WO2018178594A1 - Prévention d'une infection par le virus respiratoire syncytial dans les voies respiratoires supérieures - Google Patents
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Definitions
- hyper-enriched composition of anti-RSV immunoglobulin Ig is meant an immunoglobulin composition comprising at least 10%, at least 20%, at least 30%>, at least 40%>, at least 50%> at least 60%>, at least 65%, at least 70%, at least 75%, at least 80%; at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99% by weight neutralizing immunoglobulins vis-à-vis the RSV.
- the immunoglobulin hyper-enriched anti-RSV immunoglobulin concentrate comprises at least 10% by weight of polyvalent immunoglobulins capable of recognizing and / or neutralizing the RSV virus or one of of its parts.
- the anti-RSV immunoglobulin hyper-enriched immunoglobulin concentrate comprises at least 30% by weight of polyvalent immunoglobulins capable of recognizing and / or neutralizing the RSV virus or the one of its parts.
- the immunoglobulin hyper-enriched anti-RSV immunoglobulin concentrate comprises at least 60% by weight of polyvalent immunoglobulins capable of recognizing and / or neutralizing the RSV virus or one of its parts.
- the plasma or plasma fraction at the start of the enrichment process consists of plasma from blood plasma or pools of blood plasma from mammalian subjects (human or non-human) or a fraction of that plasma, being any part or part of the plasma, having been subjected to one or more purification steps.
- the plasma or plasma fraction initially subjected to the enrichment process advantageously consist of plasma from pools of blood plasma of normal human subjects or a fraction thereof, any part or sub- part of the plasma, having undergone one or more purification steps.
- the method advantageously further comprises a subsequent step of subjecting the hyper-enriched immunoglobulin composition to anti-RSV immunoglobulins to at least one inactivation and / or viral elimination step.
- the method advantageously comprises the following steps: providing a sample of a prepurified plasma fraction obtained by ethanolic fractionation and / or caprylic fractionation and / or chromatographic separation
- This concentrate is then subjected to an immunoaffinity chromatographic step on the matrix as described above.
- the method may furthermore comprise, preferably after the step of capture on anti-virus affinity chromatography, a dedicated stage of depletion of certain immunoglobulins, in particular immunoglobulins A (IgA), and / or immunoglobulins. E (IgE) and / or immunoglobulin M (IgM), which may be involved in mechanisms of deleterious side effects in patients.
- the immunoglobulins to be depleted are advantageously selected in particular according to the route of administration chosen for the anti-virus immunoglobulin hyper-enriched immunoglobulin concentrate and / or according to the content of the plasma sample or the starting plasma fraction.
- the muco-adhesive is of the polymer type, advantageously selected from: cellulose or its derivatives (in particular methylcellulose, carboxymethylcellulose, sodium carboxymethylcellulose, hydroxypropylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose), polyacrylic acid or its derivatives, dextrans and its derivatives such as amino dextrans or DEAE-dextran, nanoparticles hydrogel of poly (methacrylic acid grafted with poly (ethylene glycol)), microparticles of alginates conjugated to lectins, thiolated polymers, natural oligosaccharide gums, xanthan gums, gums gellanes, carbomers and carboxypolymethylenes, Carbopol® 974 or 974P, Carbopol® 971 or 971P, sea curve 240, scleroglucans, hydroxypropylcellulose, pectins, polycarbophils, polymers bearing boronate groups.
- cellulose or its derivatives in particular methylcellulose, carboxy
- the muco-adhesive is advantageously chosen from:
- methylcellulose in particular Methocel® A15C and Methocel® A4C, and methylcellulose derivatives such as carboxymethylcellulose (CMC) or hydroxypropylmethylcellulose (HPMC), especially hydroxypropylmethylcellulose of low viscosity or median viscosity, in particular HPMC K4M or HPMC K15M
- - chitosan and its derivatives in particular medium molecular weight chitosan, more than 50% deacetylated chitosan (> 50% DD), thiolated chitosan and N-trimethylchitosan
- PEG polyethylene glycol
- PEG 4000 polyethylene glycol 4000
- the muco-adhesive is chosen from the following mucoadhesives or mucoadhesive mixtures:
- CMC carboxymethyl cellulose
- - chitosan in particular medium molecular weight chitosan, more than 50% deacetylated chitosan (> 50% DD) combined with a polyvinyl alcohol (PVA)
- composition immunoglobulin (Ig) hyper-enriched anti-RSV immunoglobulin as described above is applied to the upper respiratory tract, more particularly to the mucous membranes of the upper respiratory tract.
- said composition is applied to the mucous membranes of the nasal cavities and / or the nasopharynx.
- the pharmaceutical composition according to the invention is applied or administered in the nostril of the subject.
- said pharmaceutical composition applied in the nostril of the subject has an administration volume of between 50 and 250 ⁇ 1 per nostril.
- said dose has a suitable administration volume so that the anti-RSV Ig included in the composition remain located in the mucosa of the upper respiratory tract, preferably in the mucosa of the upper respiratory tract. one or more nasal cavities and / or nasopharynx.
- strain B (ref 13029-VO8H, SB), a synthetic protein derived from a hRSV DNA sequence (strain 036633-1) from His 67 to Ala 299, containing 244 amino acids after cleavage of the propeptide and whose mass predicted molecular is 27kDa.
- strain 036633-1 a synthetic protein derived from a hRSV DNA sequence from His 67 to Ala 299, containing 244 amino acids after cleavage of the propeptide and whose mass predicted molecular is 27kDa.
- the apparent molecular weight is included because of a high glycosylation between 80 kDa and 90 kDa.
- intranasal administration is carried out according to 3 distinct conditions:
- the anti-RSV Ig administered are capable of recognizing and effectively neutralizing the RSV virus, locally in the nose, namely as soon as the virus enters the body.
- o Chitosan and its derivatives in particular medium molecular weight chitosan, more than 50% deacetylated chitosan (> 50% DD), thiolated chitosan and N-trimethylchitosan
- the purpose of this study is to determine the best formulation of the composition enriched in anti-RSV Ig for a complete protection against the RSV virus as well as the time of administration of the treatment before the infection of the mouse. Therefore, different dosages of the prophylactic treatment are tested: 2h, 4h, 6h or 8h before intranasal RSV infection.
- Several formulations of the anti-RSV Ig enriched composition comprising one or more mucoadhesives (s) previously described are tested and compared to the unreformed anti-RSV Ig enriched composition.
- RSV infection is carried out after anesthesia of the animals on day 10 by intranasal administration of a solution comprising the genetically modified RSV virus to express luciferase.
- the volume of the solution containing the virus is limited to 10 ⁇ ⁇ thus limiting infection to the upper respiratory tract.
- luciferase can detect the virus by reaction of bio-luminescence and thus follow in real time replication of the RSV virus in mice.
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Abstract
La présente invention concerne l'utilisation d'une composition d'immunoglobulines (Ig) hyper-enrichie en immunoglobulines anti-RSV dans le traitement prophylactique d'une infection par le virus RSV chez un sujet, par application de la composition au niveau des muqueuses des voies respiratoires supérieures.
Description
Prévention d'une infection par le virus respiratoire syncytial dans les voies respiratoires supérieures
La présente invention concerne l'utilisation d'une composition d'immunoglobulines (Ig) hyper-enrichie en immunoglobulines anti-RSV dans le traitement prophylactique d'une infection par le virus RSV chez un sujet, par application de la composition au niveau des tissus cibles, à savoir au niveau des muqueuses des voies respiratoires supérieures, plus particulièrement au niveau des muqueuses des cavités nasales et/ou du nasopharynx. ARRIERE PLAN TECHNOLOGIQUE DE L'INVENTION
Le virus respiratoire syncytial (RSV) est un agent infectieux répandu des voies respiratoires. Le RSV provoque généralement une infection bénigne, asymptomatique ou avec des symptômes faibles (rhume) chez les personnes immunocompétentes, mais qui peut être responsable de plusieurs épisodes infectieux par an sur un même individu, pouvant être à l'origine d'absentéisme scolaire ou au travail.
De plus, ce virus est un facteur important d'infections dans les hôpitaux chez les patients immunodéprimés, en attente ou en sortie de greffe, chez les nourrissons ou jeunes enfants ou chez les personnes âgées. Le RSV est la plus importante cause de bronchiolites et de pneumonies chez les nourrissons et les jeunes enfants, et est largement responsable d'infections respiratoires dans les établissements pour personnes âgées.
Actuellement, il n'existe pas de vaccin efficace disponible pour prévenir l'infection par le RSV. Bien que des médicaments anti- viraux soient proposés pour traiter les infections à RSV, leur efficacité est discutable, surtout chez les enfants.
II existe donc un besoin d'un traitement préventif capable de neutraliser le virus respiratoire syncytial (RSV) dès qu'il entre en contact avec l'organisme et ainsi prévenir une infection par le RSV.
