WO1998023766A1 - Procede de preparation de ribitol - Google Patents

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WO1998023766A1
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ribitol
trichosporonoides
production method
supernatant
microorganism
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PCT/JP1997/004292
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Inventor
Tomoko Kawaguchi
Makoto Ueda
Kenji Yamagishi
Hiroshi Cho
Original Assignee
Mitsubishi Chemical Corporation
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/18—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic polyhydric

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing ribitol, and more particularly, to a method for producing ribitol from sugar using a microorganism.
  • ribitol has attracted attention not only as a constituent sugar of living organisms but also as an intermediate raw material for pharmaceuticals and agricultural chemicals.
  • methods for producing ribitol using microorganisms include: (1) a method of producing by enzymatic reaction using D-ribose as a raw material, (2) a method of producing by fermentation of sugar such as glucose, and (3) a method of producing algae.
  • a method using carbon dioxide fixation is known.
  • D-ribose is not necessarily inexpensive as a raw material
  • the method of producing ribitol by fermentation of sugar, such as glucose, which is an inexpensive raw material is the most preferable among the conventional methods.
  • sugar alcohols such as erythritol can be efficiently produced by the method using polynis (Moniliella tomentosa var pollinis) or the like, satisfactory productivity of ribitol is not necessarily obtained.
  • the present inventors have conducted intensive studies to solve the above-mentioned problems. As a result, (1) that a bacterium belonging to the genus Trichosporonoides has the ability to produce ribitol from glucose, and (2) that ribitol is d to C It was found that the compound was easily crystallized by the alcohol of No. 3 , and the present invention was completed.
  • the gist of the present invention resides in a method for producing ribitol, which comprises bringing a microorganism belonging to the genus Trichosporonoides into contact with sugar and producing ribitol by aerobic fermentation.
  • the microorganism belonging to the genus Trichosporonoides used in the present invention is not particularly limited as long as it is a microorganism having the ability to produce ribitol from Darcos.
  • the microorganism is Trichosporonoides madida, Trichosporonoides madida, Trichosporonoides nigrescens Trichosporonoides nigrescens Trichosporonoides esdocephalis Trichosporonoides oedocephalis Trichosporonoides sword sword (Trichosporonoides megachiiiensis), a microorganism belonging to Trichosporonoides sp.
  • Trichosporonoides edocephalis Trichosporonoides oedocephalis
  • Trichosporonoides medicament Trichosporonoides medicament.
  • Microorganisms belonging to the species of Gachiliensis Trichosporonoides megachiliensis
  • the microorganism may be a mutant strain or a recombinant strain derived by a genetic technique such as cell fusion or gene recombination.
  • This microorganism may produce erythritol and glycerol as by-products in addition to ribitol.
  • UV irradiation N-methyl- ⁇ '-nitro-N-nitrosogazine (NTG) treatment, ethyl methanesulfonate (EMS)
  • NTG N-methyl- ⁇ '-nitro-N-nitrosogazine
  • EMS ethyl methanesulfonate
  • CBS240.79 is a microorganism belonging to Trichosporonoides madida
  • CBS268.81, 269,81 is a microorganism belonging to Trichosporonoides oedocephalis.
  • CBS568.85 is used as a microorganism belonging to the above-mentioned Trichosporonoides edocephalis.
  • Microorganisms belonging to Neudes spatula include CBS241.79, CBS242.79A, and CBS242.79B, respectively.
  • the above microorganisms are treated with UV irradiation, N-methyl-N'-nitrosoguanidine (NTG) treatment, ethyl methanesulfonate (EMS) treatment, nitrite treatment, and acridine treatment.
  • NTG N-methyl-N'-nitrosoguanidine
  • EMS ethyl methanesulfonate
  • nitrite treatment nitrite treatment
  • acridine treatment or a recombinant strain derived by a genetic technique such as cell fusion or gene recombination.
  • Specific examples of the mutant include MCI3442 strain.
  • the MCI3442 strain is a mutant obtained by subjecting Trichosporonoides megachiliensis CBS567.85 to NTG mutation treatment and then performing ultraviolet irradiation treatment twice.
  • strains other than the MCI3442 strain are known strains, and can be easily obtained from Central View, Inc., Forsch Mel Cultures (CBS).
  • CBS Central View, Inc., Forsch Mel Cultures
  • the MCI3442 strain has been deposited as FERM BP-6176 with the Institute of Biotechnology and Industrial Technology, Ministry of International Trade and Industry.
  • mutant MCI3442 The mycological properties of mutant MCI3442 are as follows.
  • the culture initially turns white or yellowish-white at 24 ° C, turns yellow-brown one week after culture, and turns dark yellow-brown after two weeks or more of old culture.
  • the growth of the fungus is moderate, and it is multiplied by kobo-like budding.
  • the budding cells are initially colorless and become slightly thicker and pale brown.
  • the shape is oval, oval or sub-spherical, and its size is 3.8-6.3 x 3.0-5.0 / m.
  • the basal hypha elongates at the same time as the Kobo budding.
  • the basal hypha has a septum and branches.
  • the width is 1.3-2.5 / m, initially colorless and later brown.
  • Hyphae are cut into pieces to form segmented conidia, and budding conidia are formed from the side or tip of the hyphae.
  • Arthropod conidia are cylindrical or barrel-shaped and vary in length. The width is 1.5-5.0 in, initially colorless and later brown.
  • Budding conidia are formed on the side and tip of the basal hypha, and Are formed as a chain.
