (RSV), adenovirus, rhinovirus, metapneumovirus, enterovirus, et coronavirus.
Dans un mode de réalisation préféré, l'invention fournit une composition dans laquelle une desdites populations consiste en des immunoglobulines dirigées spécifiquement contre un virus choisi parmi le virus parainfluenza, notamment le virus parainfluenza de type 3, le metapneumovirus (MPV), le virus Zika, le virus de la dengue, le virus de la fièvre jaune, ou le cytomégalovirus (CMV). Dans un mode de réalisation, la composition selon l'invention est enrichie en une population d'immunoglobulines dirigées spécifiquement contre le virus RSV. Dans un mode de réalisation préféré, l'invention fournit une composition dans laquelle une desdites populations consiste en des immunoglobulines dirigées spécifiquement contre un virus choisi parmi le virus parainfluenza, notamment le virus parainfluenza de type 3, le metapneumovirus (MPV), le virus Zika, le virus de la dengue, le virus de la fièvre jaune, ou le cytomégalovirus (CMV), ladite composition étant en outre enrichie en une population d'immunoglobulines dirigées spécifiquement contre le virus RSV. Dans un autre mode de réalisation, la composition d'immunoglobulines au contraire n'est pas enrichie en une population d'immunoglobulines dirigées spécifiquement contre le virus RSV. En d'autres termes, la composition ne comprend substantiellement pas, ou comprend moins de 5%, d'immunoglobulines reconnaissant le virus RSV. Les immunoglobulines dirigées spécifiquement contre les virus ciblés peuvent se lier à l'une quelconque des protéines du virus, de préférence une protéine de surface, jouant un rôle dans les mécanismes d'infection, notamment au cours de la reconnaissance, de la liaison de la particule virale à sa cellule-hôte, de la fusion de la particule virale à sa cellule-hôte et de la propagation du virus de cellules hôte à cellule hôte.
Dans le cas du RSV et du métapneumovirus appartenant à la famille des paramyxoviridae, on peut citer notamment la protéine SH, la protéine M, la protéine G ou la protéine F.
Dans le cas du virus parainfluenza de type 3 humain, également de la famille des paramyxoviridae, on peut citer en plus la protéine hemagglutinine-neuraminidase (HN) qui remplace la protéine G.
Dans le cas du virus CMV, on peut citer les antigènes B, gH,gL,gO, gM, gN UL128, UL130 et UL131.
Dans le cas de virus influenza de la famille des orthomyxoviridae, on peut citer les protéines hémagglutinines (HA) et neuraminidase (NA).
Dans le cas du virus BK de la famille des polyomaviridae, on peut citer les protéines VPl, 2 et 3.
Dans le cas des flavivirus (comme le virus Zika, le virus de la dengue, et le virus de la fièvre jaune), on peut citer la protéine E, et les protéines prM/M. Méthodes de préparation des compositions d'immunoglobulines
Plusieurs méthodes de préparation des compositions de l'invention sont possibles. Les principales méthodes sont décrites ci-après.
Lorsque le virus d'intérêt est un virus humain contre lequel un humain adulte est généralement immunisé (par contact antérieur avec le virus, de manière souvent asymptomatique) et que cette immunité est réputée protectrice, on privilégiera une méthode de préparation d'immunoglobulines à partir de pools de plasma, avantageusement de plasma humain. C'est par exemple le cas du RSV ou du CMV. Une telle méthode implique des étapes de concentration des préparations plasmatiques, typiquement d'un facteur 100 à 1000.
Dans le cas où l'être humain n'est généralement pas immunisé (comme par exemple lorsque le virus visé est un flavivirus), on pourra par exemple produire les anticorps dans un animal (non- humain) transgénique.
Selon une première méthode, des préparations d'immunoglobulines issues de plasma humain ou de fractions de plasma sanguin sont soumises à une chromatographie d'affinité utilisant une protéine virale comme ligand d'affinité, pour obtenir une préparation d'immunoglobulines hyper-enrichies en immunoglobulines capables de reconnaître, et avantageusement de neutraliser, ledit virus. Les préparations d'immunoglobulines hyper-enrichies en immunoglobulines d'intérêt sont ensuite combinées pour former la composition selon l'invention.
Alternativement, des préparations d'immunoglobulines issues de plasma humain ou de fractions de plasma sanguin sont soumises à une ou plusieurs chromatographie(s) d'affinité, en séquentiel ou en une étape sur lit mélangé, utilisant plusieurs protéines virales distinctes comme ligands d'affinité, pour obtenir une préparation d'immunoglobulines hyper-enrichies en immunoglobulines capables de reconnaître, et avantageusement de neutraliser, lesdits virus.
Ces méthodes mettent en œuvre des supports de chromatographie d'affinité sur lesquels sont greffés une ou plusieurs protéines virales, ou des fragments antigéniques de celles-ci. Parmi les protéines virales utiles comme ligands, on peut citer par exemple les protéines décrites plus haut, ou préférentiellement les protéines de surface, jouant un rôle dans les mécanismes d'infection, notamment au cours de la reconnaissance, de la liaison de la particule virale à sa cellule-hôte, de la fusion de la particule virale à sa cellule-hôte et de la propagation du virus de cellules hôte à cellule hôte. La chromatographie utilise une matrice comprenant un support à base de particules de polymère, et est de préférence sous forme d'un gel ou d'une résine. Ces particules de polymère sont de préférence de forme sphérique ou oblongue, il peut s'agir notamment de billes. Le polymère peut être naturel ou non-naturel, organique ou inorganique, réticulé ou non réticulé. Le polymère est de préférence un polymère organique, de préférence réticulé. Dans un mode de réalisation préféré, le polymère est de la cellulose, et les particules sont de préférence des billes de cellulose poreuses. D'autres types de polymères possibles incluent l'agarose, le dextran, les polyacrylates, le polystyrène, le polyacrylamide, le polyméthacrylamide, des copolymères de styrène et divinylbenzène, ou des mélanges de ces polymères.
Les particules peuvent fournir un milieu de chromatographie que l'on peut utiliser pour remplir une colonne par exemple.
Sur le support est greffée une protéine virale, ou un fragment antigénique de celle-ci, soit directement, soit via un espaceur, qui lie de manière covalente le ligand aux particules du support chromatographique.
Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, le support greffé présente plusieurs ligands différents. Le support peut alors être greffé avec plusieurs protéines différentes et/ou plusieurs fragments antigéniques différents appartenant à différents virus ou souches virales, afin d'obtenir un concentré d'immunoglobulines présentant différentes cibles antigéniques. Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, les ligands spécifiques de chaque virus ou souche virale peuvent être sous la forme d'un mélange de cibles antigéniques, constitué de plusieurs protéines différentes et/ou plusieurs fragments antigéniques différents appartenant au même virus ou souche virale.
Une particule peut porter plusieurs espaceurs. La liaison entre le ligand et l'espaceur peut être, par exemple, une liaison amide. L'espaceur comprend typiquement au moins un atome de C, O, N, ou S. Les ligands sont immobilisés chimiquement par des liaisons covalentes entre les particules et l'espaceur, et entre l'espaceur et le ligand. Cette immobilisation peut être réalisée de manière classique par l'homme du métier.
Dans un mode de réalisation préféré, la particule porte un bras -NH-R1-COOH. De préférence il s'agit d'acide alpha-aminocaproïque (où RI est un groupe pentyle).
De manière classique, la particule peut être activée en utilisant des réactifs bifonctionnels tels que l'épichlorhydrine, l'épibromhydrine, le dibromo-et dichloropropanol, le dibromobutane, l'éthylène glycol diglycidyléther, le butanediol diglycidylether, divinylsulfone, l'allylglycidyléther, et le bromure d'allyle. Le réactif bifonctionnel est capable de réagir à la fois avec les particules et le bras -NH-R1-COOH. Les composés hétéro fonctionnels allyle, tels que le bromure d'allyle, sont des réactifs bifonctionnels préférés et permettent d'obtenir une matrice activée. Pour certains supports solides, tels que la cellulose, les composites contenant un hydrogel ou d'autres matériaux présentant des groupes hydroxyles, il est avantageux de déprotoner les groupes hydroxyles avec une source d'hydroxyde, par exemple, avant la réaction avec un réactif bifonctionnel. La matrice sous forme de gel est préparée par addition classique d'un tampon sur les particules de polymère portant les ligands, comme cela est connu de l'homme du métier, de manière à obtenir une matrice sous forme de gel, adaptée pour une chromatographie d'affinité.