RESUME DE L'INVENTION
La présente invention concerne une composition d'immunoglobulines (Ig) hyper-enrichie en immunoglobulines anti-virus respiratoire syncytial (RSV), pour son utilisation dans le traitement prophylactique d'une infection par le virus RSV chez un sujet, par application de la
composition au niveau des muqueuses des voies respiratoires supérieures, plus particulièrement au niveau des muqueuses des cavités nasales et/ou du nasopharynx.
Ladite composition d'Ig hyper-enrichie en immunoglobulines anti-RSV comprend en outre un muco-adhésif, de préférence sélectionné dans le groupe constitué de : acide polyacrylique ou ses dérivés, diméthyl aminé, acide polylactique, carbomère, polycarbophyle, polyméthacrylate de méthyle ou ses dérivés, poloxamères, Pluronic® F 127, alcool polyvinylique, cellulose ou ses dérivés, méthylcellulose, Methocel® A15C, Methocel® A4C, carboxyméthylcellulose, carboxyméthylcellulose de sodium, hydroxypropylcellulose, hydroxypropylméthylcellulose, chitosane ou ses dérivés et ses sels pharmaceutiquement acceptables, glutamate de chitosane, chitosane de poids moléculaire moyen, chitosane déacétylée à plus de 50%, chitosane thiolée, N-triméthyl-chitosane, alginates, microparticules d'alginates conjugués aux lectines, amidons prégélatinisés, pectines, acide hyaluronique, sulfate de chondroïtine, N vinyl pyrrolidone, polyvinylpyrrolidone, gélatine, phosphoglycérine, dextrans et ses dérivés comme les amino dextrans ou DEAE-dextran, polyéthylène glycol, polyéthylène glycol 4000, nanoparticules hydrogel de poly(acide méthacrylique greffé de poly(éthylène glycol)), polymères thiolés, polymères porteurs de groupes boronates, alginate de sodium, gommes d'oligosaccharides naturels, gommes xanthanes, gommes gellanes, carbomères et carboxypolyméthylènes, Carbopol® 974 ou 974P, Carbopol® 971 ou 971P, sea curve 240, scléroglucanes, polycarbophiles.
Ladite composition d'Ig hyper-enrichie en immunoglobulines anti-RSV peut comprendre en outre un composé bactériostatique, en particulier ledit composé bactériostatique peut être sélectionné dans le groupe constitué de : chlorure de benzalkonium, alcool benzylique, chlorobutanol, parabènes, alcool phényléthylique, acide benzoïque , EDTA, 2-pyrrolidone, et leurs dérivés.
De manière préférée, la composition d'Ig hyper-enrichie en immunoglobulines anti-RSV utile selon la présente invention comprend une concentration d'immunoglobulines anti-RSV comprise entre 10 et 250g/L.
Selon un mode de réalisation particulier, ladite composition d'Ig hyper-enrichie en immunoglobulines anti-RSV est destinée à être administrée sous forme de particules ou de
gouttelettes ayant une taille comprise entre 2 et ΙΟΟμιη, plus préférentiellement entre 5 et 50μιη.
Selon un mode de réalisation particulier, ladite composition d'Ig hyper-enrichie en immunoglobulmes anti-RSV est destinée à être administrée ou appliquée sous forme de gouttes nasales, de suspension, de poudre, d'émulsion, de gel, de pommade, de crème, d'aérosol.
Selon un mode de réalisation particulier, ladite composition d'Ig hyper-enrichie en immunoglobulmes anti-RSV est destinée à être administrée ou appliquée à l'aide d'un dispositif, ledit dispositif étant sélectionné dans le groupe constitué de : un système de dispersion de poudre, un goutte à goutte, un système d'atomisation ou de pulvérisation, un spray nasal, un nébuliseur. Selon un mode de réalisation particulier, ladite composition d'Ig hyper-enrichie en immunoglobulmes anti-RSV est destinée à être administrée ou appliquée dans la narine du sujet, de préférence avec un volume d'administration compris entre 50 et 250μί par narine.
Selon un mode de réalisation particulier, la composition d'Ig hyper-enrichie en immunoglobulmes anti-RSV est destinée à être administrée ou appliquée une fois par jour et par narine.
Avantageusement, l'application de la composition d'Ig hyper-enrichie en immunoglobulmes anti-RSV est adaptée pour que les immunoglobulmes anti-RSV se lient au RSV au niveau des muqueuses des voies respiratoires supérieures, de préférence au niveau des muqueuses des cavités nasales et/ou du nasopharynx.
Selon un mode de réalisation particulier, ladite composition d'Ig hyper-enrichie en immunoglobulmes anti-RSV est utilisée dans le traitement prophylactique d'une infection par le virus RSV chez un sujet appartenant à au moins un des groupes suivants : les enfants, les nourrissons, les personnes immunodéprimées, notamment les nourrissons prématurés et les enfants ou personnes âgées atteints d'une maladie pulmonaire, cardiaque ou immunitaire, les personnes traitées pour une greffe, en particulier une greffe de poumon, les personnes atteintes de broncho-pneumopathie chronique obstructive (BPCO).
LEGENDE DES FIGURES
Figure 1. Analyse de la réplication virale chez la souris, 1 jour après une infection par le virus RSV. Etude par imagerie in vivo (vue dorsale) de la réplication virale 1 jour après une infection au virus RSV chez des souris ayant reçu préventivement, par voie nasale : une composition comprenant des Ig non spécifiques (contrôle négatif) ou une composition enrichie en Ig anti-RSV à une dose de lmg/kg ou une composition enrichie en Ig anti-RSV à une dose de 0, lmg/kg.
A) Premier groupe de souris testées (2 souris par condition)
B) Deuxième groupe de souris testées (2 souris par condition)
C) Moyenne des résultats obtenus pour les groupes de souris A et B regroupés dans un histogramme pour chaque condition. Anticorps irrelevant = Contrôle négatif ; LFB 1 = composition enrichie en Ig anti-RSV à une dose de lmg/kg ; LFB 0,1 = une composition enrichie en Ig anti-RSV à une dose de 0, lmg/kg.
Figure 2. Analyse de la réplication virale chez la souris, 4 jours après l'infection au virus RSV. Etude par imagerie in vivo (vue dorsale) de la réplication virale 4 jours après une infection au virus RSV chez des souris ayant reçu préventivement, par voie nasale : une composition comprenant des Ig non spécifiques (contrôle négatif) ou une composition enrichie en Ig anti-RSV à une dose de lmg/kg ou une composition enrichie en Ig anti-RSV à une dose de 0, lmg/kg.
A) Premier groupe de souris testées (2 souris par condition)
B) Deuxième groupe de souris testées (2 souris par condition)
C) Moyenne des résultats obtenus pour les groupes de souris A et B regroupés dans un histogramme pour chaque condition. Anticorps irrelevant = Contrôle négatif ; LFB 1 = composition enrichie en Ig anti-RSV à une dose de lmg/kg ; LFB 0,1 = une composition enrichie en Ig anti-RSV à une dose de 0, lmg/kg.
Figure 3. Analyse de la réplication virale chez la souris, entre 1 et 4 jours après une infection par le virus RSV.
A) Etude par mesure de la radiance, dans des lysats de fosses nasales de souris, de la réplication virale après une infection au virus RSV chez des souris ayant reçu préventivement, par voie nasale : une composition comprenant des Ig non spécifiques (contrôle négatif) ou une composition enrichie en Ig anti-RSV à une dose de lmg/kg ou une composition enrichie en Ig
anti-RSV à une dose de 0,lmg/kg. Les mesures de la radiance ont été réalisées sur les lysats de fosses nasales de souris sacrifiées 1 jour ou 4 jours après leur infection. Cette étude comprenait 6 souris/jour de sacrifice/condition. Anticorps irrelevant = Contrôle négatif ; LFB 1 = composition enrichie en Ig anti-RSV à une dose de lmg/kg ; LFB 0,1 = une composition enrichie en Ig anti-RSV à une dose de 0, lmg/kg.
B) Etude par mesure de la radiance, dans des lysats de poumons de souris, de la réplication virale après une infection au virus RSV chez des souris ayant reçu préventivement, par voie nasale : une composition comprenant des Ig non spécifiques (contrôle négatif) ou une composition enrichie en Ig anti-RSV à une dose de lmg/kg ou une composition enrichie en Ig anti-RSV à une dose de 0, lmg/kg. Les mesures de la radiance ont été réalisées sur les lysats des poumons de souris sacrifiées 1 jour ou 4 jours après leur infection. Cette étude comprenait 6 souris/jour de sacrifice/condition. Anticorps irrelevant = Contrôle négatif ; LFB 1 = composition enrichie en Ig anti-RSV à une dose de lmg/kg ; LFB 0,1 = une composition enrichie en Ig anti-RSV à une dose de 0, lmg/kg.
Figure 4. Représentation schématique du dispositif utilisé pour la mesure du temps de rétention (adapté de Batchelor et al., An in vitro mucosal model for prédiction of the bioadhesion of alginate solutions to the oesophagus, Int J Pharm. 2002 May 15;238(1- 2): 123-32.).
DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
Traitement préventif II est ici décrit une méthode de traitement prophylactique d'une infection par le virus RSV chez un sujet, ladite méthode comprenant l'application topique et ciblée d'une composition d'immunoglobulines (Ig) hyper-enrichie en immunoglobulines anti-virus respiratoire syncytial (RSV). Le sujet peut être tout mammifère, de préférence un être humain, quel que soit son âge ou son sexe. Il peut s'agir notamment d'un sujet à risque vis à vis d'une infection par le virus RSV, par exemple un enfant, un nourrisson, ou une personne immunodéprimée, notamment chez les nourrissons prématurés et les enfants ou personnes âgées atteints d'une maladie pulmonaire,
cardiaque ou immunitaire. De préférence, le sujet, s'il est infecté, est asymptomatique, c'est- à-dire qu'il n'a pas encore développé de symptômes associés à l'infection.
En particulier, le sujet peut appartenir à au moins un des groupes suivants : les enfants, les nourrissons, les personnes immunodéprimées, notamment les nourrissons prématurés et les enfants ou personnes âgées atteints d'une maladie pulmonaire, cardiaque ou immunitaire, les personnes traitées pour une greffe, en particulier une greffe de poumon, les personnes atteintes de broncho-pneumopathie chronique obstructive (BPCO). Le terme « traitement prophylactique » se réfère à la prévention ou l'arrêt du développement de l'infection, avant que celle-ci n'atteigne les voies respiratoires inférieures, et provoque une inflammation des poumons. Il prévient ainsi l'apparition des symptômes, à savoir congestion ou écoulement nasal, mais surtout inflammation pulmonaire, notamment chez les nourrissons prématurés et les enfants atteints d'une maladie pulmonaire, cardiaque ou immunitaire.
Composition d'Ig hyper-enrichie en Ig anti-RSV
La composition d'immunoglobulines utile selon l'invention est une composition d'immunoglobulines hyper-enrichie en immunoglobulmes anti-RSV qui présente une action neutralisante vis-à-vis du RSV et présente une efficacité thérapeutique pour le patient. Plus particulièrement, la composition est hyper-enrichie en immunoglobulmes dirigées de manière spécifique contre le virus RSV. Le terme « spécifique » signifie que les immunoglobulmes reconnaissent et se lient à un immunogène dudit virus, substantiellement sans réaction croisée avec un autre virus. Dans l'ensemble de la description, les termes « Ig », « immunoglobulmes » et « anticorps » peuvent être interchangeables.
La composition d'immunoglobulines comprend des anticorps qui se lient à un même immunogène viral (on parle alors de population monovalente d'anticorps), ou à plusieurs immunogènes différents du RSV (on pourra alors parler de population polyvalente d'anticorps). Essentiellement, il s'agit d'anticorps polyclonaux.
Ladite composition d'immunoglobulines contient essentiellement des immunoglobulmes humaines polyvalentes qui peuvent être des immunoglobulmes A (IgA), des immunoglobulmes E (IgE), des immunoglobulmes M (IgM) ou des immunoglobulmes G (IgG). Avantageusement, la composition d'immunoglobulines contient essentiellement des IgG et/ou des IgM et/ou des IgA.
Dans un mode de réalisation particulier, la composition d'immunoglobulines comprend essentiellement des IgG, quelle que soit leur sous-classe (IgGl, IgG2, IgG3 et IgG4).
De préférence, la composition est adaptée à une administration locale et contient de préférence essentiellement des IgG et/ou des IgA, les IgA permettant le recrutement de cellules telles que des cellules mucosales présentant des alfa récepteurs.
Par « composition d'Ig hyper-enrichie en immunoglobulines anti-RSV» on entend une composition d'immunoglobulines comprenant au moins 10%, au moins 20%, au moins 30%>, au moins 40%>, au moins 50%>, au moins 60%>, au moins 65%, au moins 70%, au moins75%, au moins 80% ; au moins 85%, au moins 90%, au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98%, au moins 99% en poids d'immunoglobulines neutralisantes vis-à-vis du RSV. Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, le concentré d'immunoglobulines hyper-enrichi en immunoglobulines anti-RSV comprend au moins 10% en poids d'immunoglobulines polyvalentes capables de reconnaître et/ou de neutraliser le virus RSV ou l'une de ses parties. Dans un autre mode de réalisation particulier de l'invention, le concentré d'immunoglobulines hyper-enrichi en immunoglobulines anti-RSV comprend au moins 30% en poids d'immunoglobulines polyvalentes capables de reconnaître et/ou de neutraliser le virus RSV ou l'une de ses parties. Dans un autre mode de réalisation alternatif et particulier de l'invention, le concentré d'immunoglobulines hyper-enrichi en immunoglobulines anti-RSV comprend au moins 60% en poids d'immunoglobulines polyvalentes capables de reconnaître et/ou de neutraliser le virus RSV ou l'une de ses parties. Les immunoglobulines dirigées spécifiquement contre le RSV peuvent se lier à l'une quelconque des protéines du virus, de préférence une protéine de surface, jouant un rôle dans les mécanismes d'infection, notamment au cours de la reconnaissance, de la liaison de la particule virale à sa cellule-hôte, de la fusion de la particule virale à sa cellule-hôte et de la propagation du virus de cellules hôte à cellule hôte. On peut citer notamment la protéine SH, la protéine G ou la protéine F du RSV.
La composition est généralement concentrée. En particulier, la composition peut comprendre une concentration d'immunoglobulines anti-RSV comprise entre 10 et 250g/l, de préférence entre 10 et 100g/l.
Méthodes de préparation de la composition d'Ig hyper-enrichie en Ig anti-RSV
Plusieurs méthodes de préparation de la composition d'Ig hyper-enrichie en Ig anti-RSV sont possibles. Préférentiellement, on utilise une méthode de préparation d'immunoglobulines à partir de pools de plasma, avantageusement de plasma humain. Une telle méthode implique des opérations de concentration des préparations plasmatiques, typiquement d'un facteur 100 à 1000.
Selon un mode particulier de réalisation, des préparations d'immunoglobulines issues de plasma ou de fractions de plasma sanguin sont soumises à une chromatographie d'affinité utilisant une protéine virale comme ligand d'affinité, pour obtenir une préparation d'immunoglobulines hyper-enrichies en immunoglobulines capables de reconnaître, et avantageusement de neutraliser, ledit RSV. Cette méthode met en œuvre des supports de chromatographie d'affinité sur lesquels sont greffés une ou plusieurs protéines virales du RSV, ou des fragments antigéniques de ceux-ci. Parmi les protéines virales utiles comme ligands, on peut citer par exemple les protéines de l'enveloppe : la protéine SH, la protéine G (glycoprotéine transmembranaire hautement glycosylée responsable de la liaison à la cellule hôte), la protéine F (glycoprotéine transmembranaire responsable de la fusion à la membrane hôte, de l'entrée du virus dans la cellule et de la formation des syncitia).
La chromatographie utilise une matrice comprenant un support à base de particules de polymère, et est de préférence sous forme d'un gel ou d'une résine. Ces particules de polymère sont de préférence de forme sphérique ou oblongue, il peut s'agir notamment de billes. Le polymère peut être naturel ou non-naturel, organique ou inorganique, réticulé ou non réticulé. Le polymère est de préférence un polymère organique, de préférence réticulé. Dans un mode de réalisation préféré, le polymère est de la cellulose, et les particules sont de préférence des billes de cellulose poreuses. D'autres types de polymères possibles incluent agarose, dextran, polyacrylates, polystyrène, polyacrylamide, polyméthacrylamide, des copolymères de styrène et divinylbenzène, ou des mélanges de ces polymères. Les particules peuvent fournir un milieu de chromatographie que l'on peut utiliser pour remplir une colonne par exemple.
Sur le support est greffé une protéine virale du RSV, ou un fragment antigénique de celle-ci, soit directement, soit via un espaceur, qui lie de manière covalente le ligand aux particules du support chromatographique. Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, la protéine greffée sur le support est une protéine de surface du RSV, par exemple la protéine F du RSV ou la protéine G du RSV, ou un fragment antigénique de celles-ci, soit directement, soit via un espaceur, qui lie de manière covalente le ligand aux particules du support chromatographique.
Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, le support greffé présente plusieurs protéines différentes et/ou plusieurs fragments antigéniques différents appartenant au RSV, afin d'obtenir un concentré d'immunoglobulines présentant différentes cibles antigéniques. Une particule peut porter plusieurs espaceurs. La liaison entre le ligand et l'espaceur peut être, par exemple, une liaison amide.
La matrice sous forme de gel est préparée par addition classique d'un tampon sur les particules de polymère portant les ligands, comme cela est connu de l'homme du métier, de manière à obtenir une matrice sous forme de gel, adaptée pour une chromatographie d'affinité. La matrice telle que définie ici est utile dans une chromatographie d'affinité liant des immunoglobulines. La matrice est particulièrement utile dans une chromatographie d'affinité à lit mélangé. Une telle matrice comprend avantageusement plusieurs antigènes différents spécifiques du RSV et est donc capable de lier des immunoglobulines dirigées contre plusieurs épitopes différents du RSV. Les immunoglobulines anti-RSV présentes dans le plasma ou la fraction plasmatique se fixent à la matrice, et le produit adsorbé est élué et récupéré, enrichi en immunoglobulines anti-RSV. De manière avantageuse, les conditions de mise en œuvre de la chromatographie d'affinité sont adaptées par l'homme du métier pour garantir la réutilisation de la matrice tout en maintenant des conditions d'élution non dégradantes pour le produit d'intérêt.