  • the shape is sub-spherical or elliptical, and the size is 4.4-9.4 X 2.8—4.4 // m. It is initially colorless, later brown, and slightly thicker. ⁇ Physiological features>
  • This strain (MCI3442) has (1) kotoboid budding type cells, (2) dimorphism of segmented conidia and budding conidia, (3) budding type conidia. Conidia are characteristically formed apically and not synchronously. Based on these characteristics, they were compared with the parent strain of Trichosporonoides megachil iensis (CBS567.85) and compared with the original description in the monograph of GD Inglis et al. G. (1992) (Mycologia 84: 555-570). As a result, the properties of this mutant were consistent with those of the parent strain of Trichosporonoides megachiliensis and the original description. O Therefore, the mutant was identified as Trichosporonoides megachiliensis.
  • microorganisms are used.
  • the microorganisms are cultured in the usual manner using glucose as a carbon source. That is, the microorganism is inoculated on an aqueous medium containing 60% (WZV) or less, preferably 20-45% glucose.
  • carbohydrates such as fructos, alcohols such as glycerol, organic acids, and the like that can be assimilated by the microorganism can be appropriately added.
  • the above-mentioned medium contains a nitrogen source which can be assimilated by the present microorganism.
  • a nitrogen source As a nitrogen source
  • the use of a fish meat extract or a plant-derived extract is effective in both the raw material price and the ribitol fermentation performance.
  • the fish meat extract include extracts derived from skipjack, tuna, mackerel, and Pacific saury.
  • concentrated fish extract derived from skipjack is preferred.
  • the plant-derived substance include soybean, corn or cottonseed-derived powder or extract, and among these, soybean powder, defatted soybean powder, cottonseed extract protein or corn extract is preferable.
  • concentrated fish meat extract derived from Ricchio is preferred from the viewpoint of total easiness of cultivation such as price, ribitol fermentation results, degree of foaming during culturing, and the like.
  • the preferred initial concentration of the nitrogen source contained in the medium is 0.5 to 4.0% in the case of yeast extract, and 1.0 to 8.0% in the case of corn steep liquor, fish meat extract, and soybean-derived substances.
  • the preferred nitrogen source concentration is affected by the sugar concentration.
  • the concentration of the nitrogen source added to the medium is preferably 1/10 or less of the sugar concentration.
  • inorganic ions and vitamins are used as necessary in addition to the above-mentioned carbon source and nitrogen source.
  • inorganic ions phosphate ions, magnesium ions, iron ions, manganese ions, molybdenum ions and others are used.
  • vitamins include thiamine, inositol, pantothenic acid, nicotinic acid amide and the like.
  • glucose and other carbon sources nitrogen sources, inorganic ions, and vitamins may be supplemented and added at an appropriate time during the culturing, if necessary.
  • Culture is performed under aerobic conditions.
  • the microorganism is other than ribitol.
  • Erythritol and glycerol may be by-produced, but it is important to provide sufficient ventilation in order to increase the production rate of ribitol.
  • the cultivation is usually performed at a temperature of 20 to 37 ° C, preferably 27 to 32 ° C, for 24 hours to 2 weeks.
  • the microorganisms are removed by a conventional method, that is, a centrifugation method or a membrane filtration method. Prior to the eradication, heat may be applied to the culture termination solution to sterilize it. If necessary, ordinary procedures for sugar purification, such as desalting and decoloring, can be added.
  • the bacteria-free culture supernatant thus obtained is preferably concentrated 5 to 15 times.
  • Preferred alcohols are methanol, ethanol, 1-propanol, 2-propanol, and more preferred alcohols are methanol or ethanol.
  • the amount of the alcohol to be added is usually at least half, preferably at least twice, more preferably at least five times the syrup volume.
  • the alcohol mixture thus obtained is allowed to stand at room temperature or lower, preferably at 0 to 10 ° C, ribitol is crystallized.
  • the crystals thus obtained can be easily separated from the alcohol solution by using a conventional method such as centrifugation or membrane filtration.
  • the obtained wet crystals are dried by vacuum drying or the like.
  • the thus obtained ribitol crystals can be dissolved again in an aqueous solution as needed, and further purified by adding the usual procedures for sugar purification such as desalting and decoloring.
  • Strains A to H of the above (a) were inoculated into 200 ml baffled flasks containing 20 ml of a medium consisting of 30% glucose and 1.0% yeast extract, respectively. These baffled flasks were set in a shaking incubator rotating at 160 rpm and cultured at 30 ° C for 7 days.
  • the mutant MCI3442 and the strain E each of which used the strain E (Trichosporonoides megachiliensis CBS567.85) in Example 1 as a parent strain, were inoculated into a 200-ml baffled flask containing 20 ml of a medium consisting of 30% glucose and 2.0% fish meat extract. These baffled flasks were set on a shaking incubator rotating at 160 rpm. C was cultured for 7 days. The production amounts of ribitol and other saccharides in the obtained culture solution were measured in the same manner as in Example 1. The production results of both strains are shown in Table 2 below. Table 2
  • Trichosporonoides megachi liens is a mutant strain MCI3442 with CBS567.85 as a parent strain (deposited with the Institute of Biotechnology and Industrial Technology, Ministry of International Trade and Industry as FERM BP-6176)
  • the above strain was inoculated into a 200 ml baffled flask containing 20 ml of a medium containing 30% glucose and 1 to 2% of each nitrogen source described in Table 3 below.
  • the flask with the baffle was set in a shaking incubator rotating at 160 rpm, and cultured at 30 ° C for 7 days.
