WO1998006850A1 - Immunologisch aktive proteine von borrelia burgdorferi, dafür kodierende nukleinsäuren sowie deren verwendung in testkits und als impfstoffe - Google Patents
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Abstract
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind immunologisch aktive Proteine von Borrelia burgdorferi, die in einer von anderen aus Borrelia burgdorferi stammenden Proteinen freien Form vorliegen, mit der Sequenz des Proteins 1829-22A, das die Aminosäuresequenz MKKFNLIIEALFAILLTACNFGLMEETKIALESSSKDVKNKILQIKKDAEDKGVNFAAFTSSETGSKVTNGGLALREAKIQAINEVEKFLKRIEEEALKLKEHGNSGQFLELFDLLLEVLESLEPIGIKGLKDFISEEAKCNPISTSERLIEVKVQIENKMEEVKRKQNLNKERKSNKGKKKK hat, oder einer Teilsequenz davon mit wenigstens 10 aufeinanderfolgenden Aminosäuren oder mit der Sequenz des Proteins 1829-22B, das die Aminosäuresequenz MIKYNKIILTLTLLASLLAACSLTGKARLESSVKDITNEIEKAIKEAEDAGVKTDAFTETQTGGKVAGPKIRAAKIRVADLTIKFLEATEEETITFKENGAGEDEFSGIYDLILNAAKAVEKIGMKDMTKTVEEAAKENPKTTANGIIEIVKVMKAKVENIKEKQTKNQK hat, oder einer Teilsequenz davon mit wenigstens 10 aufeinanderfolgenden Aminosäuren.
Description
Immunologisch aktive Proteine von Borrelia burgdorferi, dafür kodierende Nukleinsäuren sowie deren Verwendung in Testkits und als Impfstoffe
Die Lyme-Borreliose ist die häufigste von Zecken übertragene Infektionskrankheit des Menschen. Ein erheblicher Teil der Zecken, die als Vektoren für die Übertragung der Lyme-Borreliose dienen, ist mit dem Erreger der Lyme-Borreliose, der Spirochäte Borrelia burgdorferi, durchseucht. Der Durchseuchungsgrad kann je nach geographischem Gebiet zwischen 1 ° und b s zu 100 °s liegen.
Eine Infektion mit B . burgdorferJ fuhrt zu einem komplexen Krankheitsbild, das man in verschiedene Stadien einteilen kann.
In einigen Fallen kann die Infektion mit B . burgdorfeπ subklinisch verlaufen. Problematisch s nd jedoch häufig Spätfolgen, die durch nicht erkannte bzw. nicht behandelte Borrelien-Infektionen verursacht werden. Insbesondere wegen der gefährlichen Erkrankungen, die bei nicht erkannten bzw. nicht behandelten Infektionen auftreten können, wie Karditis, Myositis, Iritis, Panophthalimitis oder neurologische Manifestationen ist es wichtig, eine etwaige Infektion mit B . burgdorfer möglichst sicher und zutreffend diagnostizieren zu können.
Der Erregernachweis kann insbesondere im Frühstadium aus Patientenmaterial gefuhrt werden. Hierbei st allerdings nachteilig, daß die Anzuchtung von B . burgdorferi verhältnismäßig schwierig ist und daher in der Regel Speziallabors vorbehalten bleibt.
Wünschenswert ist es αaher, die Antikörper aus dem Serum, be L neurologischen Manifestationen auch aus Liquor und be L Gelenkbeschwerden aus Gelenkpunxtat nachzuweisen.
Für die Diagnostik ist es wichtig, bestimmen zu können, ob eine Infektion erst vor kurzem stattgefunden hat, oder ob es sich un eine Infektion handelt, die schon einige Zeit zurückliegt. Dies«1 Unterscheidung kann durch die immunologische Bestimmung der nachgewiesenen Antikörper gefuhrt werden, wobei in der Regel IgM- Antikörper für eine erst kürzlich zurückliegende Infektion sprechen, wohingegen IgG-Antικorper für eine bereits langer zurückliegende Infektion sprecnen.
Für die Diagnostik st auch wicntig, daß die diagnostischen Tests spezifisch sind, d.h. daß keine Kreuzreaktionen auftreten mit solchen bakteriellen Erregern, die eine gewisse phylogenetische Verwandtschaft zu den Borrelien aufweisen, wie beispielsweise' Treponema pallidum.
Andererseits ist es aber für die Diagnostik auch bedeutsam, daP durch die in den Testverfahren eingesetzten Proteine bzw. Peptide möglichst alle Stamme von Borrelia burgdorferi erkannt werden können .
Da die Lyme-Borreliose weitvercreitet ist und, da eine Infektion leicht durch einen Zecκenbιß übertragen werden kann, besteht auch ein erhebliches Bedurrnis, Imptstoffe zu entwickeln, die einen Immunschutz gegen Borrelien-Infektionen gewahrleisten.
Für die Entwicklung von Impfstoffen eignen sich insbesondere solche Proteine, die an der Oberfläche der Bakterien mit dem Immunsystem des befallenen Organismus in Kontakt kommen.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung konnten nun zwei Proteine aufgefunden werden, die sowohl für die Diagnostik wie auch für die Entwicklung von Impfstoffen besonders geeignet sind.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind daher immunologisch aktive Proteine von Borrelia burgdorferi, die in einer von anderen aus Borrelia burgdorferi stammenden Proteinen freien Form vorliegen, und die Sequenz des Proteins 1829-22A mit der Aminosäuresequenz (Seq.ID: 1)
MKKFNLIIEALFAILLTACNFGLMEETKIALE5SSKDVKNKILQIKKDAEDKGVNFAAFTSSETG SKVTNGGLALREAKIQAINEVEKFLKRIEEEALKLKEHGNSGQFLELFDLLLEVLESLEPIGIKG LKDFISEEAKCNPISTSERLIEVKVQIENK EEVKRKQNLNKERKSNKGKKKK
oder eine Teilsequenz davon mit wenigstens 10 aufeinanderfolgenden Aminosäuren oder die Sequenz des Proteins 1829-22B mit der Ammosauresequenz (Seq.ID: 2)
MIKYNKIILTLTLLASLLAACΞLTGKARLESSVKDITNEIEKAIKEAEDAGVKTDAFTETQTGGK VAGPKIRAAKIRVADLTIKFLEATEEETITFKENGAGEDEFSGIYDLILNAAKAVEKIGMKDMTK TVEEAAKENPKTTANGIIEIVKV KAKVENIKEKQTKNQK
oder eine Teilsequenz davon mit wenigstens 10 aufeinanderfolgenden Aminosäuren aufweisen.
