WO1998037757A1

WO1998037757A1 - Cellules multipotentes comprenant des genes intrinseques dissocies

Info

Publication number: WO1998037757A1
Application number: PCT/JP1998/000860
Authority: WO
Inventors: Kazuma Tomizuka; Hitoshi Yoshida; Kazunori Hanaoka; Mitsuo Oshimura; Isao Ishida
Original assignee: Kirin Beer Kabushiki Kaisha
Priority date: 1997-02-28
Filing date: 1998-03-02
Publication date: 1998-09-03
Also published as: AU6118998A; EP0972445B1; DE69835145T2; DE69841452D1; EP0972445A4; EP0972445A1; ATE332077T1; EP1707051B1; ATE455179T1; JP4082740B2; EP1707051A3; DE69835145D1; DK0972445T3; EP1707051A2

Description

明細書内因性遺伝子が破壊されている分化多能性保持細胞技術分野

本発明は、キメラ非ヒト動物、その作製法およびその利用法に関する。本発明のキメラ非ヒト動物を用いれば、これまで不可能であった 1Mb (百万塩基対）以上の外来巨大 DNA断片を動物個体で保持発現させることが可能になる。従って、これを利用することにより、

•生物学的に活性な物質をコードする遺伝子の全長、例えば、ヒ卜抗体遺伝子全長を保持し、発現する動物個体の作製が可能になる。この動物から得られる生物学的に活性な物質、例えば、ヒト抗体は医薬品としての利用価値がある。

• ヒト巨大遺伝子（組織適合性抗原、ジス卜ロフィン等）の動物個体における機能解析が可能になる。

- ヒト優性遺伝病及び染色体異常症のモデル動物作製に利用できる。

また、本発明は、内因性遺伝子が破壊されている分化多能性保持細胞およびその使用、ならびにミクロセル法を用いたキメラ動物の作製法および該キメラ動物の使用に関する。破壊された内因性遺伝子と同じまたは相同の遺伝子産物をコードする遺伝子を含む外来染色体またはその断片を受容細胞としての本発明の細胞に移入させて、その細胞から目的とする機能細胞やキメラ非ヒト動物を作製すれば、分化多能性細胞を生殖系列細胞へ分化させなくとも、導入遺伝子を効率良く発現させることが可能になる。これは内因性遺伝子の破壊あるいは導入遺伝子によって、非ヒト動物の生殖細胞に影響を与えるかあるいは生殖細胞への分化を不可能にするような場合にも、分化多能性細胞から目的とする機能細胞ゃ非ヒ卜動物を作製することによって、内因性遺伝子を欠損し内因性遺伝子産物を低減した状態で、これまで不可能であった 1 M b (百万塩基）を超える外来巨大 D N A断片をかかる機能細胞やキメラ非ヒ卜動物の個体、組織または細胞において保持発現させることが可能になる。背景技術

外来遺伝子を動物個体において発現させる技術、すなわちトランスジェニック動物作製技術は、その遺伝子の生体内機能に関する情報を得るために有用なばかりでなく、遺伝子発現を制御する DNA配列の同定（例えば、 Magramら， Nature, 315:338, 1985) 、ヒ卜疾患モデル動物の開発（山村ら，マニュアル疾患モデルマウス，中山書店， 1994) 、さらには家畜の育種（例えば、 Muilerら， Experien tia, 47:923, 1991) 、それを用いた有用物質の生産に利用されてきた（例えば、 Velanderら， P. N. A. S.， 89:12003, 1992) 。遺伝子導入の対象としてはこれまでマウスが最も多く用いられてきた。実験動物として詳細に研究され、胚操作技術も確立されているマウスはこの目的に最も適した哺乳動物であるといえる。マウス個体への外来遺伝子導人法は大きく分けて 2つ知られている。 1っは受精卵前核に DNAを注入する方法（Gordonら， P. N. A. S.， 77:7380, 1980) であり、もう一つは分化全能性を保持した胚幹細胞（以下 ES細胞、という）に DNAを導入し、キメラマウスを作製する方法（Takahashiら， Development, 102:259, 19 88) である。後者の場合、キメラマウスにおいては、 ES細胞の貢献した細胞、組織においてのみ、 ES細胞由来の生殖細胞を経て得られる子孫においてはすべての細胞、組織で導入遺伝子が保持される。これらの技術を利用して現在までに数多くのトランスジヱニックマウスが作製されてきた。

しかし、現状では導入可能な DNAの大きさに限界があり、それがこの技術の利用範囲を大きく制限している。その限界はクローン化可能な DNAの大きさに依存し、これまで最も大きな DNA断片を導入した例の一つは、酵母人工染色体（YAC ) にクローニングされた約 670kbの DNA断片である（Jakobov sら， Nature, 36 2:255, 1993) 。さらに最近になってヒト抗体重鎖遺伝子の可変領域の約 8割及び定常領域の一部（C 、 C (5、 Cァ 2) を含む約 1 Mbの YACの導入も報告された（Mendezら、 Nature Genetics, 15:146， 1997)。これらの実験は、 YACを保持する酵母とマウス ES細胞を融合することにより行なわれた。 YACにおいては、約 2Mbまでの外来 DNAをクローニングできるとされているが（Den Dunnenら， Hum. ol. Genet., 1:19， 1992 ) 、出芽酵母細胞中では、相同 DNA配列同士の組換え頻度が高いことが知られており、反復配列を多く有するヒト DNA断片を完全な形で安定に保持することが困難な場合がある。事実、ヒトゲノム DNAを含む YA Cライブラリーでは、その？り〜^ が何らかの組換えを起こしている（Greenら， Genomics, 11:584, 1991) 。

もう 1つの方法として、ヒト培養細胞から得られる中期染色体を顕微切断し、その断片（10Mb以上と推定される）をマウス受精卵に注入することが試みられた (Richaら， Science, 245:175, 1989) 。この結果得られたマウス個体においてヒト特異的 DNA配列（Alu 配列）が検出されたが、ヒ卜遺伝子発現については確認されていない。また、ここで用いられた染色体調製法では染色体をスライドグラスに固定する際、酢酸メタノールを使用するために、 DNA自体が小さく断片化してしまうことが避けられず、注入した DNAがー続きの DNAとして存在している可能性は低い。

いずれにせよ、現在まで 1Mbを超える一続きの外来 DNA断片をマウス個体へ導入、発現させた例はないといえる。

マウスに導入することが望まれる、有用かつ興味深いヒ卜遺伝子：抗体（例えば、 Cookら， Nature Genetics, 7:162, 1994) 、 T細胞受容体（Hoodら， Cold S pring Harbor Symposia on Quantitative Biology, Vol. LVI 11, 339， 1993 ) 、組織適合性抗原（Carrolら， P. N. A. S.， 84:8535, 1987) 、ジストロフィン（ Den Dunnenら，前記）等は、そのコード領域自体が 1Mbを超える大きさを持つことが知られている。とりわけ、ヒト型抗体の医薬品としての重要性から、ヒトの免疫グロブリン重鎖（〜1.5Mb、 Cookら，前記）、軽鎖/ (〜3Mb、 Zachau, Ge ne， 135:167, 1993)、軽鎖； I (〜1.5Mb、 Frippiatら， Hum. Mol. Genet. , 4:98 3, 1995)の遺伝子全長を保持し、発現するようなマウスの作製が望まれているがそれは現状の技術では不可能である（日経バイオテク， 1993.7.5.) 。

また、ヒ卜の優性遺伝疾患、先天異常を引き起こす染色体異常症（ダウン症等 ) の原因遺伝子の多くはクローン化されておらず、染色体上の大まかな位置情報のみ利用可能である。例えば、中期染色体をギムザ染色することによって得られる Gバンドは、通常数 Mb〜10Mb以上の大きさを有している。従って、ある原因遺伝子が特定の Gバンド上に存在することが明らかとなっても、これらの異常形質をマウスに導入するためには、原因遺伝子周辺の染色体断片（数 Mb以上）を導人することが必要であるが、これも現状の技術では不可能である。

ここに従来技術の限界である 1Mbを超える外来 DNAをマウス個体に導入し、発現させる技術の開発が望まれている。

動物培養細胞においては、従来技術により上述の限界を越える大きさの DNAを導入することが可能である。これは主に、染色体（ヒ卜の場合約 50〜300Mbの大きさを持つ）を媒体として行なわれる。細胞への染色体移入法はいくつか報告されているが（例えば、 McBr i deら， P. N. A. S. , 70： 1258， 1973) 、その中でも望みの染色体を 1本だけ導入する方法として最適と考えられているのがミクロセル法である（Ko iら， Jpn. J. Cancer Res. , 80 : 413, 1989) 。ミクロセルと呼ばれる構造体は 1本〜数本の染色体が核膜、形質膜に包まれたものである。ある種の細胞において紡垂体形成を阻害する薬剤により誘導されるミクロセルを分離し、受容細胞と融合することにより、少数（多くの場合は 1本）の染色体を導入することが可能である。この方法により得られた、ヒト染色体を 1本だけ保持するモノク口モソ一ム雑種細胞のライブラリ一は既知遺伝子のマッビングや、未知の癌抑制遺伝子、細胞老化遺伝子等の存在する染色体を特定するために利用されてきた（例えば、 Saxonら， EMBO J. , 5 : 3461， 1986 ) 。さらに、ミクロセルにガンマ線を照射することにより、染色体を断片化しその一部を導入することも可能である（Ko iら， Sc i ence, 260 : 361, 1993) 。すなわち、ミクロセル法は、 1Mbを超える DNAを動物培養細胞に導入する方法として適していると考えられる。

培養細胞からマウス個体を作り出すことができないかという期待は、分化全能性を安定に保持する ES細胞の発見（Evansら， Nature, 292 : 154, 1981) により確実に現実のものとなった。この ES細胞には外来遺伝子、種々の突然変異、さらには、標的遺伝子組換えによる変異が導入可能となり、マウス個体レベルの遺伝的改変が自在に行なえるようになった（例えば、 Mansou'rら， Nature, 336 : 348, 1988) 。このような ES細胞で、ジーンターゲッティングによって標的遺伝子を破壊したマウスを作製し、目的遺伝子を導入したトランスジエニックマウスとを交配させ、目的遺伝子を効率良く発現するマウスを作製することができる。例えば、マウスの抗体遺伝子を破壊したマウスとヒ卜抗体遺伝子を導入したマウスを交配させ、ヒト抗体遺伝子を効率良く発現させることができる。正常二倍体細胞には対立遺伝子（アレル）が存在する。マウスの片側のアレルの抗体重鎖遺伝子を破壊したトランスジヱニックマウスでは、マウス血清中のヒト抗体濃度が上昇し、さらに交配によって両側のァレルとも破壊したマウスではさらにヒト抗体濃度が顕著に上昇する' （S. D. Wagnerら， Genomi cs, 35 : 405-414, 1996) 。

また片側のアレルの標的遺伝子を破壊した後、選択薬剤を高濃度にし、両側のアレルとも標的遺伝子を欠損させること（ダブルノックアウト）も行われてきたしかし高濃度選択培養法で得られた標的遺伝子欠損細胞は i n v i vo での培養が長期にわたること、薬剤による選択圧がきついことなどの理由から生殖細胞への分化能が低下しているおそれがあった（高津 ·瀧、実験医学別冊バイオマニュアル U Pシリーズ免疫研究の基礎技術、羊土社、 1995) 。あるいは、 2種類の選択薬剤、例えばネオマイシン耐性細胞に対してハイグロマイシンを用いてダブルノックァゥ卜をした場合には、その二重耐性 ES細胞が変異マウスとなる例は少ない（渡部ら、組織培養 21、 42-45 、 1995) 。また、 ES細胞は培養条件によって分化能や増殖能を失うおそれがあり、 2回のジーンターゲッティングではキメラマウスの生殖細胞への分化能を失わないが、第 2段階の相同組換え頻度が極めて低いなどから（勝木ら、実験医学 Vol. 11 No. 20 増刊 1993)、標的遺伝子欠損ホモ接合体を得る場合、とりわけ標的遺伝子が 2つ以上の場合には、それぞれの標的遺伝子をへテロ欠損させたマウスを作製したのち交配して 2つ以上の遺伝子をホモに欠損したマウスを作製することが多かった（N. Longber ら， Nature, 368 : 856-859, 1994)。破壊するべき遺伝子が近接して存在し、交配によって 2つ以上の遺伝子を欠損したマウスが得られない場合には、 ES細胞において、 2つの標的遺伝子をへテロに欠損させたマウスを作製し、交配によってホモ欠損マウスを作製することが行われてきた（J. H. van Reeら， Hum Mo l Gene t 4 : 1403-1409, 1995)。

分化多能性を持つ ES細胞を、 i n V roで機能細胞に分化させることが試みられている（T. Nakano ら， Sc i ence, 265 : 1098-1101, 1994, A. J. Po tocn i k ら， Th e EMBO Journal, 13 : 5274-5283, 1994) 。このような培養システム、例えば成熟 B細胞まで分化を誘導できるシステムは、 B細胞の発生 ·分化過程において機能する未知の増殖 ·分化因子の同定への利用が期待されている。一方、巨大 DNAの導入という意味では前述の YACべクターにクローニング可能な外来 DNA断片の大きさが限界と考えられてきた。その大きさを越える DNAを培養細胞に導入可能な染色体移人という従来技術がマウス個体レベルへの遺伝子導入に利用されたことはなく、またその達成は困難であると考えられてきた（村松ら，トランスジエニックバイオロジー，講談社サイェンティフイク， ρ143- , 198 9) 。

理由としては、以下のようなものが挙げられる。

•受容細胞を正常核型のマウス ES細胞としてこれにヒト染色体導入を行なう場合、それは染色体異常そのものを導入することである。これまで、顕微鏡によつて識別可能な染色体レベルの大きな遺伝子異常はマウスの発生にとって多くの場合致死的であると考えられてきた（Groppら， J.Exp.Zool., 228:253, 1983; 相沢慎一，バイオマニュアルシリーズ 8 ジーンターゲティング，羊土社， 1995)

•我々が得ることのできるヒト染色体は通常、有限増殖の正常繊維芽細胞、あるいは癌細胞等の分化した体細胞のものであり、そのような体細胞由来の染色体が未分化な ES細胞に導入された場合、 ES細胞を分化させたり（Mullerら， Nature ， 311:438, 1984) 、老化させてしまうのではないか（Sugawara, Science, 247 :707, 1990) と考えられた。

•体細胞由来の染色体が初期胚に導入された場合、胚発生過程で生殖細胞由来のそれと同様に正しく機能し、多様な組織、細胞における特異的遺伝子発現を担 'うことができるかという問題についての研究は非常に少ない。この 2者における大きな違いの一つは染色体 DNAのメチル化状態と想像される。これは細胞の分化に伴って変化し、組織特異的な遺伝子発現における重要な役割が示唆されている (Ceder, Cell, 53:3, 1988) 。例えば、抗体遺伝子の活性化に不可欠な部位特異的 DNA組換え反応について、メチル化した基質を B細胞に導入した場合、メチル化の状態は複製後も保持され、組換え反応を阻害するという報告がある（Hsie hら， EMBO J., 11:315, 1992) 。また、株化された細胞中では生体内と比較して、 de novoのメチル化が起こりやすいとされている（Antequeraら， Cell, 62 :503， 1990) 。よってこれまでの研究から、繊維芽細胞や、ヒトーマウス雑種細胞のおそらく高度にメチル化されているであろう抗体遺伝子がマウスの B細胞で正常に発現すると想像することは容易ではなかった。

ここで、関連するものとして I Umenseeらの 2つの報告（P. N. A. S.， 75； 1914, 1978 ; P. N. A. S. , 76'：· 879, 1979 ) に注目しなければならない。 1っはヒト肉腫細胞とマウス EC細胞、もう 1つはラット肝癌細胞とマウス EC細胞の全細胞融合により得られた融合株からキメラマウスを作製したという報告である。これらの報告においてはその実験結果に数多くの疑問点が指摘され、その信憑性は低いと考えられている（野口ら，マウスのテラトーマ，理工学社， 5節， 1987) 。また、 1 日も早い追試が望まれていたにも関わらず、報告から 18年を経た現在までこの実験を再現できたという報告は存在しない。従って、これらの報告によっては

、マウス個体において外来染色体を保持させ、該染色体上の遺伝子を発現させ得たということはできないと考えられてきた。

こうした状況において、染色体断片ほどの巨大 DNAをマウスをはじめとする動物個体に導入し、発現させることは困難とされ、実際この問題について検討がなされたことは上記の 1 1 lmenseeらの報告以来ない。

従って、本発明は、外来染色体またはその断片を保持し、該染色体またはその断片上の遺伝子を発現するキメラ非ヒ卜動物およびその子孫、並びに前記のキメラ非ヒ卜動物の作製法を提供することを目的とする。

また、本発明は、前記のキメラ非ヒト動物およびその子孫に由来する組織および細胞を提供することを目的とする。

さらに、本発明は、前記のキメラ非ヒト動物およびその子孫に由来する細胞とミエローマ細胞との融合により作製されたハイプリドーマを提供することも目的とする。

さらにまた、本発明は、非ヒト動物の個体、組織または細胞を用いて、外来染色体またはその断片上の遺伝子の発現産物である生物学的に活性な物質を製造する方法を提供することを目的とする。

また、本発明は、外来染色体またはその断片を保持し、該染色体またはその断片上の遺伝子を発現するキメラ非ヒ卜動物を作製するにあたって、外来染色体またはその断片を移入させる受容細胞として利用可能な分化多能性を保持する細胞を提供することを目的とする。

また、本発明は、前記の分化多能性を保持する細胞の利用方法を提供することも目的とする。発明の開示

発明者は前記課題を解決するために鋭意研究を行なった結果、ヒト正常繊維芽細胞由来染色体あるいはその部分断片をミクロセル法によりマウス ES細胞に導入し、それを安定に保持する株を得ることに成功した。さらにこの ES細胞株から、その正常組織においてヒト染色体を保持し、ヒト抗体重鎖遺伝子を含む複数のヒ卜遺伝子を発現するキメラマウスを得た。我々はこの一連の方法により、これまで不可能であった巨大 DNA断片の個体における保持、及び該 DNA 断片上の遺伝子の発現を可能にした。さらに、発明者は、抗体重鎖遺伝子および抗体軽鎖遺伝子が共にノックァゥ卜された胚性幹細胞を得ることにも成功した。

本発明の要旨は以下の通りである。

1 . 単一または複数の外来染色体あるいはその断片を含むミクロセルを作製し、該ミクロセルとの融合により、分化多能性を保持する細胞へ前記単一または複数の外来染色体あるいはその断片を移入させることを特徴とする、キメラ非ヒト動物の作製法。

2. 単一または複数の外来染色体あるいはその断片を含むミクロセルを作製し、該ミクロセルとの融合により、分化多能性を保持する細胞へ前記単一または複数の外来染色体あるいはその断片を移入させることを特徴とする、単一または複数の外来染色体あるいはその断片を含む分化多能性を保持する細胞の作製方法。

1 または 2の方法においては、単一または複数の外来染色体あるいはその断片が 6 7 0 k bを越えてもよく、さらに、 1 M b (百万塩基対）以上であつてもよい。外来染色体あるいはその断片は抗体をコードする領域を含むものであってもよい。単一または複数の外来染色体あるいはその断片を含むミクロセルは、単一または複数の外来染色体あるいはその断片を含む細胞とミクロセル形成能の高い細胞とを融合させて作製されたハイプリッド細胞から誘導されたものであってもよい。さらに、単一または複数の外来染色体あるいはその断片を含むミクロセルは、前記ハイブリツド細胞から誘導されたミクロセルをさらにミクロセル形成能の高い細胞と融合させて作製された細胞から誘導されたものであってもよい。単一または複数の外来染色体あるいはその断片を含む細胞はヒト正常 2倍体細胞であってもよい。ミグロセル形成能の高い細胞はマウス A 9細胞であってもよい。分化多能性を保持する細胞は、胚性癌腫細胞、胚性幹細胞、胚性生殖細胞およびそれらの変異体から成る群より選択することができる。外来染色体あるいはその断片が目的の遺伝子を含むものであり、分化多能性を保持する細胞がその外来染色体あるいはその断片上の該目的の遺伝子と同じあるいは相同の内因性遺伝子が破壊されているとよい。外来染色体あるいはその断片が少なくとも 2種の目的の遺伝子を含むものであり、分化多能性を保持する細胞がその外来染色体あるいはその断片上の該目的の遺伝子と同じあるいは相同の内因性遺伝子が破壊されていてもよい。分化多能性を保持する細胞において、前記目的の遺伝子と同じあるいは相同の内因性遺伝子の両側または片側の対立遺伝子が破壊されているとよい。目的の遺伝子は抗体遺伝子であつてもよい。抗体遺伝子は抗体重鎖遺伝子および抗体軽鎖遺伝子であってもよい。 1および 2の方法においては、外来染色体あるいはその断片が目的の遺伝子を含むものであり、その外来染色体あるいはその断片上の前記目的の遺伝子と同じあるいは相同の内因性遺伝子が破壊されている分化多能性を保持する細胞に、該目的の遺伝子を含む外来染色体あるいはその断片を移人した後、該細胞と前記目的の遺伝子と同じあるいは相同の内因性遺伝子が欠損している系統の非ヒト動物の胚とのキメラを作製してもよい。前記目的の遺伝子と同じあるいは相同の内因性遺伝子が欠損している系統の非ヒト動物が標的遺伝子相同組み換え法により作製することができる。キメラ非ヒト動物は、単一または複数の外来染色体あるいはその断片を保持し、該外来染色体あるいはその断片上の遺伝子を発現し、該外来染色体あるいはその断片を子孫に伝達可能なものであるとよい。キメラ非ヒト動物は、好ましくは哺乳動物であり、より好ましくはマウスである。

3 . 単一または複数の外来染色体あるいはその断片を含む分化多能性を保持する細胞。

単一または複数の外来染色体あるいはその断片は 6 7 0 k bを越えてもよい。 3の細胞においては、外来染色体あるいはその断片が目的の遺伝子を含むものであり、分化多能性を保持する細胞においてはその外来染色体あるいはその断片上の該目的の遺伝子と同じあるいは相同の内因性遺伝子が破壊されていてもよい。また、外来染色体あ'るいはその断片が少なくとも 2種の目的の遺伝子を含むものであり、分化多能性を保持する細胞においてはその外来染色体あるいはその断片上の該目的の遺伝子と同じあるいは相同の内因性遺伝子が破壊されていてもよい。さらに、分化多能性を保持する細胞において、前記目的の遺伝子と同じあるいは相同の内因性遺伝子の両側または片側の対立遺伝子が破壊されているとよい。外来染色体あるいはその断片は抗体遺伝子を含んでもよい。抗体遺伝子は抗体重鎖遺伝子および抗体軽鎖遺伝子であつてもよい。分化多能性を保持する細胞は、胚性癌腫細胞、胚性幹細胞、胚性生殖細胞およびそれらの変異体から成る群より選択することができる。 3の細胞は、キメラ非ヒト動物を作製するために使用することができる。

4 . 単一または複数の外来染色体あるいはその断片を保持し、該外来染色体あるいはその断片上の遺伝子を発現するキメラ非ヒト動物、または、前記の単一もしくは複数の外来染色体あるいはその断片を保持し、該外来染色体あるいはその断片上の遺伝子を発現するその子孫。

単一または複数の外来染色体あるいはその断片は 6 7 O k bを越えてもよい。外来染色体あるいはその断片が目的の遺伝子を含むものであり、該目的の遺伝子と同じあるいは相同の内因性遺伝子が破壊されていてもよい。外来染色体あるいはその断片が少なくとも 2種の目的の遺伝子を含むものであり、該目的の遺伝子と同じあるいは相同の内因性遺伝子が破壊されていてもよい。前記目的の遺伝子と同じあるいは相同の内因性遺伝子の両側または片側の対立遺伝子が破壊されていてもよい。前記目的の遺伝子は抗体遺伝子であってもよい。抗体遺伝子は抗体重鎖遺伝子および抗体軽鎖遺伝子であつてもよい。

5 . 4のキメラ非ヒト動物またはその子孫の交配により得られる単一または複数の外来染色体あるいはその断片を保持し、該外来染色体あるいはその断片上の遺伝子を発現する非ヒト動物、または、単一もしくは複数の外来染色体あるいはその断片を保持し、該外来染色体あるいはその断片上の遺伝子を発現するその子孫 6 . 単一または複数の外来染色体あるいはその断片を保持し、該外来染色体あるいはその断片上の遺伝子を発現する 4のキメラ非ヒト動物もしくはその子孫または 5の非ヒト動物もしくはその子孫を、該遺伝子と同じあるいは相同の遺伝子が欠損している系統の非ヒ卜動物と交配させることにより作製された非ヒト動物、または、前記の単一もしくは複数の外来染色体あるいはその断片を保持し、該外来染色体あるいはその断片上の遺伝子を発現するその子孫。

7 . 4のキメラ非ヒト動物もしくはその子孫、 5の非ヒト動物もしくはその子孫、または 6の非ヒト動物もしくはその子孫に由来する組織。

8 . 4のキメラ非ヒト動物もしくはその子孫、 5の非ヒ卜動物もしくはその子孫、または 6の非ヒト動物もしくはその子孫に由来する細胞。

細胞は、 B細胞であってもよいし、動物の組織由来の初代培養細胞あるいは株化細胞との融合細胞であってもよい。

9 . 上記の B細胞とミエローマ細胞との融合により作製されたハイプリドーマ。

10. 4のキメラ非ヒト動物もしくはその子孫、 5の非ヒト動物もしくはその子孫、または 6の非ヒ卜動物もしくはその子孫の個体、組織または細胞において、単一または複数の外来染色体あるいはその断片上の遺伝子を発現させ、その産物としての生物学的に活性な物質を回収することを特徴とする、生物学的に活性な物質の製造法。

キメラ非ヒト動物の細胞は B細胞であってもよい。 B細胞はミエローマ細胞と融合して、不死化されていてもよい。また、キメラ非ヒ卜動物の細胞は、動物の組織由来の初代培養細胞あるいは株化細胞との融合細胞であってもよい。生物学的に活性な物質は抗体であってもよい。抗体は、好ましくは哺乳動物の抗体であり、より好ましくはヒト抗体である。

1 1. 10の方法により製造できる生物学的に活性な物質。

12. 6 7 0 k bを越えるヒト抗体遺伝子の少なくとも一つを保持し、発現する非ヒ卜動物。

12の非ヒ卜動物は、 1 M b以上のヒト抗体遺伝子の少なくとも一つを保持し、発現するとよい。ヒト抗体遺伝子は、ヒト重鎖遺伝子、ヒト軽鎖/ c遺伝子、ヒト軽鎖 l遺伝子またはそれらの組み合わせであってもよい。さらに、 12の非ヒ卜動物においては、そのヒト抗体遺伝子と同じあるいは相同の非ヒ卜動物抗体遺伝子が欠損しているとよい。そのヒト抗体遺伝子と同じあるいは相同の非ヒト動物抗体遺伝子の欠損は、 '遺伝子相同組換えによる該非ヒト動物抗体遺伝子の破壊によるものであってもよい。

13. 12の非ヒト動物の脾臓細胞とミエローマ細胞との融合により得られるハイブリドーマ。

14. 13のハイプリドーマにより産生される抗体。

15. ヒト抗体の少なくとも一つのクラスまたはサブクラスを発現する非ヒ卜動物 c 15の非ヒト動物においては、発現するヒト抗体のクラスまたはサブクラスの遺伝子と同じあるいは相同の内因性遺伝子が欠損していてもよい。ヒト抗体のクラスまたはサブクラスは、 I g M、 I g G、 I g E、 I g A、 I g Dおよびそれらのサブクラス、またはそれらの組み合わせであってもよい。

16. 6 7 0 k bを越える単一または複数の外来 D N Aを保持し、該外来 D N A上の遺伝子を発現する非ヒ卜動物。

16の非ヒト動物においては、発現する外来 D N A上の遺伝子と同じあるいは相同の内因性遺伝子が欠損していてもよい。 16の非ヒト動物は、 1 M b以上の単一または複数の外来 D N Aを保持し、該外来 D N A上の遺伝子を発現してもよい。発現する外来 D N A上の遺伝子と同じあるいは相同の内因性遺伝子は欠損していてもよい。

17. 単一または複数の外来染色体あるいはその断片を含むミクロセルを作製し、該ミクロセルとの融合により、前記単一または複数の外来染色体あるいはその断片を胚盤胞に由来する培養細胞へ移入し、該細胞の核を除核した未受精卵に移植することを特徴とする、トランスジヱニック非ヒ卜動物の作製法。

18. 少なくとも 2種の内因性遺伝子が破壊されている分化多能性を保持する細胞 _c 18の細胞においては、少なくとも 2種の内因性遺伝子の両側または片側の対立遺伝子が破壊されていてもよい。破壊されている内因性遺伝子は抗体遺伝子であつてもよい。破壊されている抗体遺伝子は抗体重鎖遺伝子および抗体軽鎖遺伝子であってもよい。分化多能性を保持する細胞は、胚性癌腫細胞、胚性幹細胞、胚性生殖細胞およびそれらの変異体から成る群より選択することができる。

19. 少なくとも 2回の相同組換えにより、 18の細胞を作製する方法。

19の方法においては、薬剤耐性マーカ一遺伝子を用いる相同組換えにより分化多能性を保持する細胞の内因性遺伝子の片側の対立遺伝子を破壊し、該細胞を該薬剤の存在下で培養し、薬剤耐性となった株を選択し、これらの株をスクリ一二ングすることにより内因性遺伝子の両側の対立遺伝子が破壊された株を得る工程を含んでもよい。薬剤耐性マーカー遺伝子を用いる相同組換えにより分化多能性を保持する細胞の内因性遺伝子の片側の対立遺伝子を破壊し、さらに内因性遺伝子の他方の側の対立遺伝子も薬剤耐性マーカー遺伝子を用いる相同組換えにより破壊してもよい。内因性遺伝子の片側の対立遺伝子を破壊するための相同組換えに用いる薬剤耐性マーカー遺伝子が、他方の側の対立遺伝子を破壊するための相同組換えに用いる薬剤耐性マーカー遺伝子と同じ種類であってもよい。内因性遺伝子の片側の対立遺伝子を破壊するための相同組換えに用いる薬剤耐性マーカー遺伝子が、他方の側の対立遺伝子を破壊するための相同組換えに用いる薬剤耐性マーカー遺伝子と異なる種類であってもよい。

また、本発明は、単一または複数の外来遺伝子あるいはその断片ないしは単一または複数の外来染色体あるいはその断片を移入させる受容細胞としての、前記の分化多能性を保持する細胞の利用方法を提供する。単一または複数の外来遺伝子あるいはその断片は、プラスミド、コスミド、 Y A C等のベクタ一に組み込まれていてもよく、単一または複数の外来染色体あるいはその断片はミクロセルに含まれていてもよい。移入させる単一または複数の外来染色体あるいはその断片は、分化多能性を保持する細胞において破壊されている内因性遺伝子と同じまたは相同の遺伝子を含むものであるとよいが、特に限定されるものではない。本明細書において、「相同の遺伝子」とは、生物種間または種内において、同種または近似の性質を持つタンパク質をコードする遺伝子をいうものとする。

さらに、本発明は、キメラ非ヒト動物を作製するための、前記の分化多能性を保持する細胞の利用方法を提供する。

さらにまた、本発明は、単一または複数の外来染色体あるいはその断片を含むミクロセルを作製し、該ミクロセルとの融合により、前記の少なくとも 2種の内因性遺伝子が破壊されている分化多能性を保持する細胞へ前記単一または複数の外来染色体あるいはその断片を移入させることを特徴とする、単一または複数の外来染色体あるいはその断片を含む分化多能性を保持する細胞の作製方法、および単一または複数の外来染色体あるいはその断片を含むミクロセルを作製し、該ミクロセルとの融合により、前記の少なくとも 2種の内因性遺伝子が破壊されている分化多能性を保持する細胞へ前記単一または複数の外来染色体あるいはその断片を移入させることを特徴とする、キメラ非ヒ卜動物の作製法を提供する。単一または複数の外来染色体あるいはその断片は 1 M b (百万塩基）を超える大きさを有するものであってもよい。外来染色体あるいはその断片は抗体をコードする領域を含むものであってもよい。単一または複数の外来染色体あるいはその断片を含むミクロセルは、単一または複数の外来染色体あるいはその断片を含む細胞とミクロセル形成能の高い細胞とを融合させて作製されたハイプリッド細胞から誘導されてもよい。また、単一または複数の外来染色体あるいはその断片を含むミクロセルは、前記ハイプリッド細胞から誘導されたミクロセルをさらにミクロセル形成能の高い細胞と融合させて作製された細胞から誘導されたものであつてもよい。単一または複数の外来染色体あるいはその断片を含む細胞はヒ卜正常 2倍体細胞であってもよい。ミクロセル形成能の高い細胞はマウス A 9細胞であつてもよい。上記のキメラ非ヒト動物の作製法においては、少なくとも 2種の内因性遺伝子が破壊されている分化多能性を保持する細胞に、該細胞において破壊されている内因性遺伝子と同じあるいは相同の遺伝子を含む外来染色体あるいはその断片を移入した後、該細胞と前記内因性遺伝子と同じあるいは相同の遺伝子が欠損している系統の非ヒト動物の胚とのキメラを作製してもよい。少なくとも 2種の内因性遺伝子が破壊されている分化多能性を保持する細胞において破壊されている内因性遺伝子と同じあるいは相同の遺伝子が欠損している系統の非ヒト動物は、標的遺伝子相同組み換え法により作製されたものであってもよい。キメラ非ヒト動物は、単一または複数の外来染色体あるいはその断片を保持し、該外来染色体あるいはその断片上の遺伝子を発現し、該外来染色体あるいはその断片を子孫に伝達可能なものであるとよい。キメラ非ヒト動物は哺乳動物であるとよく、より好ましくは、マウスである。また、本発明は、単一または複数の外来染色体あるいはその断片を含むミクロセルを作製し、該ミクロセルとの融合により、前記の少なくとも 2種の内因性遺伝子が破壊されている分化多能性を保持する細胞へ前記単一または複数の外来染色体あるいはその断片を移人させることを特徴とする、キメラ非ヒト動物の作製法により作製することができ、単一または複数の外来染色体あるいはその断片を含む分化多能性を保持する細胞を提供する。本発明は、さらに、キメラ非ヒ卜動物を作製するための上記細胞の利用方法も提供する。

本発明は、上記のキメラ非ヒト動物の作製法により作製することができ、単一または複数の外来染色体あるいはその断片を保持し、該外来染色体あるいはその断片上の遺伝子を発現するキメラ非ヒト動物、または、前記の単一もしくは複数の外来染色体あるいはその断片を保持し、該外来染色体あるいはその断片上の遺伝子を発現するその子孫を提供する。また、本発明は、上記のキメラ非ヒ卜動物またはその子孫の交配により得られる単一または複数の外来染色体あるいはその断片を保持し、該外来染色体あるいはその断片上の遺伝子を発現する非ヒ卜動物、または、単一もしくは複数の外来染色体あるいはその断片を保持し、該外来染色体あるいはその断片上の遺伝子を発現するその子孫を提供する。さらに、本発明は、上記のキメラ非ヒ卜動物もしくはその子孫または非ヒ卜動物もしくはその子孫に由来する組織および細胞を提供する。この細胞は B細胞であってもよい。また、本発明は、上記のキメラ非ヒト動物もしくはその子孫または非ヒト動物もしくはその子孫に由来する細胞とミエローマ細胞との融合により作製されたハイブリドーマを提供する。

本発明は、単一または複数の外来染色体あるいはその断片を保持し、該外来染色体あるいはその断片上の遺伝子を発現する上記のキメラ非ヒ卜動物もしくはその子孫または上記の非ヒ卜動物もしくはその子孫を、該遺伝子と同じあるいは相同の遺伝子が欠損している系統の非ヒ卜動物と交配させることにより作製された非ヒト動物、または、前記の単一もしくは複数の外来染色体あるいはその断片を保持し、該外来染色体あるいはその断片上の遺伝子を発現するその子孫を提供する。さらに、本発明は、上記のキメラ非ヒ卜動物もしくはその子孫または非ヒト動物もしくはその子孫の個体、組織または細胞において、単一または複数の外来染色体あるいはその断片上の遺伝子を発現させ、その産物としての生物学的に活性な物質を回収するこ.とを特徴とする、生物学的に活性な物質の製造法を提供する。上記のキヌラ非ヒト動物もしくはその子孫または非ヒト動物もしくはその子孫の細胞は B細胞であってもよい。 B細胞はミエローマ細胞と融合して、不死化されていてもよい。生物学的に活性な物質は抗体であってもよく、抗体は哺乳動物の抗体であるとよく、より好ましくは、ヒト抗体である。

さらにまた、本発明は、上記の単一または複数の外来染色体あるいはその断片を保持し、該外来染色体あるいはその断片上の遺伝子を発現するキメラ非ヒト動物もしくはその子孫または非ヒ卜動物もしくはその子孫を、該遺伝子と同じあるいは相同の遺伝子が欠損している系統の非ヒ卜動物と交配させ、誕生した子動物の個体、組織または細胞において、前記の単一または複数の外来染色体あるいはその断片上の遺伝子を発現させ、その産物としての生物学的に活性な物質を回収することを特徴とする、生物学的に活性な物質の製造法を提供する。

本発明はまた、外来染色体からなる非ヒト動物及び非ヒト動物細胞への遺伝子導入用ベクターを提供する。外来染色体は、好ましくはヒトに由来するものであり、より好ましくはヒト 1 4番染色体断片である。非ヒ卜動物は、好ましくはマゥスである。

本明細書においては、対立遺伝子（al l el e) を以下「アレル」ということとする。

また、本明細書において、「相同の遺伝子」とは、生物種間または種内において、同種または近似の性質を持つタンパク質をコ一ドする遺伝子をいうものとする図面の簡単な説明

図 1は、ヒト 2番染色体（断片）を保持する A9細胞の解析（PCR解析）の結果が示されている。

図 2は、 E14耐性株においてヒト 22番染色体（断片）が保持されていることがる（PCR解析）。

図 3は、 22番染色体導入 ES細胞由来キメラマウスにおいてヒト L1配列が保持されていることを示す電気泳動写真である（サザン解析）。

図 4は、ヒト 22番染色体導入キメラ'マウス臓器におけるヒ卜染色体の保持の様子を示す電気泳動写真である（PCR解析）。

図 5は、ヒト 22番染色体導入キメラマウスにおけるヒト遺伝子発現（RT- PCR) の結果を示す電気泳動写真である。

図 6は、ヒ卜 22番染色体導入キメラマウス臓器におけるヒト遺伝子発現（RT - P CR) の結果を示す電気泳動写真である。

図 7は、 E14耐性株においてヒ卜 4番染色体（断片）が保持されていることが示されている（PCR解析）。

図 8は、ヒ卜 4番染色体導入 E14細胞株におけるヒト L1配列の検出（サザン解析）の結果を示す電気泳動写真である。

図 9は、ヒト 4番染色体導入 ES細胞由来キメラマウスにおいてヒ卜 L1配列が保持されていることを示す電気泳動写真である（サザン解析）。

図 10は、 TT2耐性株においてヒ卜 14番染色体（断片）が保持されていることが示されている（PCR解析）。

図 11は、ヒト 14番染色体導入 ES細胞由来キメラマウス臓器におけるヒト染色体の保持の様子を示す電気泳動写真である（PCR解析）。

図 12は、尻尾由来繊維芽細胞 G418耐性テス卜の結果が示されている。

図 13は、ヒト血清アルブミン免疫キメラマウス血清中のヒ卜抗体 I gM濃度（EL I SA) が示されている。

図 14は、ヒト血清アルブミン免疫キメラマウス血清中のヒ卜抗体 I gG濃度（EL I SA) が示されている。

図 15は、ヒト I gM産生ハイプリドーマクローン H4B7の解析（EL ISA) の結果が示されている。

図 16は、ヒ卜 2番染色体部分断片及び 14番染色体部分断片を保持するマウス ES 細胞株（TT2細胞株 PG15) の FI SH解析の結果を示す染色体の形態の写真である。図 17は、ヒト血清アルブミン免疫キメラマウス血清中の抗ヒト血清アルブミンヒト i gG抗体価の増加が示されている。

図 18は、ヒ卜血清アルブミン免疫キメラマウス血清中の抗ヒ卜血清アルブミンヒト I g / 抗体価の増加が示されている。

図 19は、ヒト 22番染色体導入 TT2細胞株におけるヒト L1配列の検出（サザン解析）の結果を示す電気泳動写真である。

図 20は、ヒ卜血清アルブミン免疫キメラマウス血清中の抗ヒ卜血清アルブミンヒト i g A抗体価の増加が示されている。

図 21は、ヒト 2番染色体部分断片導入キメラマウスの子孫においてヒ卜 2番染色体部分断片が保持されていることが示されている写真である（PCR解析）。図 22は、ヒト 14番染色体導人キメラマウス脾臓において細胞表面にヒト鎖力く発現している細胞の存在を示している（フローサイトメトリ一解析）。

図 23は、 pLoxP- STneo プラスミド DNA の構造を示している。

図 24は、マウス抗体重鎖 C zのゲノム DNAの構造を示している。

図 25は、マウス抗体軽鎖/ のゲノム DNAの構造を示している。

図 26は、マウス抗体重鎖 C ターゲッティングベクターと形質転換体 TT2F細胞ゲノム DNA のサザンブロッ卜に使用するプローブと相同組換え体で検出される DN A断片について示している。

図 27は、マウス抗体軽鎖ターゲッティングベクタ一と形質転換体 TT2F細胞ゲノム DNA のサザンブロッ卜に使用するプローブと相同組換え体で検出される DNA 断片について示している。

図 28は、マウス抗体重鎖相同組換え体及び相同組換え体由来高濃度 G418耐性株のサザン解析の結果を示す電気泳動写真である。

図 29は、マウス抗体軽鎖相同組換え体のサザン解析の結果を示す電気泳動写真 C、あ <o。

図 30は、 pLoxP- PGKPuro プラスミド DNA の構造を示している。

図 31は、マウス抗体軽鎖/ cターゲッティングベクタ一と形質転換体 TT2F細胞ゲノム DNA のサザンブロッ卜に使用するプローブと相同組換え体で検出されるべき

DNA断片について示している。

図 32は、マウス抗体軽鎖相同組換え体由来高濃度 G418耐性株のサザン解析の結果を示す電気泳動写真である。

図 33は、 HSA免疫キメラマウス血清中の抗 HSAヒト I gH抗体価の増加を示している。

図 34は、ヒト 14番染色体断片及び、ヒト 2番染色体断片を保持する抗体重鎖、抗体軽鎖欠損マウス ES細胞の F ISH解析の結果を示す写真である。

図 35は、 HSA免疫キメラマウス血清中の抗 HSAヒ卜 i g抗体価の増加を示している。

図 36は、ヒト 14番染色体断片を含むマウス A9細胞の F I SH解析（ヒトセントロメァ配列プローブ）の結果を示す写真である。

図 37は、ヒト 14番染色体断片を含むマウス A9細胞の F I SH解析（ヒト染色体特異的プローブ）の結果を示す写真である。

図 38は、ヒト染色体断片（14番： SC20、 2番： W23)のマウス ES細胞における安定性テス卜の結果を示している。

図 39は、ヒト 14番染色体断片のマウス個体における安定性解析の結果を示している。

図 40は、ヒト 22番染色体（断片）を保持する G418耐性雑種細胞の PCR解析の結果を示している。

図 41は、断片化ヒト 22番染色体を保持する A9細胞の F I SH解析の結果を示す写真である。

図 42は、交配により確立された完全なヒト抗体を産生するマウス系統の解析結果を示している。

図 43は、ヒト 2番染色体断片 W23を保持するマウス血清中のヒ卜抗体/ c鎖濃度測定の結果を示している。

図 44は、血清マウス / c鎖、 λ鎖濃度測定の結果を示している。

図 45は、 pBS-TEL/L IFPuro の構造を示す。

図 46は、 DT40細胞株におけるヒ卜 22番染色体の保持を示す。

図 47は、 L I F遺伝子座における相同組み換え体の同定を示す。

図 48は、 DT40/ii22neo細胞株におけるヒト 22番染色体の断片化を示す。

図 49は、全長及び断片化ヒト 22番染色体を保有する DT40細胞株を示す写真である' 発明を実施するための最良の形態

ヒ卜染色体またはその断片を保持し、該染色体またはその断片上の遺伝子を発現するマウス個体は、

( 1) 標識されたヒト染色体またはその断片を保持する染色体供与細胞の作製

(2) 分化多能性を保持するマウス細胞へのミクロセル法によるヒ卜染色体またはその断片の移入

(3) 上記マウス細胞を用いたキメラマウスの作製

(4) キメラマウスにおけるヒト染色体保持及び、ヒト遺伝子発現確認

の過程を経ることにより得ることができる。なお、ここでは、ヒト染色体またはその断片を保持し、該染色体またはその断片上の遺伝子を発現する非ヒト動物として、マウスを例にとった（以下、このマウスを「ヒト染色体導入マウス」と称する。）。