  • Example 3 The same method as in Example 1 was employed. The chromatographic retention time of each carbohydrate contained in the culture supernatant was the same as in Example 1. In addition, production of carbohydrates other than ribitol, erythritol and glycerol was not confirmed. The production results using each nitrogen source are as shown in Table 3 below. Table 3
  • Example 2 After 500 ml of the culture termination solution obtained by the same method as in Example 1 (using strain E) was heat-sterilized with 100 at 20 minutes, the cells, heat-denatured insoluble proteins, and the like were removed by centrifugation. 480 ml of the obtained culture supernatant was heated to 60 ° C, 2 g of slaked lime was added, and the mixture was gently stirred for 30 minutes, and then insoluble substances were removed by centrifugation. The resulting clear supernatant is passed through an ion-exchange resin column (mixed bed of DIAION PA312 (Mitsubishi Chemical) and DIAION WK10 (Mitsubishi Chemical)) to remove. Salted.
  • DIAION PA312 Mitsubishi Chemical
  • DIAION WK10 Mitsubishi Chemical
  • Example 2 After 500 ml of the culture termination solution obtained by the same method as in Example 1 (using strain E) was heat-sterilized with 100 at 20 minutes, the cells and the heat-denatured insoluble protein were removed by centrifugation. 480 ml of the obtained culture supernatant was heated to 60 ° C, 2 g of slaked lime was added, and the mixture was gently stirred for 30 minutes, and then insoluble substances were removed by centrifugation. The resulting clear supernatant was concentrated to 50 ml. 200 ml of ethanol was added to the syrup with stirring, and the mixture was allowed to stand at 4 eC for 15 hours to grow crystals.
  • Example 2 After 500 ml of the culture termination solution obtained by the same method as in Example 1 (using strain E) was heat-sterilized with 100 at 20 minutes, the cells, heat-denatured insoluble proteins, and the like were removed by centrifugation. 480 ml of the obtained culture supernatant was concentrated to 50 ml. 200 ml of methanol was added to this bottle with stirring, and the mixture was allowed to stand at 4 for 15 hours to grow crystals. After confirming that crystals had sufficiently grown and precipitated in methanol, the sugar composition of the supernatant was analyzed by HPLC. When the crystallization ratio was calculated, the content of ribitol was 73.5% by weight.
  • ribitol can be efficiently produced by one-stage fermentation using inexpensive saccharides. Also, according to ⁇ alcohol crystallization employed in the production method of the present invention, even glycerol are-produced in significant proportion in the culture solution, glycerol is relatively easily soluble in alcohol d -C 3 Therefore, it can be easily separated from ribitol. Furthermore, since the coloring component soluble in alcohol is dissolved in the alcohol solution and removed from the obtained crystals, the load of the decoloring step before or after crystallization should be significantly reduced. Is possible.