Erfindungsgemäß werden bevorzugt solche Teilsequenzen eingesetzt, die Epitope aufweisen, die diagnostisch und/oder therapeutisch relevant sind. Bei dem Protein 1829-22A, dessen Sequenz im Sequenzprotokoll unter Seq.ID No . 1 aufgeführt ist, sind folgende Teilsequenzen besonders bevorzugt:
Der Bereich zwischen der Aminosäure 31 (Lys) und der Aminosäure 55 (Asn). Ein anderes bevorzugtes Polypeptid befindet sich zwischen Position 60 (Thr) und Position 71 (Gly). Ein weiteres bevorzugtes Polypeptid befindet sich zwischen Aminosäure 82 (Gin) und Aminosäure 108 (Gin) . Weiterhin ist besonders bevorzugt der C-terminale Bereich zwischen Aminosäure 130 (Gly) und Aminosäure 183 (Lys).
Bei dem Protein 1829-22B, das mit der Seq.ID No . 2 wiedergegeben ist, sind folgende Teilbereiche besonders bevorzugt: Aminosäure 61 (Gin) bis Aminosäure 71 (He); Aminosäure 87 (Glu) bis Aminosäure 108 (Gly); Aminosäure 121 (Glu) bis Aminosäure 145 (Asn) und der C-terminale Bereich von Aminosäure 150 (He) bis Aminosäure 170 (Lys). Die Positionen der Aminosäuren sind in den Sequenzprotokollen angegeben. Die Peptide, die die oben angegebenen Teilsequenzen aufweisen, können entweder durch chemische Synthese hergestellt werden oder gentechnologisch in geeigneten Wirtssystemen exprimiert werden.
Die erfindungsgemäßen Proteine bzw. Peptide können mit Hilfe von gentechnologischen Methoden hergestellt werden, was den Vorteil hat, daß keine anderen von B . burgdorferi herstammenden Proteine mit den gewünschten Proteinen assoziiert sind. Alternativ können geeignete Peptide auch auf klassische chemische Art und Weise synthetisiert werden; derartige Peptide sind auch frei von immunologisch inaktiven Verunreinigungen. Es ist jedoch durchaus möglich, die erfindungsgemäßen Proteine bzw. Peptide zusammen mit anderen isolierten Proteinen von B . burgdorferi in Testkits oder bei Impfstoffen einzusetzen.
Der im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendete Begriff "immunologisch aktives Protein" umfaßt nicht nur ein Protein, das die vollständige Aminosäuresequenz des Proteins 1829-22A oder 1829-22B umfaßt, sondern auch Teile dieses Proteins, die wenigstens so lang sind, daß sie mindestens ein lineares Epitop umfassen. Im allgemeinen beträgt die Mindestlänge eines
erfindungsgemäßen Peptids, das eine Epitopeigenschaft aufweisen kann, wenigstens sechs, bevorzugt 10, besonders bevorzugt 25 und ganz besonders bevorzugt wenigstens 50 Aminosäuren.
Es muß berücksichtigt werden, daß bei den einzelnen Stämmen von Borrelia burgdorferi zumindest geringfügige Veränderungen in der Aminosäuresequenz des Proteins in Abhängigkeit von dem jeweiligen Stamm auftreten. Daher betrifft die vorliegende Erfindung auch solche immunologisch aktiven Proteine bzw. Peptide, die eine hohe Homologie zu den oben beschriebenen Aminosäuresequenzen aufweisen .
Die erfindungsgemäßen immunologisch aktiven Proteine bzw. Peptide weisen eine Homologie von wenigstens 60 %, bevorzugt wenigstens 80 % und besonders bevorzugt von wenigstens 90 % bezogen auf die erfindungsgemäßen Proteine 1829-22A und 1829-22B auf. Unter dem Begriff einer Homologie von 90 ° versteht man beispielsweise, daß in dem homologen Peptid neun von 10 Aminosäuren identiscn sind mit den entsprechenden Aminosäuren an der homologen Stelle in der Aminosauresequenz 1829-22A bzw. 1829-22B.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind solche Bereiche der erfindungsgemäßen Proteine bzw. Peptide besonders wichtig, die Epitope aufweisen, aiso solche Stellen im Protein, an die Antikörper spezifiscn binden. Die Bestimmung, an welchen Stellen Epitope zu erwarten sind, kann entweder durch an sich bekannte Computermethoden festgelegt werden oder es ist auch möglich, bestimmte kurze Peptide mit einer Lange von wenigstens 10, bevorzugt wenigstens 25 Aminosäuren zu synthetisieren. Diese Peptide werden dann mit Hilfe von positiven Seren getestet, und zwar, ob immunologische Reaktionen stattfinden oder nicht. Auf diese Art und Weise können lineare Epitope bestimmt werden. Bei der Herstellung dieser Proteine bzw. Peptide können entweder gentechnologische Verfahren verwendet werden, wobei die Peptide
beispielsweise als Fusionsproteine in Mikroorganismen exprimiert werden oder die Peptide können mit Hilfe der klassischen Synthese (Merrifield-Technik ) synthetisiert werden.
Die Bestimmung von immunologiεcn relevanten Epitopen ist nicht nur für die Diagnostik, sonαern insbesondere auch für die Herstellung von Impfstoffen wichtig. Für Impfstoffe können immunologisch sehr reaktive Eereiche aus den erfindungsgemäßen Proteinen kombiniert werden mit entsprechenden Bereichen aus anderen, bereits bekannten Proteinen von Borrelia burgdorferi, wie OspA, OspC oder mit Ammosauresequenzen aus dem Flagellin.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind auch Testkits zum Nachweis von Antikörpern gegen Borrelia-Stamme, die wenigstens ein erfindungsgemäßes immunologisch aktives Protein enthalten, das mit den in der Untersuchungsflüssigkeit vorhandenen Antikörpern reagieren kann und die wenigstens eine Anzeigekomponente aufweisen, die den Nachweis von Komplexen aus immunologisch aktivem Protein und Antikörper ermöglichen.
Bevorzugt sind Testkits, die wenigstens ein immunologisch aktives Protein mit einer Teilsequenz des Proteins 1829-22A und wenigstens ein Protein mit einer Teilsequenz des Proteins 1829- 22B aufweisen.
Bei der Anzeigekomponente kann es sich um einen gegen der nachzuweisenden Antikörper gerichteten Antikörper handeln, der eine Markierung aufweist. Bevorzugt handelt es sich hierbei urr, einen Antihuman-IgG- oder Antihuman-IgM-Antikörper . Bei der Markierung handelt es sich häufig um ein Enzym, das e ne Farbreaktion katalysieren kann.
Eine Möglichkeit des Nachweises besteht darin, daß das erfindungsgemäße immunologisch aktive Protein oder ein dagegen gerichteter onoklonaler Antikörper biotinyliert ist und, daß die Anzeigekomponente Avidin oder Streptavidin mit daran kovalent gebundenem Enzym, insbesondere Peroxidase ist.