La matrice telle que définie ici est utile dans une chromatographie d'affinité liant des immunoglobulines. La matrice est particulièrement utile dans une chromatographie d'affinité à lit mélangé. Une telle matrice comprend avantageusement plusieurs antigènes différents spécifiques du même virus et est donc capable de lier des immunoglobulines dirigées contre plusieurs épitopes différents d'un même virus. Une telle matrice peut également avantageusement comprendre plusieurs antigènes différents issus de différents virus, et est donc capable de lier à la fois des immunoglobulines spécifiques d'un premier virus et des immunoglobulines dirigées contre un autre virus choisi.
Les immunoglobulines anti-virus présentes dans le plasma ou la fraction plasmatique se fixent à la matrice, et le produit adsorbé est élué et récupéré, enrichi en immunoglobulines anti-virus. De manière avantageuse, les conditions de mise en œuvre de la chromatographie d'affinité selon l'invention sont adaptées par l'homme du métier pour garantir la réutilisation de la matrice selon l'invention tout en maintenant des conditions d'élution non dégradantes pour le produit d'intérêt.
Le plasma ou la fraction plasmatique de départ soumis au procédé d'enrichissement consiste en du plasma provenant de plasmas sanguins ou de pools de plasmas sanguins de sujets mammifères (humains ou non humains) ou en une fraction de ce plasma, soit toute partie ou sous-partie du plasma, ayant fait l'objet d'une ou plusieurs étapes de purification. Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, le plasma ou la fraction plasmatique de départ soumis au procédé d'enrichissement de l'invention consistent avantageusement en du plasma provenant de pools de plasmas sanguins de sujets humains normaux ou en une fraction de ce plasma, soit toute partie ou sous-partie du plasma, ayant fait l'objet d'une ou plusieurs étapes de purification.
Les fractions plasmatiques utilisables incluent ainsi le surnageant de plasma cryoprécipité, le cryoprécipité de plasma (remis en suspension), les fractions I à V obtenues par fractionnement éthanolique (selon la méthode de Cohn ou de Kistler & Nitschmann), le surnageant et le précipité obtenus après précipitation à l'acide caprylique et/ou caprylate, les éluats de chromatographies et les fractions non adsorbées des colonnes de chromatographie, et les filtrats. De manière particulièrement avantageuse, le plasma ou la fraction plasmatique de départ soumis au procédé d'enrichissement proviennent de pools de plasmas sanguins de sujets humains normaux, sans sélection préalable des donneurs, en particulier, sans sélection des donneurs sur la base de leur éventuel taux plasmatique en immunoglobulines anti-virus d'intérêt. Le plasma ou la fraction plasmatique de départ soumis au procédé d'enrichissement comporte ainsi avantageusement un taux d'immunoglobulines anti-virus similaire ou égal au taux d'immunoglobulines anti- virus d'un plasma issu du pool d'au moins 1000 donneurs humains normaux aléatoirement choisis. Le plasma ou la fraction plasmatique de départ soumis au procédé d'enrichissement de l'invention est avantageusement non enrichi en immunoglobulines anti-virus d'intérêt comparé au taux d'immunoglobulines anti-virus d'un plasma issu du pool d'au moins 1000 donneurs choisis de manière aléatoire.
Le plasma ou la fraction plasmatique de départ soumis au procédé d'enrichissement contient des immunoglobulines humaines polyvalentes qui peuvent être des immunoglobulines A (IgA), des immunoglobulines E (IgE), des immunoglobulines M (IgM) ou des immunoglobulines G (IgG). Avantageusement, le plasma ou la fraction plasmatique de départ contient essentiellement des IgG quelle que soit leur sous-classe (IgGl, IgG2, IgG3 et IgG4) et/ou des IgM.
Le procédé utilise préférentiellement comme échantillon de départ un plasma ou une fraction plasmatique provenant de pools de plasmas sanguins de sujets humains normaux, sans sélection préalable des donneurs, en particulier, sans sélection des donneurs sur la base de leur éventuel taux plasmatique en immunoglobulines anti-virus.
Le procédé peut typiquement être un procédé indépendant, dédié à la purification d'immunoglobulines anti-virus uniquement, et est alors avantageusement effectué à partir de plasma ou d'une fraction plasmatique.
Dans ce mode de réalisation, le procédé comprend avantageusement les étapes suivantes : fourniture d'un échantillon de plasma ou d'une fraction plasmatique,
- passage de l'échantillon de plasma ou d'une fraction plasmatique sur une chromatographie d'immunoaffînité sur la matrice décrite ici,
récupération de la fraction adsorbée sur la matrice correspondant à la composition d'immunoglobulines hyper-enrichie en immunoglobulines anti-virus.
De manière avantageuse, le procédé peut comprendre en outre, après l'étape de capture sur chromatographie d'affinité anti-virus, une étape dédiée de déplétion de certaines immunoglobulines, en particulier les immunoglobulines E (IgE) et/ou immunoglobulines M
(IgM), qui peuvent être impliquées dans des mécanismes d'effets secondaires délétères chez les patients. Le procédé comprend avantageusement en outre une étape ultérieure consistant à soumettre la composition d'immunoglobulines hyper-enrichie en immunoglobulines anti-virus à au moins une étape d'inactivation et/ou d'élimination virale.
Dans encore un autre mode de réalisation particulier, le procédé d'obtention des immunoglobulines anti-virus est couplé à un procédé d'obtention d'immunoglobulines G polyvalentes afin d'obtenir, à partir d'un même pool de plasma de départ, à la fois un concentré d'immunoglobulines G polyvalentes et un concentré d'immunoglobulines hyper-enrichies en anti- virus.
Le procédé de l'invention comprend alors typiquement une étape préalable d'obtention de la fraction plasmatique, par fractionnement éthanolique et/ou fractionnement caprylique et/ou séparation chromatographique.
Dans ce mode de réalisation, le procédé selon l'invention comprend avantageusement les étapes suivantes :
fourniture d'un échantillon d'une fraction plasmatique prépurifiée obtenue par fractionnement éthanolique et/ou fractionnement caprylique et/ou séparation chromatographique,
passage de la fraction plasmatique prépurifiée sur une chromatographie d'immunoaffînité sur la matrice décrite ici,
récupération de la fraction adsorbée sur la matrice correspondant à la composition d'immunoglobulines hyper-enrichie en immunoglobulines anti-virus.
Par « séparation chromatographique », on entend toute étape de chromatographie, qu'il s'agisse de chromatographie échangeuse d'ions (échangeuse d'anions et/ou échangeuse de cations), mixed mode, ou chromatographie d'affinité (utilisant des ligands de type chimiques, anticorps, fragments d'anticorps, aptamères). Par séparation chromatographique, on entend aussi bien une seule et unique colonne de chromatographie, ou un ensemble de colonnes de chromatographie, utilisant ou non le même type de support, en série (mode multicolonnes par exemple) ou en parallèle.
