JPH0767629A

JPH0767629A - 標的遺伝子置換法

Info

Publication number: JPH0767629A
Application number: JP5243238A
Authority: JP
Inventors: Motoya Katsuki; 元也勝木
Original assignee: DEINAADE KK
Current assignee: DEINAADE KK
Priority date: 1992-09-29
Filing date: 1993-09-29
Publication date: 1995-03-14

Abstract

(57)【要約】【構成】ゲノムＤＮＡの標的遺伝子領域が、２種類の
異なる抗生物質の各々に対して耐性および感受性を示す
１種以上の外来遺伝子を含有するＤＮＡ配列によって相
同組換えされている胚幹細胞に、希望する構造の遺伝子
を組込んだＤＮＡ断片を導入し、上記胚幹細胞ＤＮＡの
相同組換え配列領域を導入ＤＮＡ断片によって相同的に
置換することにより、胚幹細胞ゲノムＤＮＡの標的遺伝
子領域を希望する構造の遺伝子に置換する。【効果】ＥＳ細胞ゲノムＤＮＡの任意の遺伝子を、希
望する構造の遺伝子に、確実に、かつ効率よく置換する
ことができ、広範な研究および産業分野において有用な
トランスジェニック動物が得られる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】この発明は、胚幹細胞とこの胚幹
細胞を用いた標的遺伝子置換法、およびそれによって得
られる置換体胚幹細胞とトランスジェニック動物に関す
るものである。さらに詳しくは、この発明は、胚幹細胞
ゲノムＤＮＡの任意の遺伝子を希望する構造の遺伝子に
よって選択的に置換する標的遺伝子置換法と、特定の遺
伝子が希望する構造の遺伝子に置換された動物個体に関
するものである。

【０００２】この発明の標的遺伝子置換法は、遺伝学や
発生学等の基礎研究分野における研究戦略としてばかり
か、新しい遺伝子療法への応用も可能である。またトラ
ンスジェニック動物は、疾患モデル動物としてヒト遺伝
子疾患の解明やその治療法および治療薬の開発に有用で
ある。

【０００３】

【従来の技術】近年、組換えＤＮＡをはじめとする遺伝
子操作技術の進歩には目覚しいものがあり、生物学一般
のみならず、医学、工学、農学等への応用展開も急速に
拡大しつつある。また、遺伝子そのものについても、そ
の塩基配列構造の解析から多数の知見が蓄積されてきて
おり、今日ではその研究対象が３０億塩基対とも言われ
る膨大なヒトゲノムＤＮＡにまで及んでいる。

【０００４】しかしながら、そのようにして構造決定が
なされた種々の遺伝子によってヒトの生物現象を真に理
解しようとするならば、それらの遺伝子の個体レベルに
おける機能解析が不可欠である。また一方で、癌をはじ
めとするヒト疾患の多くが遺伝子発現の何らかの異常に
よることが明らかになるにつれ、医学研究に用いられる
実験動物にも遺伝子解析や遺伝子操作が要求されるよう
になっている。

【０００５】このような理由から、特定の遺伝子（例え
ば、ヒトの機能未知遺伝子や疾患原因遺伝子）を動物個
体において計画的に機能発現させることのできる技術や
そのような動物それ自体の研究がこれまでにも活発にな
されている。そのような研究の重要な成果が、いわゆる
遺伝子導入法である。これは、たとえばマウスの受精卵
に外来遺伝子ＤＮＡを物理的に導入し、ある程度体外で
培養した後、再びメスマウスの子宮に戻して個体へと発
生させる方法であり、この方法によって、生まれながら
にして外来遺伝子を染色体の一部に安定的に組み込んだ
動物（トランスジェニック動物）を得ることが可能にな
った。

【０００６】ただし、この方法の場合には、導入遺伝子
を動物染色体の希望する位置に組み込むことが不可能な
ため、その導入遺伝子を個体レベルで効率よく発現させ
たり、あるいはその発現機能の特異性を同定することが
困難であった。これに対して、最近、動物の任意の遺伝
子を、導入遺伝子によって希望する構造に置き換えるこ
とのできる新しい遺伝子導入法が開発された。それが標
的遺伝子導入法（ジーンターゲッティング：gene targe
ting）である。