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Description

明 細 書 リビトールの製造方法 技術分野
本発明は、 リビトールの製造方法に関し、 より詳細には微生物を用いて糖か らリビトールを製造する方法に関する。 背景技術
近年、 リビトールは、 生物の構成糖としてのみならず、 医薬および農薬の中 間原料として注目されている。 従来、 微生物を用いてリビトールを製造する方 法としては、 （1) D —リボースを原料として酵素反応により製造する方法、 （2) グルコース等の糖の発酵により製造する方法、 （3) 藻類の炭酸固定による方法 が知られている。
D—リボースを原料とする方法としては、キャンディダ ポリモルファ （Candida polymorpha) 又はトルロプシス ファマ夕 （Torulopsis famata) を用いる方 法 （特公昭 45— 2071号公報） 及びコ リネパクテリ ゥム エスピー (Corynebacterium sp) を用いる方法 （特公昭 49— 12718号公報） が報告され ている。
グルコース等の糖の発酵による方法としては、 ピキア ギリエルモンディ
(Pichia guilliermondii) を用いる方法 (Biochem. Physiol. Pflanz 175 (8/9)732 (1980))及びモニリエラ トメントーザ バー ポリニス（Moniliella tomentosa var pollinis) を用いる方法 （特公平 6 - 30591号公報、 特公平 6 - 30592号 公報、 特公平 6 - 30593号公報、 特公平 6 - 30594号公報） が報告されている。 また、 藻類の炭酸固定による方法としては、 トレボウキシァ （Trebouxia) 属を 用いる方法 （特公昭 44— 16350号公報） が報告されている。
しかしながら、 実際に従来の方法を用いて工業的規模でリビトールの製造を 行う場合、 種々の問題が生じる。 具体的には、 藻類を用いた生産設備は複雑に なりがちであり、 また、 微生物を用いた従来法では菌体の培養と反応の二段階 の行程が必要であるためコストがかかるという難点がある。
加えて、 D—リボースは原料として必ずしも安価ではないため、従来法の中で は安価な原料であるグルコース等の糖の発酵によりリビトールを製造する方法 が最も好ましいが、 従来のモニリエラ トメ ントーザ バ一 ポリニス (Monil iella tomentosa var pollinis) 等を用いる方法ではエリスリ トール等 の他の糖アルコールは効率的に製造できるものの、 リビトールに関しては満足 のいく生産性が必ずしも得られていない。
そこで、 安価な糖類を用いて一段階の発酵でリビトールを製造する方法、 換 言すれば、 リビトールを効率よく製造する方法の開発が求められていた。 ところで、 リビトール結晶を高純度に得るためには、 リビトール生産菌を水 性培地中で培養して得られた培養液からリビトールを高純度で分離、 回収する 必要が生じる。 従来、水溶性の糖アルコール含有溶液から純度の高い糖アルコー ルを回収する方法としては、 クロマ卜分離を用いる方法や低温晶析法などが知 られている。
しかしながら、 リビトールの場合、 これまで培養液からの有効な分離、 精製 方法は報告されていない。 従来の方法はエリスリ トール等の他の糖アルコール は効率的に分離、 精製できるものの、 リビトールに関しては必ずしも応用され 得る方法ではなかった。
そこで、 培養終了後のリビトール含有液からリビトールを効率よく分離、 精 製する方法の開発が求められていた。 発明の開示
本発明者らは、 上述の問題を解決すべく鋭意検討した結果、 （1) トリコスポ ロノイデス （Trichosporonoides) 属に属する菌がグルコースからリビトールを 製造する能力を有すること、 （2) リビトールが d 〜C3 のアルコールにより容 易に晶析されることを見い出し、 本発明を完成するに至った。
すなわち、 本発明の要旨は、 トリコスポロノイデス （Trichosporonoides) 属 に属する微生物と糖を接触させ、 好気的発酵によりリビトールを産生すること を特徴とするリビトールの製造方法に存する。
そして、 本発明の好ましい実施形態においては、 上記の培養液から菌体を除 去し、 得られた上清液に C, 〜C3 のアルコールを添加してリビトール結晶を晶 析する。
以下、 本発明を詳細に説明する。
先ず、 本発明で用いる微生物について説明する。
本発明で用いるトリコスポロノイデス属に属する微生物としては、 ダルコ一 スからリビトールを製造する能力を有する微生物であれば特に限定されないが、 好ましくは、 トリコスポロノィデス マディダ （Trichosporonoides madida)、 卜リコスポロノづテス 二クレスセンス (Trichosporonoides nigrescens) 卜 リコスホロノィテス ェドセフアリス (Trichosporonoides oedocephalis)ヽ 卜 リコスホロノイデス メ刀チリェンシス (Trichosporonoides megachiiiensis)、 トリコスポロノイデス スパチュラ一タ （Trichosporonoides spathulata) の 種に属する微生物が挙げられ、 更に好ましくは、 トリコスポロノイデス エド セファリス (Trichosporonoides oedocephalis) と卜リコスポロノィデス メ ガチリェンシス （Trichosporonoides megachil iensis) の種に属する微生物が 挙げられる。
なお、 上記微生物は、 変異株または細胞融合もしくは遺伝子組み換え法など の遺伝的手法により誘導される組み換え株などであってもよい。
