WO2017055775A1 - Procédé d'enrichissement d'une préparation d'immunoglobulines en immunoglobulines anti-rsv et préparation ainsi enrichie - Google Patents

Procédé d'enrichissement d'une préparation d'immunoglobulines en immunoglobulines anti-rsv et préparation ainsi enrichie Download PDF

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WO2017055775A1
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Gérald PERRET
Abdessatar Chtourou
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Laboratoire Francais Du Fractionnement Et Des Biotechnologies
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    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Definitions

  • the present invention relates to the enrichment of a preparation of immunoglobulins (Ig) derived from human plasma, immunoglobulins capable of recognizing and advantageously neutralizing respiratory syncytial virus (RSV).
  • Ig immunoglobulins
  • RSV respiratory syncytial virus
  • Respiratory syncytial virus is a common infectious agent of the respiratory tract.
  • RSV Respiratory syncytial virus
  • anti-viral drugs are proposed to treat RSV infections, their efficacy in children is debatable.
  • RespiGam® a hyperimmune normal immunoglobulin pool preparation that contains a high immunoglobulin titer against RSV, has been used as an alternative immunoprophylactic approach. Nevertheless, RespiGam® is a concentrate of hyperimmune immunoglobulins, so it is prepared from plasma of subjects selected for their high titre in anti-RSV immunoglobulins, and using a conventional immunoglobulin fractionation method. Thus, while comprising more anti-RSV immunoglobulins than a conventional immunoglobulin concentrate, RespiGam® does not comprise more than 1% of anti-RSV immunoglobulins. In addition, the selection of donors limits the volume of production.
  • Gupta et al, PLOS One, 2013, 8 (7): 1-5 showed the presence of anti-RSV immunoglobulins in intravenous immunoglobulin G preparations (IglV), obtained from plasma pools. thousands of healthy blood donors.
  • IglV immunoglobulin G preparations
  • Gupta et al retained RSV-specific immunoglobulins, by passage on affinity matrices presenting the recombinant RSV G protein.
  • the presence of anti-RSV immunoglobulins in these IglV preparations is explained by the high prevalence of the virus throughout the world. Nevertheless, Sastre et al have shown that such IglV preparations have a low neutralizing power with respect to RSV.
  • the inventors now propose to subject immunoglobulin (Ig) preparations derived from human plasma or blood plasma fractions to affinity chromatography using an RSV protein as an affinity ligand, to obtain hyper-immune immunoglobulin preparations.
  • Ig immunoglobulin
  • RSV respiratory syncytial virus
  • the F protein of RSV virus advantageously stabilized in pre-fusion or post-fusion conformation, is used as an affinity chromatography ligand.
  • the particular conformations of the RSV F protein, and in particular the pre-fusion conformation, advantageously make it possible to retain more particularly anti-RSV immunoglobulins with a neutralizing power.
  • An object of the invention is more specifically a process for preparing an immunoglobulin (Ig) concentrate useful for treating an RSV infection comprising a step comprising subjecting an Ig composition derived from blood plasma to an affinity chromatography employing a specific RSV ligand.
  • Ig immunoglobulin
  • This RSV-specific ligand may be an RSV protein, particularly RSV G, SH and F proteins, or a variant of these proteins or an antigenic fragment of these proteins or variants thereof.
  • the RSV-specific ligand is an RSV F protein, preferably in a pre-fusion conformation, or a variant, or an antigenic fragment thereof, or a variant thereof.
  • the RSV specific ligand for example RSV virus F protein, preferably in pre-fusion conformation, or an antigenic fragment thereof, is attached to the affinity matrix by a linkage. covalente, either directly or via a spacer.
  • the RSV protein may be a variant protein, for example it may be an RSV F protein carrying the mutations S155C, S290C, S190F and / or V207L.
  • Another object of the invention is an Ig concentrate enriched in anti-RSV Ig, obtained by the above method, particularly useful in the treatment of an RSV infection.
  • Figure 2 also extracted from McLellan et al, illustrates the passage from the prefusion conformation (left in the figure) to the postfusion conformation (right in the figure) of the antigenic site 0;
  • Figure 3 shows a plot of percent infection versus log of antibody concentration
  • Figure 4 shows a plot of percent infection versus log of antibody concentration
  • FIG. 5 represents the impact of the F protein ligand on the IVIG seroneutralization Detailed description of the invention
  • the RSV
  • Respiratory syncytial virus is a common infectious agent of the respiratory tract.
  • RSV generally causes a mild, asymptomatic or weak (cold) infection in immunocompetent individuals, but may be responsible for several infectious episodes per year on the same individual, which may cause absenteeism or job.
  • RSV is the most important cause of bronchiolitis and pneumonia in infants and young children, and is largely responsible for respiratory infections in nursing homes.
  • RSV or "respiratory syncytial virus” is intended to mean both the free viral particle present in the patient's biological fluids, and the viral particle having fused with a patient's host cell and giving rise to the syncitia formation.
  • RSV proteins :
  • Respiratory syncytial virus is an RNA virus comprising 10 genes encoding 11 proteins among which: protein M, the matrix protein necessary for the assembly of the viral particle; the M2 protein, 2nd matrix protein, also required for transcription. M2 contains CD8 epitopes;
  • P protein the N protein of the nucleocapsid that will associate with the viral genome
  • SH protein protein G (highly glycosylated transmembrane glycoprotein responsible for binding to the host cell)
  • F protein transmembrane glycoprotein responsible for fusion to the host membrane, virus entry in the cell and formation of syncitia
  • the term "RSV protein” is intended to mean one of the 11 proteins encoded by the genome of the virus in its native form, or one of their variants or their antigenic fragments. Among these proteins, some are advantageously present on the surface of the RSV, playing a role in the mechanisms of infection, especially during the recognition, the binding of the viral particle to its host cell, the melting of the particle. viral to its host cell and the spread of the host cell host cell virus.
  • These proteins having the advantage of being accessible to the immune system, are in particular: the SH protein,
  • the accessibility of these surface proteins can be constitutional or induced.
  • the accessibility of the protein can be modified by a change of conformation, revealing all or part of epitopes that were hitherto inaccessible to the immune system.
  • the term "RSV surface proteins” is intended to mean one or a combination of proteins accessible to the immune system, in their native form irrespective of their conformation, one of their variants, or their antigenic fragments. .
  • the surface proteins of RSV are present on the membrane of RSV, both on the free viral particle present in the patient's biological fluids, and on the viral particle having fused with a patient's host cell and giving rise to the formation of syncitia.
  • the term "variant” includes any sequence subject to one or more substitutions, additions and / or deletions without substantially altering the conformation of the protein and / or the stability of the protein.
  • the variants considered have a sequence identity of at least 80%, preferably at least 85%, more preferably at least 90%, more preferably at least 95%.
  • the antigenic fragments allow the attachment of neutralizing anti-RSV immunoglobulins.
  • these are fragments of at least 10 amino acids, more preferably at least 20, 30, 40, or 50 amino acids, which comprise one or more epitopes of an RSV protein.
  • the antigenic fragments of the RSV proteins used are advantageously peptides offering linear epitopes, not constrained by the three-dimensional structure, which may be exposed during changes in the conformation of the protein.
  • the antigenic fragments of the RSV proteins used are advantageously also peptides offering conformational epitopes, which may be exposed during changes in the conformation of the protein.
  • RSV F protein is a surface glycoprotein that mediates the virion fusion phenomenon with the membrane of the cell that it infects, allowing the virus to enter the cytoplasm of the cell. Protein F has conformational diversity. The fusion proceeds from the difference in folding energy between two states: a metastable state adopted before the virus-cell interaction (this is the "pre-fusion” state), and a stable state formed after the fusion (c '). is the state of "post-fusion”).
  • the RSV F protein used according to the invention discloses epitopes for the binding of anti-RSV neutralizing immunoglobulins. In a particular embodiment of the invention, the RSV F protein used is in pre-fusion conformation.
  • antigenic site 0 The native sequence of the RSV F protein (SEQ ID NO: 1) is listed on the Genbank database, accession number AHB33455.
  • SEQ ID NO: 1 mellihrssa ifltlainal yltssqnite efyqstcsav srgylsalrt gwytsvitielsniketkcn gtdtkvklik qeldkyknav telqllmqnt paannrarre apqymnytinttknlnvsis kkrkrrflgf llgvgsaias giavskvlhl egevnkikna llstnkavvslsngvsvlts kvldlknyin nqllpivnqqcremenietv iefqqknsrl leitrefsvnagvttplsty mltnsellsl indmpitndq kklmssnvqi vrqqsysims
  • RSV virus F protein refers to the native form of sequence SEQ ID NO: 1, or to one of its variants.
  • variant includes any sequence subject to one or more substitutions, additions and / or deletions without substantially altering the conformation of the protein and / or the stability of the protein.
  • the variants considered have a sequence identity of at least 80%, preferably at least 85%, more preferably at least 90%, more preferably at least 95% with the native sequence.
  • Variants of the F protein are, for example, described on the Genbank basis, under access numbers AAB59858 (SEQ ID NO: 2) and PI 1209 (SEQ ID NO: 3).
  • SEQ ID NO: 2 (AAB59858): mellilkana ittiltavtf cfasgqnite efyqstcsav skgylsalrt gwytsvitielsnikenkcn gtdakvklik qeldkyknav telqllmqst pptnnrarre lprfmnytlnnakktnvtls kkrkrrflgf llgvgsaias gvavskvlhl egevnkiksa llstnkavvslsngvsvlts kvldlknyid kqllpivnkq scsisnietv iefqqknnrl leitrefsvnagvttpvsty mltnsellsl indmpitndq kklmsnnvq
  • SEQ ID NO: 3 (P11209): melpilktna itailaavtl cankqnite efyqstcsav skgylsalrt gwytsvitielsnikenkcn gtdakvklik qeldkyksav telqllmqst patnnrarre lprfmnytlnntkntnvtls kkrkrrflgf llgvgsaias giavskvlhl egevnkiksa llstnkavvslsngvsvlts kvldlknyid kqllpivnkq scsisnietv iefqqknnrl leitrefsvnagvttpvsty mltnsellsl indmpitndq kklmsnnv
  • variants designated “DS” (carrying the double mutation S155C, S290C), “Cav1” (carrying the double mutation S190F, V207L) or “DS-Cav1” (carrying the four mutations S155C, S290C, S 190F, V207L), as described in McLelland et al., 2013, SCIENCE, 342: 592-598.
  • the variant designated "DS-Cav1" carrying the mutations S155C, S290C, S190F, V207L is used.
  • RSV F protein without its pre-fusion conformation, can be prepared by any standard purification technique, by peptide synthesis and in particular by chemical synthesis, genetic engineering, or other.
  • a recombinant F protein is used, which can be obtained by a conventional method of producing recombinant proteins, comprising the transfer of an expression vector into a host cell, under conditions allowing the expression of the recombinant protein encoded by the vector, and the recovery of the protein thus produced.
  • the expression vector can be prepared according to methods commonly used by those skilled in the art, and can be introduced into the host cell, by standard methods, such as lipofection, electroporation, heat shock or the like.
  • the host cell may especially be a bacterium, a yeast, a foam, a fungus, a plant cell or a mammalian cell.
  • the antigenic fragments of RSV F protein can alternatively be used as ligands of affinity chromatography.
  • the antigenic fragments allow the attachment of neutralizing anti-RSV immunoglobulins.
  • the antigenic fragments of the F protein of the RSV used are advantageously peptides offering linear epitopes, not constrained by the three-dimensional structure, which are normally exposed on the F protein in prefusion conformation but which are not exposed to the solvents in post-fusion conformation.
  • the antigenic fragments of the RSV F protein used are advantageously also peptides with conformational epitopes, which are normally exposed on the F protein in prefusion conformation, but which are not exposed to solvents in post-fusion conformation.
  • fragments designated "F24-136" fragment F derived from the chain F2
  • fragments designated "F164-315" fragment 2/3 N-terminal chain Fl
  • fragments designated "F283-402” central segment of chain F1
  • F403-524 as described in the article Sastre et al, Vaccine 23 (2004) 435-443.
  • fragments corresponding to the peptides designated "F167-201” fragment heptad repeat A
  • fragment heptad repeat B fragment corresponding to the peptides designated "F167-201" (fragment heptad repeat A), “F235-275” (antigenic site fragment II) and "F478-512" (fragment heptad repeat B) as described in Sastre et al., Vaccine 23 (2004) 435-443.
  • fragments designated "F24- 136", “F 164-31”, “F283-402”, “F403-524”, “F167-201", “F235-275” are used, and / or "F478-512".
  • fragments corresponding to the heptad repeat A and / or heptad repeat B regions of the F protein are used, alone or in combination.
  • the antigenic fragments of the RSV F protein used are a combination of several peptides proposing linear epitopes, not constrained by the three-dimensional structure, which are normally exposed on the F protein in conformation prefusion. but which are not exposed to solvents in postfusion conformation.
  • RSV G protein is a surface transmembrane glycoprotein that binds the virus to the host cell. It interacts with the CX3CR1 receptor of the host cell to modulate the immune response and facilitate infection.
  • Protein G comprises 289 to 299 amino acids or 32-33kDa, depending on the strain, and is palmitoylated. Highly glycosylated, it comprises 30-40 O-glycosylations and 4-5 N-glycosylations. Glycosylation and thus the size of the G protein depends on the cell type in which it is produced: 80-100 kDa in immortalized cell lines, but 180 kDa in primary cultures of epithelial amniotic cells.
  • Protein G comprises a conserved core domain (130-230) with a highly conserved portion of 13 amino acids (164-176), a "cysteine noose” with 2 disulfide bridges (C173, C176, C182, C1 86), and a CX3C motif of 5 amino acids (Cl 82-XXX-C186).
  • the strain B RSV further comprises a repeat domain of 20 amino acids in the second mucin-like domain, while the strain A RSV comprises in the same region a repeat domain of 24 amino acids.
  • the RSV G protein used according to the invention has epitopes for the binding of anti-RSV neutralizing immunoglobulins.
  • the RSV G protein used is derived from RSV strain A and designated GA.
  • SEQ ID NO: 4 The native sequence of the RSV GA protein (SEQ ID NO: 4) is listed on the Genbank database under access number P27022.
  • SEQ ID NO: 4 msknkdqrta ktlertwdtl nhllfisscl yklnlksvaq itlsilamii stsliivaii fiasanhkit stttiiqdat nqiknttpty ltqnpqlgis psnpsditsl ittildsttp gvkstlqstt vgtkntttq aqpnkpttkq rqnkppskpn ndfhfevfnf vpcsicsnnp tcwaickrip nkkpgkrttt kptkkptpkt tkkgpkpqtt kske
  • the RSV G protein used is derived from RSV strain B and designated GB
  • the native sequence of the RSV GB protein (SEQ ID NO: 5) is listed on the Genbank database under accession number 036633.
  • RSV virus protein G refers to the native form of sequence SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 5, or to one of its variants.
  • variants of the G protein are used.
  • variant includes any sequence subject to one or more substitutions, additions and / or deletions without substantially altering the conformation of the protein and / or the stability of the protein.
  • the variants considered have a sequence identity of at least 80%, preferably at least 85%, more preferably at least 90%, more preferably at least 95% with the native sequence.
  • the RSV G protein may be prepared by any of the standard purification techniques, by peptide synthesis and in particular by chemical synthesis, genetic engineering, or the like.
  • a recombinant G protein is used, which can be obtained by a conventional method of producing recombinant proteins, comprising the transfer of a vector expression in a host cell, under conditions allowing the expression of the recombinant protein encoded by the vector, and the recovery of the protein thus produced.
  • the expression vector can be prepared according to methods commonly used by those skilled in the art, and can be introduced into the host cell, by standard methods, such as lipofection, electroporation, heat shock or the like.
  • the host cell may especially be a bacterium, a yeast, a foam, a fungus, a plant cell or a mammalian cell.
  • the antigenic fragments of the RSV G protein may alternatively be used as ligands for affinity chromatography.
  • the antigenic fragments allow the attachment of neutralizing anti-RSV immunoglobulins.
  • the antigenic fragments consist of all or part of the conserved central region of the G protein (164-186).
  • the antigenic fragments of the RSV G protein used are advantageously peptides offering linear epitopes, not constrained by the three-dimensional structure, which are normally exposed on the G protein.
  • the antigenic fragments of the RSV G protein used are advantageously also peptides with conformational epitopes, which are normally exposed on the G protein.
  • fragments "G2Na” and “G2Nb” fragments 130-230 as described in Nguyen et al., PLoS ONE, March 2012, Volume 7, Issue 3 or the "Gs” fragments as described in Sastre et al. al, Vaccine 23 (2004) 435-444 in particular in Figure 6.
  • fragments designated “G2Na” and / or “G2Nb” and / or “Gs” are used.
  • the fragments corresponding to the conserved regions of the G protein are used, alone or in combination.