【０００７】図８は、この方法を用いた標的遺伝子導入
マウスの作成工程図である。この標的遺伝子導入法で
は、図８に示したように、外来遺伝子ＤＮＡを哺乳動物
（マウス）の胚幹細胞（Embryonic Stem Cell ：以下、
ＥＳ細胞と記載することがある）に導入する。このマウ
スＥＳ細胞は、やがてマウス個体へと発生する初期胚の
内部細胞塊に由来する細胞であり、体外で未分化のまま
培養増殖することができる。そこで培養中のＥＳ細胞
に、電気穿孔法等を用いて外来遺伝子ＤＮＡを導入し、
この細胞を別系統のマウスから得られた胚盤胞に注入し
て仮親マウスに移植すれば、注入された正常胚の一部と
なって個体まで発生し、キメラマウス（縞模様）が誕生
する。このキメラマウスの生殖細胞にＥＳ細胞由来の細
胞が分化していれば、ＥＳ細胞の性質は子孫へと伝達さ
れ、その染色体の任意の遺伝子が外来遺伝子によって置
き換えられたトランスジェニックマウス（標的遺伝子導
入マウス）が得られる。

【０００８】しかしながら、この方法の場合にも、ＥＳ
細胞に導入された外来遺伝子ＤＮＡは、ほとんどの場
合、染色体上のランダムな位置に挿入され、その相同遺
伝子（標的遺伝子）との組換え（相同組換え）の確率
は、約１０００分の１（１０^-3）程度と見積まれてい
る。そこで、外来遺伝子由来の突然変異を標的遺伝子に
有する動物個体を得るためには、ＥＳ細胞のレベルで、
相同組換え体のみを選択する必要があり、そのための方
法として、薬剤耐性を用いた以下のような選択方法が提
案されている。

【０００９】すなわち、この方法は、導入遺伝子の構造
を工夫し、その配列内に、遺伝子の発現調節領域（プロ
モーター／エンハンサー）もポリＡシグナルも含まない
ようにしておき、さらに、Ｇ４１８という薬剤に対する
耐性遺伝子であるＮｅｏ耐性遺伝子（ｎｅｏ^r）を適当
なエキソンにアミノ酸配列のフレームを一致させて挿入
したＤＮＡ断片を構築する。この遺伝子をマウスＥＳ細
胞に導入した場合に、それがマウスゲノムＤＮＡの標的
遺伝子領域と相同組換えを起こしたときには、図９
（Ａ）に示したように、標的遺伝子固有のプロモーター
とポリＡシグナルとによってｎｅｏ^r遺伝子が発現し、
ＥＳ細胞はＧ４１８に対して耐性となり増殖する。一
方、導入遺伝子がゲノムＤＮＡのランダムな位置に挿入
されたときには、図９（Ｂ）に示したように、その近傍
にプロモーターもポリＡシグナルもないことが多いであ
ろうから、ｎｅｏ^r遺伝子も発現されず、したがってそ
のようなＥＳ細胞はＧ４１８によって死滅してしまう。

【００１０】この方法によれば、遺伝子導入細胞中から
１０^-3の頻度でしか得られない相同組換え体細胞を効率
よく選択することができ、実際には約１０倍の濃縮が可
能とされている。また、ＥＳ細胞が本来発現していない
遺伝子を導入する場合には、プロモーターおよびポリＡ
シグナルを備えたｎｅｏ^r遺伝子とともに、もう一種類
の選択マーカー遺伝子（例えば、ウイルスのチミジンキ
ナーゼ遺伝子）を組込んだ導入遺伝子を構築し、２段階
の選択によって相同組換え体細胞を得る方法も提案され
ている（例えば、最新医学、第４６巻、増巻号、第１２
７〜１３４頁、１９９１年）。

【００１１】

【発明が解決しようとする課題】従来の標的遺伝子導入
法では、上記のような薬剤耐性を用いた選択を行なうこ
とによって、遺伝子導入細胞からある程度効率よく相同
組換え体を得ることができる。しかしながら、上記のよ
うに、導入遺伝子に薬剤耐性遺伝子等を組込んで選択マ
ーカーとする方法は、標的遺伝子導入法の目的が動物染
色体上の任意の遺伝子と外来遺伝子との相同的な置換で
あることを考慮した場合、以下の２つの理由において必
ずしも好ましいものではない。

【００１２】第１の理由は、導入遺伝子に薬剤耐性遺伝
子を組込むために、導入する外来遺伝子の一部を欠失さ
せなければならないということである。すなわち、図１
０に示したように、導入遺伝子にｎｅｏ^r遺伝子を挿入
し、かつ導入遺伝子の他の配列領域とＥＳ細胞ゲノムの
相同領域とを対合させて相同組換えを起こすためには、
互いのホモロジーが確保されるように外来遺伝子の一部
（この図１０の場合には、第２番目のエクソン）を切り
取って、そこにｎｅｏ^r遺伝子を挿入しなければならな
い。