ここでヒト染色体とは、ヒト細胞由来の天然の DNAと蛋白質の複合体のことを指す。正常なヒト染色体は 23種（雄は 24種） 46本存在し、それぞれ約 50〜300Mb の長さの DNAを含むとされるが、本発明においては独立染色体として安定に複製、分配が可能な部分断片、およびマウス染色体上に転座し、安定に保持されている部分断片も含まれる。その DNAの大きさは通常 1Mb以上だが、それ以下の場合もある。本発明の特徴は大腸菌、酵母等でのクローニングあるいは細胞からの DN A抽出処理等を行なわず、染色体そのものを媒体としてマウス個体でヒト遺伝子を保持、発現させることにある。

また、ヒ卜染色体導入マウスとは、その正常体細胞の全てまたは一部において、単一あるいは複数のヒト染色体あるいはその断片を保持するものを指す。さらには、その正常体細胞の全てまたは一部において、ヒト染色体上の単一あるいは複数のヒト遺伝子を発現しているものを指す。

(1) 標識されたヒト染色体またはその断片を保持する染色体供与細胞の作製染色体供与細胞としては、 1) 受容細胞で選別可能なマーカーで標識されたヒト染色体を保持し、 2) それ以外のヒ卜染色体を含まない、 3 ) ミクロセル形成能が高い細胞、が望ましい。

ヒ卜染色体提供の材料としては、ヒト由来のあらゆる細胞株、癌細胞、初代培養細胞を用いることが出来るが、染色体の欠失、増幅等の異常の可能性が低く、また培養が容易な点.を考慮すると正常繊維芽細胞が適している。

まず 1) について、ヒト細胞は薬剤（G418, ピューロマイシン，ノヽィグロマイシン，ブラストサイジン）耐性等のマーカー遺伝子を発現するべクタ一により形質転換することができる。ここで用いるマーカー発現制御のためのプロモーダ一としては、ヒト細胞のみならず、マウス ES細胞のような受容細胞で効率よく働くものが望ましい。この目的には SV40ェンハンサ一と単純へルぺスウィルスチミジンキナーゼプロモーターの連結したもの（Katohら， Cell Struct. Funct. , 12:5 75, 1987) 、マウス PGK- 1プロモータ一（Sorianoら， Cell, 64:693, 1991) 等を用いることが出来る。エレクトロボレ一シヨン（石田ら，細胞工学実験操作入門，講談社， 1992) 等による形質転換を実施し、選択することにより、導入されたマーカー遺伝子が、 23種 46本あるヒ卜染色体上にランダムに挿入されたようなヒト細胞形質転換体のライブラリーを得ることが出来る。

3) については、多くのヒト正常細胞がミクロセル形成能が非常に低いので、上記の形質転換体をミクロセル形成能の高い細胞例えば、マウス A9細胞（Oshimu ra, M. , Environ. Health Perspect. , 93:57, 1991) と全細胞融合することにより、形成能を付与することが出来る。マウスーヒト雑種細胞では、ヒ卜染色体が選択的に消失することが知られているが、ここで得られた融合株は、先述のマーカ —で選択することにより、マ一キングされたヒト染色体を安定に保持することが出米る。

さらに、 2) の条件を満たすために、この細胞融合株からミクロセルを取得し

、マウス A9細胞と再度融合することが望ましい。この場合も、ヒト染色体上のマ

—カーで選択することにより、得られるミクロセル融合株の多くは、 1) 、 2)

、 3) の条件を満たしたものであると考えられる。マーキングされたヒ卜染色体の同定は、最終段階で得られるマウス—ヒトモノクロモソ一ム雑種細胞において

、 PCR (ポリメラーゼチヱインリアクション、 Saikiら， Science, 239:487, 19

88) 、サケンブロット解析 (Ausubelら， Current protocols in molecular bio

2 l l ogy, John W i l ey Sons, I nc. , 1994) 、 F I SH (フルォレツセンスインサイチュ一ハイブリダィゼーシヨン、 Lawrenceら， Ce l l , 52 : 51, 1988) 解析等により調べることが出来る。ある特定の染色体導入を望む場合には、多くのヒト細胞形質転換体クローンに—ついて、それぞれ上記の過程を繰り返して、目的染色体がマ一キングされたものを探す。あるいは、ヒト細胞形質転換体クローンの混合物について上記の過程を実施し、得られる多数のマウスーヒ卜モノクロモソ一厶雑種細胞についてヒト染色体の同定を行なうことが可能である。

さらに、導入を望む染色体上の DNA配列を標的とした相同組換え（Thomas ら， Ce l l , 51 : 503, 1987) により、特定の部位にマ一力一遺伝子を揷入することも可能である。

マウスーヒト雑種細胞から調製したミクロセルにガンマ線照射することにより、マ一キングされたヒト染色体を断片化してマウス A9細胞に導入することも出来る。また、ミクロセルにガンマ線照射しない場合でも、ある割合で部分断片化したヒト染色体が移人されることがある。これらの場合、得られるミクロセル融合株は、マ一キングされたヒト染色体の部分断片を保持している。これらは、受容細胞に染色体部分断片を導入したい場合に用いることができる。

E S細胞に導入されるヒト染色体には欠失、転座、置換等の改変を施しうる。これらは具体的には以下の方法で達成される。

1 ) 上記に既述のマウスーヒト雑種細胞の作製、マウス—ヒト雑種細胞からのミクロセル誘導、該ミクロセルとマウス A 9細胞の再融合、該再融合細胞からのミクロセル誘導、該ミクロセルとマウス E S細胞の融合の各過程において、ヒ卜染色体の欠失、転座が起こる場合がある。これらの変異染色体を保持する細胞を、染色体の顕微鏡観察、 P C R、サザン解析等により適宜選抜する。種々のヒト染色体を保持するマウス A 9細胞ライブラリから所望の変異染色体を保持するクローンを選抜することも可能であり、特定のヒト染色体を保持するマウス A 9細胞からミクロセルを誘導し、 A 9細胞あるいは E S細胞に融合したもののなかから所望の変異染色体を保持するクローンを選抜することも可能である。また、染色体の断片化はガンマ線照射によりその発生頻度をあげることができる（Ko iら、 Sc i ence, 260 : 361 , 1993) 。 2 ) ヒト染色体を保持する細胞において、 C r e酵素の認識配列である 1 0 X p 配列を保持するターゲティングベクターを構築し、相同組換えにより染色体上の所望の位置に 1 0 X p配列の挿入されたクローンを取得の後、 C r e酵素を細胞内で発現させること.により、部位特異的組換えにより染色体の欠失 ·転座等の変異体を得る。 W097/49804および Smithら、 Nature Genetics, 9:376, 1995を参照のこと。また、ターゲティングベクタ一の導入に際しての宿主細胞として、 D T 4 0細胞（Diekenら、 Nature Genetics, 12:174, 1996 ) のような相同組換え頻度の高い細胞を用いることもできる。

3 ) ヒ卜染色体を保持する細胞において、ヒトテロメァ配列を保持するターゲティングべクタ一を構築し、相同組換えにより染色体上の所望の位置にテロメァ配列の挿入されたクローンを取得の後、テロメァ ' トランケ一シヨンによる欠失変異体を得る。 Itzhakiら、 ature Genet., 2, 283-287, 1992;及び Brownら、 P.

N. A. S.， 93:7125, 1996を参照のこと。また、タ一ゲティングベクターの導入に際しての宿主細胞として、 DT 4 0細胞（ Diekenら、前記）のような相同組換え頻度の高い細胞を用いることもできる。 DT 4 0細胞におけるヒト染色体のテロメァ ' トランケ一シヨンは本発明において初めて開示された。前記 Brownらの開示はべクタ一の揷入が染色体上のリピート配列に対するものであり、特定の位置をターゲットできるものではない。 Itzhakiらの開示によれば、ヒトテロメァ配列を導人した腫瘍細胞の一種である HT 1 0 8 0細胞株を 1 1 0 0 0株に渡つて解析した結果 8個の相同組換え体を取得し、そのうちわずか 1株においてテロメァ配列による欠失を見出したに過ぎない。また、細胞によってはテロメァ配列が揷人されてもトランケーション体が全く得られないという結果も報告されているが（Barnettら、 Nucleic Acids Res. , 21:27, 1993) 、発明者らはトランケ一ション体を得るためにはともかくも相同組換え体の絶対数を増やすことが必要と考え、 DT 4 0細胞を宿主としたテロメァ · トランケ一ションを試みた。その結果、予想外のことに取得された 8個の相同組換え体のすべてにおいて、トランケ一ションが起こっていることを見出した。

以上に開示された導入染色体の改変により、ヒト染色体導人マウスにおいて発現させたくない遺伝子を排除することができる。また、導入される染色体のサイズの縮小化により、導入される染色体断片をヒト染色体導入マウスの子孫に伝達することが可能となる。さらに、染色体の転座、置換により、複数の染色体由来の遺伝子を同一の染色体断片上において発現させること、染色体断片上の複数の遺伝子の一部を異なる遺伝子に置き換えること、すなわち、外来染色体断片をマウス個体及びマウス細胞への遺伝子導入用のベクターとして用いることが可能となる。

(2) 分化多能性を保持するマウス細胞へのヒト染色体またはその断片の移人 . これまでに、種々の系統のマウス由来の胚性癌腫細胞（EC細胞、 Hanaokaら，

D i f f eren t i a t i on, 48 : 83, 1991 ) 、胚性幹細胞（ES細胞、 Evansら， Nature,

292 : 154, 1981 ) 、胚性生殖細胞 ( EG細胞、 Ma tsu iら， Ce l l , 70 : 841, 1992) がマウス初期胚に注入あるいは共培養することによりその正常体細胞に寄与する、すなわちキメラマウス作製可能であることが報告されている。 ES、 EG細胞はその能力が特に高く、多くの場合生殖細胞にも寄与し、その細胞由来の子孫を作ることができる。 EC細胞は主に生殖細胞癌から、 ES細胞は胚盤胞の内部細胞塊から、

EG細胞は発生初期に出現する始原生殖細胞から得られる。本発明におけるヒ卜染色体移人の受容細胞としてはこれらの細胞株及びその変異株、さらにはマウス個体において全て、あるいは一部の正常体細胞に分化可能なあらゆる未分化細胞を用いることができる。これらの受容細胞は、キメラマウス、キメラマウス由来の組織あるいは細胞において、導入されるヒト遺伝子の発現を好適なものとするため、導人されるヒト遺伝子に相同なマウス遺伝子等の、単一あるいは複数の遺伝子を標的遺伝子相同組換え法（Joynerら， Gene Targe t i ng, 1993, I RL PRESS)等の方法を用いて破壊することも可能である。

受容細胞へのヒ卜染色体移入の材料としては（1) で得られたヒト染色体供与細胞から調製されるミクロセルあるいはガンマ線照射したミクロセルを用いることができる。受容細胞への移人はく清水素行，細胞工学ハンドブック，羊土社，

1992>等に記された方法で受容細胞とミクロセルを融合することにより行なう。ミクロセル供与細胞においてはあるヒト染色体またはその断片が受容細胞において選別可能なマーカーを保持している。この中から、（1) と同様 PCR、サザンブロット解析、 FISH解析等により、導入を目的とする遺伝子あるいは染色体あるいはその断片を保持する株を選択すれば、あらゆるヒト染色体、あるいはその断片を導入することが可能である。また、異なる選択マーカ一を保持する複数の染色体、あるいはその断片を逐次導入することにより、これらを同時に保持する受容細胞を得ることも-できる。さらに、すでにあるヒト染色体を導入した細胞株の中から、導入染色体数が増加したものを選抜することも可能である。これは通常、培養液中に添加する選択薬剤の濃度を高めることにより達成される。

ヒト染色体上のマーカー（G418耐性等）により選抜された受容細胞が、供与細胞の保持していたヒト染色体の全部あるいは一部を保持していることは、以下のようにして確認される。選抜された受容細胞から抽出したゲノム DNAを用い、ブローブとしてヒト特異的繰り返し配列（Ll、 Alu等、 Korenbergら， Cell, 53:3 91， 1988) 、ヒ卜遺伝子等を用いたサザン解析により検出される。また、ヒト遺伝子特異的プライマ一による PCR法、及びヒ卜染色体特異的プローブ（Lichte rら， Human Genetics, 80:224, 1988) を用いたフルォレツセンスインサイチュ一ハイブリダィゼ一シヨン（FISH) 等の染色体解析により確認することができる

(3) ヒト染色体導入 ES細胞からのキメラマウス作製

(2) で得られた ES細胞株からのキメラマウス作製は、く相沢慎一，バイオマニュアルシリーズ 8 ジーンタ一ゲティング，羊土社， 1995>等に記された方法で行なう。効率的なキメラマウス作製を行なうための宿主胚の発生時期、系統等の選択については、それぞれの ES細胞株につし、てすでに検討された条件を用、ることが望ましい。例えば、 CBAXC57BL/6 F1 由来の TT2細胞（野生色、 Yagiら， Analytical Biochemistry, 214:70， 1993) については Balb/c (白色、日本クレア社）あるいは ICR (白色、日本クレア社）由来の 8細胞期胚を宿主胚として用いるのが望ましい。

(4) キメラマウスにおけるヒ卜染色体の保持及びヒト遺伝子発現

ES細胞株を注入した胚から誕生したマウスにおける ES細胞の貢献率は、その毛色によりおおまかに判定することができる。但し、毛色に全く貢献が見られないからといって他の組織で貢献がないとは断定できない。より詳細な、キメラマウス各組織におけるヒト染色体の保持は各組織より抽出されたゲノム DNAを用いたサザン解析、 PCR等によって確認することができる。

導入ヒ卜染色体上の遺伝子発現は以下のようにして確認される。ヒ卜染色体由来 mRNAの発現は各組織由来 RNAを用いた RT- PCR法（Kawasak iら， P. N. A. S. , 85 : 5 698, 1988) 、ノーザンブロッ卜法（Ausube lら，前記）により検出される。蛋白質レベルの発現は、マウスの相同蛋白質との交差反応性を最小にした抗ヒト蛋白質抗体による酵素免疫測定法（EL !SA、富山 ·安東，単クローン抗体実験マ二ュアル，講談社サイェンティフイク， 1987 ; 石川，超高感度酵素免疫測定法，学会出版センタ一， 1993) 、ウェスタンブロッ卜法（Ausube lら，前記）あるいは、電気泳動度の違いを利用したアイソザィム分析（Κο ί ら， Jpn. J. Cancer Res .， 80 : 413, 1989)等により検出される。さらに、キメラマウス細胞中でのヒト染色体の保持及び該染色体上の遺伝子の発現が、キメラマウス由来初代培養細胞での薬剤耐性マーカー遺伝子発現による耐性細胞の出現より確認できる。

例えば、ヒト免疫グロプリン重鎖の存在するヒト 14番染色体を保持する ES細胞から作製されたキメラマウスについて、キメラマウス血清中のヒト I gM、 I gG、 I gA等をマウス抗体との交差反応性を最小にした抗ヒ卜 i g抗体による酵素免疫測定法により検出することができる。また、このキメラマウスをヒト由来抗原（例えばヒト血清アルブミン）により免疫し、その脾臓細胞とマウスミエ口一マを融合することにより得られる、ハイプリドーマ（安東 ·千葉，単クローン抗体実験操作入門，講談社サイェンティフイク， 1991) を EL I SAによりスクリーニングすることにより、ヒト免疫グロブリン重鎖を産生するハイプリドーマを得ることができる。

以上、マウスを例にとり、ヒト染色体またはその断片を保持し、該染色体またはその断片上の遺伝子を発現するキメラ非ヒ卜動物の作製法を説明したが、本発明において、キメラ非ヒト動物へ移入される染色体またはその断片は、ヒト由来のものに限られず、広く外来染色体またはその断片を移入し、該染色体またはその断片上の遺伝子を発現させることが可能である。ここで、「外来染色体」とは、分化多能性を保持する細胞へ移入され、キメラ非ヒト動物において、該染色体またはその断片上の遺伝子が発現することを特徴とするものであり、その由来とする生物種は特に限定されるものではない。また、本発明の方法により、キメラマウスのみならず、他のキメラ動物、例えば、ラット、ブタ等の哺乳類その他のキメラ動物も作製することができる。マウス以外の動物種における ES細胞あるいは ES様細胞の樹立はラット（I annacconeら， Dev. B i o l . , 163, 288-, 1994) 、ブ夕（Whee l er ら， Reprod. Fer t i 1. Dev.， 6， 563-, 1994) 、ゥシ（S imsら， Pr o a t l . Acad. Sc i . USA, 91， 6143-6147, 1994) において報告され、さらにメダカ、ニヮトリ等でも試みられている（トランスジヱニック動物，蛋白質核酸酵素， 1995年 10月号増刊，共立出版）。また、ヒッジにおいては ES様細胞（ED細胞）さらにはそれを 10代以上継代して得られる上皮様細胞由来の核を移植された未受精卵が正常に発生することが知られている（Campbe l lら， Na t ure, 380, 64- . 1996) 。これら ESあるいは ES様細胞を受容細胞とした外来染色体移入によってマウスの場合と同様に外来染色体あるいはその断片を保持し、該染色体またはその断片上の遺伝子を発現するキメラ非ヒ卜動物が作製可能である。

また、本発明において、外来染色体あるいはその断片が移人される、分化多能性を保持する細胞は、前述の E S細胞、 E C細胞、 E G細胞に限られるものではない。例えば、骨髄幹細胞に外来染色体あるいはその断片を移人することが可能であり、該骨髄幹細胞の生体への移植により、遺伝病等の治療を行うことが可能である。

キメラ非ヒト動物において、外来染色体を保持する ES細胞がその生殖細胞に分化した場合、生殖により得られる子孫にも導入染色体または断片が認められ、その子孫は導入された染色体または断片上の遺伝子を発現する。

上記のようにして得られるキメラ非ヒト動物またはその子孫を利用して、外来染色体またはその断片上の遺伝子を発現させ、その産物を回収することにより、生物学的に活性な物質を製造することができる。具体的には、キメラ非ヒト動物またはその子孫の個体を外来染色体またはその断片上の遺伝子を発現しうる条件下で飼育し、その後発現産物を動物の血液、腹水などから回収することができる c あるいはまた、キメラ非ヒト動物またはその子孫の組織、細胞あるいはそれを不死化したもの（例えば、ミエローマ細胞との融合により不死化したハイプリドーマ）などを外来染色体またはその断片上の遺伝子を発現しうる条件下で培養し、その後発現産物を培養物から回収することができる。さらには、これらキメラ非ヒト動物またはその子孫の組織、細胞、あるいはそれを不死化したものから抽出した外来染色体あるいはその断片、または外来染色体またはその断片を構成する

DNA、さらにはまた、キメラ非ヒト動物またはその子孫の組織、細胞、あるいはそれを不死化したものに保持された外来染色体あるいはその断片に由来する c DN Aを動物細胞あるいは昆虫細胞（例えば、 CHO細胞、 BHK細胞、肝ガン細胞、ミエローマ細胞、 S F 9細胞等）に導入し、該細胞を外来染色体またはその断片上の遺伝子を発現しうる条件下で培養し、その後発現産物（例えば、特定の抗原特異的な抗体蛋白質等）を培養物から回収することができる。発現産物は遠心分離などの公知の方法に従って回収することができ、さらに、硫安分画、分配クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、分取薄層クロマトグラフィ一などの公知の方法に従って精製することができる。生物学的に活性な物質は、外来染色体上にコードされているあらゆる物質を含み、例えば、抗体、特にヒト抗体などを挙げることができる。例えば、得られたキメラ動物の脾細胞あるいはそのハイプリドーマなどの不死化細胞から該染色体上のヒ卜抗体遺伝子をクローニングし、チャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO) やミエローマ細胞に導入してヒト抗体を生産することができる（Lynette ら， Bi otechnology, 10， 1121-, 1992; Bebbingtonら, Biotechnology, 10， 169-, 199 2)。

本発明により得られるヒト 2番、 14番、 22番染色体（断片）を保持するキメラマウス及びその子孫は、ヒト抗体重鎖（14番染色体上）、軽鎖/ c (2番染色体上）軽鎖 I (22番染色体上）それぞれの遺伝子の機能的配列の大部分を保持し得る。すなわち、酵母人工染色体等を用いてヒ卜抗体遺伝子の一部を導入した既知の卜ランスジエニックマウス（Greenら， Nature Genetics, 7， 13-, 1994， Lonberg ら， Nature, 368, 856-, 1994等）と比較して、ヒトにおいて観察されるものにより近い、非常に多様なヒト抗体レパートリーを発現することが可能である。また、本発明により得られる 2番 +14番、 22番 +14番等の染色体（断片）を同時に保持するキメラマウス及びその子孫、並びに、それらを交配することにより得られる 2番 +14番 +22番等の染色体（断片）を同時に保持するマウス及びその子孫は、重鎖、軽鎖の両者がヒト由来である完全なヒト抗体を産生することが可能である。これらのマウスはヒト由来抗原に対してそれを異物とみなして免疫反応を起こし、抗原特異的ヒト抗体を産生することができる。この性質は治療用のヒトモノクローナル抗体、あるいはヒトポリク口一ナル抗体を得るために非常に有用である（Gr e enら、前記、し onbe rgら、前記）。一方、特定の抗原に対して親和性の高いヒト抗体を得る効率を上げるためには、マウス抗体を産生せず、ヒト抗体のみを産生するマウスを作成することが望まれる（G r eenら、前記、 Lonbe rg ら、前記）。本発明において、これは典型的には以下の方法 Aあるいは Bにより達成される。

方法 Α：マウス抗体欠損 ES細胞およびマウス抗体欠損キメラ宿主胚を用いる方法方法 B：ヒト染色体導入キメラマウスよりヒト染色体を保持する子孫を得てマウス抗体遺伝子を欠損するマウス系統との交配を行う方法。

以下に A, Bそれぞれの方法の典型的な例について以下に具体的に記す。

方法 Aの具体的手順

1 . マウス ES細胞に 2コピー存在するマウス抗体重鎖遺伝子の片側のアレルを標的遺伝子相同組み換え法（J oynerら， Gene Targe t i ng, 1993, I RL PRESS) を用いて破壊する。遺伝子破壊箇所には後に部位特異的組換えにより除去可能な配列、例えば Ι οχΡ配列（Creレコンビナ一ゼにより組み換え、 Saue rら、前記、他に FLPレコンビナ一ゼ- FRT配列を用いた 0' Go rmanら， S c i en c e, 251 , 1351 -, 1991 の例がある）にはさまれた G418耐性遺伝子等のマーカー遺伝子を揷人する。

2 . 抗体重鎖遺伝子の片側のァレルが破壊された上記薬剤耐性マウス ES細胞を高濃度の薬剤存在下で培養し、高濃度薬剤耐性となった株を選抜する。これらの株をスクリーニングすることにより抗体重鎖遺伝子の両側のァレルが破壊された株が得られる（相沢慎一、前記）。あるいは、抗体重鎖遺伝子の片側のアレルが破壊された上記薬剤耐性マウス ES細胞のもう一方の側のァレルの標的遺伝子も相同組み換え法を用いて破壊する。予め挿入されたマーカー遺伝子とは別のマーカー遺伝子を使用することによって、同様な操作を繰り返すことができる。例えば、 G418耐性遺伝子を用いて相同組み換えを行つた後、ピューロマイシン耐性遺伝子を用いて相同組み換えを行い、両側のァレルとも抗体重鎖遺伝子が破壊された株を得る。予め挿入されたマーカー遺伝子と同じマーカー遺伝子を使用する場合には、 1 . で薬剤耐性遺伝子の両側に挿入した組み換え配列の間で、部位特異的組み換え反応を起こす酵素遺伝子を一時的に導入し、標的遺伝子に挿入されていた薬剤耐性遺伝子を除—去された薬剤感受性株を選抜する。その後、再度標的遺伝子相同組み換え法によって、マーカ一遺伝子を挿入し、両側のアレルとも標的遺伝子が破壊された株を得る（高津聖志ら、実験医学別冊、免疫研究の基礎技術、 P. 255-, 1995、羊土社）。

3 . 2 . で得られた抗体重鎖遺伝子の両側のアレルが破壊されたマウス ES細胞に 1 . で薬剤耐性遺伝子の両側に挿入した組換え配列の間で部位特異的組み換え反応を起こす酵素遺伝子、例えば Creレコンビナ一ゼ遺伝子（Sauerら、前記）を一時的に導入し、 Ι οχΡ配列の間で組み換え反応が起こって両方の抗体重鎖遺伝子に揷入された薬剤耐性遺伝子が除去された薬剤感受性株を選抜する（高津聖志ら、実験医学別冊、免疫研究の基礎技術、 p255-、 1995、羊土社）。

4 . マウス抗体軽鎖/ c遺伝子について上記 1〜 3の過程を繰り返し、最終的に抗体重鎖及び / 鎖を完全に欠損した薬剤感受性株を取得する。

5 . 4の株（抗体重鎖、 / 鎖欠損マウス ES細胞）を受容細胞としたミクロセル融合により、薬剤耐性マーカ一（例えば G418耐性遺伝子）でマ一キングされたヒト抗体重鎖遺伝子を含むヒト 14番染色体（断片）を導入する。

6 . 5で得られた株を受容細胞としたミクロセル融合により、 5 とは異なる薬剤耐性マーカ一（例えばピューロマイシン耐性遺伝子）でマーキングされたヒト抗体軽鎖遺伝子を含むヒト 2番染色体（断片）あるいは 22番染色体（断片）またはその両者を導入する。

7 . 自らの抗体を産生することができないマウス系統（例えば RAG- 2ノックァゥトマウス、 Sh i nkaiら， Cel l, 68， 855 -， 1992、膜型〃鎖ノックアウトマウス、

Ki tamuraら， Nature, 350， 423-, 1991) から得た胚を宿主胚として 6で得られた

ES細胞とのキメラマウスを作成する。

8 . 得られるキメラマウスにおいてほとんどの機能的な Bリンパ球は ES細胞に由来する（高津聖志ら、実験医学別冊、免疫研究の基礎技術、 p234-、羊土社、 19

95) 。この Bリンパ球においてはマウス重鎖、鎖が欠損しているため、主として導人染色体上の機能的なヒ卜抗体遺伝子よりヒ卜の抗体のみが産生される。方法 Bの具体的手順

1. ヒト抗体重鎖、軽鎖または軽鎖 λを含むヒト染色体あるいはその断片を保持するキメラマウスからそれらを安定に保持する継代可能な子孫を得る。

2. 1. で得られたヒト抗体重鎖または軽鎖を発現するマウス系統あるいはそれらの交配により得られたヒト抗体重鎖および軽鎖の両者を発現するマウス系統と自らの抗体遺伝子が欠損しているマウス系統（例えば膜型//鎖ノックァゥトマゥス、前記、軽鎖/ ノックアウトマウス、 Chenら， EMBO J. , 3, 821-, 1993) との交配により、マウス抗体重鎖、及び軽鎖の欠損についてホモ接合体であり、なおかつヒト抗体重鎖（14番） +軽鎖/ c (2番）、抗体重鎖（14番） +軽鎖； I (22 番）あるいはヒト抗体重鎖（14番） +軽鎖/ c (2番） +軽鎖 λ (22番）を含むヒ卜染色体を保持するマウス系統を得る。このマウス系統においてはマウス抗体重鎖、軽鎖 c遺伝子が欠損しているため、主として導入染色体上の機能的なヒト抗体遺伝子よりヒ卜の抗体のみが産生される。

なお、上記の Αおよび Βの方法は、ヒ卜抗体のみならず、外来染色体上に存在するあらゆる遺伝子の産物を効率的に得るために、用いることができる。

以下に実施例を示して具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものでない。

(実施例 1 ) G418耐性標識されたヒ卜染色体（断片）を保持する染色体供与細胞の作製

G418耐性遺伝子を含むプラスミド pSTneoB (Katohら、 Cell Struct. Funct.,

12:575, 1987; Japanese Col lection of Research Biologicals (JCRB), Depos it Number: VE039) を制限酵素 Sal I (宝酒造）で線状化し、ヒト正常繊維芽細胞

HFL-1 (RIKEN Cell Bankより入手、 RCB0251)へ導人した。 HFL- 1細胞をトリプシン処理し、 5x10^s個 Zmlとなるようにダルベッコのリン酸バッファー（PBS) に懸濁してから 10〃gDNA存在下でジーンパルサ一（バイオラッド）を用いてエレクトロポレーシヨンを行なった（石田ら，細胞工学実験操作人門，講談社， 1992 25〃 Fの容量で 1000Vの電圧を 4mm長のエレクト口ポレーシヨンセル（165 -

2088、バイオラッド）を用いて室温で印加した。エレク卜口ポレーシヨンした細胞を 15%牛胎児血清（FBS) を添加したイーグル F12培地（以下 F12、という）を含む 100mm組織培養用プラスチックシャーレ（コ一ニング） 3〜 6枚に播種した。 1 日後に 200 g/mlの G418 (GENETI C IN，シグマ）を含む 15,¾FBSを添加した F1 2培地と置き換えた。 · 2〜 3週間後に生じたコロニー 100個程度を一つの集団として 52グループにそれぞれまとめ、 100 讓シャーレに再び播種し培養した。

マウス A9細胞（Osh imura, Env i ron. Heal th Perspec t. , 93 : 57, 1991， JCRB0211 ) を 10%牛胎児血清（FBS) を添加したダルベッコ改変イーグル培地（以下 DMEM 、という）中、 100 mm シャーレで培養した。 52グループの G418耐性 HFい 1 細胞を 15%牛胎児血清（FBS) と 200 g/mlの G418を添加した F12中で、それぞれ 100m mシャーレで培養した。マウス A9細胞と HFL- 1 細胞をトリプシン処理後それぞれ四分の一から半分量ずつ混合し、 100誦シャーレに播種し 10%牛胎児血清（FBS ) を添加した DMEMと 15%牛胎児血清（FBS) を添加した F12との等量混合物中で半日から一日培養した。細胞融合は（清水ら，細胞工学ハンドブック，羊土社， P. 127-， 1992) に記述されている方法に従った。 DMEMで細胞表面を 2回洗った後、 2ml の PEG ( 1 ： 1. 4) 溶液で 1分間処理し、さらに、 2mlの PEG ( 1 ： 3) 溶液に換え 1分間処理した。 PEG溶液を吸い取り、無血清培地（DMEM) で 3回洗つた後、通常の培地（10% FBS、 DMEM) で 1 日間培養した。細胞をトリプシン処理により分散し、ゥヮバイン（1x10— ⁵M，シグマ）および G418 (800 g/ml ) を含む二重選択培地（10% FBS、 DMEM) に懸濁し、 100腿シャーレ 3枚に播種した。約 3週間培養した後、生じたコロニーをトリブシン処理により細胞を分散し G4 18 (SOO ^ g/ml ) を含む選択培地（10% FBS、 DMEM) で培養した。

トリプシン処理により細胞を分散し 2グループを一つにまとめて、 6本の 25cm

²遠心用フラスコ（コースター、 3025) にて細胞密度が 70〜80%飽和程度まで培養した。コルセミド（0. 05 g/ml，デメコルシン，和光純薬）を含む培養液（20

% FBS、 DMEM) に交換し、 2 日間培養しミクロセルを形成させた。培養液を除去し、予め保温（37°C) しておいたサイトカラシン B (lO ^ g/ml , シグマ）溶液を遠心用フラスコに満たし、アクリル製遠心容器に遠心用フラスコを挿人し、 34°C

、 8000rpm ， 1時間の遠心を行なった。ミクロセルを無血清培地に懸濁し、フィルターで濾過し精製した。マウス A9細胞を 80%飽和の状態まで培養した 25cm^: フラスコに精製した微小核を加え PEG溶液で融合させた。 G418を含む選択培地で培養しコロニーを単離した。各クローンが保持するヒ卜染色体（2番、 4番、 14番、 22番）は以下の通り同定した。上記以外のすべての実験操作及び試薬等はく清水ら、細胞工学ハンドブック、羊土社、 P.127-〉に従った。

(1) PCR解析

単離した細胞を培養し、細胞から Puregene DNA Isolation kit (Gentra Syste m社）を用いてゲノム DNAを抽出し、このゲノム DMAを铸型とし、ヒ卜染色体特 . 異的なプライマ一を用いて PCR法で 2、 4、 14、 22番ヒト染色体を保持するクロ —ンを選抜した。 PCR増幅は約 0. l〃gのゲノム DNAを使用し（Innisら， PCR 実験マニュアル， HBJ出版局， 1991，サーマルサイクラ一は GeneAmp 9600， Perk in- Elmer社を使用）に従い行なつた。 Taqポリメラーゼは Perkin-Elmer社製を用い、反応条件は、 94°C5分を 1サイクル行なった後、変性 94°C15秒、ァニーリング 54〜57°C15秒（プライマ—により適宜変更）、伸長 72°C20秒を 35サイクル行なつた。プライマーは各染色体上に存在する遺伝子（O'Brien, Genetic Maps, 6th edition, Book 5, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1993 ) 及び多型性マ一力一 (Polymorphic STS Primer Pair, BIOS 社； Weissenbach ら， Nature 359:794, 1992; Walterら， Nature Genetics, 7:22, 1994等）を用いた。遺伝子プライマ一は GenBank、 EMBL等のデ一タベースより人手した塩基配列をもとに作製した。多型性プライマーの名称及び、遺伝子プライマーの配列はそれぞれの染色体について以下の実施例で示した（2番：実施例 1、 4番：実施例 6、 14番：実施例 9、 22番：実施例 2) 。 2番染色体の同定には以下に示す遺伝子マーカ一及び多型性マーカー（Polymorphic STS Primer Pair, BIOS社： D2S207, D2S1 77, D2S156, D2S159 BIOS社) を用いた。

C c (immunoglobulin kappa constant) ： 5' -TGGAAGGTGGATAACGCCCT (配列番号 1 )， 5， -TCATTCTCCTCCAACATTAGCA (配列番号 2 )

FABP1 (fatty acid binding protein - 1 liver) ： 5' -GCAATCGGTCTGCCGGAAGA (配列番号 3 )， 5' -TTGGATCACTTTGGACCCAG (配列番号 4 )

Vk3-2 (immunoglobulin kappa variable) ： 5' -CTCTCCTGCAGGGCCAGTCA (配列番号 5 )， 5' -TGCTGATGGTGAGAGTGAACTC (配列番号 6 ) Vkl-2 (immunoglobulin kappa variable) ： 5' -AGTCAGGGCATTAGCAGTGC ( 配列番号 7 )， 5' -GCTGCTGATGGTGAGAGTGA (配列番号 8 )

☆

(2) フルォレツセ—ンスインサイチューハイブリダィゼーシヨン（FISH)

FISH解析は（松原ら， FISH実験プロトコール，秀潤社， 1994) に記された方法に従い、ヒ卜 2番、 4番、 14番、 22番染色体特異的プローブ（CHROMOSOME PAINT I G SYSTEM, Cambio社）を用いて行なった。

例えば、 2番染色体を保持するクローンは 26グループ（745クローン）中 10グル —プに 1個以上のクローンを得た。このうち用いた 2番染色体特異的なプライマ一すべてに陽性であつたのは 5クローンだった。これらのクローンを FI SH解析した。 FISH解析は（松原ら， FISH実験プロトコール、秀潤社、 1994) に記された方法に従い、ヒト 2番染色体特異的プローブ（CHROMOSOME PAINTING SYSTEM, CANBI ◦社）を用いて行なった。すべてのプライマ一に陽性な細胞ではヒト 2番染色体がほぼ完全な形で観察され、 1部のプライマ一のみ陽性なクローンのうちいくつかのクローンではヒト 2番染色体よりも小さな独立染色体が観察され、あるいはヒ卜 2番染色体以外の染色体と融合しているような形の染色体を持つ細胞も観察された（図 1 ) 。図 1において、横列がクローン名、縦列は PCRに使用したブライマ一を示す。秦は陽性を、 Xは陰性を示した。また、 FISHにより観察されたヒト 2番染色体の存在形態を最下行に示した。記載のないものは実施していない。同様にして、ヒト 4番、 14番、 22番染色体を保持する A9細胞を得た。

(実施例 2) マウス ES細胞へのミクロセル法によるヒト 22番染色体導入

染色体供与細胞として、（実施例 1) で得られたヒト 22番染色体を保持するマウス A9細胞株（以下 A9/#22、という）を用いた。染色体受容細胞としてはマウス

ES細胞株 E14 (Martin L. Hooperより入手、 Hooperら， Nature, 326 :292, 1987

) を用いた。 E14の培養法はく相沢慎一，バイオマニュアルシリーズ 8，ジーンタ一ゲティング，羊土社， 1995>に記された方法に従い、栄養細胞としては、マイトマイシン C (シグマ）処理した G418耐性 ST0細胞株（大阪大学、近藤寿人教授より人手）を用いた。まず清水ら（細胞工学ハンドブック、羊土社、 1992) の報告した方法に従い、約 10⁸個の A9/S22からミクロセルを調製した。得られたミクロセルは全量を 5mlの DMEMに懸濁した。約 10⁷個の E14を卜リプシンで分散させた後、 DMEMで 3回洗浄し、 5mlの DMEMに懸濁した後、ミクロセルとあわせ、丄 250rpni、 10分間遠心して上清を除いた。沈殿をタッピングによりょくほぐし、 1:1.4PEG溶液（5g PEG1000，く和光純薬〉， lml DMS0<シグマ〉を 6mlDMEMに溶解) 0.5mlを加えて室温で 1分 30秒静置した後、 lOmlの DMEMをゆっくりと加えた。直ちに 1250rpm、 10分間遠心して上清を除き、沈殿を 30mlの ES細胞用培地に懸濁し、あらかじめ栄養細胞をまいた直径 100mmの組織培養用プラスチックシャーレ（コ一二ング） 3枚に播種した。 24時間後に 300 g/mlの G418 (GENETIC IN, シグマ）を加えた培地と交換し、その後毎日培地交換を行なった。 1週間〜 10日後には薬剤耐性コロニーが出現する。その出現頻度は E14細胞 10⁷個あたり 0〜5個であった。そのコロニーをピックアップし増殖させ、 5x 10⁶個あたり lmlの保存用培地（ES細胞用培地十 10¾DMS[Kシグマ〉）に懸濁し、 - 80°Cにて凍結保存した。同時に各薬剤耐性株について 10⁶〜10⁷個の細胞からゲノム DNAを Puregene

DNA Isolation Kit (Gentra System社）により調製した。

ヒ卜 22番染色体の断片化はミクロセルにガンマ線照射することにより行なった

(Koiら， Science, 260:361， 1993) 。約 10⁸個の A9/#22より取得したミクロセルを 5mlの DMEMに懸濁し、ガンマセル 40 (カナダ原子力公社製）により、氷上で 60Gyのガンマ線を照射した（1.2Gy/分 x 50分）。ガンマ線照射したミクロセルは未照射ミクロセルと同様に融合、薬剤耐性株選抜を行なった結果、薬剤耐性株の出現頻度は E14細胞 10⁷個あたり 1〜7個であった。薬剤耐性株については未照射の場合と同様にして凍結保存、 DNA取得を行なった。

未照射ミクロセル薬剤耐性株 E14/#22-9 、 E14/#22-10 、ガンマ線照射ミクロセル薬剤耐性株 E14/#22_14、 E14/#22-25における導入染色体の保持は以下の（1) 〜（3)により確認した。

(1) PCR解析（図 2 )

薬剤耐性株ゲノム DNAを铸型としてヒト 22番染色体上に存在する遺伝子（Gene tic Maps, 前記）及び多型性マーカ一（Polymorphic STS Primer Pair, BIOS社

： D22S315, D22S275, D22S278, D22S272, D22S274; Nature 359:794, 1992) の存在を PCR法により検出した。 GenBank、 EMBL等のデータベースより入手した塩基配列をもとに作製した遺伝子プライマーォリゴヌクレオチドの配列を記す。 PVALB (parvalbumin) ： 5' -TGGTGGCTGAAAGCTAAGAA (配列番号 9 )， 5' -CCAGAA GAATGGTGTCATTA (配列番号 10)

MB (myoglobin) ： 5' -TCCAGGTTCTGCAGAGCAAG (配列番号 11)， 5' -TGTAGTTGGAGG CCATGTCC (配列番号 12)

DIA1 (cytochrome b- 5 reductase) ： 5' -CCCCACCCATGATCCAGTAC (配列番号 13 )， 5' -GCCCTCAGAAGACGAAGCAG (配列番号 14)

Ig (immunoglobulin lambda) ： 5' -GAGAGTTGCAGAAGGGGTGACT (配列番号 15 )， 5' -GGAGACCACCAAACCCTCCAAA (配列番号 16)

ARSA (arylsulfatase A) ： 5' - GGCTATGGGGACCTGGGCTG (配列番号 17)， 5' -CAGA GACACAGGCACGTAGAAG (配列番号 18)

☆

約 0. l/ gのゲノム DNAを铸型として上記の 10種のブラィマーについて PCR増幅（innisら，前記）を行なった。その結果、未照射の 2株は全てのプライマ一、ガンマ線照射した 2株については一部のプライマ一について期待される長さの増幅産物が検出された。以上の結果を図 2に示す。図 2において、左側にヒ卜 22 番染色体の Gバンド像に基づく模式的な染色体地図、また、位置が明らかになつているいくつかのマ一カーについてはどのバンドに位置するかを示した（0' Brie n, GENETIC MAPS, 6th edition, BOOK 5等）。遺伝子及び多型性マ一力一の並び方は、現在までに入手出来る情報（Science, HUMAN GENETIC MAP, 1994， Nature

Genetics, 7:22, 1994， Nature 359:794, 1992等）を基に、大まかな位置関係を示したもので、順序は必ずしも正確ではない。 4種の G418耐性 E14細胞株について、 PCRにより期待される増幅産物が検出されたマーカ一は國で、検出されなかったマーカ一を□で示した。下側には FISH解析による観察結果を示した。

22は、染色体供与細胞である。

(2) サザンプロット解析

サザンブロット解析はヒト特異的な繰り返し配列である L1配列（ハプロイドゲノム当たり 10⁴〜10⁵コピー存在、 RIKEN DNA Bankより入手、 Nucleic acids re search, 13;7813, 1985, pUK19A由来 1.4kb EcoRI-BamHI 断片）をプローブとして、制限酵素（Bglil、宝酒造製）処理を行なった約 2 zgのゲノム DNAに対してく Ausubelら， Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, 1 n ， 1994〉に記された方法に従い行なった。その結果、各薬剤耐性株 DNAにおいてヒ卜し 1 配列とハイブリダィズするバンドが多数検出された。未照射の 2株についてはそのパターン及び、各バンドの濃度から推定できるヒト染色体 DNAのマウスゲノム DNAに対する量比は A9/#22のそれと同等であった。ガンマ線照射株の全体のシグナル強度は A9/#22と比較した場合、 PCR解析で示された欠失の程度と相関していた。

( 3 ) フルォレツセンスインサイチューハイブリダィゼ一シヨン（FISH)

FISH解析は（松原ら， FISH実験プロトコール，秀潤社， 1994) に記された方法に従い、ヒ卜 22番染色体特異的プローブ（CHROMOSOME PAINTING SYSTEM, Cambio 社）を用いて行なった。その結果、観察した分裂像のほとんどにおいて、 E14/ 2-9 はマウス染色体に転座した形で、他の 3株は独立した染色体としてヒ卜 22番染色体が検出された。