本微生物はリビトール以外にエリスリ トールとグリセロールを副生する場合 があるが、 例えば、 紫外線照射や N—メチル—Ν '—ニトロ— N -二トロソグァ 二ジン （NTG) 処理、 ェチルメタンスルホネート （EMS) 処理、 亜硝酸処理、 ァクリジン処理など通常知られた方法により、 リビトールの生産比率がよく、逆 にエリスリ トールゃグリセロールの生産性の低い変異株を取得することは有効 である。 これらの変異株を用いることによりグルコースを効率的にリビトール に変換できるのみならず、 その後のリビトールの分離 ·精製工程における負荷 を著しく軽減することが出来る。 また、 同様の変異処理により、 培養時の発泡 の少ない変異株を取得することも、 リビトール生産性向上に大変有効である。 そして、例えば、上記のトリコスポロノイデス マディダ（Trichosporonoides madida) に属する微生物としては CBS240.79が、 上記のトリコスポロノイデ ス エドセファリス (Trichosporonoides oedocephalis) に属する微生物とし ては CBS268.81、 269,81が、 上記のトリコスポロノイデス エドセファリス (Trichosporonoides oedocephalis) に属する微生物としては CBS568.85力、上 記の ト リ コスポロノイデス メガチリェンシス （Tri chosporonoides megachiliensis) に属する微生物としては CBS567.85が、 上記のトリコスポロ ノイデス スパチュラ一夕 （Trichosporonoides spathulata) に属する微生物 としては CBS241.79、 CBS242.79A、 CBS242.79Bがそれぞれ挙げられる。 また、上記の微生物は、 UV照射、 N—メチルー N' —ニトロソグァニジン（NTG) 処理、 ェチルメタンスルホネート （EMS) 処理、 亜硝酸処理、 ァクリジン処理 などによる変異株、 または、 細胞融合もしくは遺伝子組換え法などの遺伝学的 手法により誘導される組換え株などであってもよい。 変異株の具体例としては MCI3442株が挙げられる。 MCI3442株は、 トリコスポロノイデス メガチリ ェンシス （Trichosporonoides megachiliensis) CBS567.85を NTG変異処理 した後、 紫外線照射処理を 2度行って得られた変異株である。
上記の菌株のうち、 MCI3442株以外の菌株は全て公知の菌株であり、 セント ラルビュー口一フオーシュメルカルチャーズ （CBS) から容易に入手すること が出来る。 また、 MCI3442株は、 通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究 所に FERM BP— 6176として寄託されている。
変異株 MCI3442についての菌学的性状は以下の通りである。
ぐ形態学的特徴 >
LCA上、 24 °Cの培養で初め白色ないし黄味白色、 培養 1週間後に黄褐色、 2 週間以上の古い培養では暗い黄茶色に変色する。 菌の生育は中程度、 コゥボ様 の出芽により増殖する。
出芽細胞は、 初め、 無色、 後にやや厚膜化して淡褐色を呈する。 形状は、 楕 円形、 卵形または亜球形であり、 その大きさは 3.8— 6.3 x 3.0— 5.0 / mである。
1〜4回出芽して増殖する、 多極出芽である。
コゥボ様の出芽と同時に基底菌糸が伸張する。 基底菌糸は、 隔壁を有し、 分 枝する。 幅は 1.3— 2.5 / mであり、 初め無色、 後に褐色になる。 菌糸は、 断片 状に切れて分節型の分生子になり、 菌糸の側面または先端部より出芽型の分生 子を形成する。
分節型分生子は、 円筒形ないし樽型であり、 長さは変化に富む。 幅は 1.5 - 5. 0 inであり、 初め無色、 後に褐色になる。
出芽型分生子は、 基底菌糸の側面および先端に形成され、 単一または 2、 3個 の連鎖となって形成される。 形状は亜球形ないし楕円形であり、 大きさは 4.4一 9.4 X 2.8— 4.4 // mである。 そして、 初め無色、 後に褐色、 やや厚膜化する。 <生理学的特徴〉
生育温度 ： 9〜37 °C (PDA上、 10日間培養）
最適生育温度 ： 27〜30 eC
生育 pH : 4〜9 (LCA液体培地上、 10日間培養）
最適生育 pH : 5〜6 本菌株 （MCI3442) は、 （1) コゥボ状の出芽型細胞を有する、 （2) 分節型分 生子と出芽型分生子の二形性を有する、 （3) 出芽型分生子は求頂的に形成され、 同調的に形成されない、特徴を有す。 これらの特徴に基づいて、 Trichosporonoides megachil iensis (CBS567.85) の親株と対比すると共に、 G. D. Ingl is et al. G. (1992) のモノグラフ （Mycologia 84： 555 - 570) の原記載と照合した結 果、 本変異株の性状は Trichosporonoides megachil iensisの親株の性状および 原 §d載によ 合致した o 従って、 変異株は Trichosporonoides megachiliensis と同定した。
次に、 リビトールの製造方法について説明する。
本発明の製造方法においては、上記の微生物の 1種または 2種以上が用いられ る。 そして、 微生物はグルコースを炭素源として常法通り培養される。 つまり、 微生物は、 60 % (WZV) 以下、 好ましくは 20〜45 %のグルコースを含む水性 培地に植菌される。
炭素源としては、 本微生物が資化し得るフルク ト一ス等の炭水化物、 グリセ ロール等のアルコール類、 有機酸などを適宜加えることが出来る。
更に、 上記の培地には本微生物が資化し得る窒素源が含まれる。 窒素源とし ては、 酵母エキス、 コーンスティープリカ一、 NZアミン、 トリプト一ス、 ぺプ トン、 ポリペプトン、 肉エキス、魚肉エキス、 その他の有機窒素源、 または、 硝 酸ナトリウム、 その他の無機窒素源が適宜用いられる。 これらの中では、 酵母 エキス、 魚肉エキス又は植物由来物質を用いることが好ましく、 特に、 魚肉ェ キス又は植物由来の抽出物質を用いると原料価格およびリビトール発酵成績の 両面で効果的である。 魚肉エキスとしては、 カツォ、 マグロ、 サバ又はサンマ 由来のエキスが挙げられ、 これらの中ではカツォ由来の濃縮魚肉エキスが好ま しい。 植物由来物質としては、 大豆、 トウモロコシ若しくは綿実由来の粉末ま たは抽出物などが挙げられ、 これらの中では、 大豆粉末、 脱脂大豆粉末、 綿実 抽出タンパク質またはトウモロコシ抽出物が好ましい。 特に、 価格、 リビトー ル発酵成績、培養中の発泡の度合い等の培養の容易さ等を総合した観点から、 力 ッォ由来の濃縮魚肉エキスが好ましい。