【００１３】第２の理由は、ｎｅｏ^rのような薬剤耐性
遺伝子の発現を指標として相同組換え体細胞を選択する
ため、導入された薬剤耐性遺伝子が組換体ＥＳ細胞中に
必ず残存してしまうということである。このように、従
来の方法は、外来遺伝子を希望する完全な形で導入する
ことができず、また、希望しない遺伝子を導入しなけれ
ばならないという点において、完全な遺伝子置換法とは
言えないものであった。

【００１４】この発明は、以上の通りの事情に鑑みてな
されたものであり、標的遺伝子を希望する構造の遺伝子
に置換することができ、しかも選択マーカー遺伝子を残
存させることのない新しい遺伝子置換法を提供すること
を目的としている。またこの発明は、そのための組換体
ＥＳ細胞を提供することを目的としてもいる。

【００１５】

【課題を解決するための手段】この発明は、上記の課題
を解決するものとして、ゲノムＤＮＡの任意の遺伝子領
域が、２種類の異なる抗生物質の各々に対して耐性およ
び感受性を有する１種以上の外来遺伝子を含有するＤＮ
Ａ配列によって相同組換えされていることを特徴とする
胚幹細胞を提供する。

【００１６】また、この発明は、ゲノムＤＮＡの標的遺
伝子領域が、２種類の異なる抗生物質の各々に対して耐
性および感受性を示す１種以上の外来遺伝子を含有する
ＤＮＡ配列によって相同組換えされている胚幹細胞に、
希望する構造の遺伝子を組込んだＤＮＡ断片を導入し、
上記胚幹細胞ＤＮＡの相同組換え配列領域を導入ＤＮＡ
断片によって相同的に置換することにより、胚幹細胞ゲ
ノムＤＮＡの標的遺伝子領域に希望する構造の遺伝子を
導入することを特徴とする標的遺伝子置換法と、この方
法によって得られる標的遺伝子置換体胚幹細胞、および
その胚幹細胞由来のトランスジェニック動物を提供す
る。

【００１７】さらにこの発明は、ゲノムＤＮＡの任意の
遺伝子領域に突然変異配列を有する動物細胞において、
その動物細胞の突然変異遺伝子領域を２種類の異なる抗
生物質の各々に対して耐性および感受性を示す１種以上
の外来遺伝子を含有するＤＮＡ配列によって相同的に置
換し、突然変異遺伝子の正常遺伝子を組込んだＤＮＡ断
片を上記置換体細胞に導入し、置換体細胞ＤＮＡの相同
組換え配列領域を導入ＤＮＡ断片によって相同的に置換
することにより、動物細胞ゲノムＤＮＡの突然変異遺伝
子領域を正常遺伝子に置換することを特徴とする標的遺
伝子置換法をも提供する。

【００１８】なおこの発明は、上記の標的遺伝子置換法
において、一方の抗生物質に対する耐性を指標として相
同組換体細胞を選択し、他方の抗生物質に対する非感受
性を指標として相同置換体細胞を選択することを好まし
い態様としてもいる。以下、この発明についてさらに詳
しく説明する。この発明の標的遺伝子置換法は、ＥＳ細
胞を対象とする場合には、まず、第１の段階としてＥＳ
細胞の任意の遺伝子領域を、２種類の異なる抗生物質の
各々に対して耐性および感受性を示す１種以上の外来遺
伝子を含有するＤＮＡ配列によって相同的に組換える。
この段階では、ＤＮＡ配列中に置換を目的とする構造は
付与しない。組換え体細胞は、ＤＮＡ配列中にたとえば
薬剤耐性遺伝子であるｎｅｏ^r遺伝子を導入した場合に
は、従来方法と同様に、抗生物質Ｇ４１８に対する生存
細胞として選択することができる。なお、この場合には
薬剤耐性遺伝子とともに薬剤感受性遺伝子または条件致
死遺伝子をＤＮＡ配列中に挿入するが、これらの遺伝子
は、この段階では相同組換え体の選択マーカーとして用
いない。

【００１９】図１（Ａ）は、この標的遺伝子組換え段階
における相同組換えの好ましい態様を例示した模式図で
ある。本来、Ｇ４１８に対して感受性を有するＥＳ細胞
は、そのゲノムＤＮＡの任意の遺伝子領域が、ｎｅｏ^r
遺伝子とヘルペス単純ウイルスのチミジンキナーゼ遺伝
子（以下、ＨＳＶ−ｔｋと記す）を含有するＤＮＡ配列
によって相同的に組換えられると、ｎｅｏ^r遺伝子の存
在によってＧ４１８耐性細胞へとその形質を変化させ
る。従って、Ｇ４１８存在下で生き残った細胞を回収す
ることによって、相同組換体細胞を選択することができ
る。