以上の実験により、得られた G418耐性株 E14/#22-9 、 E14/#22-10 はヒト 22番染色体の全てあるいは大部分を、 E14/#22- 14 、 E14/#22-25 はその部分断片を保持することが確かめられた。

(実施例 3) ヒト 22番染色体を保持する ES細胞からのキメラマウス作製

一般的なマウス胚取得、培養、 ES細胞の胚への注入、仮親子宮への移植等の手技については、く相沢慎一，バイオマニュアルシリーズ 8，ジーンターゲティング，羊土社， 1995〉に記された方法に従った。（実施例 2) で得られ、ヒ卜 22番染色体を保持していることが確認された G418耐性 ES細胞株 E14/ 22- 9を凍結ストックより立ち上げ、 C57BL/6XC3H F1雌マウス（日本クレア社）を C3H雄マウス

(日本クレア社）と交配することにより取得した胚盤胞期胚に胚あたり 10〜15 個注人した。偽妊娠処理後 2.5日の仮親 ICRマウス（日本クレア社）の子宫に片側の子宮あたり約 10個の ES細胞注入胚を移植した。その結果を（表 1 ) に示す。表 1 . ヒト 22番染色体（断片）を保持する E14 細胞株からのキメラマウス作製

ES細胞株/ G418耐性 ES細胞を注人し子マウスキメラマウス毛色への貢献率ヒト染色体株番号 - た胚盤胞期胚数の数の数 10¾ 10-30¾ 30,

E14/#22 9 166 29 16

計 166個の注入胚を移植した結果 29匹の子マウスが誕生した。キメラ個体は、毛色において宿主胚由来の野生色（濃茶）の中に E14細胞由来の薄灰色が認められるかどうかにより判定される。誕生した 29匹のうち毛色に明らかに薄灰色の部分のある、すなわち、 E14細胞の貢献の認められる個体は 16匹であった。また、最高の貢献率は K22- 22における約 40%であつた。

この結果より、ヒト 22番染色体を保持するマウス ES細胞株 Ε14/ίί22- 9はキメラ

7

形成能、すなわちマウス個体の正常組織に分化する能力を保持していることが確認された。 3

(実施例 4) ヒト 22番染色体を保持する ES細胞由来キメラマウス各組織におけ

6 るヒト染色体 DNAの保持確認

(実施例 3) の毛色による判定に加えて、尻尾より調製したゲノム DNAを铸型とした PCR解析により、導入染色体の保持を確認した。誕生後 3週以上を経たキメラマウスからく勝木元也，発生工学実験マニュアル，講談社サイェンティフィク， 1987>に記された方法に従い尻尾を取得し、 Puregene DNA I so l at i on Ki tを用いてゲノム DNAを抽出した。このゲノム DNAを铸型として（実施例 2) で使用した多型性プライマーのうち PVALB、 D22S278を用いて増幅産物の確認を行なつた。毛色に貢献の見られた個体のうち 10匹について解析を行った結果、全ての個体において少なくともいずれかのプライマーによる増幅産物が確認された。サザン解析は（実施例 2) と同様に、ヒト L1配列をプローブとして用い、 6個体のキメラマウス、 1個体の非キメラマウスの 2〃gの尻尾ゲノム DNAに対して行なった。その結果、全てのキメラ個体において多数のヒ卜 L1配列の存在が認められ、そのパターンは E14/#22- 9と類似していた。マウスゲノムに対する量比は最も多いもので 10%程度であった（図 3 ) 。図 3において、各レーンとも、 Bgl l 肖化した 2 // gのゲノム DNAを使用した。 '一 ' P標識ヒ卜 L1配列をプローブとし、シグナルはイメージアナライザー BAS2000 (富士写真フィルム社）により検出した。右より、キメラマウス（K22- 6， 7， 8， 9， 10， 11， 12 ： 9は非キメラ）の尻尾由来ゲノム DNAおよびコントロール DNA(C : C は、 E14/#22- 9 と E14ゲノム DNA を 1 : 9の重量比で混合したもの）のレーンである。左側に DNA分子量、右側に各キメラ個体のキメラ率を示した。（- ： 0 、 + ：〜10%、： 10〜30 )

さらに、毛色に 5,¾程度の貢献の見られたキメラ個体（K22- 7) について脳、肝臓、筋肉、心臓、脾臓、胸腺、卵巣、腎臓から I SOGEN (二ツボンジーン社）によりゲノム DNAを取得し、それぞれの組織について、（実施例 2) で使用した遺伝子プライマ一のうち MB、 D IA1を用いて PCR解析を行なった。その結果 2つのブライマ一とも全ての組織において期待される増幅産物が確認された。 D 1A1ブラィマ —による結果を（図 4 ) に示す。 PCR産物は 2%ァガロースゲルにて電気泳動した後、臭化工チジゥム染色して検出した。図 4の各レーンは左から B：脳、 L :肝臓、 SM：骨格筋、 H：心臓、 Sp：脾臓、 Th：胸腺、 0v：卵巣、 K：腎臓、 nc：非キメラマウス尻尾 DNA (陰性コントロール）、 pc : ヒト繊維芽細胞（HFL- 1) DNA( 陽性コントロール）を示す。

これらの結果より、 E14/#22-9はマウス個体において種々の正常組織に貢献し、かつヒト 22番染色体を保持していることが確かめられた。

(実施例 5) ヒト 22番染色体を保持する ES細胞由来キメラマウスにおけるヒト遺伝子の発現

ヒト遺伝子発現確認のための試料としては、毛色に 5¾程度の貢献の見られた個体（K22- 7) の尻尾を液体窒素にて凍結後粉碎したものを用いた。これは皮膚、骨、筋肉、血液等の組織の混合したものである。これより ISOGEN (ニッボンジーン）を使用して総 RNAを抽出し、 RT- PCR法により、ヒト-ミオグロビン（MB) 、ヒト-チトクローム b5 レダクタ一ゼ（D IA1) の mRNAの検出を行なった。 RT-PCR はく I nni sら， PCR実験マニュアル， HBJ出版局， 1991 >に記された方法に従つて行なった。逆転写反応用プライマーは、ランダムへキサマ一オリゴヌクレオチド（終濃度 100pmol、宝酒造製）を、逆転写酵素は BRL社製（スーパースクリブト）を使用した。 cDNAを铸型とした増幅に用いたプライマーを記す。

MB： 5' -TTAAGGGTCACCCAGAGACT (配列番号 19)， 5' -TGTAGTTGGAGGCCATGTCC (配列番号 20) -

DIA1： 5' -CAAAAAGTCCAACCCTATCA (配列番号 21)， 5' -GCCCTCAGAAGACGAAGCAG (配列番号 22) その結果、両遺伝子の mRNAに特異的な増幅産物が検出された（図 5 ) 。 RT- PCR 産物は 2¾ァガロースゲルにて電気泳動した後、臭化工チジゥム染色して検出した o 図 5において、 M はマーカー (HindlH消化； I DNA + HaeIII消化 0X174DNA, 宝酒造）、 MBはヒ卜ミオグロビン、 DIA1はヒトチトクローム b5レダクタ一セ、 WT は野生型 C3Hマウスを示す。

さらに同じ個体（K22- 7) について、脳、心臓、胸腺、肝臓、脾臓、腎臓、卵巣、骨格筋から IS0GENを使用して総 RNAを抽出し、上記の 2種のプライマーにより各臓器の RT- PCRを行った。その結果、 DIA1は全ての臓器で、 MBは心臓と骨格筋のみで期待される増幅産物が確認された（図 6) 。ミオグロビンは筋細胞特異的に発現することが知られており（Bassel- Dubyら， MCB, 12:5024, 1992) 、この結果は導入したヒト染色体上の遺伝子がマウス個体で正常な組織特異的発現制御を受け得ることを示している。 PCR産物は 2%ァガロースゲルにて電気泳動した後、臭化工チジゥム染色して検出した。図 6において、各レーンは左から B:脳、 H:心臓、 Th:胸腺、 L:肝臓、 Sp: 脾臓、 K:腎臓、 0v: 卵巣、 SM: 骨格筋、 M:マーカー（上記）を示す。 MBの結果において観察される下方のバンドは非特異的産物と考えられる。

すなわち、導入されたヒト 22番染色体はキメラマウスの正常組織において機能し得ることが確かめられた。

(実施例 6) ヒト 4番染色体またはその部分断片の ES細胞への導入

染色体供与細胞として、（実施例 1) で得られたヒ卜 4番染色体を保持するマウス A9細胞株（以下 A9/#4、という）を用いた。染色体受容細胞としてはマウス

ES細胞株 E14 (実施例 2と同様）を用いた。ミクロセル融合実験および G418耐性株の選択は（実施例 2) と同様に行なった。薬剤耐性株の出現頻度は E14細胞 10 固あたり 1〜2個であった。薬剤耐性株の凍結保存、ゲノム DNA取得は（実施例 2) と同様に行なった。薬剤耐性株 E14/#4 - 4 、 E14/#4-7 、 E14#4 - 11におけるヒト 4番染色体またはその断片の保持は以下の（1) 〜（3) により確認した

(1) PCR解析 (図 7)

薬剤耐性株ゲノム DNAを铸型としてヒト 4番染色体上に存在する遺伝子（O'Br. ien, Genetic Maps, 6th edi tion, Book 5, Cold Spring Harbor Laboratory Pre ss， 1993) 及び多型性マーカ— （Polymorphic STS Primer Pair BIOS社： D4S395 ， D4S412, D4S422, D4S413, D4S418, D4S426, Fll; Nature 359:794, 1992 ) の存在を PCR法により検出した。 GenBank、 EMBし等のデータベースより入手した塩基配列をもとに作製した遺伝子プライマ一ォリゴヌクレオチドの配列を記す。 HD (huntington disease) ： 5' -TCGTTCCTGTCGAGGATGAA (配列番号 23)， 5， - TCAC TCCGAAGCTGCCTTTC (配列番号 24)

IL-2 (interleukin-2) ： 5' -ATGTACAGGATGCAACTCCTG (配列番号 25)， 5' -TCATCT GTAAATCCAGCAGT (配列番号 26)

KIT (c-kit) ： 5' -GATCCCATCGCAGCTACCGC (配列番号 27)， 5' -TTCGCCGAGTAGTC GCACGG (配列番号 28)

FABP2 (fatty acid binding protein 2， intestinal) ： 5' -GATGAACTAGTCCAGG TGAGTT (配列番号 29)， 5' -CCTTTTGGCTTCTACTCCTTCA (配列番号 30) 上記の 11種のプライマ一について PCR増幅を行なった結果、 3株共に、全て、あるいは一部のプライマーについて期待される増幅産物が確認された。 E14/#4 - 4

、 E14/#4-7 株のように一部領域に欠失がみられるものもあった。以上の結果を図 7に示す。図 7において、左側にヒト 4番染色体の Gバンド像に基づく模式的な染色体地図、また、位置が明らかになっているいくつかのマーカ一についてはどのバンドに位置するかを示した（実施例 2参照）。遺伝子及び多型性マーカーの並び方は、現在までに入手出来る情報（実施例 2参照）を基に、大まかな位置関係を示したもので、順序は必ずしも正確ではない。 3種の G418耐性 E14細胞株について、 PCRにより期待される増幅産物が検出されたマーカーは園で、検出されなかったマ一力一を□で示した。下側には FISH解析による観察結果を示した。 A9/#4は染色体供与細胞を示す。

(2) サザンプロッ _ト解析（図 8 )

サザンブロッ卜解析は（実施例 2) と同様に、 E14/#4-4 、 E14/#4-7 より取得したゲノム DNAについてヒト L1配列をプローブとして行なった。その結果、両株 DNAにおいてヒト Li 配列とハイブリダィズするバンドが多数検出された。 A9 ./#4と比較して、全体のシグナル強度は PCR解析で示された欠失の程度と相関していた。図 8において、各レーンとも、 Bglll消化した 2〃gのゲノム DNAを使用した。 ³²P標識ヒト L1配列をプローブとし、シグナルはイメージアナライザ一 BAS2000 (富士写真フィルム社）により検出した。図 8において、各レーンは、左から、 1:Α9/#4 (染色体供与細胞) 、 2:A9/#4+A9 (1:2) 、 3:A9/#4+A9 (1:9 ) 、 4:A9、 5:E14/#4- 7、 6 : E14/#4- 4を示す。 2、 3は 2 種の DNAを括弧内に示した比率で混合したものである。左側に DNA分子量を示した。

(3) フルォレツセンスインサイチューハイブリダィゼ一シヨン（FISH)

FISH解析は（実施例 2) と同様に、ヒ卜 4番染色体特異的プローブ（CHR0M0S0 ME PAINTING SYSTEM, Cambio社）を用いて行なった。その結果、 3株すベてのほとんどの分裂像において、ヒト 4番染色体あるいはその部分断片が検出された。 E14/#4- 4はマウス染色体に転座した形で、他の 2株は独立した染色体として存在していた。観察されるヒト染色体の相対的な大きさは、 PCR解析の結果から推測されるそれと一致していた。

以上の実験により、得られた G418耐性株はヒト 4番染色体の全てあるいはその部分断片を保持することが明かとなつた。

(実施例 7) ヒ卜 4番染色体部分断片を保持する ES細胞からのキメラマウス作製ヒ卜 4番染色体部分断片を保持していることが確認された G418耐性 ES細胞株 E1

4/#4- 4、 E14/#4-7を凍結ストックより立ち上げ、（実施例 3) と同様にして取得した胚盤胞期胚に胚あたり 10〜15個注入した。偽妊娠処理後 2.5日の仮親 ICRマウス（日本クレア社）の子宮に片側の子宮あたり約 10個の ES細胞注入胚を移植した。その結果を（表 2 ) に示す c 表 2 . ヒト 4番染色体（断片）を保持する E14 細胞株からのキメラマウス作製

ES細胞株/ G418耐性 ES細胞を注入し子マウスキメラマウス毛色への貢献率ヒ卜染色体株番号た胚盤胞期胚数の数の数 10¾ 10-30 30,V

E14/#4 4 160 8 5 5

7 80 5 2 1

計 240個の注入胚を移植した結果 13匹の子マウスが誕生した。キメラ個体は、毛色において宿主胚由来の野生色（濃茶）の中に E14細胞由来の薄灰色が認められるかどうかにより判定される。誕生した 13匹のうち毛色に明らかに薄灰色の部分のある、すなわち、 E14細胞の貢献の認められる個体は 7匹であった。また、最高の貢献率は E14/#4- 7由来の 1個体において約 15%であつた。

この結果より、ヒト 4番染色体部分断片を保持するマウス ES細胞株 E14/#4- 4、 E14/#4- 7はキメラ形成能を保持している、すなわちマウス個体の正常組織に分化する能力を保持していることが確認された。

(実施例 8) ヒ卜 4番染色体部分断片を保持する ES細胞由来キメラマウスにおけるヒ卜染色体 DNAの保持及び、 G418耐性遺伝子の発現確認

( 1) PCR解析

(実施例 7) で得られたキメラマウスのうち E14/#4- 7由来の 1個体（K#4-7-l ：キメラ率約 5%) 、 Ε14/#4- 4由来の 1個体（Κ#4- 4- 41 ：キメラ率約 5 ) について (実施例 4) と同様に尻尾よりゲノム DMを調製した。それを铸型とし、（実施例 6) で示した 4番染色体解析用プライマ一のうち E14/#4- 7、 E14/#4-4で検出された多型性マ一力一 F11について PCR解析を行なった。その結果、 2個体とも期待される増幅産物が検出された。

(2) サザン解析（図 9 ) サザン解析は（実施例 2) と同様、 E14/#4-7由来の 1個体（K 4-7- 1 ：キメラ率約 5» についてヒト L1配列をプローブとして用い、 2 gの尻尾由来ゲノム DN Aに対して行なった。その結果、多数のヒ卜 L1配列の存在が認められ、そのパ夕 —ンは E14/#4-7と類似していた。マウスゲノムに対する量比は E14/#4- 7の約 10% 程度であった。図 9において、各レーンとも、 Bgl l l消化した 2〃gの尻尾由来ゲノム DNAを使用した。 ^{3 2} P標識ヒト L1配列をプローブとし、シグナルはィメ一ジアナライザ一 BAS2000 (富士写真フィルム社）により検出した。左側に DNA分. 子量を示した。各レーンは左から i ： K#4- 7- 1、 2：ブランク、 3 ： Ε14/#4-7 を示す。

(3) 尻尾由来繊維芽細胞の G418耐性試験

キメラマウスのうち、 E14/ 4- 7由来の 1個体（K - 7 - 1 ：キメラ率約 5¾) 、 E1 4/#4-4由来の 1個体（K#4- 4- 41 ：キメラ率約 5%) について尻尾から以下のように繊維芽細胞を調製した。 DNA調製（実施例 4) と同様にキメラマウスの尻尾を 5m π！〜 10mm切断し、 PBS/lmM EDTAで数回洗浄した後、メスで切れ込みをいれて表皮を除去し、内部の組織をメスで細かく切り刻む。組織細片を 5mlの PBS/lmM ED TAをいれたチューブに移し、 30分〜 1 時間室温静置する。その後、 1mlの PBS/ED TAを残して上清を取り除き、 1mlの 0. 25%トリプシン/ PBSを加え、 5〜10分間室温でタッビングあるいはピベッティングしながら組織をよくほぐす。 lOOOrpm, 10 分間遠心し、沈殿を 2mlの DMEM ( 10¾FCS) に懸濁し、 35誦シャーレに播種する。 7〜10日の培養後、トリプシン処理により細胞をシャーレからはがし、シャーレあたり約 10 '¹個の細胞を 35誦シャーレ 2枚に播種し、うち 1枚に終濃度 400 g/ mlの G418を加え、 5〜7日間培養し、それぞれのシャーレの生細胞を観察する。この条件で、野生型 ICRマウス由来の繊維芽細胞は、 G418存在下でほぼ 100¾死滅する。この結果、 2個体共 G418耐性の繊維芽細胞の存在が認められた。

これらの結果より、 E14/#4- 7、 E14/#4- 4はマウス個体において種々の正常組織に貢献し、かつヒト 4番染色体部分断片を保持していることが確認された。

(実施例 9) マウス ES細胞へのヒト 14番染色体またはその断片の導入

染色体供与細胞として、（実施例 1) で得られたヒト 14番染色体を保持するマウス A9細胞株（以下 A9/#14、という）を用いた。染色体受容細胞としてはマウス ES細胞株 TT2 (ライフテックオリエンタル社より購入、 Yagiら， Analytical Bioc hem. , 214:70， 1993) を用いた。 ΤΤ2の培養法はく相沢慎一，バイオマ二ユアルシリーズ 8，ジーンターゲティング，羊土社， 1995>に記された方法に従い、栄養細胞はマイトマ'イシン C (シグマ）処理した G418耐性初代培養細胞（ライフテックオリエンタル社より購人）を用いた。ミクロセル融合実験および G418耐性株の選択は（実施例 2) と同様に行なった。薬剤耐性株の出現頻度は ΤΤ2細胞 10 固あたり 3〜6個であった。薬剤耐性株の凍結保存、ゲノム DNA取得は（実施例 2) と同様に行なった。

ヒ卜 14番染色体の断片化はミクロセルにガンマ線照射することにより行なった

(Koiら， Science, 260:361, 1993) 。約 10⁸個の A9/#14より取得したミクロセルを 5mlの DMEMに懸濁し、ガンマセル 40 (前記）により、氷上で 30Gyのガンマ線を照射した（1.2Gy/分 X 25分）。ガンマ線照射したミクロセルを未照射ミクロセルと同様に融合、薬剤耐性株選抜を行なった結果、薬剤耐性株の出現頻度は TT2 細胞 10 個あたり 3個であった。薬剤耐性株については（実施例 2) と同様にして凍結保存、 DNA取得を行なった。

ガンマ線未照射ミクロセル移人による G418耐性株 1-4、 1-5、ガンマ線（30Gy ) 照射ミクロセル移入による G418耐性株 3-1、 3-2計 4株におけるヒト 14番染色体または部分断片の保持は以下の（1) 、 (2) により確認した。

( 1 ) PCR解析 (図 10)

薬剤耐性株ゲノム DNAを铸型としてヒト 14番染色体上に存在する遺伝子（O'Br ien, Genetic Maps, 6th edi tion, Book 5， Cold Spring Harbor Laboratory Pr ess, 1993 ) 及び多型性マーカー（Polymorphic STS Primer Pair BIOS社： D14 S43, D14S51, D14S62, D14S65, D14S66, D14S67, D14S72, D14S75, D14S78, Dl 4S81, PCI ； Nature 359:794, 1992； Nature Genetics, 7:22, 1994) の存在を PC R法により検出した。 GenBank、 EMBL等のデータベースより人手した塩基配列をもとに作製した遺伝子プライマ一ォリゴヌクレオチドの配列を記す。

NP (nucleoside phosphory lase) ： 5' -ATAGAGGGTACCCACTCTGG (配列番号 31), 5' -AACCAGGTAGGTTGATATGG (配列番号 32)

TCRA (T- ceil receptor alpha) ： 5' -AAGTTCCTGTGATGTCAAGC (配列番号 33)， 5 ' -TCATGAGCAGATTAAACCCG (配列番号 34)

MYH6 (myosin heavy chain cardiac) ： 5' -TGTGAAGGAGGACCAGGTGT (配列番号 35), 5' -TGTAGGGGTTGACAGTGACA (配列番号 36)

IGA2 (immunoglobulin alpha- 2 constant) ： 5' -CTGAGAGATGCCTCTGGTGC (配列番号 37). 5' -GGCGGTTAGTGGGGTCTTCA (配列番号 38)

IGG1 (immunoglobulin gamma- 1 constant) : 5' - GGTGTCGTGGAACTCAGGCG (配列番号 39)， 5' - CTGGTGCAGGACGGTGAGGA (配列番号 40)

IGM (immunoglobulin mu constant) ： 5' -GCATCCTGACCGTGTCCGAA (配列番号 41), 5' -GGGTCAGTAGCAGGTGCCAG (配列番号 42)

IGVH3 (immunoglobulin heavy variable- 3 ) ： 5' -AGTGAGATAAGCAGTGGATG ( 配列番号 4:3), 5' -GTTGTGCTACTCCCATCACT (配列番号 44)

☆

薬剤耐性株 4株のゲノム DNAを铸型として、上記の 18種のプライマ一について

(実施例 2) 同様に PCR増幅を行なった結果、全て、あるいは一部のプライマ一について期待される増幅産物が確認された。ガンマ線照射したミクロセルを用いて得られた薬剤耐性株 3-1、 3- 2は、 14番染色体の一部領域を欠失している傾向が認められた。また、未照射ミクロセルを用いた場合でも 1-4株のごとく欠失がみられるものもあった。以上の結果を図 10に示す。図 10において、左側にヒト 14 番染色体の Gバンド像に基づく模式的な染色体地図、また、位置が明らかになつているいくつかのマーカ一についてはどのバンドに位置するかを示した（実施例

2参照）。遺伝子及び多型性マ一カーの並び方は、現在までに人手出来る情報（実施例 2参照）を基に、大まかな位置関係を示したもので、順序は必ずしも正確ではない。 4種の G418耐性 TT2細胞株について、 PCRにより期待される増幅産物が検出されたマーカ一は酾で、検出されなかったマーカーを口で示した。 A9/#l

4 は染色体供与細胞である。右端には実施例 11 (1) の結果が示されている。

(2) フルォレツセンスインサイチューハイブリダィゼ一シヨン（FISH)

FISH解析は（松原ら， FISH実験プロトコ一ル、秀潤社、 1994) に記された方法に従い、ヒト 14番染色体特異的プローブ（CHROMOSOME PAINTING SYSTEM, Cambio 社）を用いて行なった。その結果、 4株すべてについてほとんどの分裂像に、ヒ卜 14番染色体あるいはその部分断片が、独立した染色体として観察された。観察されるヒト染色体の相対的な大きさは、 PCR解析の結果から推測されるそれと一致していた。

以上の実験により、. 得られた G418耐性株 1 -4、 1 -5、 3- 1、 3- 2はヒ卜 14番染色体の全てあるいはその部分断片を保持することが確かめられた。

(実施例 10) ヒ卜 H番染色体断片を保持する ES細胞からのキメラマウス作製 (実施例 9) で得られ、ヒ卜 14番染色体を保持していることが確認された G418 耐性 ES細胞株 4株（1 -4、 3-1、 3-2、 1 -5) を凍結ストックより立ち上げ、 1 CRあるいは MCH( I CR) (日本クレア社）雄雌マウスの交配により得られた 8細胞期胚に胚あたり 8〜10個注人した。 E S培地（実施例 9 ) で一晩培養して胚盤胞に発生させた後、偽妊娠処理後 2. 5日の仮親 I CRマウス（日本クレア社）の子宮に片側の子宮あたり約 10個のインジェクション胚を移植した。その結果を（表 3 ) に示す。表 3 . ヒ卜 14番染色体（断片）を保持する TT2 細胞株からのキメラマウス作製

ES細胞株/ G418耐性 ES細胞を注入し子マウスキメラマウス毛色への貢献率ヒト染色体株番号た 8細胞期胚数の数の数〜20¾ 20- 50% 50- 80%

ΤΤ2/#14 1-4 98 20

1-5 110 14

3-1 103 11

3-2 183 19

計 494個の注入胚を移植した結果、 64匹の子マウスが誕生した。キメラ個体は

、毛色において宿主胚（I CR) 由来の白色の中に TT2細胞由来の野生色（濃茶）が認められるかどうかにより判定される。誕生した 64匹のうち毛色に明らかに野生色の部分のある、すなわち、 ES細胞の貢献の認められる個体は 8匹であった。また、最高の貢献率は 1 -4由来の 1個体における約 80%であつた。

この結果より、ヒト 14番染色体またはその断片を保持する G418耐性 ES細胞株（卜 4、 1 -5, 3- 1、 3-2) はキメラ形成能を保持している、すなわちマウス個体の正常組織に分化する能力を保持していることが確認された。

(実施例 11) ヒト 14番染色体断片を保持する ES細胞由来キメラマウスにおけるヒ卜 14番染色体断片の保持確認

(実施例 10) で得られたキメラマウスにおけるヒ卜 14番染色体部分断片の保持は以下の（1) 〜（3) により確認した。

( 1) 各種組織由来 DNAを用いた PCR解析

キメラマウスのうち 3-1由来の i個体（K3- 1- 1 ：キメラ率約 25%) について（実施例 4) と同様に尻尾よりゲノム DNAを調製した。それを铸型とし、（実施例 9) で示した 14番染色体解析用ブライマ一のうち 3-1で検出された 14種全てについて PCR解析を行なった。その結果、 14種すべてについて期待される増幅産物が検出された（図 10) 。

さらに、同じ個体（K3- 1 - 1) について脳、腎臓、脾臓、心臓、肝臓、胸腺から Puregene DNA I so lat i on Ki tによりゲノム DNAを取得し、それぞれの組織について、 IGMプライマ一（実施例 9) を用いた PCR解析を行なった。その結果全ての組織において期待される増幅産物が確認された（図 11) 。 PCR産物は 2¾ァガロースゲルにて電気泳動した後、臭化工チジゥム染色して検出した。図 11において、各レーンは左から B：脳、 K：腎臓、 Sp：脾臓、 H：心臓、 L：肝臓、 Th：胸腺、 pc : ヒト繊維芽細胞（HFL-1) DNA (陽性コントロール）、 nc :非キメラマウス尻尾 DNA (陰性コントロール）、 M : マーカ一（Hi nd I I ^^l: ;i DNA + Hae H ! 消化 0 X174DNA, 宝酒造）を示す。

(2) 尻尾由来繊維芽細胞の G418耐性試験

キメラマウスのうち、 3-2由来の 2個体（K3- 2- 1 ：キメラ率約 25%, K3- 2- 3：キメラ率約 50%) 、 1 -4由来の 1個体（K1 - 4- 1 ：キメラ率約 80%) について尻尾から以下のように繊維芽細胞を調製した。 DNA調製（実施例 4) と同様に 3〜6週令のキメラマウスの尻尾を 5mm~ 10inm切断し、 PBS/lmM EDTAで数回洗浄した後、メスで切れ込みをいれて表皮を除去し、内部の組織をメスで細かく切り刻む。組織細片を 5miの PBS/lmM EDTAをいれたチューブに移し、 30分〜 1 時間室温静置する。その後、 1mlの PBS/EDTAを残して上清を取り除き、 1mlの 0. 25¾トリブシン ZPBSを加え、 5〜10分間室温でタッピングあるいはピベッティングしながら組織をよくほぐす。 1000'rpm, 10分間遠心し、沈殿を 2mlの DMEM ( 10¾FCS) に懸濁し、 35隱シャーレに播種する。 7〜10日の培養後、トリプシン処理により細胞をシャーレからはがし、シャーレあたり約 10 ¹個の細胞を 35MIシャーレ 4枚に播種し、うち 2枚に 400 / g/mlの G418を加え、 5〜7日間培養し、それぞれのシャーレの生胞数をカウントする。この条件で、野生型 I CRマウス由来の繊維芽細胞は、 G4 18存在下でほぼ 100¾死滅する。非選択培地での生細胞数に対する選択培地での生細胞数の割合は、 G418耐性繊維芽細胞の増殖速度が 2つの条件で同等であると仮定すれば、 G418耐性 ES細胞株由来繊維芽細胞の繊維芽細胞集団における貢献率を反映していると考えられる。この結果、（図 12) に示した通り、 3個体共 G418 耐性の繊維芽細胞の存在が認められた。図 12において、耐性率はそれぞれの個体について 2組の選択 Z非選択 35mniシャーレから得られた値を平均した。 I CR は野生型 ICRマウスを示す。

(3) 尻尾由来 G418耐性繊維芽細胞の F I SH解析

(実施例 2) と同様な方法で、上記（2) で得られた G418耐性繊維芽細胞（K3 - 2 - 3，K1 - 4- 1由来）の F ISH解析を行なった。プローブは HFい 1細胞（実施例 1) より抽出したヒト全 DMAを F ITC標識した（松原ら， F ISH実験プロ卜コール，秀潤社， 1 994) ものを用いた。その結果、 2個体共、ほとんどの分裂像に独立したヒ卜染色部分断片が観察された。

これらの結果より、ヒト 14番染色体部分断片を保持した TT2細胞株はマウス個体において種々の正常組織に貢献し、かつヒ卜 14番染色体部分断片を保持していることが確かめられた。

(実施例 12) ヒト 2番染色体部分断片の ES細胞への導入

染色体供与細胞として、（実施例 1) で得られたヒ卜 2番染色体部分断片を保持するマウス A9細胞 W23 (以下 A9/#2 W23、という）を用いた。染色体受容細胞としてはマウス ES細胞株 TT2 (実施例 9) を用いた。ミクロセル融合実験および G418耐性株の選択は（実施例 2 ) と同様に行なった。薬剤耐性株の出現頻度は TT2細胞 10 ' 個あたり 1〜3個であった。薬剤耐性株の凍結保存、ゲノム DNA取得は（実施例 2 ) と同様に行なった。薬剤耐性株 5-1、 5-2、 5- 3におけるヒ卜 2番染色体部分断片の保持は以下の（1) 、 (2) により確認した。

(1) PCR解析 ―'

薬剤耐性株ゲノム DNAを鋅型としてヒト 2番染色体上に存在する遺伝子（Gene tic Maps,前記）のうち、染色体供与細胞 A9/#2 W23において検出された C Λ；、 FABP1の存在を PCR法により検出した。

各プライマ一について PCR増幅を行なった結果、 3株共に、両方のプライマ— について期待される増幅産物が確認された。

(2) フルォレツセンス in situハイブリダィゼ一シヨン（FISH)

FISH解析は（実施例 2) と同様な方法で、ヒト 2番染色体特異的プローブ（CH R0 0S0 E PAINTING SYSTEM, Cambio社）を用いて行なった。その結果、 3株すベてのほとんどの分裂像において、ヒト 2番染色体部分断片が独立した染色体として検出された。その大きさは A9/#2 W23で観察されたものと同等であった。

以上の実験により、得られた G418耐性株はヒト 2番染色体部分断片を保持することが確かめられた。

(実施例 13) ヒト 2番染色体断片を保持する ES細胞からのキメラマウス作製

(実施例 12) で得られ、ヒト 2番染色体部分断片を保持していることが確認された G418耐性 ES細胞株 5- 1を凍結ス卜ックより立ち上げ、 ICRあるいは MCH(ICR) (日本クレア社）雄雌マウスの交配により得られた 8細胞期胚に胚あたり 10〜12 個注人した。 E S培地（実施例 9) で一晩培養して胚盤胞に発生させた後、偽妊娠処理後 2.5日の仮親 ICRマウス（日本クレア社）の子宮に片側の子宮あたり約 10個のィンジヱクション胚を移植した。

キメラ作製の結果を（表 4) に示す。表 4. ヒト 2番染色体（断片）を保持する TT2 細胞株からのキメラマウス作製

ES細胞株/ G418耐性 ES細胞を注入し子マウスキメラマウス毛色への貢献率ヒ卜染色体株番号 ' た 8細胞期胚数の数の数〜20% 20- 50¾ 50- 80¾

TT2/#2 5-1 264 51 18

(W23)

計 264個の注入胚を移植した結果、 51匹の子マウスが誕生した。キメラ個体は、毛色において宿主胚 GCR) 由来の白色の中に TT2細胞由来の野生色（濃茶）が認められるかどうかにより判定される。誕生した 51匹のうち毛色に明らかに野生色の部分のある、すなわち、 ES細胞の貢献の認められる個体は 18匹であった。また、最高の貢献率は約 80%であった。 7

この結果より、ヒト 2番染色体部分断片を保持する G418耐性 ES細胞（5-1) は

5

キメラ形成能を保持している、すなわちマウス個体の正常組織に分化する能力を保持していることが確認された。 6

(実施例 14) ヒ卜 14番染色体断片導入キメラマウス血清におけるヒト抗体重鎖の検出

血清中のヒ卜抗体濃度をェンザィムリンクドィ厶ノソルベントァッセィ（EUSA ) を用いて測定した。 ELISA は以下に記載されている方法に従った。富山 ·安東、単クローン抗体実験マニュアル、講談社、 1987; 安東 ·千葉、単クローン抗体実験操作入門、講談社、 1991; 石川、超高感度酵素免疫測定法、学会出版センタ一、 1993； Ed Harlow and David Lane, Antibodies A Laboratory Manual, Col d Spring Harbor Laboratory, 1988; A. Doyle and J. B. Griffiths, Cell & Ti ssue Culture: Laboratory Procedures, John Wiley & Sons Ltd., 1996 ₀ これらの文献に記載の方法を参考にして、測定系によっては反応時間や温度を 4 で終夜行うなどの改良を行つた。測定しょうとするヒト免疫グ口ブリンに対する抗体あるいは抗原を、 0.5 から 10 zg/ml程度に（100から 5000倍）に希釈し、 ELISA プレートを 4 °Cで一晚コーティングした。血清試料の測定では、ブロッキング、試料および標識抗体の希釈に 5%マウス血清（シグマ、 M5905)を添加した PBSを、ハイプリドーマ培養上清の測定には 1%牛胎児血清を添加した PBSを用いた。 20倍にキメラマウス血清を希釈する場合には PBSを用いて希釈した。コーティングしたプレートを洗浄した後、ブロッキングを 1時間以上行つた。プレー卜を洗浄後、試料を加え 30分以上インキュベートした。プレート洗浄後 100 から 5000倍に希釈した酵素標識抗ヒ卜免疫グロプリン抗体を加えて、 1時間以上ィンキュベ一.トした後、プレートを洗浄し基質液を加えて発色させた。また測定系によって、基本的には同じ操作で、ピオチン標識した抗体を用い、プレート洗浄後これにアビジン一酵素複合体を加えてィンキュベートした後洗浄し基質液を加えた。マイク口プレートリーダ一（バイオテック、 EL312e) で吸光度を測定した。

生後 29日から 35日のキメラマウス（実施例 10、 K3-1-2, K3-2-2, K3-2-3) より採血し EUSAで解析した。 50mMの炭酸一炭酸水素バッファ一 pH9.6で希釈した抗ヒト IgMマウスモノクローナル抗体（シグマ， 16385) を 96穴マイクロタイ夕ープレー卜にコーティングし、マウス血清（シグマ、 M5905) を加えた PBSで希釈した血清試料を加えた。次いでペルォキシダーゼ標識抗ヒト IgMャギ抗体（Tago，2 392)を加えてインキュベートした後、 ABTS基質（Kirkegaard & Perry Laborator ies Inc., 506200) の添加により酵素活性を 405nmの吸光度で評価した。精製されたヒト IgM抗体（オルガノン ' テク二力， 6001-1590 ) またはヒト IgG抗体（シグマ， 14506)を標準とした。標準はマウス血清を添加した PBSで段階的に希釈した。またヒ卜 IgG測定には抗ヒト IgGャギ抗体（シグマ， 13382) をプレートに固定し、ペルォキシダーゼ標識抗ヒ卜 IgGャギ抗体（シグマ， A0170) で検出した。その結果を（表 5 ) に示す。ヒト IgMと IgGは共に検出された。

また生後 27日、 34日、 41日の 3回にわたりヒト 14番染色体断片を保持したキメラマウス（実施例 10、 K3-1-1, K3-2-1) に、 PBSに溶解したヒト血清アルブミン

(HSA，シグマ， A3782) 2mlをアジュバント（MPL+TDM Emulsion, RIBI Immunoche m Reseach Inc. ) と混合しその 0.25mg/ml を 0.2 mlを免疫した。このキメラマウス血清も同様に EL1SAによって解析した。その結果を（図 13、図 14) に示す。結果は、 HSAで免疫したキメラマウス血清中のヒ卜抗体濃度は免疫後上昇し、個体 K3- 1-1ではヒト lgM18^g/mlと IgG2. が免疫後 17日目の血清中に検出された。ヒト染色体を導人していないマウスの血清ではヒ卜抗体の力価は有意ではなかった。表 5. キメラマウス血清中のヒト抗体濃度（EL1SA) キメラマウス I G (mg/1) IgM (mg/1)

(実施例 15) ヒト 14 番染色体導入キメラマウスからのヒト抗体重鎖産生ハイプリドーマ取得

(実施例 14) においてヒトアルブミンで免疫したキメラマウス（K3- 1-1，実施例 14) から生後 44日目に脾臓を取り出し、ミエローマ細胞と細胞融合し、ハイブリド一マを作製した。ハイプリドーマの作製法はく安東、単クローン抗体実験操作人門、講談社サイェンティフイク， 1991〉に記された方法に従い、ミエ口一マ細胞としては、 P3X63- Ag.8.653 (大日本製薬より購人、 05-565) を使用した。 96 穴プレート 10枚にまき込み、 1週間培養後培養上清を ELISA法で解析した。 EL1S

A法は抗ヒ HgMマウスモノクローナル抗体（シグマ、 16385) をプレートに固定化して実施例 14と同様に行ない、陽性のクローンを 6個得た。また HSAを抗原とし 50mMの炭酸一炭酸水素バッファー pH9.6で濃度 5〃g/mlの溶液とし、 ELISA プレー卜の全ゥエルに 100/ 1づっ分注した。ペルォキシダ一ゼで標識した抗ヒト IgA+IgG+IgMャギ抗体 (Kirkegaard & Perry Laboratories Inc. , 04-10-17) を用いて検出した。プレート 10枚中陽性のクローンを 1つ確認した。このクロ一ンは 6個のヒト igM陽性クローンのうちの 1つであつた。このクローン（H4B7) をさらに培養し、培養上清を希釈し HSAを抗原として上述のようにペルォキシダーゼ標識抗ヒ卜 I gMャギ抗体（Tago, 2392) を用いて EL ISAを行なったところ、培養上清の希釈率の増加にともなって吸光度の減少が認められた。一方ヒト l g (オルガノン ' テク二力， 6001 - 1590)を培地によって 2 ^ g/mlに希釈した試料では希釈率によらず吸光度は低かった。これはハイプリドーマ H4B7が生産する抗体が HSAに特異性のある抗体であることを示唆するものである（図 15) = 図 15において、横軸は培養上清試料の希釈率を縦軸は 405nmにおける吸光度'

(実施例 16) G418耐性マーキングされたヒト 2番染色体断片のピューロマイシン耐性による再マーキング

G418耐性で標識されたヒト 2番染色体断片を保持する A9細胞（W23) ( 実施例 1 、図 1参照）を iOOnrniシャーレで G418 (800 z g/ml ) を含む選択培地（10% FBS 、 DMEM) で培養した。ピューロマイシン耐性遺伝子を含むプラスミド pPGKPuro

(WH ITEHEAD I NSTITUTE, Dr. Pe ter W. La i rd から分与）をトランスフヱクシヨン前に制限酵素 Sai l (宝酒造）で線状化した。細胞をトリプシン処理し、 5x10 ^s 個 /mlとなるようにダルベッコのリン酸バッファ一（PBS) に懸濁してから 10 gD NA存在下でジーンパルサー（バイオラッド）を用いてエレクト口ポレーシヨン（実施例 1参照）を行なった。 25 / Fの容量で 1000Vの電圧を 4 mm長のエレクトロポレーシヨンセル（実施例 1 ) を用いて室温で印加した。エレクトロボレ一ションした細胞を 100mmシャーレ 3〜6枚に播種した。 1 日後に 10〃 g/mlのピュー口マイシン（シグマ， P- 7255) および G418 (800 ^ g/ml ) を含む二重選択培地と置き換えた。 2〜3週間後に生じたコロニー 200個程度を一つの集団としてまとめた。この細胞を 3つの集団についてそれぞれ 25cm²フラスコ 2〜 3本中で培養し、ミクロセルを形成させ 25cm²フラスコで培養したマウス A9細胞と実施例 1と同様に融合した。 100議シャーレ 2枚に移し G418とピューロマイシンを含む上記の二重選択培地で培養し、 3つの集団のうち 1つの集団から 2つの二重薬剤耐性クローンが得られた。このクローンではヒト 2番染色体断片にピュー口マイシン耐性マーカ一が導人された可能性が高い。

(実施例 17) ヒト染色体導入 ES細胞における導入ヒト染色体倍加

G418耐性遺伝子でマーキングされたヒト 14番染色体断片を保持する ES細胞株 ( E 14/# 14-36 ) を、高濃度の G418を添加した培地中で培養することにより、ヒト染色体が倍化した ES細胞のクローンを取得した（バイオマニュアルシリーズ 8、ジ —ン夕一ゲティング、羊土社、 1995) 。 G418耐性マウス初代細胞（ライフテックオリエンタルより購—入）をマイトマィシン処理することなく I OOIMIシャーレに播種し栄養細胞とした。この 100mmシャーレに E 14/# 14- 36 を播種し、半日後 G418 濃度 I 6 m g/mlの培地と交換した。 1〜2日毎に培地交換し 1週間後に G418 濃度を 10 m g/m lとして培養を続け、生じたコロニーの中から 15個を取り出し培養し、染色体をヒ卜 14番特異的プローブ（実施例 9参照）を用いて F I SH解析した。結果として 8 クローンでヒ卜 14番染色体断片が倍化していた。