Le plasma ou la fraction plasmatique de départ soumis au procédé d'enrichissement consiste en du plasma provenant de plasmas sanguins ou de pools de plasmas sanguins de sujets mammifères (humains ou non humains) ou en une fraction de ce plasma, soit toute partie ou sous-partie du plasma, ayant fait l'objet d'une ou plusieurs étapes de purification. Dans un mode de réalisation particulier, le plasma ou la fraction plasmatique de départ soumis au procédé d'enrichissement consistent avantageusement en du plasma provenant de pools de plasmas sanguins de sujets humains normaux ou en une fraction de ce plasma, soit toute partie ou sous-partie du plasma, ayant fait l'objet d'une ou plusieurs étapes de purification. Les fractions plasmatiques utilisables incluent ainsi le surnageant de plasma cryoprécipité, le cryoprécipité de plasma (remis en suspension), les fractions I à V obtenues par fractionnement éthanolique (selon la méthode de Cohn ou de Kistler & Nitschmann), le surnageant et le précipité obtenus après précipitation à l'acide caprylique et/ou caprylate, les éluats de chromatographies et les fractions non adsorbées des colonnes de chromatographie, et les filtrats.
De manière particulièrement avantageuse, le plasma ou la fraction plasmatique de départ soumis au procédé d'enrichissement proviennent de pools de plasmas sanguins de sujets
humains normaux, sans sélection préalable des donneurs, en particulier, sans sélection des donneurs sur la base de leur éventuel taux plasmatique en immunoglobulines anti-RSV. Le plasma ou la fraction plasmatique de départ soumis au procédé d'enrichissement comporte ainsi avantageusement un taux d'immunoglobulines anti-RSV similaire ou égal au taux d'immunoglobulines anti-RSV d'un plasma issu du pool d'au moins 1000 donneurs humains normaux aléatoirement choisis. Le plasma ou la fraction plasmatique de départ soumis au procédé d'enrichissement est avantageusement non enrichi en immunoglobulines anti-RSV d'intérêt comparé au taux d'immunoglobulines anti-RSV d'un plasma issu du pool d'au moins 1000 donneurs choisis de manière aléatoire.
Dans un mode de réalisation supplémentaire, le plasma ou la fraction plasmatique de départ soumis au procédé d'enrichissement consistent en du plasma provenant de plasmas sanguins ou de pools de plasmas sanguins de sujets mammifères non humains, mâles et/ou femelles, avantageusement de chèvre, brebis, bouc, bison, buffle, chameau, lama, souris, rat, vache, taureau, cochon, truie, lapin(e), cheval, jument. Le mammifère non humain est avantageusement transgénique et a été préalablement exposé au virus RSV afin de produire dans son plasma des immunoglobulines humaines anti-RSV.
Le plasma ou la fraction plasmatique de départ soumis au procédé d'enrichissement contient des immunoglobulines humaines polyvalentes qui peuvent être des immunoglobulines A (IgA), des immunoglobulines E (IgE), des immunoglobulines M (IgM) ou des immunoglobulines G (IgG). Avantageusement, le plasma ou la fraction plasmatique de départ contient essentiellement des IgG quelle que soit leur sous-classe (IgGl, IgG2, IgG3 et IgG4) et/ou des IgA.
Le procédé peut typiquement être un procédé indépendant, dédié à la purification d'immunoglobulines anti-RSV, et est alors avantageusement effectué à partir de plasma ou d'une fraction plasmatique.
Dans ce mode de réalisation, le procédé comprend avantageusement les étapes suivantes : fourniture d'un échantillon de plasma ou d'une fraction plasmatique,
passage de l'échantillon de plasma ou d'une fraction plasmatique sur une chromatographie d'immunoaffînité sur la matrice décrite ici,
récupération de la fraction adsorbée sur la matrice correspondant à la composition d'immunoglobulines hyper-enrichie en immunoglobulines anti-RSV.
De manière avantageuse, le procédé peut comprendre en outre, après l'étape de capture sur chromatographie d'affinité anti-RSV, une étape dédiée de déplétion de certaines immunoglobulines, en particulier les immunoglobulines E (IgE) et/ou immunoglobulines
(IgM), qui peuvent être impliquées dans des mécanismes d'effets secondaires délétères chez les patients.
Le procédé comprend avantageusement en outre une étape ultérieure consistant à soumettre la composition d'immunoglobulines hyper-enrichie en immunoglobulines anti-RSV à au moins une étape d'inactivation et/ou d'élimination virale.
Dans encore un autre mode de réalisation particulier, le procédé d'obtention des immunoglobulines anti-RSV est couplé à un procédé d'immunoglobulines G polyvalentes afin d'obtenir, à partir d'un même pool de plasma de départ, à la fois un concentré d'immunoglobulines G polyvalentes et un concentré d'immunoglobulines hyper-enrichies en anti-RSV.
Le procédé comprend alors typiquement une étape préalable d'obtention de la fraction plasmatique, par fractionnement éthanolique et/ou fractionnement caprylique et/ou séparation chromatographique.
Dans ce mode de réalisation, le procédé comprend avantageusement les étapes suivantes : fourniture d'un échantillon d'une fraction plasmatique prépurifiée obtenue par fractionnement éthanolique et/ou fractionnement caprylique et/ou séparation chromatographique
passage de la fraction plasmatique prépurifiée sur une chromatographie d'immunoaffinité sur la matrice décrite ici,
récupération de la fraction adsorbée sur la matrice correspondant à la composition d'immunoglobulines hyper-enrichie en immunoglobulines anti-RSV.
Par « séparation chromatographique », on entend toute étape de chromatographie, qu'il s'agisse de chromatographie échangeuse d'ions (échangeuse d'anions et/ou échangeuse de cations), mixed mode, affinité (utilisant des ligands de type chimiques, anticorps, fragments d'anticorps, aptamères). Par séparation chromatographique, on entend aussi bien une seule et unique colonne de chromatographie, ou un ensemble de colonnes de chromatographie, utilisant ou non le même type de support, en série (mode multicolonnes par exemple) ou en parallèle.
Plus précisément, la fraction plasmatique peut être obtenue par un fractionnement éthanolique développé à l'origine par Cohn et al (Cohn et al, 1946. J. Am. Chem. Soc. 68, 459 ; Oncley et al, 1949, J. Am. Chem. Soc. 71, 541), ou bien par une séparation chromatographique, telle que décrite par exemple dans EP 0 703 922 et WO 99/64462, ou encore par un fractionnement caprylique tel que décrit par Steinbuch et al 1969, Arch Biochem Biophys. 134(2):279-84). On préfère tout particulièrement les procédés mis au point par la Demanderesse dans les demandes de brevet WO 94/29334 et WO 02/092632, et tout particulièrement celui décrit
dans WO 02/092632. Dans ce cas, on soumet un plasma sanguin, ou une fraction de plasma sanguin enrichie en Ig, à un fractionnement caprylique (prépurification par précipitation de contaminants non immunoglobulines), et une chromatographie unique sur un support de résine échangeuse d'anions effectuée à pH alcalin. Un traitement d'inactivation virale peut être réalisé, de préférence effectué par solvant-détergent, comme décrit par Horowitz dans le brevet US 4 764 369, éventuellement complété par une étape d'élimination virale par nanofïltration sur filtre de taille de pores 75N, 35N, 20N et/ou 15N.
La fraction d'Ig ainsi récoltée est déjà concentrée, mais peut ensuite subir des étapes de concentration supplémentaire par ultrafïltration, et de filtration stérilisante.
Ce concentré est ensuite soumis à une étape chromatographique d'immunoaffinité sur la matrice telle que décrite plus haut.
De manière avantageuse, le procédé peut comprendre en outre, de préférence après l'étape de capture sur chromatographie d'affinité anti- virus, une étape dédiée de déplétion de certaines immunoglobulines, en particulier les immunoglobulines A (IgA), et/ou immunoglobulines E (IgE) et/ou immunoglobulines M (IgM), qui peuvent être impliquées dans des mécanismes d'effets secondaires délétères chez les patients. Les immunoglobulines à dépléter sont avantageusement sélectionnées en particulier selon la voie d'administration choisie pour le concentré d'immunoglobulines hyper-enrichi en immunoglobulines anti-virus et/ou selon le contenu de l'échantillon de plasma ou de la fraction plasmatique de départ.
Le procédé peut en outre comprendre les étapes ultérieures consistant à additionner un ou plusieurs stabilisants pharmaceutiquement acceptables; et éventuellement congeler ou lyophiliser le concentré ainsi obtenu.