In einer bevorzugten Aus führungs form der Erfindung handelt es sich bei dem Testkit um ein ELISA-Testki . Bei einer besonders bevorzugten Ausführungs form der vorliegenden Erfindung ist wenigstens ein erfindungsgemäßes immunologisch aktives Protein an Mikrotiterplatten gekoppelt und die Anzeigekomponente besteht aus Anti-Human-Immunoglobulin, insbesondere IgG- und/oder IgM- Antikörpern, an die ein eine Farbreaktion katalysierendes Enzym gekoppelt ist.
In einer weiteren bevorzugten Aus führungs form der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei dem Testkit um einen Immun-Blot, der auch als Protem-Blot oder Western-Blot bezeichnet wird. Bei derartigen Testkits wird Protein mit Hilfe eines Elektrophoresegels, beispielsweise eines Polyacrylamidgels auf eine immobilisierende Matrix (z.B. Mitrocellulose-Filter ) über-tragen. Die Übertragung kann beispielsweise durch Elektro-transfer erfolgen. Anschließend findet eine immunologische Reaktion zwischen den auf der Matrix befindlichen Proteinen und den gegen die Proteine gerichteten Antikörpern statt. Die Antikörper können dann durch geeignete Methoden nachgewiesen werden, z.B. durch enzymmarkierte Anti-Antikörper.
Unter dem Begriff "Testkits" wird ein Satz von Testreagenzien verstanden, der den Nachweis von bestimmten Antikörpern ermöglicht. Die erfindungsgemäßen Testkits weisen als erf indungsgemaße Komponente wenigstens ein er indungsgemäßes Protein bzw. Peptid auf. Das immunologisch aktive Protein bzw. Peptid wirkt als Antigen und reagiert mit den in der Untersuchungsflüssigkeit vorhandenen Antikörpern. Die erfindungsge aßen Testkits können auf verschiedenen, an sich
bekannten Prinzipien ceruhen. In der Regel findet eine Reaktion zwischen dem Antigen und Antikörpern statt und diese Reaktion bzw. der hierbei entstandene Komplex wird nachgewiesen. Es ist möglich, daß das Antigen an eine feste Phase, wie eine Mikrotiterplatte oder magnetische Kugelchen gebunden ist. Dieses Antigen kann dann mit der Untersuchungsflüssigkeit (Serum oder Liquor) m Kontakt gebracht werαen. Dabei binden die in der Untersuchungsflussigkeit voihanαenen Antikörper an das Antigen. Üblicherweise wird dann gewaschen und die gebundenen Antikörper werden nachgewiesen durch Anti-Antikorper, die eine Markierung tragen. Bei der MarKierung kann es sich um ein radioaktives Isotop handeln oder ein Enzym, das eine Farbreaktion katalysiert wie beispielsweise die Meerrettich-Peroxidase .
Es gibt jedoch eine Vielzahl von Testausgestaltungen, die dem Fachmann an sich bekannt sind. So kann beispielsweise auch der Anti-Antikorper an eine feste Phase gebunden sein und das Antigen kann eine nachweisbare Markierung aufweisen.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind insbesondere solche' Testkits bevorzugt, αie zur Durchfuhrung eines ELISA (Enzym- Lmked Immunosorbent Assay) oder zur Durchfuhrung eines sogenannten Western blcts geeignet sind.
Da die Verwendung von radioaktiv markierten Markierungssubstanzen mehr und mehr auf Widerstand stoßt, wird erfmdungsgemaß bevorzugt der Komplex bestehend aus Antigen/nachzuweisendeir Antikörper und Anti-Antikorper dadurch nachgewiesen, daß entweder Antigen oder Antι-Antικorper biotmyliert sind. Der Nachweis des Komplexes erfolgt dann durch Zugabe von Avidin, an das beispielsweise ein eine Farbreaktion katalysierendes Enzym gekoppelt ist.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist auch der sogenannte μ- Capture-Test besonders bevorzugt. Bei dem μ-Capture-Test wird an die Festphase ein Antikörper gegen humane IgM-Anti-körper
(μ-Ketten) gebunden. Diese Anti-Antikorper fangen aus dem Serumgemisch sowohl für das Antigen spezifische, wie auch unspeziflsche IgM-Antikorper heraus. Nach Zugabe von Antigen, welches direkt markiert sein kann, wird die IgM- Immunantwort nachgewiesen. Alternativ hierzu kann auch nicht-markiertes Antigen eingesetzt werden und das Antigen (erfindungsgemäßes immunologisch aktives Protein) wird durch einen weiteren markierten Antikörper gegen aas Antigen nachgewiesen. Bei der Markierung kann es sich beispielsweise um ein Enzym handeln, das eine Farbreaktion katalysiert.
Die erfmdungsgemaßen immunologisch aktiven Proteine bzw. Peptide können auch zur Herstellung von onoklonalen Antikörpern verwendet werden. Die Herstellung von monoklonalen Antikörpern erfolgt nach an sich bekannten Standardverfahren.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind weiterhin Impfstoffe, die wenigstens ein erf mdungsgemaßes Protein bzw. Peptid enthalten. Die erfmdungsgemaßen immunologisch aktiven Proteine von Borrelia burgdorferi können also zur Herstellung eines Impfstoffs zum Schutz gegen Infe tionen von Borrelia burgdorfeπ- Bakterien verwendet werden.
Für die Herstellung eines Impfstoffes ist es wesentlich, diejenigen Bereiche in immunologisch aktiven Proteinen festzustellen, die die Bildung von schutzenden Antikörpern hervorrufen. Wenn die immunologisch aktiven Proteine dem zu impfenden Organismus appliziert werden, müssen sich solche Antikörper bilden, die bei einer Infektion von Borrelia burgdorferi an die eingedrungenen Bakterien binden und, die die Abtotung der eingedrungenen Bakterien durch das körpereigene Immunsystem ermöglichen. Die er mdungsgemaßen Impfstoffe werden bevorzugt zur Impfung von Menschen, aber auch zur Impfung von Tieren verwendet. Eine Impfung ist vor allem sinnvoll für Tiere,
die durch Zecken gebissen werden können und dadurch von Borrelia burgdorferi infiziert werden können. Insbesondere ist eine Impfung sinnvoll bei Hunden σαer Pferden.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind auch Nukleinsäuren, die für die erfmdungsgemaßen immunologisch aktiven Proteine kodieren.