【００２０】次いで、第２段階として、上記相同組換え
体細胞に、希望する構造の遺伝子を挿入した遺伝子ＤＮ
Ａ断片を導入し、ＥＳ細胞ゲノム上の上記相同組換え領
域を、再度導入遺伝子ＤＮＡ断片によって相同的に組換
える。図１（Ｂ）は、このような第２段階相同組換えの
好ましい態様を例示した模式図である。この場合に、第
１段階の相同組換えによって得られた組換え体細胞は、
そのゲノムＤＮＡ内に、ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子を保有する
ため、抗生物質であるガンシクロビル（ＧＡＮＣ）を培
養液に添加すると、ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子の働きによって
ＧＡＮＣを代謝し、ＤＮＡの伸長阻害を来して死滅す
る。一方、導入遺伝子ＤＮＡ断片によって相同組換えが
なされた細胞は、そのゲノム中にＨＳＶ−ｔｋ遺伝子が
もはや存在しないため、ＧＡＮＣの存在下でも生存し、
したがって導入遺伝子による相同置換え体のみが選択さ
れる。なお、図１（Ｂ）に示したように、この第２段階
の相同組換えによって、ｎｅｏ^r遺伝子もＥＳ細胞中か
ら完全に排除される。

【００２１】この第２段階の選択マーカー遺伝子として
は、ＨＳＶ−ｔｋのような薬剤感受性遺伝子の他に、た
とえばＦＡＳ抗原遺伝子のような条件致死遺伝子を用い
ることができる。その場合には、ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子に
対するＧＡＮＣと同様の働きをする抗生物質として、抗
ＦＡＳ抗体を用い、抗ＦＡＳ抗体に対する非感受性細胞
（生存細胞）から相同組換え体を得ることができる。

【００２２】図２は、この発明の標的遺伝子置換法にお
ける別の好ましい態様を例示した模式図である。この場
合には、まず図２（Ａ）に示したように、大腸菌のグア
ニン・キサンチン・ヒポキサンチン・フォスフォリボシ
ル転移酵素（ｇｐｔ）遺伝子をフォスフォグリセロール
遺伝子のプロモーター（ＰＧＫ）に連結し、これを含有
するＤＮＡ配列と、ＥＳ細胞の標的遺伝子領域との間で
相同組換えを行なう。しかもこの場合には、ＥＳ細胞と
してヒポキサンチン・フォスフォリボツル転移酵素（ｈ
ｐｒｔ）欠損株を用いる。

【００２３】すなわち、生物の細胞は幾つかの経路を介
してそのそのＤＮＡを合成しているが、ｈｐｒｔ^-細胞
はそれらのほとんどが機能せず、唯一、イノシン５′−
一リン酸（ＩＭＰ）→キサントシン５′−一リン酸（Ｘ
ＭＰ）→グアノシン５′−一リン酸（ＧＭＰ）→ＤＮＡ
の経路によってのみＤＮＡを合成している。ところが、
マイコフェノリック酸（ＭＰＡ）は、上記経路のＩＭＰ
→ＸＭＰ間を遮断してしまうため、ｈｐｒｔ^-細胞はＭ
ＰＡ存在下ではＤＮＡを合成することができず死滅して
しまう。これに対して、ｇｐｔはキサンチン（Ｘ）から
ＸＭＰへの合成を触媒するため、このｇｐｔ遺伝子を有
するｈｐｒｔ^-ＥＳ細胞は、Ｘ→ＸＭＰ→ＧＭＰ→ＤＮ
Ａの経路が機能し、ＭＰＡ存在下でも生存することがで
きる。従って、図２（Ａ）に示した方法では、ＭＰＡ耐
性細胞を回収することによって、標的遺伝子領域がＰＧ
Ｋ−ｇｐｔを含むＤＮＡ配列に組換えられた細胞を選択
することができる。

【００２４】一方、このようにｇｐｔ遺伝子を有するｈ
ｐｒｔ^-細胞は上記のとおりＸ→ＸＭＰの経路が機能し
ているが、この細胞を抗生物質６−チオグアニン（６−
ＴＧ）存在下で培養すると、Ｘ→ＸＭＰの経路が６−Ｔ
Ｇを取り込み、ＤＮＡの合成阻害を来して死滅してしま
う。そこで、図２（Ｂ）に示したように、上記組換体細
胞のｇｐｔ遺伝子を含む領域を、導入遺伝子ＤＮＡ断片
によって置換え、６−ＴＧに対して非感受性を示す細胞
を回収すれば、相同置換体細胞を容易に選択することが
できる。

