WO1997049829A1 - Procede biologique servant a preparer des steroides 25-hydroxyles - Google Patents

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WO1997049829A1
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cyclodextrin
steroids
steroid
sphingomonas
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PCT/JP1997/001909
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Inventor
Koji Takeda
Tadashi Terasawa
Kazuyuki Dobashi
Takeo Yoshioka
Original Assignee
Mercian Corporation
Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P33/00—Preparation of steroids
    • C12P33/06—Hydroxylating

Definitions

  • the present invention relates to a method for biologically hydroxylating the 25-position of steroids other than cholesterol.
  • the present invention, c present invention aims to provide a method of hydroxylating the 2 5-position of steroids other than cholesterol using microorganisms other than stress but-Kluyveromyces biologically are many microorganisms Among them, they have been made based on the finding that microorganisms belonging to the genus Amycolata or Sphingomonas ⁇ have the ability to hydroxylate the 25-position of steroids.
  • the present invention relates to the use of steroids (but not cholesterol) in microbial cells or cultures belonging to Amycolataata or Sphingomonas ⁇ which have the ability to hydroxylate the 25-position of steroids.
  • steroids but not cholesterol
  • Biological production of hydroxides at the 25-position of steroids characterized in that a hydrogen atom bonded to the carbon at the 25-position of the steroid is converted into a hydroxyl group by adding Provide a method.
  • the steroids targeted in the present invention include steroids other than cholesterol, and other carbon atoms may be any element as long as the carbon atom at position 25 is bonded to a hydrogen atom.
  • the carbon atom at position 22 may be an oxygen atom, a zeolite atom, a nitrogen atom, or the like.
  • a substituent at a position other than the 25-position a lower alkyl group, a cyclic hydrocarbon group, a heterocyclic group such as triazoline, or an optionally protected hydroxyl group, amino group, lower hydroquinyl alkyl group, lower hydroquinoxy alkoxy group, etc.
  • the steroid skeleton may have one or more unsaturated bonds, and may further have an epoxy ring in which the unsaturated bonds are oxidized.
  • the target steroid is preferably a compound represented by the following general formula (I).
  • R represents a hydrogen atom or a hydroxyl group which may be protected
  • R 2 represents a hydrogen atom or a hydroxy lower alkoxy group which may have a protected hydroxyl group
  • R 2 represent R 3 represents a hydrogen atom or a protecting group
  • R 4 , R s , R e, and R 7 each represent a hydrogen atom or R 4 and A force where one or both of R 5 , Re and R 7 form a double bond, a force which forms a double bond with R 5 and R e , and which can protect a conjugated double bond with R 7
  • X represents CH 2 or an oxygen atom.
  • X is CH 2
  • R , R 2 , Re and R 7 are hydrogen atoms and R 4 and Rs form a double bond is excluded.
  • Examples of the protective group in the formula include, for example, an acetyl group, a bivaloyl group, a methoxycarbonyl group, a benzyloxycarbonyl group, a p-toluenesulfonyl group, and other substituted groups such as an acyl group, a methyl group, and a methoxymethyl group.
  • Examples thereof include substituted silyl groups such as a good alkyl group, a trimethylnil group, a triethylsilyl group, and a t-butyldimethylsilyl group, and a trimethylsilyl group, a triethylsilyl group, and a t-butyldimethylsilyl group.
  • 4-phenyl-1,2,4-triazoline-13,5-dione, getyl maleate and the like are used.
  • steroids specifically, 1 ⁇ , 3 dihydroxy 5,7-cholesyl gen, 2 S— (3-hydroquinpropyloquine) -1a, 3) S— Dihydroxy-5,7-cholesone gen, 5,8 ⁇ - (3,5-dioxo-1-41,2,1,2,4-triazolidino) -1,6-cholesone gen-13S-ol , 3S-hydroxy-1,5, Arcoles striene, 1 ⁇ , 2 ⁇ -epoxy-1 5 ⁇ , 8 ⁇ - (3,5-dioxtwo 4-1,2,1,2,4-triabridino) 1 6-cholesten 1 3) 3-ol, 1 ⁇ , 2 ⁇ -epoxy-1 3; 3-hydroxy-1 5, arcoles, 20 (S) — (3-methylbutyl 5,7-Gen-1- ⁇ , 38-diol, 20 (S)-(3-methylbutyroxy) -Bregner 5-en-1 ⁇ , 3 / 3-diol,
  • the hydroxyl group in the steroid can be hydroxylated at position 25 irrespective of the number of hydroxyl groups, and the hydroxyl position can be directly hydroxylated at position 25 irrespective of the position or number of double bonds.
  • the microorganisms belonging to the genus Amycolata having the ability to hydroxylate the 25-position of the steroids used in the present invention include Amycolata saturnea A-124, strain Amycolata, and Amycolata. One night. Amycolata saturnea FERM BP-2307, Amycolata autotrophica ATCC 337 966, etc. Any strain having the ability to hydroxylate can be used.
  • Microorganisms belonging to the genus Sphingomonas include Sphingomonas parapaucimobilis IFO 15100, which is a strain having the ability to hydroxylate steroids at position 25. If so, deviations can be used.
  • Amycolata saturnea (Amycolata saturnea) A-12466 strain was isolated from the soil by the present inventors and has the following mycological properties.
  • the growth state on the medium is medium, and the color of the back of the colony is light brown.
  • the formation of aerial mycelium is moderate and creamy. No soluble pigment is produced.
  • the state of growth on the medium is somewhat poor, and the color of the back of the colony is cream. Aerial hypha formation is moderate and white. No soluble pigment is produced.
  • the state of growth on the medium is good, and the color of the back of the colony is pale yellow.
  • the formation of aerial mycelium is good and it is white. No soluble pigment is produced.
  • the growth state on the medium is moderate, and the color of the back of the colony is cream.
  • the formation of aerial mycelium is good and it is white. No soluble pigment is produced.
  • the growth on the medium is moderate, and the color tone of the back of the colony is red.
  • the formation of aerial mycelium is good and it shows a cream color. Produces a light reddish brown soluble pigment.
  • the state of growth on the medium is good, and the color of the back of the colony is pale yellow.
  • the formation of aerial mycelium is good and it is white. No soluble pigment is produced.
  • the growth state on the medium is moderate, and the color of the back of the colony is cream.
  • the formation of aerial mycelium is rather poor, giving a white appearance. No soluble pigment is produced.
  • the growth state on the medium is medium, and the color of the back of the colony is light brown.
  • the formation of aerial mycelium is moderate and creamy. No soluble pigment is produced.