Bevorzugt handelt es sich hierbei um eine Nukleinsaure, die eine DNA-Sequenz aufweist, die für das Protein 1829-22A kodiert und die Sequenz (Seq.ID: 3)
ATGAAAAAGTTCAATTTAATAATTGAGGCGCTGTTTGCTATTCTATTAACAGCTTGTAATTTTGG ATTAATGGAAGAAACAAAAATAGCGCTTGAATCATCCTCTAAGGATGTAAAAAATAAAATTTTAC AAATAAAAAAAGACGCTGAGGACAAGGGTGTAAATTTTGCAGCTTTTACAAGCAGTGAAACCGGT TCTAAAGTGACAAATGGAGGATTAGCTTTAAGAGAAGCAAAAATACAAGCAATTAATGAAGTGGA AAAGTTTCTCAAGAGAATAGAAGAAGAGGCTTTAAAACTTAAAGAACATGGAAATAGTGGTCAAT TCTTGGAGCTGTTTGACTTACTGCTTGAAGTTTTAGAATCATTAGAACCGATTGGAATAAAAGGC: TTAAAAGACTTTATTTCAGAGGAAGCTAAATGTAACCCTATAAGCACATCTGAAAGATTAATTGA GGTTAAGGTGCAAATAGAAAATAAGATGGAAGAGGTTAAGAGAAAACAAAATCTTAATAAGGAGA GAAAAAGTAATAAAGGCAAAAAAAAGAAATAA
besitzt oder eine Teilsequenz davon, die wenigstens 18 Nukleotide umfaßt.
In einer anαeren Ausfuhrungsform handelt es sich um eine Nukleinsaure, die eine DNA-Sequenz aufweist, die für das Protein 1829-22B kodiert und die Sequenz (Seq.ID: 4)
ATGATTAAATATAATAAAATTATACTTACACTAACTTTACTTGCTAGCCTGTTAGCAGCATGTAG TTTAACAGGAAAAGCTAGATTGGAATCATCAGTTAAAGACATTACAAATGAAATAGAGAAAGCTA TAAAAGAAGCTGAAGACGCTGGTGTAAAGACAGACGCGTTCACAGAAACACAAACAGGTGGCAAG GTGGCAGGCCCTAAAATΛAGAGCAGCAAAAATACGCGTCGCTGACTTAACAATCAAATTCCTAGA AGCAACAGAAGAGGAAACTATTACATTTAAAGAAAATGGAGCGGGGGAAGATGAATTCTCAGGAA TATACGATTTAATACTCAACGCCGCAAAAGCAGTAGAAAAAATTGGGATGAAAGATATGACAAAA ACGGTCGAAGAGGCCGCTAAAGAAAATCCTAAAACTACAGCTA
- i l -
ATGGGATAATTGAGATTGTAAAAGTAATGAAAGCAAAAGTGGAAAACATTAAAGAAAAACAAACT AAAAATCAAAAATAA
besitzt oder eine Teilseσuenz davon, die wenigstens 18 Nukleotide umfaßt.
Erf mdungsgemaß sind auch Teilsequenzen der oben genannten Sequenzen bevorzugt, die wenigstens 30 und besonders bevorzugt 50 Nukleotide aufweisen.
Die erfmdungsgemaßen Nukleinsäuren, Nukle saurefragmente sowie damit hybridisierende Nuklemsaurefragmente mit einer Lange von mindestens 12 Nukleotiden können zum Nachweis einer Infektion von Borrelia burgdorferi mit Hilfe der Polymerase Kettenreaktion eingesetzt werden.
Bei den erf mdungsgemaßen Nukleinsäuren handelt es sich bevorzugt um DNA-Sequenzen. Die erf αungsgemaßen DNA-Sequenzen sind erforderlich, um die erf dungsgemaßen immunologisch aktive Proteine von Borrelia burgdorferi mit Hilfe von gentechnologischen Methoden herzustellen. Es ist aber auch besonders vorteilhaft, Teilsequenzen der erf mdungsgemaßen Sequenzen für diagnostische Vertanren einzusetzen, wobei das PCR- Verfahren eine weitgenende Veroreitung gefunden hat. Hierzu werden kurze Fragmente der erf mdungsgemaßen Nukleinsäuren synthetisiert, die mit den komplementären Sequenzen m der Untersuchungsprobe hybridisieren können. Durch die Polymerase Kettenreaktion (PCR werden dann geringste Mengen der gesuchten Nukleinsäuren amplifiziert und anschließend nachgewiesen.
Eine andere bevorzugte Verwendung der erf mdungsgemaßen Nukleinsäuren ist die DNA-Vaccinierung . Dabei werden die erfmdungsgemaßen Nukleinsäuren bzw. Teile davon in den zu immunisierenden Wirt eingebracht, wobei die Nukleinsaure entweder in nackter Form oder in Form von Plasmiden oder retroviralen
Vektoren vorliegen kann. Die DNA wird dann im Wirtsorganismus translatiert und durch die translatierten Genprodukte erfolgt eine Immunisierung im Wirt.
Die vorliegende Erfinαung wird durch die nachfolgenden Beispiele weiter erläutert.
Beispiel 1
Bestimmung von Partialsequenzen
Aus Lysaten von B. burgdorferi, Stamm Pko, wurde durch Extraktion mit n-Octyl ß-D-Thioglucopyranosid eine darin lösliche Proteinfraktion partiell aufgereinigt und weiter durch SDS- Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese aufgetrennt. Anschließend wurden aus dem niederen Molekulargewichtsbereich (<30kDa) Antigene durch Western Blotting auf eine Glasfibermatrix übertragen und die entsprechenden Stucke mit B. burgdorferi Antigenen ausgeschnitten (nach Eckerskorn et al . , 1988, Eur . J . Bioche . 176: 509 - 519, A new siliconized fiber as support for protein-chemical analysis ol electroblotteα protems.). Eines dieser so erhaltenen Proteine wurde naher untersucht. Eine direkte Ansequenzierung war nicht möglich, da der N-Termmus einer Sequenzierung nicht zuganglich war . Das Antigen wurde deshalb im Gel gespalten und anschließenc wurden die Peptide extrahiert.