Formulation
Avantageusement, une composition d'immunoglobulines telle que décrite plus haut est sous la forme d'une composition pharmaceutique comprenant les immunoglobulines anti-RSV, en association avec au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable. Par excipient pharmaceutiquement acceptable, on entend des excipients qui ne sont pas nocifs ou toxiques vis-à-vis de la muqueuse des voies respiratoires supérieures, notamment vis-à-vis de l'épithélium nasal et de la clairance muco-ciliaire nasale.
La formulation de la composition pharmaceutique utile selon l'invention est adaptée pour une application au niveau des muqueuses des voies respiratoires supérieures. En particulier, les muqueuses des voies respiratoires supérieures consistent en les muqueuses des cavités nasales
et/ou du nasopharynx. Ainsi, la composition pharmaceutique peut être préparée selon les méthodes habituelles, en utilisant des excipients appropriés, de préférence adaptés à une application au niveau des muqueuses des voies respiratoires supérieures. Par exemple, le chlorure de sodium est un excipient intéressant pour des compositions nasales aqueuses.
De plus, d'autres additifs peuvent être mis en œuvre dans la formulation, tels que des conservateurs, des agents de viscosité, des agents influençant l'osmolarité, des agents complexants (comme par exemple l'édétate de sodium), des tensio-actifs et des agents qui influencent le pH et la tonicité de la formulation nasale. La composition pharmaceutique comprend en outre un ou plusieurs muco-adhésif(s). En particulier, au sens de la présente invention, on entend par muco-adhésif un composé ou un mélange de composés aptes à adhérer à la muqueuse, c'est-à-dire au revêtement tissulaire des cavités corporelles en communication avec l'extérieur par des orifices naturels. Le muco- adhésif permet avantageusement d'augmenter le temps de clairance de la composition une fois celle-ci appliquée au niveau des muqueuses des voies respiratoires supérieures. En particulier, le muco-adhésif peut être sélectionné parmi : acide polyacrylique ou ses dérivés, diméthyl aminé, acide polylactique, carbomère, polycarbophyle, polyméthacrylate de méthyle ou ses dérivés, poloxamères, Pluronic® F127, alcool polyvinylique, cellulose ou ses dérivés, méthylcellulose, Methocel® A15C, Methocel® A4C, carboxyméthylcellulose, carboxyméthylcellulose de sodium, hydroxypropylcellulose, hydroxypropylméthylcellulose, chitosane ou ses dérivés et ses sels pharmaceutiquement acceptables, glutamate de chitosane, chitosane de poids moléculaire moyen, chitosane déacétylée à plus de 50%, chitosane thiolée, N-triméthyl-chitosane, alginates, microparticules d'alginates conjugués aux lectines, amidons prégélatinisés, pectines, acide hyaluronique, sulfate de chondroïtine, N vinyl pyrrolidone, polyvinylpyrrolidone, gélatine, phosphoglycérine, dextrans et ses dérivés comme les amino dextrans ou DEAE-dextran, polyéthylène glycol, polyéthylène glycol 4000, nanoparticules hydrogel de poly(acide méthacrylique greffé de poly(éthylène glycol)), polymères thiolés, polymères porteurs de groupes boronates, alginate de sodium, gommes d'oligosaccharides naturels, gommes xanthanes, gommes gellanes, carbomères et carboxypolyméthylènes, Carbopol® 974 ou 974P, Carbopol® 971 ou 971P, sea curve 240, scléroglucanes, polycarbophiles, ou des mélanges des muco-adhésifs énoncés ci-dessus.
Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, le muco-adhésif est de type polymère, avantageusement sélectionné parmi : cellulose ou ses dérivés (en particulier méthylcellulose, carboxyméthylcellulose, carboxyméthylcellulose de sodium, hydroxypropylcellulose, hydroxypropylméthylcellulose), acide polyacrylique ou ses dérivés, dextrans et ses dérivés comme les amino dextrans ou DEAE-dextran, nanoparticules hydrogel de poly(acide méthacrylique greffé de poly(éthylène glycol)), microparticules d'alginates conjugués aux lectines, polymères thiolés, gommes d'oligosaccharides naturels, gommes xanthanes, gommes gellanes, carbomères et carboxypolyméthylènes, Carbopol® 974 ou 974P, Carbopol® 971 ou 971P, sea curve 240, scléroglucanes, hydroxypropylcellulose, pectines, polycarbophiles, polymères porteurs de groupes boronates.
Dans un autre mode de réalisation particulier, le muco-adhésif est un polymère d'origine biologique, en particulier la cellulose et ses dérivés ou la pectine. Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, le muco-adhésif peut également présenter d'autres propriétés intéressantes pour la formulation de la composition, celui-ci peut notamment produire un effet stabilisateur pour la composition.
Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, le muco-adhésif est avantageusement choisi parmi :
- méthylcellulose (MC), en particulier Methocel® A15C et Methocel® A4C, et dérivés de méthylcellulose tels que le carboxyméthylcellulose (CMC) ou Γ hydroxypropylméthylcellulose (HPMC), notamment l'hydroxypropylméthylcellulose de faible viscosité ou viscosité médiane, en particulier Γ HPMC K4M ou HPMC K15M
- poloxamères, en particulier le Pluronic® F 127
- chitosane et ses dérivés, en particulier chitosane de poids moléculaire moyen, chitosane déacétylée à plus de 50% (>50%DD), chitosane thiolée et N-triméthyl-chitosane
- carbomères et carboxypolyméthylènes, en particulier Carbopol® 971P et Carbopol® 974
- alcool polyvinylique (PVA)
- polyéthylène glycol (PEG), en particulier polyéthylène glycol 4000 (PEG 4000)
- gomme xanthane
- gomme gellane
- pectine, et en particulier pectine naturelle additionnée de Ca2+
- N vinyl pyrrolidone (Providone)
- diméthyle amine
- phosphoglycérine
- acide polylactique
- polymères porteurs de groupes boronates
- alginate de sodium
seul ou en mélange.
Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, le muco-adhésif est choisi parmi les muco-adhésifs ou mélanges de muco-adhésifs suivants:
- carboxyméthyl-cellulose (CMC)
- poloxamères, et en particulier le Pluronic® F 127
- poloxamères, et en particulier le Pluronic® F 127, associé à la chitosane
- poloxamères, et en particulier le Pluronic® F 127, associé à la carboxylméthyl-cellulose CMC
- hydroxypropylméthyl- cellulose (HPMC) de faible viscosité ou de viscosité médiane, en particulier l'HPMC K4M ou HPMC K15M
- chitosane, en particulier chitosane de poids moléculaire moyen, chitosane déacétylée à plus de 50% (>50%DD) associée à un alcool polyvinylique (PVA)
- chitosane associée à du polyéthylène glycol (PEG), et en particulier au polyéthylène glycol 4000 (PEG 4000)
- gomme xanthane
En particulier, la composition pharmaceutique présente un pH, une osmolarité, un ou des agents muco-adhésifs adaptés pour que les Ig anti-RSV comprises dans la composition agissent au niveau des muqueuses des voies respiratoires supérieures, de préférence au niveau des muqueuses d'une ou des cavités nasales et/ou du nasopharynx.
Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, la composition selon l'invention comprend en outre un composé bactériostatique. Par composé bactériostatique, on entend tout composé capable d'interférer avec la croissance des microorganismes, en particulier des bactéries, notamment capable de suspendre ou inhiber la croissance des microorganismes, en particulier des bactéries.
En particulier, ledit composé bactériostatique peut être sélectionné dans le groupe constitué de : chlorure de benzalkonium, alcool benzylique, chlorobutanol, parabènes, alcool phényléthylique, acide benzoïque , EDTA, 2-pyrrolidone, et leurs dérivés.
Administration et Posologie
Ladite composition d'immunoglobulines (Ig) hyper-enrichie en immunoglobulines anti-RSV telle que décrite précédemment est appliquée au niveau des voies respiratoires supérieures, plus particulièrement au niveau des muqueuses des voies respiratoires supérieures. En particulier, ladite composition est appliquée au niveau des muqueuses des cavités nasales et/ou du nasopharynx.
On entend par « application au niveau des muqueuses des voies respiratoires supérieures », toute application, libération et/ou administration de la composition au niveau des surfaces muqueuses des voies respiratoires supérieures, ces surfaces constituant un territoire susceptible d'infection par le virus du RSV et présentent donc un intérêt dans la prophylaxie d'une infection au RSV. En particulier, ladite composition est appliquée de manière topique et ciblée au niveau des muqueuses des voies respiratoires supérieures. Par « voies respiratoires supérieures » ou « voies aériennes supérieures », on entend tout conduit ou cavité extra thoracique en contact avec l'air tel que le nez, les cavités nasales, le nasopharynx. En particulier, l'application permet à la composition d'atteindre et/ou pénétrer les muqueuses des cavités nasales et/ou du nasopharynx. Les muqueuses des cavités nasales et du nasopharynx sont caractérisées par une superficie totale d'environ 140 cm2. La muqueuse nasale largement vascularisée permet une absorption rapide de la composition utilisée selon l'invention.
Avantageusement, l'application de la composition est adaptée pour que les immunoglobulines anti-RSV se lient au RSV au niveau des muqueuses des voies respiratoires supérieures, de préférence au niveau des muqueuses des cavités nasales et/ou du nasopharynx.