  • this strain belongs to actinomycetes, and it is clear that the strain belongs to the International 'Journal of Systematic' Vol. 36, p 29 As compared with the characteristics of known microorganisms reported in J. A.-37 (1 986), this strain was almost identical to Amycolata saturnea. Based on the above results, this strain was determined to belong to Amicola saturnea (Amvola saturnea) and named as Amicola saturnea (yq ⁇ ata saturnea) A-1246 strain. This strain is located at 1-3-1 Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japan Deposited at the Biotechnology Industrial Technology Research Institute (March 7, 1995, FE RM BP — 5.54 4).
  • the method of the present invention for biologically hydroxylating the 25-position of steroids other than cholesterol is a method for preparing a substrate in a solution containing a microorganism belonging to the genus Amycolata or Sphingomonas. It hydroxylates steroids other than cholesterol under aerobic conditions.
  • the microbial cells required for the reaction are produced by inoculating the above strain into a nutrient source-containing medium and aerobically culturing.
  • the method for culturing the above microorganisms is basically the same as the method for culturing general microorganisms, but it is usually preferable to carry out the culture under aerobic conditions such as shaking culture by liquid culture or aeration and stirring culture.
  • the medium used for the culture may be any medium containing a nutrient source that can be used by a microorganism belonging to the genus Amycola or Sphingomonas, and may be any of various synthetic, semi-synthetic media, and natural media. Both are available.
  • a medium composition glucose, maltose, xylose, fructose, sucrose and the like as a carbon source can be used alone or in combination.
  • organic nitrogen sources such as peptone, meat extract, soy flour, casein, amino acids, yeast extract, and urea
  • inorganic nitrogen sources such as sodium nitrate and ammonium sulfate can be used alone or in combination. it can.
  • salts such as sodium chloride, potassium chloride, calcium carbonate, magnesium sulfate, sodium phosphate, lithium phosphate, cobalt chloride, etc., heavy metal salts, and vitamins can be added as necessary. If foaming during culturing is remarkable, various known antifoaming agents can be appropriately added to the medium.
  • Culture conditions can be appropriately selected within a range where the strain can grow well. Usually, the cells are cultured at pH 6 to 7.5 and 28 to 30 ° C for about 2 to 8 days.
  • the above-mentioned various culture conditions can be appropriately changed according to the type and characteristics of the microorganism used, external conditions, and the like, and the optimum conditions can be selected.
  • Steroids are added to the reaction solution containing the microbial cells thus prepared to produce steroids having a hydroxy group at the 25-position. That is, a culture solution containing microbial cells in culture is used as it is, or a solution in which the cells separated by centrifugation or filtration after culture is suspended is used. Solutions that can be used to suspend cells are It is the above-mentioned medium, or a single or mixed buffer such as tris-sick acid, tris-hydrochloride, sodium succinate, sodium citrate, sodium phosphate, potassium phosphate and the like. The pH of the buffer is preferably 7.0 to 8.5.
  • the steroids serving as the substrate may be added to the reaction solution containing the microbial cells either as a powder or dissolved in a water-soluble organic solvent, for example, ethanol, and added to the reaction solution containing the microbial cells.
  • the preferred range is 0.5 to 0.6 O mg per m 1. If the addition amount is more than 0.6 O mg / ml, the conversion rate is undesirably reduced.
  • the reaction is carried out under aerobic conditions at 27 to 3 C for 1 to 3 days, preferably for about 1 day, by shaking or aeration and the like. Steroids having a hydroxyl group can be produced.
  • steroids having a hydroxy group at the 25-position can be produced from steroids by using microorganisms belonging to the genus Amycolata or Sphin gomonas ⁇ .
  • a cyclodextrin or cyclodextrin derivative together with a steroid in a reaction solution for the microbial reaction, the conversion rate to a steroid having a hydroxy group at the 25-position can be dramatically increased.
  • the cyclodextrin used in the present invention includes / S-cyclodextrin and 7 -cyclodextrin.
  • Examples of the cyclodextrin derivatives include hydroquinpropyl 1 / 3-cyclodextrin, maltosyl / 3-cyclodextrin, and glycosyl-3-cyclodextrin / methylated cyclodextrin. Of these, methylated cyclodextrin is preferred.
  • methylated cyclodextrin refers to a compound in which the hydrogen atom of the hydroxyl group at the 2-, 3- or 6-position of cyclodextrin is substituted with a methyl group, and ⁇ -cyclodextrin is completely methylated at the 2- and 6-positions.
  • the methylation rate is preferably between 50 and 70%, most preferably about 61%.
  • any one or more selected from the above methylated cyclodextrins are used, and particularly, partially methylated cyclodextrins derived from 5-cyclodextrin are preferably used.
  • the amount of cyclodextrin or a derivative thereof to be added is preferably 0.1 to 10 mg per 1 ml of the reaction solution, and more preferably 0.5 to 5 mg. If the amount of cyclodextrin or its derivative added is less than 0.1 mg / m1 of the reaction solution, the effect of improving the conversion to steroids having a hydroxy group at the 25-position is not sufficient, and 1 O mg If the temperature exceeds the above, the reaction rate of the conversion reaction becomes slow, and the foaming of the reaction solution becomes remarkable, making it difficult to continue the microbial reaction.
  • the surfactant include nonionic surfactants such as polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester (for example, Tween 80 (manufactured by Sigma), sorbitan fatty acid ester (for example, Span 85 (manufactured by Sigma)), and polyoxyethylene ether.
  • nonionic surfactants such as polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester (for example, Tween 80 (manufactured by Sigma), sorbitan fatty acid ester (for example, Span 85 (manufactured by Sigma)), and polyoxyethylene ether.
  • the amount of the nonionic surfactant to be used is preferably about 0.1 to 0.5%, and the amount of the nonionic surfactant used is 25 to 25 produced by these reactions.
  • Various known methods can be selected and combined to isolate steroids having a droxy group from the reaction solution, for example, solvent extraction using ethyl acetate, n-butanol, etc., silica gel, etc.
  • Example 1 shows weight% unless there is particular notice.
  • Seed mother consisting of 1.5% glucose, 1.5% noktosoyton (Difco), 0.5% corn chip liquor (Nippon Food Processing), 0.4% sodium chloride, 0.2% calcium carbonate (pH 7.0) and the balance water 100 ml of a medium (hereinafter, referred to as medium A) was placed in a 500 ml 1- Erlenmeyer flask, and sterilized by heating at 120 ° C for 20 minutes. This was inoculated with 2 ml of a frozen seed mother of Amycolata autotrophics ATCC 33796 and shake-cultured at 28 C, 220 rpm (amplitude 70 mm) for two days to prepare a seed mother culture solution. .