  • the antigenic fragments of the RSV G protein consist of one or more peptides corresponding to an exposed area of the virus.
  • the antigenic fragments of the G protein of the RSV used are a combination of several peptides offering linear epitopes, not constrained by the three-dimensional structure, advantageously of several peptides of strains A and / or B. .
  • the RSV G protein or its variants or fragments is glycosylated, preferably sufficiently glycosylated to maintain a minimal conformation of the epitope (s) allowing their recognition by anti-RSV immunoglobulins.
  • the method of the invention implements affinity chromatography.
  • This chromatography uses a matrix comprising a support based on polymer particles, and is preferably in the form of a gel or a resin.
  • These polymer particles are preferably of spherical or oblong shape, it may be in particular beads.
  • the polymer may be natural or non-natural, organic or inorganic, crosslinked or uncrosslinked.
  • the polymer is preferably an organic polymer, preferably crosslinked.
  • the polymer is cellulose, and the particles are preferably porous cellulose beads.
  • Other types of possible polymers include agarose, dextran, polyacrylates, polystyrene, polyacrylamide, polymethacrylamide, copolymers of styrene and divinylbenzene, or mixtures of these polymers.
  • the particles can provide a chromatography medium that can be used to fill a column, for example.
  • the substrate-grafted protein is an RSV surface protein, for example RSV F protein or RSV G protein, or an antigenic fragment thereof, either directly or via a spacer, which covalently links the ligand to the particles of the chromato graphical support.
  • the grafted support has several different ligands.
  • the support can then be grafted with several different proteins and / or several antigenic fragments different from the RSV, advantageously several RSV surface proteins or their fragments, in order to obtain an anti-RSV immunoglobulin concentrate with different antigenic targets.
  • the grafted support thus has a mixture of ligands consisting of: protein F in conformation prefusion, and / or
  • F protein in postfusion conformation and / or
  • GA protein and / or
  • GB protein and / or their respective fragments or variants.
  • the grafted support thus has a mixture of ligands consisting of: protein F in prefusion conformation, advantageously the ligand hRSV-F 11049-V08B, and
  • GA protein advantageously the ligand 11070-V08H2, SB, and
  • GB protein advantageously 13029-VO8H ligand, SB.
  • the support may also be grafted with one or more RSV proteins and one or more proteins from one or more other infectious agents to obtain a concentrate comprising both anti-RSV immunoglobulins (optionally having different antigenic targets) and immunoglobulins directed against another infectious agent.
  • each protein corresponds to at least 30% by weight, or at least 50% by weight of the grafted antigens on the support.
  • a particle can carry several spacers.
  • the bond between the ligand and spacer may be, for example, an amide bond.
  • the spacer typically comprises at least one C, O, N, or S atom.
  • the ligands are chemically immobilized by covalent bonds between the particles and the spacer, and between the spacer and the ligand. This immobilization can be carried out in a conventional manner by those skilled in the art.
  • the particle carries an -NH-R1-COOH arm.
  • it is alpha-aminocaproic acid (where R1 is a pentyl group).
  • the particle may be activated using bifunctional reagents such as epichlorohydrin, epibromohydrin, dibromo-and dichloropropanol, dibromobutane, ethylene glycol diglycidyl ether, butanediol diglycidylether, divinylsulfone, allylglycidylether, and bromide. allyl.
  • the bifunctional reagent is capable of reacting with both the particles and the -NH-R1-COOH arm. Allyl heterofunctional compounds, such as allyl bromide, are preferred bifunctional reagents and provide an activated matrix.
  • the gel matrix is prepared by conventional addition of a buffer to the ligand-carrying polymer particles, as known to those skilled in the art, so as to obtain a gel matrix suitable for chromatography. affinity.
  • the matrix as defined herein is useful in affinity chromatography binding anti-RSV immunoglobulins.
  • the matrix is particularly useful in mixed bed affinity chromatography.
  • Such a matrix advantageously comprises several different antigens from RSV and is therefore able to bind anti-RSV immunoglobulins directed against several different epitopes.
  • Such a matrix may also advantageously comprise several different antigens from different infectious agents, and is therefore capable of binding both anti-RSV immunoglobulins and immunoglobulins directed against another selected infectious agent.
  • the matrix can be introduced into a chromatography column.
  • the column may contain from 1 to 150 liters, or even 250 to 500 liters, if necessary.
  • columns of 1 to 50 cm in height can be used, the diameter is then adapted to the column height used.
  • the matrix volume can also be adjusted to meet the constraints of an industrial process, in particular to be adapted to the volumes of product to be treated.
  • the anti-RSV immunoglobulins present in the plasma or plasma fraction bind to the matrix, and the adsorbed product is eluted and recovered, enriched in anti-RSV immunoglobulins.
  • the matrix is grafted with protein F ligands in post-fusion or pre-fusion conformation.
  • the RSV F protein remains and / or returns to its pre-fusion conformation during all stages of preparation and use of the matrix: grafting, washing, balancing, loading, washing, elution , regeneration, sanitization.
  • the RSV F protein is grafted onto the matrix in its prefusion conformation.
  • the grafting method and the possible choice of the spacer are therefore adapted by those skilled in the art in order to maintain the RSV F protein in the prefusion conformation.
  • the matrix is grafted with protein G ligands derived from RSV strain A and / or strain B.
  • the conditions for implementing the affinity chromatography according to the invention are adapted by those skilled in the art to guarantee the reuse of the matrix according to the invention while maintaining non-degrading elution conditions for the product of interest.
  • the plasma or the starting plasma fraction subjected to the enrichment process of the invention advantageously consist of plasma originating from blood plasmas or blood plasma pools of mammalian subjects (human or non-human) or in a fraction of this plasma, or any part or subpart of the plasma, having undergone one or more purification steps.
  • the plasma or starting plasma fraction subjected to the enrichment process of the invention advantageously consist of plasma from blood plasma or pools of blood plasma from nonhuman mammalian subjects, male and / or females, preferably goat, ewe, goat, bison, buffalo, camel, llama, mouse, rat, cow, bull, pig, sow, rabbit (e), horse, mare.
  • the non-human mammal is advantageously transgenic and has been previously exposed to the RSV virus in order to produce anti-RSV human immunoglobulins in its plasma.
  • the plasma or the starting plasma fraction subjected to the enrichment process of the invention advantageously consist of plasma originating from plasma pools of normal human subjects or in a fraction of this plasma, or any part or subpart of the plasma, having been subjected to one or more purification steps.
  • the plasma fractions that can be used include the cryoprecipitated plasma supernatant, the plasma cryoprecipitate (resuspended), the fractions I to V obtained by ethanolic fractionation (according to the Cohn or Kistler & Nitschmann method), the supernatant and the precipitate obtained. after precipitation with caprylic acid and / or caprylate, the chromatographic eluates and the non-adsorbed fractions of chromato graphie columns, and the filtrates.
  • the plasma or the starting plasma fraction subjected to the enrichment process of the invention comes from pools of blood plasmas of normal human subjects, without prior selection of the donors, in particular, without selection of the donors on the basis of their possible plasma level of anti-RSV immunoglobulins.
  • the plasma or the initial plasma fraction subjected to the enrichment process of the invention thus advantageously comprises a level of anti-RSV immunoglobulins similar or equal to the anti-RSV immunoglobulin level of a plasma from the pool of minus 1000 normal human donors randomly selected.
  • the plasma or the starting plasma fraction subjected to the enrichment process of the invention is advantageously not enriched with anti-RSV immunoglobulins compared with the anti-RSV immunoglobulin level of a plasma originating from the pool of at least 1000 chosen donors. randomly.
  • the plasma or starting plasma fraction subjected to the enrichment process of the invention contains polyvalent human immunoglobulins which may be immunoglobulin A (IgA), immunoglobulin E (IgE), immunoglobulin M (IgM) or immunoglobulin G (IgG).
  • polyvalent human immunoglobulins which may be immunoglobulin A (IgA), immunoglobulin E (IgE), immunoglobulin M (IgM) or immunoglobulin G (IgG).
  • the plasma or the initial plasma fraction essentially contains IgG irrespective of their subclass (IgG1, IgG2, IgG3 and IgG4) and / or IgM.
  • the method of the invention preferably uses as a starting sample a plasma or a plasma fraction originating from blood plasma pools of normal human subjects, without prior selection of the donors, in particular, without selection of the donors on the basis of their possible plasma levels.
  • the method of the invention may typically be an independent method, dedicated to the purification of anti-RSV immunoglobulins only, and is then advantageously performed from plasma or a plasma fraction.
  • the method according to the invention advantageously comprises the following steps: providing a plasma sample or a plasma fraction,
  • the method according to the invention may further comprise, after the step of capture on anti-RSV affinity chromatography, a dedicated step of depletion of certain immunoglobulins, in particular immunoglobulins E (IgE) and / or immunoglobulins (IgM), which may be involved in mechanisms of deleterious side effects in patients.
  • immunoglobulins E immunoglobulins E
  • IgM immunoglobulins
  • the method advantageously further comprises a subsequent step of subjecting the anti-RSV immunoglobulin hyper-enriched immunoglobulin composition to at least one inactivation and / or viral elimination step.
  • the method for obtaining anti-RSV immunoglobulins is made from an unused plasma fraction from a method of purifying an additional plasma protein.
  • the method according to the invention advantageously comprises the following steps: providing a plasma sample or a plasma fraction that is not used in a method for purifying a plasma protein,
  • the method according to the invention may further comprise, after the chromatographic capture step. of anti-RSV affinity, a dedicated stage of depletion of certain immunoglobulins, in particular immunoglobulins E (IgE) and / or immunoglobulins (IgM), which may be involved in mechanisms of deleterious side effects in patients.
  • immunoglobulins E immunoglobulins E
  • IgM immunoglobulins
  • the method advantageously further comprises a subsequent step of subjecting the anti-RSV immunoglobulin hyper-enriched immunoglobulin composition to at least one inactivation and / or viral elimination step.
  • the process for obtaining anti-RSV immunoglobulins is coupled to a polyvalent G immunoglobulin method in order to obtain, from the same starting plasma pool, both a polyvalent G immunoglobulin concentrate and a hyper-enriched anti-RSV immunoglobulin concentrate.
  • the process of the invention then typically comprises a preliminary step of obtaining the plasma fraction, by ethanolic fractionation and / or caprylic fractionation and / or chromatographic separation.
  • the method according to the invention advantageously comprises the following steps: providing a sample of a prepurified plasma fraction obtained by ethanolic fractionation and / or caprylic fractionation and / or chromato graphical separation
  • chromatographic separation is meant any chromatography step, whether it is ion exchange chromatography (anion exchange and / or cation exchange), mixed mode, affinity (using ligands chemical type, antibodies, antibody fragments, aptamers).
  • Chromatographic separation according to the invention means both a single chromatography column, or a set of chromatography columns, whether or not using the same type of support, in series (multicolumn mode for example) or in parallel.
  • the plasma fraction can be obtained by an ethanol fractionation originally developed by Cohn et al (Cohn et al, 1946. J. Am Chem Soc 68, 459, Oncley et al, 1949, J. Am. Soc 71, 541), or by chromatographic separation, as described, for example, in EP 0 703 922 and WO 99/64462, or by caprylic fractionation as described by Steinbuch et al 1969, Arch Biochem. Biophys. 134 (2): 279-84).
  • a blood plasma, or an Ig-enriched blood plasma fraction is subjected to caprylic fractionation (prepurification by precipitation of non-immunoglobulin contaminants), and a single chromatography on an anion exchange resin carrier carried out at pH. alkaline.
  • a viral inactivation treatment can be carried out, preferably carried out by solvent-detergent, as described by Horowitz in US Pat. No. 4,764,369, optionally supplemented by a step of viral elimination by nanofiltration on a 75N, 35N pore size filter, 20N and / or 15N.
  • the Ig fraction thus harvested is already concentrated, but can then undergo additional concentration steps by ultrafiltration, and sterilizing filtration. This concentrate is then subjected to an immunoaffinity chromatographic step on the matrix of the invention.
  • the method according to the invention may furthermore comprise, preferably after the step of capture on anti-RSV affinity chromatography, a dedicated stage of depletion of certain immunoglobulins, in particular immunoglobulins A (IgA), and / or immunoglobulin E (IgE) and / or immunoglobulin M (IgM), which may be involved in mechanisms of deleterious side effects in patients.
  • immunoglobulins to be depleted are advantageously selected in particular according to the route of administration chosen for the anti-RSV immunoglobulin hyper-enriched immunoglobulin concentrate and / or according to the content of the plasma sample or of the starting plasma fraction.
  • the method according to the invention comprises an anion exchange chromatography step, advantageously using a TMAE-type chromatography, in order to deplete the immunoglobulin M (IgM) of the hyper-enriched immunoglobulin composition.
  • anti-RSV immunoglobulins The method advantageously further comprises a subsequent step of subjecting the anti-RSV immunoglobulin hyper-enriched immunoglobulin composition to at least one inactivation and / or viral elimination step.
  • the inactivation and / or viral elimination step may consist of acidic pH treatment, solvent-detergent treatment, pasteurization, dry heating, nanofiltration and / or sterilizing filtration.
  • the method comprises a step of inactivation by solvent-detergent and a step of viral elimination by nanofiltration.
  • the method comprises a subsequent step of viral elimination by nanofiltration,
  • the method may further comprise the subsequent steps of adding one or more pharmaceutically acceptable stabilizers; and optionally freeze or lyophilize the concentrate thus obtained.
  • composition of hyper-enriched immunoglobulins Composition of hyper-enriched immunoglobulins:
  • the hyper-enriched immunoglobulin composition obtained according to the enrichment method of the invention essentially contains polyvalent human immunoglobulins which may be immunoglobulin A (IgA), immunoglobulin E (IgE), immunoglobulin M (IgM) or immunoglobulins.
  • immunoglobulin G immunoglobulin G
  • the immunoglobulin composition essentially contains IgG and / or IgM and / or IgA.
  • the immunoglobulin composition according to the invention essentially comprises IgG, regardless of their subclass (IgG1, IgG2, IgG3 and IgG4).
  • the composition may be adapted by those skilled in the art depending on the chosen route of administration and / or the desired mechanism of action.
  • the intravenous composition preferably contains predominantly IgG and / or IgM, and is advantageously depleted of IgA.
  • the composition in other routes of administration such as the local route, preferably contains mainly IgG and / or IgA, IgA allowing the recruitment of cells such as mucosal cells with alfa receptors.
  • the immunoglobulin composition obtained according to the enrichment method of the invention is a hyper-enriched anti-RSV immunoglobulin immunoglobulin composition which has a neutralizing action with respect to RSV and has a therapeutic efficacy for the patient.
  • hyper-enriched anti-RSV immunoglobulin composition is meant an immunoglobulin composition comprising at least 10%, at least 20%, at least 30%, at least 40%, at least 50%, at least 60%, at least 65%, at least 70%, at least 75%, at least 80%; at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99% by weight neutralizing immunoglobulins vis-à-vis the RSV.
  • the hyper-enriched anti-RSV immunoglobulin composition according to the invention advantageously comprises 10% to 100% by weight of neutralizing immunoglobulins vis-à-vis the RSV, still more advantageously. % to 100% by weight of RSV neutralizing immunoglobulins, preferably 60% to 100% by weight neutralizing immunoglobulins vis-à-vis the RSV.
  • the anti-RSV immunoglobulin composition advantageously has a higher neutralizing power against the RSV virus than that of the blood plasma of normal human subjects, greater than that of the plasma of subjects. selected for their anti-RSV immunoglobulin titre, higher than that of the RSV (RSV-IVIG) hyperimmune immunoglobulins such as Respigam® or RI-002 from Adma Biologics, and / or higher than that of the anti-RSV monoclonal antibodies such as palivizumab (Synagis®).
  • the anti-RSV immunoglobulin composition comprises at least 10%, at least 20%, at least 30%, at least 40%, at least 50%, at least 60%, at least 65%, at least 70%, at least 75%, at least 80%; at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99% by weight of immunoglobulins specifically directed against at least one epitope of the F protein .
  • the hyper-enriched anti-RSV immunoglobulin composition according to the invention advantageously comprises 10% to 100% by weight of immunoglobulins directed specifically against at least one epitope of the F protein, still more advantageously 30% to 100% by weight of immunoglobulins directed specifically against at least one epitope of the F protein, preferably 60% to 100% by weight of immunoglobulins directed specifically against at least one epitope of the F protein.
  • the anti-RSV immunoglobulin composition comprises at least 10%, at least 20%, at least 30%, at least 40%, at least 50%, at least 60% at least 65%, at least 70%, at least 75%, at least 80%; at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99% by weight of immunoglobulins specifically directed against at least one epitope of the F protein in prefusion conformation.
  • the hyper-enriched anti-RSV immunoglobulin composition according to the invention advantageously comprises 10% to 100% by weight of immunoglobulins directed specifically against at least one epitope of the F protein in the prefusion conformation, still more advantageously 30% to 100% by weight.