(実施例 18) ヒト 2番染色体部分断片及び 14番染色体部分断片を同時に保持するマウス ES細胞株の取得

(実施例 16) において取得した二重薬剤耐性クローンのうち PG1をミクロセル供与細胞、野性型 A9細胞を受容細胞としたミクロセル移入実験により、 PG 1が保持するヒト 2番染色体部分断片がさらにピュー口マイシン耐性遺伝子によりマ一キングされていることを確認した。ミクロセル取得及び A9細胞との融合は（実施例 1 ) と同様に行なった。その結果、ミクロセル融合 10曰後に計 59個の G418耐性コロニーが出現した。これらのコロニーについて 8〃 g/mlのピュー口マイシンを含む培地に交換後、さらに 3日間培養したところ、 45個（76%) のコロニーが生存した。ミクロセル法においては、 1つの受容細胞に、多くの場合 1本あるいは少数の染色体のみが移入されることから、両耐性遺伝子が高率に同時に移入されることは、すなわち、 PG1が保持する G418耐性標識されたヒト 2番染色体部分断片がピューロマイシン耐性遺伝子によりマ一キングされていることを示している。さらに、ヒト 2番染色体部分断片上の各マーカー遺伝子検出のため、 A9/#2 W2 3 (G418耐性のみ：実施例 16) については pSTneoB (実施例 1 ) 、 PG 1については pPGKPuro (実施例 16) をプローブとした F I SH解析を行なった（松原ら， F I SH実験プロトコ一ル，秀潤社， 1994) 。その結果、 A9/#2 W23では（実施例 12) で確認されたヒト 2番染色体部分断片のそれぞれの姉妹染色分体上に 1個づつ、計 2 個のシグナルが観察された。これは、ヒト 2番染色体部分断片上の 1箇所に pSTn eoBが挿入されていることを示す。また、 PG1では同等の大きさの染色体断片上に計 4個のシグナルが観察された。 pSTneoBと pPGKPuroはべクター部分で相同の配列を持つので、 pPGKPuroプローブでは pSTneoBも検出される。すなわち、 PG1 で観察された 4個のシグナルのうち、 2個は pSTneoB、一方の 2個は pPGKPuro由来のシグナルと考えられる。この結果より、 PG1が保持するヒト 2番染色体部分断片は、 G418耐性、ピューロマイシン耐性両者によりマ一キングされていることが確認された。

ヒ卜 2番染色体部分断片、 14番染色体部分断片を同時に保持するマウス ES細胞取得のため、染色体供与細胞としてこの PG1細胞株を用いた。染色体受容細胞としてはすでにヒ卜 14番染色体部分断片を保持している G418耐性 TT2細胞株 1 -4 ( 実施例 9) を用いた。ミクロセル融合実験およびピューロマイシン耐性株の選択は 0. 75 g/mlのピューロマイシン濃度で他は（実施例 9) の G418耐性株選択の場合と同様に行なった。この結果出現したピュー口マイシン耐性株の出現頻度は i - 4細胞 10⁷個あたり 3〜7個であった。これらのピュー口マイシン耐性株は 300 g/mlの G418存在下でも増殖することから G418耐性も同時に保持していることが確認された。二重薬剤耐性株の凍結保存、ゲノム DNA取得は（実施例 2) と同様に行なった。ヒト 2番染色体部分断片及び、ヒト 14番染色体部分断片の保持は二重薬剤耐性株 PG5、 PG15、 PG16については以下の（1) により、 PG15についてはさらに（2) により確認した。

( 1) PCR解析

二重薬剤耐性株ゲノム DNAを铸型としてヒト 2番、 14番染色体上に存在する遺伝子（Gene t i c Maps,前記）のうち、 2番染色体については（実施例 12 ； A9/S2 W23) 、 14番染色体については（実施例 9 ； TT2/#14 1-4) で存在が確認されている各プライマ一について PCR増幅を行なった結果、 3株共に、全てのプライマ一について期待される増幅産物が確認された。

(2) フルォレツセンス i n s Uuハイブリダィゼーシヨン（F ISH)

F ISH解析は（実施例 11) と同様に、ヒト全 DNAを F 1TC標識したものをプローブとして用いて行なった。その結果、ほとんどの分裂像において、大小 2つのヒ卜染色体断片が確認された。大きい方は（実施例 9； TT2/#14 1 -4) でヒ卜 14番染色体特異的プローブにより確認された部分断片と、小さい方は（実施例 12 ; ΤΤ2/ =2 5- 1 ) でヒ卜 2番染色体特異的プローブにより確認された部分断片と同等の大きさであった。（図 16) にその結果を示す。図中輝度の低い染色体はマウス由来のもの、 F ITCの蛍光により輝度の高い大小 2つの染色体断片（矢印にて指示）はヒト由来のものであり、それぞれヒト 14番、 2番染色体部分断片と考えられる。以上の実験により、得られた二重耐性 ES細胞株はヒト 2番染色体部分断片、 14 番染色体部分断片を同時に保持することが確かめられた。

(実施例 19) ヒ卜 2番染色体部分断片及び 14番染色体部分断片を同時に保持するマウス ES細胞株からのキメラマウス作製

(実施例 18) で得られ、ヒト 2番染色体部分断片及び 14番染色体部分断片を保持していることが確認された G418、ピューロマイシン二重耐性 TT2細胞株 PG5、 PG15、 PG16を凍結ストックより立ち上げ、 I CRまたは MCH ( R) (日本クレア社）雄雌マウスの交配により得られた 8細胞期胚に胚あたり 10〜12個注人した。 ES細胞用培地（実施例 9) で一晩培養して胚盤胞に発生させた後、偽妊娠処理後 2. 5 日の仮親 I CRマウス（日本クレア社）の子宮に片側の子宮あたり約 10個のインジヱクション胚を移植した。

キメラ作製の結果を（表 6 ) に示す。表 6 . ヒ卜 2番染色体部分断片及び 14番染色体部分断片を同時に保持するマウス ES細胞株からのキメラマウス作製

ES細胞株/ 2重耐性 ES細胞を注入し子マウスキメラマウス毛色への貢献率ヒト染色体株番号た 8細胞期胚数の数の数〜10% 10- 50% 50 〜

TT2/ PG5 160 26 8

#14+#2 PG15 168 15 3

PG16 223 32 12 計 551個の注入胚を移植した結果、 73匹の子マウスが誕生した。キメラ個体は、毛色において宿主胚 OCR) 由来の白色の中に TT2細胞由来の野生色（濃茶）が認められるかどうかにより判定される。誕生した 73匹のうち毛色に明らかに野生色の部分のある、すなわち、 ES細胞の貢献の認められる個体は 23匹であった。この結果より、ヒト 2番染色体部分断片及び 14番染色体部分断片を保持する ES 細胞株（PG5、 PG15、 PG16) はキメラ形成能を保持している、すなわちマウス個体の正常組織に分化する能力を保持していることが確認された。

(実施例 20) ヒト 2番染色体部分断片及び 14番染色体部分断片を同時に保持する

ES細胞由来キメラマウス血清におけるヒト抗体の検出

(実施例 19) で作製したキメラマウスのうち、 KPG- 15 (9週齢； PG5由来、キメラ率 10 ) 、 KPG-18 (5週齢： PG5由来、キメラ率 10%) の 2匹に対して、 PB

Sに溶解したヒト血清アルブミン（HSA、シグマ、 A3782) とアジュバント（MP

L!TDM Emulsion, RIBI Immunochem Reseach Inc. ) とを混合して 0.25mg/mlの HS

A溶液を調整し 0.2mlを免疫した。免疫直前、及び 8日後のキメラマウスより採血し、血清中のヒ卜抗体鎖およびヒト抗体/ 鎖を ELISA法を用いて検出した（実施例 14参照）。 50mMの炭酸一炭酸水素バッファー pH9.6で希釈した抗ヒト抗体鎖ャギ抗体（VECTOR LABORATORIES, INC.. AI-3060) を 96穴マイクロタイタ一プレートにコーティングし、血清試料を加え、次いでピオチン標識抗ヒト抗体 c 鎖ャギ抗体（VECTOR LABORATORIES, INC.. BA-3060) を加えてインキュベートしさらにピオチン化ヮサビペルォキシダ一ゼとアビジン DHの複合体（VECTOR LABOR

ATORIES, INC. , Vectastain ABCキッ卜 PK4000) を加えてインキュベートした後、ペルォキシダ一ゼ基質として 3, 3',5, 5'-テトラメチルベンチジン（TMBZ、住友べ一クライト、 Mい 1120T) の添加により酵素活性を 450nmの吸光度で評価した。精製された /c鎖を持つ濃度既知のヒ卜 igG (シグマ、卜 3889) を標準としマウス血清を添加した PBSで段階的に希釈した。鎖については 50mMの炭酸一炭酸水素バッファー ρΗ9· 6で希釈した抗ヒト //鎖マウスモノクローナル抗体（シグマ、 1-63

85) を 96穴マイクロタイ夕一プレートにコ一ティングし、血清試料を加え、次いでペルォキシダ一ゼ標識抗ヒ卜鎖マウス抗体（The Binding Si te Limited, M

P008) を加えてインキュベートした後、 TMBZ (住友べ一クライト、 Mい 1120T) の添加により酵素活性を 450nmの吸光度で評価した。精製された//鎖を持つ濃度既知のヒト IgM (オルガノン ·テク二力、 600卜 1590) を標準としマウス血清（シグマ、： V15905) を添加した PBSで段階的に希釈した。その結果、 2個体とも免疫前においてヒト抗体 /鎖、 /c鎖両者が検出され、その血清中濃度は、免疫後上昇した（表 7、表 8 ) 。表 7. キメラマウス K P G 1 5中のヒト抗体濃度（E L I S A)

I gM (m gZ l ) I g κ (m g/ 1 ) 免疫前 0. 1 9 1. 6

免疫後 8日目 0. 7 5 1. 7

表 8. キメラマウス K P G 1 8中のヒト抗体濃度（ E L I S A )

I g M (m g/ 1 ) I g K (mg/ 1 ) 免疫前 0. 2 9 0. 5 7 免疫後 8日目 3. 4 0. 8 7

この結果より、ヒト 2番染色体部分断片及び 14番染色体部分断片を保持する ES 細胞由来キメラマウスにおいてヒト抗体重鎖、軽鎖遺伝子は機能することが確認された。

(実施例 21) ヒ卜 14番染色体断片導入キメラマウス血清における抗 HSAヒト抗体ァ鎖の検出

(実施例 10) と同様にして作製したヒト 14番染色体断片を保持したキメラマウス（K9、 Kll；共に ΤΤ2細胞株 3-2由来、キメラ率はそれぞれ 50?ό、 30¾) に対して、生後 79日、 93日、 107日、 133日の 4回（Κ9) 、または生後 74日、 88日、

111日（K11) の 3回にわたり（実施例 20) と同様に HSAを免疫した。このキメラマウス血清中のヒ卜血清アルブミンに対するヒトァ鎖を含む抗体を EL 1 SA法によって検出した（実施例 14参照）。 50mMの炭酸一炭酸水素バッファー pH9. 6で希釈した HSA (シグマ、 A 3782) を 96穴マイクロ夕イタ一プレートにコ一ティングし、試料を加え、次いでペルォキシダーゼ標識抗ヒ卜 I gGマウス抗体（ファーミンジヱン、 08007E) を加えてインキュベートした後、ペルォキシダ一ゼ基質として 0—フヱニレンジァミン（0PD、住友ベークライト、 Mい 11300) の添加により酵素活性を 490nmの吸光度で評価した。 HSAで免疫したキメラマウス血清中の抗. HSAヒト I gGの力価は免疫後上昇した。対照 ICRマウスでは、 HSA免疫後の抗 HS Aヒト I gGの力価はバックグランドレベルであった。結果を（図 17) に示した。図 17において横軸はキメラマウスに HSAを免疫してからの日数を、縦軸は 490nm における吸光度を示した。この結果より、ヒト 14番染色体部分断片を保持するキメラマウスにおいて、 HSA抗原刺激に対して抗原特異的ヒト I gGの抗体価上昇が起こることが確認された。

(実施例 22) ヒ卜 22番染色体断片導入キメラマウス血清におけるヒト抗体； I鎖の検出

9ヶ月齢のキヌラマウス（実施例 3、 K22-7；キメラ率 10%) より採血し、血清中のヒト抗体；鎖を EL 1 SA法を用いて検出した（実施例 14参照）。 50mMの炭酸炭酸水素バッファ一 pH9. 6で希釈した抗ヒ卜抗体 λ鎖ャギ抗体（VECTOR LABOR ATOR I ES, INC. , A I -3070) を 96穴マイクロタイタープレートにコーティングし、血清試料を加え、次いでピオチン標識抗ヒト抗体； I鎖ャギ抗体（VECTOR LAB0RAT OR I ES, INC. , ΒΑ-3070) を加えてインキュベートしさらにピオチン化ヮサビペルォキシダ一ゼとアビジン DHとの複合体（VECTOR LABORATOR I ES, INC. , Vec tas tai n ABCキット ΡΚ4000) を加えてインキュベートした後、ペルォキシダ一ゼ基質として TMBZ (住友べ一クライ卜、 Mい 1120T) の添加により酵素活性を 450nmの吸光度で評価した。精製された； I鎖を持つ濃度既知のヒト I gG (シグマ、 1 -4014) を標準としマウス血清を添加した PBSで段階的に希釈した。 180ng/mlのヒト I gGに相当する濃度のヒト抗体； I鎖がキメラマウス中に検出された。この結果より、ヒト 22番染色体を保持するキメラマウスにおいてヒト抗体; I鎖遺伝子が機能することが確認された。 (実施例 23) ヒト 2番染色体断片導入キメラマウス血清におけるヒト抗体/ 鎖の検出

5週齢のキメラマウス（実施例 13、 1(2-8、キメラ率は 70¾) および 9週齢のキメラマウス（実施例 13、 K2- 3、 K2-4、 K2-12, キメラ率はそれぞれ 50¾、 20¾, 80¾) より採血し、血清中のヒト抗体/ c鎖を ELISA法を用いて検出した（実施例 14) 。 50πιΜの炭酸一炭酸水素バッファー ρΗ9.6で希釈した抗ヒ卜抗体鎖ャギ抗体（VECTOR LABORATORIES, INC. , ΑΙ-3060) を 96穴マイクロタイタープレートにコ一ティングし、血清試料を加え、次いでピオチン標識抗ヒト抗体/ c鎖ャギ抗体 (VECTOR LABORATORIES, INC. , ΒΑ-3060) を加えてインキュベートしさらにピオチン化ヮサビペルォキシダ一ゼとアビジン DHの複合体（VECTOR LABORATORIES, IN 、 Vectastain ABCキット）を加えてインキュベートした後、 TMBZ (住友べ一クライト、 Mい 1120T) の添加により酵素活性を 450nmの吸光度で評価した。精製された鎖を持つ濃度既知のヒト IgG (シグマ、 1-3889) を標準としマウス血清を添加した PBSで段階的に希釈した。結果を（表 9) に示した。表 9. キメラマウス中のヒト抗体/ c鎖濃度（E L I SA)

キメラマウス Ig c (m gZ 1 )

K 2 - 3 1 2 4

Κ 2 - 4 8 5

Κ 2 - 8 2 5

Κ 2 - 1 2 5 6

またヒト 2番染色体断片を保持したキメラマウス（実施例 13、 Κ2- 3、および Κ2

-4) に生後 66日、 80日、 102日の 3回にわたり（実施例 20) と同様に HSAを免疫した。またキメラマウス（Κ2- 12) に生後 63日、 77日、 91日、 116日の 4回にわたり、このキメラマウス血清中の HSAに対するヒト抗体/ 鎖を ELISA法によって検出した（実施例 14参照）。 50mMの炭酸一炭酸水素バッファー ρΗ9.6で希釈した HSA (シグマ、 A 3782) を 96穴マイクロタイ夕一プレー卜にコ一ティングし、試料を加え、次いでビォチン標識抗ヒ卜抗体/ 鎖ャギ抗体（VECTOR LABORATORIES, INC.、 BA-3060) を加えてインキュベートしさらにピオチン化ヮサビペルォキシダ一ゼとアビジン DHの複合体 (VECTOR LABORATORIES, INC. , Vectastain ABCキット）を加えてインキュベートした後、ペルォキシダ一ゼ基質として 0PD (庄友べ —クライト、 ML - 11300) の添加により酵素活性を 490nmの吸光度で評価した。 HS Aで免疫したキメラマウス血清中の抗 HSAヒト / c鎖の力価は免疫後上昇した ₃ — 方対照 ICRマウスでは、 HSA免疫後の抗 HSAヒト抗体/ 鎖の力価はバックグランドレベルであった。結果を（図 18) に示した。図 18において横軸はキメラマウスに HSAを初めて免疫してからの日数を、縦軸は 490nmにおける吸光度を示した。これらの結果より、ヒ卜 2番染色体部分断片を保持するキメラマウスにおいてヒ卜抗体/ c鎖遺伝子が機能し、さらには HSA抗原刺激に対して抗原特異的ヒ卜 ig の抗体価上昇が起こることが確認された。

(実施例 24) ヒト 14番染色体導人キメラマウスからのヒ卜抗体重鎖（鎖もしくは Ί鎖）産生ハィブリド一マ取得

(実施例 21) において HSAで免疫したキメラマウス K9から生後 136日目に脾臓を取り出し、ミエローマ細胞と細胞融合し、ハイプリドーマを作製した。ハイブリドーマの作製法はく安東 ·千葉、単クローン抗体実験操作人門、講談社サイェンティフイク， 1991〉に記された方法に従い、ミエローマ細胞としては、 Sp- 2/0 -Agl4 (大日本製薬、 05-554) を使用した。培養液に ORIGEN Hybridoma Cloning

Factor (HCF、ボクスィ * ブラウン）を 10%添加し 96穴プレー卜 8枚にまき込み、 3日後に培養液中に G418を lmg/ml添加した。 1〜3週間培養後の培養上清を

ELISA法で解析した（実施例 14参照）。鎖は 50mMの炭酸一炭酸水素バッファー pH9.6で希釈した抗ヒト〃鎖マウスモノクローナル抗体（シグマ、卜 6385) を 96 穴マイクロタイタープレー卜にコーティングし、 PBSで希釈した試料を加え、次いでペルォキシダーゼ標識抗ヒト〃鎖マウス抗体（The Binding Site Limited, P008) を加えてインキュベートした後、基質として 2， 2—アジノジ一（3—ェチルベンズチアゾリン- 6-スルホン酸）ジアンモニゥム塩（ABTS、 Kirkegaard&P erry Laboratories Inc.、 04-10-17) を用いて検出し 7個の陽性ゥヱルを得た。ァ鎖については抗ヒ卜ァ鎖マウスモノクローナル抗体（シグマ、卜 6260) を 96穴マイクロタイタープレートにコーティングし、 PBSで希釈した試料を加え、次いでペルォキシダーゼ標識抗ヒトァ鎖マウス抗体（ファーミンジヱン、 08007E) を加えてインキュベートした後、 ABTS (K i rkegaard & Perry Labora tor i es I nc. 、 04-10-17) を用いて検出し 2個のヒト抗体ァ鎖陽性ゥエルを得た。

(実施例 25) ヒ卜 2 番染色体導入キメラマウスからのヒ卜抗体軽鎖産生ハイプリド一マ取得

(実施例 23) において HSAで免疫したキメラマウス K2- 3から生後 105日目に脾臓を取り出し、ミエローマ細胞と細胞融合し、ハイプリドーマを作製した。ハイプリドーマの作製法は〈安東 ·千葉、単クローン抗体実験操作人門、講談社サイェンティフイク， 1991〉に記された方法に従い、ミエ口一マ細胞としては、 P3X6 3Ag8. 653 (大日本製薬、 05-565) を使用した。培養液に HCF (ポクスィ，ブラウン）を 10¾添加し 96穴プレート 10枚にまき込み、 3日後培養液中に G418を lmg/ml 添加し、 1〜3週間培養しコロニーが出現したゥヱルの培養上清を EL ISA法で解折した。 EL ISA法は（実施例 23) と同様に行ない、ヒト抗体/ c鎖陽性のクローンを 2個得た。

(実施例 26) G418耐性マーキングされたヒ卜 22番染色体のピューロマイシン耐性による再マーキング

G418耐性で標識されたヒト 22番染色体を保持する A9細胞（A9/#22 7 2；実施例

1で取得）について、（実施例 16) と同様な方法でヒ卜 22番染色体のピューロマイシン耐性による再マーキングを行った。ァ 2細胞に pPGKPuroをエレク卜ロボレ

—シヨンして得られた二重薬剤耐性株コロニー 200個程度を一つの集団とし、 3 つの集団（Pl、 P2、 P3) を供与細胞として野生型マウス A9細胞へのミクロセル移入を行なった。その結果、 P1より 6個、 P2より 1個、 P3より 3個の二重薬剤耐性クローンが得られた。取得した二重薬剤耐性クローンのうち P3由来の 6 - 1をミクロセル供与細胞、野性型 A9細胞を受容細胞としたミクロセル移入実験により、ヒ卜 22番染色体がさらにピュー口マイシン耐性遺伝子によりマ一キングされていることを確認した（実施例 18) 。ミクロセル取得及び A9細胞との融合は（実施例 1) と同様に行なった。その結果、ミクロセル移入 11日後に 28個の G418耐性コロニーが出現した。これらのコロニーについて 8 ig/mlのピュー口マイシンを含む培地に交換した後、さらに 3日間培養したところ、 21個（75» のコロニーが生存した。ミクロセル法においては、 iつの供与細胞に、多くの場合 1本あるいは少数の染色体のみが移入されることから、両耐性遺伝子が高率に同時に移入されることは、すなわち、 6-1が保持する G418耐性標識されたヒト 22番染色体がさらにピユーロマイシン耐性遺伝子によりマ一キングされていることを示している。

(実施例 27) ヒト抗体重鎖を産生するハイプリドーマからのヒト抗体重鎖可変領域 cDNAの取得及び塩基配列決定

(実施例 15) において取得されたヒト抗体重鎖（I ）を産生するハイプリド一マのうち、 H4B7 (HSA特異的）及び H8F9 (非特異的）より、 iSOGEN (二ツボンジーン）を使用して、総 RNAを取得した。 cDNAの合成は、 Ready- To-Go T- primed

1st strandキット（Pharmacia社）を用い各々 5 gの総 RNAを使用した。得られた cDNAについて下記に示したプライマー（Larrickら， BIO/TECHNOLOGY, 7，

934 -， 1989、 Wordら, Int. Immunol. , 1， 296-, 1989を参考に作製) により PC Rを行ない、ヒト抗体重鎖可変領域を増幅した。

CM1 (ヒト IgM定常領域）： 5' -TTGTATTTCCAGGAGAAAGTG (配列番号 4 5 )

CM2 (同上) ： 5' -GGAGACGAGGGGGAAAAGGG (配列番号 4 6 )

HS1 (ヒト重鎖可変領域）： 5' -ATGGACTGGACCTGGAGG(AG)TC(CT)TCT(GT)C (配列番号 4 7 ) (8種の混合物）

HS2 (同上) ： 5' -ATGGAG(CT)TTGGGCTGA(GC)CTGG(GC)TTT(CT)T (配列番号 4 8 ) (16種の混合物）

C)CT(CT)CTG (配列番号 4 9 ) (6144種の混合物)

* ( )はその位置の塩基が（）内のいずれかからなる混合物であることを示す。

H4B7、 H8F9共に、 1回目の PCRは HS1 X CM1、 HS2XCMK HS3XCM1の 3種

のプライマーの組み合わせについて行い（94°C 1分、 50°C 2分、 72°C 3分、 40サィクル、パーキンエルマ一社、サ一マルサイクラ一 140使用）、その PCR産物をそれぞれ HS1XCM2、 HS2 x CM2_N HS3 x CM2のプライマ一で再度増幅した（温度条件は前記同様、 30サイクル）。増幅産物は 1.5%ァガロース電気泳動後、臭化ェチジゥム染色することにより検出した。その結果、 H4B7については HS3X 12 のプライマ一で約 490bpの增幅産物が確認された。また、 H8F9については、 HS3 X CM2プライマ一で微かなバンドが同様の位置に確認されたのでこのプライマ一で再度増幅した（温度条件は前記同様、 30サイクル）。その結果、増幅産物は非常に強いシグナルとして検出された。これらの PCR産物は、石田ら（遺伝子発現実験マニュアル、講談社サイェンティフイク、 1995) の方法に従い、 pBlueScrip tl I SK+ (Stratagene社）ベクタ一の Smal部位にクローニングした。増幅産物の挿人されたプラスミドのうち #2、 3、 #4 (H4B7) 、 1K #13、 #14 (H8F9) について、自動蛍光シーケンサー（Applyed Bio System社）により、増幅産物の塩基配列を決定した。得られた塩基配列及び予想されるァミノ酸配列をすでに報告されているヒト抗体 VH領域（Marksら、 Eur. J. Immunol. 21, 985-, 1991) 、 JH領域（Ravetchら， Cell, 27， 583 -， 1981) の配列と比較した結果、 H4B7、 H8 F9共に、 VH4ファミリー、 JH2の組み合わせからなることが判明した。この結果は、ヒト 14番染色体部分断片を保持するキメラマウスにおいて、完全な機能的ヒ卜抗体重鎖蛋白質が産生されていることを示している。

(実施例 28) ヒト抗体/ c鎖を発現するキメラマウス脾臓からのヒト抗体鎖 cDNA の取得と塩基配列決定

(実施例 13) において取得され、（実施例 23) においてヒト抗体/ c鎖を発現することが確認されたキメラマウス K2- 8の脾臓より（実施例 5) と同様な方法で合成した cDNAについて、下記のプライマー（Larrickら， BIO/TECHNOLOGY, 7, 934 -， 1989、 Whitehurstら， Nucleic Acids Res.， 20, 4929-, 1992 を参考に作製）により PCRを行ない、ヒト / 鎖可変領域を増幅した。陰性コントロールとして K2 -8より取得した肝臓由来 cDNA及び、（実施例 10) の TT2/U4 3- 2由来キメラマウス K3-2- 2より取得した脾臓由来 cDNAを用いた。

KC2 (ヒト Ig c鎖定常領域) ： 5， -CAGAGGCAGTTCCAGATTTC (配列番号 5 0 )

KC3 (同上) ： 5' -TGGGATAGAAGTTATTCAGC (配列番号 5 1 )

KVMIX (ヒト Ig/c鎖可変領域）：

5' - . T (配列番号 5 2 ) (3456種の混合物）

*( )はその位置の塩基が（）内のいずれかからなる混合物であることを示す。

PCRは KVlIXxKC2. KVMIX x KC3プライマーの組み合わせで 94°C 15秒、 55°C 15秒、 72°C20秒、 40サイクル（パーキンエルマ一社、サ一マルサイクラ一 9600使用）の条件で行なった。増幅産物は 1.5¾ァガロース電気泳動後、臭化工チジゥム染色することにより検出した。その結果、両者の組み合わせ共に、期待される約 420bps (KC2) 、約 450bps (KC3) の長さの増幅産物が検出された。一方、 2種の陰性コントロールでは特異的増幅産物は検出されなかった。これらの増幅産物は、石田ら（遺伝子発現実験マニュアル、講談社サイェンティフイク、 1995) の方法に従い、 pBlueScriptll SKI (Stratagene社）ベクターの Smalあるいは EcoR V部位にクローニングした。増幅産物の揷人されたプラスミドのうち KVMiXxKC 2由来の VK- #1クローン 1種類について、自動蛍光シーケンサ一（Applyed Bio System社）により、増幅産物の塩基配列を決定した。得られた塩基配列はヒト lg 鎖の開始コドンから定常領域に至るまで終始コドンを含まないので、クロー二ングされた増幅産物は機能的ヒト Ig/ 鎖可変領域をコ一ドしていると考えられる c また、すでに報告されているヒト抗体 V 領域（Kleinら， Eur. J. Immunol. , 23, 3248-, 1993) 、 J /c領域（Wh ehurstら，前記）の塩基配列と比較した結果、 V/c3ファミリー、 J /c 4の組み合わせからなることが判明した。この結果は、ヒト 2番染色体部分断片を保持するキメラマウスにおいて、完全な機能的ヒト抗体鎖蛋白質が産生されていることを示している。

(実施例 29) ヒト 14番染色体断片を保持するキメラマウスの血清中のヒト抗体ァ鎖サブクラスおよび鎖の検出、および定量

(実施例 10) の生後 11週齢のキメラマウス（K15Aおよび K16A； 1-4由来、キメラ率 70、 50%) より採血し、血清中のヒト抗体ァ鎖サブクラス濃度を（実施例 14) に従い ELISA法を用いて検出した。

[ヒ卜 IgGlの測定] 抗ヒト IgG抗体（シグマ、卜 6260) を PBSで希釈し、 96穴マイクロタイタ一プレートをコーティングした。血清試料を加え、次いでペルォキシダーゼ標識した抗ヒト IgGl抗体（ファーミンジヱン、 08027E) を加えてインキュべ一卜した後、 T1BZ (住友べ一クライト、 Mい 1120T) の添加により酵素活性を 450隱の吸光度で評価した。精製された濃度既知のヒ卜 IgGl (シグマ、卜 3889) を標準としマウス血清を添加した PBSで段階的に希釈した。

[ヒト lgG2の測定] '抗ヒト lgG2抗体（シグマ、卜 9513) を PBSで希釈し、 96穴マイク口タイタープレートをコ一ティングした。血清試料を加え、次いでペルォキシダーゼ標識した抗ヒト IgG抗体（シグマ、 A- 0170) を加えてインキュベートした後、 TMBZ (住友べ一クライト、 Mい 1120T) の添加により酵素活性を 450 の吸光度で評価した。精製された濃度既知のヒト IgG2 (シグマ、 1-4139) を標準としマゥス血清を添加した PBSで段階的に希釈した。

[ヒト IgG3の測定] 抗ヒト lgG3抗体（シグマ、卜 7260) を 100mMグリシン塩酸バッファ一 pH2.5で希釈し 5分間室温で放置した後、 100mMリン酸バッファ一 pH7. 0で 10倍に希釈し、 96穴マイクロタイタープレートをコーティングした。血清試料を加え、次いでペルォキシダーゼ標識した抗ヒ卜 IgG抗体（ファーミンジヱン、 08007E) を加えてインキュベートした後、 TMBZ (住友べ一クライト、 1い 1120T) の添加により酵素活性を 450nmの吸光度で評価した。精製された濃度既知のヒ卜 IgG3 (シグマ、 1-4389) を標準としマウス血清を添加した PBSで段階的に希釈した。

[ヒト igG4の測定] 抗ヒト IgG4抗体（シグマ、 1-7635) を 100mMグリシン塩酸バッファー pH2.5で希釈し 5分間室温で放置した後、 lOOmMリン酸ノくッファ一 pH7. 0で 10倍に希釈し、 96穴マイクロタイタープレートをコーティングした。血清試料を加え、次いでペルォキシダ一ゼ標識した抗ヒト IgG抗体（ファーミンジヱン、 08007E) を加えてインキュベートした後、 TMBZ (住友べ一クライ卜、 Mい 1120T) の添加により酵素活性を 450nmの吸光度で評価した。精製された濃度既知のヒ卜 IgG4 (シグマ、卜 4639) を標準としマウス血清を添加した PBSで段階的に希釈した。

[ヒト IgMの測定] 鎖については PBSで希釈した抗ヒ卜鎖マウスモノクローナル抗体（シグマ、 1-6385) を 96穴マイクロタイ夕一プレー卜にコーティングし、血清試料を加え、次いでペルォキシダ一ゼ標識抗ヒ卜鎖マウス抗体（The Bind ing Site Limited, P008) を加えてインキュベートした後、ペルォキシダ一ゼ基質として TMBZ (住友べ一クライ卜、 Mい 1120T) の添加により酵素活性を 450nm の吸光度で評価し、精製された鎖を持つ濃度既知のヒト IgM (オルガノン · テクニ力、 6001-1590) を標準としマウス血清（シグマ、 M5905) を添加した PBS で段階的に希釈した。 ·

結果を表 10に示す。キメラマウス K15Aと K16Aの 2個体で IgGl, IgG2, IgG3， IgG4 のすベてのサブクラスおよび IgMが検出された。表 10. キメラマウス中のヒト抗体 IgGサブクラスおよび IgM濃度（ELISA) キメラマウス IgGl I G2 I G3 IgG4 IgM (mg/1) 15A 2.25 1.96 0.17 0.43 7.09

K16A 0.30 0.69 0.10 0.07 0.87

(実施例 30) ヒト 22番染色体を保持するマウス ES細胞株（TT2) の取得ヒ卜 22番染色体を保持するマウス ES細胞（TT2) 取得のため、染色体供与細胞として（実施例 26) で取得した 6-1 (A9/#22, G418, ピューロマイシン耐性）細胞株を用いた。染色体受容細胞としては野生型 TT2細胞株（実施例 9) を用いた。ミクロセル融合実験およびピュー口マイシン耐性株の選択は 0.75〃g/mlのピューロマイシン濃度で他は（実施例 9) の G418耐性株選択の場合と同様に行なった。この結果出現したピュー口マイシン耐性株の出現頻度は TT2細胞 10 固あたり 1 〜2個であった。ピュ一ロマイシン耐性株の凍結保存、ゲノム DNA取得は（実施例 2) と同様に行なった。ヒト 22番染色体の保持はピューロマイシン耐性株 PG22 - 1について以下の（ 1 ) 、（2) により確認した。

( 1 ) PCR解析

ピュー口マイシン耐性株ゲノム DNAを铸型としてヒト 22番染色体上に存在する遺伝子（Genetic Maps，前記）のうち、（実施例 2 ； A9/S22) で存在が確認されている 10種のプライマーについて PCR增幅を行なった結果、（実施例 2 ； A9/#22) に存在した全てのマーカーが検出された。

( 2 ) サザンブロット解析（実施例 2) で示した方法に従い、ヒ卜 L1配列をプローブとして用い、陰性コントロール野生型 TT2、染色体供与細胞 6 しピュー口マイシン耐性 ΤΤ2細胞株 PG22- 1由来のゲノム DNAについて行った。その結果を（図 19) に示す。図中左側に DNA分子量を示した。 PG22- 1におけるバンドパターンは 6- 1のそれと一致し、シグナル強度も同程度であることから、 6-1細胞株中の 22番染色体は確かに PG22-1に移入されたことが確認された。

以上の実験によりピューロマイシン耐性 ΤΤ2細胞株 PG22- 1はヒ卜 22番染色体の全てあるいは大部分を保持することが確認された。

(実施例 31 ) ヒト 22番染色体を保持するマウス ES細胞株（ΤΤ2) からのキメラマウス作製

(実施例 30) で得られ、ヒト 22番染色体を保持していることが確認されたピュ —口マイシン耐性 ΤΤ2細胞株 PG22-1を凍結ス卜ックより立ち上げ、 I CRまたは MC H( I CR) (日本クレア社）雄雌マウスの交配により得られた 8細胞期胚に胚あたり 10〜個注入した。 ES細胞用培地（実施例 9) でー晚培養して胚盤胞に発生させた後、偽妊娠処理後 2. 5日の仮親 I CRマウス（日本クレア社）の子宮に片側の子宮あたり約 10個のィンジヱクション胚を移植した。

キメラ作製の結果を（表 11) に示す。計 266個の注入胚を移植した結果、 36匹の子マウスが誕生した。キメラ個体は、毛色において宿主胚（I CR) 由来の白色の中に TT2細胞由来の野生色（濃茶）が認められるかどうかにより判定される。誕生した 36匹のうち毛色に明らかに野生色の部分のある、すなわち、 ES細胞の貢献の認められる個体は 8匹であつた。

この結果より、ヒト 22番染色体を保持する ES細胞株（TT2由来、 PG22-1) はキメラ形成能を保持している、すなわちマウス個体の正常組織に分化する能力を保持していることが確認された。表 11. ヒト 22番染色体を保持する TT2細胞株からのキメラマウス作製

ES細胞株/ ビュ-ロマイシン ES細胞を注入し子マウスキメラ毛色への貢献率ヒト染色体耐性株番号た 8細胞期胚数の数 7ウスの数〜20¾ 20-50¾ 50-80⁵

ΤΤ2/#2ί PG22- 1 266 36

(実施例 32) ヒト 22番染色体を保持するキメラマウスの血清中のヒ卜抗体 λ鎖の検出、および定量

(実施例 31) のキメラマウス KPG22- 1〜3の血清中のヒト抗体濃度を（実施例 14) に従い EL 1 SA法を用いて定量した。生後 2 ヶ月のキメラマウスより採血し、血清中のヒ卜抗体； I鎖を EL ISA法を用いて検出した。 PBSで希釈した抗ヒ卜免疫グロブリン； I鎖抗体（VECTOR LABORATOR I ES, INC. . IA - 3070) を 96穴マイクロタイタ一プレー卜にコーティングし、血清試料を加え、次いでピオチン標識した抗ヒト免疫グロプリン I鎖抗体（VECTOR LABORATOR I ES, INC.、 BA-3070) を加えてィンキュベ一トしさらにピオチン化ヮサビペルォキシダ一ゼとアビジン DHの複合体（VECTOR LABORATOR IES, INC. . Vec tas ta i n ABCキット）を加えてインキュベー卜した後、 TMBZ (住友べ一クライト，Μい 1120T) の添加により酵素活性を 450nm の吸光度で評価し、精製された； I鎖を持つ濃度既知のヒト I gM (大日本製薬、 U1 3200) を標準としマウス血清を添加した PBSで段階的に希釈した。結果を表 12に示す。この結果より 22番染色体を保持するキメラマウスにおいてヒ卜抗体； I鎖遺伝子が機能することが確認された。表 12. キメラマウス中のヒ卜抗体； l鎖濃度（EUSA) キメラマウスキメラ率％ I g X (mg/1 )

KPG22- 1 50 12

PG22-2 50 18

KPG22-3 20 24

(実施例 33) ヒト 22番染色体導入キメラマウス血清における抗ヒ卜 HSAヒト体 λ鎖の検出

キメラマウス（実施例 31、 KPG22-3) に生後 79日、 94日、 110日の 3回にわたり（実施例 20) と同様に HSAを免疫した。血清中のヒト抗体； I鎖を（実施例 14) に従い EL I SA法を用いて検出した。 50mMの炭酸一炭酸水素バッファ一 pH9. 6で 5 〃g/mlに希釈した HSA (シグマ、 A 3782) を 96穴マイクロタイタープレートにコ —ティングし、血清試料を加え、次いでピオチン標識した抗ヒト免疫グロブリン λ鎖抗体（VECTOR LABORATOR I ES, INC.、 BA-3070) を加えてインキュベートしさらにピオチン化ヮサビペルォキシダ一ゼとアビジン DHの複合体（VECTOR LAB0RAT 0R I ES， INC.、 Vectas tai n ABCキッ卜）を加えてインキュベートした後、 TMBZ (住友べ一クライト、 Mい 1120T) の添加により酵素活性を 450nmの吸光度で評価した。

HSAで免疫したキメラマウス血清中の抗 HSAヒト λ鎖の力価は免疫後上昇した。 —方対照とした ICRマウスでは、 HSA免疫後の抗 HSAヒト抗体； I鎖の力価はバックグランドレベルであった。結果を（図 20) に示す。図 20において横軸はキメラマウスに初めて HSAを免疫してからの日数を、縦軸は 450nmにおける吸光度を示した。これらの結果より、ヒト 22番染色体を保持するキメラマウスにおいてヒト抗体; I鎖遺伝子が機能し、さらには HSA抗原刺激に対して抗原特異的ヒ卜 I g Aの抗体価上昇が起こることが確認された。

(実施例 34) ヒト 22番染色体導人キメラマウスからのヒト抗体軽鎖産生ハイブリド一マ取得 (実施例 25) と同様に（実施例 33) においてヒトアルブミンで免疫したキメラマウス KPG22-3から生後 113日目に脾臓を取り出し、ミエローマ細胞と細胞融合し、ハイプリドーマを作製した。ハイプリドーマの作製法は〈安東 '千葉、単クローン抗体実験操作入門、講談社サイェンティフイク， 1991〉に記された方法に従い、ミエローマ細胞としては、 SP- 2/0- Agi4 (大日本製薬、 05-554) を使用した。培養液に HCF (エア ' ブラウン）を 10%添加し 96穴プレート 5枚にまき込み、 1〜3週間培養しコロニーが出現したゥヱルの培養上清を EL 1 SA法で解析した。 . EU SA法は（実施例 33) と同様に行ない、ヒト抗体ス鎖陽性のクローンを 4個得た。

(実施例 35) ヒト 22番染色体部分断片及び、 14番染色体部分断片を同時に保持するマウス ES細胞株の取得

ヒ卜 22番染色体、 14番染色体部分断片を同時に保持するマウス ES細胞取得のため、染色体供与細胞として（実施例 26) で取得した 6-1 (A9/#22, G418, ピューロマイシン耐性）細胞株を用いた。染色体受容細胞としてはすでにヒ卜 14番染色体部分断片を保持している G418耐性 TT2細胞株卜 4 (実施例 9) を用いた。ミクロセル融合実験およびピューロマイシン耐性株の選択は 0. 75 n g/mlのピュ一ロマイシン濃度で他は（実施例 9) の G418耐性株選択の場合と同様に行なった。この結果出現したピューロマイシン耐性株の出現頻度は卜 4細胞 10⁷個あたり 1〜2 個であつた。これらのピューロマイシン耐性株は 300 g/mlの G418存在下でも增殖することから G418耐性も同時に保持していることが確認された。二重薬剤耐性株の凍結保存、ゲノム DNA取得は（実施例 2) と同様に行なった。ヒ卜 22番染色体及び、ヒト 14番染色体部分断片の保持は二重薬剤耐性株 PG22- 5について以下の

PCR解析により確認した。二重薬剤耐性株ゲノム DNAを铸型としてヒト 22番、 14 番染色体上に存在する遺伝子（Gene t i c Maps，前記）のうち、 22番染色体については（実施例； A9/#22) 、 14番染色体については（実施例 9； ΤΤ2/#14 1-4) で存在が確認されている各プライマーにつし、て PCR増幅を行なつた結果、 22番染色体については 10種のうち 3種のマーカ一（D22S275, D22S315, I g ) 、 14番染色体については TT2/ 14 1-4に存在した全てのマ一カーが検出された。以上の実験により、得られた二重耐性 TT2細胞株はヒト 22番染色体部分断片、 14番染色体部分断片を同時に保持することが確かめられた。

(実施例 36) ヒト 22番染色体部分断片及び、 14番染色体部分断片を同時に保持するマウス ES細胞株からのキメラマウス作製

(実施例 35) で得られ、ヒト 22番染色体部分断片及び 14番染色体部分断片を保持していることが確認された G418、ピューロマイシン二重耐性 TT2細胞株 PG22 - 5 を凍結ストックより立ち上げ、 I CRまたは MCH( I CR) (日本クレア社）雄雌マウスの交配により得られた 8細胞期胚に胚あたり 10〜12個注入した。 ES細胞用培地（実施例 9) で一晩培養して胚盤胞に発生させた後、偽妊娠処理後 2. 5日の仮親 I C Rマウス（日本クレア社）の子宮に片側の子宮あたり約 10個のインジヱクシヨン胚を移植した。

キメラ作製の結果を（表 13) に示す。計 302個の注入胚を移植した結果、 16匹の子マウスが誕生した。キメラ個体は、毛色において宿主胚（I CR) 由来の白色の中に TT2細胞由来の野生色（濃茶）が認められるかどうかにより判定される。誕生した 16匹のうち毛色に明らかに野生色の部分のある、すなわち、 ES細胞の貢献の認められる個体は 5匹であった。

この結果より、ヒ卜 22番染色体部分断片及び 14番染色体部分断片を保持する ES 細胞株（PG22- 5) はキメラ形成能を保持している、すなわちマウス個体の正常組織に分化する能力を保持していることが確認された。表 13. ヒ卜 22番染色体と 14番染色体を保持する TT2細胞株からのキメラマウス作製

ES細胞株/ 二重耐性 ES細胞を注入し子マウスキメラ毛色への貢献率ヒト染色体株番号た 8細胞期胚数の数マウスの数 -20% 20-50% 50 - 80¾

TT2/#22+?14 PG22-5 302 16

(実施例 37) ヒト 22番染色体部分断片及び、 14番染色体部分断片を同時に保持する ES細胞由来キヌラマウス血清中のヒ卜抗体； I鎖およびヒト抗体鎖の検出 · (実施例 36) のキメラマウス（KPG22- 9、 10、および 12) に対して、 HSAを免疫した。 KPG22-9と KPG22- 10には生後 11週齢で免疫し、その 2週間後に採血した。 KPG22- 12には生後 7週齢と 9週齢の 2度免疫し、 2度目の免疫の 2週間後に採血した。