  • medium A a medium
  • Conversion medium consisting of 0%, 0.5% cone steep liquor, 0.04% dibasic potassium phosphate, 0.04% sodium chloride, 0.2% calcium carbonate (pH 7.4), and the balance water (50%) 1 was placed in a 250m 1 Erlenmeyer flask and sterilized by heating at 120 ° C for 20 minutes. Inoculate 2 ml of the seed culture prepared above, incubate at 28'C for 2 days on a rotary shaker, and dispense 3 ml of the culture into test tubes.
  • the reaction was carried out for 6 hours in the same manner as in Example 1 except that steroid a was used as a substrate and the concentration of PMCD was changed, and the amount of steroids having a hydroxyl group at the 25-position was determined.
  • the results are shown in Table 1-2.
  • the reaction was carried out for 6 hours in the same manner as in Example 1 except that steroid a was used as the substrate, the PMCD concentration was 1%, and the concentration of the substrate was changed, to produce steroids having a hydroxyl group at the 25-position. The amount was determined. The results are shown in Table-3.
  • Example 2 The reaction was performed for 6 hours or 24 hours in the same manner as in Example 1 except that steroid a was used as the substrate, various cyclodextrins or derivatives thereof were used at a concentration of 1.0%, and Tween 80 was used at 0 or 0.2%. The amount of steroids having a hydroxy group at the 25-position was determined. The results are shown in Tables 1 and 4.
  • the cyclodextrin (CD) or its derivative used is as follows: c ⁇ -CD, one CD, r-CD, hydroxypropyl one-CD, maltosyl- ⁇ -CD
  • PMCD-a partially methylated cyclodextrin (methylation rate 72.1%)
  • PMCD-b partially methylated cyclo-dextrin (methylation rate 69.0%)
  • PMCD-c partially methylated cyclodextrin (methylation rate 55.8%)
  • PMCD—aZPMCD—c 2Zl mixture (methylation rate 66.7%)
  • TMCD 2, 3, 6-tree 0-methyl / 3-cyclodextrin (methylation rate 100
  • Example 6 Reaction was performed for 6 hours or 24 hours in the same manner as in Example 1 except that steroid a was used as a substrate and various microorganisms were used in the absence of PMCD or in the presence of 1% PMCD. The amount of steroids produced was determined. The results are shown in Table-6.
  • the bacteria used are shown below.
  • Streptomyces species HB-103 Streptomyces species HB- 1 03
  • the quantification was performed by comparing with the interview value on the 25-hydroxylated sample of steroid a obtained by chemical synthesis on HPLC. As a result, formation of the 25-position hydroxylated form of steroid a of 78 OmgZL was confirmed.
  • PMCD was not added to the medium, the amount of steroid a hydroxylated at position 25 was 9.1 mgZL.
  • HPLC separation conditions were as follows: column: Inertsil Prep-ODS (20 ⁇ 250 mm; manufactured by GL Sciences), eluent: 90% methanol, flow rate: 1 OmIZmin, detection: ultraviolet absorption at 265 nm.
  • eluent 90% methanol
  • flow rate 1 OmIZmin
  • detection ultraviolet absorption at 265 nm.
  • 97 mg of steroid a hydroxylated at position 25 was obtained.