培地中に含まれる窒素源の好ましい初発濃度は、 酵母エキスの場合 0.5〜4.0 %、 コーンスティ一プリカ一や魚肉エキス、 大豆由来物質の場合、 1.0〜8.0 % である。 好ましい窒素源の濃度は糖の濃度に影響される。 培地に加える窒素源 の濃度は糖の濃度に対して 1/10以下とするのが好ましい。
上述の炭素源、 窒素源の他に、 無機イオンやビタミン類を必要に応じ添加す ることは有効である。 無機イオンとしては、 リン酸イオン、 マグネシウムィォ ン、 鉄イオン、 マンガンイオン、 モリブデンイオン、 その他が用いられる。 ビ タミン類としては、 チアミン、 イノシトール、 パントテン酸、 ニコチン酸ァミ ド等が挙げられる。
また、 上述のグルコースその他の炭素源、 窒素源、 無機イオン、 ビタミン類 は、 必要に応じて培養中の適当な時点で追補添加してもよい。
培養は好気的条件下で行う。 本発明において、 本微生物はリビトール以外に エリスリ トールとグリセロールを副生する場合があるが、 リビトールの生成比 率を効率よくするためには十分な通気を行うことが重要である。 培養は、 通常 20〜37 °C、 好ましくは 27〜32 °Cの温度で、 24時間から 2週間行う。
次に、 リビトールの分離、 精製方法について説明する。
培養終了後、 微生物は、 常法、 すなわち遠心分離法や膜ろ過法により除去さ れる。 除菌に先立ち、 培養終了液に熱を加え殺菌を行ってもよい。 また、 必要 に応じ、 脱塩、 脱色など、 通常の糖の精製における操作を加えることも出来る。 こうして得られた除菌済みの培養上清液は、 好ましくは 5〜15倍に濃縮される。 そして、 濃縮後のリビトール含有シロップに d 〜C3 のアルコールの 1種また は 2種以上を撹拌しながら加える。 好ましいアルコールは、メタノール、エタノー ル、 1 一プロパノール、 2—プロパノールであり、 更に好ましいアルコールは、 メタノール又はエタノールである。 アルコールの添加量は、 シロップ容量に対 し、通常 2分の 1量以上、好ましくは 2倍以上、 更に好ましくは 5倍以上である。 こうして得られたアルコール混液を室温以下、 好ましくは 0〜10 °Cで静置する とリビトールが晶析される。
こうして得られた結晶は、 遠心分離法や膜ろ過法と言った常法を用いること で容易にアルコール溶液中から分離できる。 得られた湿潤結晶は真空乾燥など により乾固される。 こうして得られたリビトール結晶は、 必要に応じ、 再度水 溶液に溶解し、 脱塩、 脱色など、 通常の糖の精製における操作を加え更に精製 することも可能である。
上記の分離、 精製方法においては、 必要に応じ、 アルコール晶析の前後に脱 塩 ·脱色と言った工程を組み合わせることが可能であるが、 晶析前の濃縮工程 以前に炭酸飽充を行うことが有効である。 すなわち、 除菌済みの培養上清液に、 その培養上清液に含まれると思われる固形分の 0.1〜10重量％、 好ましくは 0.5 〜2.0重量％の消石灰を添加し、 好ましくは 60 °C前後で 15分から 1時間保持し た後、 二酸化炭素を吹き込み中和する。 液中に共存したタンパク質、 多糖、 核 酸、 色素などの糖以外の不純物質は、 不溶性の金属塩に吸着され、 ろ過によつ て除去される。 発明を実施するための最良の形態
以下に実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、 その要旨を超えな い限り本発明の技術分野における通常の変更をすることが出来る。
実施例 1
(a) 使用微生物
菌株 A Trichosporonoides madida CBS240.79
菌株 B Trichosporonoides nigrescens CBS268.81
菌株 C Trichosporonoides nigrescens CBS269.81
菌株 D Trichosporonoides oedocephalis CBS568.85
菌株 E Trichosporonoides megachiliensis CBS567.85
菌株 F Trichosporonoides spathulata CBS241.79
菌株 G Trichosporonoides spathulata CBS242.79A
菌株 H Trichosporonoides spathulata CBS242.79B
(b) 培養方法
30 %グルコース、 1.0 %酵母エキスより成る培地 20mlを入れた 200mlバッ フル付きフラスコに、 上記 （a) の菌株 A〜Hをそれぞれ接種した。 これらのバ ッフル付きフラスコは 160rpmで回転する振とう培養機にセッ 卜され、 30 °Cで 7日間培養が行われた。
(c) リビトールの生産確認 先ず、 上記 （b) の培養にて得られた培養終了液を各々遠心分離し、 微生物菌 体を除去した。 得られた培養上清に含まれるリビトール等の糖類含量を高速液 体クロマトグラフィー （HPLC) により下記の条件で測定した。 各糖質の保持時 間は下記分析条件において、 それぞれ、 グルコース 10.57分、 リビトール 12.22 分、 エリスリ トール 13.36分、 グリセロール 15.09分である。 また、 上記菌株 A 〜Hの何れにおいても、 リビトール、 エリスリ トール及びグリセロール以外の糖 質の生産は確認されなかった。
<高速液体クロマトグラフィ一分析条件 >
力 ラ ム： MCI GEL CK08EH8mmI. D. x 300mm
(三菱化学株式会社製）
溶 離 液： 1N リン酸水溶液
流 速： 0.6mlZ分
カラム温度： 50 eC
検 出 器： RI
(d) 結果
各菌株の生産結果は次の表 1に示す通りである。
表 1
Figure imgf000013_0001
実施例 2
実施例 1における菌株 E (Trichosporonoides megachiliensis CBS567.85) を親株とした変異株 MCI3442と菌株 Eを各々、 30 %グルコース、 2.0 %魚肉ェ キスより成る培地 20mlを入れた 200mlバッフル付きフラスコに接種した。 こ れらのバッフル付きフラスコは 160rpmで回転する振とう培養機にセッ トされ、 30。Cで 7日間培養が行われた。 得られた培養液中のリビトールその他の糖質生 産量を実施例 1と同様の方法で測定した。 両菌株の生産結果は次の表 2に示す通 りである。 表 2