Dazu wurαe das Antigen mittels SDS-PAGE aufgetrennt und das Gel anschließend mit Coomassie-Blau angefärbt. Nach Lokalisation der Proteinbanden wurde das Gel mit
10 % Essigsaure entfärbt. Die Proteinbande und eine entsprechende Referenzbande ohne Antigen, mit der gleichen Große, wurde ausgeschnitten, durch ein Sieb gedruckt und zerkleinert (Poren 30 μm x 100 μm) . Das zerquetschte Gel wurde mit konz . Inkubationspuffer 2 M gewaschen (12.5 M Tris , 0.5 M EDTA, pH 8,5), abzentrifugiert und der Puffer entfernt. Das so extrahierte Gel wurde lh in der Vakuum-Zentrifuge angetrocknet bis zu einem
Restwasser-Gehalt von etwa 5 h und einer gummiartigen Konsistenz. Endoprotease LysC wurαe in 400 μl 12,5 M Tπs/HCl, pH 8,5 gelöst (Enzym : Protein = 1:10) und 0.1 O Laurylmaltosit zugefügt. Je 200 μl wurden zu Proße und Referenz gegeben und über Nacht bei 37°C im Heiznlockschuttler inkubiert. Danach wurden die Peptide mittels reversed phase Chromatographie auf einer HPLC-Anlage aufgetrennt, und die Sequenz ausgesuchter Peptide analysiert. Der N-terminale Abbau der Aminosäuren und damit die Sequenzbestimmung erfolgte in einem automatischen Sequenzer Porton 3600 (Beckmann Instruments) nach Edman & Begg (1967, Eur . J . Biochem. 1, 80-91). Hierbei wurden folgende Peptide nach Sequenzierung erhalten:
AA1829-22B PH: T-D-A-F-T-E-T-Q-T-G-G-K (Seq.ID: 5)
AA1829-22B P13: D-I-T-N-E-I-E-K (Seq.ID: 6)
AA1829-22B P23: F-L-E-A-T-E-E-E-T-I-T-F-K (Seq.ID: 7)
Beispiel 2
Bereitstellung der Sonden
Aus den gemäß Beispiel 1 gewonnenen Aminosäure-Abfolgen wurden die nachfolgend aufgeführten Oligodesoxynukleotid-Sequenzen abgeleitet. Da meist mehrere Codon-Moglichkeiten für eine Aminosäure bestehen, nußten an den entsprechenden Stellen des Oligonukleotids auch Ξasenvariationen berücksichtigt werden und während der Synthese m äquimolaren Verhaltnissen eingebaut werden. Zur Vermeidung von zu großen Basenvariationen wurde die Häufigkeit der Kcdons von bereits bekannten und molekularbiologisch charakterisierten Gensequenzen, wie z.B. OspA, OspC und plOO analysiert und zur Darstellung der abgeleiteten Oligonukleotidsequenzen verwendet.
AA1829-22B - Oliσodesoxynukleotid-Sequenzen
Die in Klammern angegeoenen und durch ' ; " getrennten Basen wurden während der Synthese (auf Pharmacia DNA Synthesizer) in aquimolaren Verhältnissen eingebaut:
Primer 1829-22B pH Oligodesoxynukleotid-Sequenz :
AC(A;T) GAT GC(T;A) TTT AC(T;A) GA(A;G) AC(A;T) CAA AC(A;T) GG(T;A) GG(T;A) AA (Seq.ID: 8)
Primer 1829-22B pl3 Oligodesoxynukleotid-Sequenz :
GAT AT(A;T) AC(A;T) AA(C;T) GA(G;A) AT(A;T) GA(G;A) AA
(Seq.ID: 9)
Primer 1829-22B p23 Oligodesoxynukleotid-Sequenz:
TTT TT(A;G) GA(G;A) GC(T;A) AC(A;T) GA(G;A) GA(G;A) GA(G;A) AC(A;T) AT(A;T) AC(A;T) TTT (Seq.ID: 10)
Beispiel 3
Auffinden des kodierenden Genfragmentes
Die Oligσnukleotid-Sequenzen wurden als Sonden verwendet und m Southern Blot nach Markierung mit Digoxigenm eingesetzt (nach The DIG System User ' s Guide for Filter Hybridization, Boehringer Mannheim GmbH) . Dazu wurde chromosomale DNA vom Borrelia burgdorferi Stamm Pko nach üblicher Methode (siehe Maniatis: Molecular Cloning, A laboratory Manual) isoliert, mit verschiedenen Restriktionsendonukleasen enzvmatisch ge-spalten und in 1 % Agarose-Gel aufgetrennt. Die DNA aus den Agarose-Gelen wurde nach vorheriger Denaturierung auf Nyionmembranen übertragen (Southern Blotting: nach The DIG System User's Guide for Filter Hybridization, Boehringer Mannheim GmbH) . Die Hybridisierung
wurde nach Standardbeαmgungen (s.o. Boehringer Mannheim GmbH) durchgeführt. Gebundene Oligodesoxynukleotide wurden mittels anti-Digoxigenin Antikörpern, an die alkalische Phosphatase gekoppelt sind, immunologisch nachgewiesen. Entsprechende hybridisierende Banden wurden nach Anfarbung identifiziert. Solche identifizierte Banden wurden nach praparativer Agarose- Gelelektrophorese aus dem Gel eluiert, durch EtOH gefällt, in geeignetem Puffer aufgenommen und mit E.coli Plasmiden ligiert, die mit entsprechenden Restriktionsendonukleasen enzymatisch gespaltenen wurden. Die so ligierte DNA wurde in kompetente E. coli Zellen eingeschleust und transformierte E. coli Zellen wurden erhalten. Die positiven E. coli Zellen wurden von den negativen Zellen nach Plasmid Screen g und Restπktionsendonuklease Spaltung der erhaltenen DNA und anschließend erneuter Hybridisierung mit den Digoxigenm (Boehringer Mannheim) markierten Primern (siehe oben) getrennt. Geeignete Klone wurden durch Hybridisierung aufgefunden. Unter Verwendung von Restrikionsendonuklease mit bevorzugter Erkennung von Hexamer Sequenzen wurde eine Restriktionskarte eines Hmdlll- Hindlll DNA-Inserts erstellt. Darauf erfolgte eine Subklonierung verschiedener DNA Fragmente und daran anschließende Sequenzierung durch automatische Sequenzierung nach Fluoreszenzlabell g (Applied Biosystems, ABI-Pris 377, Weiterstadt).
Nach Analyse der so erhaltenen Sequenz mit einem Computerprσgramm zur DNA Analyse (DNASTAR, Lasergene London) wurden mehrere offene Leserahmen identifiziert. Wovon 2 Leserahmen typische Signalsequenzen, wie Start des Leserahmens mit Methionm oder Ribosomenbindungstelle in entsprechendem Abstand vor dem Leserahmen aufwiesen. Ein Leserahmen wies deutliche Sequenzuberemstimmung mit den ursprünglich erhaltenen Peptidsequnzen und den davon abgeleiteten Primern auf. Dieser Leserahmen weist die in Figur 1 dargestellte Sequenz auf. Die davon abgeleitete Aminosauresequenz ist in Figur 2 dargestellt.
Das Protein 1829-22B weist eine Länge von 170 Aminosäuren auf. Die entsprechenden Peptid Sequenzen, die bei der primären Charakterisierung gefunden wurden, sind m Figur 2 unterstrichen.
Überraschenderweise wurαe auf dem wie oben beschriebenen DNA- Fragment ein weiteres Gen gefunden. Der Leserahmen wurde mit 1829-22A bezeichnet. Die DNA-Sequenz ist in Figur 3 dargestellt.
Das davon abgeleitete Protein 1829-22A weist bei einer Länge von 183 Aminosäuren die in Figur 4 dargestellte Sequenz auf.