  • weight of immunoglobulins specifically directed against at least one epitope of the F protein in prefusion conformation preferably 60% to 100% by weight of immunoglobulins directed specifically against at least one epitope of the F protein in conformation prefusion.
  • the anti-RSV immunoglobulin composition comprises at least 10%, at least 20%, at least 30%, at least 40%, at least 50%, at least 60%, at least 65%, at least 70%, at least 75%, at least 80%; at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99% by weight of immunoglobulins directed specifically against at least one epitope of the G protein.
  • the hyper-enriched anti-RSV immunoglobulin composition according to the invention advantageously comprises 10% to 100% by weight of immunoglobulins directed specifically against at least one epitope of the G protein, still more advantageously 30% to 100% by weight of immunoglobulins directed specifically against at least one epitope of the G protein, preferably 60% to 100% by weight of immunoglobulins directed specifically against at least one epitope of the G protein.
  • the hyper-enriched anti-RSV immunoglobulin composition according to the invention advantageously comprises hyperneutralizing immunoglobulins directed against a plurality of RSV epitopes.
  • the hyper-enriched anti-RSV immunoglobulin composition according to the invention comprises anti-RSV immunoglobulins directed against at least 2 epitopes, at least 3 epitopes, at least 5 epitopes, at least 10 different epitopes of RSV.
  • the anti-RSV immunoglobulin hyper-enriched composition according to the invention comprises anti-RSV immunoglobulins directed against at least one epitope of the F protein and at least one epitope of the G protein. .
  • the composition enriched in anti-RSV immunoglobulins comprises a mixture of anti-RSV immunoglobulins and immunoglobulins directed against at least one other infectious agent.
  • the composition enriched with anti-RSV immunoglobulins then comprises at least 30% by weight of anti-RSV immunoglobulins, and at most 70% by weight of immunoglobulins directed against at least one other infectious agent.
  • the composition enriched with anti-RSV immunoglobulins can thus advantageously comprise at least 30% anti-RSV immunoglobulins, and at most 70% anti-tetanus and anti-hepatitis B immunoglobulins.
  • the composition enriched with anti-RSV immunoglobulin comprises at least 50% by weight of anti-RSV immunoglobulins and at most 50% by weight of immunoglobulins directed against at least one other infectious agent.
  • the composition enriched in anti-RSV immunoglobulins does not comprise more than 10, not more than 7, not more than 5, not more than 3, not more than 2 different infectious specificities.
  • the immunoglobulin hyper-enriched concentrate for anti-RSV immunoglobulins for therapeutic use may be administered by any route of administration: ocular, nasal, intra-auricular, oral, sublingual, pulmonary, intraperitoneal, intravenous, percutaneous, subcutaneous, intramuscular, transmucosal, vaginal, rectal.
  • Ig concentrates for therapeutic use are generally at concentrations of between 50 and 100 g / l. These concentrates are intended for clinical use and may in particular be injected intravenously. For this purpose, they must be safe and, where appropriate, contain excipients, such as stabilizers, compatible with this clinical use.
  • Ig concentrates for therapeutic use may also be administered subcutaneously. In this case, the concentration of the products is greater than or equal to 100 g / l, advantageously greater than or equal to 150 g / l. Ig concentrates for therapeutic use may also be administered intramuscularly.
  • the anti-RSV immunoglobulin hyper-enriched immunoglobulin concentrate comprises at least 10%, at least 20%, at least 30%, at least 40%, at least 50%, at least 60%, at least 65%, at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99% % by weight of polyvalent immunoglobulins capable of recognizing and / or neutralizing the RSV virus or a part thereof.
  • the anti-RSV immunoglobulin hyper-enriched immunoglobulin concentrate comprises at least 30% by weight of polyvalent immunoglobulins capable of recognizing and / or neutralizing the RSV virus or one of of its parts.
  • the immunoglobulin hyper-enriched concentration of anti-RSV immunoglobulins comprises at least 60% by weight of polyvalent immunoglobulins capable of recognizing and / or neutralizing the RSV virus or one of its parts.
  • the anti-RSV immunoglobulin hyper-enriched immunoglobulin concentrate advantageously comprises at least 10%, at least 20%, at least 30%, at least 40%, at least 50%, at least 60%, at least minus 65%, at least 70%, at least 75%, at least 80%; at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99% by weight neutralizing immunoglobulins vis-à-vis the RSV.
  • the anti-RSV immunoglobulin hyper-enriched immunoglobulin concentrate comprises at least 30% by weight of neutralizing immunoglobulins vis-à-vis the RSV.
  • the anti-RSV immunoglobulin hyper-enriched immunoglobulin concentrate comprises at least 60% by weight neutralizing immunoglobulins vis-a-vis RSV.
  • the anti-RSV immunoglobulin composition advantageously has a higher neutralizing capacity vis-à-vis the RSV virus than the blood plasma of normal human subjects, higher than that of the subject plasma. selected for their anti-RSV immunoglobulin titre, higher than that of the RSV (RSV-IVIG) hyperimmune immunoglobulins such as Respigam® or RI-002 from Adma Biologics, and / or higher than that of the anti-RSV monoclonal antibodies such as palivizumab (Synagis®).
  • the anti-RSV immunoglobulin hyper-enriched immunoglobulin concentrate comprises at least 10%, at least 20%, at least 30%, at least 40%, at least 50%, at least 60%, at least 65%, at least 70%, at least 75%, at least 80%; at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99% by weight of immunoglobulins specifically directed against at least one epitope of the F protein .
  • the anti-RSV immunoglobulin hyper-enriched immunoglobulin concentrate comprises at least 10%, at least 20%, at least 30%, at least 40%, at least 50%, at least 60%, at least minus 65%, at least 70%, at least 75%, at least 80%; at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99% by weight of immunoglobulins specifically directed against at least one epitope of F protein in conformation prefusion.
  • the immunoglobulin hyper-enriched anti-RSV immunoglobulin concentrate comprises at least 30% by weight of immunoglobulins specifically directed against at least one epitope of the F protein in conformation prefusion.
  • the anti-RSV immunoglobulin hyper-enriched immunoglobulin concentrate comprises at least 60% by weight of immunoglobulins specifically directed against at least one epitope of the F protein in a prefusion conformation.
  • the anti-RSV immunoglobulin hyper-enriched immunoglobulin concentrate comprises at least 10%, at least 20%, at least 30%, at least 40%, at least 50%, at least 60%, at least 65%, at least 70%, at least 75%, at least 80%; at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99% by weight of immunoglobulins specifically directed against at least one epitope of the G-protein .
  • the anti-RSV immunoglobulin hyper-enriched immunoglobulin concentrate comprises at least 30% by weight of immunoglobulins directed specifically against at least one epitope of the G protein. In particular embodiment of the invention, the anti-RSV immunoglobulin hyper-enriched immunoglobulin concentrate comprises at least 60% by weight of immunoglobulins directed specifically against at least one epitope of the G protein.
  • the hyper-enriched anti-RSV immunoglobulin immunoglobulin immunoglobulin concentrate according to the invention advantageously comprises hyperneutralizing immunoglobulins directed against a plurality of RSV epitopes.
  • the immunoglobulin hyper-enriched anti-RSV immunoglobulin concentrate according to the invention comprises anti-RSV immunoglobulins directed against at least 2 epitopes, at least 3 epitopes, at least 5 epitopes, at least 10 different RSV epitopes.
  • the anti-RSV immunoglobulin hyper-enriched immunoglobulin concentrate according to the invention comprises anti-RSV immunoglobulins directed against at least one epitope of the F protein and at least one epitope of the G protein.
  • the immunoglobulin hyper-enriched anti-RSV immunoglobulin concentrate comprises a mixture of anti-RSV immunoglobulins and immunoglobulins directed against at least one other infectious agent.
  • the hyper-enriched anti-RSV immunoglobulin immunoglobulin concentrate then comprises at least 30% by weight of anti-RSV immunoglobulins, and at most 70% by weight of immunoglobulins directed against at least one other infectious agent.
  • the immunoglobulin hyper-enriched anti-RSV immunoglobulin concentrate can thus advantageously comprise at least 30% of anti-RSV immunoglobulins, and at most 70% of anti-tetanus and anti-hepatitis B immunoglobulins.
  • the immunoglobulin hyper-enriched anti-RSV immunoglobulin concentrate comprises at least 50% by weight of anti-RSV immunoglobulins and at most 50% by weight of immunoglobulins directed against at least one other anti-RSV immunoglobulin. infectious agent.
  • the anti-RSV immunoglobulin hyper-enriched immunoglobulin concentrate does not comprise more than 10, not more than 7, not more than 5, not more than 3, not more than 2 different infectious specificities.
  • Ig concentrates enriched in anti-RSV Ig according to the invention are useful for the treatment of RSV infection.
  • They can in particular be used for immunoprophylaxis in uninfected but at risk patients: children, infants, hospitalized persons, immunocompromised persons, elderly people.
  • the anti-RSV immunoglobulin hyper-enriched immunoglobulin concentrate according to the invention then makes it possible to slow down and / or prevent the spread of infection from the upper respiratory tract to the lower respiratory tract.
  • Ig concentrate enriched with anti-RSV Ig according to the invention makes it possible to slow down and / or prevent the propagation of RSV from cells to cells and / or to slow down and / or to prevent the formation of syncytia.
  • the hyper-enriched anti-RSV immunoglobulin immunoglobulin concentrate according to the invention allows the significant reduction of the viral load, normalized with respect to a known reference, in the treated patient.
  • the hyper-enriched anti-RSV immunoglobulin immunoglobulin concentrate according to the invention also advantageously allows the destruction of the infected cells via the recruitment of effector cells by virtue of the ADCC functions of the immunoglobulins of the composition.
  • the treated patient is preferably a human being, regardless of age and sex.
  • the therapeutic treatment of children and infants is particularly envisaged, as well as that of the elderly, hospitalized or immunocompromised.
  • the RSV-F 11049-V08B protein (Sino Biological Inc), a synthetic protein derived from a hRSV (RSS-2) DNA sequence, is used as the affinity ligand. Met 1 Thr 529, containing 518 amino acids after cleavage of the propeptide and whose predicted molecular mass is 58kDa. In SDS-PAGE analysis and reduction conditions, the apparent molecular weights are 45-55 kDa and 18 kDa.
  • the RSV-F 11049-V08B ligand used for grafting is in post-fusion conformation.
  • the coupling was evaluated at 98%, corresponding to a ligand density of 0.89 mg / ml of grafted gel.
  • Coupling efficiency NA NA 98% In order to test its functionality, the gel undergoes in the chromatography cycle with a sample of polyvalent immunoglobulins (22.4 mL of sample ILP10, purity 98% IgG, concentration 9.45g IgG / L, titrated 0.0107 mg / mL anti-RSV ). The contact time is 3.3min.
  • the buffers used are as follows: fixation / washing lOmM Citrate, pH7, 0.5M NaCl;
  • the sample used is a plasma fraction (ILP10) resulting from the immunoglobulin purification process as described in the patent application WO02092632 of the applicant.
  • the purification process comprises the following steps:
  • the eluate of the anion exchange chromatography at basic pH constitutes ILP10 sample No. 13606 / 10L02032 at 9.45 g / l of IgG (purity of 99% IgG) and containing 0.11% of immunoglobulins. anti-RSV (107 ⁇ g / mL).
  • the sample is equilibrated in the injection buffer by adding a concentrated solution of NaCl buffer and trisodium citrate qs 0.05M NaCl and 0.01M trisodium citrate.
  • the product is then passed over the column during 3.3min (contact time).
  • the elution is carried out in 0.1M glycine buffer, 30% propylene glycol at pH 2.57.
  • the eluate is immediately neutralized with 1M Tris-HCl pH 9 buffer to raise the pH to about 6.
  • the gel is then regenerated in order to remove the non-eluted Ig with a 6M guanidine buffer pH 6.
  • the fraction recovered is also neutralized by the addition of 1M Tris-HCl pH9 to raise the pH to 6.
  • the analytical assay of the fractions is carried out in the MSD (Mesoscale DiscoveryTM) method.
  • the plate On the eve of the assay, the plate is coated with the F protein by adding 3C / L / well to 1 ⁇ g / ml of protein F in PBS buffer, and the mixture is incubated overnight at 4 ° C. The plate is then washed three times with 200 ⁇ l of PBS buffer, 0.1% Tween. Saturation is then carried out by adding 150 ⁇ per well of PBS, 3% BSA, by incubating for 1 h at room temperature with stirring. The plate is again washed three times with 200 ⁇ l of PBS buffer, 0.1% Tween.
  • the samples to be assayed are added at the rate of 25 ⁇ per well, and incubated for 2 hours at room temperature with stirring. A new washing cycle identical to the previous ones is carried out.
  • the anti-human IgG Sulfo-Tag conjugate is then added at the rate of 25 ⁇ in each of the wells, and incubated for 2 hours at room temperature with stirring. A new wash cycle is performed, then 150 ⁇ per well of half-water diluted read buffer is added. The plate is shaken moderately and read immediately afterwards.
  • a high proportion of anti-RSV immunoglobulins bind to the hRSV-F affinity chromatography support (-70%), which represents in this test 166 ⁇ g of anti-RSV immunoglobulin per ml of gel.
  • the unadsorbed fraction and the wash fraction are depleted of anti-RSV immunoglobulins.
  • the eluted immunoglobulin fraction of the acidic pH support and in the presence of propylene glycol shows a 301-fold enrichment in anti-RSV immunoglobulins and the eluted proportion represents 55% of the proportion bound to the support.
  • the regeneration fraction comprises a small amount of immunoglobulins but also comprises a high proportion of anti-RSV immunoglobulins which can be recovered either by modifying the conditions of elution of the chromatography (composition of the buffer, pH, etc. ) or by ironing the regeneration fraction on the column in order to recover the anti-RSV immunoglobulins.
  • the test shows that affinity chromatography using a protein F ligand in post-fusion conformation grafted via NHS chemistry allows the purification of anti-RSV immunoglobulins with a yield of 38% under the conditions tested (55% of the immunoglobulins fixed to the support ), corresponding to an enrichment factor of 301.
  • the composition obtained after protein F affinity chromatography in post-fusion conformation thus comprises at least 30% by weight of immunoglobulins directed specifically against at least one epitope of the protein F.
  • composition is useful for the preparation of a hyper-enriched anti-RSV immunoglobulin immunoglobulin concentrate comprising at least 30% by weight of immunoglobulins directed specifically against at least one epitope of the F protein.
  • the fractions obtained were furthermore analyzed to determine the distribution of the different IgG subclasses.
  • an hRSV (18) -cherry3 viral strain containing a reporter gene coding for a fluorescent protein is used on a Hep2 cell line.
  • the intensity of the fluorescence is directly representative of the viral replication.
  • cells were subcultured in 96 well plate at 0.5xlO e 6cellules / mL and incubated at 37 ° C under 7% CO2.
  • the control monoclonal antibodies Synagis TM, solution of monoclonal antibodies directed against RSV
  • negative (Hurnira TM, anti-TNF monoclonal antibody solution) as well as the fractions to be tested are diluted in MEM medium.
  • the virus is likewise diluted in MEM medium at 1125 ° C. and 70 ⁇ l are deposited in the wells containing the antibody solutions. Homogenization is done by suction / discharge. The mixture is then incubated for 1 h at 37 ° C. under 7% CO 2. For the infection of the cells, the cellular supernatant is aspirated, ⁇ of the Ig / virus mixture is rapidly deposited and the incubation is carried out at 37 ° C. under 7% CO 2 for 36 to 48 hours. The revelation is done by measuring the fluorescence by exciting at 580 nm and using at 620 nm.
  • the values are normalized relative to the "100% infection” control where the virus is brought into contact with the cells alone, and the "0% infection” control corresponds to the cells brought into contact with the MEM medium alone.
  • the determination of an IC50 is performed by using the dose-response curves as a function of the antibody concentrations.
  • the IC50 value of Synagis was averaged from 3 trials.
  • the immunoglobulin hyper-enriched anti-RSV immunoglobulin concentrate obtained by affinity chromatography thus has a neutralizing activity allowing its use in the treatment of an RSV infection.
  • EXAMPLE 3 Affinity Chromatography Using the RSV-G Protein Ligand, Strains A (11070-V08H2 ⁇ SB) or B (13029-VQ8H ⁇ SB) Preparation of the Anti-RSV Affinity Chromatography Matrix
  • RSV-G protein is used as affinity ligands
  • strain A (ref 11070-V08H2, SB), a synthetic protein derived from a DNA sequence of hRSV (rsbl734 strain) from Asn 66 to Arg 297, containing 242 amino acids after cleavage of the propeptide and whose predicted molecular mass is 26,3kDa.
  • hRSV rsbl734 strain
  • the apparent molecular weight is included because of a high glycosylation between 60 kDa and 90 kDa.