Plus précisément, la fraction plasmatique peut être obtenue par un fractionnement éthanolique développé à l'origine par Cohn et al (Cohn et al, 1946. J. Am. Chem. Soc. 68, 459 ; Oncley et al, 1949, J. Am. Chem. Soc. 71, 541), ou bien par une séparation chromatographique, telle que décrite par exemple dans EP 0 703 922 et WO 99/64462, ou encore par un fractionnement caprylique tel que décrit par Steinbuch et al 1969, Arch Biochem Biophys. 134(2):279-84). On préfère tout particulièrement les procédés mis au point par la Demanderesse dans les demandes de brevet WO 94/29334 et WO 02/092632, et tout particulièrement celui décrit dans WO 02/092632. Dans ce cas, on soumet un plasma sanguin, ou une fraction de plasma sanguin enrichie en Ig, à un fractionnement caprylique (prépurification par précipitation de contaminants non immunoglobulines), et une chromatographie unique sur un support de résine échangeuse d'anions effectuée à pH alcalin. Un traitement d'inactivation virale peut être réalisé, de préférence effectué par solvant-détergent, comme décrit par Horowitz dans le brevet US 4 764 369, éventuellement complété par une étape d'élimination virale par nanofiltration sur filtre de taille de pores 75N, 35N, 20N et/ou 15N.
La fraction d'Ig ainsi récoltée est déjà concentrée, mais peut ensuite subir des étapes de concentration supplémentaire par ultrafîltration, et de fîltration stérilisante.
Ce concentré est ensuite soumis à une étape chromatographique d'immunoaffinité sur la matrice telle que décrite plus haut.
De manière avantageuse, le procédé peut comprendre en outre, de préférence après l'étape de capture sur chromatographie d'affinité anti- virus, une étape dédiée de déplétion de certaines immunoglobulines, en particulier les immunoglobulines A (IgA), et/ou immunoglobulines E (IgE) et/ou immunoglobulines M (IgM), qui peuvent être impliquées dans des mécanismes d'effets secondaires délétères chez les patients. Les immunoglobulines à dépléter sont avantageusement sélectionnées en particulier selon la voie d'administration choisie pour le concentré d'immunoglobulines hyper-enrichi en immunoglobulines anti-virus et/ou selon le contenu de l'échantillon de plasma ou de la fraction plasmatique de départ.
Le procédé peut en outre comprendre les étapes ultérieures consistant à additionner un ou plusieurs stabilisants pharmaceutiquement acceptables; et éventuellement congeler ou lyophiliser le concentré ainsi obtenu.
Selon un autre procédé de préparation, des mammifères non humains sont immunisés avec au moins deux immunogènes viraux pour produire des populations d'anticorps qui se lient aux immunogènes viraux.
Selon un autre procédé de préparation, des immunoglobulines hyper-enrichies sont obtenues à partir d'une bibliothèque d'immunoglobulines polyvalentes recombinantes générée via le séquençage du répertoire lymphocytaire d'au moins 50 donneurs. Le principe de cette technologie est décrit par exemple dans le brevet US 9, 412, 547.
Selon un autre procédé de préparation, des mammifères non humains transgéniques sont immunisés avec au moins deux immunogènes viraux pour produire des populations d'anticorps qui se lient aux immunogènes viraux. Le terme «animal transgénique» ou «mammifère transgénique» est utilisé ici de manière interchangeable pour désigner un mammifère non humain qui a été génétiquement modifié pour coder une séquence d'acide nucléique exogène dans son génome. Dans certains modes de réalisation, le mammifère transgénique a été génétiquement modifié pour produire des anticorps xénogènes en réponse à un immunogène. Dans certains modes de réalisation, le mammifère transgénique a été génétiquement modifié pour produire des anticorps humains en réponse à un immunogène. Dans certains modes de réalisation, le mammifère non humain est un ongulé. Dans certains modes de réalisation, le mammifère non humain est un bovin, une chèvre, un mouton, un bison, un chameau, un cochon, un lapin, un buffle, un cheval, un rat, une souris ou un lama.
Dans certains modes de réalisation, les mammifères non humains transgéniques ont été modifiés pour coder un chromosome artificiel humain dans son génome ; ces mammifères sont alors qualifiés de transchromosomiques. Dans certains modes de réalisation, les mammifères non humains transchromosomiques ont été modifiés pour coder un chromosome artificiel humain dans le génome d'un type de cellule particulier (par exemple, des cellules B). Voir, par exemple, Macnab et al. Gene Therapy (2009) 16: 1180-1188; Kazuki et al. Mol. Ther. (201 1) 19 (9): 1591-1601, incorporé ici à titre de référence.
Les animaux transgéniques ou transchromosomiques décrits ici peuvent être génétiquement modifiés pour contenir tout ou partie du locus du gène de l'immunoglobuline de lignée germinale exogène de telle sorte que l'immunisation des animaux transgéniques ou transchromosomiques conduit à la production d'anticorps exogènes (par exemple, humains) contre l'immunogène d'intérêt. Le gène en question comprend typiquement un ou plusieurs acides nucléiques codant pour tout ou partie d'un gène d'anticorps xénogène qui est capable de subir un réarrangement et d'exprimer un ou plusieurs anticorps xénogènes dans des cellules B. Un locus génétique capable de subir un "réarrangement" se réfère à un locus d'anticorps qui n'a pas subi de recombinaison V (D) J mais qui est capable de subir un réarrangement et d'exprimer des anticorps exogènes (par exemple humains) en réponse à une immunisation avec un immunogène.
Dans certains modes de réalisation, les animaux sont modifiés pour contenir tous les segments d'acide nucléique codant pour un segment de gène V d'une chaîne légère d'anticorps séparés de tous les segments d'acide nucléique codant pour un segment de gène J par un ou plusieurs nucléotides. Dans certains modes de réalisation, tous les segments d'acide nucléique codant pour un segment de gène V d'une chaîne lourde d'anticorps sont séparés de tous les segments d'acides nucléiques codant pour un segment de gène D par un ou plusieurs nucléotides et / ou tous les segments d'acide nucléique codant pour un segment de gène D d'une chaîne lourde d'anticorps sont séparés de tous les segments d'acide nucléique codant pour un segment de gène J par un ou plusieurs nucleotides. Dans certains modes de réalisation, le locus de gène d'immunoglobuline comprend un ou plusieurs loci de chaîne lourde d'immunoglobuline humaine. Dans certains modes de réalisation, les loci de chaîne lourde d'immunoglobuline humaine comprennent un segment V de chaîne lourde, un segment D de chaîne lourde et / ou un segment J de chaîne lourde. Dans certains modes de réalisation, les loci de chaîne lourde d'immunoglobuline humaine comprennent au moins un segment de région constante de chaîne lourde. Dans certains modes de réalisation, les loci de chaîne lourde d'immunoglobuline humaine comprennent un segment V de chaîne lourde, un segment D de chaîne lourde et / ou un segment J de chaîne lourde et au moins un segment de région constante de chaîne lourde. Dans certains modes de réalisation, le locus de gène d'immunoglobuline comprend un ou plusieurs loci de chaîne légère d'immunoglobuline humaine. Dans certains modes de réalisation, les loci de chaîne légère d'immunoglobuline humaine comprennent un segment VL de chaîne légère et / ou un segment JL de chaîne légère. Dans certains modes de réalisation, les loci de chaîne légère d'immunoglobuline humaine comprennent au moins un segment de région constante de chaîne légère. Dans certains modes de réalisation, les loci de chaîne légère d'immunoglobuline humaine comprennent un segment VL de chaîne légère, un segment JL de chaîne légère et un segment de région constante de chaîne légère.
Dans certains modes de réalisation, le locus du gène de l'immunoglobuline de lignée germinale est un locus de gène d'immunoglobuline humaine. Dans certains modes de réalisation, le locus du gène de l'immunoglobuline de ligne germinale est identique au moins à 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% à la région correspondante d'un acide nucléique naturel provenant d'un être humain.
Dans certains modes de réalisation, les animaux transgéniques ou de préférence transchromosomiques sont génétiquement modifiés de sorte qu'ils produisent des taux réduits d'anticorps endogènes (par exemple bovins) ou ne produisent pas d'anticorps endogènes (par exemple bovins). Dans certains modes de réalisation, les animaux transgéniques ou de préférence transchromosomiques ont une mutation qui réduit ou élimine l'expression d'anticorps endogènes ou un isotype particulier d'anticorps endogènes. Dans certains modes de réalisation, la mutation réduit ou élimine l'expression de la chaîne lourde IgM fonctionnelle. Dans certains modes de réalisation, les animaux transgéniques ou de préférence transchromosomiques ont une mutation qui réduit ou élimine l'expression de la chaîne légère d'anticorps fonctionnel. Dans certains modes de réalisation, l'animal transgénique a une mutation qui réduit ou élimine l'expression de la chaîne lourde IgM fonctionnelle et de la chaîne légère fonctionnelle d'Ig.