Beispiel 4
Herstellung von Expressionsklonen für das Antigen 1829-22B
Ausgehend von dem kompletten Leserahmen für das Gen 1829-223 wurden Expressionsklone hergestellt. Dabei wurden sowohl der gesamte Leseranmen als auch ein verkürztes Fragment dargestellt. Nachfolgende Oligonukleotid-Primer wurden zur Darstellung der Sequenzen verwendet.
Primer 1:
5 ' GAG GGA TCC ATC ATG ATT AAA TAT AAT AAA ATT ATA C 3 '
{Seq.ID: 11)
Primer 2 :
5 ' GAG GGA TCC ATC ATG AAA AGT TTA ACA GGA AAA GCT AG 3 '
(Seq.ID: 12)
Primer 3:
5 ' GGA CTG CAG GTC GAC TTA TTT TTG ATT TTT A GT TTG 3 '
(Seq.ID: 13)
Dabei wurden die Primer-Kombinationen Primer 1 und Primer 3 bzw Primer 2 und Primer 3 zur Darstellung der vollständigen Sequenz bzw. zur verkürzten Sequenz eingesetzt. Als Template DNA wurde
gereinigte DNA von einem das gesamte Insert (1829-22B, 1829-22A und flankierende Sequenzen, Hindlll-Hindlll-Fragment ) enthaltenden Klon verwendet. Die Polymerasekettenreaktion (PCR) wurde nach Herstellervorschrif mit dem PCR-Core Kit (Boehringer Mannheim) durchgeführt. Die Reaktion wurde in einem Thermocycler mit folgendem Programm αurchgeführt :
Programm:
A. Denaturierungszeit 94°C 4min.
B. 35 Zyklen
"Zyklus: 1.94°C 1min. 2.42°C 1mm. 3.72°C 1,5min."
C. Elongation: 72°C 5min.
Durch die Verwendung von Erkennungssequenzen für Restriktionsendonuklease mnnerhalb der Primer Sequenzen konnten so die Amplifikate enzymatisch gespalten werden und in E. coli Plasmid, z.B. pUC8, ebenfalls mit denselben Restriktionsendonukleasen gespalten, ligiert werden. Nach Transformation unα Analyse der Klone sowohl durch Agarose- Gelelektrophorese enzymatisch gespaltener DNA, aber auch durch SDS-Polacrylamid-Gelelektrophorese und Coomassie-Blau-Färbung bzw. anschließendem Transfer auf Nitrocellulose und immunologischer Detektion, wurden positive Klone identifiziert. Dabei stellte sich heraus, daß das verkürzte Fragment deutlich besser darzustellen war und damit auch eine bessere Reaktivität im Westernblot zu erreichen war.
Beispiel 5
Reinigung von rekombmanten Borrelia burgdorferi Antigen 1829-22B aus E.coli
Ein Klon, der das Antigen 1829-22B enthalt, ( pMS1829-22B) wird in 100 ml L-Broth (mit 50 μl Ampicillin/ml ) angeimpft, über Nacht wachsen gelassen und dann in 900 ml L-Broth/Ampicillm - doppelt konzentrierter Hefeextrakt/ 2 ml Glycerm - überfuhrt, nach ca. lh mit 2 mM IPTG induziert und 2- 3h weiter geschüttelt.
Nach Abzentrifugieren bei 8000 Upm für 10 Mm. wird das Pellet in 20 ml Lyse Puffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 2 mM EDTA, 0,2 mM DTE, 0,1 mM PMSF; 0,4 mg/ml Lysozy ) resuspendiert. Nach 30 Mm. Ruhren bei Raumtemperatur erfolgt Zugabe von Triton-X 100 (Endkonzentration 0,1 - 0,2 %). Zusätzlich werden 10 μl Benzonase (Merck) zugegeben. Es wird weitere 30 Mm bei Raumtemperatur gerührt. Die jetzt klare Suspension wird mit festen NaCl auf 1 M NaCl eingestellt und weitere 30 Minuten bei 4°C gerührt.
Nach Zentrifugation bei 4°C, 30 Minuten, 15 000 Upm befindet sich das Antigen 1829-22B quantitativ im Überstand. Das Pellet wird verworfen. Der Überstand wird gegen 10 mM Tris-HCl, pH 7,0 und 2 mM EDTA bei mehrmaligen Pufferwechsel dialysiert. Nach Zentrifugation unα/oder Filtration wird auf DEAE Sepharose (Pharmacia) aufgetragen, wobei die Säule mit 50 mM Tris-HCl und ' mM EDTA, pH 7,0 equilibriert wird. Bei Elution mit 0 M NaC L befindet sich das Antigen im Durchlauf. Die ersten Fraktionen können verworfen werden, der Rest wird gesammelt und im Dialyseschlauch gegen 50 mM MES (2-[N- Morpholmo Jethansulfonsaure ) Puffer, pH 6,0 dialysiert. Nach Zentrifugation und Filtration wird das Antigen auf S-Sepahrose fast flow (Pharmacia) Säule aufgetragen. Zuerst wird mit 0 m NaC L gewaschen, dann mit einem Gradienten von 0 - 1 M NaCl eluiert Das Antigen 1829-22B eluiert als scharfer Peak bei etwa
0,2 M NaCl. Nach Dialyse gegen 10 mM Tris-HCl pH 7,5, kann das Antigen in einem geeigneten Testkit, bspw. einem ELISA oder Westernblot verwendet werden.
Beispiel 6
Verwendung von rekombinant produziertem B. burgdorferi Antigen 1829-22B im Westernblot
Gereinigtes Antigen 1829-22B wird dazu in der SDS- Polyacrylamidgelelektrophorese aufgetrennt und auf Nitrozellulose transferiert. Dazu werden SDS-Polyacrylamidgele wie folgt hergestellt. Die SDS-Gele bestehen aus einem Sammelgel und einem Trenngel (nach Laemmli, U.K. 1970, Cleavage of structural proteins duπng assemDly of the head of bacteπphage T4 , Nature 227, 680-685). Die Zusammensetzung der Trenngele ist folgendermaßen: 15 % Acrylamid (Bio-Rad), 0,026 \ Diallyltarta iα (DATD, Bio-Rad) pro Prozent Acrylamid, 0,15 ^ SDS, 375 mM Tris-HCl pH 8,5, 0,14 mM Ammoniumperoxiddisulphat (AMPER, Bio-Rad) und 0,035 % N, N, N', N'-Tetramethylethylendiamin (TEMED, Bio-Rad). Amper und TEMED dienten dabei als Radikaistarter für die Polymerisation. 2-4 Stunden nach Polymerisation wurde das Sammelgel (3,1 % Acrylamid, 0,08 % DATD, 0,1 % SDS, 125 mM Tris-HCl pH 7,0, 3 mM Amper und 0,05 % TEMED) über das Trenngel gegossen. Die Anoden- und Kathoαenkammer wurde mit identischer Pufferlosung gefüllt: 25 mM Tπs-Base, 192 mM Glycin und 0,1 % SDS, pH 8,5. Die Antigen enthaltende Probe wurde mit gleichem Teil Probenauftragspuffer (3 % Sacharose, 2 % SDS, 5 % Mercaptoethanol 20 mM Tris-HCl pH 7,0, Bromphenolblau) versetzt, für genau 5 Minuten bei 100°C erhitzt und auf das Sammelgel aufgetragen. Die Elektrophorese wurde bei Raumtemperatur über Nacnt mit konstanter Stromstarke von 6 mA für Gele der Große 20x15 cm durchgeführt. Anschließend wurden die Antigene auf Nitrozellulose (Schleicher und Schuell, Dassel) transferiert .