血清中のヒ卜抗体//鎖およびヒ卜抗体； I鎖さらにヒ卜ス鎖かつヒ卜 //鎖を有する抗体を（実施例 14) に従い EL I SA法を用いて検出した。

完全ヒ卜抗体の検出には PBSで希釈した抗ヒト免疫グロブリン λ鎖抗体（Ki rk egaard & Perry Laborator i es I nc.、 01 - 10- 11) を 96穴マイクロタイタープレー卜にコーティングし、血清試料を加え、次いでペルォキシダ一ゼ標識抗ヒ卜免疫グロプリン /鎖抗体（The B i nd i ng S i te L i mi ted, MP008) を加えてインキュべ — 卜した後、ペルォキシダ一ゼ基質として TMBZ (住友べ一クライト、 Mい 1120T) の添加により酵素活性を 450nmの吸光度で評価し、精製された I鎖を持つ濃度既知のヒ卜 I gM (大日本製薬、 U13200) をマウス血清を添加した PBSで段階的に希釈したものと比較し血清中のヒト抗体濃度を求めた。ヒト抗体//鎖およびヒト抗体; I鎖を EUSA法を用いて（実施例 29) および（実施例 32) と同様に検出 '定量した。結果を表 14に示す。キメラマウスでは； I鎖と / 鎖がともに検出された。ヒト抗体//鎖かつ λ鎖を持つ抗体も検出された。この結果より、ヒト 22番染色体部分断片及び 14番染色体部分断片を保持する ES細胞由来キメラマウスにおいてヒト抗体; 鎖遺伝子とヒト抗体/ /鎖遺伝子は同時に機能し、一部の Β細胞では重鎖と軽鎖がともにヒトである完全抗体が産生されることが確認された。

また対照として測定したヒト 14番染色体のみを保持する（実施例 10) のキメラマウス（Κ9) 、ヒ卜 22番染色体のみを保持する（実施例 31) のキメラマウス（ΚΡ G22-2) の血清中のヒ卜抗体； I鎖かつ//鎖を持つ抗体濃度はバックグランドレべルであり、ここでの検出系はヒト λ鎖かつ鎖を持つ完全抗体のみを検出していることが確認された。表 14. キメラマウス中のヒト抗体濃度（EL A)

ESクロ-ンキメラマウスキメラ率％ IgM(mg/l) I A (mg I , λ (mg/1)

PG22-5 KPG22-9 30 2.54 9.9 0.043

PG22-5 KPG22-10 5 4.96 21.5 0.333

PG22-5 PG22-12 40 3.71 7.0 0.048

3-2 9 50 6.66 <0.003

PG22-1 PG22-2 50 17.6 <0.003

(実施例 38) ヒ卜 2番染色体部分断片及び、 14番染色体部分断片を同時に保持する ES細胞由来キメラマウス血清におけるヒト抗体の検出（ヒ卜 /c鎖かつヒト鎖を有する抗体）

(実施例 19) で作製したキメラマウス KPG- 15 (TT2ES クローン PG5由来、キメラ率 105 に対して、生後 2から 3ヶ月齢の間に、 PBSに溶解したヒト血清アルブミン（HSAヽシグマ、 A3782) とアジュバント（MPL+TDM Emulsion, RIBI Imm unochem Reseach Inc. ) とを混合して 0.25mg/mlの HSA溶液を調整し 0.2mlを 3 回免疫し、採血した。また生後 6週齢の（実施例 19) のキメラマウス KPG-26 (TT 2ES クローン PG6由来、キメラ率 40%) から採血した。血清中の完全ヒト抗体濃度を（実施例 14) に従い ELISA法で検出した。 PBSで希釈した抗ヒ卜免疫グロブリン鎖抗体（Kirkegaard & Perry Laboratories Inc.、 01-10-10) を 96穴マイクロタイタープレートにコ一ティングし、マウス血清（シグマ、 M5905) を加えた PBSで希釈した血清試料を加え、次いでペルォキシダーゼ標識抗ヒト免疫グロブリン//鎖抗体（The Binding Site Limited, MP008) を加えてインキュベートした後、ペルォキシダーゼ基質として TMBZ (住友べ一クライ卜、 Mい 1120T) の添加により酵素活性を 450nmの吸光度で評価し、精製された /c鎖を持つ濃度既知のヒ卜 IgM (オルガノン · テク二力、 6001-1590) を標準としマウス血清を添加した PBSで段階的に希釈した。 /c鎖、鎖については（実施例 20) と同様にして濃度を求めた。結果を表 15に示す。ヒ卜抗体//鎖かつ /c鎖を持つ抗体が検出されたまた対照としたヒト 14番染色体のみを保持する（実施例 10) のキメラマウス（ K9) 、ヒト 2番染色体のみを保持する（実施例 13) のキメラマウス（K2-9) 血清中のヒ卜抗体で/ 鎖かつ/ 鎖を持つ抗体濃度は 0. 002mg/ml以下でバックグランドレベルであった。この結果より、ヒ卜 2番染色体部分断片及び 14番染色体部分断片を保持する ES細胞由来キメラマウスにおいてヒ卜抗体/ 鎖遺伝子とヒト抗体鎖遺伝子は同時に機能し、一部の B細胞では重鎖と軽鎖がともにヒトである完全抗体が産生されることが確認された。表 15. キメラマウス中のヒ卜抗体濃度（EL I SA)

ESクロ-ンキメラマウスキメラ率％ I gM(mg/ l ) I g c (mg/ 1 ) I gM, κ (mg/ 1 )

PG-5 KPG15 10 0. 18 1. 01 0. 075

PG-6 PG26 40 1. 52 1. 26 0. 018

3-2 K9 50 6. 66 0. 002以下

5- 1 K2-9 40 135 0. 002以下

(実施例 39) ヒト 2番染色体部分断片を保持するマウス ES細胞株（TT2F， X0) の取得

ヒ卜 2番染色体部分断片を保持するマウス ES細胞（X0) 取得のため、染色体供与細胞として（実施例 16) で取得した PG1細胞株を用いた。染色体受容細胞としては（39， X0) の染色体構成を持ち、キメラマウスにおいて効率よく卵細胞に分化することが報告されている（相沢慎一、バイオマニュアルシリーズ 8，ジーン夕ーゲティング，羊土社， 1995) TT2F細胞株（ライフテックオリエンタル社より購人）を用いた。ミクロセル融合実験およびピューロマイシン耐性株の選択は 0. 75 g/mlのピューロマイシン濃度で他は（実施例 9) の G418耐性株選択の場合と同様に行なった。この結果出現したピューロマイシン耐性株の出現頻度は TT2F細胞 10⁷個あたり 5個であった。これらのピューロマイシン耐性株の凍結保存、ゲノム DNA取得は（実施例 2) と同様に行なった。ヒト 2番染色体部分断片の保持は薬剤耐性株 P-20, P- 21について以下の PCR解析により確認した。薬剤耐性株ゲノ厶 DNAを铸型としてヒト 2番染色体上に存在する遺伝子（Gene t i c Maps，前記）のうち、（実施例 1 ； A9/#2 w23) で存在が確認されているプライマ一C /c、 FA BP1、 V 1 -2の 3種について PCR増幅を行なった結果、 2株共に、 3種全てのブライマ一について期待される増幅産物が確認された。

以上の実験により、得られたピューロマイシン耐性 ES細胞株（TT2F， X0) はヒ卜 2番染色体部分断片を保持することが確かめられた。

(実施例 40) ヒト 2番染色体部分断片を保持するマウス ES細胞株（TT2F, X0) からのキメラマウス作製

(実施例 39) で得られ、ヒト 2番染色体部分断片を保持していることが確認されたピューロマイシン耐性 TT2F細胞株 P- 21を凍結ストツクより立ち上げ、 Rまたは MCH( ICR) (日本クレア社）雄雌マウスの交配により得られた 8細胞期胚に胚あたり 10〜12個注人した。 ES細胞用培地（実施例 9) で一晩培養して胚盤胞に発生させた後、偽妊娠処理後 2. 5日の仮親 ICRマウス（日本クレア社）の子宮に片側の子宮あたり約 10個のィンジクション胚を移植した。

計 141個の注入胚を移植した結果、 20匹の子マウスが誕生した。キメラ個体は、毛色において宿主胚（I CR) 由来の白色の中に TT2細胞由来の野生色（濃茶）が認められるかどうかにより判定される。キメラ作製の結果を（表 16) に示す。誕生した 20匹のうち毛色に明らかに野生色の部分のある、すなわち、 ES細胞の貢献の認められる個体は 9匹であった。うち 4個体は毛色が完全に野生色の（ES細胞に由来する）キメラマウスであった。

この結果より、ヒト 2番染色体部分断片を保持する ES細胞株（P- 21) はキメラ形成能を保持している、すなわちマウス個体の正常組織に分化する能力を保持していることが確認された。表 16. ヒ卜 2番染色体部分断片を保持する TT2F細胞株からのキメラマウス作製

ES細胞株/ ビュ-ロマイシン ES細胞を注入子マウスキメラ毛色への貢献率ヒト染色体耐性株 -' した 8細胞期の数マウスの数〜20% 20-50% 50- 90¾ 100¾

番号胚数

TT2F/#2fg. P-21 141 20 9 0 2 3 4

(実施例 41) ヒト 2番染色体部分断片を保持する TT2F由来キメラマウスの血清中のヒ卜抗体鎖の検出、および定量

(実施例 40) の生後約 1ヶ月齢のキメラマウス（P-21由来、キメラ率 100¾、 K2

- 1F〜4F) より採血し血清中のヒ卜抗体鎖濃度を（実施例 20) と同様に EL1SA 法を用いて定量した。

結果を表 17に示す。使用する ES細胞を TT2Fとしてもヒト抗体/ c鎖遺伝子がキメラマウス中で機能することが確認された。

表 17. キメラマウス中のヒト抗体 κ鎖濃度（ELISA) キメラマウスキメラ率％ Ig/c (mg/1)

K2-1F 100 66

K2-2F 100 156

K2-3F 100 99

2-4F 100 20

(実施例 42) ヒト 2番染色体部分断片を保持するマウス ES細胞（TT2F, X0) 由来キメラマウスの子孫におけるヒト染色体保持の検出 (実施例 40) で得られた雌キメラマウスのうち K2- 1 F, K2 -4F (共に毛色のキメラ率 100¾) について雄 I CRマウスとの交配により ES細胞由来の子孫が誕生するかを検討した。この交配において R雄マウス（アルビノ、劣性）由来精子により受精したキメラマウス中の TT2F細胞（野生色：優性）由来の卵子からは野生色、 I CR由来卵子からは白色の子マウスが誕生する。それぞれ 1回の交配によって得られた生存可能な子マウス（K2- 1 F ： 10匹、 K2- 4F ： 5匹）のすべてが ES細胞由来の毛色である野生色を示した。これらの子マウスの尻尾より調製したゲノム DN Aについてヒト染色体断片の保持を PCR法により検討した。 P-21 (実施例 39) で存在が確認されている 3種のプライマーについて PCR増幅を行なつた結果、 10匹中 4匹（K2 - 1 F) 、 5匹中 2匹（K2- 4F) において P- 21で検出された 3種のマー力一の存在が確認された。 15匹の子マウスの PCRの結果を（図 21 ) に示す。図中右側にマ一力一（0 X174， Hae l i l断片，二ツボンジーン）および主なバンドの DN A分子量を、左側にそれぞれのプライマ一によって期待される増幅産物の長さを矢印で示した。右側に陽性コントロールとして親キメラ K2- 1 F、 K2- 4Fの尻尾由来 DNAを用いた結果も示す。これらの結果は、ヒ卜 2番染色体部分断片を保持する TT2F細胞株 P-21がキメラマウス中で機能的な卵子に分化し、その卵子由来の子孫にヒト 2番染色体部分断片が伝達されたことを示している。

(実施例 43) ヒト 2番染色体部分断片を保持するマウス ES細胞（TT2， XY) 由来キメラマウスの子孫におけるヒト染色体保持の検出

(実施例 13) で得られたキメラマウスのうち K2- 18 (雄、キメラ率 70¾) と K2 - 19 (雌、キメラ率 60%) 及び同腹の非キメラ雌を混合して交配し、 ES細胞由来の子孫が誕生するかを検討した。 TT2細胞は（40， XY) の染色体構成を持つので雄キメラ K2- 18において機能的な精子に分化している可能性がある。その場合キメラマウス中の _TT2細胞（野生色、優性）由来精子により受精した I CR (白色：劣性）由来の卵子からは野生色の子マウスが誕生する。交配によって得られた生存可能な子マゥス計 1 10匹のうち 10匹が ES細胞由来の毛色である野生色を示した。これらの野生色子マウス 10匹のうち 7匹の尻尾より調製したゲノム DNAについてヒト染色体断片の保持を PCR法により検討した。 5- 1株（TT2/#2 f g.，実施例 12) で存在が確認されている 2種のプライマ一（C A：、 FABP 1 ) 及び、（実施例 1 ) で示した V /c l - 2 ブライマ一について PCR増幅を行なった結果、 7匹中 2匹において 3種のマーカ一全ての存在が確認された。この結果は、ヒト 2番染色体部分断片を保持する TT2細胞株 5-1がキメラマウス中で機能的な精子に分化し、その精子由来の子孫にヒ—ト 2番染色体部分断片が伝達されたことを示している。

(実施例 44) キメラマウス子孫の血清中のヒト抗体鎖の検出、および定量 (実施例 42) のキメラマウス子孫 K2- 1F-1〜10および K2- 4F- 1〜5の血清中のヒ卜抗体/ 鎖濃度を EU SA法を用いて定量した。生後約 4〜6週齢のマウスより . 採血し、血清中のヒト抗体/ c鎖を（実施例 20) と同様に EL ISA法を用いて検出した。結果を（実施例 42) で得られた染色体保持の結果と共に表 18に示す。キメラマウスから生まれた子孫においてもヒト抗体/ c鎖遺伝子が機能することが確認された。

表 18. キメラマウス子孫中のヒ卜抗体 /c鎖濃度（ELISA) 親キメラマウスマウス個体番号ヒト 2番染色体断片 Ig c (mg/1) 2-1F 0.58

ft

K2-1F 44789023523561 1 84.1

K2-1F 12.8

2-1F 15.1

K2-1F 0.52

K2-1F 0.58

K2-1F I.30

K2-1F 0.90

K2-1F 0.56

K2-1F 28.8

K2-4F 0.04以下

K2-4F 23.3

K2-4F II.8

K2-4F 0.08

K2-4F 0.06

(実施例 45) ヒト 14番染色体部分断片導入キメラマウス脾臓細胞の解析フローサイトメトリーによる解析は下記の文献に記載の方法に従った。日本生化学会編、新生化学実験講座 12分子免疫学 1一免疫細胞 · サイトカインー 1989、東京化学同人；東京大学医科学研究所制癌研究部編、細胞工学別冊 8 新細胞工学実験プロトコ一ル、 1991、秀潤社； A. Doyle and J. B. Griffiths, "Cell &

Tissue Culture: Laboratory Procedures", published by John Wiley & Sons L td.， 1996 。（実施例 19) の生後 6ヶ月齢のキメラマウス（KPG06； PG16由来、キメラ率 30%) から脾臓をとりだし、塩化アンモニゥム水溶液で処理した後ラット血清を 1%含む PBS中で、フルォレツセインイソチオシァネート（FITC) 標識抗マウス CD45R(B220)抗体（ファーミンジヱン、 0U24A) で細胞を染色した。洗浄後 5 %マウス血清を含む PBS中でピオチン標識抗ヒト IgM 抗体（ファーミンジェン、 08072D) または対照としてビォチン標識抗ヒトス鎖抗体（ファーミンジェン、 08152D) と反応させた後、ス卜レブトァビジンフィコエリスリン（ファ —ミンジェン、 13025D) で染色し、フローサイトメトリ一（べクトンデッキンソン、 FACSort) で解析した。また対照としてヒト染色体を保持しない Rマウスも同様に解析した。図 22に結果を示す。図中横軸はヒト IgM 、縦軸は CD45R(B220 ) を示す。 B細胞マ一カー CD45R陽性（FITC) でかつヒト IgM陽性（PE) である細胞集団が 4%増加しており、これによつてキメラマウスではヒト抗体//鎖を細胞表面に発現している細胞の存在が確認された。

(実施例 46) ヒト抗体重鎖、 c鎖、ス鎖をそれぞれ発現するキメラマウス脾臓由来 cDNAからのヒ卜抗体遺伝子可変領域クローニングと塩基配列決定

(実施例 29) 、（実施例 23) 、（実施例 32) においてヒト抗体重鎖、 /c鎖、 λ 鎖をそれぞれ発現することが確認されたキメラマウス K15A (1-4株由来、実施例 10に示した方法で作製）、 Κ2- 8 (実施例 13で作製）、 KPG22- 2(実施例 31で作製）の脾臓由来 RNAより（実施例 5) と同様な方法で合成した cDNAについて、下記のプライマーにより PCRを行ない、それぞれのヒ卜抗体遺伝子可変領域を増幅した。陰性コントロールとして非キメラマウス ICRより取得した脾臓由来 cDNAを用いた。参考文献の記載のないプライマ一は Genbank等のデータベースより入手した塩基配列をもとに作製した。

• K15A (重鎖）

定常領域用： HIGMEX1-2： 5' -CCAAGCTTCAGGAGAAAGTGATGGAGTC (配列番号 53)

HIGMEX1-1： 5' -CCAAGCTTAGGCAGCCAACGGCCACGCT (VH3BACKの 2ndP CRに使用）（配列番号 54)

可変領域用： VH1/5BACK (59°C, 35cycles, Marksら， Eur. J. Immnol. , 21, 9 85-, 1991) ， VH4BACK (59°C, 35cycles, Marksら，前記）， VH3BAC (IstP CR:59°C, 35cycles, 2ndPCR:59。C， 35cycles, Marksら，前記）

☆ • K2-8 (軽鎖 )

定常領域用 KC2H： 5' -CCAAGCTTCAGAGGCAGTTCCAGATTTC (配列番号 55)

可変領域用： Vkl/4BACK (55°C， 40cydes， Marksら， Eur. J. Immnol. , 21, 985 -, 1991) ， Vk2BACK. (55°C, 40cycles, Marksら，前記）， Vk3BACK (55°C, 40cycles， Marksら. 前記)

. KPG22₁2 (軽鎖 λ )

定常領域用： CAMIX (以下の 3種のプライマ一を等モル比で混合したもの）

IGL1-CR： 5' -GGGAATTCGGGTAGAAGTCACTGATCAG (配列番号 56)

IGL2-CR ： 5' -GGGAATTCGGGTAGAAGTCACTTATGAG (配列番号 57)

IGL7-CR ： 5' -GGGAATTCGGGTAGAAGTCACTTACGAG (配列番号 58)

可変領域用： 1LEA1 (55°C, 40cycles, Williamsら， Eur. J. Immunol. , 23， 1456-， 1993) ， VA 2MIX (55°C, 40cycles，前記の Wi 11 iamsらの報告にある V A2LEA1, VA2JLEAD を等モル比で混合したもの）， V i3MIX (55°C， 40 cycle s，前記の Williamsらの報告にある V;i3LEAl， VA3JLEAD, Vス 3BACK4を等モル比で混合したもの）それぞれ定常領域用 X可変領域用（重鎖 3種、 /c鎖 3種、 λ鎖 3種）の組み合わせで 94°C15秒、それぞれの可変領域プライマーに示したァニーリング温度 15秒、

72°C20秒、それぞれの可変領域プライマーに示したサイクル数（パーキンエルマ

—社、サーマルサイクラ一 9600使用）の条件で行なった。 VH3BACKにおける 2ndP

CRは IstPCRの増幅産物を（HIGMEX1- 1XVH3BACK) のプライマ一の組み合わせで再度増幅した。全ての増幅産物は 1.5%ァガロース電気泳動後、臭化工チジゥム染色することにより検出した。その結果、全て組み合わせにおいて、期待される長さ（重鎖： 470bp付近、軽鎖/ c ： 400bp付近、軽鎖 λ ： 510bp付近）の増幅産物が検出された。一方、陰性コントロールでは全てにおいて同じ位置に特異的増幅産物は検出されなかった。これらの増幅産物は、ァガロースゲルより prep.A.gen e (バイオラッド）により抽出した後、制限酵素処理（重鎖： Hindlll- Pstl、軽鎖/ ： Hindlll-PvuIU 軽鎖； I ： Hindll I-EcoRI) し、 pUC119 (宝酒造）ベクタ —の Hindlll, Pstl 部位（重鎖）、 Hindlll, Hindi部位（鎖）、 Hindlll, E coRI部位（ス鎖）にクローニングした。増幅産物の挿入されたプラスミドのうち以下のもの（右側に示したクローン数）について、自動蛍光シーケンサ一（Appl yed Bio System社） 'により、増幅産物の塩基配列を決定した。

• HIG EX1- XVH1/5BACK： 10クローン、

• HIGMEX1-2XVH4BACK： 8クローン、

- HIG EXl-2(2nd PCR, H IGMEX1 - 1) x VH3BACK： 5クローン

• KC2HXV 1/4BACK： 6クローン、

• KC2HXV C2BACK： 7クローン、

. C2HXV 3BACK : 4 クローン、

• CAMIXxVA 1LEA1 ： 5クローン、

• CAMIXXVA2MIX： 6クローン、

• CAMIXxVA3 IX： 5クローン得られた塩基配列を DNASIS(Hitachi Software Engneering) により解析した結果、全てがヒト由来配列であり、 /c鎖、ス鎖の全て、重鎖の計 23種中 21種が開始コドンから定常領域に至るまで終始コドンを含まない機能的配列であった。決定された配列からお互いに同一なものを除くと重鎖 17種、 / 鎖 11種、 λ鎖 12種のそれぞれ異なる可変領域配列が同定された。

(実施例 47) ヒト抗体重鎖、 Λ;鎖、ス鎖をそれぞれ発現するキメラマウス脾臓由来 cDNAからのヒト抗体遺伝子可変領域塩基配列の解析

(実施例 46) において決定された塩基配列（重鎖 Πクローン、 /c鎖 11クローン、 λ鎖 12クローン）について以下の点について解析を行った。

1. 各可変領域配列において使用されている既知の生殖系列 V遺伝子断片を特定

2. 各可変領域配列において使用されている既知の生殖系列 J遺伝子断片を特定

3. 重鎖可変領域において使用されている既知の生殖系列 D断片を特定

4. 1、 2、 3の結果をもとにした重鎖可変領域における N領域の付加の同定

5. 各可変領域塩基配列から導かれるアミノ酸配列の決定

その結果を（表 19) に示す。 1、 2については Genbankに登録されている生殖系列 V及び J断片とのホモロジ一検索を DNASISにより行い特定した。 VH断片は（ Cookら， Nature gentics, 7, 162-, 1994) 、 V 断片は（Kleinら， Eur. J. Immunol, 23, 3248-, 1993) 、 V;i断片は（Williamsら，前記）の表記法に従い、各 V断片ファミリ一名と共に表中に記した。 3については（Ichiharaら， The E BO J. , 7, 13, 4141-， 1988) の報告に記された生殖系列 D断片とのホモロジ —検索を DNASISにより行い、連続して 8bp以上一致することを指標として決定し表中に記した。 DN*については（Greenら， Nature Genetics, 7, 13-, 1994) で報告された新しい DNファミリ一断片と考えられる。 4については 1 (V) 、 2 (J) 、 3 (D) の結果をもとに、いずれの生殖系列断片にも見いだされない塩基配列を N領域とみなした。その結果、 D領域の特定された 13種中 11種に N領域が観察され、その平均の長さは 8.7bpであった。 5については各塩基配列を DNAS ISを使用して 1文字表記のアミノ酸配列に変換した。表中には CDR3領域のみ示した。表中右側に各可変領域のクローニングに使用したプライマー名及び各クローン名を記した。

表 19

V segment J(D) pi lone

K15A

VH1 VH1-8 VRS SSWYEYYYYGMDV J6CDN1) VH BACK K4-10

VH1-18 GGITTvfVRGLIITD YPDL I2CDXP'l) VH1/5BAC Kl-7

VH1-24 APYSGRFDY VH1/5BACK HI -6

VH1-46 ERYYGSGSYQDYYYYYGMDV J6(DXP'l) VH1/5BACK Kl-2

GGYSGYEDYYYYGMDV J6(DK1) VH1/5BAC Kl-10

VH2 VH2-5 SYFDWPDFDY J4 (DXP1) VH4BACK

VH3 VH3-21 EGCSGGSCLPGYYYYGMDV J6 CDし R2) VH1/53AC Hl-4

VH3-23 AHGDPYFDY J4 VH1/5BAC HI.3

VH3-23 DADAFDI J3 VH1/5BACK Hl-8

VH3-23 SGWDY J4 (DN1*) VH3BACK K3-3 w¾ TGFDL J2 VH4B八 CK

VH3-33 EGGYGSVGDYYYYGMDV Jo (DXP 1) VH1/5BAC Hl-9

VH3-33 GGYSYGYDYYYYGMDV TA ΓΠΥΡΊ "\ VH3BACK H3-5

VH3-33 GYSSGWYDY J4 (DM1*) VH4BACK H4-9

VH4 VH4-34 RYSSGWYYFDY J4 (DNl*) VH4BACK H4-15

VH4-59 GRIAVASFDY J4 (DN1*) VH4BACK H4-2

VH4-5 GSGSYFHFDY J4 VH4BACK H4-6

' - _·

K2-8

1 018-8 ^^riiJi i^r^r J3 V 1 ΐ¾ V

018-8 00YDNLPIT J5 , V 1BACK l-3

018-8 00HDNLPFA J3 VK2BACK K2-2

LI OOYNSYPLT J4 V IB八 CK l-6

V 2 Al 1 MQGTHLLT J4 V 2BACK K2-1

A17 MQGTHWIT J3 V 2BACK K2-5

V/c3 A27 OOYGSSPTWT J 1 V 3BAC K3-1

A27 OOYGSSPFT J3 V 3BACK K3-4

A27 Jl 3 RACK K3-5

A27 Jl V tc 3 BACK 3-6

V A: 6 A26-10 HOSSSLPOT Jl V κ 2BACK K2-4

KPG22-2

V 1 DPL3 AAWDDSLDVV JC3 V 1し EA1

DPL5 JC2 V J IT FA 1

DPL5 GTWDSSLSAGVV JC3 Vス 1し EA1 Ll-6

DPL5 GTWDSSLSAVV JC2 Vス 1し EA1 Ll-9

DPL8 QSYDSSLSGW JC3 V 1LEA1 Ll-S

V 2 DPし 10 CSYAGSSTLV JC2 V 2MIX し 24

DPL11 SSYTSSSTVV JC2 Vス 2MIX L2-1

DPし 11 SSYTSSSTLV JC2 V 2 ΙΧ L2-3

DPL11 CSYTSSSTFV JC2 V 2ΜΙΧ L2-7

DPL12 SSYAGSNNLV JC3 V A 2MIX L2-5

DPし 12 SSYAGSNNP V JC3 V Λ 2MIX L2-6

V； 3 DPL16 NSRDSSGNLV JC2 V 3^ΠΧ L3-1 (実施例 48) TT2F ES細胞の抗体遺伝子（重鎖、軽鎖 /c) ノックアウト用のターゲッティングべクターの作製

マウス抗体遺伝子（重鎖、軽鎖 /c) が破壊された TT2(または TT2F)細胞へ G418 耐性遺伝子でマーキングされたヒ卜 14番染色体断片（実施例 9 ) およびピュー口マイシン耐性遺伝子でマーキングされたヒト 2番（実施例 18) または 22番染色体

(実施例 35) を導入することが可能となる。このようなヒ卜 14番 +2番またはヒト 14番 +22番染色体を導入したマウス抗体（重鎖、軽鎖 /c) 遺伝子破壊 ΤΤ2(または TT2F)ES細胞を用いて、（重鎖 + /c鎖：実施例 19、重鎖 + λ鎖：実施例 36) の方法によって作成されたキメラマウスでは、主に重鎖と軽鎖がヒト由来の抗体が産生されることが期待される。以下に示す図 23〜図 27における制限酵素の略称等は、以下のとおりである。

制限酵素： Kp: KpnU B: BamHし Bg2: BgllU RI : EcoRI 、 RV: EcoRV 、 N': Not 、 SI: Sal K Sea: Seal 、 Sfi: Sf i I 、 Sm: SmaU X: Xhol 、（X):ラムダべクタ一由来の Xhol切断部位、

dK: Kpnl切断部位を消失、 dX: Xhol切断部位を消失、

(Sm/Sl): Sail 平滑後 Smal切断部位と結合、（Sl/RV): Sail 平滑後 EcoRV 切断部位と結合。

点線部分： pBluescript S II(I) または pUC18 プラスミド DNA

<^0： LoxP配列

1. G418耐性遺伝子の両側に LoxP配列を入れた pLoxP- STneo プラスミドの作製

TT2F細胞の抗体遺伝子をノックアウトした後、 G418耐性遺伝子を除去するために G418耐性遺伝子（実施例 1 ) の両端に Creリコンビネース（Sauerら， Pro

Natl. Acad. Sci. USA, 85， 5166 -, 1988 ) の認識配列である LoxP配列 (Sauer ら、前記）を同じ向きに入れる必要がある。 pSTneoBプラスミド DNA (実施例 1

、 Katohら、 Cell Struct. Funct. , 12:575， 1987; Japanese Collection of Re search Biologicals (JCRB), Deposit Number: VE039) より制限酵素 Xholで G418 耐性カセット（STneo) を切り出し、ァガロースゲル電気泳動により DNA断片を精製したのち T4DNAポリメラーゼ（Takara社製 DNA Blunting Kit)により両端を平滑化した。 LoxP配列が入ったプラスミド DNA pBS246 (Plasmid pBS246, 1οχΡ2 Ca ssette Vector, U.S. Patent 4959317) は、 GIBCO BRL社より購入した。このプラスミドの EcoRI及び Spel切断部位へ Xholリンカー DNAを挿入することによって Xhol認識配列に変更したものを使用した。この改変 PBS246の EcoRV切断部位へ上記 STneo DNA 断片を揷入してプラスミド pLoxP- STneo を得た（図 23) 。

2. C57BL/6由来抗体重鎖 C （IgM定常領域）、軽鎖 J/c-C/c (Ig/c連結領域および定常領域）を含むゲノム DNAクローンの単離

TT2(または TT2F)細胞は、 C57BL/6マウスと CBAマウスの F 1マウス由来であることから、 C57BL/6マウス由来のゲノム DNAクローンを用いて抗体遺伝子ノックアウト用ベクターを作製することにした。ゲノム DNAライブラリ一は、 Clonte ch社 aduit C57BL/6N male 1 i ver由来ラムダ DNAライブラリーを使用した。スクリーニングのためにプローブとしては、以下の合成 DNA配列（60 mer) を用いた重鎖 C プローブ： 5' -ACC TTC ATC GTC CTC TTC CTC CTG AGC CTC TTC TAC AGC ACC ACC GTC ACC CTG TTC AAG-3' (配列番号 59)

軽鎖プローブ： 5'-TGA TGC TGC ACC AAC TGT ATC CAT CTT CCC ACC ATC CAG T GA GCA GTT AAC ATC TGG AGG-3' (配列番号 60) 単離されたラムダクローンを解析して、重鎖 C /または軽鎖 J - C/cを含む DN A断片を pBluescript SKIK+) プラスミド（Stratagene社）へサブクローニングした（重鎖：図 24；軽鎖 J/C - C/c ：図 25) 。これらの DNA断片を用いて、以下のように TT2(または TT2F)ES細胞中のマウス抗体遺伝子破壊のためのターゲッティングベクタ一を作製した。

3. マウス抗体重鎖遺伝子破壊用べクタ一プラスミドの作製

2で調製したマウス抗体重鎖定常領域を含むゲノム DNAの C をコードする領域の内で、第 2〜第 4ェクソンが含まれる DNA断片（BamHl〜Xhol) を 1で作製したし oxP- STneo遺伝子と置き換えた（図 26) 。 STneoの転写方向は、抗体重鎖遺伝子の転写方向と同じ向きとなっている。更にこのプラスミドの Notl部位に、 DT

- Aカセット A(Pro Natl. Acad. Sci. USA, 87， 9918-9922, 1990，オリエンタル酵母より購人） [以下、 DTと呼ぶ] の Apal、 SaU部位を Not I部位に変換したものを揷入した。 DT遺伝子の転写方向は、重鎖遺伝子の転写方向と同じ向きとなるものを選択した。このプラスミド DNAは、大腸菌 DH5 を用いて増幅し、セシウムクロライド平銜遠心により精製した（細胞工学実験操作入門、 1992年講談社刊）。精製したプラスミド DNAは、制限酵素 SacIIにより、一箇所切断して TT2F ES 細胞へのトランスフエクシヨンに使用した。形質転換体 TT2F ES細胞の中から抗体重鎖部分がタ一ゲッティングベクターと相同組換えが起こつたクローンを検出するための形質転換体ゲノム DNAサザンブロッ卜用のプローブとして、 C〃の上流に存在するスィッチ領域の DNA断片（約 500塩基対）を用いた。この DNA断片は以下の条件で 129マウスゲノム DNAを PCR增幅して得た。

センスプライマ一： 5' - CTG GGG TGA GCC GGA TGT TTT G 3' (配列番号 61) アンチセンスプライマ— ： 5'-CCA ACC CAG CTC AGC CCA GTT C- 3' (配列番号 62) テンプレート DNA： EcoRI消化 129マウスゲノム DNA 1〃 g

反応バッファ一、デォキシヌクレオチドミックス、 TaqDNAポリメラーゼは、 Taka ra社製のものを使用。

反応条件： 94度 C, 3分， 1回 → 94度 (；， 1分； 55度 2分； 72度 C， 2分； 3回 → 94度 C， 45秒； 55度 1分； 72度 C， 1分； 36回増幅された DNAが Genbankのデータベースにあるとおり、制限酵素 Hind IIIで一箇所切断されることを確認して、 pBluescriptプラスミドの EcoRV切断部位へサブクローニングした。このプラスミド DNA (S8) を制限酵素 BamHIと Xholで切断して、ァガロースゲル電気泳動で PCR断片（約 550塩基対）を精製したものをプローブとした。タ一ゲッティングべクターで形質転換した TT2F ES細胞のゲノム DNAを制限酵素 EcoRIと Xholで消化し、ァガロースゲル電気泳動で分離後サザンブロットを行ない、上記プローブで検出した。

4. マウス抗体遺伝子軽鎖/ c破壊用べクタ一の作製

2で調製したマウス抗体軽鎖/ c J領域および定常（C) 領域を含むゲノム DNA の C領域が含まれる DNA断片（SacII〜BglIl ) を 1で作製した LoxP- STneo遺伝子の Kpnl部位をつぶしたものと置き換えた（図 27) 。 STneo の転写方向は、抗体遺伝子の転写方向と逆向きとなっている。このプラスミド DNAは以下のように構築した。 pUC18 プラスミドのマルチクロ一ニング部位の配列（EcoR卜 Hindlll)を DNA 化学合成によつて作製した配列：

5' -AATTCCCGCGGGTCGACGGATCCCTCGAGGGTACCA -3' (配列番号 6 3 )

3' - GGGCGCCCAGCTGCCTAGGGAGCTCCCATGGTTCGA-5' (配列番号 6 4 )

EcoRI SacII Sail BamHI Xhoi Kpnl Hindlll

に変換した。このプラスミドの EcoRI 、 SacII 部位へ. J を含む EcoR 1 〜Sacli DNA 断片（図 25) を挿入した。次に、できたプラスミドの BamHI 、 Xhoi部位へ 3' - 側 Bglll〜Bglll 〜BglII 〜Xhol DNA断片（図 25) を揷入した。このプラスミドの Xhoi部位、 Sail部位に順次、 DTを含む Xhoi〜SalI DNA断片、 Kpnl断片を潰した LoxP- STneoを含む Xhoi DNA断片を挿入した。 DT遺伝子の転写方向は、軽鎮/ 遺伝子の転写方向と同じ向きとなる。このプラスミド醒は、大腸菌 DH5を用いて増幅し、セシウムクロライド平衡遠心により精製した。精製したプラスミド DNA は、制限酵素 Kpnlにより、一箇所切断して TT2F ES細胞へのトランスフヱクションに使用した。形質転換体 TT2F ES細胞の中から抗体軽鎖部分がターゲッティングベクタ一と相同組換えが起こったクローンを検出するための形質転換体ゲノム DNAサザンブロット用のプローブとして、軽鎖 J/c- C/ ゲノム DNA (図 25参照）の 3'端の DNA断片（XhoI〜EcoRI ；約 1.4k塩基対）を用いた。ターゲッティングべクターで形質転換した TT2F ES細胞のゲノム DNAを制限酵素 EcoRIで消化し、ァガロースゲル電気泳動で分離後サザンブロッ卜を行ない、上記プローブで検出した。

(実施例 49) マウス ES細胞抗体重鎖遺伝子破壊株の取得

抗体重鎖遺伝子相同組換え体取得の為、実施例 48-3で作成した抗体重鎖ターゲッティングベクターを制限酵素 SacII (宝酒造）で線状化し、（相沢慎一、バイォマニュアルシリーズ 8,ジーンターゲティング，羊土社， 1995) の方法に従いマウス ES細胞 TT2Fへ導入した。 TT2F細胞をトリプシン処理し、 2.5xl0⁷個/ mlとなるように HBSに懸濁してから 5〃gDNAを加え、ジーンパルサ一（バイオラッド、抵抗器ュニット接続せず）を用いてエレクトロポレーシヨンを行なった。 960〃

Fの容量で 250Vの電圧を4 長のエレクトロポレーションセルを用いて室温で印加した。エレクトロポレーシヨンした細胞を 20mlの ES培地に懸濁し、あらかじめフィ一ダ一細胞をまいた 100mm組織培養用プラスチックシャーレ（コ一ニング） 2枚に播種した。同様に 10， 15 / gDNAを用いた実験も行った。 1 日後に 300〃 g/ mlの G418 (GENETI C IN，シグマ）を含む培地と置き換えた。 7〜9日後に生じたコロニ一計 176個をピックアップし、それぞれを 12穴プレー卜でコンフル一ェントになるまで増殖させ、その 4/5を 0. 2miの保存用培地（ES培地 H0?0DMS0くシグマ >) に懸濁し、 -80°Cにて凍結保存した。残りの 1/5は 12穴ゼラチンコートプレ一卜に播種し、 2日間培養して、 10⁶〜10⁷個の細胞からゲノム DNAを Puregene

DNA I so lat i on Ki t (Gen t ra Sys tem社）により調製した。これらの G418耐性 TT 2F細胞ゲノム DNAを制限酵素 EcoR iと Xho i (宝酒造）で消化し、ァガロースゲル電気泳動で分離後サザンブロッ卜を行ない、実施例 48- 3に示したプローブで相同組換え体を検出した。その結果 176株中 3株が相同組換え体であるという結果を得た。野生型 TT2F細胞及び相同組換え体 #131、 #141のサザンブロッ卜解析の結果を（図 28) 左側 3レーンに示す。野生型 TT2F細胞では EcoR I、 Xho i消化により 2 本のバンド（a、 b) が検出された。相同組換え体においては、これらのいずれかのバンドが消失し、新たに下部にバンド（c) が現われることが予想される。図中 #131, #141において aのバンドが消失し、新たに cのバンドが出現している。図中左側には DNAの大きさを示した。すなわちこれらのクローンは抗体重鎖遺伝子の片方のァレルが相同組換えにより破壊されたものである。

(実施例 50) 抗体重鎖相同組換え体 ES細胞からのキメラマウス作成

(実施例 49) で得られた抗体重鎖相同組換え体 TT2F細胞株 #131を凍結ス卜ックより立ち上げ、 I CRまたは MCH( I CR) (日本クレア社）雄雌マウスの交配により得られた 8細胞期胚に胚あたり 10〜12個注入した。 ES細胞用培地（実施例 9) で一晚培養して胚盤胞に発生させた後、偽妊娠処理後 2. 5日の仮親 Rマウス（日本クレア社）の子宮に片側の子宮あたり約 10個のィンジクション胚を移植した。計 94個の注人胚を移植した結果、 22匹の子マウスが誕生した。キメラ個体は、毛色において宿主胚（I CR) 由来の白色の中に TT2F細胞由来の野生色（濃茶）が認められるかどうかにより判定される。誕生した 22匹のうち毛色に明らかに野生色の部分のある、すなわち、 ES細胞の貢献の認められる個体は 18匹であった。うち 16個体は毛色の 80%以上が野生色の（ES細胞に由来する）雌キメラマウスであつた。この結果より、抗体重鎖相同組換え体 ES細胞株 31はキメラ形成能を保持していることが確認された。得られたキメラマウスのうち多くの個体は非常に高い貢献率を示す雌であるので、 ES細胞が機能的な生殖細胞（卵子）に分化している可能性が高い。キメラマウスのうち 100%の貢献率を示す雌キメラ 2個体を

R)雄マウスと交配した結果、生まれた子マウスはすべて野性色を示した。これらの子マウスは # 13 1由来であり（実施例 42参照）、 2匹に 1匹の割合で破壊された抗体重鎖ァレルが伝達していると考えられる。

(実施例 51 ) 抗体重鎖相同組換え体からの 2重破壊株の取得

片側ァレルが G418耐性遺伝子の揷人により破壊された ES細胞株において、培養液中の G418濃度を上げて培養することにより得られる高濃度 G418耐性株をスクリ

—ニングすれば両側ァレル共に破壊された株を取得することが可能なことが報告されている（相沢慎一ら、バイオマニュアルシリーズ 8，ジーンターゲテイング，羊土社， 1995) 。これに基づき、我々は TT2F抗体重鎖相同組換え体 # 131， # 141について両側アレルの破壊株取得の為、以下の実験を行った。まず、 # 131， # 141両株について致死 G418濃度検定のため 35mmシャーレ各 10枚（この実施例においては栄養細胞はマイトマイシン処理をしていない G418耐性初代培養細胞（ライフテツクオリエンタル社より購人）を使用した。実施例 9参照）に 1枚あたり約 100個の細胞を播種し、 0， 0. 5， 1 , 2, 3, 5， 8, 10, 15, 20 mg/m l の G418 ( GENET I C I

N、シグマ）をそれぞれ含む ES培地中で 10日間培養した。その結果 3mg/mlの濃度までは明らかなコロニーが認められたが、 5mg/m 1ではコロニー形成は認められなかった。この結果をもとに最小致死濃度を 5mg/mlと決定し、 4, 5， 6， 7， 8mg/ml の各濃度で高濃度 G418耐性株の選抜を行った。 #131， # 141それぞれについて 100m mシャーレ計 10枚に夂当たり約 10⁶個の細胞を播種し、上記の各濃度の G418を含む ES培地（5段階、各濃度シャーレ 2枚づつ）により培養した。培養開始 12曰後に 7mg， 8mg/m lのシャーレにおいて明らかなコロニー（#131 ： 12株、 141 : 10 株）をピックアップし、実施例 49と同様に凍結保存、 DNA取得を行った。これらの高濃度 G418耐性株ゲノム DNAを制限酵素 EcoR Iと Xho l (宝酒造）で消化し、ァガロースゲル電気泳動で分離後サザンブロットを行ない、実施例 48- 3に示したプローブで両側アレルの破壊された株を検出した。その結果 # 131株由来の 1株（ ΐ 31 -3) が両側アレル破壊株であるという結果を得た。 ΐη31由来の 6株についてのサザンブロット解析の結果を（図 28) に示す。野生型 TT2F細胞では EcoR I、 Xho l 消化により 2本の野生型バンド（a、 b) が検出された。片側アレル相同組換え体 131， ί 141 ) においては、上部のバンド aが消失し、新たにバンド cが現われた（実施例 49) 。さらに両側アレルが破壊されることにより、もう一方の野生型バンド bが消失し、破壊型バンド cのみとなることが予想される。図中 3 (# 1 31 -3) のクローンにおいてこのバンドパターンが観察された。すなわちこのクローンは抗体重鎖遺伝子の両方のアレルが破壊されたものである。

(実施例 52) 抗体重鎖欠損ホモ接合体 TT2F細胞株からの G418耐性マーカー遺伝子の除去

実施例 51で取得された抗体重鎖両側アレル破壊株（高濃度 G418耐性株 #131 - 3) の G418耐性マーカ一遺伝子を以下の手順により除去した。 G418耐性マーカー遺伝子の両側に挿入した l oxP配列（実施例 48- 1 ) の間で部位特異的組換えを起こす Cr eレコンビナーゼ遺伝子を含む発現べクタ一 pBS185 ( BRL) を（相沢慎一、バイォマニュアルシリーズ 8，ジーンターゲティング，羊土社， 1995、及び高津聖志ら