  • Nuclear magnetic resonance, infrared absorption, and mass spectrum of the separated product were measured and subjected to structural analysis. As a result, it was confirmed that the product was a 25-position hydroxide of steroid a.
  • Amicola overnight Autotrophica ATCC 33796 was cultured in medium B containing PMCD in the same manner as in Example 6, and 200 ml of a culture solution was obtained (for four flasks).
  • 25 mg of steroid b was dissolved in 1 ml of ethanol, added to each, and cultured for 24 hours.
  • 25 mg of steroid b was dissolved in 1 ml of ethanol and added to this culture solution, followed by culturing for 24 hours (additional concentration of steroid b 1 g / L).
  • 778 mgZL of the 25-position hydroxylated form of steroid b was stored.
  • the accumulated amount in medium B without PMCD was 4.0 mg / L.

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Description

朋細書 ステロイド類の 2 5位水酸化物の生物学的製造方法 技術分野
本発明は、 コレステロール以外のステロイド類の 2 5位を生物学的に水酸化す る方法に関するものである。 発明の背景
ステロイド類の 2 5位を生物学的に水酸化する方法としては、 ステロイド類の 2 5位を水酸化することができる能力を有するストレブトマイセス属微生物を用 いる方法が既に知られている（特開平 7— 1 2 3 9 9 7号公報)。 ストレプトマイ セス属微生物として具体的には、 ストレプトマイセス ·スぺシーズ H B— 1 0 3 (Streptomyces species H B - 1 0 3 ) が挙げられている。 この菌を用いると、 構造の複雑なステロイド類の 2 5位を効率よくかつ簡易に直接水酸化することが できる。 発明の開示
本発明は、 ストレブトマイセス属以外の微生物を用いたコレステロール以外の ステロイド類の 2 5位を生物学的に水酸化する方法を提供することを目的とする c 本発明は、 多くの微生物のなかからアミコラ一夕 （Amycolata)属又はスフイン ゴモナス（Sphingomonas)厲に厲する微生物がステロイド類の 2 5位を水酸化する ことができる能力を有するとの知見に基づいてなされたものである。
すなわち、 本発明は、 ステロイド類の 2 5位を水酸化することができる能力を 有するァミコラータ （Amycolata)厲又はスフィンゴモナス（Sphingomonas)厲に属 する微生物菌体または培養液にステロイド類 （但し、 コレステロールを除く） を 添加して、 ステロイド類の 2 5位の炭素に結合している水素原子を水酸基に変え ることを特徴とするステ αィド類の 2 5位水酸化物の生物学的製造方法を提供す る。 発明を実施するための最良の形態
本発明で対象とするステロイド類としては、 コレステロール以外のステロイド であって、 2 5位が炭素原子であってここに水素原子が結合しているかぎり、 他 の炭素原子はいずれの元素でもよいステロイド類である。 たとえば、 2 2位の炭 素原子が酸素原子、 ィォゥ原子、 窒素原子などでも良い。 また 2 5位以外に置換 基として、 低級アルキル基、 環状炭化水素基、 トリァゾリンなどのへテロ環基や、 保護されていてもよい、 水酸基、 アミノ基、 ヒドロキン低級アルキル基、 ヒドロ キン低級アルコキシ基、 ァシル基などを有していてもよい。 またステロイド骨格 中に 1以上の不飽和結合を有してレ、てもよく、 さらにその不飽和結合が酸化され たェポキシ環を有していてもよい。
本発明は、 対象とするステロイド類としては、 下記一般式 ( I ) で示される化 合物が好ましい。
Figure imgf000004_0001
(式中、 R , は水素原子または保護されていてもよい水酸基を、 R 2 は水素原子 または水酸基が保護されていてもよいヒドロキシ低級アルコキシ基を示すか、 ま たは R , と R2 で二重結合を形成するかエポキシ環を形成することを示す。 R 3 は水素原子または保護基を示し、 R 4 、 R s 、 R e 、 R7 は、 それぞれ水素原子 を示すか、 R 4 と R 5 、 R e と R7 の一方もしくは両方が二重結合を形成してい る力、、 R 5 と R e で二重結合を形成し、 と R7 で共役二重結合を保護し得る ジエノファイルと結合していることを示す。 Xは C H2 または酸素原子を示す。 、 但し、 Xが CH2 である場合には、 R， 、 R2 、 Re 及び R7 が水素原子であり、 R4 と Rs で二重結合を形成している場合を除く。 ）
式中の保護基としては、 例えば、 ァセチル基、 ビバロイル基、 メトキシカルボ ニル基、 ベンジルォキシカルボニル基、 p—トルエンスルホニル基などのァシル 基、 メチル基、 メ トキシメチル基などの置換されていてもよいアルキル基、 トリ メチルンリル基、 トリェチルシリル基、 t—プチルジメチルシリル基などの置換 シリル基などがあげられ、 好ましくはトリメチルシリル基、 トリェチルシリル基、 t一プチルジメチルシリル基などがあげられる。
また、 共役二重結合を保護し得るジエノファイルとしては、 一般式 （ I I ) で 示される化合物が用いられる。
Figure imgf000005_0001
(式中 Aおよび Bは、 同一または異なる基で 1〜 4個の炭素原子を有するアルコ キシ基を表すか、 あるいは Aと Bとは一緖にフヱ二ルイミノ基または 0—フエ二 レン基を表す。 Yは窒素原子またはメチン基 （=CH—） を表す。 ） 。 このうち、 好ましくは、 4一フエ二ルー 1 , 2, 4—トリァゾリン一 3， 5—ジオン、 マレ ィン酸ジェチルなどが用いられる。
本発明で対象とするステロイ ド類として、 具体的には、 1 α, 3 ージヒドロ キシー 5, 7—コレス夕ジェン、 2 S— （3—ヒドロキンプロピルォキン） ー 1 a, 3 )S—ジヒドロキシー 5, 7—コレス夕ジェン、 5な， 8 α- (3, 5—ジ ォキソ一 4一フエ二ルー 1 , 2， 4ートリアゾリジノ） 一 1, 6—コレス夕ジェ ン一 3 S—オール、 3 S—ヒドロキシー 1, 5, アーコレス夕トリェン、 1 α, 2 α—エポキシ一 5 α, 8 α- (3, 5—ジォキツー 4一フエ二ルー 1 , 2, 4 一トリアブリジノ） 一 6—コレステン一 3 )3—オール， 1 α, 2 α—エポキシ一 3 ;3—ヒドロキシ一 5, アーコレス夕ジェン、 20 (S) — （3—メチルブチル ォキシ） ープレグナー 5, 7—ジェン一 1 α, 3 8—ジオール、 20 (S) — (3—メチルプチルォキシ） —ブレグナー 5—ェンー 1 α, 3 /3—ジオール等が あげられる。