Für den Proteintransfer befand sich das Gel mit der anliegenden Nitrozellulose zwischen Whatmann 3 MM Filterpapier, leitfähigem, 1 cm dicken Schaumstoff unα zwei Kohleplatten, die über Platinelektroden den Strom leiteten. Filterpapier, Schaumstoff und Nitrozellulose wurden gut mit Blot-Puffer (192 mM Glycin, 25 mM Tris-Base, 20 % Methanol, pH 8,5) getränkt. Der Transfer fand bei 2 mA/cm2 für 2h statt. Freie Bindungstellen auf der Nitrozellulose wurden f r 1h bei 37°C mit Cohen-Puffer (1 mg/ml Ficoll 400, 1 mg/ml Polyvmylpyrrolidon, 16 mg/ml Rinderserumalbumin, 0,1 % NP40, 0,05 % Bacto-Gelat e n Natriumboratpuffer pH 8,2); (nach Cohen et al.: Localisation and Synthesis of an antigenic determinant of Herpes Simplex virus glycoprote D that stimulates the production of neutralizing antibodies . J.Virol. 49, 1984, 4183-4187) abgesattigt. Die Blotstreifen wurden ber Nacht bei Raumtemperatur mit Patientenseren (Verdünnung 1:100 in 154 mM NaCl und 10 mM Tris- HCl pH 7,5) inkubiert.
Nach der Seruminkubation wurde der Blot mit TTBS (50 mM Tris-HC. pH 7,5, 500 mM NaCl, 0,01 % Tween 20) viermal für je 15 Minuten gewaschen. Anschließend wurden die Blotstreifen mi Peroxidase-gekoppelten anti-human-IgG Immunglobulin (DAKO, Verdünnung 1:1000 in 154 mM NaCl und 10 mM Tris-HCl, pH 7,5) bzw anti-human-IgM Immunglobulin (DAKO, Verdünnung 1:500 in 154 mM NaCl und 10 M Tris-HCl, pH 7,5) für 2h bei Raumtemperatur inkubiert. Nach mehrmaligem Waschen mit TTBS wurden die Blotstreifen mit 10 mg /50 ml Diammobenzidm und 0,01 l Wasserstoffperoxid in 50 mM Tris-HCl pH 7,5 gefärbt. Die Färbung wurde mit IN Schwefelsaure gestoppt, der Blot mit Wasser säurefrei gewaschen und zwischen Filterpapier getrocknet.
Die Ergebnisse mit charakterisierten Seren sind in der Tabelle 1 zusammengefaßt:
Seren IgG-reaktiv IgM reaktiv
Blutspender n=94 0/94 nicht bestimmt
Blutspender n=20 0/20 0/20
Ly e Borreliose Patienten (Stadium 2/3) bzw. IgG-Seroloqie positiv n=24 24/24 nicht bestimmt
Lyme Borreliose Patienten (Stadium 1) bzw. IgM-Serologie positiv n=10 nicht bestimmt 1/10
Tabelle 1
Beispiel 7
Nachweis der diagnostischen Bedeutung des rekombinanten Antigens 1829-22B
Für den ELIΞA wurden reκombinante Borrelia burgdorferi Antigene, wie plOO, OspC oder p41/internes Fragment, ohne oder in
Kombination mit gereinigtem pl829-22B-Antιgen auf
Polystyrolplatten in Carbonat-Puf fer , pH 10,6 über Nacht bei 4°C beschichtet. Die Mikrotiterplatten wurden mit BSA-Lösung abgesättigt. Die Seruminkubation erfolgte in PBS,
1 % Rinderserumalbumin, pH 7,0 (Verdünnungspuffer) für eine
Stunde bei 37°C in der Verdünnung H100. Nach viermaligem Waschen mit PBS, 0,05 % Tween 20, pH 7,0 (Waschpuffer) wurde antihuman
IgG Peroxidase-Kon ugat in Verdünnungspuffer für 30 Min bei 37°C zugegeben. Nach erneutem viermaligen Waschen mit Waschpuffer wurde Substrat TMB zugegeben und für 30 Min im Dunklen bei
Raumtemperatur inkubiert. Die Reaktion wird mit Schwefelsäure gestoppt und die Immunfärbung bei 450 nm im Photometer vermessen.
Cutoff wurde durch Vermessen von definierten positiven Seren und negativen Seren eingestellt.
Die bei dem Versuch erhaltenen Ergebnisse werden in der nachfolgenden Tabelle 2 zusammengefaßt. Die Ergebnisse zeigen, daß durch Verwendung des erfindungsgemäßen Antigens pl829-22B eindeutigere Ergebnisse erhalten werden konnten. Besonders hervorzuheben ist, daß beim EIA (Enzyme Immuno Assay) ohne pl829- 22B mehrere Seren als negativ klassifiziert wurden, die sich im Bestätigungεtest mit Hilfe des Immunoblots als positiv herausstellten .
EIA πut p!829-22B
positiv fraglich negativ n
Bestätigungstest positiv 55 (Immunoblot) fraglich 3 negativ 30
64 22 88
EIA ohne p!829-22B
positiv fraglich negativ n
Bestätigungstest positiv 55 (Immunoblot) fraglich 3 negativ 30
n 50 32 88
Tabelle 2
Claims
1. Immunologisch aktives Protein von Borrelia burgdorferi, das in einer von anderen aus Borrelia burgdorferi stammenden Proteinen freien Form vorliegt, dadurch gekennzeichnet, daß es die Sequenz des Proteins 1829-22A mit der Aminosäuresequenz
MKKFNLIIEALFAILLTACNFGLMEETKIALESSSKDVKNKILQIKKDAEDKGVNFAAFTSSETG SKVTNGGLALREAKIQAINEVEKFLKRIEEEALKLKEHGNSGQFLELFDLLLEVLESLEPIGIKG LKDFISEEAKCNPISTSERLIEVKVQIENKMEEVKRKQNLNKERKSNKGKKKK
oder eine Teilsequenz davon mit wenigstens 10 aufeinanderfolgenden Aminosäuren
oder die Sequenz des Proteins 1829-22B mit der Aminosäuresequenz
MIKYNKIILTLTLLASLLAACSLTGKARLESSVKDITNEIEKAIKEAEDAGVKTDAFTETQTGGK VAGPKIRAAKIRVADLTIKFLEATEEETITFKENGAGEDEFSGIYDLILNAAKAVEKIGMKDMTK TVEEAAKENPKTTANGIIEIVKVMKAKVENIKEKQTKNQK
oder eine Teilsequenz davon mit wenigstens 10 aufeinanderfolgenden Aminosäuren aufweist.