【００２５】このような２段階の選択によって得られる
ＥＳ細胞は、目的とする遺伝子（標的遺伝子）が、希望
する構造の遺伝子に完全に置き換えられており、しかも
選択マーカーとして用いた遺伝子（例えば、ｎｅｏ^r遺
伝子とＨＳＶ−ｔｋ遺伝子、またはｇｐｔ遺伝子）もそ
のゲノム中に残存しない。導入遺伝子としては、たとえ
ば標的遺伝子の点突然変異、欠失、アンチセンス、ｃＤ
ＮＡ等の各ＤＮＡ配列、あるいはヒトを含めた異種動物
の相同遺伝子やそれらの各種変異配列など、あらゆる種
類の遺伝子を用いることができる。

【００２６】このようにして、任意の遺伝子を希望する
構造の遺伝子に置換したＥＳ細胞は、常法に従い、胚盤
胞へ注入してキメラ動物へと個体発生させることがで
き、さらにその子孫からトランスジェニック動物を得る
ことができる。さらに、以上で述べたこの発明の標的遺
伝子置換法は、ＥＳ細胞だけではなく、ヒトを含めた哺
乳動物のあらゆる組織細胞に対しても適用することがで
きる。たとえば、何らかかの遺伝子欠損によって正常な
機能を消失している組織の細胞を取り出して、その欠損
遺伝子を正常遺伝子に置換して元の組織に戻せば、その
組織の正常な機能を回復させることができる。このよう
な応用は、現在、たとえばレトロウイルス感染細胞を用
いて行なわれている遺伝子療法の新しい有効な手段とな
る。また、たとえば癌治療等に用いられているいわゆる
ミサイル療法への応用も可能である。

【００２７】以下、実施例を示して、この発明の標的遺
伝子置換法について具体的に説明する。もちろんこの発
明は、以下の例によって限定されるものでないことは言
うまでもない。

【００２８】

【実施例】

実施例１（相同組換え体ＥＳ細胞の作成）ｎｅｏ^r遺伝子とＨＳ
Ｖ−ｔｋ遺伝子とを組込んだ導入遺伝子ＤＮＡ断片によ
ってマウスＥＳ細胞（ＣＣＥまたはＥ１４）のｐ５３遺
伝子を相同組換えした。

【００２９】未分化の培養ＥＳ細胞（８×１０⁷個）
に、電気穿孔法（約５００μＦ）によって導入遺伝子Ｄ
ＮＡ断片を５０μｇ／０. １ｍｌの割合で導入した。そ
の結果、全ＥＳ細胞の約３０％が生存し、遺伝子導入Ｅ
Ｓ細胞が得られた。これらのＥＳ細胞を３０枚のプレー
トに播き、Ｇ４１８を添加して７日間培養し、Ｇ４１８
に耐性を示す５４のコロニーを得た。次いで、これらの
コロニーを個別に分離して、さらに４日間培養の後、Ｄ
ＮＡを抽出し、サザンブロッティングによって相同組換
え体細胞を確認した。

【００３０】図３は、その結果の一例であり、制限酵素
ＨｉｎｄIII 断片のサザンブロット図（Ａ）と、ｐ５３
遺伝子の構造を示した模式図（Ｂ）である。すなわち、
マウスｐ５３遺伝子からは、図３（Ｂ）に示した位置の
３′プローブによって大小２つのＨｉｎｄIII 断片がブ
ロットされる。従って、非相同組換え体の場合には、図
３（Ａ）のクローン１，２，４，６，９等のように大小
２つの明瞭なバンドが得られる。これに対して、その配
列中の３′末端側にＨｉｎｄIII 認識配列を有する導入
遺伝子によって相同組換えを起したｐ５３遺伝子から
は、３′プローブによってさらに小さなＨｉｎｄIII 断
片がブロットされる。そして、そのような相同組換え遺
伝子はＥＳ細胞染色体の２倍体の一方に存在するため、
図３（Ａ）のクローン３，５，７，８，１７のように、
分子量がわずかに異なる２つの小断片のバンドが１／２
量づつ得られる。