  • strain B (ref 13029-V08H, SB), a synthetic protein derived from a hRSV DNA sequence (strain 036633-1) from His 67 to Ala 199, containing 244 amino acids after cleavage of the propeptide and whose predicted molecular mass is 27kDa.
  • strain 036633-1 a synthetic protein derived from a hRSV DNA sequence from His 67 to Ala 199, containing 244 amino acids after cleavage of the propeptide and whose predicted molecular mass is 27kDa.
  • the apparent molecular weight is included because of a high glycosylation between 80 kDa and 90 kDa.
  • the coupling is carried out according to the same protocol as that used in Example 1.
  • gel G-A corresponding to a density of Protein G strain A of 1 mg / ml of grafted gel
  • gel GB corresponding to a density of Protein G strain B of 1 mg / ml of grafted gel
  • G-AB gel corresponding to a mixture of 50% GA gel and 50% GB gel
  • the sample used is a plasma fraction resulting from the immunoglobulin purification process as described in patent application WO02092632 of the applicant.
  • the purification process comprises the following steps:
  • the eluate of the anion exchange chromatography is a sample of IgG (> 98% purity IgG) and contains 0.04% anti - RSV immunoglobulin.
  • the contact time is 3 min.
  • the buffers used are:
  • fractions The analytical determination of the fractions is carried out in nephelemetry method (total IgG) and in CFCA Biacore assay (anti-RSV Ig) according to the following protocol:
  • a large proportion of the anti-RSV immunoglobulins bind to the hRSV-G affinity chromatography support, regardless of the strain, which in this test represents at least 6 ⁇ g of anti-RSV immunoglobulin per ml of gel.
  • the unadsorbed fraction and the wash fraction are depleted of anti-RSV immunoglobulins.
  • the eluted immunoglobulin fraction of the support at acidic pH and in the presence of propylene glycol shows a minimum enrichment of 109 times in anti-RSV immunoglobulins.
  • the assay shows that affinity chromatography using a G protein ligand of A or B strains grafted via NHS chemistry allows the purification of anti-RSV immunoglobulins with a yield of at least 26.2% under the conditions tested, corresponding to a minimum enrichment factor of 109 times.
  • composition obtained after G protein ligand affinity chromatography therefore comprises at least 30% by weight of immunoglobulins directed specifically against at least one epitope of the G protein.
  • composition is useful for the preparation of a hyper-enriched anti-RSV immunoglobulin immunoglobulin concentrate comprising at least 30% by weight of immunoglobulins directed specifically against at least one epitope of the G protein.

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Abstract

Procédé d'enrichissement d'une préparation d'immunoglobulines en immunoglobulines anti-RSV et préparation ainsi enrichie L'invention concerne un procédé de préparation d'un concentré d'immunoglobulines (Ig) utile pour traiter une infection au virus RSV comprenant une étape consistant à soumettre une composition d'Ig issue de plasma sanguin, à une chromatographie d'affinité mettant en œuvre un ligand spécifique du virus RSV. Dans un mode de réalisation particulier, le ligand spécifique du virus RSV est une protéine F du virus RSV, préférentiellement en conformation pré-fusion, ou un variant ou un fragment antigénique de celle-ci.

Description

Procédé d'enrichissement d'une préparation d' immunoglobulines en immunoglobulines anti-RSV et préparation ainsi enrichie
La présente invention concerne l'enrichissement d'une préparation d' immunoglobulines (Ig) issues de plasma humain, en immunoglobulines capables de reconnaître, et avantageusement de neutraliser, le virus respiratoire syncytial (RSV). L'invention fournit également une composition d'Ig ainsi enrichie, utile dans le traitement d'une infection au RSV.
Arrière-plan technolo ique : Le virus respiratoire syncytial (RSV) est un agent infectieux répandu des voies respiratoires. Le RSV provoque généralement une infection bénigne chez les personnes immunocompétentes, mais est la plus importante cause de bronchiolites et de pneumonies chez les nourrissons et les jeunes enfants. Actuellement, il n'existe pas de vaccin efficace disponible pour prévenir l'infection par le RSV. Bien que des médicaments anti-viraux soient proposés pour traiter les infections à RSV, leur efficacité chez les enfants est discutable.
RespiGam®, une préparation de pools d' immunoglobulines normales hyperimmunes qui contient un titre élevé en immunoglobulines dirigées contre le RSV, a été utilisée comme une approche immunoprophylactique alternative. Néanmoins, RespiGam® est un concentré d'immunoglobulines hyperimmunes, il est donc préparé à partir de plasma de sujets sélectionnés pour leur haut titre en immunoglobulines anti-RSV, et en utilisant un procédé de fractionnement d'immunoglobulines classique. Ainsi, bien que comprenant plus d'immunoglobulines anti-RSV qu'un concentré classique d'immunoglobulines, RespiGam® ne comprend pas plus de 1% d'immunoglobulines anti-RSV. De plus, la sélection des donneurs limite le volume de production.
L'émergence sur le marché d'un anticorps monoclonal hautement spécifique, le palivizumab, a conduit au retrait de la composition d'immunoglobulines hyperimmunes RespiGam® du marché. Cependant, le coût et la trop grande spécificité des anticorps monoclonaux rendent également cette solution insatisfaisante.
Dans ce contexte, Gupta et al, PLOS One, 2013, 8(7) :l-5 ont montré la présence d'immunoglobulines anti-RSV dans des préparations d'immunoglobulines G intraveineuses (IglV), obtenues à partir de pools de plasma de plusieurs milliers de donneurs de sang en bonne santé. Pour cela, Gupta et al ont retenu les immunoglobulines spécifiques du RSV, par passage sur des matrices d'affinité présentant la protéine G recombinante du RSV. La présence d'immunoglobulines anti-RSV dans ces préparations d'IglV s'explique par la forte prévalence du virus à travers le monde. Néanmoins, Sastre et al ont montré que de telles préparations d'IglV possédaient un faible pouvoir neutralisant vis-à-vis du RSV.
Il existe donc un besoin de méthode d'obtention de préparations d'immunoglobulines hyper-enrichies en immunoglobulines capables de neutraliser le virus respiratoire syncytial (RSV). Résumé de l'invention:
Les inventeurs proposent maintenant de soumettre des préparations d'immunoglobulines (Ig) issues de plasma humain ou de fractions de plasma sanguin à une chromatographie d'affinité utilisant une protéine du RSV comme ligand d'affinité, pour obtenir des préparation d'immunoglobulines hyper-enrichies en immunoglobulines capables de reconnaître, et avantageusement de neutraliser, le virus respiratoire syncytial (RSV). De préférence la protéine F du virus RSV, avantageusement stabilisée en conformation pré- fusion ou post-fusion, est utilisée comme ligand de chromatographie d'affinité.
Les conformations particulières de la protéine F du RSV, et notamment la conformation pré-fusion, permettent avantageusement de retenir plus particulièrement les immunoglobulines anti-RSV au pouvoir neutralisant.
Un objet de l'invention est plus précisément un procédé de préparation d'un concentré d'immunoglobulines (Ig) utile pour traiter une infection au RSV comprenant une étape consistant à soumettre une composition d'Ig issue de plasma sanguin, à une chromatographie d'affinité mettant en œuvre un ligand spécifique du RSV.
Ce ligand spécifique du RSV peut être une protéine du RSV, en particulier les protéines G, SH et F du RSV, ou un variant de ces protéines ou un fragment antigénique de ces protéines ou de leurs variants.
Dans un mode de réalisation particulier le ligand spécifique du RSV est une protéine F du RSV, préférentiellement en conformation pré-fusion, ou un variant, ou encore un fragment antigénique de celle-ci ou d'un de ses variants.
Dans un mode de réalisation particulier, le ligand spécifique du RSV, par exemple la protéine F du virus RSV, de préférence en conformation pré-fusion, ou un fragment antigénique de celui-ci, est fixé à la matrice d'affinité par une liaison covalente, soit directement, soit via un espaceur.
Avantageusement la protéine du RSV peut être une protéine variante, par exemple il peut s'agir d'une protéine F du RSV qui porte les mutations S155C, S290C, S 190F et/ou V207L. Un autre objet de l'invention est un concentré d'Ig enrichi en Ig anti-RSV, obtenu par le procédé ci-dessus, particulièrement utile dans le traitement d'une infection par le virus RSV.
Brève description des figures
La Figure 1 extraite de McLellan et al, présente un modèle de protéine F en conformation préfusion ;
La Figure 2 également extraite de McLellan et al, illustre le passage de la conformation préfusion (à gauche sur la figure) à la conformation postfusion (à droite sur la figure) du site antigénique 0 ;
La Figure 3 représente une courbe du pourcentage d'infection en fonction du log de la concentration en anticorps ; La Figure 4 représente une courbe du pourcentage d'infection en fonction du log de la concentration en anticorps ;
La Figure 5 représente l'impact du ligand protéine F sur la séroneutralisation des IVIG Description détaillée de l'invention Le RSV :
Le virus respiratoire syncytial (RSV) est un agent infectieux répandu des voies respiratoires. Le RSV provoque généralement une infection bénigne, asymptomatique ou avec des symptômes faibles (rhume) chez les personnes immunocompétentes, mais qui peut être responsable de plusieurs épisodes infectieux par an sur un même individu, pouvant être à l'origine d'absentéisme scolaire ou au travail.
De plus, ce virus est un facteur important d'infections dans les hôpitaux chez les patients immunodéprimés, en attente ou en sortie de greffe, chez les nourrissons ou jeunes enfants ou chez les personnes âgées. Le RSV est la plus importante cause de bronchiolites et de pneumonies chez les nourrissons et les jeunes enfants, et est largement responsable d'infections respiratoires dans les établissements pour personnes âgées.
Par « RSV » ou « virus respiratoire syncytial » au sens de la présente invention, on entend aussi bien la particule virale libre présente dans les fluides biologiques du patient, que la particule virale ayant fusionné avec une cellule hôte du patient et donnant lieu à la formation de syncitia. Les protéines du RSV :
Le virus respiratoire syncytial est un virus à ARN comprenant 10 gènes codant 11 protéines parmi lesquelles : la protéine M, protéine de la matrice nécessaire à l'assemblage de la particule virale ; la protéine M2, 2eme protéine de la matrice, également requise pour la transcription. M2 contient des épitopes CD8 ;
la protéine P ; la protéine N de la nucléocapside qui va s'associer au génome viral ;
la protéine L d'ARN polymérase ;
les protéines de l'enveloppe : la protéine SH, la protéine G (glycoprotéine transmembranaire hautement glycosylée responsable de la liaison à la cellule hôte), la protéine F (glycoprotéine transmembranaire responsable de la fusion à la membrane hôte, de l'entrée du virus dans la cellule et de la formation des syncitia).
Par « protéine du RSV » au sens de la présente invention, on entend aussi bien l'une des 11 protéines encodées par le génome du virus dans sa forme native, que l'un de leurs variants ou leurs fragments antigéniques. Parmi ces protéines, certaines sont avantageusement présentes à la surface du RSV, jouant un rôle dans les mécanismes d'infection, notamment au cours de la reconnaissance, de la liaison de la particule virale à sa cellule-hôte, de la fusion de la particule virale à sa cellule- hôte et de la propagation du virus de cellules hôte à cellule hôte. Ces protéines, présentant l'avantage d'être accessibles au système immunitaire, sont en particulier : - la protéine SH,
la protéine G
la protéine F
L'accessibilité de ces protéines de surface peut être constitutionnelle ou induite. En particulier, l'accessibilité de la protéine peut être modifiée par un changement de conformation, dévoilant tout ou une partie d'épitopes qui étaient jusque-là inaccessibles au système immunitaire.
Par « protéines de surface du RSV » au sens de la présente invention, on entend une ou une combinaison des protéines accessibles au système immunitaire, dans leur forme native quelle que soit leur conformation, l'un de leurs variants, ou de leurs fragments antigéniques. Les protéines de surface du RSV sont présentes sur la membrane du RSV, aussi bien sur la particule virale libre présente dans les fluides biologiques du patient, que sur la particule virale ayant fusionné avec une cellule hôte du patient et donnant lieu à la formation de syncitia. Le terme « variant » comprend toute séquence soumise à une ou plusieurs substitutions, additions et/ou délétions, sans altération substantielle de la conformation de la protéine et/ou de la stabilité de la protéine. Les variants considérés présentent une identité de séquence d'au moins 80%, de préférence d'au moins 85%, de préférence encore d'au moins 90%, de préférence encore d'au moins 95%.
De manière avantageuse, les fragments antigéniques permettent la fixation d'immunoglobulines anti-RSV neutralisantes. De préférence, il s'agit de fragments d'au moins 10 acides aminés, de préférence encore au moins 20, 30, 40, ou 50 acides aminés, qui comprennent un ou plusieurs épitopes d'une protéine du RSV. Les fragments antigéniques des protéines du RSV utilisés sont avantageusement des peptides proposant des épitopes linéaires, non contraints par la structure tridimensionnelle, qui peuvent être exposés lors de changements de la conformation de la protéine. Les fragments antigéniques des protéines du RSV utilisés sont avantageusement également des peptides proposant des épitopes conformés, qui peuvent être exposés lors de changements de la conformation de la protéine.
La protéine F du RSV :
La protéine F du RSV est une glycoprotéine de surface qui médie le phénomène de fusion du virion avec la membrane de la cellule qu'il infecte, permettant l'entrée du virus dans le cytoplasme de la cellule. La protéine F présente une diversité conformationnelle. La fusion procède de la différence d'énergie de repliement entre deux états : un état métastable adopté avant l'interaction virus-cellule (c'est l'état de « préfusion »), et un état stable formé après la fusion (c'est l'état de « postfusion »). De manière avantageuse, la protéine F du RSV utilisée selon l'invention dévoile des épitopes permettant la fixation d'immunoglobulines neutralisantes anti-RSV. Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, la protéine F du RSV utilisée est en conformation pré-fusion. Cette conformation a été modélisée dans l'article McLellan et al, Science, 2013, 340 : 1113- 1117. Le site antigénique de la protéine F du RSV, reconnu préférentiellement par des anticorps neutralisants, y est désigné « site antigénique 0 » (voir les figures 1 et 2). La séquence native de la protéine F du RSV (SEQ ID NO : 1) est répertoriée sur la base Genbank, sous le numéro d'accès AHB33455.
SEQ ID NO : 1 : mellihrssa ifltlainal yltssqnite efyqstcsav srgylsalrt gwytsvitielsniketkcn gtdtkvklik qeldkyknav telqllmqnt paannrarre apqymnytinttknlnvsis kkrkrrflgf llgvgsaias giavskvlhl egevnkikna llstnkavvslsngvsvlts kvldlknyin nqllpivnqq scrisnietv iefqqknsrl leitrefsvnagvttplsty mltnsellsl indmpitndq kklmssnvqi vrqqsysims iikeevlayvvqlpiygvid tpcwklhtsp lcttnikegs nicltrtdrg wycdnagsvs ffpqadtckvqsnrvfcdtm nsltlpsevs lcntdifnsk ydckimtskt disssvitsl gaivscygktkctasnknrg iiktfsngcd yvsnkgvdtv svgntlyyvn klegknlyvk gepiinyydplvfpsdefda sisqvnekin qslafirrsd ellhnvntgk sttnimitai iiviivvllsliaiglllyc kakttpvtls kdqlsginni afsk
Dans le contexte de la présente invention, le terme « protéine F du virus RSV » se réfère à la forme native de séquence SEQ ID NO : 1, ou à un de ses variants.
Le terme « variant » comprend toute séquence soumise à une ou plusieurs substitutions, additions et/ou délétions, sans altération substantielle de la conformation de la protéine et/ou de la stabilité de la protéine. Les variants considérés présentent une identité de séquence d'au moins 80%, de préférence d'au moins 85%, de préférence encore d'au moins 90%, de préférence encore d'au moins 95% avec la séquence native.
Des variants de la protéine F sont par exemple décrits sur la base Genbank, sous les numéros d'accès AAB59858 (SEQ ID NO :2) et PI 1209 (SEQ ID NO :3).