Les animaux transchromosomiques pouvant être utilisés dans les procédés décrits ici ainsi que les procédés pour produire de tels animaux transchromosomiques utilisant des chromosomes artificiels sont connus dans la technique. Voir, par exemple, les brevets US 7 074 983; US 7 652 192 et US 9 315 824.
Ce procédé permet de produire des populations isolées d'anticorps qui se lient à différents immunogènes viraux. Les populations d'anticorps qui se lient à l'un quelconque des immunogènes décrits ici peuvent être combinées dans une composition à condition que les populations soient différentes (non identiques). Dans certains modes de réalisation, les populations d'anticorps sont des anticorps humains, tels que des anticorps humains qui sont produits de manière transgénique chez un mammifère non humain, comme décrit ici.
Dans certains modes de réalisation, les populations isolées d'anticorps sont préparées par immunisation d'un mammifère non humain (par exemple bovin) avec au moins deux ou trois immunogènes viraux différents. Les populations peuvent ensuite être isolées à partir d'un échantillon (par exemple, un liquide corporel, tel que sang, urine, lait) collecté à partir du mammifère non humain. Dans certains modes de réalisation, plus d'un mammifère non humain transgénique est immunisé avec un immunogène viral. Dans certains modes de réalisation, au moins deux ou trois mammifères non humains transgéniques sont chacun immunisés avec un immunogène viral différent, de sorte que chaque mammifère non humain transgénique produit une population d'anticorps qui se lie à un immunogène viral. Les populations peuvent ensuite être isolées à partir d'échantillons collectés à partir de chacun des mammifères non humains et ensuite combinées pour former une composition de combinaison.
L'isolement des populations d'immunoglobulines dirigées spécifiquement contre les virus d'intérêt peut être réalisé en mettant en œuvre une chromatographie d'immunoaffinité, comme décrit plus haut. Avantageusement, et comme décrit en détails plus haut, on utilise pour cela une matrice sur laquelle au moins une protéine virale, ou un fragment antigénique de celle-ci, est fixée.
Compositions pharmaceutiques et traitements
L'invention fournit également une composition pharmaceutique comprenant une composition d'immunoglobulines telle que décrite plus haut, en association avec au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable. Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, la composition pharmaceutique peut être administrée par toute voie d'administration, par exemple : oculaire, nasale, intra-auriculaire, orale, sublinguale, pulmonaire, intrapéritonéale, intraveineuse, percutanée, sous-cutanée, intramusculaire, transmuqueuse, vaginale, rectale.
La composition est généralement concentrée, en ce qu'elle comprend des immunoglobulines à des concentrations comprises entre 50 et 100 g/1. Ces concentrés sont destinés à un usage clinique et peuvent en particulier être injectés par voie intraveineuse. A cet effet, ils doivent être sécurisés et, le cas échéant, contenir des excipients, tels que des stabilisants, compatibles avec cet usage clinique.
Il est ici décrit des méthodes de traitement ou de prévention d'une infection virale chez un sujet impliquant l'administration de compositions en une quantité thérapeutiquement efficace. L'invention fournit une "multi-thérapie" en traitant ou en empêchant l'infection avec plus d'un virus en fournissant des populations d'immunoglobulines qui se lient à différents immunogènes viraux. Dans certains modes de réalisation, les méthodes de traitement impliquent l'administration au sein d'une même composition, d'au moins deux ou trois populations d'anticorps qui se lient à différents immunogènes viraux, qui peuvent être utilisés pour traiter ou prévenir une infection par au moins deux ou trois, virus ou souches virales.
Le sujet ou patient est de préférence un humain, mais il peut aussi s'agir d'un animal, de préférence un mammifère, par exemple un animal de compagnie (chien ou chat par exemple), un cheval, un bovin, un ovin, etc. Il peut encore s'agir d'un animal qui représente un hôte pour le virus, par exemple un singe.
Dans le contexte de l'invention, le terme «traitement » signifie soulager ou atténuer au moins un symptôme associé à une infection, ou ralentir ou inverser la progression de l'infection. Par exemple, en liaison avec une infection virale, le terme «traitement» peut signifier éliminer ou réduire la charge virale, ou inhiber ou réduire un ou plusieurs symptômes de l'infection. Le terme «prévention» inclut l'administration d'une composition à un sujet pour réduire ou retarder le début de la manifestation de symptômes cliniques ou subcliniques, de complications, de pathologies ou de troubles biochimiques d'une maladie ou d'une infection, ou pour réduire ou inhiber la propagation/transmission d'un virus. Une telle administration avant l'infection, l'exposition ou le risque d'exposition au virus peut être appelée administration prophylactique.
Dans certains modes de réalisation, le sujet est un humain qui a été diagnostiqué avec une infection par l'un quelconque des virus décrits ici. Dans certains modes de réalisation, le sujet présente au moins l'un des symptômes cliniques associés à l'infection avec l'un quelconque des virus décrits ici. Dans certains modes de réalisation, le sujet est un humain qui est à risque d'infection, par exemple, le sujet peut avoir été exposé à un virus ou habiter ou avoir voyagé dans une zone géographique dans laquelle le virus est endémique. Dans certains modes de réalisation, le sujet est considéré comme étant à risque d'infection ou risque d'être infecté, par exemple parce que le sujet est immunodéprimé ou immuno logiquement immature.
Les compositions de l'invention peuvent en particulier être utilisées pour l'immunoprophylaxie chez des patients non infectés mais à risque : enfants, nourrissons, personnes hospitalisées, personnes immunodéprimées, personnes âgées.
Avantageusement, les compositions selon l'invention permettent la réduction significative de la charge virale, normée par rapport à une référence connue, chez le patient traité.
Elles peuvent en outre avantageusement provoquer la destruction des cellules infectées via le recrutement de cellules effectrices grâce aux fonctions ADCC des immunoglobulines de la composition.
Dans certains modes de réalisation, les compositions de l'invention sont utiles pour traiter ou prévenir une infection par un flavivirus (par exemple le virus Zika, le virus de la fièvre jaune, le virus de la dengue). Les flavivirus peuvent causer une variété de symptômes lors de l'infection d'un sujet, dont malaise; légère fièvre; éruption cutanée (exanthème) sur le visage, le cou, les bras; mal de tête; sensibilité à la lumière; douleur articulaire non inflammatoire; conjonctivite; manque d'appétit; diarrhée; douleur abdominale; et/ou vertiges. La sévérité et la durée des symptômes associés à l'infection par flavivirus peuvent varier, par exemple, en fonction du flavivirus spécifique provoquant l'infection et de l'un quelconque d'un grand nombre de facteurs hôtes. L'infection par le virus Zika pendant la grossesse a été associée à une microcéphalie chez le foetus/nouveau-né. Le virus de la dengue, agent causal de la dengue et de la dengue hémorragique, peut entraîner une fièvre élevée, des maux de tête sévères, des douleurs articulaires et musculaires sévères, de la fatigue, des nausées, des vomissements, des éruptions cutanées, des chocs, des saignements. La fièvre jaune, transmise par le virus de la fièvre jaune, provoque également des symptômes pouvant être graves, y compris fièvre, maux de tête, douleurs musculaires, nausées, vomissements, jaunisse, diminution de la miction, délire, arythmies, saignements, convulsions et/ou un coma.