【００３１】図４（Ａ）（Ｂ）は、同様にして、ｐ５３
遺伝子のＥｃｏＲＩ断片を５′プローブおよび３′プロ
ーブによってそれぞれブロットした結果と、その遺伝子
構造である。すなわち、ｐ５３遺伝子は、その両端にの
みＥｃｏＲＩ認識配列を有するため、非相同組換え体の
場合には、いずれのプローブによっても単一のバンドと
して検出される。一方、相同組換え体の場合には、導入
遺伝子中にＥｃｏＲＩ配列が存在するため、５′プロー
ブおよび３′プローブの各々によって、大小２つのバン
ドが１／２量づつ得られる。ただし、図４（Ａ）に示し
たように、クローン３２，３５および４２は、５′プロ
ーブによてのみ２つのバンドが検出され、３′プローブ
に対しては単一のバンドしか得られないため、相同組換
え体からは除外した。従って、このＥｃｏＲＩ断片のサ
ザンブロッティングからは、クローン３４，３６，３
７，４３，５１，５３および５４が相同組換え体として
確認され、図３に示した結果と合わせて、合計１２クロ
ーンの相同組換え体細胞が得られた。実施例２（標的遺伝子置換体ＥＳ細胞の作成）実施例１で得た相
同組換え体ＥＳ細胞の組換え遺伝子領域（ｎｅｏ^r遺伝
子とＨＳＶ−ｔｋ遺伝子を組込んだｐ５３遺伝子）を、
ＬａｃＺ遺伝子を組込んだ導入遺伝子ＤＮＡ断片によっ
て置換した。

【００３２】実施例１で得た１２クローンのうちの１つ
のＥＳ細胞：ＰＦＴ２０１（４×１０⁷個）に、電気穿
孔法（約５０μＦ）によって導入遺伝子ＤＮＡ断片を５
０μｇ／０．１ｍｌの割合で導入した。その結果、約３
０％が生存し、遺伝子導入ＥＳ細胞が得られた。これら
の細胞を３０枚のプレートに播き、ＧＡＮＣを添加して
７日間培養し、ＧＡＮＣに対して耐性を示す４８のコロ
ニーを得た。次いで、これらのコロニーを個別に分離し
て、さらに４日間培養の後、ＤＮＡを抽出し、サザンブ
ロッティングによって、１クローンの標的遺伝子置換体
細胞：ＰＦＺ２５２を得た。

【００３３】また、以上の手続きを繰り返し行ったとこ
ろ、再現性よくもう１つのクローンＰＦＺ６３２が得ら
れた。図５（Ａ）は、各々、ＥＳ細胞のｐ５３遺伝子領
域、ＰＦＴ２０１の相同組換え領域、ＰＦＺ２５２およ
びＰＦＺ６３２の相同置換領域から得られたＥｃｏＲＩ
断片のサザンブロット図であり、図５（Ｂ）はそれぞれ
の遺伝子領域の構成を示した模式図である。

【００３４】すなわち、ＥｃｏＲＩ認識部位を有するＰ
ＦＴ２０１、ＰＦＺ２５２・６３２からは５′−プロー
ブおよび３′プローブに対して各々大小２つのバンドが
得られているが、図５（Ｂ）に示したＥｃｏＲＩ部位の
違いによって、ＰＦＺ２５２・６３２の一方のバンドは
ＰＦＴ２０１よりも５′断片が大きく、３′断片が小さ
い。

【００３５】さらに、ＰＦＺ２５２および６３２に対す
る別のサザンブロット分析の結果、これらの標的遺伝子
領域はｎｅｏ^r遺伝子やＨＳＶ−ｔｋ遺伝子をプローブ
とした場合には検出されず、ＬａｃＺ遺伝子をプローブ
とした時にのみ明瞭なバンドとして検出された。以上の
結果は、ＥＳ細胞のｐ５３遺伝子が導入遺伝子によって
完全に置き換えられ、ｎｅｏ^r遺伝子およびＨＳＶ−ｔ
ｋ遺伝子が除去されていることを示すものである。さら
にこれらのクローンは図６に示したように、Ｘ−ｇａｌ
染色によって青く染まることから、ＬａｃＺ遺伝子が正
常に機能してβ−ガラクトシターゼを発現していること
が確認された。実施例３（キメラマウスの作成）実施例２で得た標的遺伝子置換
体ＥＳ細胞ＰＦＺ２５２を、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの
胚盤胞へ常法により注入し、仮親マウスへ移植して個体
へと発生させた。

【００３６】その結果、１５匹（♂１１、♀４）のキメ
ラマウスを得た。次に、これらのキメラマウスの尾部よ
り抽出したＤＮＡをサザンブロット分析し、ｐ５３遺伝
子が目的通りｌａｃＺ遺伝子に置換されている個体を選
別し、このマウスと野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊを交配させ
て初代トランスジェニックマウス（Ｆ₀）を得た。