本発明の方法によるとステロイド中の水酸基の位置あるレ、は水酸基の数に関係 なく 25位を水酸化しさらに二重結合の位置あるいは数に関係なく 25位を直接 水酸化することができる。
本発明で用いるステロイド類の 25位を水酸化することができる能力を有する アミコーラ夕 （Amycolata)属に属する微生物としては、 アミコラー夕 .サツルネ ァ （Amycolata saturnea) A— 1 2 4 6株、 アミ コラ一夕 .サツルネア (Amycolata saturnea) FERM BP— 2307、 アミコラー夕 .オート ト ロヒカ (Amycolata autotrophica) ATCC 337 9 6などの菌株をあげること ができる力 \ アミコラ一タ属に属し、 ステロイド類の 25位を水酸化することが できる能力を有する菌株であればいずれも使用可能である。 又、 スフインゴモナ ス（Sphingomonas)属に属する微生物としては、 スフィンゴ乇ナス ·パラパゥシモ ヒ "リ CSphingomonas parapaucimobilis) IFO 15100 などがあげられ、 ステロイ ド類の 25位を水酸化することができる能力を有する菌株であれば 、ずれも使用 可能である。
これらのうち、 アミコラ一夕 ·オート トロヒカ （Amycolata autotrophica) ATCC 33796及びァミコラータ ·サツルネア （Amycolata saturnea) A—
1 246株が好ましい。 このァミコラ一夕 ·サツルネア （Amycolata saturnea) A- 1 24 6株は、 本発明者らが土壌中より分離したものであって、 次の菌学的 性状を示す。
( 1 ) 形態
栄養菌糸は合成寒天培地および天然寒天培地においてよく発達し、 不規則的に 分岐する。 また隔壁は認められない。 胞子はグリセリン ·ァスパラギン寒天培地 およびスターチ無機塩寒天培地などで良好に形成される。 顕微鏡で観察すると、 胞子形成菌糸の分岐方法は、 単純分岐で胞子は ΕίΙ状に形成される。 胞子は通常 3個以上の連鎖が認められ、 培養の後期には長い鎖上を呈し、 表面は平滑である。 胞子の形状は円筒形で、 その大きさは 0.5〜0.8 Χ2.5〜4.3 mである。 菌核、 胞子のう、 鞭毛胞子は観察されない。
(2) 各種培地における生育状態（30eC)
(2- 1) シユークロース '硝酸塩寒天培地
培地上での生育状態は、 中程度であり、 コロニー裏面の色調は、 淡褐色である。 気菌糸の形成は中程度であり、 クリーム色を呈する。 可溶性色素は産生しない。
(2-2) グルコース 'ァスパラギン寒天培地
培地上での生育状態は、 やや不良であり、 コロニー裏面の色調は、 クリーム色 である。 気菌糸の形成は中程度であり、 白色を呈する。 可溶性色素は産生しない。
(2- 3) グリセリン ·ァスパラギン寒天培地
培地上での生育状態は、 良好であり、 コロニー裏面の色調は、 淡黄色である。 気菌糸の形成は良好であり、 白色を呈する。 可溶性色素は産生しない。
( 2— 4 ) スターチ '無機塩寒天培地
培地上での生育状態は、 中程度であり、 コロニー裏面の色調は、 クリーム色で ある。 気菌糸の形成は良好であり、 白色を呈する。 可溶性色素は産生しない。
(2- 5) チロシン寒天培地
培地上での生育伏態は、 中程度であり、 コロニー裏面の色調は、 赤掲色である。 気菌糸の形成は良好であり、 クリ一ム色を呈する。 淡赤褐色の可溶性色素を産生 する。
(2- 6)栄養寒天培地
培地上での生育状態は、 良好であり、 コロニー裏面の色調は、 淡黄色である。 気菌糸の形成は良好であり、 白色を呈する。 可溶性色素は産生しない。
(2- 7) イースト '麦芽寒天培地
培地上での生育状態は、 良好であり、 コロニー裏面の色調は、 淡黄色である。 気菌糸の形成はやや不良であり、 白色を呈する。 可溶性色素は産生しない。
(2-8) オートミール寒天培地
培地上での生育状態は、 中程度であり、 コロニー裏面の色調は、 クリーム色で ある。 気菌糸の形成はやや不良であり、 白色を呈する。 可溶性色素は産生しない。
(2— 9) ペプトン 'イースト '鉄寒天培地
培地上での生育状態は、 中程度であり、 コロニー裏面の色調は、 淡褐色である。 気菌糸の形成は中程度であり、 クリーム色を呈する。 可溶性色素は産生しない。
(3) 生理的性質
(3- 1)生育温度範囲：栄養寒天培地を使用した場合、 20〜 30での温度範 囲で良好な生育が認められる。 1 0°C以下および 4 (TC以上では生育しない。
(3-2) 好気性 ·嫌気性の区別：好気性である。
(3- 3) ゼラチンの液化：陽性である。
(3- 3) スターチの加水分解：陰性である。
(3-4)脱脂牛乳の凝固、 ぺブトン化：いずれも陰性である。
(3- 5) メラニン様色素の生成：陰性である。
(3- 6) 硝酸還元能：陰性である。
( 4 ) 各種炭素源の利用性： フリ ドハム ·ゴトリ一ブ寒天培地上に各種の炭素源 を加え、 生育を見た場合、 D—グルコース、 シユークロース、 D—キシロース、 イノシトール、 D—マンニッ ト、 D—フルクトースのいずれの炭素源も利用する ことができる。 Lーァラビノース、 L一ラムノースおよびラフイノースは利用で きない。
( 5 ) 細胞壁成分
細胞壁成分を全菌体の分解物を用いて調べた結果、 ルシェバリエの分類 （イン ターナショナル · ジャーナル · ォブ■ システマティ ック ' バクテリォロジ一 (International Journal of Systematic Bacteriology) vol. 20， p 435 〜443 ( 1 970) ) によるタイプ I I I細胞壁に属した。 またミコール酸は 含まれていない。
以上の菌学的性状から本菌株が放線菌に属することは明確であり、 インタ —ナショナル ' ジャーナル · ォブ ' システマティ ック ' ノくクテリオロジー (International Journal of Systematic Bacteriology) vol. 36, p 29〜 37 ( 1 986) に報告されている既知微生物の性状と比較したところ、 本菌株 は、 アミコラ一夕 'サツルネア （Amycolata saturnea) とほぼ一致した。 以上の 結果から、 本菌株はアミコラ一夕 'サツルネア （Amv ola saturnea) に属する ものと判断し、 ァミコラー夕 ·サツルネア （ yq^ata saturnea) A— 1 246 株と命名した。 本菌株は、 日本国茨城県つくば市東 1丁目 1番 3号の工業技術院 生命工学工業技術研究所に寄託されている （平成 7年 8月 7日、 F E RM B P — 5 5 4 4 ) 。