Le diagnostic d'une infection par flavivirus chez des sujets exposés à un flavivirus suspecté d'être infecté ou susceptible d'être exposé à un flavivirus peut impliquer la détection de la présence d'anticorps spécifiques de virus et/ou des tests moléculaires détectant le virus, tels que la PCR ou la PCR en temps réel, par exemple à partir d'échantillons de sang ou de salive d'un sujet. Dans certains modes de réalisation, les compositions décrites ici sont utilisées pour traiter ou prévenir une infection par un virus respiratoire. L'infection par un virus respiratoire peut inclure n'importe lequel d'un certain nombre de symptômes basés, par exemple, sur la partie du tractus respiratoire qui est affectée par l'infection (l'infection virale et/ou la réponse immunitaire à l'infection virale). Par exemple, l'infection par le virus respiratoire peut affecter les voies respiratoires supérieures, les voies respiratoires inférieures, ou les deux. Dans certains modes de réalisation, les compositions de l'invention comprenant des immunoglobulines dirigées contre au moins un virus respiratoire, sont utiles pour traiter ou prévenir une infection virale respiratoire telle qu'une bronchiolite, une pneumonie, une grippe, un croup (laryngo -trachéite aiguë) et/ou une bronchite. Elles peuvent être particulièrement utiles en traitement curatif par administration précoce. De manière avantageuse, elles peuvent permettre de ralentir et/ou d'empêcher la diffusion de l'infection des voies respiratoires hautes vers les voies respiratoires basses. L'infection respiratoire du virus peut inclure des symptômes tels que la congestion, le nez qui coule, la toux, les éternuements, la fièvre, le mal de gorge, la difficulté à respirer et la fatigue et le malaise général. L'infection respiratoire du virus est habituellement diagnostiquée par l'observation de la présentation des symptômes, des tests fonctionnels pulmonaires, de la détection du virus, par exemple à partir d'échantillons nasopharyngés, d'écouvillons de gorge et/ou d'expectorations.
Dans certains modes de réalisation, la composition comprend en outre un adjuvant, ou est administrée en combinaison avec un adjuvant, de manière simultanée ou séquentielle.
La posologie peut être ajustée de manière appropriée pour atteindre les niveaux souhaités de chacune des populations d'immunoglobulines, local ou systémique, selon le mode d'administration.
Les exemples suivants illustrent l'invention sans en limiter la portée. EXEMPLE 1 : Préparation d'une composition d'Ig multivalente anti-hRSV, anti-hMPV et anti-hPIV3
1. Enrichissement en Ig anti-hRSV, Ig anti-hMPV, et Ig anti-hPIV3 à partir de fractions plasmatiques Dans cet exemple, l'échantillon utilisé est une fraction plasmatique issue du procédé de purification d'immunoglobulines tel que décrit dans la demande de brevet WO02092632. Le procédé de purification comprend les étapes suivantes :
Récupération d'une fraction Ι+Π+ΠΙ, obtenue à partir de plasma sanguin traité à l'éthanol
Précipitation à l'acide caprylique
- Traitement solvant-détergent (Triton/TnBP)
Chromatographie échangeuse d' anions (TMAE) à pH basique
L'éluat de la chromatographie échangeuse d'anions à pH basique est ensuite soumis à une chromatographie d'immunoaffinité, comme décrit ci-dessous.
1.1. Chromatographie d'affinité anti-hRSV (protéine F) On utilise comme ligand d'affinité deux versions de la protéine RSV-F ; d'une part la protéine F en conformation post-fusion 11049-V08B (Sino Biological Inc), protéine synthétique issue d'une séquence ADN du hRSV (RSS-2) de la Met 1 à la Thr 529, contenant 518 acides aminés après clivage du propeptide et dont la masse moléculaire prédite est de 58kDa et d'autre part la même protéine mais stabilisée en conformation pré-fusion décrite dans la publication McLellan et al, SCIENCE, 2013, 342(6158):592-8 et produite en cellule HEK293F dont la masse apparente en SDS PAGE-Western Blot est de 58 Kda .
2mL de gel de sépharose activée (« NHS-activated sepharose 4 Fast Flow ») sont mis en place dans une colonne de chromatographie de diamètre 1.1cm et les tampons utilisés sont ceux recommandés par le fournisseur du gel. Après lavage (ImM HCL à 4°C) et équilibrage en tampon de couplage, 1,98 mg de protéine F à greffer sont ajoutées au gel et l'ensemble est mis en agitation. Le blocage des groupements réactifs sur le gel est réalisé en ajoutant 6 mL de tampon 0.5M ethano lamine, 0.5M NaCl, pH 8.3 (6mL), et le gel est mis en agitation pendant 12h. Le gel couplé est lavé avec une alternance de 3 volumes de tampons basique puis acide : 0.1M Tris-HCl pH 8.4 et 0.1M acétate, 0.5M NaCl pH 4, ce cycle étant répété trois fois. Le gel est ensuite stocké en tampon lOmM citrate, 0.5M NaCl, 0.1 g L azide de sodium pH 6.6. Le couplage a été évalué à 98%, correspondant à une densité de ligand de 0,89mg/mL de gel greffé.
L'échantillon est équilibré dans le tampon d'injection en y ajoutant une solution concentrée de tampon de NaCl et de citrate trisodique qsp 0,05M NaCl et 0,01M Citrate trisodique. Le produit est ensuite passé sur la colonne durant 33min (temps de contact). Après lavage, Pélution est réalisée en tampon 0, 1M glycine, 30% propylène glycol à pH 2,57. L'éluat est immédiatement neutralisé par du tampon 1M Tris-HCl pH 9 pour en remonter le pH à environ 6. Le gel est alors passé en régénération afin de décrocher les Ig non éluées avec un tampon 6M guanidine pH 6. La fraction récupérée est aussi neutralisée par l'ajout de 1M Tris-HCl pH9 pour en remonter le pH à 6.
1.2. Chromatographie d'affinité anti-hRSV (protéine G)
Alternativement, ou en complément, on utilise comme ligands d'affinité la protéine RSV-G souche A (ref 11070-V08H2, SB), protéine synthétique issue d'une séquence ADN du hRSV (souche rsbl734) de la Asn 66 à l'Arg 297, contenant 242 acides aminés après clivage du propeptide et dont la masse moléculaire prédite est de 26,3kDa. En analyse SDS-PAGE et conditions réductrice, la masse moléculaire apparente est comprise du fait d'une importante glycosylation entre 60 kDa et 90 kDa.
souche B (ref 13029-VO8H, SB), protéine synthétique issue d'une séquence ADN du hRSV (souche 036633-1) de l'His 67 à l'Ala 299, contenant 244 acides aminés après clivage du propeptide et dont la masse moléculaire prédite est de 27kDa. En analyse SDS-PAGE et conditions réductrice, la masse moléculaire apparente est comprise du fait d'une importante glycosylation entre 80 kDa et 90 kDa.
Le couplage est réalisé selon le même protocole que celui utilisé à la section 1.1.
Trois colonnes sont réalisées :
gel G- A, correspondant à une densité de Protéine G souche A de 1 mg/mL de gel greffé, gel G-B, correspondant à une densité de Protéine G souche B de 1 mg/mL de gel greffé, gel G-AB, correspondant à un mélange 50%> gel G-A et 50%> gel G-B.
Le design de l'expérience a en outre permis de constater que les IgG anti-RSV purifiés sur le variant A de la protéine G interagissaient également avec le variant B de la protéine G et inversement laissant penser qu'il existe une réactivité croisée entre les anticorps polyclonaux anti-RSV pour les deux variants de la protéine G.
Une forte proportion des immunoglobulines anti-RSV se fixe au support de chromatographie par affinité à la protéine hRSV-G, quelle que soit la souche, ce qui représente dans cet essai au moins 6^g d'irnrnunoglobulines anti-RSV par mL de gel. La fraction non adsorbée et la fraction de lavage sont appauvries en immunoglobulines anti-RSV. La fraction d'irnrnunoglobulines éluées du support à pH acide et en présence de Propylène glycol montre un enrichissement minimum de 109 fois en immunoglobulines anti-RSV.
L'essai montre que la chromatographie d'affinité utilisant un ligand protéine G de souches A ou B greffées via une chimie NHS permet la purification d'immunoglobulines anti-RSV avec un rendement d'au moins 26,2% dans les conditions testées, correspondant à un facteur d'enrichissement minimum de 109 fois. La composition obtenue après chromatographie d'affinité sur ligand protéine G en comprend donc au moins 30% en poids d'immunoglobulines dirigées spécifiquement contre au moins un épitope de la protéine G.