2. Immunologisch aktives Protem nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Teilseαuenz des Protems 1829-22A oder des Proteins 1829-22B wenigstens 25 aufeinanderfolgende Aminosäuren aufweist.
3. Immunologisch aktives Protein nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Teilsequenz des Proteins 1829-22A oder des Proteins 1829-22B wenigstens 50 aufeinanderfolgende Aminosäuren aufweist.
4. Testkit zum Nachweis von Antikörpern gegen Borrelia-Stämme, dadurch gekennzeichnet, daß es wenigstens ein immunologisch aktives Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 3 enthält, das mit den in der Untersuchungsflüssigkeit vorhandenen Antikörpern reagieren kann und, daß es wenigstens eine Anzeigekomponente aufweist, die den Nachweis von Komplexen aus immunologisch aktivem Protein und Antikörper ermöglicht.
5. Testkit nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß es wenigstens ein immunologisch aktives Protein mit wenigstens einer Teilsequenz des Proteins 1829-22A und wenigstens ein Protein mit wenigstens einer Teilsequenz des Proteins 1829-22B aufweist.
6. Testkit nach einem der Ansprüche 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Anzeigekomponente ein gegen den nachzuweisenden Antikörper gerichteter Antikörper ist, der eine Markierung aufweist.
7. Testkit nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Anzeigekomponente ein Antihuman- IgG- oder Antihuman- IgM- Antikörper ist.
8. Testkit nach einem der Ansprüche 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Markierung aus einem Enzym besteht, das eine Farbreaktion katalysieren kann.
9. Testkit nach einem der Ansprüche 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß das immunologisch aktive Protein oder ein dagegen gerichteter monoklonaler Antikörper biotinyliert ist und, daß die Anzeigekomponente Avidin oder Streptavidin mit daran kovalent gebundenem Enzym, insbesondere Peroxidase ist.
10. Testkit nach einem der Ansprüche 4 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß es ein ELIΞA-Testkit ist.
11. Testkit nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens ein immunologisch aktives Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 3 an Mikrotiterplatten gekoppelt ist und die Anzeigekomponente aus Anti-Human- Immunoglobulin, insbesondere IgG- und/oder IgM-Antikorpern besteht, an die ein eine Farbreaktion katalysierendes Enzym gekoppelt ist.
12. Testkit nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Western-Blot ist.
13. Impfstoff, dadurch gekennzeichnet, daß er wenigstens ein Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 3 enthält.
14. Verwendung eines immunologisch aktiven Proteins von Borrelia burgdorferi nach einem der Ansprüche 1 bis 3 zur Herstellung eines Impfstoffs zum Schutz gegen Infektionen von Borrelia burgdorfeπ-Bakterien .
15. Nukleinsaure, dadurch gekennzeichnet, daß sie für ein immunologisch aktives Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 3 kodiert.
16. Nukleinsaure nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß sie die DNA-Sequenz koαierend für das Protein 1829-22A mit der Sequenz
ATGAAAAAGTTCAATTTAATAATTGAGGCGCTGTTTGCTATTCTATTAACAGCTTGTAATTTTGG ATTAATGGAAGAAACAAAAATAGCGCTTGAATCATCCTCTAAGGATGTAAAAAATAAAATTTTAC AAATAAAAAAAGACGCTGAGGACAAGGGTGTAAATTTTGCAGCTTTTACAAGCAGTGAAACCGGT TCTAAAGTGACAAATGGAGGATTAGCTTTAAGAGAAGCAAAAATACAAGCAATTAATGAAGTGGA AAAGTTTCTCAAGAGAATAGAAGAAGAGGCTTTAAAACTTAAAGAACATGGAAATAGTGGTCAAT TCTTGGAGCTGTTTGACTTACTGCTTGAAGTTTTAGAATCATTAGAACCGATTGGAATAAAAGGC TTAAAAGACTTTATTTCAGAGGAAGCTAAATGTAACCCTATAAGCACATCTGAAAGATTAATTGA GGTTAAGGTGCAAATAGAAAATAAGATGGAAGAGGTTAAGAGAAAACAAAATCTTAATAAGGAGA GAAAAAGTAATAAAGGCAAAAAAAAGAAATAA oder eine Teilsequenz davon, die wenigstens 18 Nukleotide umfaßt, aufweist .
17. Nukleinsaure nacn Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine DNA-Sequenz kodierend für das Protein 1829-22B mit der Sequenz
ATGATTAAATATAATAAAATTATACTTACACTAACTTTACTTGCTAGCCTGTTAGCAGCATGTAG TTTAACAGGAAAAGCTAGATTGGAATCATCAGTTAAAGACATTACAAATGAAATAGAGAAAGCTA TAAAAGAAGCTGAAGACGCTGGTGTAAAGACAGACGCGTTCACAGAAACACAAACAGGTGGCAAG GTGGCAGGCCCTAAAATAAGAGCAGCAAAAATACGCGTCGCTGACTTAACAATCAAATTCCTAGA AGCAACAGAAGAGGAAACTATTACATTTAAAGAAAATGGAGCGGGGGAAGATGAATTCTCAGGAA TATACGATTTAATACTCAACGCCGCAAAAGCAGTAGAAAAAATTGGGATGAAAGATATGACAAAA ACGGTCGAAGAGGCCGCTAAAGAAAATCCTAAAACTACAGCTAATGGGATAATTGAGAT GTAAA AGTAATGAAAGCAAAAGTGGAAAACATTAAAGAAAAACAAACTAAAAATCAAAAATAA
oder eine Teilsequenz davon, die wenigstens 18 Nukleotide umfaßt, aufweist .
18. Nukleinsaure nach Anspruch 16 oder 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Teilsequenz wenigstens 30 Nukleotide umfaßt.
19. Verwendung einer Nukleinsaure nach einem der Ansprüche 15 bis 18 oder ein damit hybridisierendes Nukleinsäurefragment mit einer Länge von mindestens 18 Nukleotiden zum Nachweis einer Infektion von Borrelia burgdorferi mit Hilfe der Polymerase- Kettenreaktion.
20. Verwendung einer Nukleinsaure nach einem der Ansprüche 15 bis 18 zur DNA-Vaccinierung .
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