本発明のコレステロール以外のステロイド類の 2 5位を生物学的に水酸化する 方法は、 アミコラ一夕 （Amycolata)属又スフインゴモナス（Sphingomonas)属に属 する微生物を含有する溶液中で、 基質であるコレステロール以外のステロイド類 を好気的条件下で水酸化させるものである。 反応に必要な微生物菌体は、 上記菌 株を栄養源含有培地に接種し、 好気的に培養することにより製造される。 上記微 生物の培養方法は、 原則的には一般微生物の培養方法に準ずるが、 通常は液体培 養による振盪培養、 通気撹拌培養などの好気的条件下で実施するのが好ましい。 培養に用いられる培地としては、 アミコラ一夕 （Amycola )属又スフイ ンゴモ ナス（Sphingomonas)属に属する微生物が利用できる栄養源を含有する培地であれ ばよく、 各種の合成、 半合成培地、 天然培地などいずれも利用可能である。 培地 組成としては炭素源としてのグルコース、 マルト一ス、 キシロース、 フルクトー ス、 シュ一クロース等を単独または組み合わせて用いることができる。 窒素源と しては、 ペプトン、 肉エキス、 大豆粉、 カゼイン、 アミノ酸、 酵母エキス、 尿素 等の有機窒素源、 硝酸ナトリウム、 硫酸アンモニゥム等の無機窒素源を、 単独ま たは組み合わせて用いることができる。 その他、 例えば塩化ナトリウム、 塩化力 リウム、 炭酸カルシウム、 硫酸マグネシウム、 リン酸ナトリウム、 リン酸力リウ ム、 塩化コバルト等の塩類、 重金属類塩、 ビタミン類も必要に応じ添加使用する ことができる。 なお、 培養中発泡が著しい場合には、 公知の各種消泡剤を適宜培 地中に添加することもできる。
培養条件は、 該菌株が良好に生育し得る範囲内で適宜選択することができる。 通常、 p H 6〜7. 5、 2 8〜3 0 °Cで 2〜8日程度培養する。 上述した各種の培 養条件は、 使用微生物の種類や特性、 外部条件等に応じて適宜変更でき、 最適条 件を選択できる。
このように調製した微生物菌体を含有する反応溶液にステロイド類を添加し、 2 5位にヒドロキシ基を有するステロイド類を生産させる。 すなわち培養中の微 生物菌体を含む培養液をそのまま用いるか、 培養終了後、 遠心分雜または濾過に より分離した菌体を懸濁させた溶液を用いる。 菌体の懸濁に使用できる溶液は、 前記した培地であるか、 あるいはトリス—酔酸、 トリスー塩酸、 コハク酸ナトリ ゥム、 クェン酸ナトリウム、 リン酸ナトリウム、 リン酸カリウムなどの緩衝液を 単独または混合したものである。 緩衝液の p Hは、 7. 0〜8. 5が好ましい。
基質となるステロイド類は、 粉末のままか、 あるいは水溶性有機溶媒、 例えば ェタノ一ルなどに溶解して微生物菌体を含有する反応溶液に添加すればよく、 そ の添加量は、 反応溶液 1 m 1当り 0. 〖 5〜0. 6 O m gが好ましい。 添加量を 0. 6 O m g/m lより多くすると、 変換速度が遅くなり好ましくない。 基質添加 後は、 2 7〜3 Cで 1〜3日間、 好ましくは約 I日間、 振とうあるいは通気撹 拌などの操作を行い、 好気的条件下で反応を進行させることにより 2 5位にヒド 口キシ基を有するステロイド類を生産することができる。
以上述べたとおり、 アミコラ一夕 （Amycolata)属又はスフインゴモナス（Sphin gomonas)厲に属する微生物を用いることによりステロイド類を原料として 2 5位 にヒドロキシ基を有するステロイド類を製造することができるが、 さらに、 その 微生物反応の際の反応溶液中にステロイド類と共にシクロデキストリン又はシク ロデキス卜リン誘導体を共存させることにより、 2 5位にヒドロキシ基を有する ステロイド類への変換率を飛躍的に増大できる。
本発明で使用するシクロデキストリンとしては、 /S—シクロデキストリン、 7 ーシクロデキストリンが挙げられる。 またシクロデキストリン誘導体としては、 ヒドロキンプロピル一 /3—シクロデキストリン、 マルトシルー /3—シクロデキス トリン、 グリコシルー 3—シクロデキストリンゃメチル化シクロデキストリンな とがあげられる。 これらのうち、 メチル化シクロデキストリンが好ましい。 ここ で、 メチル化シクロデキストリンとは、 シクロデキストリンの 2 , 3または 6位 の水酸基の水素原子がメチル基で置換された化合物をいい、 2および 6位が完全 にメチル化された α—シクロデキストリン由来のへキサキスー （2， 6—0—ジ メチル） 一ひーシクロデキストリン、 /3—シクロデキストリン由来のヘプ夕キス - ( 2 , 6— Ο—ジメチル） — S—シクロデキストリンおよびアーシクロデキス トリン由来のォクタキス一 （2 , 6—0—ジメチル） 一アーシクロデキストリン、 あるいは 2 , 3および 6位が完全にメチル化された α—シクロデキストリン由来 のへキサキス一 （2 , 3 , 6—0—トリメチル） 一 α—シクロデキストリン、 —シクロデキストリン由来のへブ夕キスー （2 , 3 , 6—0—トリメチル） 一 —シクロデキストリンおよび 7 -シクロデキストリン由来のォクタキスー （2 , 3 , 6— 0—トリメチル） 一アーシクロデキストリン、 あるいは 2， 3 , 6位の 各 6個、 7個もしくは 8個の水素基が部分的にメ千ル化された部分メチル化シク ロデキストリン （以下、 P M C Dと略称することがある） を挙げることができる。 メチル化率は 5 0〜7 0 %であるのが好ましく、 最も好ましくは約 6 1 %である。 本発明においては、 上記メチル化シクロデキストリンの中から任意の一種または 二種以上が選択されて用いられる力 特に5—シクロデキストリン由来の部分メ チル化シクロデキストリンが好適に用いられる。
シクロデキストリン又はその誘導体の添加量は、 反応溶液 1 m 1当り 0. 1〜 1 0 m gが好ましく、 より好ましい範囲は、 0. 5〜5 m gである。 シクロデキス トリ ン又はその誘導体の添加量が反応溶液 1 m 1当り 0. 1 m g未満の場合は、 2 5位にヒドロキシ基を有するステロイド類への変換率の改善効果が十分でなく、 1 O m gを越えると、 変換反応の反応速度が遅くなり、 また反応溶液の発泡が著 しくなり、 微生物反応の継続が困難になる。
本発明では、 シクロデキストリン類と同時に界面活性剤を共存することが有効 な手段である。 界面活性剤としては、 非イオン性界面活性剤としてポリオキシェ チレン ' ソルビタン脂肪酸エステル （例えば Tween 8 0 (シグマ社製） 、 ソルビ タン脂肪酸エステル （例えば Span 8 5 (シグマ社製） ） 、 ポリオキシエチレン エーテル （例えば Bri j 9 6 (シグマ社製） ） や Tri ton X— 1 0 0 (シグマ社 製） 、 ノニルフヱノール （例えばノニボール 4 5 (三洋化成工業 （株） ） 製） 、 酸化エチレン一酸化プロピレンのブロック共重合物 （例えば Pluronic L - 6 1 (旭電化工業 （株） 製） 、 および陰イオン性界面活性剤としてダイレックス （日 本油脂 （株） 製） 、 トラックス （日本油脂 （株） 製） などを用いることができる。 使用する非イオン界面活性剤の量は、 0. 1〜0. 5 %程度とするのが好ましい。 これらの反応により製造された 2 5位にヒドロキシ基を有するステロイド類を 反応溶液から単離するには、 既知の種々の方法を選択、 組み合わせて行うことが できる。 例えば、 酢酸ェチル、 n—ブタノ一ル等を用いた溶媒抽出、 シリカゲル 等によるカラム法あるいは薄層クロマトグラフィー、 液々分配クロマトグラフィ 一、逆相カラムを用いた分取用高速液体クロマトグラフィー、 合成吸着樹脂を用 いたカラムクロマトグラフィー等を、 単独あるいは適宜組み合わせ、 場合により 反復使用することにより分離精製することができる。