Dans un mode de réalisation particulier, ladite composition est destinée à une administration par voie nasale, notamment à une inhalation par voie nasale.
Ladite composition d'immunoglobulines (Ig) hyper-enrichie en immunoglobulines anti-RSV peut ainsi être administrée par voie nasale ou intranasale sous forme de gouttes nasales, de suspension, de poudre, d'émulsion, de gel, de pommade, de crème, d'aérosol. Ladite composition d'immunoglobulines (Ig) hyper-enrichie en immunoglobulines anti-RSV peut être appliquée ou administrée à l'aide d'un distributeur ou d'un dispositif, par exemple : une ampoule de dose unitaire, un atomiseur, un nébuliseur, une pompe, un tampon nasal, une seringue préremplie, une éponge nasale ou une gélule, ou n'importe quelle autre méthode d'administration par voie nasale, connue dans la littérature pharmaceutique. Dans un mode de réalisation particulier de l'invention le dispositif comprend en outre un filtre limitant la contamination bactérienne. De préférence le dispositif d'administration permet l'administration de ladite composition sous forme d'aérosol. De préférence, le dispositif d'administration est un nébuliseur permettant la pulvérisation de ladite composition sous forme d'aérosol. Un nébuliseur est défini ici comme un dispositif capable d'aérosoliser un matériau liquide dans une phase liquide dispersée.
Selon un mode de réalisation particulier, la composition de l'invention est appliquée ou administrée à l'aide d'un dispositif sélectionné dans le groupe constitué de : un système de dispersion de poudre, un goutte à goutte, un système d'atomisation ou de pulvérisation, un spray nasal, un nébuliseur.
De préférence, ladite composition est sous forme de particules ou de gouttelettes ayant une taille et une morphologie adaptées pour cibler les muqueuses des voies respiratoires supérieures, et de préférence les muqueuses des cavités nasales et/ou du nasopharynx. Préférentiellement, la taille des particules (solides) ou des gouttelettes (liquides) est comprise entre 2 et 100 μιη, plus préférentiellement entre 5 et 50 μιη.
La taille des particules peut être mesurée par toute technique connue de l'homme du métier, notamment les techniques de diffraction laser. La taille des gouttelettes peut être mesurée par toute technique connue de l'homme du métier, notamment les techniques utilisant la diffraction laser et les techniques basées sur l'effet doppler. En particulier, l'homme du métier pourra effectuer ses mesures à l'aide d'un appareil mettant en œuvre la diffraction laser et notamment les modèles d'appareils Visisize D30, Visisize P15, Visisize N60 et Visisize S200 (Oxford Lasers Inc).
Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, ladite composition est sous forme d'un aérosol comprenant des particules ou des gouttelettes ayant une taille comprise entre 2 et 100 μιη, plus préférentiellement entre 5 et 50 μιη. Un aérosol est défini ici comme la dispersion de particules solides ou de gouttelettes liquides très fines dans un gaz. En particulier, l'aérosol comprend une phase gazeuse continue et, dispersée dans celle-ci, une phase discontinue ou dispersée de particules ou de gouttelettes.
La composition pharmaceutique selon l'invention peut se présenter sous forme de doses unitaires (le dispositif ne permet qu'une seule application) ou de multidoses (le dispositif permet plusieurs applications).
Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, la composition pharmaceutique se présente avantageusement sous forme de doses unitaires.
Selon un mode de réalisation particulier, la composition pharmaceutique selon l'invention est appliquée ou administrée dans la narine du sujet. De préférence, ladite composition pharmaceutique appliquée dans la narine du sujet présente un volume d'administration compris entre 50 et 250μ1 par narine.
Par « volume d'administration » on entend le volume de ladite composition administrée par dose ou prise.
Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, ladite dose possède un volume d'administration adapté pour que les Ig anti-RSV comprises dans la composition restent localisées au niveau des muqueuses des voies respiratoires supérieures, de préférence au niveau des muqueuses d'une ou des cavités nasales et/ou du nasopharynx.
Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, la composition est administrée à l'aide d'un spray nasal délivrant un volume d'administration d'environ 150 μΐ par utilisation.
La posologie peut être ajustée de manière appropriée pour atteindre les niveaux souhaités d'immunoglobulines au niveau local, suivant une application au niveau des muqueuses des voies respiratoires supérieures. Par exemple, dans un mode de réalisation particulier de l'invention, ladite composition d'Ig hyper-enrichie en immunoglobulines anti-RSV est appliquée au niveau des muqueuses des voies respiratoires supérieures une fois par jour et par narine.
Les exemples suivants illustrent l'invention sans en limiter la portée.
EXEMPLES EXEMPLE 1 : Préparation d'une composition enrichie en Ig anti-RSV, à partir de fractions plasmatiques
Dans cet exemple, l'échantillon utilisé est une fraction plasmatique issue du procédé de purification d'immunoglobulines tel que décrit dans la demande de brevet WO02092632. Le procédé de purification comprend les étapes suivantes :
- Récupération d'une fraction I+II+III, obtenue à partir de plasma sanguin traité à l'éthanol Précipitation à l'acide caprylique
Traitement solvant-détergent (Triton/TnBP)
Chromatographie échangeuse d'anions (TMAE) à pH basique
L'éluat de la chromatographie échangeuse d'anions à pH basique est ensuite soumis à une chromatographie d'immunoaffînité, comme décrit ci-dessous.
1. Chromatographie d'affinité anti-RSV (protéine F)
On utilise comme ligand d'affinité la protéine RSV-F 11049-V08B (Sino Biological Inc), protéine synthétique issue d'une séquence ADN du hRSV (RSS-2) de la Met 1 à la Thr 529, contenant 518 acides aminés après clivage du propeptide et dont la ma masse moléculaire prédite est de 58kDa. En analyse SDS-PAGE et conditions de réduction, les masses moléculaires apparentes sont 45-55 kDa et 18 kDa. Le ligand RSV-F 11049-V08B utilisé pour le greffage est en conformation post-fusion.
2mL de gel NHS-activated sepharoseTM 4 Fast Flow sont mis en place dans une colonne de chromatographie de diamètre 1.1cm et les tampons utilisés sont ceux recommandés par le fournisseur du gel. Après lavage (ImM HCL à 4°C) et équilibrage en tampon de couplage, 1,98 mg de protéine F à greffer sont ajoutées au gel et l'ensemble est mis en agitation. Le blocage des groupements réactifs sur le gel est réalisé en ajoutant 6 mL de tampon 0.5M ethanolamine, 0.5M NaCl, pH 8.3 (6mL), et le gel est mis en agitation pendant 12h. Le gel couplé est lavé avec une alternance de 3 volumes de tampons basique puis acide : 0.1 M Tris- HC1 pH 8.4 et 0.1M acétate, 0.5M NaCl pH 4, ce cycle étant répété trois fois. Le gel est ensuite stocké en tampon lOmM citrate, 0.5M NaCl, 0.1 g/L azide de sodium pH 6.6
Le couplage a été évalué à 98%, correspondant à une densité de ligand de 0,89mg/mL de gel greffé.
L'échantillon est équilibré dans le tampon d'injection en y ajoutant une solution concentrée de tampon de NaCl et de citrate trisodique qsp 0,05M NaCl et 0,01 M Citrate trisodique. Le produit est ensuite passé sur la colonne durant 3.3min (temps de contact). Après lavage, l'élution est réalisée en tampon 0,1M glycine, 30% propylène glycol à pH 2,57. L'éluat est immédiatement neutralisé par du tampon 1M Tris-HCl pH 9 pour en remonter le pH à environ 6. Le gel est alors passé en régénération afin de décrocher les Ig non éluées avec un tampon 6M guanidine pH 6. La fraction récupérée est aussi neutralisée par l'ajout de 1M Tris-HCl pH9 pour en remonter le pH à 6.
2. Chromatographie d'affinité anti-RSV (protéine G)
Alternativement, ou en complément, on utilise comme ligand d'affinité la protéine RSV-G souche A (ref 11070-V08H2, SB), protéine synthétique issue d'une séquence ADN du hRSV (souche rsbl734) de la Asn 66 à l'Arg 297, contenant 242 acides aminés après clivage du propeptide et dont la masse moléculaire prédite est de 26,3kDa. En analyse SDS-PAGE et conditions réductrice, la masse moléculaire apparente est comprise du fait d'une importante glycosylation entre 60 kDa et 90 kDa.
souche B (ref 13029-VO8H, SB), protéine synthétique issue d'une séquence ADN du hRSV (souche 036633-1) de l'His 67 à l'Ala 299, contenant 244 acides aminés après clivage du propeptide et dont la masse moléculaire prédite est de 27kDa. En analyse SDS-PAGE et conditions réductrice, la masse moléculaire apparente est comprise du fait d'une importante glycosylation entre 80 kDa et 90 kDa.
Le couplage est réalisé selon le même protocole que celui utilisé à la section 1.