、実験医学別冊、免疫研究の基礎技術、 p255-、 1995、羊土社）の方法に従い # 1

31 - 3株へ導入した。 #131 - 3細胞をトリプシン処理し、 2. 5x l0⁷個/ mlとなるように HBSに懸濁してから 30〃gの pBS 185DNAを加え、ジーンパルサ一（バイオラッド、抵抗器ュニッ卜接続せず）を用いてエレクトロポレーシヨンを行なった。 96

0〃Fの容量で 250Vの電圧を 4imn長のエレクトロポレーシヨンセル（165-2088、バイオラッド）を用いて印加した。エレクトロボレ一シヨンした細胞を 5mlの ES 培地に懸濁し、あらかじめフィ一ダ一細胞をまいた 60删組織培養用プラスチックシャーレ（コ一二ング）夂に播種した。 2日後に細胞をトリブシン処理し、フィ一ダ一細胞をまいた lOOmnrンャ一レ 3枚にそれぞれシャーレ夂当たり 100、

200、 300細胞となるように再度播種した。ジーンパルサ一の設定（抵抗器ュニット接続、抵抗値無限大）のみ変更した条件でも同様に行った。 7日後に生じたコロニー計 96個をピックアップし、トリプシン処理した後 2つに分け、フィーダ

—細胞をまいた 48穴プレート及びゼラチンコ一ト処理のみを行った 48穴プレー卜 2枚にそれぞれ播種した。後者は 300 / mlの G418 (GENET I C IN, シグマ）を含む培地で 3日間培養し、その生存率で G418耐性を判定した。その結果 6クローンが G418存在下で死滅した。これらの G418感受性株を 35誦シャーレでコンフル一ェン卜になるまで増殖させ、その 4/5を 0. 5mlの保存用培地（ES培地 + 10¾DMS0くシグマ〉）に懸濁し、 - 80°Cにて凍結保存した。残りの 1/5は 12穴ゼラチンコートプレートに播種し、 2日間培養して、 10⁶〜10⁷個の細胞からゲノム DNAを Pure gene DNA I so la t i on Ki t (Cen tra Sys tem社）により調製した。これらの G418感受性 TT2F細胞株ゲノム DNAを制限酵素 EcoR I (宝酒造）で消化し、ァガロースゲル電気泳動で分離後サザンブロットを行ない、 G418耐性遺伝子を含む pSTneoB由来 3. 2kb Xho l断片（プローブ A ) で G418耐性遺伝子の除去を確認した。その結果、 #131 - 3において観察される、プローブ Aとハイブリダィズするバンドが、感受性株においては全く検出されなかった。これらの結果より、取得された G418感受性株において確かに G418耐性マーカ一遺伝子が除去されていることが確認された。さらに上記と同様な方法で pBS 185DNAを EcoR I消化したプローブ Bを用いてサザン解析を行った結果、これら G418感受性株にプローブ Bとハイプリダイズする特異的なバンドは検出されなかったことから、 Creレコンビナーゼを含む PBS185 は感受性株染色体に揷入されていないと考えられる。すなわち、これらの感受性株は実施例 48 - 4に示した抗体軽鎖ノックァゥトベクター（G418耐性遺伝子の両側に Ι οχΡ配列が存在する）による形質転換を行うことができる。この G418感受性株 #131 - 3- 5より実施例 40の方法に従って、キメラマウスを作製した。その結果、毛色のキメラ率 100¾のマウスが得られた。

(実施例 53) 抗体重鎖欠損 ES細胞株へのヒト 14番染色体（抗体重鎖）の導入

(実施例 52) で得られた、内在性の抗体重鎖を欠損するマウス ES細胞株（TT2F 由来、 G418感受性）に（実施例 9) で示した通りに G418耐性遺伝子によりマ一キングされたヒ卜 14番染色体（抗体重鎖遺伝子を含む）をミクロセル法により導人する。得られる G418耐性株において PCR解析等（実施例 9) によりヒト抗体重鎖遺伝子を含むヒト 14番染色体（断片）の保持が確認される。

(実施例 54) ヒト 14番染色体（断片）を保持する抗体重鎖欠損 ES細胞株へのヒト

2番染色体断片ある、は 22番染色体の導入 (実施例 53) ,で得られた、ヒト 14番染色体断片を保持する抗体重鎖欠損マウス ES細胞株（G418耐性）に（実施例 18、 35) で示した通りにピューロマイシン耐性遺伝子によりマ一キングされたヒ卜 2番染色体断片（抗体軽鎖 /C遺伝子を含む）あるいはヒト 22番染色体（抗体軽鎖； I遺伝子を含む）をミクロセル法により導入する。得られるピューロマイシン、 G418二重薬剤耐性株において PCR解析等（実施例 18、 35) によりヒト 14番染色体（断片）及び 2番染色体断片あるいは 22番染色体（断片）の保持が確認される。

(実施例 55) ヒ卜抗体重鎖遺伝子を含む 14番染色体（断片）を保持する内在性抗体重鎖欠損マウス ES細胞からのキメラマウス作成

(実施例 53) で取得されるヒト抗体重鎖遺伝子を含む 14番染色体（断片）を保持する内在性抗体重鎖遺伝子欠損マウス ES細胞株からのキメラマウス作成は（実施例 10) で示した方法により行う。ここで得られるキメラマウスにおいては、 ES 細胞株由来の B細胞で産生されるヒト抗体重鎖が（実施例 14) で示した方法により検出される。また、この ES細胞由来の B細胞において機能的な抗体重鎖遺伝子は導入染色体上のヒト由来のもののみであるので、 ES細胞株由来 B細胞の多くはヒト抗体重鎖を産生する。

(実施例 56) ヒト 14番 + 2番、 14番 + 22番染色体（断片）を保持する内在性抗体重鎖欠損マウス ES細胞からのキメラマウス作成

(実施例 54) で取得されるヒト 14番 + 2番、 14番 + 22番染色体（断片）を保持する内在性抗体重鎖遺伝子欠損マウス ES細胞株からのキメラマウス作成は（実施例 19、 36) 等で示した方法により行う。ここで得られるキメラマウスにおいては、 ES細胞株由来の B細胞でヒト抗体重鎖及び軽鎖/ cあるいは軽鎖 λが（実施例 14、 23、 32) で示した方法により検出される。また、（実施例 55) と同様にこの ES細胞由来の Β細胞において機能的な抗体重鎖遺伝子は導入染色体上のヒ卜由来のもののみであるので、 ES細胞由来 Β細胞の多くはヒト抗体重鎖を産生する。さらに、

(実施例 37、 38) で示したように重鎖、軽鎖が共にヒ卜由来である完全なヒト抗体分子が検出される。

(実施例 57) ヒト 14番 + 2番、 14番 + 22番染色体（断片）を保持する内在性抗体重鎖欠損マウス ES細胞由来キメラマウスからのヒト抗体産生ハイプリドーマ取得 (実施例 15、 25、 34) と同様に（実施例 56) で作成されるキメラマウスに目的とする抗原で免疫し、脾臓を取り出し、ミエローマ細胞と細胞融合し、ハイプリドーマを作成する。 1〜3週間培養し培養上清を EL I SA法で解析する。 EL 1 SA法は（実施例 14、 15、 21、 24、 25、 33、 34、 37、 38) に示した方法で行ない、ヒ卜抗体陽性及びヒト抗体陽性かつ免疫した抗原特異的クローンを得る。

(実施例 58) 抗体重鎖欠損ホモ接合体マウス ES細胞からの抗体軽鎖遺伝子破壊株の取得

実施例 52で取得した抗体重鎖欠損ホモ接合体 TT2F細胞株（G418感受性）においてさらに抗体軽鎖遺伝子を破壊した相同組換え体を以下の手順で取得した。実施例 48- 4で作製した抗体軽鎖ターゲッティングベクタ一を制限酵素 Κρη ί (宝酒造）で線状化し、（相沢慎一、バイオマニュアルシリーズ 8，ジーンターゲティング，羊土社， 1995) の方法に従い実施例 49と同様に上記 TT2F細胞株（G418感受性）へ導入した。すなわち、細胞を HBSに懸濁し、 2. 5 X 10⁷ ce l l s/mlの懸濁液とした後、 DNA 5 〃g を 0. 5 mlの細胞懸濁液に加え、エレトクロポレーシヨンセルに 96

0 F 、 250 V の電圧を印加した。 7〜9日後に生じたコロニーをピックアップし、実施例 49に示した方法で凍結保存、ゲノム DNAを取得した。 G418耐性株ゲノム DNAを制限酵素 EcoR l (宝酒造）で消化し、ァガロースゲル電気泳動で分離後サザンプロット解析を行ない、実施例 48- 4に示したプローブで相同組換え体を検出した。結果を図 29に示す。親株である抗体重鎖欠損ホモ接合体 TT2F細胞では Ec oR I 消化により 1本のバンド（a) が検出された。相同組み換え体においては、このバンドに加えて新たに下部にバンド（b) が現れることが予想される。図中、形質転換株 2 、 5 において（b) のバンドが出現している。図中、左側には DNA の大きさを示した。すなわち、これらのクローンは抗体軽鎖遺伝子の片方のアレルが相同組み換えによって破壊されたものである。解析した 120 株中 28株の相同組み換え体を得た。これらのクローンは、通常の培養条件において、遺伝子破壊以前の TT2F株と比較して、増殖速度および形態に変化が見られず、キメラマウス形成能を保持していることが示唆される。

(実施例 59) 抗体軽鎖相同組換え体からの 2重破壊株の取得

実施例 58で得られた TT2F抗体軽鎖相同組換え体（かつ抗体重鎖欠損ホモ接合体 ) について軽鎖両側アレルの破壊株を以下の手順により取得した。実施例 51と同様な方法で高濃度 G418耐性株を取得した。 G418濃度 9〜14 mg/mlの 5〜 7 日間培養を行った後、 G418濃度を 4 mg/ml に下げ培養し、培養開始から 10〜 13曰後に生じたコロニーをピックアップし、実施例 51と同様な方法で凍結保存、 DNA取得を行なった。高濃度 G418耐性株ゲノム DNAを制限酵素 EcoR Iと No t i (宝酒造）で消化し、ァガロースゲル電気泳動で分離後サザンブロットを行ない、実施例 48- 4に示したプローブで両側アレルの破壊された株を検出した。サザンブロット解析の結果を図 32に示す。 2重破壊株では図 32の（a) のバンドが消失し、バンド（b) のみになることが予想される。図中、高濃度 G418耐性株 2 、 3 、 8 においてバンドが消失している。すなわち、これらクローンは抗体軽鎖遺伝子の両側のアレルが破壊されたものである。それぞれ独立した片側ァレル破壊株 3株から得られた高濃度耐性株を解析し、それぞれ 59株中 36株、 43株中 2株、 49株中 1株の抗体軽鎖遺伝子の両側のァレルが破壊されたクローンを取得した。これらのクローンは、通常の培養条件において、遺伝子破壊以前の TT2F株と比較して、増殖速度および形態に変化が見られず、キメラマウス形成能を保持していることが示唆される。

(実施例 60) 抗体軽鎖欠損ホモ接合体（かつ抗体重鎖欠損ホモ接合体） TT2F細胞株からの G418耐性マーカ一遺伝子の除去

実施例 59で取得された抗体軽鎖両側アレル破壊株（高濃度 G418耐性株）の G418 耐性マーカ一遺伝子を実施例 52で示した手順により除去した。 G418耐性マーカ一遺伝子の両側に挿入した Ι οχΡ配列（実施例 48- 1) の間で部位特異的組換えを起こす Creレコンビナーゼ遺伝子を含む発現ベクター pBS185 (BRL) を実施例 52の方法に従い上記の株へ導人した。実施例 52と同様に得られる G418感受性株を 35腳シヤーレでコンフル一ェン卜になるまで増殖させ、その 4/5を 0. 5mlの保存用培地

(ES培地 H0¾DMS0くシグマ〉）に懸濁し、 -80°Cにて凍結保存した。残りの 1/5 は 12穴ゼラチンコートプレートに播種し、 2日間培養して、 10⁶〜10⁷個の細胞からゲノム DNAを Puregene DNA I so l at i on Ki t (Gen tra Sys tem社）により調製した。これらの G418感受性 TT2F細胞ゲノム DNAを制限酵素 EcoR l (宝酒造）で消化し、ァガロースゲル電気泳動で分離後サザンブロットを行ない、 G418耐性遺伝子を含む pSTneoB由来 3. 2kbXho l断片をプローブとし、 G418耐性遺伝子の除去を確認した。

(実施例 61)

( 1) 内在性抗体重鎖、 / 鎖欠損 ES細胞株へのヒト 14番染色体断片（抗体重鎖遺伝子を含む）の導入

(実施例 78 ) で得られた内在性の抗体重鎖及び /c鎖の両者を欠損するマウス E S 細胞株（TT2F由来、 G418、ピューロマイシン感受性） HKD31に（実施例 68- (2)) に示す通りヒト 14番染色体断片 SC20 (ヒト抗体重鎖遺伝子を含む）をミクロセル法により導入した。ミクロセル融合および G418耐性株の選択は（実施例 2) と同様に行った。得られた G418耐性株のうち 8株について I gM、 D14S543プライマ一を用いた PCR解析（実施例 68) を行った結果、 7株中 8株において両者が検出された。よってこれらの抗体重鎖、鎖欠損 ES細胞株は、ヒト 14番染色体断片 SC20 を保持していることが確認された。

(2) ヒ卜 14番染色体断片（抗体重鎖遺伝子を含む）を保持する内在性抗体重鎖、 c鎖遺伝子欠損マウス ES細胞からのキメラマウス作成

実施例 61 - ( 1) で取得されたヒト 14番染色体断片（抗体重鎖遺伝子を含む）を保持する内在性抗体重鎖、 Λ;鎖遺伝子欠損マウス ES細胞株 HKD31 -8からのキメラマウス作成は（実施例 10) 等で示した方法により行った。計 188個の注人胚を移植した結果、 25匹の子マウスが誕生した。キメラ個体は、毛色において宿主胚

( I CR) 由来の白色の中に TT2細胞由来の野生色（濃茶）が認められるかどうかにより判定される。誕生した 25匹のうち毛色に明らかに野生色の部分のある、すなわち、 ES細胞の貢献の認められる個体は 17匹であった。うち 3個体は毛色がほぼ完全（95%以上）に野生色の（ES細胞に由来する）キメラマウスであった。この結果より、ヒト 14番染色体断片（抗体重鎖遺伝子を含む）を保持する内在性抗体重鎖、 c鎖遺伝子欠損マウス ES細胞株はキメラ形成能を保持している、すなわちマウス個体の正常組織に分化する能力を保持していることが確認された。

(3) ヒト 14番染色体断片（抗体重鎖遺伝子を含む）を保持する内在性抗体】、鎖欠損マウス ES細胞由来キメラマウス血清におけるヒト抗体（ヒト ^、ァ、 α鎖を有する抗体）の検出

実施例 61 - (2) で作製したキメラマウス（HKD31- 8由来）から生後 12週齢（ # 1 ) または生後— 7週齢（# 2〜4) に採血し、血清中のヒト抗体濃度を（実施例 14) に従い EL I SA法で定量した。 PBSで希釈した抗ヒ卜免疫グロプリン ^鎖抗体（シグマ、 16385) 、あるいは抗ヒ卜免疫グロブリンァ鎖抗体（シグマ、 1338 2) あるいは抗ヒト免疫グロブリン鎖抗体（Pharmi ngen、 08091 D) を 96穴マイクロタイ夕一プレー卜にコ一ティングし、マウス血清（シグマ、 M5905) を加えた PBSで希釈した血清試料を加え、次いでペルォキシダ一ゼ標識抗ヒト免疫グロブリン鎖抗体（The B i nd i ng S i te L imi ted, MP008) あるいはペルォキシダーゼ標識抗ヒト免疫グロブリンァ鎖抗体（シグマ、 Α0Π0) を加えてインキュべ一卜した。あるいはピオチン標識抗ヒ卜免疫グロブリン鎖抗体（Pharmi ngen、 08 092D) を加えてインキュベートした後、プレートを洗浄し、アビジン一ペルォキシダ一ゼ複合体（Vector、 ABCキッ卜 PK4000) を加えてインキュベートした。ぺルォキンダーゼ基質として TMBZ (住友べ一クライト、 Mい 1120T) の添加により酵素活性を 450nmの吸光度で評価し、精製された //鎖、ァ鎖、鎖を持つ濃度既知のヒトイムノグロプリン I gM (CAPPEし、 6001-1590) 、 I gG (シグマ、 14506) 、 I gA (シグマ、 12636) をマウス血清を添加した PBSで段階的に希釈したものと比較し血清中のヒト抗体濃度を求めた。結果を表 20に示す。ヒト抗体//およびァ鎖濃度が、通常のマウス血清中の抗体濃度とほぼ同レベルに高い、キメラマウス個体が確認された。またヒ卜 α鎖を発現するキメラマウス個体が確認された。さらに（実施例 29) の方法に従い、ヒト免疫グロブリンァ鎖サブクラスを検出し、 4種のサブクラス（ァ i 、ァ 2 、ァ 3 、ァ 4)すべてが検出された。

この結果からヒト 14番染色体断片（抗体重鎖遺伝子を含む）を保持する内在性抗体重鎖、 / 鎖欠損マウス ES細胞由来キメラマウスにおいてヒト抗体重鎖遺伝子が効率良く発現し、鎖さらにはクラススィツチによってすベてのァ鎖サブクラスおよび α鎖も発現することが示された。表 20 キメラマウス中のヒ卜抗体濃度（ELISA) キメラマウスキメラ率％ヒト抗体 (mg/1)

I M IgG I A

(4) ヒ卜 14番染色体断片（抗体重鎖遺伝子を含む）を保持する内在性抗体重鎖、鎖欠損マウス ES細胞由来キメラマウスからのヒト 7鎖を含む抗 HSA抗体産生ハイブリドーマの取得

実施例 61- (3) で血清中のヒ卜抗体ァ鎖濃度が高いキメラマウス #3 (HKD31- 8由来、キメラ率 99?0 および #4 (キメラ率 95%) に対して、生後 16週齢から PB Sに溶解したヒト血清アルブミン（HSA、シグマ、 A3782) とアジュバント（MP L+TDM Emulsion, RIBI Immunochem Reseach Inc. ) とを混合して 0· 25mg/mlの HS A溶液を調整し 0.2mlを 2週間おきに 2回腹腔に免疫し、さらに 2週間後に PBS に溶解したヒト血清アルブミンを免疫し、採血した。血清中の抗 HSAヒト抗体濃度を（実施例 14) に従い ELISA法で検出した。 HSAをコーティングし、ペルォキシダ一ゼ標識した抗ヒト Ig 抗体（The Binding Site, MP008) 、抗ヒト Igァ抗体（シグマ、 A1070) 、抗ヒト Iga抗体（Kirkegaard & Perry Labolatories In c, 14-10-01) を用いて検出した。結果を図 33に示す。ハイプリドーマの作製法はく安東、単クローン抗体実験操作入門、講談社サイェンティフイク， 1991〉に記された方法に従い、ミエローマ細胞としては、 SP-2/0- Agl4 (大日本製薬）を使用した。最終免疫の 3日後に、キメラマウスからひ臓を取り出し、（実施例 24 ) に従い PEGにて細胞融合し、ハイプリドーマを作製した。同時に採血し、（実施例 29) の方法に従い、血清中のヒト Igアサブクラスの定量を行った。キメラマウス #3の血清中にはァ 1 力く 920mg/l 、 γ 2 力く 520mg/l 、 γ 3 力 img/i、ァ 4 が 14 0mg/l 存在した。融合後の細胞を、ひ細胞数が 100万個/ mlとなるよう、 HCF (エア ' ブラウン ) を 5¾添加し、 HAT (大日本製薬、 o.16-808-49) あるいは lmg/mlの G418を添加した培地（三光純薬、エス ' クローンクロ一ニングメデュー厶 CM- B) に希釈し、各 wellに 100 1ずつ 96穴プレート分注し培養した。培養 8日目に培養上清を採取し、（実施例 14) に従い ELISA法によってヒト抗体産生ハイブリド一マのスクリ一二ングを行った。 CBB緩衝液に溶解し 5 zg/mlとした HSA溶液をコ一ティングし、ペルォキシダーゼ標識抗ヒ卜免疫グ口ブリン Ί鎖抗体（シグマ、 A017.0) を用いて ΙΒΖ (住友べ一クライ卜、 Mい 1120T) により検出した。陰性対照の約 3 倍以上の吸光度を目安にして判定し、キメラマウス #3より 74個、キメラマウス #4より 29個の陽性ゥエルを得た。また HSA溶液をコーティングし、ペルォキシダ一ゼ標識抗ヒ卜免疫グロプリン鎖抗体（Tago、 #2392) を用いてヒ卜鎖を持つ抗 HSA扰体をスクリ一ニングした。キメラマウス #3の融合処理細胞をまきこんだ 96穴プレー卜 15枚の中で G418選択を行ったプレート 4枚の培養上清をスクリ一二ングし 5個の陽性ゥエルを得た。 HATあるいは lmg/mlの G418による選択でコロニー出現したゥエルはプレート 1枚あたり各々、 74個および 29個であった。ヒトァ鎖を持つ抗 HSA抗体陽性で、細胞数が比較的多いゥエルの細胞を 48穴プレ一卜に移しさらに 4日間培養し、培養上清中の抗体のアイソタイプを ELISAにより決定した。 HSA溶液をコーティングし、アルカリフォスファターゼ標識した抗ヒ HgGl抗体 (Zymed labolator ies, Inc.. 05-3322) 、抗ヒト IgG2抗体 (Zyme d labolatories, Inc. _N 05-3522) 、抗ヒ卜 IgG3抗体 (Zymed labolatories, Inc .、 05-3622) 、抗ヒト IgG4抗体 (Zymed labolatories, Inc. , 05-3822) を用いて (実施例 14) に従い ELISAを行い判定した。陽性クローンはヒト IgGlが 27、 IgG2が 11、 lgG3が 2、 IgG4が 13クローンあった。キメラマウス # 4の融合処理細胞も同様に判定し、細胞数の多いクローン 4株を判定し、ヒト IgGl産生クローンを得た。

この結果よりヒ卜抗体遺伝子（重鎖）を含む 14番染色体部分断片を保持する内在性抗体重鎖、軽鎖欠損マウス ES細胞由来キメラマウスにヒトのタンパク（HSA

) を免疫することによって、抗原特異的ヒト、ァおよび《抗体価の上昇が起り、鎖およびすベてのヒトァ鎖サブクラスを含む抗 HSA抗体産生ハイプリドーマの取得が可能であることが示された。

(実施例 62) ヒト 14番染色体断片（抗体重鎖遺伝子を含む）を保持する内在性抗体重鎖、 /c鎖欠損マウス ES細胞へのヒ卜 2番染色体（軽鎖/ 遺伝子を含む）の導入

実施例 61 - ( 1 ) で得られた、内在性抗体重鎖及び c鎖欠損かつヒト 14番染色体断片（抗体重鎖遺伝子を含む）を保持するマウス ES細胞株 HKD31 - 8に（実施例 18) で示した通りにピューロマイシン耐性遺伝子でマ一キングされたヒト 2番染色体断片（抗体軽鎖 c遺伝子を含む）をミクロセル法により導入した。その結果得られたピューロマイシン、 G418二重耐性株 13株について PCR解析（実施例 18) を行つた。使用したプライマ一は 14番染色体断片については 1 および D 14S543 の 2種（実施例 68) 、 2番染色体断片については V /c 1および FABP1の 2種（実施例 12) である。その結果、 8株において 4種全てのマ一力一の存在が確認された。そのうち KH13株についてはヒト染色体特異的プローブを用いて F ISH解析を行つた（実施例 9、 12) 。その結果を図 34に示す。 KH13においてはプローブにハイブリダィズする独立した染色体小断片が 2本観察された。これらの結果より、 KH 13は 14番染色体断片および 2番染色体断片を同時に保持することが示された。

(実施例 63) ヒト 14番染色体断片（抗体重鎖遺伝子を含む）を保持する内在性抗体重鎖、 Λ;鎖欠損マウス ES細胞へのヒト 22番染色体（軽鎖 I遺伝子を含む）の導入

実施例 61 - (1) で得られた、内在性抗体重鎖及び/ c鎖欠損かつヒト 14番染色体断片（抗体重鎖遺伝子を含む）を保持するマウス ES細胞株 HKD31- 8に（実施例

35) で示した通りにピューロマイシン耐性遺伝子でマーキングされたヒト 22番染色体（抗体軽鎖； I遺伝子を含む）をミクロセル法により導人した。その結果得られたピューロマイシン、 G418二重耐性株 12株について PCR解析（実施例 35) を行つた。使用したプライマ一は Μ番染色体断片については I および D14S543の 2 種、 22番染色体断片については I g A、 D22S315. D22S275、 D22S278, D22S272

、 D22S274の 6種（実施例 2) である。その結果、 10株において 8種全てのマ一カーの存在が確認された。残り 2株のうち LH13株においては 8種中 l g\'l， D 14S543 , I g l , D22S275, D22S274の 5種のマーカ一のみが確認されたので、この株は断片化されたヒト 22番染色体を含むと考えられる。さらに LH13についてはヒト 22番染色体特異的プ口一ブぉよびヒト番染色体特異的プローブを各々用いて F 1 SH解析を行った。その結果、それぞれのプローブにハイブリダィズする独立した染色体断片が観察された。すなわちこの株は 14番染色体断片および 22番染色体断片を同時に保持することが示された。

(実施例 64) ヒ卜 2番（抗体軽鎖/ c ) 、 14番（抗体重鎖）、 22番（抗体; I鎖）染色体あるいはその部分断片を同時に保持する内在性抗体重鎖、軽鎖欠損マウス ES 細胞の取得

3種のヒト染色体を同時に保持するマウス ES細胞を得るために、ヒト 2番あるいは 22番染色体をブラストサイジン耐性（I zumiら、 Exp. Ce l l . Res.， 197， 22 9， 1991 ) 、ハイグロマイシン耐性（Wi ndら、 Ce l l , 82, 321 -， 1995) 等のマーカー遺伝子の挿入によりマ一キングする。これは（実施例 16、 26) に示した方法により行う。（実施例 62) で得られた、内在性抗体重鎖及び軽鎖欠損でありかつヒ卜 14番染色体（断片）及び 2番染色体部分断片を保持するマウス ES細胞株（TT 2F由来、 G418耐性、ピューロマイシン耐性）に（実施例 9) で示した方法と同様にブラス卜サイジン耐性あるいはハイグロマイシン耐性等でマーキングされたヒト 22番染色体（ヒト抗体軽鎖; I遺伝子を含む）を導入する。 ES細胞培養用のフィーダ一細胞はそれぞれの選択マ一カーに適したものを使用する。ハイグロマイシン耐性マーカーを使用する場合は、そのマ一力一を保持し、発現するトランスジエニックマウス系統より得た初代培養繊維芽細胞（Johnsonら、 Nuc i e i c Ac i ds Research, vo l . 23, No. 7, 1273-, 1995) を使用する。得られる G418、ピューロマイシン、ハイグロマイシン（あるいはブラストサイジン）三重耐性株は上記 3種のヒト染色体（断片）を保持していること力 <PCR解析等（実施例 9、 18、 35 ) により確認される。（実施例 63) で得られた内在性抗体重鎖及び軽鎖欠損でありかつヒト 14番染色体（断片）及び 22番染色体（断片）を保持するマウス ES細胞株（TT2F由来、 G418耐性、ピューロマイシン耐性）へのハイグロマイシンあるいはブラストサイジン耐性遺伝子でマ一キングされたヒ卜 2番染色体断片の導人も同様に行う。

(実施例 65) ヒト抗体重鎖および軽鎖遺伝子をそれぞれ含む複数の染色体（断片 ) を同時に保持する内在性抗体重鎖、軽鎖遺伝子欠損マウス ES細胞からのキメラマウス作成

(実施例 61、 62、 63、 64) で取得されるヒト抗体遺伝子を含む染色体（断片）を保持する内在性抗体重鎖、軽鎖遺伝子欠損マウス ES細胞株からのキメラマウス作成は（実施例 10) 等で示した方法により行う。ここで得られるキメラマウスにおいては、宿主胚由来の B細胞で産生されるマウス抗体と ES細胞株由来の B細胞で主に産生されるヒト抗体が（実施例 14、 23、 32) で示した方法により検出される。また、この ES細胞由来の B細胞において機能的な抗体重鎖及び軽鎖/ c遺伝子は導入染色体上のヒト由来のもののみであるので、 ES細胞由来の B細胞の多くはヒト抗体重鎖及び軽鎖/ を産生する（ Lonbergら， Nature, 368, 856-, 1994) 。さらに、（実施例 37、 38) で示した方法により重鎖、軽鎖が共にヒト由来である完全なヒト抗体分子が検出される。

( 1) ヒト 14番染色体断片（抗体重鎖遺伝子を含む）及びヒト 2番染色体断片（軽鎖/ c遺伝子を含む）を同時に保持する内在性抗体重鎖、 /c鎖遺伝子欠損マウス ES細胞からのキメラマウス作成

実施例 62で取得されたヒト 14番染色体断片（抗体重鎖遺伝子を含む）及びヒト 2番染色体断片（軽鎖/ c遺伝子を含む）を同時に保持する内在性抗体重鎖、 /c鎖遺伝子欠損マウス ES細胞株 KH13からのキメラマウス作成は（実施例 10) 等で示した方法により行った。計 176個の注入胚を移植した結果、 20匹の子マウスが誕生した。キメラ個体は、毛色において宿主胚（I CR) 由来の白色の中に TT2細胞由来の野生色（濃茶）が認められるかどうかにより判定される。誕生した 20匹のうち毛色に明らかに野生色の部分のある、すなわち、 ES細胞の貢献の認められる個体は 7匹であった。

この結果より、ヒト 14番染色体断片（抗体重鎖遺伝子を含む）及びヒ卜 2番染色体断片（軽鎖/ ί遺伝子を含む）を同時に保持する内在性抗体重鎖、鎖遺伝子欠損マウス ES細胞株はキメラ形成能を保持している、すなわちマウス個体の正常組織に分化する能力を保持していることが確認された。

(2) ヒト 14番染色体断片（抗体重鎖遺伝子を含む）及びヒ卜 22番染色体断片（軽鎖 I鎖遺伝子を含む）を同時に保持する内在性抗体重鎖、 c鎖遺伝子欠損マウス ES細胞からのキメラマウス作成

実施例 63で取得されたヒ卜 14番染色体断片（抗体重鎮遺伝子を含む）及び.ヒト 22番染色体断片（軽鎖； I遺伝子を含む）を同時に保持する内在性抗体重鎖、鎖遺伝子欠損マウス ES細胞株 LH13からのキメラマウス作成は（実施例 10) 等で示した方法により行った。計 114個の注入胚を移植した結果、 22匹の子マウスが誕生した。キメラ個体は、毛色において宿主胚（ICR) 由来の白色の中に TT2細胞由来の野生色（濃茶）が認められるかどうかにより判定される。誕生した 22匹のうち毛色に明らかに野生色の部分のある、すなわち、 ES細胞の貢献の認められる個体は 5匹であつた。

この結果より、ヒト 14番染色体断片（抗体重鎖遺伝子を含む）及びヒ卜 22番染色体断片（軽鎖 λ鎖遺伝子を含む）を同時に保持する内在性抗体重鎖、 c鎖遺伝子欠損マウス ES細胞株はキメラ形成能を保持している、すなわちマウス個体の正常組織に分化する能力を保持していることが確認された。

(3) ヒ卜 2番染色体部分断片及びヒ卜 14番染色体部分断片を同時に保持する内在性抗体重鎖、 / 鎖欠損マウス ES細胞由来キメラマウス血清における完全ヒト抗体の検出 ·定量

実施例 65- (1) で作製したキメラマウス（KH13由来）から生後 40日目に採血し、血清中のヒ卜抗体濃度を（実施例 14) に従い ELISA法で検出した。 PBSで希釈した抗ヒ卜免疫グロブリン鎖抗体（Kirkegaard & Perry Labolatories Inc.

、 01-10-10) あるいは抗ヒト免疫グロブリン/ c鎖抗体（Vector、 AI-3060) をコ一ティングし、マウス血清（シグマ、 M5905) を加えた PBSで希釈した血清試料を加え、次いでペルォキシダ一ゼ標識抗ヒ卜免疫グロブリン /鎖抗体（The Bind ing Site Limited, P008) あるいはペルォキシダ一ゼ標識抗ヒト免疫グロブリンァ鎖抗体（シグマ、 A0170) を加えてインキュベートした。ペルォキシダーゼ基質として TMBZ (住友べ一クライト、 Mい 1120T) の添加により酵素活性を 450nm の吸光度で評価し、精製された鎖と / 鎖を持つ濃度既知のヒトイ厶ノグロプリン IgM (Caltag, 1-3000) 、 IgG (シグマ、 14506) をマウス血清を添加した PB Sで段階的に希釈したものと比較し血清中のヒ卜抗体濃度を求めた。結果を表 21 に示す。完全ヒ卜抗体濃度が内在性遺伝子を破壊しない ES細胞から作製されたキメラマウスに比べて、 10倍以上高いキメラマウス個体が確認された。またヒ.トァ鎖を含む完全抗体がキメラマウス血清中に確認された。

この結果よりヒ卜 14番染色体部分断片及びヒト 22番染色体部分断片を保持する内在性抗体重鎖、 c鎖欠損マウス ES細胞由来キメラマウスにおいて、重鎖と軽鎖がともにヒ卜である完全ヒ卜抗体濃度が上昇することが確認された。表 21 キメラマウス中のヒト抗体濃度（ELISA)

ESクローンキメラマウスキメラ率％ IgM, κ (mg/1) IgG, κ (mg/1) KH13 CKH13-1 95 0.1 0.07

KH13 CKH13-2 85 0.9 0.13

(4) ヒト 14番染色体部分断片及びヒト 22番染色体部分断片を保持する内在性抗体重鎖、鎖欠損マウス ES細胞由来キメラマウス血清における完全ヒト抗体の検出 ·定量

実施例 65- (2) で作製したキメラマウス（LH13由来）からから生後 49日目に採血し、血清中のヒト抗体濃度を（実施例 14) に従い ELISA法で検出した。 PBS で希釈した抗ヒ卜免疫グロブリン； I鎖抗体（Kirkegaard & Perry Labolatories

Inc.、 01-10-11) あるいは抗ヒト免疫グロブリン； I鎖抗体（Vector, AI-3070) をコーティングし、マウス血清（シグマ、 M5905) を加えた PBSで希釈した血清試料を加え、次いでペルォキシダ一ゼ標識抗ヒ卜免疫グロプリン鎖抗体（The

Binding Site Limited, MP008) あるいはペルォキシダ一ゼ標識抗ヒト免疫グロブリンァ鎖抗体（シグマ、 A0170) を加えてインキュベートした。ペルォキシダーゼ基質として TMBZ (住友べ一クライト、 Mい 1120T) の添加により酵素活性を 45 Onmの吸光度で評価し、精製された//鎖と / c鎖を持つ濃度既知のヒトイムノグロブリン IgM (Caltag, 13000) 、 IgG (シグマ、 14506) をマウス血清を添加した PBSで段階的に希釈したものと比較し血清中のヒト抗体濃度を求めた。結果を表 22に示す。完全.ヒ卜抗体濃度が内在性遺伝子を破壊しない ES細胞から作製されたキメラマウスに比べて、約 40倍高いキメラマウス個体が確認された。またヒト 7鎖を含む完全抗体がキメラマウス血清中に確認された。

この結果よりヒ卜 14番染色体部分断片及びヒト 22番染色体部分断片を保持する内在性抗体重鎖、 c鎖欠損マウス ES細胞由来キメラマウスにおいて、重鎖と軽鎖がともにヒトである完全ヒト抗体濃度が上昇することが確認された。表 22 キメラマウス中のヒ卜抗体濃度（ELISA)

ESクローンキメラマウスキメラ率％ IgM, λ (mg/1) I G, λ (mg/1) LH13 CLH13-1 95 13 2.6

LH13 CLH13-2 90 2.8 0.36

(実施例 66) ヒ卜 14番染色体部分断片及びヒト 22番染色体部分断片を保持する内在性抗体重鎖、軽鎖欠損マウス ES細胞を免疫不全マウス宿主胚に移人して作製したキメラマウスからの完全ヒ卜抗体産生ハイブリドーマの取得

(実施例 67- (3)) で作製されたキメラマウス CLH13- 3 (TT2FESクローンし H13由来、キメラ率 35%) に対して、生後 43日目から HSAによる免疫を開始した。 PBS に溶解したヒト血清アルブミン（HSA、シグマ、 A3782) とアジュバント（MPL- TDM Emulsion, RIBI Immunochem Reseach Inc. ) とを混合して 0.25mg/mlの HSA 溶液を調整し、その 0.2mlを 1週間おきに 2回腹腔に免疫した。さらに 1週間後に PBSに溶解したヒト血清アルブミンを免疫した。 1週間おきに採血し、血清中の抗 HSAヒト抗体濃度を（実施例 14) に従い EL1SA法で検出した。結果を図 35に示す。最終免疫の 3日後に、キメラマウスからひ臓を取り出し、（実施例 24) に従い PEGにて細胞融合し、ハイプリドーマを作製した。融合後の細胞を、ひ細胞数が 100万個/ miとなるよう、 HAT (大日本製薬、 No, 16 - 808- 49) あるいは lmg/ mlの G418を添加した培地（三光純薬、エス ' クローンクローニングメデューム 1 -B) に希釈し、 96穴プレートの各 weiiに 100 1ずつ分注し培養した。どちらの選択培地にも HCF (エア ' ブラウン）を 5 %添加した。 G418、 HAT選択のプレー卜共に、培養 6日目にはほぼ全 weliにコロニーが生じ、合計約 770個のハイプリドーマ陽性ゥエルを得た。培養上清を採取し、（実施例 14) に従い EL1SA法によつてヒ卜抗体産生ハイプリドーマのスクリーニングを行った。抗ヒ卜免疫グロブリン λ鎖抗体（Vector Λ卜 3070) をコ一ティングし、ピオチン標識抗ヒト免疫グロブリン； I鎖抗体（Vector、 BA-3070) さらにアビジン一ペル才キシダーゼ複合体（Vector、 ABCキット PK4000) を用いて TMBZ (住友べ一クライト、 Mい 1120T ) により検出した。陰性対照の約 2倍以上の吸光度を目安にして判定し、 17個の陽性ゥエルを得た。陽性ゥエルの細胞を 24穴プレートに移し、 [MDMに 10¾FBSを添加した培地を用いて培養した。培養上清を（実施例 65- (4)) の方法に従い EL1SA で解析し、 16個のゥエルで 0.09〜llmg/inlの、ヒト Ig//と ig λを持つ完全ヒト抗体の存在が確認された。（実施例 33) に従い、抗 HSAヒト λ鎖の抗体価を測定し、 1個の陽性ゥエルを得た。完全ヒト抗体陽性かつ抗 HSAヒト λ鎖陽性ゥエルの細胞をく安東、単クローン抗体実験操作入門、講談社サイェンティフイク， 1991 > に記された方法に従い、限界希釈法を用いてクローニングした。抗 HSAヒトス鎖陽性ハイプリドーマを 2クローン得た。

この結果よりヒ卜 14番染色体部分断片及びヒト 22番染色体部分断片を保持する内在性抗体重鎖、軽鎖欠損マウス ES細胞を免疫不全マウス宿主胚に移入して作製したキメラマウスから完全ヒト抗体を生産するハイプリドーマが得られることが確認された。また HSA抗原刺激に対して、抗原特異的ヒト lg および Ig;iの抗体価上昇が起こることが確認された。さらにこのキメラマウスからヒト lg〃と ^スから成る HSA特異的抗体を生産するハイプリドーマが得られることが確認された

〇

また染色体が薬剤耐性マーカーを持っため、 HATを添加せず、 G418を用いてハイブリドーマを選択することが可能であった。このことによってヒト染色体を持つ細胞のみが増殖するため、ハイプリドーマを選択的に得ることができる。また融合後の細胞からヒト染色体の脱落を防ぐことが期待できる。さらに融合に用いるミエロ一マ細胞力く HGPRT酵素 (hypoxanthine-guanine-phosphor ibosy 1 trasf er ase) を持っているような、 HAT選択に不向きな細胞であっても使用可能となることが期待される。

(実施例 67) 重鎖遺伝子欠損宿主胚とのキメラマウス作成

(実施例 49) で作成した内在性抗体重鎖片側ァレル欠損 TT2F細胞株由来キメラマウスの子孫のうち野性色を示すものについてサザン解析（実施例 49) 等により欠損アレルを保持する個体を選抜する（期待される確率は 1/2である）。これらの抗体重鎖欠損へテロ接合体の雌雄個体の交配により生まれる子マウスについてサザン解析（実施例 49参照）、血清中の抗体重鎖産生（K i tamuraら， Na ture, 35 0, 423-, 1991 ) 等の解析を行い、両側アレルが欠損し、自身の機能的な抗体をほとんど産生できない抗体重鎖欠損ホモ接合体を得ることができる（期待される確率は 1/4である、膜型鎖欠損マウスにおける結果は !U tamuraら， Na ture, 350,

423-, 1991参照）。

( 1) 抗体重鎖ノックァゥ卜マウス系統の確立

(実施例 49) で作成した内在性抗体重鎖片側アレル欠損 TT2F細胞株由来キメラマウスの子孫のうち野性色を示すものについてサザン解析を行ない欠損ァレルを保持する個体を選抜した。これらの抗体重鎖欠損へテロ接合体の雌雄個体の交配により生まれる子マウスについてサザン解析（実施例 49参照）、血清中の抗体^ 鎖産生（マウス//鎖の EU SA解析は実施例 75参照、 lU tamuraら， Na ture, 350, 4 23-, 1991) 等の解析を行った結果、両側アレルが欠損し、自身の抗体をほとんど産生できない抗体重鎖欠損ホモ接合体を得ることができた（膜型鎖欠損マウスにおける結果は! ( amuraら， Na ture, 350, 423-， 1991参照）。

すなわち、抗体重鎖片側アレル欠損 TT2F細胞株より、抗体重鎖ノックアウトマウス系統を確立することができた。

清浄な環境で飼育したホモ接合体雌雄個体の交配により得られる胚をキメラマウス作成の際の宿主として利用できる。この場合キメラマウスにおいて機能的な

B細胞はほとんど注入した ES細胞に由来する。 RAG- 2欠損マウス (Sh i nka iら，

Ce l l , 68, 855-, 1992) 等、機能的な B細胞を自ら作ることができない他のマウス系統もこの目的に同様に利用できる。このシステムにおいて（実施例 62、 63、 64) で得られる内在性抗体重鎖及び軽鎖欠損かつヒト 14番 + 2番あるいは 14番 + 22番あるいは 14番 + 2番 + 22番染色体（断片）を保持するマウス ES細胞株を使用し（実施例 10) 等に示した方法でキメラマウスを作成する。得られるキメラマウスでは ES細胞由来の B細胞において機能的なヒ卜抗体重鎖（14番染色体上）、軽鎖/ c (2番染色体上）、軽鎖； I (22番染色体上）遺伝子より主にヒ卜抗体を生産する。

(2) ヒト 2番染色体部分断片及びヒト 14番染色体部分断片を同時に保持する内在性抗体重鎖、鎖欠損マウス ES細胞を免疫不全マウス宿主胚に注人して作製したキメラマウス血清における完全ヒト抗体の検出 ·定量