SEQ ID NO :2 (AAB59858) : mellilkana ittiltavtf cfasgqnite efyqstcsav skgylsalrt gwytsvitielsnikenkcn gtdakvklik qeldkyknav telqllmqst pptnnrarre lprfmnytlnnakktnvtls kkrkrrflgf llgvgsaias gvavskvlhl egevnkiksa llstnkavvslsngvsvlts kvldlknyid kqllpivnkq scsisnietv iefqqknnrl leitrefsvnagvttpvsty mltnsellsl indmpitndq kklmsnnvqi vrqqsysims iikeevlayvvqlpiygvid tpcwklhtsp lcttntkegs nicltrtdrg wycdnagsvs ffpqaetckvqsnrvfcdtm nsltlpsein lcnvdifnpk ydckimtskt dvsssvitsl gaivscygktkctasnknrg iiktfsngcd yvsnkgmdtv svgntlyyvn kqegkslyvk gepiinfydplvfpsdefda sisqvnekin qslafirksd ellhnvnagk sttnimitti iiviivillsliavglllyc karstpvtls kdqlsginni afsn
SEQ ID NO :3 (P11209) : melpilktna itailaavtl cfassqnite efyqstcsav skgylsalrt gwytsvitielsnikenkcn gtdakvklik qeldkyksav telqllmqst patnnrarre lprfmnytlnntkntnvtls kkrkrrflgf llgvgsaias giavskvlhl egevnkiksa llstnkavvslsngvsvlts kvldlknyid kqllpivnkq scsisnietv iefqqknnrl leitrefsvnagvttpvsty mltnsellsl indmpitndq kklmsnnvqi vrqqsysims iikeevlayvvqlplygvid tpcwklhtsp lcttntkegs nicltrtdrg wycdnagsvs ffplaetckvqsnrvfcdtm nsltlpsevn lcnidifnpk ydckimtskt dvsssvitsl gaivscygktkctasnkdrg iiktfsngcd yvsnkgvdtv svgntlyyvn kqegkslyvk gepiinfydplvfpsdefda sisqvnekin qslafirksd ellhnvnagk sttnimitti iiviivillsliavglllyc karstpvtls kdqlsginni afsn
En particulier, sont compris les variants désignés « DS » (portant la double mutation S155C, S290C), « Cavl » (portant la double mutation S190F, V207L), ou encore « DS- Cavl » (portant les quatre mutations S155C, S290C, S 190F, V207L), tels que décrits dans l'article McLelland et al, 2013, SCIENCE, 342 : 592-598.
Dans un mode de réalisation préféré, on utilise le variant désigné « DS-Cavl » portant les mutations S155C, S290C, S 190F, V207L.
Est également compris le variant désigné « FcN2c-c » (portant 4 mutations L481C, D489C, S509C, D510C) tel que décrit dans l'article Magro et al, 2012, PNAS, voll09, n°8 : 3089- 3094.
La protéine F du RSV, sans sa conformation pré-fusion, peut être préparée par toutes les techniques classiques de purification, par synthèse peptidique et notamment par synthèse chimique, par génie génétique, ou autre. De préférence, on utilise une protéine F recombinante, qui peut être obtenue par un procédé classique de production de protéines recombinantes, comprenant le transfert d'un vecteur d'expression dans une cellule hôte, dans des conditions permettant l'expression de la protéine recombinante codée par le vecteur, et la récupération de la protéine ainsi produite. Le vecteur d'expression peut être préparé selon les méthodes couramment utilisées par l'homme du métier, et peut être introduit dans la cellule hôte, par des méthodes standard, telles que la lipofection, l'électroporation, le choc thermique ou autre. La cellule hôte peut notamment être une bactérie, une levure, une mousse, un champignon, une cellule végétale ou une cellule de mammifère.
Les fragments antigéniques de la protéine F du RSV peuvent être alternativement utilisés comme ligands de la chromatographie d'affinité. De manière avantageuse, les fragments antigéniques permettent la fixation d'immunoglobulines anti-RSV neutralisantes. De préférence il s'agit de fragments d'au moins 10 acides aminés, de préférence encore au moins 20, 30, 40, ou 50 acides aminés, qui comprennent un ou plusieurs épitopes de la protéine F du RSV.
Les fragments antigéniques de la protéine F du RSV utilisés sont avantageusement des peptides proposant des épitopes linéaires, non contraints par la structure tridimensionnelle, qui sont normalement exposés sur la protéine F en conformation préfusion mais qui sont non exposés aux solvants en conformation postfusion.
Les fragments antigéniques de la protéine F du RSV utilisés sont avantageusement également des peptides proposant des épitopes conformés, qui sont normalement exposés sur la protéine F en conformation préfusion, mais qui sont non exposés aux solvants en conformation postfusion.
En particulier sont compris les fragments désignés « F24-136 » (fragment F dérivé de la chaîne F2), « F164-315 » (fragment 2/3 N-terminal de la chaîne Fl),« F283-402 » (segment central de la chaîne Fl) et « F403-524 » tels que décrits dans l'article Sastre et al, Vaccine 23 (2004) 435-443. Sont également compris les fragments correspondants aux peptides désignés « F167-201 » (fragment heptad repeat A), « F235-275 » (fragment site antigénique II) et « F478-512 » (fragment heptad repeat B) tels que décrits dans l'article Sastre et al, Vaccine 23 (2004) 435-443.
Dans un mode de réalisation préféré, on utilise les fragments désignés « F24- 136 », « F 164- 315 », « F283-402 », « F403-524 », « F167-201 », « F235-275 », et/ou « F478-512 ». Dans un autre mode de réalisation particulier de l'invention, on utilise les fragments correspondants aux régions heptad repeat A et/ou heptad repeat B de la protéine F, seuls ou en combinaison.
Dans un autre mode de réalisation de l'invention, les fragments antigéniques de la protéine F du RSV utilisés sont une combinaison de plusieurs peptides proposant des épitopes linéaires, non contraints par la structure tridimensionnelle, qui sont normalement exposés sur la protéine F en conformation préfusion mais qui sont non exposés aux solvants en conformation postfusion.
La protéine G du RSV : La protéine G du RSV est une glycoprotéine transmembranaire de surface permettant la liaison du virus à la cellule hôte. Elle interagit avec le récepteur CX3CR1 de la cellule hôte pour moduler la réponse immunitaire et faciliter l'infection. La protéine G comprend 289 à 299 acides aminés soit 32-33kDa, selon la souche, et est palmitoylée. Hautement glycosylée, elle comprend 30-40 O-glycosylations et 4-5 N-glycosylations. La glycosylation et donc la taille de la protéine G dépend du type cellulaire dans laquelle elle est produite : 80-100 kDa dans des lignées cellulaires immortalisées, mais 180 kDa dans des cultures primaires de cellules amniotiques épithéliales. La protéine G comprend un domaine central conservé (130-230) avec une partie hautement conservée de 13 acides aminés (164-176), une « cystéine noose » avec 2 ponts disulfures (C173, C176, C182, Cl 86), et un motif CX3C de 5 acides aminés (Cl 82- XXX-C186). Le RSV de souche B comprend en outre un domaine répété de 20 acides aminés dans le deuxième domaine mucine-like, tandis que le RSV de souche A comprend dans la même région un domaine répété de 24 acides aminés. De manière avantageuse, la protéine G du RSV utilisée selon l'invention possède des épitopes permettant la fixation d'immunoglobulines neutralisantes anti-RSV.
Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, la protéine G du RSV utilisée est issue de RSV de souche A et désignée GA.
La séquence native de la protéine GA du RSV (SEQ ID NO : 4) est répertoriée sur la base Genbank, sous le numéro d'accès P27022. SEQ ID NO : 4 msknkdqrta ktlertwdtl nhllfisscl yklnlksvaq itlsilamii stsliivaii fiasanhkit stttiiqdat nqiknttpty ltqnpqlgis psnpsditsl ittildsttp gvkstlqstt vgtknttttq aqpnkpttkq rqnkppskpn ndfhfevfnf vpcsicsnnp tcwaickrip nkkpgkrttt kptkkptpkt tkkgpkpqtt kskeapttkp teeptinttk tniittllts nttrnpelts qmetfhstss egnpspsqvs itseypsqps sppntpr
Dans un autre mode de réalisation particulier de l'invention, la protéine G du RSV utilisée est issue de RSV de souche B et désignée GB
La séquence native de la protéine GB du RSV (SEQ ID NO : 5) est répertoriée sur la base Genbank, sous le numéro d'accès 036633.
SEQ ID NO : 5 mskhknqrta rtlektwdtl nhlivisscl yrlnlksiaq ialsvlamii stsliiaaii fiisanhkvt lttvtvqtik nhteknitty ltqvppervs sskqptttsp ihtnsattsp ntksethhtt aqtkgrttts tqtnkpstkp rlknppkkpk ddyhfevfnf vpcsicgnnq lcksicktip snkpkkkpti kptnkpttkt tnkrdpktpa kttkketttn ptkkptlttt erdtstsqst vldtttleht iqqqslhstt pentpnstqt ptasepstsn stqntqsha
Dans le contexte de la présente invention, le terme « protéine G du virus RSV » se réfère à la forme native de séquence SEQ ID NO : 4 ou SEQ ID NO : 5, ou à un de ses variants.
Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, on utilise des variants de la protéine G.
Le terme « variant » comprend toute séquence soumise à une ou plusieurs substitutions, additions et/ou délétions, sans altération substantielle de la conformation de la protéine et/ou de la stabilité de la protéine. Les variants considérés présentent une identité de séquence d'au moins 80%, de préférence d'au moins 85%, de préférence encore d'au moins 90%, de préférence encore d'au moins 95% avec la séquence native.
La protéine G du RSV peut être préparée par toutes les techniques classiques de purification, par synthèse peptidique et notamment par synthèse chimique, par génie génétique, ou autre.
De préférence, on utilise une protéine G recombinante, qui peut être obtenue par un procédé classique de production de protéines recombinantes, comprenant le transfert d'un vecteur d'expression dans une cellule hôte, dans des conditions permettant l'expression de la protéine recombinante codée par le vecteur, et la récupération de la protéine ainsi produite. Le vecteur d'expression peut être préparé selon les méthodes couramment utilisées par l'homme du métier, et peut être introduit dans la cellule hôte, par des méthodes standard, telles que la lipofection, l'électroporation, le choc thermique ou autre. La cellule hôte peut notamment être une bactérie, une levure, une mousse, un champignon, une cellule végétale ou une cellule de mammifère.
Les fragments antigéniques de la protéine G du RSV peuvent être alternativement utilisés comme ligands de la chromatographie d'affinité. De manière avantageuse, les fragments antigéniques permettent la fixation d'immunoglobulines anti-RSV neutralisantes. De préférence il s'agit de fragments d'au moins 10 acides aminés, de préférence encore au moins 20, 30, 40, ou 50 acides aminés, qui comprennent un ou plusieurs épitopes de la protéine G du RSV. De manière avantageuse, les fragments antigéniques sont constitués de tout ou partie de la région centrale conservée de la protéine G (164-186). Les fragments antigéniques de la protéine G du RSV utilisés sont avantageusement des peptides proposant des épitopes linéaires, non contraints par la structure tridimensionnelle, qui sont normalement exposés sur la protéine G.
Les fragments antigéniques de la protéine G du RSV utilisés sont avantageusement également des peptides proposant des épitopes conformés, qui sont normalement exposés sur la protéine G.
En particulier sont compris les fragments « G2Na » et « G2Nb » (fragments 130-230) tels que décrits dans Nguyen et al, PLoS ONE, March 2012, Volume 7, Issue 3 ou les fragments « Gs » tels que décrits dans Sastre et al, Vaccine 23 (2004) 435-444 en particulier en figure 6. Dans un mode de réalisation préféré, on utilise les fragments désignés « G2Na » et/ou « G2Nb » et/ou « Gs ».
Dans un autre mode de réalisation particulier de l'invention, on utilise les fragments correspondants aux régions conservées de la protéine G, seuls ou en combinaison. Dans un autre mode de réalisation de l'invention, les fragments antigéniques de la protéine G du RSV consistent en un ou plusieurs peptides correspondant à une zone exposée du virus.
Dans un autre mode de réalisation de l'invention, les fragments antigéniques de la protéine G du RSV utilisés sont une combinaison de plusieurs peptides proposant des épitopes linéaires, non contraints par la structure tridimensionnelle, avantageusement de plusieurs peptides de souches A et/ou B.
Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, la protéine G du RSV ou ses variants ou ses fragments est glycosylée, de préférence suffisamment glycosylée pour maintenir une conformation minimale du ou des épitopes permettant leur reconnaissance par les immunoglobulines anti-RSV.
Le support de chromatographie:
Le procédé de l'invention met en œuvre une chromatographie d'affinité. Cette chromatographie utilise une matrice comprenant un support à base de particules de polymère, et est de préférence sous forme d'un gel ou d'une résine. Ces particules de polymère sont de préférence de forme sphérique ou oblongue, il peut s'agir notamment de billes. Le polymère peut être naturel ou non-naturel, organique ou inorganique, réticulé ou non réticulé. Le polymère est de préférence un polymère organique, de préférence réticulé.
Dans un mode de réalisation préféré, le polymère est de la cellulose, et les particules sont de préférence des billes de cellulose poreuses. D'autres types de polymères possibles incluent agarose, dextran, polyacrylates, polystyrène, polyacrylamide, polyméthacrylamide, des copolymères de styrène et divinylbenzène, ou des mélanges de ces polymères.
Les particules peuvent fournir un milieu de chromatographie que l'on peut utiliser pour remplir une colonne par exemple.
Sur le support est greffé une protéine du RSV, ou un fragment antigénique de celle-ci, soit directement, soit via un espaceur, qui lie de manière covalente le ligand aux particules du support chromato graphique. Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, la protéine greffée sur le support est une protéine de surface du RSV, par exemple la protéine F du RSV ou la protéine G du RSV, ou un fragment antigénique de celles-ci, soit directement, soit via un espaceur, qui lie de manière covalente le ligand aux particules du support chromato graphique. Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, le support greffé présente plusieurs ligands différents. Le support peut alors être greffé avec plusieurs protéines différentes et/ou plusieurs fragments antigéniques différents du RSV, avantageusement plusieurs protéines de surface du RSV ou leurs fragments, afin d'obtenir un concentré d' immunoglobulines anti-RSV présentant différentes cibles antigéniques. Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, le support greffé présente ainsi un mélange de ligands constitué de : protéine F en conformation préfusion, et/ou
protéine F en conformation postfusion, et/ou
protéine GA, et/ou
- protéine GB et/ou leurs fragments ou variants respectifs.
Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, le support greffé présente ainsi un mélange de ligands constitué de : protéine F en conformation préfusion, avantageusement le ligand hRSV-F 11049- V08B, et
protéine GA, avantageusement le ligand 11070-V08H2, SB, et
protéine GB, avantageusement le ligand 13029-VO8H, SB.
Le support peut également être greffé avec une ou plusieurs protéines du RSV et une ou plusieurs protéines issues d'un ou plusieurs autres agents infectieux afin d'obtenir un concentré comprenant à la fois des immunoglobulines anti-RSV (éventuellement présentant différentes cibles antigéniques) et des immunoglobulines dirigées contre un autre agent infectieux. Avantageusement dans ce mode de réalisation, chaque protéine correspond à au moins 30% en poids, ou au moins 50% en poids des antigènes greffés sur le support.
Une particule peut porter plusieurs espaceurs.
La liaison entre le ligand et espaceur peut être, par exemple, une liaison amide. L' espaceur comprend typiquement au moins un atome de C, O, N, ou S.
Les ligands sont immobilisés chimiquement par des liaisons covalentes entre les particules et l'espaceur, et entre l'espaceur et le ligand. Cette immobilisation peut être réalisée de manière classique par l'homme du métier.
Dans un mode de réalisation préféré, la particule porte un bras -NH-R1-COOH. De préférence il s'agit d'acide alpha-aminocaproïque (où RI est un groupe pentyle).
De manière classique, la particule peut être activée en utilisant des réactifs bifonctionnels tels que l'épichlorhydrine, l'épibromhydrine, dibromo-et dichloropropanol, dibromobutane, l'éthylène glycol diglycidyléther, le butanediol diglycidylether, divinylsulfone, allylglycidyléther, et le bromure d' allyle. Le réactif bifonctionnel est capable de réagir à la fois avec les particules et le bras -NH-R1-COOH. Les composés hétérofonctionnels allyle, tels que le bromure d' allyle, sont des réactifs bifonctionnels préférés et permettent d'obtenir une matrice activée. Pour certains supports solides, tels que la cellulose, les composites contenant un hydrogel ou d'autres matériaux présentant des groupes hydroxyles, il est avantageux de déprotoner les groupes hydroxyles avec une source d'hydroxyde, par exemple, avant la réaction avec un réactif bifonctionnel.
La matrice sous forme de gel est préparée par addition classique d'un tampon sur les particules de polymère portant les ligands, comme cela est connu de l'homme du métier, de manière à obtenir une matrice sous forme de gel, adaptée pour une chromatographie d'affinité. La matrice telle que définie ici est utile dans une chromatographie d'affinité liant des immunoglobulines anti-RSV. La matrice est particulièrement utile dans une chromatographie d'affinité à lit mélangé. Une telle matrice comprend avantageusement plusieurs antigènes différents provenant du RSV et est donc capable de lier des immunoglobulines anti-RSV dirigées contre plusieurs épitopes différents. Une telle matrice peut également avantageusement comprendre plusieurs antigène différents issus de différents agents infectieux, et est donc capable de lier à la fois des immunoglobulines anti- RSV et des immunoglobulines dirigées contre un autre agent infectieux choisi.