Trois colonnes sont réalisées :
gel G- A, correspondant à une densité de Protéine G souche A de 1 mg/mL de gel greffé, gel G-B, correspondant à une densité de Protéine G souche B de 1 mg/mL de gel greffé, gel G-AB, correspondant à un mélange 50% gel G-A et 50%> gel G-B.
Le design de l'expérience a en outre permis de constater que les IgG anti-RSV purifiés sur le variant A de la protéine G interagissaient également avec le variant B de la protéine G et inversement (anti-varB sur variantA) laissant penser qu'il existe une réactivité croisée entre les anticorps polyclonaux anti-RSV pour les deux variants de la protéine G.
Une forte proportion des immunoglobulines anti-RSV se fixe au support de chromatographie par affinité à la protéine hRSV-G, quelle que soit la souche, ce qui représente dans cet essai au moins 6^g d'immunoglobulines anti-RSV par mL de gel. La fraction non adsorbée et la fraction de lavage sont appauvries en immunoglobulines anti-RSV. La fraction
d'immunoglobulines éluées du support à pH acide et en présence de Propylène glycol montre un enrichissement minimum de 109 fois en immunoglobulines anti-RSV.
L'essai montre que la chromatographie d'affinité utilisant un ligand protéine G de souches A ou B greffées via une chimie NHS permet la purification d'immunoglobulines anti-RSV avec un rendement d'au moins 26,2% dans les conditions testées, correspondant à un facteur d'enrichissement minimum de 109 fois.
La composition obtenue après chromatographie d'affinité sur ligand protéine G en comprend donc au moins 30%> en poids d'immunoglobulines dirigées spécifiquement contre au moins un épitope de la protéine G.
EXEMPLE 2 : Etude de l'efficacité d'un traitement préventif par administration par voie nasale de la composition enrichie en Ig anti-RSV
La composition enrichie en Ig anti-RSV telle que préparée dans l'exemple 1 ci-dessus et dialysée à l'aide d'une solution tampon contenant du mannitol (0,15 M) et de la glycine (0,1 M) à pH = 4 a été testée en tant que traitement prophylactique envers le virus RSV, par administration nasale.
Matériel et méthodes
L'étude est conduite sur 4 jours (J0, Jl, J2 et J4), avec des souris femelles BALB/c âgées de 6 semaines et rendues sensibles au virus RSV. lere étape : administration du traitement prophylactique.
Un prélèvement sanguin initial est effectué au début de l'étude sur toutes les souris testées. Le traitement prophylactique est administré à J0 - 1 heure.
Plus particulièrement, une administration intranasale est effectuée selon 3 conditions distinctes :
2eme étape : Infection par le virus RSV.
L'infection au virus RSV a été effectuée au jour JO, par injection intra nasale d'une solution comprenant le virus RSV associé à la luciférase (administration de ΙΟμί).
3eme étape : Analyse de la réplication virale chez la souris
La réplication virale chez la souris est ensuite analysée au jour Jl (chez un premier groupe de souris, N=18) puis au jour J4 (chez un second groupe de souris, N=18).
La réplication virale a été analysée par un système d'imagerie in vivo. Puis les souris ont été sacrifiées, les narines et poumons ont été prélevés afin de conduire un test de bio luminescence (basé sur la détection de la luciférase, complexée au virus RSV).
Résultats
Analyse de la réplication virale par imagerie in vivo :
L'analyse de luminescence dans le premier groupe de souris fournit les résultats suivants. JOUR Jl après l'infection (Figure 1A) :
JOUR J4 après l'infection (Figure 2 A)
L'analyse de luminescence dans le deuxième groupe de souris fournit les résultats suivants. JOUR Jl après l'infection (Figure 1B) :
JOUR J4 après l'infection (Figure 2B) :
On observe chez les souris contrôles (auxquelles des Ig non spécifiques ont été administrées) une réplication virale localisée au niveau du nez dès le jour Jl (Figures 1A, 1B et 1C), qui
s'amplifie au jour J4 (Figures 2 A, 2B et 2C). On remarque également que, pour l'un des contrôles, l'infection commence à s'étendre au poumon (Figure 2B, souris 2B2), ce qui est corrélé par les données obtenues sur les lysats de poumons en ajoutant directement le substrat de bio luminescence (figure 3B).
A l'inverse, le virus RSV n'est pas détecté (signal éteint) chez les souris qui ont reçu préventivement, par voie nasale, la solution enrichie en Ig anti-RSV, dès le jour Jl (Figures 1A, 1B et 1C) et jusqu'au jour J4 (Figures 2A, 2B et 2C), et ce quelle que soit la dose (lmg/kg ou 0,lmg/kg). Ces résultats sont confirmés par ceux obtenus sur les lysats des fosses nasales où aucun virus n'est détecté de façon significative (au-dessus de 200 unités de radiance) pour les deux doses (Figure 3 A).
Ces résultats démontrent l'efficacité d'un traitement préventif par administration nasale de la composition enrichie en Ig anti-RSV. Les Ig anti-RSV administrées sont capables de reconnaître et de neutraliser efficacement le virus RSV, localement au niveau du nez, à savoir dès l'entrée du virus dans l'organisme.
EXEMPLE 3 : Etude de la capacité adhésive de la composition d'immunoglobulines polyclonales avec différents muco-adhésifs dans un modèle de muqueuse
L'étude de la capacité adhésive de la composition enrichie en Ig anti-RSV avec différents muco-adhésifs est effectuée selon le protocole décrit dans la publication Mahdi MH et al, Development of mucoadhesive spray cible gellan gum fluid gels, Int J Pharm. 2015 Jul 5;488(l-2): 12-9.
Matériel et méthodes
Les différentes formulations avec muco-adhésifs testées sont les suivantes :
2.5%
F6 Chitosane de poids moléculaire moyen déacétylée à plus de 50% (3%) + alcool polyvinylique (2%)
F7 Chitosane + polyéthylène glycol 4000
F8 Gomme xanthane
L'échantillon de muqueuse provient de la muqueuse œsophagienne de porc fraîchement prélevée en abattoir. Les couches externes de muscle du tissu œsophagien de porc sont retirées. Le tissu interne est ensuite coupé en sections longitudinales de 2x4cm puis stockées à -20°C. La décongélation est effectuée à température ambiante avant utilisation. La section tissulaire ne subit aucun lavage qui pourrait affecter les propriétés de surface et donc l'interaction adhésive.
Mesure du temps de rétention
Le temps de rétention de la composition dans des conditions simulant la voie nasale (pH 7.4, 34°C) est étudié en utilisant le dispositif schématisé à la figure 4.
Un échantillon de tissu mucosal décongelé est disposé sur le dispositif et la formulation muco-adhésive est directement administrée en gouttes sur le tissu. Du PBS est ensuite perfusé sur la membrane mucosale à un débit de 1 mL/min. Le perfusat de PBS est collecté à différents temps et le taux d'immunoglobulines est mesuré en utilisant un kit dosage protéique Micro BCA™. Le taux de rétention de la composition sur la surface est ensuite calculé selon l'équation
([Ig]-[IgP])/[Ig] x 100 (1)
où [Ig] est la concentration d'immunoglobulines déposée sur le tissue et [IgP] est la concentration d'immunoglobulines détectée dans le perfusat PBS.
EXEMPLE 4 : Etude de l'efficacité d'un traitement préventif par administration au niveau des voies respiratoires supérieures de la composition enrichie en Ig anti-RSV comprenant un ou plusieurs muco-adhésifs
La composition enrichie en Ig anti-RSV telle que préparée dans l'exemple 1 ci-dessus et additionnée d'un ou plusieurs muco-adhésif(s) est testée en tant que traitement prophylactique envers le virus RSV. La composition est administrée au site d'intérêt (fosses nasales) via la voie intranasale dans un petit volume (10 μί) pour limiter la diffusion de la composition enrichie en Ig anti-RSV aux voies respiratoires supérieures.
Matériel et méthodes
L'étude est conduite sur une période totale de 6 jours (J-l à J4), avec des souris femelles BALB/c âgées de 8 semaines et rendues sensibles au virus RSV. Le jour de l'infection étant considéré comme J0.
Compositions testées
Les différentes formulations testées comprennent
- la composition enrichie en Ig anti-RSV
- un ou plusieurs muco-adhésifs en mélange sélectionné(s) parmi les muco-adhésifs connus de l'homme du métier, en particulier parmi :
o méthylcellulose (MC), en particulier Methocel® A15C et Methocel® A4C, et dérivés de méthylcellulose tels que le carboxyméthylcellulose (CMC) ou l'hydroxypropylméthylcellulose (HPMC), notamment l'hydroxypropylméthylcellulose de faible viscosité ou viscosité médiane, en particulier le HPMC K4M ou HPMC K15M
o poloxamères, en particulier le Pluronic® F 127
o chitosane et ses dérivés, en particulier chitosane de poids moléculaire moyen, chitosane déacétylée à plus de 50% (>50%DD), chitosane thiolée et N-triméthyl- chitosane
o carbomères et carboxypolyméthylènes, en particulier Carbopol® 971P et
Carbopol® 974
o alcool polyvinylique (PVA)
o polyéthylène glycol (PEG), en particulier polyéthylène glycol 4000 (PEG 4000) o gomme xanthane
o gonmme gellane
o pectine, et en particulier pectine naturelle additionnée de Ca2+
o N vinyl pyrrolidone (Providone)
o dimethyle amine
o phosphoglycérine
o acide polylactique
o polymères porteurs de groupes boronates
o alginate de sodium
Les compositions sont testées avec
- différentes concentrations d'immunoglobulines anti-RSV (0,010 mg/kg, 0,025 mg/kg, 0,050 mg/kg) et/ou
- différentes concentrations du même muco-adhésif ou mélange de muco-adhésifs (0,5% - 50%) permettant d'obtenir des compositions avec différents ratio [immunoglobulines]/[muco-adhésifJ.