【００３７】図７（Ａ）は、上記キメラマウスとＣ５７
ＢＬ／６Ｊの子（１５匹）から抽出したＤＮＡのサザン
ブロット分析の結果を示す。この図７から明らかなよう
に、２倍体染色体の一方にｌａｃＺ遺伝子領域が存在す
ることを示す２つのバンドを持ったＤＮＡが、マウスＮ
ｏ．１−３、６、８、１１−１４より得られた。さら
に、これらのＦ₀から上記サザンブロット分析によりト
ランズジェニックマウスであることが確認された個体
（♂、♀）を選び、これらを交配させて、第２代トラン
スジェニックマウス（Ｆ₁）を得た。

【００３８】図８は、上記Ｆ₀（♂、♀）の子（１５
匹）から抽出したＤＮＡのサザンブロット分析の結果を
示す。この図８から明らかなように、トランスジェニッ
クマウス（Ｆ₀）同志の子孫（Ｆ₁）からは、ｌａｃＺ
遺伝子を持たない個体（Ｎｏｓ．１、３、６、７、１
０、１１、１４）、染色体の一方にｌａｃＺ遺伝子を持
つ個体（Ｎｏｓ．２、８、９、１２、１５）、および染
色体の両方にｌａｃＺ遺伝子を持つホモ型個体（Ｎｏ
ｓ．４、５）が得られた。

【００３９】以上の結果から、この発明の方法によっ
て、ｐ５３遺伝子領域がｌａｃＺ遺伝子によって相同的
に置換されたマウスＥＳ細胞が得られ、このＥＳ細胞か
ら染色体の少なくとも一方にｌａｃＺ遺伝子を安定的に
組み込んだトランスジェニックマウスが得られることが
確認された。

【００４０】

【発明の効果】以上詳しく説明した通り、この発明の標
的遺伝子置換法によって、ＥＳ細胞の任意の遺伝子を確
実に、かつ効率よく希望する構造の遺伝子に置き換える
ことが可能となる。この方法によって得られる置換体Ｅ
Ｓ細胞由来のトランスジェニック動物は、あらゆる種類
の遺伝子発現を個体レベルで解析することを可能にす
る。また、この発明の方法を、ヒト等の体細胞に適用す
ることによって、安全で有効な遺伝子療法も可能とな
る。