(実施例 62) で取得された ES細胞株 KH10を実施例 67- (1) で確立された抗体重鎖ノックァゥトマウスの雌雄交配により得られる胚に注人することにより実施例 65- (1) と同様な方法でキメラマウスを作製した。 7週令のキメラマウスから採血し、血清中のヒト抗体濃度を（実施例 14) (実施例 65- (3)) に従い ELISA 法で検出した。結果を表 23に示す。ヒト / c鎖と / z鎖またはァ鎖を含む完全抗体がキメラマウス血清中に確認された。また免疫不全宿主胚に ES細胞を移入することにより、 B細胞は ES細胞からのみ分化するため、たとえキメラ率が低くとも完全抗体が得られることが確認された。表 23 キメラマウス中のヒト抗体濃度（ELISA)

ESクローンキメラマウスキメラ率％ I M, κ (mg/1) I G, K (mg/1) KH10 CKHlO-1 6 6.1 0.17

KH10 CKH10-2 3 1.9 0.4

(3) ヒ卜 14番染色体部分断片及びヒ卜 22番染色体部分断片を保持する内在性抗体重鎖、 /c鎖欠損マウス ES細胞を免疫不全マウス宿主胚に注入して作製したキメラマウス血清における完全ヒト抗体の検出 ·定量

(実施例 63) で取得された ES細胞株 LH13を実施例 67- (1) で確立された抗体重鎖ノックァゥトマウスの雌雄交配により得られる胚に注入することによりキメラマウスを作製した（実施例 65- (2) と同様な方法による）。誕生したキメラマウスから生後 5週齢に採血し、血清中のヒト抗体濃度を（実施例 14) (実施例 65- (4) ) に従い EL I SA法で検出した。結果を表 24に示す。ヒト； I鎖と ,"鎖またはァ鎖を含む完全抗体がキメラマウス血清中に確認された。表 24 キメラマウス中のヒト抗体濃度（EL 1 SA)

ESクローンキメラマウスキメラ率％ I g , λ (mg/1 )

し H13 CLH13-3 35 51

し H13 CLH13-4 85 32

し H13 CLH13-4 30 27

(実施例 68) ヒ卜 14番染色体断片（抗体重鎖遺伝子を含む）導人 ES細胞由来キメラマウス子孫におけるヒト染色体の保持

( 1) 抗体重鎖遺伝子を含むヒト 14番染色体断片を保持するヒトーマウス雑種細胞の単離

ヒト 2番染色体断片はマウスへの導入後、子孫への伝達が観察された（実施例 42) ことから、ヒト 14番染色体についても断片を用いることにより子孫への伝達の可能性が高まることが予想される。 G418耐性遺伝子でマーキングされたィンタクトなヒ卜 14番染色体を保持する A9/#14株（実施例 9 ； Tomi zukaら， Na ture Gen e t. vo l 16, 133-143(1997)に記載されている A9/14-C11株) についてより詳細な F ISH解析（実施例 9) を行った結果、 10 程度の細胞集団が非常に小さく断片化したヒト 14番染色体のみを含むことが観察された。この染色体断片は 2番染色体断片（実施例 12) と同程度のサイズであり、また G418耐性マーカーを含むと考えられる。

断片化ヒ卜 14番染色体を含む細胞クローンの単離のため、 A9/#14細胞約 300個を 10cmシャ一レに播種して培養し、 10日後に出現したコロニーを 31個ピックアツプした。これらのクローンよりゲノミック DNAを調製し、（実施例 9) と同様な方法で 14番染色体特異的プライマー（実施例 9に示された 18種のうち PC 1、 NPを除く 16種）を用いた PCR解析を行った。その結果、 1株（A9/SC20) において 16 種中 I gM、 I GG1、 IGA2、 1 GVH3のみが検出された。また、ヒト 14番染色体長腕部 ' テロメァ近傍のマ一カーである D14S543 (Sc i ence, HUMAN GENETI C MAP ( 1994), 塩基配列は Genbank等のデータベースより入手）も検出されたことから、この断片（以後 SC20断片）は抗体重鎖遺伝子を含む 14番染色体テロメァ近傍部を含むと考えられた。

SC20 断片についてヒ卜染色体特異的プローブを用いた F I SH解析（Tomi zuka.ら、 Nature Gene t, vo l 16， 133-143 (1997) ) を行った。その結果このクロ一ンにおいて、コントロール（インタク卜な 14番染色体を含む）と比較してプロ一ブにハィプリダイズする染色体のサイズが小さくなっていることが観察された。すなわち、 A9/SC20は断片化されたヒ卜 14番染色体を含むことが確認された。

さらに SC20断片がヒト 14番染色体由来のセントロメァ配列を含むかについて調べるため、 A9/SC20細胞の染色体標本と、ジゴキシゲニン- 11- dUTPで標識したヒ卜 14番、 22番セントロメァ特異的な αサテライト DNA (コスモバイオより購入）をプロ一ブとしハイブリダィズさせ、参考文献（Tomi zukaら， Nature Gene t i cs, 1 6, 133-143) に記載された方法に従って F ISH解析を行った。その結果、上記プローブとハイブリダィズするシグナルが確認され、 SC20断片がヒト由来のセント口メァ配列を有することが明らかとなった（図 36) 。

(2) 14番染色体（断片）の TT2F細胞への導入及び TT2F細胞における安定保持 14 番染色体断片の TT2F細胞へのミクロセル移入は染色体供与細胞として A9/SC2 0を用い、実施例 9に示した方法で行った。 G418 ( 300 β

選択の結果 5株の耐性株を得た。これらの ES細胞株についてと同様に PCR解析（実施例 68- (1)) および F ISH解析（ヒト染色体特異的プローブ使用， Tomi zukaら，前記）によりヒト 14番染色体断片の保持を確認した。 F I SH解析の結果を図 37に示す。

マウス個体における導人ヒ卜染色体の安定保持は導入遺伝子の効率的発現および導人染色体の効率的な子孫への伝達に重要である。 ES細胞株の宿主胚注入後は薬剤添加による選択ができないため、導入ヒト染色体が非選択条件でも安定に保持されることが望ましい。 SC20 断片を含む TT2F(SC20) -21株について G418非添加培地で長期間培養を行い' 、この条件における SC20断片の保持について検討した。

TT2F(SC20) -21株を選択培地（G418 300 z g/ml ) で 1週間培養した後、非選択培地で 45日間継代培養した（1日おきに 8倍希釈で植え継ぎ）。継代 0、 15、 30 、 45日目に、 300- 1000個の細胞を 35隱シャーレ 6枚に播き、そのうち 3枚を選択培地、 3枚を非選択培地で約 1週間培養してコロニーを数えた。選択条件の 3枚分のシャーレのコロニー数の合計（A) 、非選択条件の 3枚分のシャーレのコロニー数の合計（B) より染色体保持率（A/B) を求めた。比較のため、ヒト 2番染色体由来 W23断片を含む P-21 (実施例 40) についても同様（選択培地は 0. 75 /2 g/ml puromyc i n入り）な実験を行い、その結果を図 38に示した。図 38に示した値は 3回の独立した実験の平均値である。その結果 SC20は 45日間の非選択条件での培養後も 95¾以上という高い保持率を示した。一方、 W23断片は同様の条件下で 14¾'の保持率であった。

これまでに、ヒ卜 Y染色体由来の人工染色体（ヒト Y由来セントロメァを含む ) を CH0 (ハムスター線維芽細胞）や DT40 (ニヮトリ Bリンパ球細胞）、マウス ES細胞に移入した報告がある（Shenら， Hum. o l. Gene t. 6, 1375-1382) 。非選択培養下において、その人工染色体は CH0と DT40では安定に保持されていたが、マウス ES細胞中では再編成によりマウスのセント口メァを偶然に獲得した染色体のみが、安定に保持されていた。このことから、ヒト由来セン卜ロメァはマウス ES細胞中で不安定であるという意見が提出された（Shenら，前記）。

上記の結果は SC20の場合ヒト由来のセントロメァでありながら（実施例 68-(1 ) ) 、マウス ES細胞で非常に安定であることを示している。同様にヒ卜セントロメァを含むことが示唆される W23断片（Tomi zukaら，前記）の場合不安定性が見られたことから ES細胞におけるヒト由来染色体の安定性は染色体の種類により異なると考えられる。

以上の結果より、 SC20断片はマウス個体への遺伝子導入用のベクターとして非常に有用であることが示された。

(3) ヒト 14番染色体（断片）を保持する ES細胞株からのキメラマウス作製実施例 68- (2) で取得され、ヒ卜 14番染色体断片の保持が確認された G418耐性 ES細胞株 TT2F(SC20)-21を凍結ストックより立ち上げ、 ICR (日本クレア社）雄雌マウスの交配により得られた 8細胞期胚に胚あたり 10〜12個注入した。 ES細胞用培地（実施例 ·9) で一晩培養して胚盤胞に発生させた後、偽妊娠処理後 2.5 日の仮親 ICRマウス（日本クレア社）の子宮に片側の子宮あたり約 10個のインジェクション胚を移植した。

計 188個の注人胚を移植した結果、 22匹の子マウスが誕生した。キメラ個体は、毛色において宿主胚（ICR) 由来の白色の中に TT2細胞由来の野生色（濃茶）が認められるかどうかにより判定される。誕生した 22匹のうち毛色に明らかに野生色の部分のある、すなわち、 ES細胞の貢献の認められる個体は 20匹であった。うち 2個体は毛色が完全に野生色の（ES細胞に由来する）キメラマウスであったこの結果より、ヒト 2番染色体部分断片を保持する ES細胞株 TT2F(SC20)- 21はキメラ形成能を保持している、すなわちマウス個体の正常組織に分化する能力を保持していることが確認された。

5 週齢のキメラマウス 2匹（TT2F(SC20)- 21由来、キメラ率 100%、 C14m-16， - 17) より採血し血清中のヒト抗体 IgM、 IgG濃度を（実施例 14) と同様に ELISA 法を用いて定量した。結果を表 25に示す。表 25 キメラマウス中のヒト抗体抗体重鎖濃度（ELISA)

キメラマウスキメラ率％ IgM(mg/l) lgG(mg/l)

C14m-16 100 7.9 1.0

C14m-17 100 6.0 1.3 両方のキメラマウス血清中にヒト抗体 lgM、 IgGが検出された。その値はより大きなヒト 14番染色体断片を保持するキメラマウスの値（実施例 14) と同等であつた。すなわち、 SC20断片に含まれるヒト抗体遺伝子は機能的であることが示された。 (4) ヒ卜 14番染色体断片を保持するマウス ES細胞（TT2F, X0) 由来キメラマウスの子孫におけるヒト染色体保持の検出および血清中ヒ卜抗体 //鎖、ァ鎖の検出、疋里

(実施例 68- (3)·) で得られた雌キメラマウスのうち C14m- 16， C14m_lT (共に毛色のキメラ率 100¾) について雄 I CRマウスとの交配により ES細胞由来の子孫が誕生するかを検討した。この交配において I CR雄マウス（アルビノ、劣性）由来精子により受精したキメラマウス中の TT2F細胞（野生色：優性）由来の卵子からは野生色、 I CR由来卵子からは白色の子マウスが誕生する。この交配によって得られた生存可能な子マウス計 30匹のすべてが ES細胞由来の毛色である野生色を示し ES細胞の効率的な生殖系列への伝達が示された。これらの子マウスの尻尾より調製したゲノム DNAについてヒ卜染色体断片の保持を PCR法により検討した。 TT2F (SC20) -21で存在が確認されている 3種のプライマ一（IGVH3, I M, D14S543 ) について PCR増幅を行なった結果、 30匹中 10匹 (33¾) において TT2F(SC20) - 21 で検出された 3種のマーカーの存在が確認された。すなわち、ヒ卜 14番染色体断片を保持する TT2F細胞株 TT2F(SC20) - 21がキメラマウス中で機能的な卵子に分化し、その卵子由来の F1子孫にヒ卜 14番染色体断片が伝達されたことが示された。ヒ卜 14番染色体を保持することが確認された 10匹のキメラマウス子孫のうち 9 匹について血清中のヒト抗体 I gM、 I gGの検出、および定量を以下の通り行った。生後約 4~8週齢のマウスより採血し、血清中のヒト抗体//鎖およびァ鎖を（実施例 14) と同様に EL ISA法を用いて検出した。その結果（表 26) 、調べた全ての個体の血清中においてヒト抗体鎖およびァ鎖が検出された。すなわち、キメラマウスから生まれた F1子孫においてもヒ卜抗体重鎖遺伝子が機能することが確認された。表 26 キメラマウス中のヒ卜抗体 IgMおよび igG濃度（EL1SA)

親キメラマウスマウス個体番号 IgM(mg/l) IgG(mg/l)

C14m-16 16 - 5 12.9 2.2

C14m-16 16-14 3.5 2.2

C14m-16 16-16 4.1 2.0

C14m - 16 16- 17 5.5 3.9

C14m-1 17 - 7 5.7 1.0

C14m-1 17- 8 3.6 1.2

C14m-1 17-19 3.5 0.75

C14m-1 17-22 2.4 1.4

C14m-1 17-23 5.3 1.9 さらに、 Fl子孫のうち雄 3個体、雌 4個体について MCH(ICR)マウス（日本クレァより購入）と交配し、誕生した F2子孫について上記に示した尻尾 DNAの PCR解析及び、ヒト抗体//鎖発現解析を行った。その結果、雄経由で 30% (142匹中 43 匹ポジティブ）、雌経由で 33% (60匹中 20匹ポジティブ）の F2子孫に SC20断片が伝達したことが確認された。

これらの結果より、 14番染色体断片（ヒト抗体重鎖遺伝子を含む）を保持し、ヒト抗体重鎖を発現する継代可能なマウス系統を確立することができた。

(5) ヒト 14番染色体断片のマウス個体における安定保持

(実施例 68-(4)) において取得された SC20断片を保持する F1子孫 3匹（表 26中

： 16-5、 17-8、 17-23) をマウス個体における SC20断片保持率解析に用いた。マウスにコルセミド（100 zg/ml) を 0.3ml腹腔内注射し、頸椎脱臼により安楽死させ、脳、肝臓、脾臓、精巣、骨髄を摘出した。骨髄をのぞくすべての組織を PB

S (-) で洗浄した後、組織を解剖用ハサミで細かく切り、 KC1 (0.075M) により 15分間の低調処理、カルノア固定をした。カルノア固定の上清を用いて通常通り標本を作成した。 FISH解析はヒト染色体特異的プローブ（Human COT- 1 DNA) を用い、参考文献（Tomizukaら， Nature Genetics, 16, 133-143) に記載された方法に従って行った。脳、脾臓、肝臓、骨髄については任意に選んだ 30個以上の間期核についてシグナルの検出されるもの（図 39中 +) 、検出されないもの（図 39中 -）の数をカウントし保持率を算出した。精巣については、第一減数分裂期像、第二減数分裂期像、精子に分類し、各 10個以上についてカウントし保持率を算出した。その結果、脳、肝臓では 3個体とも 100¾近い保持率を示した。骨髄、脾臓では、保持率の低下が観察された。精巣では、第一減数分裂像で 80〜100% 、精子で 30〜50 %の結果が得られた。 SC20断片が安定に保持されていると仮定すると理論的には第一減数分裂で 100%、第二減数分裂と精子で 50%となる。したがって、精巣で SC20断片は安定に保持されていると考えられた。

また、同時に尻尾より繊維芽細胞を調製し（実施例 79) と同様に SC20断片の保持率を検討した。その結果は、 16-5 : 98 17- 8 : 96¾、 1了- 23 : 98,¾であった（各々 50核板についてテス卜）。

(6) ヒ卜 14番染色体断片（抗体重鎖遺伝子を含む）の導人による、抗体産生能欠損マウスの遺伝的救済

B リンパ球の発生に必須な抗体//鎖遺伝子ノックァゥトマウス（実施例 67- (1)

) は体液性免疫を担う成熟 Bリンパ球が欠損していることにより抗体を産生することができない。この欠損を交配による SC20断片（ヒト抗体重鎖遺伝子を含む）導入により救済できるかを検討するため、以下の実験を行った。

(実施例 49) で作成した内在性抗体重鎖片側アレル欠損 TT2F細胞株由来キメラマウスと MCH( ICR)マウスとの交配により得られた子孫のうち野性色を示すものについてサザン解析を行ない欠損ァレルを保持する個体を選抜した。得られた抗体重鎖欠損へテロ接合体の雌個体と（実施例 68- (4) ) で得られた SC20断片を保持する F1子孫雄個体（17-7) を交配した。その結果得られた 5匹の子マウスについて

SC20断片保持検定のための PCR解析、血清中ヒト抗体鎖、ァ鎖測定を行った（実施例 68- (4) ) 結果、 #2, #3， #5の 3個体が SC20断片を保持することが確認された（表 27) 。また、血清中マウス抗体/ z鎖発現解析（実施例 75) の結果、 1、 #3 がマウス^鎖陰性すなわち内在性抗体重鎖欠損についてホモであることが示された（表 27) 。これは 5個体の尻尾より調製した DNAを用いたサザン解析（実施例

49参照）の結果と一致した。マウス、ヒト抗体重鎖共に検出されない個体^と比較して、抗体重鎖欠損ホモかつ、 14番染色体保持の遺伝子型を持つ個体 #3においては非常に高濃度のヒト抗体//鎖（310 mg/1) 、ァ鎖（860 mg/1) が検出されたまた、（実施例 29) の方法に従い、ヒトァサブクラスの定量を行い、 4種のサブクラス（ァ 1 、ァ 2· 、ァ 3 、ァ 4)をすベて検出した。特にヒト〃鎖の濃度は野性型マウスにおけるマウス/ 鎖の濃度（Mendezら， Nature Genet. 15， 146-156 (1997)) に匹敵する。すなわち、この個体においては内在性重鎖遺伝子の欠損による抗体産生不能（Bリンパ球の欠損：参考文献 Ki tamuraら， Nature, 350, 4. 23-, 1991) という症状がヒト 14染色体断片 SC20 (抗体重鎖遺伝子を含む）の導入により治療され、抗体産生能及び Bリン '、。球産生能が回復したことを示している

表 27

個体番号 SC20断片保持マウス/ 鎖ヒト IgM(mg/l) ヒト IgG(mg/l)

1 - - 検出限界以下 0.33

2 I + 8.4 5.3

3 + - 310 860

4 - + 測定せず測定せず

5 + 十 4.8 0.86

(実施例 69) ヒト 22番染色体（断片）導入 ES細胞由来キメラマウス子孫におけるヒト染色体の保持

(1) ミクロセル融合を利用したヒト 22番染色体の断片化

ヒ卜 2番染色体断片（実施例 42) 、ヒト 14番染色体断片（実施例 68- (4)) は共にマウスへの導入後、子孫への伝達が観察されたことから、ヒト 22番染色体についても断片化することによりマウスにおける子孫への伝達の可能性が高まることが予想される。ミクロセル融合による受容細胞へのヒト染色体移入の際、 40〜80 %の移入クローンは融合時に断片化されたヒト染色体を保持することが観察されている（押村ら、蛋白質核酸酵素 vol.35， No.14 1990) が、この現象を利用してヒト 22番染色体の断片化を試みた。 6- 1株（実施例 35) を染色体供与細胞、野性型マウス A9細胞を受容細胞としたミクロセル融合実験（実施例 1 ) を行った結果、 73個の G418耐性クローンが得られた。得られたクローンよりゲノミック DNAを調製し、スプライマ一（実施例 2) を用いた PCRによりスクリーニングした。ヒ卜 I g ;i遺伝子を保持していた 67 クローンについて、 22番染色体上の 8種のマーカー（D22S315, D22S275, D22S28 0， D22S278, D22S283, D22S272, D22S282, D22S274 ； 22番染色体上での順序は Na t ure, vo l 377, 367-379, ( 1995)を参照。プライマーの塩基配列は Genbank等のデータベースより入手）特異的プライマ一を用いた PCR解析を行った。その結果 25クローンにおいてマーカーの一部が消失していたことから、これらのクローンにおいて 22番染色体が断片化していると考えられた（図 40) 。中でも、クローン 22は ΐ £ λと D22S315、 #28は I gス以外のマ一カーが消失しているため、かなり小さな断片になっていると考えられる（図 40) 。クローン #28についてヒト染色体特異的プローブを用いた F I SH解析（実施例 18) を行った結果を図 41に示す。このクローンにおいて、コントロール（インタク卜な 22番染色体を含む）と比較してプローブにハイプリダイズする染色体のサイズが小さくなっていることが観察される。すなわち、ミクロセル融合時に起こる染色体の断片化により、抗体 I遺伝子を含むヒト 22番染色体断片を取得することができた。

(2) 22番染色体（断片）の TT2F細胞への導人

22番染色体（断片）の TT2F細胞へのミクロセル移入は実施例 2に示した方法で行った。染色体供与細胞としては #22、 #28、および 6-1を用いた。クローン #2 2、 A9/#22(6_l )についてはピューロマイシン（0. 75〃g/ml ) 選択、クローン #2 8については G418 (225 g/ml ) 選択を行いそれぞれ 13株（クローン #22より）、 5株（6- 1より）および 3株（クローン #28より）の薬剤耐性株を得た。これらの ES細胞株について（実施例 69- (1 ) ) と同様に PCR解析および F I SH解析によりヒト 22番染色体（断片）の保持を確認する。

(3) ヒ卜 22番染色体（断片）を保持する ES細胞株からのキメラマウス作製実施例 69- (2) で取得され、ヒト 22番染色体の保持が確認された薬剤耐性 ES 細胞株について（実施例 3) の方法によりキメラマウスを作製する。キメラマウスにおけるヒ卜 22番染色体（断片）保持確認は（実施例 4) の方法により行う。

( 4) ヒ卜 22番染色体（断片）の子孫への伝達

ヒト 22番染色体（断片）を保持するキメラマウスと I CRマウスを混合して交配する。誕生する野生色の子マウスの尻尾より調製したゲノム DN'Aについてヒ卜 22 番染色体断片の保持を PCR法により検討する（実施例 30、 42、 43参照）。ヒト 22 番染色体あるいはその部分断片を保持するマウス ES細胞株は（実施例 42) 及び（実施例 43) で示した通りにキメラマウス中で機能的な卵子あるいは精子に分化し、それ由来の子孫にヒト 22番染色体（断片）が伝達可能である。すなわちヒト抗体軽鎖 I遺伝子を含む 22番染色体（断片）を保持する継代可能なマウス系統を確立することができる。

(実施例 70) ヒト 2番染色体断片及び 14番染色体（断片）を同時に保持するマウス個体の交配による作成

(実施例 42) あるいは（実施例 43) で得られたヒ卜 2番染色体断片を保持するマウス系統と（実施例 68) で得られたヒト 14番染色体（断片）を保持するマウス系統を交配することにより生まれる子マウスの尻尾より調製したゲノム DNAを PC R法等（実施例 9、 42、 43) により解析して、ヒト 2番染色体部分断片及びヒト 14番染色体（断片）を同時に保持する個体を得る。

(実施例 71) ヒト 22番染色体（断片）及び 14番染色体（断片）を同時に保持するマウス個体の交配による作成

(実施例 69) で得られるヒト 22番染色体（断片）を保持するマウス系統と（実施例 68) で得られるヒ卜 14番染色体（断片）を保持するマウス系統を交配することにより生まれる子マウスの尻尾より調製したゲノム DNAを PCR法等（実施例 30 、 42、 43) により解析して、ヒト 22番染色体（断片）及びヒト 14番染色体（断片 ) を同時に保持する個体を得る。 (実施例 72) ヒ卜 2番染色体断片、 14番染色体（断片）及び 22番染色体（断片）を同時に保持するマウス個体の交配による作成

(実施例 71) で得られるヒ卜 22番染色体（断片）及びヒ卜 14番染色体（断片）を保持するマウス系統を（実施例 42、 43) で得られたヒ卜 2番染色体断片を保持するマウス系統と交配することにより生まれる子マウスの尻尾より調製したゲノム DNAを PCR法等（実施例 9、 30、 42、 43) により解析して、ヒト 22番染色体（断片）及びヒト 14番染色体（断片）及びヒト 2番染色体部分断片の 3種のヒ卜染色体を同時に保持する個体を得る。あるいは（実施例 70) で得られるヒト 2番染色体（断片）及びヒ卜 14番染色体（断片）を保持するマウス系統と（実施例 69) で得られるヒト 22番染色体断片を保持するマウス系統と交配することによつても同様に 3種のヒト染色体を同時に保持するマウス個体を得る。

(実施例 73) 完全なヒ卜抗体を主として産生するマウス系統の交配による作成ヒト 2番 + 14番（実施例 70) 、 14番 + 22番（実施例 71) 、 2番 + 14番 + 22番（実施例 72) 染色体を保持するマウス系統を内在性抗体重鎖、軽鎖/ c遺伝子を欠損しているマウス系統と繰り返し交配し、ヒ卜 2番 + 14番、 14番 + 22番、または 2 番 + 14番 + 22番染色体を保持し、かつ内在性抗体重鎖遺伝子及び軽鎖/ c遺伝子欠損についてホモであるマウス系統を PCR解析等（実施例 9、 30、 42、 43) により選抜する。これらの系統においては、主として完全なヒ卜抗体が産生される（Gr eenら， Nature Gene t i cs, 7, 13-， 1994，し onbergら， Nature, 368, 856-, 199 4) 。

以下、ヒ卜 2番染色体断片及びヒト 14番染色体断片を保持し、かつ内在性抗体重鎖遺伝子及び抗体鎖遺伝子欠損についてホモであるマウス系統の確立について示す。交配に用いた 4つの系統及びそれぞれの系統の持つ遺伝子型の検定法は以下の通りである。

( 1) 実施例 42で得られたヒ卜 2番染色体断片を保持するマウス系統：実施例 42 に示した尻尾 DNAの PCR解析および血清中ヒト抗体/ c鎖発現を指標としてヒト 2 番染色体断片保持を検定

(2) 実施例 68- (4)で得られたヒト 14番染色体断片を保持するマウス系統：実施例 68- (4)に示した尻尾 DNAの PCR解析および血清中ヒト抗体//鎖発現を指標としてヒト 14番染色体断片保持を検定

(3) 実施例 67- ( 1)で得られた抗体重鎖ノックァゥトマウス系統：実施例 67- α) に示した尻尾 DNAのサザン解析及び、血清中マウス抗体鎖発現の有無（実施例 75) により重鎖欠損ホモあるいはヘテロ個体を検定

(4) 実施例 80で得られた抗体/ c鎖ノックァゥトマウス系統：実施例 80に示した尻尾 DNAのサザン解析により c鎖欠損ホモあるいはヘテロ個体を検定

上記の 4系統を互いに交配することにより、これら 4つの遺伝子型（2番染色体断片保持、 14番染色体断片保持、抗体重鎖欠損ホモあるいはヘテロ、抗体/ c鎖欠損ホモあるいはヘテロ）を同時に保持する系統の確立を行った。上記 4系統を出発材料として数回の交配を経た後、『14番染色体断片保持、抗体重鎖欠損ホモ、抗体/ 鎖欠損へテロ』の遺伝子型を持つ雄個体と『2番染色体断片保持、抗体重鎖欠損ホモ、抗体/ 鎖欠損ホモ』あるいは『2番染色体断片保持、抗体重鎖欠損ホモ、抗体鎖欠損へテロ』あるいは『2番染色体断片保持、抗体重鎖欠損へテロ、抗体/ c鎖欠損ホモ』のいずれかの遺伝子型を持つ雌個体の交配を行った。その結果、個体 HK23 『2番染色体断片保持、 14番染色体断片保持、抗体重鎖欠損ホモ、抗体 c鎖欠損へテロ』及び個体 HK29 『2番染色体断片保持、 14番染色体断片保持、抗体重鎖欠損へテロあるいは野生型、抗体/ 鎖欠損へテロ』を得た。同じ交配により得られた『2番染色体断片保持、 14番染色体断片保持、抗体重鎖欠損へテロあるいは野生型、抗体/ c鎖欠損野生型』の遺伝子型の個体（HK28)も含めて図 42に血清中各抗体濃度及び遺伝子型を示す。 HK23の血清中にはヒト鎖とヒト c鎖からなる完全なヒト抗体が 18mg/lの濃度で検出された（実施例 38) 。

ここで得られた個体同士を交配することにより、『2番染色体断片保持、 14番染色体断片保持、抗体重鎖欠損ホモ、抗体 /c鎖欠損ホモ』の遺伝子型を持つ個体を作製することができる。この系統においては、内在性/ c鎖遺伝子の欠損がヒト 2番染色体断片に含まれるヒト抗体/ c鎖遺伝子によって代替される（Lonbergら， Nature, 368, 856-, 1994) ため、 HK23よりさらに高い濃度のヒト抗体鎖が発現すると考えられる。また、ヒト重鎖と /c鎖からなる完全なヒト抗体の濃度もさらに上昇すると考えられる。 (実施例 74) 交配により得られるヒト抗体遺伝子を含むヒト染色体を保持するマウス系統からのヒト抗体産生ハイプリドーマ取得

(実施例 25) と同様に（実施例 42、 43、 68、 69、 70、 71、 7.2、 73) で得られるヒト抗体遺伝子を含むヒ卜染色体を保持するマウス個体に目的とする抗原で免疫し、脾臓を取り出し、ミエローマ細胞と細胞融合し、ハイプリドーマを作成する 1〜3週間培養し培養上清を ELISA法で解析する。 EL1SA法は（実施例 14、 15 、 21、 22、 25、 33、 34、 37、 38) に示した方法で行ない、ヒト抗体陽性及びヒ卜抗体陽性かつ免疫した抗原特異的クローンを得る。

(実施例了 5) マウス抗体重鎖両側ァレル破壊 TT2F細胞株由来キメラマウスの血清中のマウス IgMの検出および定量

(実施例 51) で取得されたマウス抗体重鎖両側ァレル破壊 TT2F細胞株（ 131- 3) より（実施例 40) に示した方法で誕生した子マウスのうちキメラ率がそれぞれ 0¾ 、 50% 、 99% の 3個体について血清中のマウス IgMの検出および定量を行った。生後約 2週齢のキメラマウスより採血し血清中のマウス IgM濃度を（実施例 14) の ELISA 法を用いて定量した。 PBSで希釈した抗マウス IgM抗体（Kirkegaard & Perry Laboratories Inc. , 01-18- 03)を固定し、次いで 5¾FBSを添加した PBSで希釈した血清試料を加えた。ペルォキシダーゼ標識抗マゥス I gM抗体（K i rkegaar d & Perry Laboratories Inc. , 074- 1803)を加え、 TMBZを基質とし、 450 議の吸光度を測定した。精製されたマウス IgM (ファーミンジヱン、 03081D) を標準とし段階的に FBS添加の PBSで希釈した。結果を表 28に示す。マウス抗体重鎖の両側アレルが破壊された TT2F細胞由来のキメラマウスのうち、キメラ率が 99% のものはマウス IgM濃度が低く、 ES細胞のマウス重鎖遺伝子がほとんど機能しないことが確認された。表 2859. o o 9 キメラマウス中のマウス IgM濃度（ELISA) キメラ率％ I giVI (mg/I)

5

(実施例 76) ES細胞の抗体遺伝子軽鎖 /cノックアウト用ターゲティングベクターの作製

実施例 48- 1と同様にしてピュー口マイシン耐性遺伝子の両側にし oxP配列を入れた LoxP- PGKPuroプラスミドを作製した。 pPGKPuroブラスミド DNA (Watanabe ら， Biochem Biophys Res Com 213: 130-137 (1995)， Peter W. Laird, Whi tehea d Institute for Biochemical Research and Massachusetts institute of tech nology, Dept. of Biology, Cambrige, MAより分与）より制限酵素 Sal 1でピューロマイシン耐性カセット PGKPuroを切り出し、平滑化した。 LoxP配列を含むブラスミドの Smalおよび EcoRV 切断部位へ PGKPuroを挿入し、プラスミド pLoxP- PGKP uro を得た（図 30) 。さらに、実施例 48と同様にしてマウス抗体軽鎖/ J領域および定常領域を含むゲノム DNAの定常領域が含まれる DNA断片を LoxP- PGKPuro遺伝子と置き換えた（図 31)

(実施例 77) 抗体軽鎖へテロ接合体（かつ抗体重鎖欠損ホモ接合体）マウス ES細胞からの抗体軽鎖遺伝子両ァレル破壊株の取得

(1) 実施例 58で取得した抗体軽鎖欠損へテロ接合体 TT2F細胞株（HD43) についてピュー口マイシン耐性遺伝子の挿人によって、さらに両側アレルが共に破壊された株を取得した。

実施例 76で作製した抗体軽鎖タ一ゲティングベクターを制限酵素！pnlで線状化し、実施例 58と同様に HD43株を形質転換した。ピューロマイシン濃度 0.75 /g/nil で選択培養を行い、 7〜9日後に生じたコロニーをピックアップし、実施例 49に示した方法で凍結保存、ゲノム DNAを取得した。ピューロマイシン耐性株ゲノム DNAを制限酵素 EcoR l (宝酒造）で消化し、ァガロースゲル電気泳動で分離後サザン解析を行い、実施例 48- 4に示したプローブで相同組み換え体を検出した（実施例 58, 59) 。その結果、解析した 74株中 4株の抗体軽鎖両アレル破壊株を得たこれらのクローンは通常の培養条件において、遺伝子破壊以前の TT2F株と比較して、増殖速度及び形態に変化が見られず、キメラマウス形成能を保持していることが示唆される。

(2) 抗体重鎖欠損ホモ接合体かつ抗体軽鎖遺伝子両アレル破壊株からのキメラマウス作製

(実施例 77- ( 1) ) で得られた抗体軽鎖両ァレル破壊株 TT2F細胞株 HD43P-10を凍結ス卜ックより立ち上げ、 I CR (日本クレア社）雄雌マウスの交配により得られた 8細胞期胚に胚あたり 10〜12個注人した。 ES細胞用培地（実施例 9) で一晩培養して胚盤胞に発生させた後、偽妊娠処理後 2. 5日の仮親 ICRマウス（日本クレァ社）の子宮に片側の子宮あたり約 10個のィンジクション胚を移植した。計 161個の注入胚を移植した結果、 37匹の子マウスが誕生した。キメラ個体は、毛色において宿主胚（I CR) 由来の白色の中に TT2細胞由来の野生色（濃茶）が認められるかどうかにより判定される。誕生した 37匹のうち毛色に明らかに野生色の部分のある、すなわち、 ES細胞の貢献の認められる個体は 9匹であった。うち 4個体は毛色の 80%以上が野生色の（ES細胞に由来する）キメラマウスであつた。

この結果より、抗体軽鎖両ァレル破壊株 ES細胞株 HD43P- 10は高いキメラ形成能を保持していることが確認された。

(実施例 78) 抗体軽鎖欠損ホモ接合体（かつ抗体重鎖欠損ホモ接合体） TT2F細胞株からの G418耐性及びピュー口マイシン耐性マ一カー遺伝子の除去

(実施例 77) で取得され、高いキメラ形成能を保持していることが確認された抗体軽鎖両側アレル破壊株 HD43P- 10 (ピューロマイシン、 G418耐性株）のピューロマイシン及び G418耐性マーカー遺伝子を（実施例 52) で示した手順により除去した。 G418耐性マ一力一遺伝子の両側に挿入した l oxP配列（実施例 48- 1 ) の間で部位特異的組換えを起こす Creレコンピナーゼ遺伝子を含む発現べクター PBS185 ( BRL) を（実施例 52) の方法に従い上記の株へ導入した c (実施例 52) と同様に得られるピューロマイシン（0. 75 z g/nil ) 感受性株（6株）を 35議シャーレでコンフルーェン卜になるまで増殖させ、その 3/5を 0. 5mlの保存用培地（ES培地 + 1 0? DMSOくシグマ >) に懸濁し、 - 80°Cにて凍結保存した。残りの 2/5は 2分して 12穴ゼラチンコートプレート 2ゥエルに播種し、一方は非選択培地、一方は 300 . g/mlの G418存在下で 2日間培養した。その結果、 G418存在下で死滅する 5株のピューロマイシン、 G418感受性株を得た。

(実施例 79) ヒ卜 2番染色体断片を保持するマウス系統と C57BL/6系統との交配による血清中ヒ卜抗体鎖発現の上昇

(実施例 43、 44) に示したヒト 2番染色体断片（以後 W23断片）を保持するキメラマウス子孫（以後 Fl (chimera x MCH) ) の遺伝的背景は、 TT2F細胞（実施例 39) 由来の CBAマウス系統及び C57BL/6マウス系統、そしてキメラマウスとの交配に用いた MCH ( I CR)マウス系統の混合したものである。できるだけ均質な遺伝的背景のもとで W23断片の挙動を観察するため、まず MCH( I CR)との戻し交配を行つた。 FKchimera x MCH) (任意に選んだ雄 8匹、雌 6匹を使用） x MCH( i CR)の交配の結果得られた子マウスにつき（実施例 43) の方法に従って、 W23断片保持を検討した。その結果雄経由で 8% (324匹中 25匹がポジティブ）、雌経由で 22% ( 148匹中 32匹がポジティブ）の子孫に W23断片が伝達することが確認された。ここで得られた F2(F1 X MCH) (任意に選んだ雄 8匹、雌 8匹を使用）をさらに MCH( ICR)と交配した際の伝達率は雄経由 9% (346匹中 30匹がポジティブ）、雌経由 24 % (202匹中 48匹がポジティブ）と FKchimera x MCH) x MCH( I CR)の結果と同様であった。この交配により F3(F2 X MCH)が得られた。

4 週令〜 12週令のキメラマウス（図 43中： ch imera、 4個体）、 FKch imera x MCH) ( 19個体）、 F2(F1 x MCH) (39個体）、 F3(F2 x MCH) (33個体）について (実施例 44) と同様の方法により血清中ヒト抗体/ c鎖濃度を測定した結果を図 43 に示す。 W23断片を保持する全ての個体の血清中にヒ卜抗体/ 鎖が検出された。一方、 F2(F1 x MCH)及び F3 (F2 x MCH)においては /c鎖濃度のばらつきが大きくなり、その平均値が ch imera及び FKchimera x MCH)と比較して低下した。

CH( I CR) 以外の系統との交配の影響を調べるため、 MCH( I CR)との交配実験で使用したものと同じ F2('F1 X MCH)個体を C57BL/6N (日本クレアより購入）系統と交配した。その結果得られた W23断片を保持する個体（F3(F2 X C57BL/6) ) の 26個体について前記と同様な /c鎖濃度測定を行つたところ、キメラマウス及び Fl (ch i mera x MCH)と同等な高い /ί鎖濃度を示した（図 43) 。前述した通り、 F3 (F2 x VICH)と F3 (F2 x C57BL/6)はまったく同じ F2(Fi x MCH)個体群を親とすることから、両者の違いは遺伝的背景のみと考えられる。すなわち、遺伝的背景の違いがヒ卜抗体 c鎖の発現量に影響を与えることが示された。そしてヒト抗体 /c鎖の効率的な発現には MCH( I CR)よりも C57BL/6の遺伝的背景がより望ましいことが明かとなった。同様な実験から、 C3H HeN系統（日本クレアより購入）の遺伝的背景も. C57BL/6と同等かそれ以上にヒト抗体/ c鎖の効率的な発現に望ましいことも示された。

ここで観察された遺伝的背景の抗体 /c鎖濃度への影響が、個体レベルでの染色体保持率（安定性）と関係しているかについて以下の実験を行い検討した。 FKc h imera x MCH)個体のうち 2F- 1 (血清中/ c鎖濃度： 84mg/l ) 、 1F-3 (血清中/ 鎖濃度： 13mg/l ) の尻尾由来繊維芽細胞及び骨髄細胞から調製した中期染色体サンプルについて F ISH解析（Tomi zukaら， Nature Gene t i cs, 16, 133-143) を行い、観察した中期分裂像のうちヒト染色体特異的プローブとハイブリダイズする W23 断片を含むものの割合を検定した。ここで得られる値は繊維芽細胞及び骨髄細胞における W23断片の保持率を示していると考えられる。その結果、 2F- 1においては繊維芽細胞： 51¾、骨髄細胞： 34%、 1F-3においては繊維芽細胞： 23¾、骨髄細胞： 18¾という保持率であった（それぞれ 50個以上の核板を測定）。これらの結果より、血清中 /c鎖濃度と繊維芽細胞、骨髄細胞における W23断片保持率の間には相関があることが示唆された。すなわち、遺伝的背景は、導入したヒト染色体断片そのものの安定性に影響を与えている可能性が高く、 C57BL/6及び C3H系統の遺伝的背景はここ示した 2番染色体断片だけでなく他の染色体断片（例えば

14番染色体断片）上の遺伝子の効率的発現にも望ましいものと考えられる。この推察を検証するために（実施例 68) で得られたヒト 14番染色体断片（以後 SC20断片）を保持し、ヒト抗体重鎖を血清中に発現する FKchimera x MCH)雄個体 #17- 7と MCH(ICR)及び C57BL/6との交配を行った。得られた子孫のうち SC20断片を保持する F2(F1 ·χ MCH) ： 2個体、 F2(F1 x C57BL/6) ： 2個体について血清中ヒ卜鎖濃度（実施例 68) 及び尻尾由来繊維芽細胞より調製した中期染色体サンプルにおける SC20断片保持率を W23断片の場合と同様に測定した。その結果、 F2(F 1 X MCH)の//鎖濃度： il.0mg/l， 1. lmg/K 染色体保持率： 74%， 54,¾に対して F2 (Fl X C57BL/6)の場合ヒ卜鎖濃度： 47mg/l， 54mg/l、染色体保持率： 84¾， 88¾ であり、ヒト鎖濃度、染色体保持率共に F2(F1 X C57BL/6)個体の方が高い値を示した。すなわち、 W23断片を保持するマウスを用いた結果より推察された通り、 C57BL/6の遺伝的背景は導入ヒト染色体の安定保持及び当該染色体上の遺伝子の効率的発現に望ましいことが明らかとなった。

(実施例 80) 抗体重鎖欠損かつ抗体 /c鎖相同組換え体 ES細胞株からのキメラマウス作成

(実施例 58) で得られた抗体重鎖欠損かつ抗体 κ鎖相同組換え体 ES細胞株 HD43 を凍結ストックより立ち上げ、 ICR (日本クレア社）雄雌マウスの交配により得られた 8細胞期胚に胚あたり 10〜12個注入した。 ES細胞用培地（実施例 9) で一晚培養して胚盤胞に発生させた後、偽妊娠処理後 2.5日の仮親 ICRマウス（日本クレア社）の子宮に片側の子宮あたり約 10個のィンジェクション胚を移植した。計 314個の注入胚を移植した結果、 51匹の子マウスが誕生した。キメラ個体は、毛色において宿主胚（ICR) 由来の白色の中に TT2細胞由来の野生色（濃茶）が認められるかどうかにより判定される。誕生した 51匹のうち毛色に明らかに野生色の部分のある、すなわち、 ES細胞の貢献の認められる個体は 26匹であった。うち 2個体は毛色の 100%が野生色の（ES細胞に由来する）雌キメラマウスであつた。

この結果より、抗体重鎖欠損かつ抗体軽鎖鎖相同組換え体 ES細胞株 HD43はキメラ形成能を保持していることが確認された。得られたキメラマウスのうち 100%の貢献率を示す雌においては、 ES細胞が機能的な生殖細胞（卵子）に分化している可能性が高い。

雌キメラマウス（毛色のキメラ率^ )0 ) について雄 I CRマウスとの交配により ES細胞由来の子孫が誕生するかを検討した。この交配において I CR雄マウス（ァルピノ、劣性）由来精子により受精したキメラマウス中の TT2F細胞（野生色：優性）由来の卵子からは野生色、 I CR由来卵子からは白色の子マウスが誕生する。それぞれ 1回の交配によって得られた生存可能な子マウスのすべてが ES細胞由来の毛色である野生色を示した。これらの子マウスの尻尾より調製したゲノム DNA について抗体鎖破壊アレルの存在をサザン解析により検討した（実施例 58) 。その結果抗体鎖破壊ァレルを持つ個体が得られた。

抗体軽鎖欠損へテロ接合体の雌雄個体の交配により生まれた 27匹の子マウスについてサザン解析（実施例 58) を行った。その結果 7匹において抗体軽鎖野性型アレルが消失し、欠損アレルのみ観察されたことから、これらの個体は抗体軽鎖欠損ホモ個体であると考えられた。また、血清中におけるマウス抗体 c鎖およびス鎖の検出、定量を行った結果を図 44に示す。