Figure imgf000014_0001
実施例 3
(a) 使用微生物
Trichosporonoides megachi liens is CBS567.85を親株とする変異株 MCI3442 株 （通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に FERM BP - 6176とし て寄託）
(b) 培養方法
30 %グルコ一スと以下の表 3に記載の 1〜2 %の各窒素源より成る培地 20ml を入れた 200mlバッフル付きフラスコに上記の菌株を接種した。 バッフル付き フラスコを 160rpmで回転する振とう培養機にセッ 卜し、 30 °Cで 7日間培養を 行った。
(c) リビトールの生産確認
実施例 1と同様の方法を採用した。 培養上清に含まれる各糖質のクロマトグラ フィ一保持時間は実施例 1と同様であった。 また、 リビトール、エリスリ トール、 グリセロール以外の糖質の生産は確認されなかつた。 各窒素源を用いた場合の 生産結果は次の表 3に示す通りである。 表 3
Figure imgf000015_0001
実施例 4
実施例 1 (菌株 Eを使用） と同様の方法で得た培養終了液 500mlを 100でで 20分間加熱殺菌した後、 菌体および熱変性した不溶性タンパク質などを遠心分 離により除去した。 得られた培養上清液 480mlを 60 °Cに加熱し、 消石灰 2gを 添加して 30分間緩やかに撹拌した後、 遠心分離により不溶性物質を除去した。 得られた清澄な上清液を更にイオン交換樹脂カラム （DIAION PA312 (三菱化 学株式会社製） と DIAION WK10 (三菱化学株式会社製） の混合床） に通し脱 塩した。 次に、 粉末活性炭 0.6gを加えて 60 °Cで 30分撹拌した後、 活性炭を除 去した。 得られた上清液は淡黄色を呈していた。 これを 50m】まで濃縮した。 こ のシロップにメタノール 200mlを撹拌しながら加え、 4°Cで 15時間静置し、 結 晶を成長させた。 十分結晶が成長しメタノール中で沈降してることを確認の上、 上清液の糖組成を HPLCにて分析し、 晶析率を算出したところ、 リビトールが 85重量％であつたのに対して、 エリスリ トール及びグリセロールは 10重量％未 満であった。 上清液をデカンテーシヨンにより除いた後、 メタノールで 3回洗浄 した。 得られた湿潤結晶を減圧乾燥し、 糖質純度 99.9重量％の白色のリビトー ル粉末結晶 22gを得た。 培養終了液および結晶中の糖組成を表 4に示す。 表 4
Figure imgf000016_0001
実施例 5
実施例 1 (菌株 Eを使用） と同様の方法で得た培養終了液 500mlを 100 で 20分間加熱殺菌した後、 菌体および熱変性した不溶性タンパク質などを遠心分 離により除去した。 得られた培養上清液 480mlを 60 °Cに加熱し、 消石灰 2gを 添加して 30分間緩やかに撹拌した後、 遠心分離により不溶性物質を除去した。 得られた清澄な上清液を 50mlまで濃縮した。 このシロップにエタノール 200ml を撹拌しながら加え、 4 eCで 15時間静置し、 結晶を成長させた。 十分結晶が成 長しメタノール中で沈降してることを確認の上、 上清液の糖組成を HPLCにて 分析した。 晶析率を算出したところ、 リビトールは 71.8重量％であった。 上清 液をデカンテ一シヨンにより除いた後、 エタノールで 3回洗浄した。 得られた湿 潤結晶を減圧乾燥し、糖質純度 98.6重量％の乳白色のリビトール粉末結晶 27.7g を得た。 培養終了液および結晶中の糖組成を表 5に示す。 表 5
Figure imgf000017_0001
実施例 6
実施例 1 (菌株 Eを使用） と同様の方法で得た培養終了液 500mlを 100でで 20分間加熱殺菌した後、 菌体および熱変性した不溶性タンパク質などを遠心分 離により除去した。 得られた培養上清液 480mlを 50mlまで濃縮した。 このシ 口ップにメタノール 200mlを撹拌しながら加え、 4でで 15時間静置し、 結晶を 成長させた。 十分結晶が成長しメタノール中で沈降してることを確認の上、 上 清液の糖組成を HPLCにて分析した。 晶析率を算出したところ、 リビトールは 73.5重量％であった。 上清液をデカンテ一シヨンにより除いた後、 メタノール で 3回洗浄した。 得られた湿潤結晶を減圧乾燥し、 糖質純度 87.5重量％の淡褐 色のリビトール粉末結晶 23.7gを得た。 培養終了液および結晶中の糖組成を表 6に示す。 表 6
Figure imgf000018_0001
産業上の利用可能性
本発明の製造方法により、 安価な糖類を用いて一段階の発酵で、 かつ効率よ く リビトールを製造することが出来る。 また、 本発明の製造方法で採用するァ ルコール晶析によれば、 培養液中にグリセロールがかなりの割合で副生してい ても、 グリセロールは d 〜C3 のアルコールには比較的容易に溶解するため、容 易にリビトールと分離することが出来る。 更に、 アルコールに可溶な着色成分 がアルコール溶液中に溶解し、 得られた結晶中から除去されているため、 晶析 の前または後で脱色工程を行う場合でも、 その負荷を著しく軽減することが可 能である。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . トリコスポロノイデス （Trichosporonoides) 属に属する微生物を、 糖を含 有する水性培地中、 好気的条件下で培養し、 リビトールを産生することを特徴 とするリビトールの製造方法。
2. トリコスポロノイデス （Trichosporonoides) 属に属する微生物が、 トリコ スポロノィァス マディダ (Trichosporonoides madida)、 トリコスポロノづテ ス ニグレスセンス (Trichosporonoides nigrescens)、 卜リコスポロノィァス ェ卜セファリス (Trichosporonoides oedocephal is八 卜リコスポロノィテス メガチリェンシス (Trichosporonoides raegachiliensis) 及び Z又は卜リコス ポロノィデス スノヽ0チユラ一夕 (Trichosporonoides spathulata) の種 ίこ属す る微生物である請求の範囲 1に記載の製造方法。