【図面の簡単な説明】

【図１】（Ａ）（Ｂ）は、各々、この発明の方法におけ
る標的遺伝子相同組換えと、その置換の一例を示した模
式図である。

【図２】（Ａ）（Ｂ）は、各々、この発明の方法におけ
る標的遺伝子相同組換えと、その置換の別の例を示した
模式図である。

【図３】相同組換領域のＨｉｎｄIII 断片に対するサザ
ンブロット図（Ａ）と、この遺伝子領域の構造を示した
模式図である。

【図４】相同組換領域のＥｃｏＲＩ断片に対するサザン
ブロット図（Ａ）と、遺伝子領域の構造模式図である。

【図５】相同組換領域と相同置換領域のＥｃｏＲＩ断片
に対するサザンブロット図（Ａ）と、遺伝子領域の構造
を示した模式図である。

【図６】ｐ５３遺伝子がｌａｃＺ遺伝子によって置換さ
れたＥＳ細胞をＸ−ｇａｌ染色した顕微鏡写図である。

【図７】（Ａ）（Ｂ）は、各々、この発明によって得ら
れたトランスジェニックマウスより抽出したＤＮＡのサ
ザンブロット図である。

【図８】標的遺伝子導入法によるトランスジェニックマ
ウスの作成例を示した模式図である。

【図９】従来の標的遺伝子導入法における相同組換え体
の選択方法を例示した模式図である。

【図１０】従来の標的遺伝子導入法における導入遺伝の
構造と、そのＥＳ細胞内での相同組換えプロセスを例示
した模式図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所 // Ａ６１Ｋ 48/00 (Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 15/00 ＡＣ１２Ｒ 1:19）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ゲノムＤＮＡの任意の遺伝子領域が、２
種類の異なる抗生物質の各々に対して耐性および感受性
を示す１種以上の外来遺伝子を含有するＤＮＡ配列によ
って相同組換えされていることを特徴とする胚幹細胞。
【請求項２】ＤＮＡ配列中の外来遺伝子が、薬剤耐性
遺伝子と、薬剤感受性遺伝子および／または条件致死遺
伝子である請求項１の胚幹細胞。
【請求項３】外来の薬剤耐性遺伝子がＮｅｏ耐性遺伝
子である請求項２の胚幹細胞。
【請求項４】外来の薬剤感受性遺伝子がヘルペス単純
ウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子である請求項２の胚
幹細胞。
【請求項５】外来の条件致死遺伝子がＦＡＳ抗原遺伝
子である請求項２の胚幹細胞。
【請求項６】胚幹細胞がヒポキサンチン・フォスフォ
リボシル転移酵素欠損株であり、ＤＮＡ配列中の外来遺
伝子が大腸菌のグアニン・キサンチン・ヒポキサンチン
フォスフォリボシル転移酵素遺伝子である請求項１の胚
幹細胞。
【請求項７】ゲノムＤＮＡの標的遺伝子領域が、２種
類の異なる抗生物質の各々に対して耐性および感受性を
示す１種以上の外来遺伝子を含有するＤＮＡ配列によっ
て相同組換えされている胚幹細胞に、希望する構造の遺
伝子を組込んだＤＮＡ断片を導入し、上記胚幹細胞ＤＮ
Ａの相同組換え配列領域を導入ＤＮＡ断片によって相同
的に置換することにより、胚幹細胞ゲノムＤＮＡの標的
遺伝子領域を希望する構造の遺伝子に置換することを特
徴とする標的遺伝子置換法。
【請求項８】一方の抗生物質に対する耐性を指標とし
て相同組換体細胞を選択し、他方の抗生物質に対する非
感受性を指標として相同置換体細胞を選択する請求項７
の標的遺伝子置換法。
【請求項９】ＤＮＡ配列中の外来遺伝子が、薬剤耐性
遺伝子と、薬剤感受性遺伝子および／または条件致死遺
伝子である請求項７または８の標的遺伝子置換法。
【請求項１０】外来の薬剤耐性遺伝子が、Ｎｅｏ耐性
遺伝子である請求項９の標的遺伝子置換法。
【請求項１１】外来の薬剤感受性遺伝子がヘルペス単
純ウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子である請求項９の
標的遺伝子置換法。
【請求項１２】外来の条件致死遺伝子がＦＡＳ抗原遺
伝子である請求項９の標的遺伝子置換法。
【請求項１３】胚幹細胞がヒポキサンチン・フォスフ
ォリボシル転移酵素欠損株であり、ＤＮＡ配列中の外来
遺伝子が大腸菌のグアニン・キサンチン・ヒポキサンチ
ン・フォスフォリボシル転移酵素遺伝子である請求項７
または８の標的遺伝子置換法。
【請求項１４】請求項７から１３のいずれかの方法に
よって得られる標的遺伝子置換体胚幹細胞。
【請求項１５】請求項１４の標的遺伝子置換体胚幹細
胞由来のトランスジェニック動物。
【請求項１６】ゲノムＤＮＡの任意の遺伝子領域に突
然変異配列を有する動物細胞において、その動物細胞の
突然変異遺伝子領域を、２種類の異なる抗生物質の各々
に対して耐性および感受性を示す１種以上の外来遺伝子
を含有するＤＮＡ配列によって相同組換えし、突然変異
遺伝子の正常遺伝子を組込んだＤＮＡ断片を上記組換体
細胞に導入し、組換体細胞ＤＮＡの相同組換え配列領域
を導入ＤＮＡ断片によって相同的に置換することによ
り、動物細胞ゲノムＤＮＡの突然変異遺伝子領域を正常
遺伝子に置換することを特徴とする標的遺伝子置換法。
【請求項１７】一方の抗生物質に対する耐性を指標と
して相同組換体細胞を選択し、他方の抗生物質に対する
非感受性を指標として相同置換体細胞を選択する請求項
１６の標的遺伝子置換法。
【請求項１８】ＤＮＡ配列中の外来遺伝子が、薬剤耐
性遺伝子と、薬剤感受性遺伝子および／または条件致死
遺伝子である請求項１６または１７の標的遺伝子置換
法。
【請求項１９】外来の薬剤耐性遺伝子が、Ｎｅｏ耐性
遺伝子である請求項１８の標的遺伝子置換法。
【請求項２０】外来の薬剤感受性遺伝子がヘルペス単
純ウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子である請求項１８
の標的遺伝子置換法。
【請求項２１】外来の条件致死遺伝子がＦＡＳ抗原遺
伝子である請求項１８の標的遺伝子置換法。
【請求項２２】胚幹細胞がヒポキサンチン・フォスフ
ォリボシル転移酵素欠損株であり、ＤＮＡ配列中の外来
遺伝子が大腸菌のグアニン・キサンチン・ヒポキサンチ
ン・フォスフォリボシル転移酵素遺伝子である請求項１
６または１７の標的遺伝子置換法。