以下、 実施例により本発明を詳細に説明する力 これによつて本発明が限定さ れるものではない。 なお、 下記の例中の％は特に断らない限り重量％を示す。 実施例 1
グルコース 1.5%、 ノくクトソィトン （ディフコ社製） 1.5%、 コーンスチープ リカー （日本食品加工社製） 0.5 %、 塩化ナトリゥム 0.4 、 炭酸カルシウム 0.2% (pH7. 0) 及び残部が水からなる種母用培地 （以下、 培地 Aという） 1 00m 1を 5 00m 1容三角フラスコに入れ、 1 20°C、 20分間加熱滅菌し た。 これにアミコラ一夕 'オートトロヒカ （Amycolata autotrophics) ATCC 33796の凍結種母 2 m 1を接種し、 28 C、 220 r pm (振幅 70 mm) で 2日間振とう培養し、 種母培養液を調製した。
次にグルコース 2. 0%、 酵母エキス （オリエンタル酵母 （株） 製） 0.2%、 ぺ プトン （極東製薬 （株） 製） 0, 5 %、 大豆粉 （エスサンミート ：味の素 （株)製） 1. 0%、 コーンスチープリカー 0.5%、 第二リン酸カリウム 0.04%、 塩化ナト リウム 0.04%、 炭酸カルシウム 0.2% (pH7.4) 及び残部が水からなる変換 培養用培地 （以下、 培地 Bという） 50m 1を 250m 1容三角フラスコに入れ、 1 20 °C 20分間加熱滅菌した。 これに先に調製した種母培養液 2m 1を接種 し、 28'C、 2日間ロータリ一シェーカーで培養し、 3m Iづっ培養液を試験管 に分注する。
この 3m 1の培養液それぞれに、 部分メチル化 ;3—シクロデキストリン （メチ ル化率 55.8%) を濃度 0、 0. 5及び 1.0重量％となるように添加し、 ついで、 下記のステロイド a、 b、 c又は dを 250 zg/mlになるようにエタノール溶液 として添加した。 ついで、 30'C、 ロータリーシヱ一カーにて 1 7時間反応させ た。 ステロイ ド a
Figure imgf000013_0001
Figure imgf000013_0002
ステロイ ド c
Figure imgf000013_0003
ステロイド d
Figure imgf000014_0001
反応後、 得られた培養液 1 m 1を供栓付き遠心沈殿管に移し 9 m 1のメタノー ルを加え密栓をした後、 1 5分間混合した。 混合液を 300 Orpm、 1 0分間遠 心分離し、 上清を HP LC分析した。 HPLC装置は L一 6000システム （日 立製作所製）を用い、 カラムは YMC A 503 CN (内径 4. 6mm, 全長 250 mm；山村化学製）、 溶離液はァセトニトリル：水 == 5 5 ： 4 5を用い、 流速 1. Om 1 Z分、 カラム温度 4 0°Cで分析を行い、 検出は 205又は 26 5 nmに おける紫外吸収で行った。 定量は化学合成で得たステロイド a、 b、 c又は dの 25位水酸化体標品の H P L C上での面積値と比較して行った。
表一 1 (変換反応 1 7時間後の分析値 （単位 g/ml) )
PMCD 0¾ P CD 0.5¾ PMCD 1.0¾ ステロイド a 基質 127 116 7.16
25位水酸化体 3.77 82.6 169 ステロイ b 基質 110 50.2 4.57
25位水酸化体 4.05 89.8 158 ステロイド c 基質 0 0 0
25位水酸化体 5.85 53.7 41.8 ステロイド d 基質 0 0 0
25位水酸化体 6.90 23.4 83.6 上記の結果から、 本発明によればステロイド類から効率よく 25位にヒドロキ シ基を有するステロイド類を製造することができ、 又部分メチル化シクロデキス トリンが共存すると、 ステロイド類の 25位の水酸化率が向上することがわかる。 実施例 2
基質として、 ステロイド aを用い、 PMCDの濃度を変化させた以外は、 実施 例 1と同様にして 6時間反応を行い、 25位にヒドロキシ基を有するステロイド 類の生成量を求めた。 結果を表一 2に示す。
表一 2 (反応 6時間後の 25位水酸化体生成量）
PMCD濃度 （％) 0 _ _ 0.2_5 _ 0.50 1.0 2.0
25位水酸化体 （ zg/ml) 6.7 25. 1 44.5 1 1 0 23.2 上記の結果から、 部分メチル化シクロデキス卜リンの至適濃度が 1 %であるこ とがわかる。
実施例 3
基質として、 ステロイド aを用い、 PMCDの濃度 1 %とし、 基質の濃度を変 化させた以外は、 実施例 1と同様にして 6時間反応を行い、 25位にヒドロキシ 基を有するステロイド類の生成量を求めた。 結果を表 - 3に示す。
表一 3 (反応 6時間後の 25位水酸化体生成量 （単位 g/ml) ) 基質濃度 65 1 25 250 500 1 000
25位水酸化体 29.8 57.5 90.4 10.7 15.7
上記の結果から、 ステロイド類の至適濃度が 250 czg/mlであることがわかる。 実施例 4
基質として、 ステロイド aを用い、 種々のシクロデキストリン又はその誘導体 を 1.0%の濃度で用い、 Twe en 80を 0又は 0.2%用いた以外は、 実施例 1 と同様にして 6時間又は 24時間反応を行い、 25位にヒドロキシ基を有するス テロイド類の生成量を求めた。 結果を表一 4及び 5に示す。
尚、 用いたシクロデキストリン （CD) 又はその誘導体は、 以下のものである c α— CD、 一CD、 r -CD, ヒドロキシプロピル一 — CD、 マルトシルー β-CD
PMCD- a ：部分メチル化シクロデキストリン （メチル化率 72. 1 %) PMCD— b ：部分メチル化シクロ-デキストリン （メチル化率 69. 0%) PMCD- c ：部分メチル化シクロデキストリン （メチル化率 55. 8%) 混合 PMCD- 1 ： PMCD- a/PMCD- c = 1 2混合物 （メチル化率 61.2%)
混合 PMCD— 2 ： PMCD— aZPMCD— c = 2Zl混合物 （メチル化率 66.7%)
D CD ： 2, 6—ジー 0—メチルー >9ーシク CJデキストリン （メチル化率 66.6 %)
TMCD： 2, 3, 6—トリー 0—メチルー /3-シクロデキストリン （メチル化 率 1 00
混合 PMCD— 3 ： DMCDZTMCD- 1/2混合物（メチノレ化率 88. 9%) 混合 PMCD - 4 ： DMCDZTMCD^^Zl混合物（メチル化率 77. 7%) 表一 4 (反応 6及び 24時間後の 25位水酸化体生成量 （単位 g/ml) ) 反応 6時間 反応 24時間