3. 微生物が、 CBS240.79、 CBS268.81、 CBS269.81、 CBS649.66、 CBS568. 85、 CBS567.85, CBS241.79、 CBS242.79A、 CBS242.79B及び/又はそれら の変異株である請求の範囲 2に記載の製造方法。
4. トリコスポロノイデス （Trichosporonoides) 属に属する微生物が、 トリコ スホロノィァス ェ卜セファリス (Trichosporonoides oedocephalis) 及び, 又は ト リ コスポロノイデス メガチリェンシス （Tr ichosporonoides raegachil iensis) の種に属する微生物である請求の範囲 2に記載の製造方法。
5. 微生物が、 CBS568.85、 CBS567.85及び/又はそれらの変異株である請求 の範囲 4に記載の製造方法。
6. トリコスポロノイデス （Trichosporonoides) 属に属する微生物が、 N —メ チルー N '—二トロー N—二トロソグァ二ジン （NTG) 処理および紫外線照射 により得られた変異株である請求の範囲 1に記載の製造方法。
7. 糖がグルコースである請求の範囲 1〜6の何れかに記載の製造方法。
8. 培養液から菌体を除去し、得られた上清液に C,〜C3 のアルコールを添加し てリビトール結晶を晶析する請求の範囲 1に記載の製造方法。
9. 〜^ のアルコールを添加してリビトール結晶を晶析するに先立って、培 養液から菌体を除去した上清液に消石灰を添加した後、二酸化炭素を吹き込み、 上清液中に共存した糖以外の不純物質を不溶性の金属塩に吸着させ、 ろ過によ つて除去する請求の範囲 8に記載の製造方法。
10. 。,〜。3 のアルコールを添加してリビトール結晶を晶析するに先立って、菌 体を除去した上清液を濃縮する、 請求の範囲 8に記載の製造方法。
11. 〜〇3 のアルコールを添加してリビトール結晶を晶析するに先立って、培 養液から菌体を除去した上清液に消石灰を添加した後、二酸化炭素を吹き込み、 上清液中に共存した糖以外の不純物質を不溶性の金属塩に吸着させ、 ろ過した 後、 得られたろ過液を濃縮する、 請求の範囲 8に記載の製造方法。
12. 晶析により得られたリビトール結晶を水に溶解し、消石灰を添加した後、二 酸化炭素を吹き込み、 上清液中に共存した糖以外の不純物質を不溶性の金属塩 に吸着させ、 ろ過によって除去する請求の範囲 8に記載の製造方法。
13. 菌体を除去した上清液中に含まれる糖が、 リビトール、 エリスリ トール及 びグリセロールを主成分とする請求の範囲 8に記載の製造方法。
14. 〜 のアルコールがメタノール、 エタノール又はプロパノールである 請求の範囲 8に記載の製造方法。
15. G〜C3 のアルコールを濃度が 50 %以上となる様に添加する請求の範囲 8 に記載の製造方法。
16. 水性培地の窒素源として、 酵母エキス、 魚肉エキス又は植物由来物質を用 いる請求の範囲 1に記載の製造方法。
17. 魚肉エキスが、 カツォ、 マグロ、 サバ又はサンマの濃縮エキスであり、 植 物由来物質が、 大豆、 とうもろこし若しくは綿実由来の粉末または抽出物であ る請求の範囲 16に記載の製造方法。
18. 魚肉エキスがカツォ濃縮エキスであり、 植物由来物質が大豆粉末、 脱脂大 豆粉末または綿実抽出蛋白質である請求の範囲 16に記載の製造方法。
19. 水性培地に加える窒素源の濃度が糖濃度に対して 1 10以下である請求の 範囲 16に記載の製造方法。
BUDAPEST TREATY ON THE I NTERNAT I 0-
.L RECOGNITION OF THE DEPOS IT OF
CROO GAN I SMS FOR THE PURPOSE'S OF 特許手親上の微生物の PATENT PROCEDURE
し に するブタぺスト条約 _j
RECE IPT IN THE CASE OF AN OR IGINAL DEPOS IT
下記国際寄託当局によつて規則 7. 1に従い
発行される。 i s s u ed pu r su an t t o Ru l e 7. 1 b y t he
INTERNATIONAL DEPOS ITARY AUTHORITY
原寄託についての受託証 i de n t i f i e d a t t h e b o t t om o f t i s a e.
氏名 （名称） 三菱化学株式会社
代表 ¾«g役 三浦 昭
寄
あ て 名 100
東京都千代田区丸の内二丁目 5番 2号
A u I
I . 微生物の表
(寄託者力付した識別のための ） (受託番号）
Tr i c ho s p o r o no i d e s 1 e g a c h 1 1 s i s MC I FERM BP- 6176 3442
2- 件- 及び分類学上の位置
1欄の微生物には、 次の事項を記載した文書が されていた。
騸 科学的性質
■ 分類学上の位 S
3- 及び
本国際寄託当局は、 平成 9 年 6 月 2 日 （原寄託日） に ¾ϋした 1欄の微生物を受託する。
4. 移管請求の受領
本国際寄託当局は、 平成 9 年 6 月 2 日 （原寄託日） に 1檷の ¾生物を ¾ϋした。
そして、 平成 9年 11 月 19 日 に原寄託よりブダぺスト条約に基づく寄託への移管請求を ¾ϋした。
( 平成 9 年 6 月 2 日 に寄託された¾工研茵寄第 Ρ— 1625 号より移管）
5. II際寄託 局
通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所
Figure imgf000022_0001
1-3, H i g a h i 1 c h ' e Ts uicub a— s h i I b a r ak i— ki
305, JAPAN
平成 9年 （1997) 11月 19日
PCT/JP1997/004292 1996-11-27 1997-11-25 Procede de preparation de ribitol WO1998023766A1 (fr)

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