1.3. Chromatographie d'affinité anti-hMPV
On utilise comme ligand d'affinité soit la protéine F (numéro d'accès Genbank: Q6WB98) produite en cellule HEK293F avec les modifications post-traductionnelles requises ou alternativement un virus hMPV entier inactivé DAG201 produit sous forme de lysat cellulaire. 2mL de gel de sépharose activée (« NHS activated sepharose 4 fast flow ») sont mis en place dans une colonne de chromatographie de diamètre 1.1cm et les tampons utilisés sont ceux recommandés par le fournisseur du gel. Après lavage (ImM HCL à 4°C) et équilibrage en tampon de couplage, 1,98 mg de protéine F ou 5 mg de virus inactivé à greffer sont ajoutées au gel et l'ensemble est mis en agitation. Le blocage des groupements réactifs sur le gel est réalisé en ajoutant 6 mL de tampon 0.5M éthanolamine, 0.5M NaCl, pH 8.3 (6mL), et le gel est mis en agitation pendant 12h. Le gel couplé est lavé avec une alternance de 3 volumes de tampons basique puis acide : 0.1M Tris-HCl pH 8.4 et 0.1M acétate, 0.5M NaCl pH 4, ce cycle étant répété trois fois. Le gel est ensuite stocké en tampon lOmM citrate, 0.5M NaCl, 0.1 g/L azide de sodium pH 6.6.
L'échantillon est équilibré dans le tampon d'injection en y ajoutant une solution concentrée de tampon de NaCl et de citrate trisodique qsp 0,05M NaCl et 0,01 M Citrate trisodique. Le produit est ensuite passé sur la colonne durant 3.3min (temps de contact). Après lavage, l'élution est réalisée en tampon 0,1M glycine, 30% propylène glycol à pH 2,57. L'éluat est immédiatement neutralisé par du tampon 1M Tris-HCl pH 9 pour en remonter le pH à environ 6. Le gel est alors passé en régénération afin de décrocher les Ig non éluées avec un tampon 6M guanidine pH 6. La fraction récupérée est aussi neutralisée par l'ajout de 1M Tris-HCl pH9 pour en remonter le pH à 6. 1.4.Chromatographie d'affinité anti-hPIV3
On utilise comme ligand d'affinité soit la protéine hemagglutinine-neuraminidase (HN) (numéro d'accès Genbank : J7ENP1) produite en cellule HEK293F avec les modifications post- traductionnelles requises, soit un virus hPIV3 entier inactivé (DAG-H10373) produit sous forme de lysat cellulaire.
2mL de gel « NHS-activated sepharose 4 Fast Flow » sont mis en place dans une colonne de chromatographie de diamètre 1.1cm et les tampons utilisés sont ceux recommandés par le fournisseur du gel. Après lavage (ImM HCL à 4°C) et équilibrage en tampon de couplage, 1,98 mg de protéine FIN ou 5 mg de virus inactivé à greffer sont ajoutées au gel et l'ensemble est mis en agitation. Le blocage des groupements réactifs sur le gel est réalisé en ajoutant 6 mL de tampon 0.5M ethanolamine, 0.5M NaCl, pH 8.3 (6mL), et le gel est mis en agitation pendant 12h. Le gel couplé est lavé avec une alternance de 3 volumes de tampons basique puis acide : 0.1M Tris-HCl pH 8.4 et 0.1M acétate, 0.5M NaCl pH 4, ce cycle étant répété trois fois. Le gel est ensuite stocké en tampon lOmM citrate, 0.5M NaCl, O.lg/L azide de sodium pH 6.6.
L'échantillon est équilibré dans le tampon d'injection en y ajoutant une solution concentrée de tampon de NaCl et de citrate trisodique qsp 0,05M NaCl et 0,01 M Citrate trisodique. Le produit est ensuite passé sur la colonne durant 3.3min (temps de contact). Après lavage, l'élution est réalisée en tampon 0,1M glycine, 30% propylène glycol à pH 2,57. L'éluat est immédiatement neutralisé par du tampon 1M Tris-HCl pH 9 pour en remonter le pH à environ 6. Le gel est alors passé en régénération afin de décrocher les Ig non éluées avec un tampon 6M guanidine pH 6. La fraction récupérée est aussi neutralisée par l'ajout de 1M Tris-HCl pH9 pour en remonter le pH à 6.
2. Préparation d'anticorps anti-hRSV à partir d'animaux transchromosomiques
Dans un mode de réalisation alternatif, on produit des anticorps anti-RSV à partir d'animaux transchromosomiques. Des vaches transchromosomiques capables de produire des anticorps humains peuvent être obtenues par la technique des chromosomes artificiels humains (HAC, pour « human articifïal chromosomes ») décrite par exemple dans le brevet US9,315,824, qui fait lui-même référence aux méthodes décrites dans les articles Kuroiwa et al., Nat. Biotechnol. 18: 1086-1090, 2000, Kuroiwa et al, Nat. Biotechnol. 20: 889-894, 2002 et Kuroiwa et al, Nat. Biotechnol. 27: 173-181, 2009. Des exemples de fragments HAC comprenant des gènes des chaînes lourdes et légères d'immunoglobulines humaines sont décrits dans Tomizuka et al., Proceeding of the National Academy of Sciences, 97, 722-727, 2000, WO98/037757, Kuroiwa et al, Nature Biotechnology, 18, 1086-1090, 2000, WO00/010383, Kuroiwa et al, Nature Biotechnology, 27, 173-181, 2009, WO09/111.086.
Les vaches transchromosomiques produites sont en outre incapables de générer des chaînes lourdes d'IgM (vaches KcHAC/IGHM"7" IGHMLl"7").
On peut alors immuniser les vaches transchromosomiques KcHAC/IGHM"7" IGHMLl"7" avec des antigènes du virus RSV (de préférence la protéine F et/ou la protéine G). Les IgG humaines spécifiques des antigènes RSV générées sont purifiées en utilisant une chromato graphie d'immunoaffinité, selon le principe décrit à la section 1 ci-dessus, en fixant sur la matrice d'immunoaffinité les mêmes antigènes RSV que ceux utilisés pour l'immunisation.
Ces anticorps anti-RSV produits à partir d'animaux transchromosomiques peuvent être utilisés en combinaison avec des Ig anti-hMPV, et anti-hPIV3, comme décrit ci-dessous.
3. Production d'anticorps anti-hMPV, à partir d'animaux transchromosomiques
De la même manière, il est possible d'immuniser les vaches transchromosomiques KcHAC/IGHM"7" IGHMLl"7" avec des antigènes du virus hMPV, soit la protéine F soit le virus inactivé, comme décrit dans Kuroiwa et al., Nat. Biotechnol. 27: 173-181, 2009. Les IgG humaines spécifiques des antigènes hMPV générées sont purifiées à partir de prélèvements sanguins des vaches, et en utilisant une chromatographie d'immunoaffinité, selon le principe décrit à la section 1.
4. Production d'anticorps anti-hPIV3, à partir d'animaux transchromosomiques
De la même manière, on immunise les vaches transchromosomiques KcHAC/IGHM"7" IGHMLl"7" avec des antigènes du virus PIV3. Les IgG humaines spécifiques des antigènes PIV3 générées sont purifiées en utilisant une chromatographie d'immunoaffinité, selon le principe décrit à la section 1, en fixant sur la matrice d'immunoaffinité les mêmes antigènes PIV3 que ceux utilisés pour l'immunisation.