Pour cela, la matrice peut être introduite dans une colonne de chromatographie. A l'échelle industrielle, la colonne peut contenir de 1 à 150 litres, voire 250 à 500 L, si nécessaire. Dans le cas d'une mise en œuvre à l'échelle pilote, on peut utiliser des colonnes de 1 à 50 cm de hauteur, le diamètre est alors adapté à la hauteur de colonne utilisée. Le volume de matrice peut également être ajusté pour répondre aux contraintes d'un procédé industriel, notamment être adapté aux volumes de produit à traiter.
Les immunoglobulines anti-RSV présentes dans le plasma ou la fraction plasmatique se fixent à la matrice, et le produit adsorbé est élué et récupéré, enrichi en immunoglobulines anti-RSV. Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, la matrice est greffée de ligands de type protéine F, en conformation postfusion ou préfusion.
Dans un mode de réalisation de l'invention, la protéine F du RSV reste et/ou revient dans sa conformation préfusion lors de toutes les étapes de préparation et d'utilisation de la matrice : greffage, lavage, équilibrage, chargement, lavage, élution, régénération, sanitisation.
Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, la protéine F du RSV est greffée sur la matrice dans sa conformation préfusion. La méthode de greffage et le choix éventuel de l'espaceur sont donc adaptés par l'homme du métier afin de maintenir la protéine F du RSV dans la conformation préfusion. Dans un autre mode de réalisation particulier de l'invention, la matrice est greffée de ligands de type protéine G issue de RSV de souche A et/ou de souche B.
De manière avantageuse, les conditions de mise en œuvre de la chromatographie d'affinité selon l'invention sont adaptées par l'homme du métier pour garantir la réutilisation de la matrice selon l'invention tout en maintenant des conditions d'élution non dégradantes pour le produit d'intérêt.
Plasma ou fraction plasmatique:
Le plasma ou la fraction plasmatique de départ soumis au procédé d'enrichissement de l'invention consistent avantageusement en du plasma provenant de plasmas sanguins ou de pools de plasmas sanguins de sujets mammifères (humains ou non humains) ou en une fraction de ce plasma, soit toute partie ou sous-partie du plasma, ayant fait l'objet d'une ou plusieurs étapes de purification.
Dans un mode de réalisation particulier, le plasma ou la fraction plasmatique de départ soumis au procédé d'enrichissement de l'invention consistent avantageusement en du plasma provenant de plasmas sanguins ou de pools de plasmas sanguins de sujets mammifères non humains, mâles et/ou femelles, avantageusement de chèvre, brebis, bouc, bison, buffle, chameau, lama, souris, rat, vache, taureau, cochon, truie, lapin(e), cheval, jument. Le mammifère non humain est avantageusement transgénique et a été préalablement exposé au virus RSV afin de produire dans son plasma des immunoglobulines humaines anti-RSV.
Dans un autre mode de réalisation particulier de l'invention, le plasma ou la fraction plasmatique de départ soumis au procédé d'enrichissement de l'invention consistent avantageusement en du plasma provenant de pools de plasmas sanguins de sujets humains normaux ou en une fraction de ce plasma, soit toute partie ou sous-partie du plasma, ayant fait l'objet d'une ou plusieurs étapes de purification.
Les fractions plasmatiques utilisables incluent ainsi le surnageant de plasma cryoprécipité, le cryoprécipité de plasma (remis en suspension), les fractions I à V obtenues par fractionnement éthanolique (selon la méthode de Cohn ou de Kistler & Nitschmann), le surnageant et le précipité obtenus après précipitation à l'acide caprylique et/ou caprylate, les éluats de chromatographies et les fractions non adsorbées des colonnes de chromato graphie, et les filtrats. De manière particulièrement avantageuse, le plasma ou la fraction plasmatique de départ soumis au procédé d'enrichissement de l'invention proviennent de pools de plasmas sanguins de sujets humains normaux, sans sélection préalable des donneurs, en particulier, sans sélection des donneurs sur la base de leur éventuel taux plasmatique en immunoglobulines anti-RSV. Le plasma ou la fraction plasmatique de départ soumis au procédé d'enrichissement de l'invention comporte ainsi avantageusement un taux d' immunoglobulines anti-RSV similaire ou égal au taux d' immunoglobulines anti-RSV d'un plasma issu du pool d'au moins 1000 donneurs humains normaux aléatoirement choisis. Le plasma ou la fraction plasmatique de départ soumis au procédé d'enrichissement de l'invention est avantageusement non enrichi en immunoglobulines anti-RSV comparé au taux d' immunoglobulines anti-RSV d'un plasma issu du pool d'au moins 1000 donneurs choisis de manière aléatoire.
Le plasma ou la fraction plasmatique de départ soumis au procédé d'enrichissement de l'invention contient des immunoglobulines humaines polyvalentes qui peuvent être des immunoglobulines A (IgA), des immunoglobulines E (IgE), des immunoglobulines M (IgM) ou des immunoglobulines G (IgG). Avantageusement, le plasma ou la fraction plasmatique de départ contient essentiellement des IgG quelle que soit leur sous-classe (IgGl, IgG2, IgG3 et IgG4) et/ou des IgM.
Procédé de purification d' immunoglobulines hyper- enrichie s en immunoglobulines anti- RSV:
Le procédé de l'invention utilise préférentiellement comme échantillon de départ un plasma ou une fraction plasmatique provenant de pools de plasmas sanguins de sujets humains normaux, sans sélection préalable des donneurs, en particulier, sans sélection des donneurs sur la base de leur éventuel taux plasmatique en immunoglobulines anti-RSV. Le procédé de l'invention peut typiquement être un procédé indépendant, dédié à la purification d' immunoglobulines anti-RSV uniquement, et est alors avantageusement effectué à partir de plasma ou d'une fraction plasmatique.
Dans ce mode de réalisation, le procédé selon l'invention comprend avantageusement les étapes suivantes : fourniture d'un échantillon de plasma ou d'une fraction plasmatique,
passage de l'échantillon de plasma ou d'une fraction plasmatique sur une chromato graphie d'immunoaffinité sur la matrice de l'invention,
récupération de la fraction adsorbée sur la matrice de l'invention correspondant à la composition d' immunoglobulines hyper-enrichie en immunoglobulines anti-RSV.
De manière avantageuse, le procédé selon l'invention peut comprendre en outre, après l'étape de capture sur chromatographie d'affinité anti-RSV, une étape dédiée de déplétion de certaines immunoglobulines, en particulier les immunoglobulines E (IgE) et/ou immunoglobulines (IgM), qui peuvent être impliquées dans des mécanismes d'effets secondaires délétères chez les patients.
Le procédé comprend avantageusement en outre une étape ultérieure consistant à soumettre la composition d' immunoglobulines hyper-enrichie en immunoglobulines anti-RSV à au moins une étape d'inactivation et/ou d'élimination virale.
Dans un autre mode de réalisation de l'invention, le procédé d'obtention des immunoglobulines anti-RSV est réalisé à partir d'une fraction plasmatique inutilisée provenant d'un procédé de purification d'une protéine plasmatique annexe.
Dans ce mode de réalisation, le procédé selon l'invention comprend avantageusement les étapes suivantes : fourniture d'un échantillon de plasma ou d'une fraction plasmatique non utilisée dans un procédé de purification d'une protéine plasmatique,
passage de l'échantillon de plasma ou d'une fraction plasmatique sur une chromatographie d'immunoaffinité sur la matrice de l'invention,
récupération de la fraction adsorbée sur la matrice de l'invention correspondant à la composition d' immunoglobulines hyper-enrichie en immunoglobulines anti-RSV De manière avantageuse, le procédé selon l'invention peut comprendre en outre, après l'étape de capture sur chromatographie d'affinité anti-RSV, une étape dédiée de déplétion de certaines immunoglobulines, en particulier les immunoglobulines E (IgE) et/ou immunoglobulines (IgM), qui peuvent être impliquées dans des mécanismes d'effets secondaires délétères chez les patients.
Le procédé comprend avantageusement en outre une étape ultérieure consistant à soumettre la composition d' immunoglobulines hyper-enrichie en immunoglobulines anti-RSV à au moins une étape d'inactivation et/ou d'élimination virale.
Dans encore un autre mode de réalisation particulier de l'invention, le procédé d'obtention des immunoglobulines anti-RSV est couplé à un procédé d' immunoglobulines G polyvalentes afin d'obtenir, à partir d'un même pool de plasma de départ, à la fois un concentré d' immunoglobulines G polyvalentes et un concentré d' immunoglobulines hyper-enrichies en anti-RSV.
Le procédé de l'invention comprend alors typiquement une étape préalable d'obtention de la fraction plasmatique, par fractionnement éthanolique et/ou fractionnement caprylique et/ou séparation chromatographique.
Dans ce mode de réalisation, le procédé selon l'invention comprend avantageusement les étapes suivantes : fourniture d'un échantillon d'une fraction plasmatique prépurifiée obtenue par fractionnement éthanolique et/ou fractionnement caprylique et/ou séparation chromato graphique
passage de la fraction plasmatique prépurifiée sur une chromatographie d'immunoaffinité sur la matrice de l'invention,
récupération de la fraction adsorbée sur la matrice de l'invention correspondant à la composition d' immunoglobulines hyper-enrichie en immunoglobulines anti-RSV
Par « séparation chromatographique » selon l'invention, on entend toute étape de chromatographie, qu'il s'agisse de chromatographie échangeuse d'ions (échangeuse d'anions et/ou échangeuse de cations), mixed mode, affinité (utilisant des ligands de type chimiques, anticorps, fragments d'anticorps, aptamères).
Par séparation chromatographique selon l'invention, on entend aussi bien une seule et unique colonne de chromatographie, ou un ensemble de colonnes de chromatographie, utilisant ou non le même type de support, en série (mode multicolonnes par exemple) ou en parallèle.
Plus précisément, la fraction plasmatique peut être obtenue par un fractionnement éthanolique développé à l'origine par Cohn et al (Cohn et al, 1946. J. Am. Chem. Soc. 68, 459 ; Oncley et al, 1949, J. Am. Chem. Soc. 71, 541), ou bien par une séparation chromatographique, telle que décrite par exemple dans EP 0 703 922 et WO 99/64462, ou encore par un fractionnement caprylique tel que décrit par Steinbuch et al 1969, Arch Biochem Biophys. 134(2):279-84). On préfère tout particulièrement les procédés mis au point par la Demanderesse dans les demandes de brevet WO 94/29334 et WO 02/092632, et tout particulièrement celui décrit dans WO 02/092632. Dans ce cas, on soumet un plasma sanguin, ou une fraction de plasma sanguin enrichie en Ig, à un fractionnement caprylique (prépurification par précipitation de contaminants non immunoglobulines), et une chromatographie unique sur un support de résine échangeuse d'anions effectuée à pH alcalin. Un traitement d'inactivation virale peut être réalisé, de préférence effectué par solvant-détergent, comme décrit par Horowitz dans le brevet US 4764 369, éventuellement complété par une étape d'élimination virale par nanofiltration sur filtre de taille de pores 75N, 35N, 20N et/ou 15N.
La fraction d'Ig ainsi récoltée est déjà concentrée, mais peut ensuite subir des étapes de concentration supplémentaire par ultrafiltration, et de filtration stérilisante. Ce concentré est ensuite soumis à une étape chromatographique d'immunoaffinité sur la matrice de l'invention.
De manière avantageuse, le procédé selon l'invention peut comprendre en outre, de préférence après l'étape de capture sur chromatographie d'affinité anti-RSV, une étape dédiée de déplétion de certaines immunoglobulines, en particulier les immunoglobulines A (IgA), et/ou immunoglobulines E (IgE) et/ou immunoglobulines M (IgM), qui peuvent être impliquées dans des mécanismes d'effets secondaires délétères chez les patients. Les immunoglobulines à dépléter sont avantageusement sélectionnées en particulier selon la voie d'administration choisie pour le concentré d' immunoglobulines hyper-enrichi en immunoglobulines anti-RSV et/ou selon le contenu de l'échantillon de plasma ou de la fraction plasmatique de départ. Dans un mode de réalisation particulier, le procédé selon l'invention comprend une étape de chromatographie échangeuse d'anions, avantageusement utilisant une chromatographie de type TMAE, afin de dépléter les immunoglobulines M (IgM) de la composition d' immunoglobulines hyper-enrichie en immunoglobulines anti-RSV. Le procédé comprend avantageusement en outre une étape ultérieure consistant à soumettre la composition d' immunoglobulines hyper-enrichie en immunoglobulines anti-RSV à au moins une étape d'inactivation et/ou d'élimination virale. L'étape d'inactivation et/ou d'élimination virale peut consister en un traitement à pH acide, un traitement par solvant- détergent, une pasteurisation, un chauffage à sec, une nanofiltration et/ou une filtration stérilisante. Avantageusement le procédé comprend une étape d'inactivation par solvant- détergent et une étape d'élimination virale par nanofiltration. Dans un mode de réalisation particulier de l'invention le procédé comprend une étape ultérieure d'élimination virale par nanofiltration,
Le procédé peut en outre comprendre les étapes ultérieures consistant à additionner un ou plusieurs stabilisants pharmaceutiquement acceptables ; et éventuellement congeler ou lyophiliser le concentré ainsi obtenu.
Composition d' immunoglobulines hyper-enrichies :
La composition d' immunoglobulines hyper-enrichies obtenue selon le procédé d'enrichissement de l'invention contient essentiellement des immunoglobulines humaines polyvalentes qui peuvent être des immunoglobulines A (IgA), des immunoglobulines E (IgE), des immunoglobulines M (IgM) ou des immunoglobulines G (IgG). Avantageusement, la composition d' immunoglobulines contient essentiellement des IgG et/ou des IgM et/ou des IgA.
Dans un mode de réalisation particulier, la composition d' immunoglobulines selon l'invention comprend essentiellement des IgG, quelle que soit leur sous-classe (IgGl, IgG2, IgG3 et IgG4).
La composition peut être adaptée par l'homme du métier selon la voie d'administration retenue et/ou le mécanisme d'action recherché. Pour une administration par voie intraveineuse par exemple, la composition contient préférentiellement essentiellement des IgG et/ou des IgM, et est avantageusement déplétée en IgA. En revanche, dans d'autres voies d'administration telle que la voie locale, la composition contient préférentiellement essentiellement des IgG et/ou des IgA, les IgA permettant le recrutement de cellules telles que des cellules mucosales présentant des alfa récepteurs.
La composition d' immunoglobulines obtenue selon le procédé d'enrichissement de l'invention est une composition d' immunoglobulines hyper-enrichie en immunoglobulines anti-RSV qui présente une action neutralisante vis-à-vis du RSV et présente une efficacité thérapeutique pour le patient. Par « composition hyper-enrichie en immunoglobulines anti-RSV » on entend une composition d' immunoglobulines comprenant au moins 10%, au moins 20%, au moins 30%, au moins 40%, au moins 50%, au moins 60%, au moins 65%, au moins 70%, au moins75%, au moins 80% ; au moins 85%, au moins 90%, au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98%, au moins 99% en poids d'immunoglobulines neutralisantes vis-à-vis du RSV.
Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, la composition hyper-enrichie en immunoglobulines anti-RSV selon l'invention comprend avantageusement 10% à 100% en poids d'immunoglobulines neutralisantes vis-à-vis du RSV, encore plus avantageusement 30% à 100% en poids d'immunoglobulines neutralisantes vis-à-vis du RSV, préférentiellement 60% à 100% en poids d'immunoglobulines neutralisantes vis-à- vis du RSV.
Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, la composition d'immunoglobulines anti-RSV présente avantageusement un pouvoir neutralisant vis-à-vis du virus RSV supérieur à celui du plasma sanguin de sujets humains normaux, supérieur à celui du plasma de sujets humains sélectionnés pour leur titre en immunoglobulines anti-RSV, supérieur à celui des immunoglobulines hyper-immunes RSV (RSV-IVIG) telles que Respigam® ou RI-002 d'Adma Biologics, et/ou supérieur à celui des anticorps monoclonaux anti-RSV tel que palivizumab (Synagis®). Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, la composition d' immunoglobulines anti-RSV comprend au moins 10%, au moins 20%, au moins 30%, au moins 40%, au moins 50%, au moins 60%, au moins 65%, au moins 70%, au moins75%, au moins 80% ; au moins 85%, au moins 90%, au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98%, au moins 99% en poids d' immunoglobulines dirigées spécifiquement contre au moins un épitope de la protéine F.
La composition hyper-enrichie en immunoglobulines anti-RSV selon l'invention comprend avantageusement 10% à 100% en poids d' immunoglobulines dirigées spécifiquement contre au moins un épitope de la protéine F, encore plus avantageusement 30% à 100% en poids d' immunoglobulines dirigées spécifiquement contre au moins un épitope de la protéine F, préférentiellement 60% à 100% en poids d' immunoglobulines dirigées spécifiquement contre au moins un épitope de la protéine F.