En particulier, les formulations suivantes sont testées :
Le but de cette étude est de déterminer la meilleure formulation de la composition enrichie en Ig anti-RSV pour une protection complète contre le virus RSV ainsi que le moment d'administration du traitement avant l'infection de la souris. Par conséquent, différents temps d'administration du traitement prophylactique sont testés : 2h, 4h, 6h ou 8h avant l'infection par le virus RSV par voie intranasale.
Plusieurs formulations de la composition enrichie en Ig anti-RSV comprenant un ou plusieurs muco-adhésifs(s) décrites précédemment sont testées et comparées à la composition enrichie en Ig anti-RSV non formulée.
Les différentes conditions sont les suivantes :
La composition comprenant des anticorps non spécifiques sert de contrôle négatif. L'étude est réalisée sur des lots de 6 souris par groupe et par condition. 2ème étape : Infection par le virus RSV (J0)
L'infection au virus RSV est effectuée après anesthésie des animaux au jour J0, par administration intranasale d'une solution comprenant le virus RSV modifié génétiquement pour exprimer la luciférase. Le volume de la solution contenant le virus est limité h 10 μΐ^ permettant ainsi de limiter l'infection aux voies respiratoires supérieures. Lorsque mis en présence de son substrat la D-luciférine, la luciférase permet de détecter le virus par réaction de bio luminescence et ainsi suivre en temps réel la réplication du virus RSV chez la souris.
3eme étape : Analyse de la réplication virale chez la souris
Aux jours Jl et J4 : La réplication virale est analysée par un système d'imagerie in vivo (IVIS) basé sur la détection de bioluminescence. Les souris sont, au préalable, anesthésiées et la D-luciférine administrée par voie intranasale juste avant la lecture. Les souris une fois analysées sont ensuite sacrifiées pour prélever les poumons ainsi que les fosses nasales afin de conduire un test de bio luminescence sur broyats d'organes (basé sur la détection de la luciférase, exprimée par virus RSV).
Claims
1. Composition d'immunoglobulines (Ig) hyper-enrichie en immunoglobulines anti- virus respiratoire syncytial (RSV), pour son utilisation dans le traitement prophylactique d'une infection par le virus RSV chez un sujet, par application de la composition au niveau des muqueuses des voies respiratoires supérieures, ladite composition comprenant en outre un muco-adhésif.
2. Composition d'immunoglobulines (Ig) hyper-enrichie en immunoglobulines anti-virus respiratoire syncytial (RSV) pour son utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que les muqueuses des voies respiratoires supérieures consistent en les muqueuses des cavités nasales et/ou du nasopharynx.
3. Composition d'Ig hyper-enrichie en immunoglobulines anti-RSV pour son utilisation selon la revendication 1 ou 2, ledit muco-adhésif étant sélectionné dans le groupe constitué de : acide polyacrylique ou ses dérivés, diméthyl aminé, acide polylactique, carbomère, polycarbophyle, polyméthacrylate de méthyle ou ses dérivés, poloxamères, Pluronic F 127, alcool polyvinylique, cellulose ou ses dérivés, méthylcellulose, Methocel A15C, Methocel A4C, carboxyméthylcellulose, carboxyméthylcellulose de sodium, hydroxypropylcellulose, hydroxypropylméthylcellulose, chitosane ou ses dérivés et ses sels pharmaceutiquement acceptables, glutamate de chitosane, chitosane de poids moléculaire moyen, chitosane déacétylée à plus de 50%, chitosane thiolée, N-triméthyl-chitosane, alginates, microparticules d'alginates conjugués aux lectines, amidons prégélatinisés, pectines, acide hyaluronique, sulfate de chondroïtine, N vinyl pyrrolidone, polyvinylpyrrolidone, gélatine, phosphoglycérine, dextrans et ses dérivés comme les amino dextrans ou DEAE-dextran, polyéthylène glycol, polyéthylène glycol 4000, nanoparticules hydrogel de poly(acide méthacrylique greffé de poly(éthylène glycol)), polymères thiolés, polymères porteurs de groupes boronates, alginate de sodium, gommes d'oligosaccharides naturels, gommes xanthanes, gommes gellanes, carbomères et carboxypolyméthylènes, Carbopol 974P, Carbopol 971P, sea curve 240, scléroglucanes, polycarbophiles .
4. Composition d'Ig hyper-enrichie en immunoglobulmes anti-RSV selon la revendication 3 ledit muco-adhésif étant sélectionné dans le groupe constitué de :
- méthylcellulose (MC), en particulier Methocel A15C et Methocel A4C, et dérivés de méthylcellulose tels que le carboxyméthylcellulose (CMC) ou l'hydroxypropylméthylcellulose (HPMC), notamment l'hydroxypropylméthylcellulose de faible viscosité ou viscosité médiane, en particulier le HPMC K4M ou HPMC K15M
- poloxamères, en particulier le Pluronic F 127
- chitosane et ses dérivés, en particulier chitosane de poids moléculaire moyen, chitosane déacétylée à plus de 50% (>50%DD), chitosane thiolée et N-triméthyl-chitosane
- carbomères et carboxypolyméthylènes, en particulier Carbopol 971P et Carbopol 974
- alcool polyvinylique (PVA)
- polyéthylène glycol (PEG), en particulier polyéthylène glycol 4000 (PEG 4000)
- gomme xanthane
- gomme gellane
- pectine, et en particulier pectine naturelle additionnée de Ca2+
- N vinyl pyrrolidone (Providone)
- diméthyle aminé
- phosphoglycérine
- acide polylactique
- polymères porteurs de groupes boronates
- alginate de sodium
seul ou en mélange.
5. Composition d'Ig hyper-enrichie en immunoglobulmes anti-RSV selon la revendication 3 ou 4, ledit muco-adhésif ou mélange de muco-adhésifs étant sélectionné parmi :
- carboxyméthyl-cellulose (CMC)
- poloxamères, et en particulier le Pluronic F 127
- poloxamères, et en particulier le Pluronic F 127, associé à la chitosane
- poloxamères, et en particulier le Pluronic F127, associé à la carboxylméthyl- cellulose CMC - hydroxypropylméthyl- cellulose (HPMC) de faible viscosité ou de viscosité médiane, en particulier l'HPMC K4M ou HPMC K15M
- chitosane déacétylée à plus de 50% (>50%>DD) associée à un alcool polyvinylique (PVA)
- chitosane associée à du polyéthylène glycol (PEG), et en particulier au polyéthylène glycol 4000 (PEG 4000)
- gomme xanthane
6. Composition d'Ig hyper-enrichie en immunoglobulines anti-RSV pour son utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, ladite composition comprenant en outre un composé bactériostatique.
7. Composition d'Ig hyper-enrichie en immunoglobulines anti-RSV pour son utilisation selon la revendication 6, ledit composé bactériostatique étant sélectionné dans le groupe constitué de : chlorure de benzalkonium, alcool benzylique, chlorobutanol, parabènes, alcool phényléthylique, acide benzoïque , EDTA, 2-pyrrolidone, et leurs dérivés.
8. Composition d'Ig hyper-enrichie en immunoglobulines anti-RSV pour son utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, comprenant une concentration d'immunoglobulines anti-RSV comprise entre 10 et 250g/L, de préférence entre 10 et 100g/L.
9. Composition d'Ig hyper-enrichie en immunoglobulines anti-RSV pour son utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle est destinée à être administrée sous forme de particules ou de gouttelettes ayant une taille comprise entre 2 et 100 μιη, plus préférentiellement entre 5 et 50 μιη.
10. Composition d'Ig hyper-enrichie en immunoglobulines anti-RSV pour son utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle est destinée à être administrée sous forme de gouttes nasales, de suspension, de poudre, d'émulsion, de gel, de pommade, de crème, d'aérosol.
11. Composition d'Ig hyper-enrichie en immunoglobulines anti-RSV pour son utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle est destinée à être administrée à l'aide d'un dispositif, ledit dispositif étant sélectionné dans le groupe constitué de : un système de dispersion de poudre, un goutte à goutte, un système d'atomisation ou de pulvérisation, un spray nasal, un nébuliseur.
12. Composition d'Ig hyper-enrichie en immunoglobulines anti-RSV pour son utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle est destinée
à être administrée dans la narine du sujet, de préférence avec un volume d'administration compris entre 50 et 250μΙ^ par narine.
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