5. Mélange des populations d'anticorps
Les anticorps anti-hRSV, anti-hMPV et anti-hPIV3 obtenus aux sections 1 à 4 ci-dessus sont mélangés dans une proportion égale, et formulés au sein d'une composition pharmaceutique. EXEMPLE 2: Préparation d'une composition d'Ig multivalente anti-RSV, anti-BKV, et anti-CMV
Dans cet exemple, on mélange des Ig humaines spécifiques des virus RSV telles que préparées à l'exemple 1.1.1 ou 1.1.2, avec des Ig humaines anti-CMV et anti-BKV. Ces dernières sont obtenues comme décrit à l'exemple 1, section 1, mais en remplaçant l'antigène de RSV par un antigène de CMV ou de BKV.
EXEMPLE 3: Préparation d'une composition d'Ig multivalente anti-Zika, anti-Dengue, et anti-fièyre jaune
3.1. Dans cet exemple, on prépare des anticorps polyclonaux humains anti-Zika, anti-Dengue et anti-fièvre jaune, en immunisant des vaches transchromosomiques KcHAC/IGHM~ ~ IGHML1 ~ ~ avec des antigènes du virus de Zika, de la dengue et de la fièvre jaune, simultanément, et en récupérant les anticorps produits, par purification sur une même colonne d'immunoaffinité, sur laquelle sont fixés les trois antigènes viraux (respectivement des virus Zika, de la dengue, et de la fièvre jaune).
3.2. Dans un autre exemple, on prépare des anticorps polyclonaux humains anti-Zika, anti- Dengue et anti-fièvre jaune, en immunisant des vaches transchromosomiques KcHAC/IGHM" /_ IGHML1 ~ ~ avec des antigènes du virus de Zika, de la dengue et de la fièvre jaune, chaque vache étant immunisée avec un seul antigène. On récupère les anticorps produits, par purification sur colonne d'immunoaffinité, sur laquelle est fixé chaque antigène (respectivement des virus Zika, de la dengue, et de la fièvre jaune). Les trois populations d'anticorps anti-Zika, anti-Dengue et anti-fièvre jaune purifiées séparément, sont ensuite mélangées dans des proportions égales.
EXEMPLE 4 : Préparation d'une composition d'Ig multivalente anti-hRSV et anti-HBV
4.1 Chromatographie d'affinité anti-hRSV (protéine F)
La méthode de préparation des anti-RSV (protéine F) décrite dans l'Exemple 1 peut également être utilisée. 4.2 Chromatographie d'affinité anti-HBV
On utilise comme ligand d'affinité un mélange d'antigènes du virus de l'hépatite B :
antigènes HBs ( S, pré-Sl, pré-S2) tel que celui fourni par SciVac 4mL de gel de sépharose activée (« NHS-activated sepharose 4 Fast Flow ») sont mis en place dans une colonne de chromatographie de diamètre 1.1cm et les tampons utilisés sont ceux recommandés par le fournisseur du gel. Après lavage aveclmM HCL à 4°C, et équilibrage en tampon de couplage (200mM Bicarbonate de sodium à pH=8), 4,8ml d'antigène HBs à greffer sont ajoutés au gel et l'ensemble est mis sous agitation pendant 16h à 4°C. Le blocage des groupements réactifs sur le gel est réalisé en ajoutant 8 mL de tampon Tris lOOmM, pH= 8,3 et le gel est mis sous agitation pendant 4h à 4°C. Le gel couplé est lavé ensuite 3 fois avec 8 ml de tampon PBS. Le gel est ensuite stocké en tampon lOmM citrate, 0.5M NaCl, O. lg/L acide de sodium pH 6.6.
Le couplage est à 75%, correspondant à une densité de ligand de 0,7mg/mL de gel greffé et une capacité estimée à 63650 mUI d'anti-HBV/ml.
L'échantillon (Immunoglbuline normale à 50g/L) est dialysé contre du tampon PBS. La capture est réalisée en système ouvert, 40ml d'échantillon est incubé avec la résine pendant 30min. La fraction de l'échantillon non retenue est séparée de la résine par une centrifugation de 2 min à 500g. Cette étape est utilisée pour chaque lavage et pour l'élution. La résine est ensuite lavée 3 fois par 5 ml de PBS. Les Immunoglobulines hyper-enrichies anti-HBV sont ensuite éluées par 5ml de tampon 4M MgC12. Un échange de tampon est ensuite réalisé sur PD10 (G25) en PBS et l'échantillon est concentré à lmg/ml sur cellule Amicon Ultra 10.
4.3 Mélange des populations d'anticorps
Les anticorps anti-hRSV et anti-HBV obtenus aux sections 4.1 et 4.2 ci-dessus sont mélangés dans une proportion égale, et formulés au sein d'une composition pharmaceutique.
4.4 Vérification de l'activité biologique
Leur capacité à neutraliser au sein d'une même composition les virus RSV et HBV peut être vérifiée avec des tests de neutralisation différents pour chacun des virus.
Pour RSV : Afin de mesurer la capacité d'inhibition de l'infection virale par les fractions obtenues, une souche virale hRSV(18)-cherry3 contenant un gène rapporteur codant pour une protéine fluorescente est utilisée sur une lignée de cellules Hep2. L'intensité de la fluorescence est directement représentative de la réplication virale. La veille du test, les cellules sont repiquées en plaque de 96 puits à 0.5xl06cellules/mL et incubées à 37°C sous 7% C02. Le jour du test, les anticorps monoclonaux témoins positifs (SynagisTM, solution d'anticorps monoclonaux dirigés contre le RSV) et négatifs (solution d'anticorps monoclonaux irrelevants) ainsi que les fractions à tester sont diluées en milieu MEM et ΊΟμΙ, sont déposés en puits de plaque de 96 puits. Le virus est de même dilué en milieu MEM au l/25ème et 70μΕ sont déposés dans les puits contenant les solutions d'anticorps. L'homogénéisation est faite par aspiration/refoulement. Le mélange est alors incubé pendant lh à 37°C sous 7% de C02. Pour l'infection des cellules, le surnageant cellulaire est aspiré, ΙΟΟμί du mélange Ig/virus sont rapidement déposés et l'incubation est réalisée à 37°C sous 7% C02 pendant 36 à 48 heures. La révélation se fait par mesure de la fluorescence en excitant à 580nm et en lisant à 620nm. Les valeurs sont normalisées par rapport au témoin « 100% infection » où le virus est mis seul en contact avec les cellules, et le témoin « 0% infection » correspond aux cellules mises en contact avec le milieu MEM seul. La détermination d'une IC50 est réalisée en exploitant les courbes de doses-réponses en fonction des concentrations d'anticorps. Pour HBV :
Des cellules Huh-106 sont inoculées avec le virus HBV w (MOI: 500ge) en présence d'une concentration d'anti-HBV comprise entre 0,5 / 5 / 50 /500 et 5000 ng/ml.
Le surnageant cellulaire est récupéré 9 jours après l'inoculation. L'IC90 permettant d'avoir 90 % de neutralisation est calculé à partir du taux de virus dosé par Northern Blot.

Claims

Revendications
1. Composition d'immunoglobulines hyper-enrichie en au moins deux populations d'immunoglobulines, chaque population consistant en des immunoglobulines dirigées spécifiquement contre un virus distinct.
2. Composition d'immunoglobulines selon la revendication 1, comprenant au moins 10%, de préférence au moins 20%, au moins 30%>, au moins 40%>, en poids de chacune desdites populations.
3. Composition d'immunoglobulines selon la revendication 1 ou 2, dans laquelle une desdites populations consiste en des immunoglobulines dirigées spécifiquement contre un virus choisi parmi le metapneumo virus (MPV), le virus parainfluenza 3, le virus Zika, le virus de la dengue, le virus de la fièvre jaune, le cytomégalovirus (CMV), le virus BK (BKV), et un virus influenza.
4. Composition d'immunoglobulines selon l'une des revendications 1 à 3, comprenant trois ou quatre populations d'immunoglobulines, chaque population consistant en des immunoglobulines dirigées spécifiquement contre un virus distinct.
5. Composition d'immunoglobulines selon la revendication 4, dans laquelle une première desdites populations consiste en des immunoglobulines dirigées spécifiquement contre le virus RSV humain, une deuxième desdites populations consiste en des immunoglobulines dirigées spécifiquement contre le virus MPV humain, et une troisième desdites populations consiste en des immunoglobulines dirigées spécifiquement contre le virus parainfluenza de type 3 humain.