Dans un autre mode de réalisation particulier de l'invention, la composition d' immunoglobulines anti-RSV comprend au moins 10%, au moins 20%, au moins 30%, au moins 40%, au moins 50%, au moins 60%, au moins 65%, au moins 70%, au moins75%, au moins 80% ; au moins 85%, au moins 90%, au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98%, au moins 99% en poids d' immunoglobulines dirigées spécifiquement contre au moins un épitope de la protéine F en conformation préfusion.
La composition hyper-enrichie en immunoglobulines anti-RSV selon l'invention comprend avantageusement 10% à 100% en poids d' immunoglobulines dirigées spécifiquement contre au moins un épitope de la protéine F en conformation préfusion, encore plus avantageusement 30% à 100% en poids d' immunoglobulines dirigées spécifiquement contre au moins un épitope de la protéine F en conformation préfusion, préférentiellement 60% à 100% en poids d' immunoglobulines dirigées spécifiquement contre au moins un épitope de la protéine F en conformation préfusion.
Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, la composition d' immunoglobulines anti-RSV comprend au moins 10%, au moins 20%, au moins 30%, au moins 40%, au moins 50%, au moins 60%, au moins 65%, au moins 70%, au moins 75%, au moins 80% ; au moins 85%, au moins 90%, au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98%, au moins 99% en poids d' immunoglobulines dirigées spécifiquement contre au moins un épitope de la protéine G.
La composition hyper-enrichie en immunoglobulines anti-RSV selon l'invention comprend avantageusement 10% à 100% en poids d' immunoglobulines dirigées spécifiquement contre au moins un épitope de la protéine G, encore plus avantageusement 30% à 100% en poids d' immunoglobulines dirigées spécifiquement contre au moins un épitope de la protéine G, préférentiellement 60% à 100% en poids d' immunoglobulines dirigées spécifiquement contre au moins un épitope de la protéine G.
La composition hyper-enrichie en immunoglobulines anti-RSV selon l'invention comporte avantageusement des immunoglobulines hyperneutralisantes dirigées contre une pluralité d'épitopes du RSV. Avantageusement, la composition hyper-enrichie en immunoglobulines anti-RSV selon l'invention comprend des immunoglobulines anti-RSV dirigées contre au moins 2 épitopes, au moins 3 épitopes, au moins 5 épitopes, au moins 10 épitopes différents du RSV. Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, la composition hyper-enrichie en immunoglobulines anti-RSV selon l'invention comprend des immunoglobulines anti-RSV dirigées contre au moins un épitope de la protéine F et au moins un épitope de la protéine G.
Dans un autre mode de réalisation particulier de l'invention, la composition enrichie en immunoglobulines anti-RSV comprend un mélange d'immunoglobulines anti-RSV et d' immunoglobulines dirigées contre au moins un autre agent infectieux. Avantageusement la composition enrichie en immunoglobulines anti-RSV comprend alors au moins 30% en poids d'immunoglobulines anti-RSV, et au plus 70% en poids d'immunoglobulines dirigées contre au moins un autre agent infectieux. La composition enrichie en immunoglobulines anti-RSV peut ainsi avantageusement comprendre au moins 30% d'immunoglobulines anti-RSV, et au plus 70% d'immunoglobulines anti-tétanos et antihépatite B. Dans un autre mode de réalisation avantageux, la composition enrichie en immunoglobulines anti-RSV comprend au moins 50% en poids d'immunoglobulines anti- RSV et au plus 50% en poids d'immunoglobulines dirigées contre au moins un autre agent infectieux. Avantageusement, la composition enrichie en immunoglobulines anti-RSV ne comprend pas plus de 10, pas plus de 7, pas plus de 5, pas plus de 3, pas plus de 2 spécificités infectieuses différentes.
Produits finaux : Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, le concentré d' immunoglobulines hyper-enrichi en immunoglobulines anti-RSV à usage thérapeutique peut être administré par toute voie d'administration : oculaire, nasale, intra- auriculaire, orale, sublinguale, pulmonaire, intrapéritonéale, intraveineuse, percutanée, sous-cutanée, intramusculaire, transmuqueuse, vaginale, rectale. Les concentrés d'Ig à usage thérapeutique sont généralement à des concentrations comprises entre 50 et 100 g/1. Ces concentrés sont destinés à un usage clinique et peuvent en particulier être injectés par voie intraveineuse. A cet effet, ils doivent être sécurisés et, le cas échéant, contenir des excipients, tels que des stabilisants, compatibles avec cet usage clinique. Les concentrés d'Ig à usage thérapeutique peuvent également être administrés par voie sous-cutanée. Dans ce cas, la concentration des produits est supérieure ou égale à 100g/l, avantageusement supérieure ou égale à 150 g/1. Les concentrés d'Ig à usage thérapeutique peuvent aussi être administrés par voie intramusculaire.
De manière avantageuse, le concentré d' immunoglobulines hyper-enrichi en immunoglobulines anti-RSV comprend au moins 10%, au moins 20%, au moins 30%, au moins 40%, au moins 50%, au moins 60%, au moins 65%, au moins 70%, au moins75%, au moins 80%, au moins 85%, au moins 90%, au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98%, au moins 99% en poids d' immunoglobulines polyvalentes capables de reconnaître et/ou de neutraliser le virus RSV ou l'une de ses parties. Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, le concentré d' immunoglobulines hyper-enrichi en immunoglobulines anti-RSV comprend au moins 30% en poids d' immunoglobulines polyvalentes capables de reconnaître et/ou de neutraliser le virus RSV ou l'une de ses parties. Dans un autre mode de réalisation particulier de l'invention, le concentré d' immunoglobulines hyper-enrichi en immunoglobulines anti-RSV comprend au moins 60% en poids d' immunoglobulines polyvalentes capables de reconnaître et/ou de neutraliser le virus RSV ou l'une de ses parties.
De manière avantageuse, le concentré d' immunoglobulines hyper-enrichi en immunoglobulines anti-RSV comprend avantageusement au moins 10%, au moins 20%, au moins 30%, au moins 40%, au moins 50%, au moins 60%, au moins 65%, au moins 70%, au moins75%, au moins 80% ; au moins 85%, au moins 90%, au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98%, au moins 99% en poids d' immunoglobulines neutralisantes vis-à-vis du RSV. Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, le concentré d' immunoglobulines hyper-enrichi en immunoglobulines anti-RSV comprend au moins 30% en poids d' immunoglobulines neutralisantes vis-à-vis du RSV. Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, le concentré d' immunoglobulines hyper- enrichi en immunoglobulines anti-RSV comprend au moins 60% en poids d' immunoglobulines neutralisantes vis-à-vis du RSV.
Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, la composition d' immunoglobulines anti-RSV présente avantageusement un pouvoir neutralisant vis-à-vis du virus RSV supérieur à celui du plasma sanguin de sujets humains normaux, supérieur à celui du plasma de sujets humains sélectionnés pour leur titre en immunoglobulines anti-RSV, supérieur à celui des immunoglobulines hyper-immunes RSV (RSV-IVIG) telles que Respigam® ou RI-002 d'Adma Biologics, et/ou supérieur à celui des anticorps monoclonaux anti-RSV tel que palivizumab (Synagis®).
De manière avantageuse, le concentré d' immunoglobulines hyper-enrichi en immunoglobulines anti-RSV comprend au moins 10%, au moins 20%, au moins 30%, au moins 40%, au moins 50%, au moins 60%, au moins 65%, au moins 70%, au moins 75%, au moins 80% ; au moins 85%, au moins 90%, au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98%, au moins 99% en poids d' immunoglobulines dirigées spécifiquement contre au moins un épitope de la protéine F.
De manière particulièrement avantageuse, le concentré d' immunoglobulines hyper-enrichi en immunoglobulines anti-RSV comprend au moins 10%, au moins 20%, au moins 30%, au moins 40%, au moins 50%, au moins 60%, au moins 65%, au moins 70%, au moins75%, au moins 80% ; au moins 85%, au moins 90%, au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98%, au moins 99% en poids d' immunoglobulines dirigées spécifiquement contre au moins un épitope de la protéine F en conformation préfusion.
Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, le concentré d' immunoglobulines hyper-enrichi en immunoglobulines anti-RSV comprend au moins 30% en poids d' immunoglobulines dirigées spécifiquement contre au moins un épitope de la protéine F en conformation préfusion. Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, le concentré d' immunoglobulines hyper-enrichi en immunoglobulines anti-RSV comprend au moins 60% en poids d' immunoglobulines dirigées spécifiquement contre au moins un épitope de la protéine F en conformation préfusion. De manière avantageuse, le concentré d' immunoglobulines hyper-enrichi en immunoglobulines anti-RSV comprend au moins 10%, au moins 20%, au moins 30%, au moins 40%, au moins 50%, au moins 60%, au moins 65%, au moins 70%, au moins75%, au moins 80% ; au moins 85%, au moins 90%, au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98%, au moins 99% en poids d' immunoglobulines dirigées spécifiquement contre au moins un épitope de la protéine G.
Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, le concentré d' immunoglobulines hyper-enrichi en immunoglobulines anti-RSV comprend au moins 30% en poids d' immunoglobulines dirigées spécifiquement contre au moins un épitope de la protéine G. Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, le concentré d' immunoglobulines hyper-enrichi en immunoglobulines anti-RSV comprend au moins 60% en poids d' immunoglobulines dirigées spécifiquement contre au moins un épitope de la protéine G.
Le concentré d' immunoglobulines hyper-enrichi en immunoglobulines anti-RSV selon l'invention comporte avantageusement des immunoglobulines hyperneutralisantes dirigées contre une pluralité d'épitopes du RSV. Avantageusement, le concentré d' immunoglobulines hyper-enrichi en immunoglobulines anti-RSV selon l'invention comprend des immunoglobulines anti-RSV dirigées contre au moins 2 épitopes, au moins 3 épitopes, au moins 5 épitopes, au moins 10 épitopes différents du RSV.
Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, le concentré d' immunoglobulines hyper-enrichi en immunoglobulines anti-RSV selon l'invention comprend des immunoglobulines anti-RSV dirigées contre au moins un épitope de la protéine F et au moins un épitope de la protéine G.
Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, le concentré d' immunoglobulines hyper-enrichi en immunoglobulines anti-RSV comprend un mélange d'immunoglobulines anti-RSV et d'immunoglobulines dirigées contre au moins un autre agent infectieux. Avantageusement le concentré d'immunoglobulines hyper-enrichi en immunoglobulines anti-RSV comprend alors au moins 30% en poids d'immunoglobulines anti-RSV, et au plus 70% en poids d'immunoglobulines dirigées contre au moins un autre agent infectieux. Le concentré d'immunoglobulines hyper-enrichi en immunoglobulines anti-RSV peut ainsi avantageusement comprendre au moins 30% d'immunoglobulines anti-RSV, et au plus 70% d'immunoglobulines anti-tétanos et anti-hépatite B.
Dans un autre mode de réalisation avantageux, le concentré d'immunoglobulines hyper- enrichi en immunoglobulines anti-RSV comprend au moins 50% en poids d'immunoglobulines anti-RSV et au plus 50% en poids d'immunoglobulines dirigées contre au moins un autre agent infectieux.
Avantageusement, le concentré d'immunoglobulines hyper-enrichi en immunoglobulines anti-RSV ne comprend pas plus de 10, pas plus de 7, pas plus de 5, pas plus de 3, pas plus de 2 spécificités infectieuses différentes.
Les concentrés d'Ig enrichis en Ig anti-RSV selon l'invention sont utiles pour le traitement d'une infection au RSV.
Ils peuvent en particulier être utilisés pour l'immunoprophylaxie chez des patients non infectés mais à risque : enfants, nourrissons, personnes hospitalisées, personnes immunodéprimées, personnes âgées.
Ils peuvent également être utilisés en traitement curatif par administration précoce. De manière avantageuse, le concentré d'immunoglobulines hyper-enrichi en immunoglobulines anti-RSV selon l'invention permet alors de ralentir et/ou d'empêcher la diffusion de l'infection des voies respiratoires hautes vers les voies respiratoires basses. Dans un autre mode de réalisation avantageux, le concentré d'Ig enrichi en Ig anti-RSV selon l'invention permet de ralentir et/ou d'empêcher la propagation du RSV de cellules à cellules et/ou de ralentir et/ou d'empêcher la formation de syncytia.
Avantageusement, le concentré d' immunoglobulines hyper-enrichi en immunoglobulines anti-RSV selon l'invention permet la réduction significative de la charge virale, normée par rapport à une référence connue, chez le patient traité.
Le concentré d' immunoglobulines hyper-enrichi en immunoglobulines anti-RSV selon l'invention permet en outre avantageusement la destruction des cellules infectées via le recrutement de cellules effectrices grâce aux fonctions ADCC des immunoglobulines de la composition.
Le patient traité est de préférence un être humain, quels que soient son âge et son sexe. Le traitement thérapeutique des enfants et nourrissons est particulièrement envisagé, ainsi que celui des personnes âgées, hospitalisées ou immunodéprimées.
EXEMPLES
EXEMPLE 1 : chromatographie d'affinité utilisant le ligand protéine hRSV-F 11049- V08B
Préparation de la matrice de chromatographie d'affinité anti-RSV On utilise comme ligand d'affinité la protéine RSV-F 11049-V08B (Sino Biological Inc), protéine synthétique issue d'une séquence ADN du hRSV (RSS-2) de la Met 1 à la Thr 529, contenant 518 acides aminés après clivage du propeptide et dont la ma masse moléculaire prédite est de 58kDa. En analyse SDS-PAGE et conditions de réduction, les masses moléculaires apparentes sont 45-55 kDa et 18 kDa. Le ligand RSV-F 11049-V08B utilisé pour le greffage est en conformation post-fusion.
2mL de gel NHS-activated sepharose™ 4 Fast Flow sont mis en place dans une colonne de chromatographie de diamètre 1.1cm et les tampons utilisés sont ceux recommandés par le fournisseur du gel. Après lavage (ImM HCL à 4°C) et équilibrage en tampon de couplage, 1,98 mg de protéine F à greffer sont ajoutées au gel et l'ensemble est mis en agitation. Le blocage des groupements réactifs sur le gel est réalisé en ajoutant 6 mL de tampon 0.5M elhanolamine, 0.5M NaCl, pH 8.3 (6mL), et le gel est mis en agitation pendant 12h. Le gel couplé est lavé avec une alternance de 3 volumes de tampons basique puis acide : 0. IM Tris-HCl pH 8.4 et 0. IM acétate, 0.5M NaCl pH 4, ce cycle étant répété trois fois. Le gel est ensuite stocké en tampon lOmM citrate, 0.5M NaCl, O.lg/L azide de sodium pH 6.6
Le couplage a été évalué à 98%, correspondant à une densité de ligand de 0,89mg/mL de gel greffé.
Tableau 1 : Rendement de couplage
Protéine F désalée Surnageant de
Protéine F initiale
pour couplage couplage
Volume initial (mL) 3 mL 4.5 5.0
Concentration de
l'échantillon déposé 0.66 0.44 0.039
(mg niL)
Quantité déposée (mg) 1.98 1.98 0.195
Rendement de couplage NA NA 98% Afin de tester sa fonctionnalité, le gel subit en cycle de chromatographie avec un échantillon d'immunoglobulines polyvalentes (22,4 mL d'échantillon ILP10, pureté 98% IgG, concentration 9.45g IgG /L, titré 0.0107 mg/mL anti-RSV). Le temps de contact est de 3.3min.
Les tampons utilisés sont les suivants : o fixation/lavage lOmM Citrate, pH7, 0.5M NaCl ;
o Elution lOOmM Glycine-HCl, pH 2.57 ;
On observe lors du premier mn sur ce gel un pic bien défini en élution. Le gel est donc fonctionnel et fixe bien une partie des immunoglobulines injectées.
Réalisation de la chromatographie d'affinité anti-RSV L'échantillon utilisé est une fraction plasmatique (ILP10) issue du procédé de purification d'immunoglobulines tel que décrit dans la demande de brevet WO02092632 de la demanderesse. Le procédé de purification comprend les étapes suivantes :
Récupération d'une fraction Ι+Π+ΙΠ, obtenue à partir de plasma sanguin traité à l'éthanol Précipitation à Γ acide caprylique
- Traitement solvant-détergent (TritonTnBP)
Chromatographie échangeuse d'anions (TMAE) à pH basique
L'éluat de la chromatographie échangeuse d'anions à pH basique constitue l'échantillon ILP10 n°13606/10L02032 à 9,45 g/L d'IgG (pureté de 99% en IgG) et contenant 0,11% d'immunoglobulines anti-RSV (107 μg/mL).