サザン解析の結果抗体 /c鎖欠損ホモと判定された個体（図中 4， 6, 14， 22, 24 ， 25， 26) においては c鎖の濃度が大きく減少し（残存している / c鎖は母親由来と考えられる）、代わりに； I鎖の濃度が大きく上昇している。これらの結果はこれまでに報告された抗体 c鎖ノックアウトマウスの解析結果（Yong-Ru i Zouら， E BO J. 12, 81 1 -820 (1993) ) と一致している。

すなわち、抗体/ 鎖相同組換え体 ES細胞株 HD43より、抗体/ c鎖ノックアウトマウス系統を確立することができた。

(実施例 81 ) ヒ卜 22番染色体上にヒトテロメァ配列を揷人するためのターゲティングベクタ一の作製

ヒト抗体軽鎖 I遺伝子（以下 I g A遺伝子と記す）が存在する 22番染色体上に相同組み換えによりヒトテロメァ配列を挿入し、断片化（J. E. zhak iら、 Na tu re Gene t. , 2， 283-287, 1992) することを試みた。具体的には、 l g ;i遺伝子の極近傍（テロメァ側）に存在する L I F遺伝子座にヒ卜テロメァ配列を挿入するための夕一ゲティングベクターを作製した。ヒトテロメァ酉己歹りは、 J. J. Harringtonら ( ature Genet.. 15, 345-355, 1 997) にならつて、 PCRにより合成した。 PCR産物をァガロースゲル電気泳動により精製し、 DNA blunting Kit (宝酒造）を用いて平滑化した。この平滑化 PCR 産物を pBluescript S.K I I(t) (東洋紡）の Eco RV部位にライゲーシヨン（DNA Li gat ion Kit, 宝酒造）により揷入した（ pBS-TEい。このプラスミド pBS- TELのシークェンスを行った結果、 Hin dill - (TTAGGG)n ― Eco RI の方向で揷入されていた。

次に、相同組み換えに用いるヒト 22番染色体上の LIF遺伝子領域を以下のようにして、 PCRで増幅し、プラスミド pBS- TELにクローニングした。 PCRに用いたプライマ一のシークエンスは以下のようである。

センスプライマー； 5' -TCGAACTAGTAGGAGAAGTGAACTTGAGGAGGC-3' (配列番号 65) アンチセンスプライマ一； 5' -TCGAACTAGTGATTCAGTGATGCTGTGCAGG-3' (配列番号 66)

PCR反応液の組成は、 10 X LA PCR buffer II (Mg²— free) (宝酒造） 5 n 1 、 25m MgCl₂ 5 〃1 ， dNTPmixture(2.5mM each) (宝酒造） 8 / しセンスプライマ一 lOpmol, アンチセンスプライマ一 lOpmol, テンプレート DNA (HFL1，ヒト初代繊維芽細胞ゲノム） lOOng, LA Taq (5u/ l) (宝酒造） 0.5 1 で、滅菌蒸留水を足して全量 50 1にした。反応液の調製は全て氷上で行い、予め 85°Cにセットしてあるサ一マルサイクラ一（PCR system 9600，パーキンエルマ一）のゥヱルに反応チューブをセッ卜した。 94°Cで 1分加熱後、 98° 10秒、 65°C, 5分のサイクルを 35回行った。 PCR産物をァガロースゲル電気泳動により精製し、 Spe 1で切断し（プライマー中に Spe I 部位が存在）、 pBS- TELの Spe I 部位に揷入した。 L IF遺伝子の方向がヒトテロメァ配列（TTAGGG)nに対して逆方向に揷人されているものを選択した（M. Giovannini ら、 Cytogenet Cell Genet 64， 240-244, 1993) [pBS-TEL/LIF] 。

次に、ピューロマイシン耐性遺伝子を含むプラスミド pGKPuro (S. Watanabe ら、 Biochem. Biophys. Res. Comm. , 213， 130-137, 1995) を Eco Rlで切断後、平滑化し、 Not I リンカ一を揷人した。 Not I 切断によりピューロマイシン耐性遺伝子を切り出し、 pBS- TEL/LIFの Not I 部位に揷人した。ピューロマイシン耐性遺伝子の転写方向力 IF遺伝子の方向と同じものを選択した（ pBS- TEL/LIFPu ro、図 45) 。このプラスミドは大腸菌 DH5を用いて増幅し、 Q IAGENカラム（フナコシ）により精製し、トランスフヱクシヨンに用いた（後記）。

(実施例 82) ヒ卜 22番染色体の卜リ DT40細胞への導人

G418耐性遺伝子でマーキングされたヒト 22番染色体を有するマウス Α9細胞（富塚ら、 a t ure Gene t. 16, 133-143, 1997、以下 A9/#22neoと記す）の培養は、 10¾ゥシ胎児血清（以下 FBSで記す）と G418 (800 / g/ml ) を添加したダルべッ . コ改変イーグル培地（以下 DMEMと記す）中で行った。トリ DT40細胞の培養は、 10 ¾ FBS、 1 ¾ニヮトリ血清、 10 ' M 2-メルカプトエタノールを添加した DME 1中で行つた。

ミクロセルは以下のようにして得た（詳細は、清水ら、細胞工学ハンドブック

、羊土社、 P127-) 。 A9/#22neo細胞を 12本の 25cm²遠心用フラスコ（コース夕一、 3025) にて、細胞密度が 90%飽和程度まで培養した。コルセミド（0. 07 g/ml , デメコルシン、和光純薬）を添加した培地（DMEM + 20¾FBS ) に交換し、さらに 2. 5- 3日間培養し、ミクロセルを形成させた。培養液を除去し、予め 37°C で保温したサイ卜カラシン B ( 10 g/ml, シグマ）溶液を遠心用フラスコに満たし、 34°C、 8000rpm, 1時間の遠心を行った。ミクロセルを DMEMに懸濁し、フィルターろ過により精製した。精製後、 1500rpmで 1 0分間遠心し、 DMEM5mlに懸濁した。 2 X 10⁷個の DT40を 1000rpm， 5分間遠心し、 DMEMで 2回洗浄し、 D

ΜΕΜ5πι1に懸濁した。再度、ミクロセルを 1500rpmで 1 0分間遠心し、上清を除かずに、先の DT40懸濁液 5mlを静かに重層した。 1300rpm， 5分間の遠心後、上清を除去し、 PHA- P ( 100 g/ml 、ダフコ） 2mlに懸濁し、 37°C、 5%C0₂インキュベター中に 15分間静置した。 1700rpm， 7分間遠心し、上清を除去し、細胞塊をタッビングでほぐした。 PEG1500 (ポリエチレングリコール、ベーリンガー） 1ml を静かに加え、撹拌しながら 1. 5- 2分間処理した。処理後、 DMEMlmlを約 1分間かけて加え、さらに DMEM3mlを約 2分間かけて加え、さらに DMEMを足して全量 11 mlにし、撹拌した。室温で 1 0分間静置した後、 1300rpm， 5分間遠心し、上清を除去して上記培溶液 10mlに懸濁し、直径 100mmディッシュ中で 24時間培養した。

24時間後、 G418 ( lmg/ml ) を添加した培地に交換し、 24穴プレート（住友べークライト） 3枚に分注し、約 2週間選択培養を行い、 G418耐性クローンを単離した。

( 1 ) PCR解析

選択培養の結果、 '約 3 0個の G418耐性クローンが得られた。これらのクローンから Puregene DNA Isolation Kit (Gentra System社）を用いてゲノム DMAを抽出し、これを铸型にしてヒト lg;i遺伝子特異的プライマ一を用いた PCRを行うことによって、 lg i遺伝子を含んだヒト 22番染色体を有するクローンを同定した。用いたヒト igA遺伝子特異的プライマーは以下のようである。

5* -GAGAGTTGCAGAAGGGGTGACT-3' (配列番号 67)

5' -GGAGACCACCAAACCCTCCAAA-3' (配列番号 68)

PCR反応液の組成は、 10 X Ex Taq buffer (宝酒造） 5 n 1, dNTPmixture(2.5 mM each) (宝酒造） 8 1，各プライマー lOpmol, ゲノム DNAlOOng, Ex Taq (5u/ H 1) (宝酒造） 0.5 \ で、滅菌蒸留水を足して全量 50 1にした。反応液の調製は全て氷上で行い、予め 85°Cにセッ卜してあるサ一マルサイクラ一（PCR system 9600，パーキンエルマ一）のゥエルに反応チューブをセッ卜した。 94°Cで 1分加熱後、 98°C， 10秒、 56°C， 30秒、 72°C， 30秒のサイクルを 35回行った。この結果、ヒト IgA遺伝子を有するクローン力く 2個同定された。この 2クローンに対して、ヒ卜 22番染色体上の多型マ一力一（D22S315, D22S280, D22S283, D22S2 74、 Polymorphic STS Primer Pair, BIOS社、 J. E. Col 1 insら、 Nature 377 sup pl:367, 1995) の存在を PCRによって検出した（図 46) 。 PCRの条件はヒト lg i 遺伝子の検出の条件と同じである。〇はマーカ一が検出されたことを、 Xは検出されなかったことを示す。左側は物理的地図に基づく各マ一力一の 22番染色体上での位置を示す。この結果から、この 2クローンはヒト 22番染色体のほぼ全長を持つものと考えられた。残りのクローンについては、ヒト ig;i遺伝子は検出されないが、上記の 22番染色体多型マ一カーの幾つかが検出された。

(2 ) FISH解析

上記 2クローン中の 52- 18に対して、実際にヒト 22番染色体が細胞中でどのように存在しているかを FISHによって解析した。染色体標本の作製、ハイブリダィゼーシヨン、検出などの基本操作は富塚ら（Nature Genet. 16， 133-143, 1997

l 3 2 ) に従い、プローブはヒト COT- 1 DNA (ローダミン標識）を用いた。 20から 30の分裂像を観察した結果、 PCRの結果のとおり、ヒト 22番染色体のほぼ全長が独立して存在していることが確認できた（図 50) 。赤色に染まっているのがヒト 22番染色体である。 ' ·

以上の解析結果より、トリ DT40細胞株 52- 18 (以下 DT40/i 22neoと記す）はヒト 22番染色体のほぼ全長を有すると判断した。

(実施例 83) 卜リ DT40細胞中でのヒト 22番染色体の特異的断片化

(実施例 82) で得た DT40/#22neoに対して、（実施例 81) で作製したプラスミド pBS - TEし/ L I FPuroをトランスフエクシヨンし、ヒト 22番染色体を L I F遺伝子座上で特異的に断片化することを試みた。

DT40/ 22neo細胞の培養は、 G418 ( lmg/ml ) を添加した（実施例 82) と同じ条件で行った。 10 固の細胞を冷 PBSで 1回洗浄し、 0. 5niiの PBSに懸濁し、氷上に置いた。 Eco R lで線状化した pBS-TEL/L I FPuro 25-30 gを細胞に加え、ピぺッ卜で混合し、エレクトロポレーション用のキュべット（バイオラッド）に移し、氷中で 10分間静置した。キュべットをジーンパルサ一（バイオラッド）にセッ卜し、 550V, 25 / F の条件で電圧印加した。氷中で 10分間静置後、培地（前記）を含んだ 75cm²培養フラスコに細胞を移し、 24時間培養した。 24時間後、 G418

( lmg/ml ) とピューロマイシン（0. 3 / g/mi，シグマ）を添加した培地に交換し、 96穴培養プレート 5- 8枚に分注し、約 2週間の選択培養を行い、耐性クローンを単離した。

( 1 ) PCR解析

選択培養の結果、約 80個の耐性クローンが得られた。これらの細胞から前記と同様にゲノム DNAを抽出し、 PCRを行い、ヒトテロメァ配列が U F遺伝子座に揷入された相同組み換え体を同定した。プライマ一の一方をベクターには含まれない L I F遺伝子領域中に設計し、もう一方のプライマーはべクタ一に含まれるピュ —ロマイシン耐性遺伝子中に設計した（図 47)。プライマーの配列は以下のようである。

Puro. 1 ; 5' -GAGCTGCAAGAACTCTTCCTCACG-3' (配列番号 69) LIF1; a' -ATGACTCTAAGGCAGGAACATCTGTACC-3' (配列番号 70)

PCR 反応液の組成は、 10 X LA PCR buffer II ( ² ~ free) (宝酒造） 5 1, 25m gCl^ 5 a 1 ， dNTPmixture(2.5mM each) (宝酒造） 8 1，各プライマ一 lOpmol, テンプレー十 DNA lOOng, LA Taq (5u/ l) (宝酒造） 0.5 1 で、滅菌蒸留水を足して全量 50/ 1にした。反応液の調製は全て氷上で行い、予め 85°Cにセットしてあるサーマルサイクラ一（PCR system 9600，パーキンエルマ一）のゥエルに反応チューブをセッ卜した。 94°Cで 1分加熱後、 98°C， 10秒、 65°C， 10分のサイクルを 35回行った。目的の相同組み換え体においてのみ、図 47に示した様な 6.3kbの PCR産物が検出されるはずである。 PCRの結果、 8クローンにおいてこの 6.3kbのバンドが検出された（相同組み換え率；約 10%) 。この PCR産物を Sal Iで切断した結果、予想通りの切断パターンが得られ、相同組み換え体であることが確認された。

次に、これら 8クローンにおいて、期待通りの断片化が起きているか否かを 22 番染色体上の遺伝子（IgA, し IF， MB, IL2RB, CYP2D6, DIAL ECGF1, ARSA, J. E • Collinsら、 Nature 377 suppl:367, 1995) 及び多型マ一カー (D22S315, D22S2 75, D22S280, D22S281, D22S277, D22S278, D22S283, D22S272, D22S282, D22S2 74， J. E. Collinsら、 Nature 377 suppl:367, 1995) の存在を PCRで検出することによって調べた。

用いたブライマ一配列の一部は以下のようである。残りのプライマー配列に関しては富塚ら（Nature Genet. 16， 133-143, 1997) が用いたものと同じである。 LIFについては、上記実験より存在していることは明らかである。

CYP2D6

センスプライマー； 5' -CTGCGTGTGTAATCGTGTCC-3' (配列番号 71)

アンチセンスプライマ一； 5' - TCTGCTGTGAGTGAACCTGC-3' (配列番号 72)

ECGF1

センスプライマ一； 5' -AGGAGGCACCTTGGATAAGC-3' (配列番号 73)

アンチセンスプライマ一； 5' -TCACTCTGACCCACGATACAGC-3' (配列番号 74)

PCR反応液の組成は、 10 X Ex Taq buffer (宝酒造） 5 1, dNTPmixture(2.5 mM each) (宝酒造） 8 1，各プライマ一 lOpmol, ゲノム DNA100ng， Ex Taq (5u/

l 3 4 1 ) (宝酒造） 0. 5 1 で、滅菌蒸留水を足して全量 50 z lにした。反応液の調製は全て氷上で行い、予め 85°Cにセッ卜してあるサ一マルサイクラ一（PCR sy s tem 9600，パーキンエルマ一）のゥヱルに反応チューブをセットした。 94°Cで 1 分加熱後、 98° (：， 10秒、 56°C ( CYP2D6と ECGF1は 65°C ) ， 30秒、 72°C, 30秒のサイクルを 35回行った。結果を図 48に示した。〇、 Xの表記は前記と同じである。この図から明らかなように、クローン 67， 68, 328, 343について、ヒトテロメァ配列が挿入されている L I F遺伝子座よりテロメァ側の遺伝子及びマーカ一は全て検出されていないことが分かる。少なくともこの 4クローンに関しては、予想通りのテロメァ配列による断片化が起きていることが考えられる。

( 2 ) F I SH解析

実際にヒ卜 22番染色体が断片化しているか否かを F I SHにより解析した。実験方法は前記と同様であり、プローブはヒト C0T1 DNA (ローダミン標識）とプラスミド pGKPuro (F ITC標識）を用いた。 C0T1染色により、ほぼ全長のヒ卜 22番染色体を持つ DT40/#22neoと比較して断片化しているかが視覚的に判断できる。また、予想通りベクターが挿入された L IF遺伝子座で断片化していれば、 Puroプロ一ブ由来のシグナルを 22番染色体断片のテロメァ- -端に認めることができるはずである。結果の一部を図 49に示した。全てのクローンにおいて、 20から 30の分裂像を観察した結果、驚くべきことに相同組み換え体 8クローンの全てにおいて、 P uroプローブ由来のシグナル（黄緑色）をテロメァ一端に持つヒト 22番染色体の小断片（赤色）が観察された。上記の PCR解析の結果、断片化が起きていないと推察されたクローン（64， 212, 222, 305) に関しては、ほぼ全長のヒト 22番染色体を持つ細胞が全細胞の約 10 位混在していた。

以上の実験結果より、トリ DT40/#22 neo細胞において、 U F遺伝子座にヒトテロメァ配列が挿入された相同組み換え体が約 10%の効率で得られ、その全てのクローンにおいて（効率 100%) 、その挿入部位でヒト 22番染色体の小断片化が起きていることが分かった。産業上の利用の可能性

本発明により、単一または複数の外来染色体またはその断片を保持し、該染色体またはその断片上の遺伝子を発現するキメラ非ヒト動物が提供された。本発明のキメラ非ヒ卜動物を利用して、生物学的に活性な物質を製造することができる本発明により、単一または複数の外来染色体またはその断片を保持し、該染色体またはその断片上の遺伝子を発現する分化多能性を持つ細胞が提供された。該細胞を利用して、骨髄移植等による遺伝病治療を行うことができる。

本発明により、少なくとも 2種の内因性遺伝子が破壊されている分化多能性を保持する細胞が提供された。破壊された内因性遺伝子と同じまたは相同の遺伝子を含む単一または複数の外来染色体あるいはその断片を移入させる受容細胞として本発明の細胞を利用することにより、単一または複数の外来染色体あるいはその断片を保持し、該外来染色体あるいはその断片上の遺伝子を発現する機能細胞あるいはキメラ非ヒ卜動物を作製することができる。かかるキメラ非ヒト動物またはその子孫の個体、組織または細胞において、単一または複数の外来染色体あるいはその断片上の遺伝子を発現させることにより、その産物としての生物学的に活性な物質を製造することができる。

配列表

配列番号： 1

配列の長さ： 2 0

配列の型：核酸 · .

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸合成 DNA

配列

TGGAAGGTGG ATAACGCCCT 20 配列番号： 2

配列の長さ： 2 2

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

卜ポロジ一：直鎖状

配列の種類：他の核酸合成 DNA

配列

TCATTCTCCT CCAACATTAG CA 22 配列番号： 3

配列の長さ： 2 0

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸合成 DNA

配列

GCAATCGGTC TGCCGGAAGA 20 配列番号： 4 配列の長さ： 2 0

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状- .

配列の種類：他の核酸合成 DNA

配列

TTGGATCACT TTGGACCCAG 20 配列番号： 5

配列の長さ： 2 0

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸合成 DNA

配列

CTCTCCTGCA GGGCCAGTCA 20 配列番号： 6

配列の長さ： 2 2

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸合成 DNA

配列

TGCTGATGGT GAGAGTGAAC TC 22 配列番号： 7

配列の長さ： 2 0

配列の型：核酸鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸合成 DNA

配列 ' ·

AGTCAGGGCA TTAGCAGTGC 20 配列番号： 8

配列の長さ： 2 0

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸合成謂 A

配列

GCTGCTGATG GTGAGAGTGA 20 配列番号： 9

配列の長さ： 2 0

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸合成 DNA

配列

TGGTGGCTGA AAGCTAAGAA 20

配列番号： 1 0

配列の長さ： 2 0

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成 DNA

配列

CCAGAAGAAT GGTGTCATTA 20 配列番号： 1 1

配列の長さ： 2 0

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸合成 DNA

配列

TCCAGGTTCT GCAGAGCAAG 20 配列番号： 1 2

配列の長さ： 2 0

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸合成 DNA

配列

TGTAGTTGGA GGCCATGTCC 20 配列番号： 1 3

配列の長さ： 2 0

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸合成 DNA

配列 CCCCACCCAT GATCCAGTAC 20 配列番号： 1 4

配列の長さ： 2 0 .

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸合成 DNA

配列

GCCCTCAGAA GACGAAGCAG 20 配列番号： 1 5

配列の長さ： 2 2

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸合成 DNA

配列

GAGAGTTGCA GAAGGGGTGA CT 22 配列番号： 1 6

配列の長さ： 2 2

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸合成 DNA

配列

GGAGACCACC AAACCCTCCA AA 22 l 4 l 配列番号： 1 7

配列の長さ： 2 0

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖 · .

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸合成 A

配列

GGCTATGGGG ACCTGGGCTG 20 配列番号： 1 8

配列の長さ： 2 2

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状 '

配列の種類：他の核酸合成 DNA

配列

CAGAGACACA GGCACGTAGA AG 22 配列番号： 1 9

配列の長さ： 2 0

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸合成 DNA

配列

TTAAGGGTCA CCCAGAGACT 20 配列番号： 2 0

配列の長さ： 2 0 配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸合成 DNA

配列

TGTAGTTGGA GGCCATGTCC 0 配列番号： 2 1

配列の長さ： 2 0

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸合成 DNA

配列

CAAAAAGTCC AACCCTATCA 20 配列番号： 2 2

配列の長さ： 2 0

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸合成 DNA

配列

GCCCTCAGAA GACGAAGCAG 20 配列番号： 2 3

配列の長さ： 2 0

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸合成 DNA

配列

TCGTTCCTGT CGAGGATGAA 20 配列番号： 2 4

配列の長さ： 2 0

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸合成 DNA

配列

TCACTCCGAA GCTGCCTTTC 20 配列番号： 2 5

配列の長さ： 2 1

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸合成 DNA

配列

ATGTACAGGA TGCAACTCCT G 21

配列番号： 2 6

配列の長さ： 2 0

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸合成 DNA 配列

TCATCTGTAA ATCCAGCAGT 20 配列番号： 2 7 '

配列の長さ： 2 0

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸合成 DNA

配列

GATCCCATCG CAGCTACCGC 0 配列番号： 2 8

配列の長さ： 2 0

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸合成 DNA

配列

TTCGCCGAGT AGTCGCACGG 20 配列番号： 2 9

配列の長さ： 2 2

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸合成 DNA

配列

GATGAACTAG TCCAGGTGAG TT 22

l 5 配列番号： 3 0

配列の長さ： 2 2

配列の型：核酸 · ·

鎖の数：一本鎖

トポ口ジ一：直鎖状

配列の種類：他の核酸合成 DNA

配列

CCTTTTGGCT TCTACTCCTT CA 22 配列番号： 3 1 .

配列の長さ： 2 0

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸合成 DNA

配列

ATAGAGGGTA CCCACTCTGG 20 配列番号： 3 2

配列の長さ： 2 0

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸合成 DNA

配列

AACCAGGTAG GTTGATATGG 20 配列番号： 3 3 配列の長さ： 2 0

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジ一：直鎖状 '

配列の種類：他の核酸合成 DNA

配列

AAGTTCCTGT GATGTCAAGC 20 配列番号： 3 4

配列の長さ： 2 0

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸合成 DNA

配列

TCATGAGCAG ATTAAACCCG 20 配列番号： 3 5

配列の長さ： 2 0

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸合成 DNA

配列

TGTGAAGGAG GACCAGGTGT 20 配列番号： 3 6

配列の長さ： 2 0

配列の型：核酸鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸合成 DNA

配列

TGTAGGGGTT GACAGTGACA 20 配列番号： 3 7

配列の長さ： 2 0

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸合成 DNA

配列

CTGAGAGATG CCTCTGGTGC 20 配列番号： 3 8

配列の長さ： 2 0

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸合成 DNA

配列

GGCGGTTAGT GGGGTCTTCA 20 配列番号： 3 9

配列の長さ： 2 0

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成 DNA

配列

GGTGTCGTGG AACTCAGGCG 20 配列番号： 4 0

配列の長さ： 2 0

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸合成 DNA

配列

CTGGTGCAGG ACGGTGAGGA 20 配列番号 4 1

配列の長さ： 2 0

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸合成 DNA

配列

GCATCCTGAC CGTGTCCGAA 20 配列番号： 4 2

配列の長さ： 2 0

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸合成 DNA

配列 GGGTCAGTAG CAGGTGCCAG 20

配列番号： 4 3

配列の長さ： 2 0 ' '

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸合成 DNA

配列

AGTGAGATAA GCAGTGGATG 20

配列番号： 4 4

配列の長さ： 2 0

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸合成 DNA

配列

GTTGTGCTAC TCCCATCACT 20

配列番号： 4 5

配列の長さ： 2 1

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸合成 DNA

配列

TTGTATTTCC AGGAGAAAGT G 21 l 5 0 配列番号： 4 6

配列の長さ： 2 0

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖 ' ·

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸合成 DNA

配列

GGAGACGAGG GGGAAAAGGG 20 配列番号： 4 7

配列の長さ： 2 7

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸合成 DNA

配列

ATGGACTGGA CCTGGAGGRT CYTCTKC 27 配列番号： 4 8

配列の長さ： 2 7

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸合成 DNA

配列

ATGGAGYTTG GGCTGASCTG GSTTTYT 27 配列番号： 4 9

配列の長さ： 2 7 配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直崖；|犬

配列の種類：他の核酸合成 DNA

配列

ATGRAMMWAC TKTGKWBCWY SCTYCTG 27 配列番号： 5 0

配列の長さ： 2 0

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸合成 DNA

配列

CAGAGGCAGT TCCAGATTTC 20 配列番号： 5 1

配列の長さ： 2 0

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸合成 DNA

配列

TGGGATAGAA GTTATTCAGC 20 配列番号： 5 2

配列の長さ： 2 7

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸合成 DMA

配列

ATGGACATGR RRDYCCHYGY KCASCTT 27 配列番号： 5 3

配列の長さ： 2 8

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸合成 DNA

配列

CCAAGCTTCA GGAGAAAGTG ATGGAGTC 28 配列番号： 5 4

配列の長さ： 2 8

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸合成 DNA

配列

CCAAGCTTAG GCAGCCAACG GCCACGCT 28 配列番号： 5 5

配列の長さ： 2 8

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸合成 DNA 配列

CCAAGCTTCA GAGGCAGTTC CAGATTTC 28 配列番号： 5 6

配列の長さ： 2 8

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸合成 DNA

配列

GGGAATTCGG GTAGAAGTCA CTGATCAG 28 配列番号： 5 7

配列の長さ： 2 8

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸合成 DNA

配列

GGGAATTCGG GTAGAAGTCA CTTATGAG 28 配列番号： 5 8

配列の長さ： 2 8

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸合成 DNA

配列

GGGAATTCGG GTAGAAGTCA CTTACGAG 28

l 5 4 配列番号： 5 9

配列の長さ： 6 0

配列の型：核酸 '

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸合成 DNA

配列

ACCTTCATCG TCCTCTTCCT CCTGAGCCTC TTCTACAGCA CCACCGTCAC CCTGTTCAAG 60 配列番号： 6 0

配列の長さ： 6 0

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸合成 DNA

配列

TGATGCTGCA CCAACTGTAT CCATCTTCCC ACCATCCAGT GAGCAGTTAA CATCTGGAGG 60

配列番号： 6 1

配列の長さ： 2 2

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸合成 DNA

配列

CTGGGGTGAG CCGGATGTTT TG 22 配列番号： 6 2 配列の長さ： 2 2

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状'

配列の種類：他の核酸合成 DNA

配列

CCAACCCAGC TCAGCCCAGT TC 22

配列番号： 6 3

配列の長さ： 3 6

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸合成 DNA

配列

AATTCCCGCG GGTCGACGGA TCCCTCGAGG GTACCA 36

配列番号： 6 4

配列の長さ： 3 6

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸合成 DNA

配列

GGGCGCCCAG CTGCCTAGGG AGCTCCCATG GTTCGA 36

配列番号： 6 5

配列の長さ： 3 3

配列の型：核酸鎖の数：一本鎖

トポ口ジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸合成 DNA

配列

TCGAACTAGT AGGAGAAGTG AACTTGAGGA GGC 33 配列番号： 6 6

配列の長さ： 3 1

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸合成 DNA

配列

TCGAACTAGT GATTCAGTGA TGCTGTGCAG G 31 配列番号： 6 7

配列の長さ： 2 2

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポ口ジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸合成 DNA

配列

GAGAGTTGCA GAAGGGGTGA CT 22 配列番号： 6 8

配列の長さ： 2 2

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成 DNA

配列

GGAGACCACC AAACCCTCCA AA 22 配列番号： 6 9

配列の長さ： 2 4

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸合成 DNA

配列

GAGCTGCAAG AACTCTTCCT CACG 24 配列番号： 7 0

配列の長さ： 2 8

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸合成 DNA

配列

ATGACTCTAA GGCAGGAACA TCTGTACC 28 配列番号： 7 1

配列の長さ： 2 0

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸合成 DNA

配列 CTGCGTGTGT AATCGTGTCC 20 配列番号： 7 2

配列の長さ： 2 0 ―'

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸合成 DNA

配列

TCTGCTGTGA GTGAACCTGC 20 配列番号： 7 3

配列の長さ： 2 0

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸合成 DNA

配列

AGGAGGCACC TTGGATAAGC 20

配列番号： 7 4

配列の長さ： 2 2

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸合成 DNA

配列

TCACTCTGAC CCACGATACA GC 22

Claims

請求の範囲

1 . 単一または複数の外来染色体あるいはその断片を含むミクロセルを作製し、該ミクロセルとの融合により、分化多能性を保持する細胞へ前記単一または複数の外来染色体あるいはその断片を移人させることを特徴とする、キメラ非ヒト動物の作製法。

2. 単一または複数の外来染色体あるいはその断片を含むミクロセルを作製し、該ミクロセルとの融合により、分化多能性を保持する細胞へ前記単一または複数の外来染色体あるいはその断片を移人させることを特徴とする、単一または複数の外来染色体あるいはその断片を含む分化多能性を保持する細胞の作製方法。

3 . 単一または複数の外来染色体あるいはその断片が 6 7 0 k bを越える請求の範囲第 1項または第 2項記載の方法。

4 . 単一または複数の外来染色体あるいはその断片が 1 M b (百万塩基対）以上である請求の範囲第 3項記載の方法。

5. 外来染色体あるいはその断片が抗体をコードする領域を含むものである請求の範囲第 1項または第 2項記載の方法。

6 . 単一または複数の外来染色体あるいはその断片を含むミクロセルが、単一または複数の外来染色体あるいはその断片を含む細胞とミクロセル形成能の高い細胞とを融合させて作製されたハイプリッド細胞から誘導されたものである請求の範囲第 1項または第 2項記載の方法。

7 . 単一または複数の外来染色体あるいはその断片を含むミクロセルが、前記ハイブリッド細胞から誘導されたミクロセルをさらにミクロセル形成能の高い細胞と融合させて作製された細胞から誘導されたものである請求の範囲第 6項記載の方法。

8 . 単一または複数の外来染色体あるいはその断片を含む細胞がヒト正常 2倍体細胞である請求の範囲第 6項記載の方法。

9 . ミクロセル形成能の高い細胞がマウス A 9細胞である請求の範囲第 6項〜第 8項のいずれか一項に記載の方法。

10. 分化多能性を保持する細胞が、胚性癌腫細胞、胚性幹細胞、胚性生殖細胞およびそれらの変異体から成る群より選択されるものである請求の範囲第 1項または第 2項記載の方法。

1 1. 外来染色体あるいはその断片が目的の遺伝子を含むものであり、分化多能性を保持する細胞がその外来染色体あるいはその断片上の該目的の遺伝子と同じあるいは相同の内因性遺伝子が破壊されているものである請求の範囲第 1項または第 2項記載の方法。

12. 外来染色体あるいはその断片が少なくとも 2種の目的の遺伝子を含むものであり、分化多能性を保持する細胞がその外来染色体あるいはその断片上の該目的の遺伝子と同じあるいは相同の内因性遺伝子が破壊されているものである請求の範囲第 1 1項記載の方法。

13. 分化多能性を保持する細胞において、前記目的の遺伝子と同じあるいは相同の内因性遺伝子の両側または片側の対立遺伝子が破壊されている請求の範囲第 1 1 項記載の方法。

14. 前記目的の遺伝子が抗体遺伝子である請求の範囲第 1 1項項記載の方法。

15. 前記抗体遺伝子が抗体重鎖遺伝子および抗体軽鎖遺伝子である請求の範囲第 14項記載の方法。

16. 外来染色体あるいはその断片が目的の遺伝子を含むものであり、その外来染色体あるいはその断片上の前記目的の遺伝子と同じあるいは相同の内因性遺伝子が破壊されている分化多能性を保持する細胞に、該目的の遺伝子を含む外来染色体あるいはその断片を移入した後、該細胞と前記目的の遺伝子と同じあるいは相同の内因性遺伝子が欠損している系統の非ヒ卜動物の胚とのキメラを作製する請求の範囲第 1項記載の方法。

17. 前記目的の遺伝子と同じあるいは相同の内因性遺伝子が欠損している系統の非ヒ卜動物が標的遺伝子相同組み換え法により作製されたものである請求の範囲第 16項記載の方法。

18. キメラ非ヒト動物が、単一または複数の外来染色体あるいはその断片を保持し、該外来染色体あるいはその断片上の遺伝子を発現し、該外来染色体あるいはその断片を子孫に伝達可能なものである請求の範囲第 1項記載の方法。

19. キメラ非ヒト動物が哺乳動物である請求の範囲第 1項記載の方法。

20. 哺乳動物がマウスである請求の範囲第 19項記載の方法。

21. 単一または複数の外来染色体あるいはその断片を含む分化多能性を保持する細胞。

22. 単一または複数の外来染色体あるいはその断片が 6 7 0 k bを越える請求の範囲第 21項記載の細胞。

23. 外来染色体あるいはその断片が目的の遺伝子を含むものであり、分化多能性を保持する細胞においてはその外来染色体あるいはその断片上の該目的の遺伝子と同じあるいは相同の内因性遺伝子が破壊されている請求の範囲第 21項記載の細胞。

24. 外来染色体あるいはその断片が少なくとも 2種の目的の遺伝子を含むものであり、分化多能性を保持する細胞においてはその外来染色体あるいはその断片上の該目的の遺伝子と同じあるいは相同の内因性遺伝子が破壊されている請求の範囲第 23項記載の細胞。

25. 分化多能性を保持する細胞において、前記目的の遺伝子と同じあるいは相同の内因性遺伝子の両側または片側の対立遺伝子が破壊されている請求の範囲第 23 項記載の細胞。

26. 前記外来染色体あるいはその断片が抗体遺伝子を含むものである請求の範囲第 21項項記載の細胞。

27. 前記抗体遺伝子が抗体重鎖遺伝子および抗体軽鎖遺伝子である請求の範囲第 26項記載の細胞。

28. 分化多能性を保持する細胞が、胚性癌腫細胞、胚性幹細胞、胚性生殖細胞およびそれらの変異体から成る群より選択されるものである請求の範囲第 21項記載の細胞。

29. 単一または複数の外来染色体あるいはその断片を保持し、該外来染色体あるいはその断片上の遺伝子を発現するキメラ非ヒト動物、または、前記の単一もしくは複数の外来染色体あるいはその断片を保持し、該外来染色体あるいはその断片上の遺伝子を発現するその子孫。

30. 単一または複数の外来染色体あるいはその断片が 6 7 0 k bを越える請求項

29記載のキメラ非ヒト動物またはその子孫。

31. 外来染色体あるいはその断片が目的の遺伝子を含むものであり、該目的の遺伝子と同じあるいは相同の内因性遺伝子が破壊されて、る請求の範囲第 29項記載のキメラ非ヒト動物またはその子孫。

32. 外来染色体ある'いはその断片が少なくとも 2種の目的の遺伝子を含むものであり、該目的の遺伝子と同じあるいは相同の内因性遺伝子が破壊されている請求の範囲第 31項記載のキメラ非ヒト動物またはその子孫。

33. 前記目的の遺伝子と同じあるいは相同の内因性遺伝子の両側または片側の対立遺伝子が破壊されている請求の範囲第 31項記載のキメラ非ヒト動物またはその子孫。

34. 前記目的の遺伝子が抗体遺伝子である請求の範囲第 31項項記載のキメラ非ヒト動物またはその子孫。

35. 前記抗体遺伝子が抗体重鎖遺伝子および抗体軽鎖遺伝子である請求の範囲第 34項記載のキメラ非ヒ卜動物またはその子孫。

36. 請求の範囲第 29項記載のキメラ非ヒト動物またはその子孫の交配により得られる単一または複数の外来染色体あるいはその断片を保持し、該外来染色体あるいはその断片上の遺伝子を発現する非ヒ卜動物、または、単一もしくは複数の外来染色体あるいはその断片を保持し、該外来染色体あるいはその断片上の遺伝子を発現するその子孫。

37. 単一または複数の外来染色体あるいはその断片を保持し、該外来染色体あるいはその断片上の遺伝子を発現する請求の範囲第 29項記載のキメラ非ヒ卜動物もしくはその子孫または請求の範囲第 36項記載の非ヒト動物もしくはその子孫を、該遺伝子と同じあるいは相同の遺伝子が欠損している系統の非ヒ卜動物と交配させることにより作製された非ヒト動物、または、前記の単一もしくは複数の外来染色体あるいはその断片を保持し、該外来染色体あるいはその断片上の遺伝子を発現するその子孫。

38. 請求の範囲第 29項記載のキメラ非ヒト動物もしくはその子孫、請求の範囲第 36項記載の非ヒト動物もしくはその子孫、または請求の範囲第 37項記載の非ヒ卜動物もしくはその子孫に由来する組織。

39. 請求の範囲第 29項記載のキメラ非ヒト動物もしくはその子孫、請求の範囲第 36項記載の非ヒト動物もしくはその子孫、または請求の範囲第 37項記載の非ヒ卜動物もしくはその子孫に由来する細胞。

40. B細胞である請求の範囲第 39項記載の細胞。

41. 請求の範囲第 40項記載の細胞とミエ口—マ細胞との融合により作製されたハィブリド一マ。

42. 請求の範囲第 29項記載のキメラ非ヒト動物もしくはその子孫、請求の範囲第 36項記載の非ヒ卜動物もしくはその子孫、または請求の範囲第 37項記載の非ヒト動物もしくはその子孫の個体、組織または細胞において、単一または複数の外来染色体あるいはその断片上の遺伝子を発現させ、その産物としての生物学的に活性な物質を回収することを特徴とする、生物学的に活性な物質の製造法。

43. キメラ非ヒト動物の細胞が B細胞である請求の範囲第 42項記載の方法。

44. B細胞がミエ口一マ細胞と融合して、不死化されている請求項 43記載の方法 c

45. 生物学的に活性な物質が抗体である請求の範囲第 42項記載の方法。

46. 抗体が哺乳動物の抗体である請求の範囲第 45項記載の方法。

47. 哺乳動物の抗体がヒト抗体である請求の範囲第 46項記載の方法。

48. 請求の範囲第 42項記載の方法により製造できる生物学的に活性な物質。

49. 6 7 0 k bを越えるヒト抗体遺伝子の少なくとも一つを保持し、発現する非ヒト動物。

50. 1 M b以上のヒト抗体遺伝子の少なくとも一つを保持し、発現する請求の範囲第 49項記載の非ヒ卜動物。

51. ヒト抗体遺伝子が、ヒト重鎖遺伝子、ヒト軽鎖 /c遺伝子、ヒト軽鎖； I遺伝子およびそれらの組み合わせから成る群より選択される請求の範囲第 49項記載の非ヒ卜動物。

52. そのヒト抗体遺伝子と同じあるいは相同の非ヒト動物抗体遺伝子が欠損している請求の範囲第 49項記載の非ヒト動物。

53. そのヒ卜抗体遺伝子と同じあるいは相同の非ヒ卜動物抗体遺伝子の欠損が、遺伝子相同組換えによる該非ヒト動物抗体遺伝子の破壊によるものである請求の範囲第 52項記載の非ヒト動物。

54. 請求の範囲第 49項記載の非ヒ卜動物の脾臓細胞とミエローマ細胞との融合により得られるハイプリドーマ。

55. 請求の範囲第 54項記載のハイプリドーマにより産生される抗体。

56. ヒト抗体の少なくとも一つのクラスまたはサブクラスを発現する非ヒト動物 _c

57. 発現するヒト抗体のクラスまたはサブクラスの遺伝子と同じあるいは相同の内因性遺伝子が欠損している請求の範囲第 56項記載の非ヒト動物。

58. ヒト抗体のクラスまたはサブクラスが、 I g M、 I g G、 I g E、 I g A、

I g Dおよびそれらのサブクラス、ならびにそれらの組み合わせから選択される請求の範囲第 56項記載の非ヒト動物。

59. 6 7 0 k bを越える単一または複数の外来 D N Aを保持し、該外来 D N A上の遺伝子を発現する非ヒト動物。

60. 発現する外来 D N A上の遺伝子と同じあるいは相同の内因性遺伝子が欠損している請求の範囲第 59項記載の非ヒト動物。

61. 1 M b以上の単一または複数の外来 D N Aを保持し、該外来 D N A上の遺伝子を発現する請求の範囲第 59項記載の非ヒト動物。

62. 発現する外来 D N A上の遺伝子と同じあるいは相同の内因性遺伝子が欠損している請求の範囲第 61項記載の非ヒト動物。

63. 単一または複数の外来染色体あるいはその断片を含むミクロセルを作製し、該ミクロセルとの融合により、前記単一または複数の外来染色体あるいはその断片を胚盤胞に由来する培養細胞へ移入し、該細胞の核を除核した未受精卵に移植することを特徴とする、トランスジエニック非ヒト動物の作製法。

64. 少なくとも 2種の内因性遺伝子が破壊されている分化多能性を保持する細胞 c

65. 少なくとも 2種の内因性遺伝子の両側または片側の対立遺伝子が破壊されている請求の範囲第 64項記載の細胞。

66. 破壊されている内因性遺伝子が抗体遺伝子である請求の範囲第 64項記載の細胞。

67. 破壊されている抗体遺伝子が抗体重鎖遺伝子および抗体軽鎖遺伝子である請求の範囲第 66項記載の細胞。

68. 分化多能性を保持する細胞が、胚性癌腫細胞、胚性幹細胞、胚性生殖細胞およびそれらの変異体から成る群より選択されるものである請求の範囲第 64項記載の細胞。

69. 少なくとも 2回の相同組換えにより、請求の範囲第 64項記載の細胞を作製する方法。

70. 薬剤耐性マーカ一遺伝子を用いる相同組換えにより分化多能性を保持する細胞の内因性遺伝子の片側の対立遺伝子を破壊し、該細胞を該薬剤の存在下で培養し、薬剤耐性となった株を選択し、これらの株をスクリーニングすることにより内因性遺伝子の両側の対立遺伝子が破壊された株を得る工程を含む請求の範囲第 69項記載の方法。

71. 薬剤耐性マーカ一遺伝子を用いる相同組換えにより分化多能性を保持する細胞の内因性遺伝子の片側の対立遺伝子を破壊し、さらに内因性遺伝子の他方の側の対立遺伝子も薬剤耐性マーカー遺伝子を用いる相同組換えにより破壊する請求の範囲第 69項記載の方法。

72. 内因性遺伝子の片側の対立遺伝子を破壊するための相同組換えに用いる薬剤耐性マーカー遺伝子が、他方の側の対立遺伝子を破壊するための相同組換えに用いる薬剤耐性マーカー遺伝子と同じ種類である請求の範囲第 71項記載の方法。

73. 内因性遺伝子の片側の対立遺伝子を破壊するための相同組換えに用いる薬剤耐性マーカー遺伝子が、他方の側の対立遺伝子を破壊するための相同組換えに用いる薬剤耐性マーカー遺伝子と異なる種類である請求の範囲第 71項記載の方法。

74. キメラ非ヒト動物を作製するための請求の範囲第 21項〜第 28項のいずれか一項に記載の細胞の使用。

75. 単一または複数の外来遺伝子あるいはその断片ないしは単一または複数の外来染色体あるいはその断片を移入させる受容細胞としての、請求の範囲第 64項〜第 68項のいずれか一項に記載の細胞の使用。

76. キメラ非ヒト動物を作製するための、請求の範囲第 64項〜第 68項のいずれか一項に記載の細胞の使用。