6. Composition d'immunoglobulines selon la revendication 4, dans laquelle une première desdites populations consiste en des immunoglobulines dirigées spécifiquement contre le virus Zika, une deuxième desdites populations consiste en des immunoglobulines dirigées spécifiquement contre le virus de la dengue, et une troisième desdites populations consiste en des immunoglobulines dirigées spécifiquement contre le virus de la fièvre jaune.
7. Composition d'immunoglobulines selon la revendication 4, dans laquelle une première desdites populations consiste en des immunoglobulines dirigées spécifiquement contre le virus RSV humain, une deuxième desdites populations consiste en des immunoglobulines dirigées spécifiquement contre le virus BKV humain, et une troisième desdites populations consiste en des immunoglobulines dirigées spécifiquement contre le virus CMV.
8. Composition d'immunoglobulines selon la revendication 1 ou 2, dans laquelle les immunoglobulines utilisées sont dirigées contre une protéine de surface du virus visé qui joue un rôle dans les mécanismes d'infection, notamment au cours de la reconnaissance, de la liaison de la particule virale à sa cellule hôte, de la fusion de la particule virale à sa cellule hôte ou de la propagation du virus de cellule hôte à cellule hôte.
9. Composition pharmaceutique comprenant une composition d'immunoglobulines selon l'une des revendications 1 à 8, en association avec au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable.
10. Composition pharmaceutique selon la revendication 9, pour une utilisation dans le traitement d'une infection virale.
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WO (1) WO2018178593A1 (fr)

Citations (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4764369A (en) 1983-07-14 1988-08-16 New York Blood Center Inc. Undenatured virus-free biologically active protein derivatives
WO1994029334A1 (fr) 1993-06-14 1994-12-22 Association Pour L'essor De La Transfusion Sanguine Dans La Region Du Nord Concentre d'immunoglobulines g a usage therapeutique et procede de production dudit concentre
WO1998037757A1 (fr) 1997-02-28 1998-09-03 Kirin Beer Kabushiki Kaisha Cellules multipotentes comprenant des genes intrinseques dissocies
WO1999064462A1 (fr) 1998-06-09 1999-12-16 Statens Serum Institut Procede de production d'immunoglobulines destinees a une administration intraveineuse et d'autres produits d'immunoglobulines
WO2000010383A1 (fr) 1998-08-21 2000-03-02 Kirin Beer Kabushiki Kaisha Procede de modification des chromosomes
WO2002092632A1 (fr) 2001-05-11 2002-11-21 Laboratoire Francais Du Fractionnement Et Des Biotechnologies Procede de preparation de concentres d'immunoglobulines humaines a usage therapeutique
US7074983B2 (en) 1999-11-19 2006-07-11 Kirin Beer Kabushiki Kaisha Transgenic bovine comprising human immunoglobulin loci and producing human immunoglobulin
WO2009111086A1 (fr) 2008-03-07 2009-09-11 Kirin Pharma Kabushiki Kaisha Mammifères transgéniques non humains avec une chaîne légère kappa d’immunoglobuline xénogénique
WO2009120306A1 (fr) * 2008-03-25 2009-10-01 Trustees Of Boston University Vecteur de vaccin multivalent dans le traitement et l’inhibition d’infection virale
US7652192B2 (en) 2001-02-23 2010-01-26 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Cloning of transgenic unglulates comprising artificial chromosomes
WO2010093335A1 (fr) * 2009-02-10 2010-08-19 Nanyang Technological University Anticorps destinés au diagnostic et au traitement d'infections flavivirales
US20110150904A1 (en) * 2005-07-25 2011-06-23 Avianax, Llc Therapeutic Antibodies for Treatment and Prophylaxis of Transmittable Viral Diseases
US9315824B2 (en) 2009-11-17 2016-04-19 Sab, Llc Human artificial chromosome vector
US9412547B2 (en) 2011-12-21 2016-08-09 Siemens Aktiengesellschaft Contactor

Patent Citations (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4764369A (en) 1983-07-14 1988-08-16 New York Blood Center Inc. Undenatured virus-free biologically active protein derivatives
WO1994029334A1 (fr) 1993-06-14 1994-12-22 Association Pour L'essor De La Transfusion Sanguine Dans La Region Du Nord Concentre d'immunoglobulines g a usage therapeutique et procede de production dudit concentre
EP0703922A1 (fr) 1993-06-14 1996-04-03 Association Pour L'essor De La Transfusion Sanguine Dans La Region Du Nord Concentre d'immunoglobulines g a usage therapeutique et procede de production dudit concentre
WO1998037757A1 (fr) 1997-02-28 1998-09-03 Kirin Beer Kabushiki Kaisha Cellules multipotentes comprenant des genes intrinseques dissocies
WO1999064462A1 (fr) 1998-06-09 1999-12-16 Statens Serum Institut Procede de production d'immunoglobulines destinees a une administration intraveineuse et d'autres produits d'immunoglobulines
WO2000010383A1 (fr) 1998-08-21 2000-03-02 Kirin Beer Kabushiki Kaisha Procede de modification des chromosomes
US7074983B2 (en) 1999-11-19 2006-07-11 Kirin Beer Kabushiki Kaisha Transgenic bovine comprising human immunoglobulin loci and producing human immunoglobulin
US7652192B2 (en) 2001-02-23 2010-01-26 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Cloning of transgenic unglulates comprising artificial chromosomes
WO2002092632A1 (fr) 2001-05-11 2002-11-21 Laboratoire Francais Du Fractionnement Et Des Biotechnologies Procede de preparation de concentres d'immunoglobulines humaines a usage therapeutique
US20110150904A1 (en) * 2005-07-25 2011-06-23 Avianax, Llc Therapeutic Antibodies for Treatment and Prophylaxis of Transmittable Viral Diseases
WO2009111086A1 (fr) 2008-03-07 2009-09-11 Kirin Pharma Kabushiki Kaisha Mammifères transgéniques non humains avec une chaîne légère kappa d’immunoglobuline xénogénique
WO2009120306A1 (fr) * 2008-03-25 2009-10-01 Trustees Of Boston University Vecteur de vaccin multivalent dans le traitement et l’inhibition d’infection virale
WO2010093335A1 (fr) * 2009-02-10 2010-08-19 Nanyang Technological University Anticorps destinés au diagnostic et au traitement d'infections flavivirales
US9315824B2 (en) 2009-11-17 2016-04-19 Sab, Llc Human artificial chromosome vector
US9412547B2 (en) 2011-12-21 2016-08-09 Siemens Aktiengesellschaft Contactor

Non-Patent Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
COHN ET AL., J. AM. CHEM. SOC., vol. 68, 1946, pages 459
KAZUKI ET AL., MOL. THER., vol. 19, no. 9, 2011, pages 1591 - 1601
KUROIWA ET AL., NAT. BIOTECHNOL., vol. 18, 2000, pages 1086 - 1090
KUROIWA ET AL., NAT. BIOTECHNOL., vol. 20, 2002, pages 889 - 894
KUROIWA ET AL., NAT. BIOTECHNOL., vol. 27, 2009, pages 173 - 181
KUROIWA ET AL., NATURE BIOTECHNOLOGY, vol. 18, 2000, pages 1086 - 1090
KUROIWA ET AL., NATURE BIOTECHNOLOGY, vol. 27, 2009, pages 173 - 181
MACNAB ET AL., GENE THERAPY, vol. 16, 2009, pages 1180 - 1188
MCLELLAN ET AL., SCIENCE, vol. 342, no. 6158, 2013, pages 592 - 8
ONCLEY ET AL., J. AM. CHEM. SOC., vol. 71, 1949, pages 541
STEINBUCH ET AL., ARCH BIOCHEM BIOPHYS., vol. 134, no. 2, 1969, pages 279 - 84
TOMIZUKA ET AL., PROCEEDING OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES, vol. 97, 2000, pages 722 - 727

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