L'échantillon est équilibré dans le tampon d'injection en y ajoutant une solution concentrée de tampon de NaCl et de citrate trisodique qsp 0,05M NaCl et 0,01M Citrate trisodique. Le produit est ensuite passé sur la colonne durant 3.3min (temps de contact). Après lavage, l'élution est réalisée en tampon 0,1M glycine, 30% propylène glycol à pH 2,57. L'éluat est immédiatement neutralisé par du tampon 1M Tris-HCl pH 9 pour en remonter le pH à environ 6. Le gel est alors passé en régénération afin de décrocher les Ig non éluées avec un tampon 6M guanidine pH 6. La fraction récupérée est aussi neutralisée par l'ajout de 1M Tris-HCl pH9 pour en remonter le pH à 6. Résultats
Le dosage analytique des fractions est réalisé en méthode MSD (Mesoscale DiscoveryTM) La veille du dosage, la plaque est coatée avec la protéine F en ajoutant 3C^L/puits à l^g/mL de protéine F en tampon PBS, et le mélange est incubé pendant une nuit à 4°C. La plaque est ensuite lavée trois fois avec 200μL· de tampon PBS, 0.1% Tween. Une saturation est alors réalisée en ajoutant 150μί par puits de PBS, 3% BSA, en incubant lh à température ambiante sous agitation. La plaque est à nouveau lavée trois fois avec 200μL· de tampon PBS, 0.1% Tween. Les échantillons à doser sont ajouter à raison de 25μί par puits, et incubés 2h à température ambiante sous agitation. Un nouveau cycle de lavage identique aux précédents est réalisé. Le conjugué Sulfo-Tag anti-Human IgG est alors ajouté à raison de 25μί dans chacun des puits, et incubés pendant 2h à température ambiante sous agitation. Un nouveau cycle de lavage est effectué, puis 150μί par puits de tampon de lecture dilué au demi en eau sont ajoutés. La plaque est agitée modérément et lue immédiatement après.
On obtient les résultats présentés dans le tableau 2 ci-dessous : Tableau 2 : Quantité d'Ig anti-RSV au cours du procédé de purification
Figure imgf000034_0001
Une forte proportion des immunoglobulines anti-RSV se fixe au support de chromatographie par affinité à la protéine hRSV-F (-70%) ce qui représente dans cet essai 166 μg d' d' immunoglobulines anti-RSV par mL de gel. La fraction non adsorbée et la fraction de lavage sont appauvries en d'immunoglobulines anti-RSV. La fraction d' immunoglobulines éluées du support à pH acide et en présence de Propylene glycol montre un enrichissement de 301 fois en d'immunoglobulines anti- RSV et la proportion éluée représente 55% de la proportion fixée au support. On note que la fraction de régénération comprend une faible quantité d'immunoglobulines mais comporte également une forte proportion d'immunoglobulines anti-RSV qui pourront être récupérées soit en modifiant les conditions d'élution de la chromatographie (composition du tampon, pH...) soit en repassant la fraction de régénération sur la colonne afin de récupérer les immunoglobulines anti- RSV.
L'essai montre que la chromatographie d' affinité utilisant un ligand protéine F en conformation postfusion greffé via une chimie NHS permet la purification d'immunoglobulines anti-RSV avec un rendement de 38% dans les conditions testées (55% des immunoglobulines fixées au support), correspondant à un facteur d'enrichissement de 301. La composition obtenue après chromatographie d'affinité sur ligand protéine F en conformation post- fusion comprend donc au moins 30% en poids d'immunoglobulines dirigées spécifiquement contre au moins un épitope de la protéine F.
Cette composition est utile pour la préparation d'un concentré d'immunoglobulines hyper- enrichi en immunoglobulines anti-RSV comprenant au moins 30% en poids d'immunoglobulines dirigées spécifiquement contre au moins un épitope de la protéine F.
Les fractions obtenues ont par ailleurs été analysées pour déterminer la répartition des différentes sous-classes d'IgG.
Les résultats sont présentés dans le tableau 3 ci-dessous :
Tableau 3 : Répartition des sous-classes d'IgG
Figure imgf000035_0001
EXEMPLE 2 : Test fonctionnel des immunoglobulines anti-RSV purifiées par chromatographie d'affinité utilisant le ligand protéine hRSV-F 11049- V08B
Protocole de séroneutralisation
Afin de mesurer la capacité d'inhibition de l'infection virale par les fractions obtenues, une souche virale hRSV(18)-cherry3 contenant un gène rapporteur codant pour une protéine fluorescente est utilisée sur une lignée de cellules Hep2. L'intensité de la fluorescence est directement représentative de la réplication virale. La veille du test, les cellules sont repiquées en plaque de 96 puits à 0.5xlOe6cellules/mL et incubées à 37°C sous 7% CO2. Le jour du test, les anticorps monoclonaux témoins positifs (Synagis™, solution d'anticorps monoclonaux dirigés contre le RSV) et négatifs (Hurnira™, solution d'anticorps monoclonaux anti-TNF) ainsi que les fractions à tester sont diluées en milieu MEM et ^0μL· sont déposés en puits de plaque de 96 puits. Le virus est de même dilué en milieu MEM au 1125^ et 70μί sont déposés dans les puits contenant les solutions d'anticorps. L'homogénéisation est faite par aspiration/refoulement. Le mélange est alors incubé pendant lh à 37°C sous 7% de CO2. Pour l'infection des cellules, le surnageant cellulaire est aspiré, ΙΟΟμί du mélange Ig/virus sont rapidement déposés et l'incubation est réalisée à 37°C sous 7% CO2 pendant 36 à 48 heures. La révélation se fait par mesure de la fluorescence en excitant à 580nm et en Usant à 620nm. Les valeurs sont normalisées par rapport au témoin « 100% infection » où le virus est mis seul en contact avec les cellules, et le témoin « 0% infection » correspond aux cellules mises en contact avec le milieu MEM seul. La détermination d'une IC50 est réalisée en exploitant les courbes de doses-réponses en fonction des concentrations d' anticorps.
Résultats
Les fractions enrichies en immunoglobulines anti-RSV obtenues à l'exemple 1 (éluat et régénération) sont concentrées, formulées en tampon (mannitol, glycine, tween 80) et testées en séroneutralisation. Tableau 4: Test de séroneutralisation
Figure imgf000037_0001
La valeur d'IC50 de Synagis a été moyennée à partir de 3 essais.
Comme cela est résumé aux figures 3, 4 et 5, on observe une activité de séroneutralisation dans les fractions purifiées (IC50 à 28 ng/mL) bien supérieure à celle d'une solution d'immunoglobulines polyvalentes commerciale (TVTG TEG 22xl03ng/mL) et qui reste supérieure à celle de SYNAGIS (145ng/ml). Le processus de chromatographie utilisé permet donc d'obtenir des immunoglobulines anti-RSV ayant une activité fonctionnelle in vitro améliorée. Cette activité séroneutralisante est également détectable dans les fractions régénérations avec une IC50 inférieure.
Le concentré d'immunoglobulines hyper-enrichi en immunoglobulines anti-RSV obtenu par chromatographie d' affinité présente donc une activité neutralisante permettant son utilisation dans le traitement d'une infection par le RSV.
EXEMPLE 3 : chromatographie d'affinité utilisant le ligand protéine RSV-G, souches A (11070- V08H2. SB) ou B (13029- VQ8H. SB) Préparation de la matrice de chromatographie d'affinité anti-RSV
On utilise comme ligands d'affinité la protéine RSV-G
souche A (ref 11070-V08H2, SB), protéine synthétique issue d'une séquence ADN du hRSV (souche rsbl734) de la Asn 66 à Γ Arg 297, contenant 242 acides aminés après clivage du propeptide et dont la masse moléculaire prédite est de 26,3kDa. En analyse SDS-PAGE et conditions réductrice, la masse moléculaire apparente est comprise du fait d'une importante glycosylation entre 60 kDa et 90 kDa.
souche B (ref 13029- V08H, SB), protéine synthétique issue d'une séquence ADN du hRSV (souche 036633-1) de l'His 67 àl'Ala299, contenant 244 acides aminés après clivage du propeptide et dont la masse moléculaire prédite est de 27kDa. En analyse SDS-PAGE et conditions réductrice, la masse moléculaire apparente est comprise du fait d'une importante glycosylation entre 80 kDa et 90 kDa.
Le couplage est réalisé selon le même protocole que celui utilisé à l'exemple 1.
Trois colonnes sont réalisées :
- gel G- A, correspondant à une densité de Protéine G souche A de 1 mg/mL de gel greffé, gel G-B, correspondant à une densité de Protéine G souche B de 1 mg/mL de gel greffé, gel G-AB, correspondant à un mélange 50% gel G-A et 50% gel G-B,
Réalisation de la chromatographie d'affinité anti-RSV
L'échantillon utilisé est une fraction plasmatique issue du procédé de purification d' immunoglobulines tel que décrit dans la demande de brevet WO02092632 de la demanderesse. Le procédé de purification comprend les étapes suivantes :
Récupération d'une fraction Ι+Π+ΙΠ, obtenue à partir de plasma sanguin traité à l'éthanol Précipitation à Γ acide caprylique
- Traitement solvant-détergent (Triton/TnBP)
Chromatographie échangeuse d' anions
L'éluat de la chromatographie échangeuse d' anions constitue réchantillon d'IgG (pureté de > 98% en IgG) et contenant 0,04% d' immunoglobulines anti-RSV. Le temps de contact est de 3 min. Les tampons utilisés sont les suivants :
o fixation/lavage 20mM phosphate, pH7,
o Elution lOOmM Glycine-HCl, pH 2.5 ;
Résultats
Le dosage analytique des fractions est réalisé en méthode néphélémetrie (IgG totale) et en dosage CFCA au Biacore (Ig anti-RSV) selon le protocole suivant :
Immobilisation des variants A et B de la protéine G sur une sensor chip CM5
Injection des fractions issues des étapes de chromatographie Mesure de la vitesse de diffusion des IgG anti-RSV, du tampon de course à la surface d'interaction
Calcul de la concentration absolue en IgG anti-RSV, dans les différentes fractions, à partir de la vitesse de diffusion mesurée et des propriétés diffusionnelles des IgG.
Tableau 5 : Quantité d'Ig anti-RSV au cours du procédé de purification sur gel G- A
Figure imgf000039_0001
Tableau 6 : Quantité d'Ig anti-RSV au cours du procédé de purification sur gel G-B
Figure imgf000039_0002
Tableau 7 : Quantité d'Ig anti-RSV au cours du procédé de purification sur gel G-AB
Quantité Ratio IgG
Quantité Facteur Bilan
IgG anti- anti-RSV
IgG Totales d'enrichisse en Ig anti- RSV /IgG Total
ment RSV (%)
( )
Matière
133770 52 0,04% - 100%
départ IglV
FNA 124000 ND - - -
Eluat 288 14 4,8% 124 26,7% NB : le design de l'expérience nous a permis de constater que les IgG anti-RSV purifiés sur le variant A de la protéine G interagissaient également avec le variant B de la protéine G et inversement (anti- varB sur variantA) laissant penser qu'il existe une réactivité croisée entre les anticorps polyclonaux anti-RSV pour les deux variants de la protéine G.
Une forte proportion des immunoglobulines anti-RSV se fixe au support de chromatographie par affinité à la protéine hRSV-G, quelle que soit la souche, ce qui représente dans cet essai au moins 6^g d' immunoglobulines anti-RSV par mL de gel. La fraction non adsorbée et la fraction de lavage sont appauvries en immunoglobulines anti-RSV. La fraction d'immunoglobulines éluées du support à pH acide et en présence de Propylène glycol montre un enrichissement minimum de 109 fois en immunoglobulines anti-RSV.
L'essai montre que la chromatographie d'affinité utilisant un ligand protéine G de souches A ou B greffées via une chimie NHS permet la purification d'immunoglobulines anti-RSV avec un rendement d'au moins 26,2% dans les conditions testées, correspondant à un facteur d'enrichissement minimum de 109 fois.
La composition obtenue après chromatographie d'affinité sur ligand protéine G en comprend donc au moins 30% en poids d'immunoglobulines dirigées spécifiquement contre au moins un épitope de la protéine G.
Cette composition est utile pour la préparation d'un concentré d'immunoglobulines hyper- enrichi en immunoglobulines anti-RSV comprenant au moins 30% en poids d'immunoglobulines dirigées spécifiquement contre au moins un épitope de la protéine G.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de préparation d'un concentré d'immunoglobulines (Ig) utile pour traiter une infection au virus syncytial respiratoire (RSV) comprenant une étape consistant à soumettre une composition d'Ig issue de plasma sanguin, à une chromatographie d'affinité mettant en œuvre un ligand spécifique du virus RSV, caractérisé en ce que le ligand spécifique du virus RSV est une protéine du virus RSV, ou un variant de celle-ci ou un fragment antigénique de celle-ci.
2. Procédé de préparation d'un concentré d'immunoglobulines (Ig) syncytial selon la revendication 1, caractérisé en ce que la protéine du virus RSV est une protéine de surface du virus RSV, ou un variant de celle-ci ou un fragment antigénique de celle-ci.
3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, dans lequel le ligand spécifique du virus RSV est une protéine SH et/ou une protéine G et/ou une protéine F du virus RSV, ou un variant de celles-ci ou un fragment antigénique de celles-ci.
4. Procédé selon l'une des revendications précédentes, dans lequel le ligand spécifique du virus RSV est une protéine F du virus RSV, en conformation pré-fusion, ou un variant de celle-ci ou un fragment antigénique de celle-ci.
5. Procédé selon la revendication 3 ou 4, dans lequel la protéine F du virus RSV porte les mutations S155C, S290C, S 190F et V207L.
6. Procédé selon l'une des revendications 3 à 5, dans lequel la protéine F du virus RSV comprend les fragments F24-136, F164-315, F283-402, F403-524, F167-201, F235-275, et/ou F478-512.
7. Procédé selon l'une des revendications précédentes, dans lequel le ligand spécifique du virus RSV est une protéine G du virus RSV ou un variant de celle-ci ou un fragment antigénique de celle-ci.
8. Procédé selon l'une des revendications précédentes, dans lequel le plasma sanguin utilisé consiste en un pool de plasmas sanguins de sujets humains normaux, sans sélection préalable des donneurs.
9. Procédé selon l'une des revendications précédentes, dans lequel la matrice d'affinité est formée d'un gel de polymère, de préférence un polymère organique.
10. Procédé selon l'une des revendications précédentes, comprenant une étape préalable d'obtention de la composition d'Ig à partir de plasma sanguin, par fractionnement éthanolique et/ou fractionnement caprylique et/ou séparation chromatographique.
11. Procédé selon l'une des revendications précédentes, comprenant l'étape ultérieure consistant à récupérer la fraction adsorbée sur la matrice d'affinité et la soumettre à au moins une étape d'inactivation et/ou d'élimination virale.
12. Procédé selon l'une des revendications précédentes, comprenant les étapes ultérieures consistant à additionner un ou plusieurs stabilisants pharmaceutiquement acceptables ; et éventuellement congeler ou lyophiliser le concentré ainsi obtenu.
13. Procédé selon l'une des revendications précédentes, dans lequel le concentré d' immunoglobulines (Ig) consiste en un concentré d' immunoglobulines polyvalentes capables de neutraliser le virus RSV ou l'une de ses parties.
14. Concentré d' immunoglobulines (Ig) hyper-enrichi en immunoglobulines anti-RSV susceptible d'être obtenu par le procédé selon l'une des revendications 1 à 13.
15. Concentré d' immunoglobulines (Ig) hyper-enrichi en immunoglobulines anti-RSV, caractérisé en ce qu'il comprend au moins 10%, au moins 20%, au moins 30%, au moins 40%, au moins 50%, au moins 60%, au moins 65%, au moins 70%, au moins75%, au moins 80%, au moins 85%, au moins 90%, au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98%, au moins 99% d' immunoglobulines polyvalentes capables de reconnaître et/ou de neutraliser le virus RSV ou l'une de ses parties.
16. Concentré d' immunoglobulines (Ig) hyper-enrichi en immunoglobulines anti-RSV caractérisé en ce qu'il comprend au moins 10%, au moins 20%, au moins 30%, au moins 40%, au moins 50%, au moins 60%, au moins 65%, au moins 70%, au moins75%, au moins 80% ; au moins 85%, au moins 90%, au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98%, au moins 99% en poids d' immunoglobulines neutralisantes vis-à-vis du RSV.
17. Concentré d' immunoglobulines (Ig) hyper-enrichi en immunoglobulines anti-RSV caractérisé en ce qu'il comprend au moins 10%, au moins 20%, au moins 30%, au moins 40%, au moins 50%, au moins 60%, au moins 65%, au moins 70%, au moins75%, au moins 80% ; au moins 85%, au moins 90%, au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98%, au moins 99% en poids d' immunoglobulines dirigées spécifiquement contre au moins un épitope de la protéine F en conformation préfusion.
18. Concentré d' immunoglobulines (Ig) hyper-enrichi en immunoglobulines anti-RSV selon l'une des revendications 14 à 17, pour une utilisation dans le traitement d'une infection par le RSV.
PCT/FR2016/052512 2015-10-01 2016-09-30 Procédé d'enrichissement d'une préparation d'immunoglobulines en immunoglobulines anti-rsv et préparation ainsi enrichie WO2017055775A1 (fr)

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