Tween80 なし 0.2¾Tween80 Tween80なし 0.2¾Tween80
CD未添加 10.7 11.3 8.76 9.38 ひ一 CD 11.1 8.37 2.20 3.67
CD 7.53 20.0 14.3 13.0 r-CD 13.7 34.7 17.2 9.97 ヒドロキシブ 7.53 20.8 45.0 73.7
口ピル一 S-CD
マルトシル— /8— CD 11.1 72.4 68.4 110
PMCD- c 107 88.4 160 157
α - CD以外は添加効果が認められた。 添加効果がもっとも高いのは PMCD 一 cであったが、 その他の CDも Tween80 との併用によって添加効果が増幅され た （反応 6時間） 。 Tween80 のみでは添加効果はわずかであった。 b (25位水酸化体生成量 （単位/ zg/ral) ) メチル 反 CL、
化率 ) 6時間 24時間
CD未添加 15.3 10.7
PMCD- a 72.1 71.4 130
PMCD-b 69.0 79.6 138
PMCD- c 55.8 89.4 144
混合 PMCD— 1 61.2 115 180
混合 PMGD— 2 66.7 87.7 149
Mし U 66.6 54.3 147
TMCD 100 43.4 108
混合 PMCD - 3 88.9 50.4 126
混合 PMCD - 4 77.7 44.9 128
上記の結果からメチル化シクロデキストリンにおいてはそれぞれ添加効果が認 められた。 特にメチル化シクロデキストリンにおいては、 平均メチル化率が 6 1 %でもつとも促進効果が高かった。
実施例 5
基質として、 ステロイド aを用い、 PMCD非共存下又は 1 %共存下、 各種微 生物を用いた以外は、 実施例 1 と同様にして 6時間又は 24時間反応を行い、 25位にヒドロキシ基を有するステロイド類の生成量を求めた。 結果を表— 6に 示す。
使用した菌を次に示す。
アミコラータ ·サツルネア (Amycolata saturnea)A- 1 24 6株 FERM BP 5544 アミコラ一夕 ·オート トロヒ力 （Amycolata autotrophics) ATCC33796 ストレブトマイセス ·ロゼォスブロス（Streptomyces roseosprous)FERM BP 1574 スフイ ンゴモナス 'ノ、'ラパゥシモビリス（Sphingomonas parapaucimobi lis) IFO 15100
ストレブトマイセス ·スぺシーズ HB— 1 0 3 (Streptomyces species HB - 1 03) FERM BP 4318
表一 6 (25位水酸化体生成量 （単位 g/ml) ) 反応 6時間 反応 24時間
CDなし PMCD CDなし 1% PMCD アミコラ一夕 'サツルネア 10.7 107 8.76 160
A - 1 24 6株
アミコラ一夕 'オート トロヒカ 9.31 111 0 177
ATCC 33796
ストレプトマイセス ' 2.65 4.29 0 10.4 ロゼォスプロス FERM BP 1574
スフイ ンゴモナス ' 2.28 2.04 1.72 1.71 パラバウシモビリス〖F0 15100
ストレプトマイセス * 5.50 30.5 5.21 90.5 スぺシ一ズ HB— 1 03
実施例 6
培地 A 1 0 0m 1を 5 0 0 m 1容量の三角フラスコに入れ、 綿栓をした後 1 2 1でで 20分間蒸気滅菌した。 冷却後、 アミコラータ ·ォゥトトロフイカ A TCC 3379 6を 1白金耳無菌的に植菌し、 28°C、 2 1 0 r pmで 3日間振 とう培養した。 培地 Bに PMCD (メチル化率 55.8%) を 1.0%になるように 添加した培地 5 Om 1を 25 Om 1容量の三角フラスコに入れ、 綿栓をした後 1 2 1 °Cで 20分間高圧蒸気滅菌したものを 4本用意し、 上記培地 Aの培養液 1.0m lを無菌的に移し、 28'C、 220 r pm (振幅 7 Omm) で 2日間培養 した。 対照として PMCDを含まない培地 Bで同様に培養した。 これらの培養液 に各々 25mgのステロイド aを 1 m 1のエタノールに溶解して各々添加し、 さ らに 24時間上記条件で培養した。 この培養液に、 さらに 25mgのステロイ ド aを 1 m 1のエタノールに溶解して追加し、 同様に 24時間上記条件で培養した (ステロイド aの添加濃度 1 gZL) 。 反応後、 得られた培養液 1 m 1を共栓付 き遠心沈殿管に移し 9mlのメタノールを加え、 密栓をした後、 1 5分間混合し た。 混合液を 3000 r pm、 1 0分間遠心分離し、 上淸を H PLC分析した。 HPLC装置は L— 6000システム （日立 （株） 製） を用い、 カラムは YMC
A 503 CN (内径 4.6mm、 全長 25 Omm；山村化学製）、 溶離液はァセ トニトリル：水 = 55 ： 45を用い、 流速 1.0m 1 / 、 カラム温度 40°Cで分 析を行い、 検出は 205又は 265 nmにおける紫外吸収で行った。 定量は化学 合成で得たステロイド aの 25位水酸化体標品との HPLC上の面接値と比較し て行った。 その結果、 78 OmgZLのステロイド aの 25位水酸化体の生成を 確認した。 培地に PMCDを添加しない場合のステロイド aの 25位水酸化体の 生成量は 9. lmgZLであった。
PMCDを含む培地 Bで得た反応液 200m lを 3000 r pm、 1 0分間の 遠心分離を行い、 上清を得た後、 アンバーライト XAD— 7カラム （内径 30 mm、 長さ 1 40mm：オルガノ製） を通過させステロイド a及びその 25位水 酸化体を吸着させた。 水洗及び 50%メタノールでカラムを洗浄した後、 1 00 %メタノールで溶出し、 溶出液を減圧濃縮乾固した。
次に、 50 gのヮコーゲル C— 300 (和光純薬製） を n—へキサン：酢酸ェ チル =3 ： 1で充塡したカラムに濃縮乾固物を少量の n—へキサン：醉酸ェチル = 3 ： 1に溶解し、 カラム上端に吸着させ、 n—へキサン：酢酸ェチル =3 ： 1 を 500m 1通過させた後、 n—へキサン：酢酸ェチル = 3 ： 2で溶出した。 溶 出画分を HPLCで分析しステロイド aの 25位水酸化体画分を減圧濃縮乾固し た。
次に HPLCにて乾固物を分離した。 HPLC分離条件は、 カラム； Inertsil Prep-ODS ( 20 x 250mm； ジーエルサイエンス社製） 、 溶出液； 90%メ 夕ノール、 流速： 1 OmIZmi n、 検出； 265 nmにおける紫外吸収で行つ た。 その結果、 97 mgのステロイド aの 25位水酸化体を得た。 この分離物の 核磁気共鳴、 赤外吸収、 及びマススペク トルを測定し構造解析を行った結果、 ス テロイド aの 25位水酸化体であることが確認された。
得られた 25位水酸化体の特性値を次に示す。
m. P. ： 1 69 ~ 1 71 °C
[a] D ：- 16.0 (c0.5, MeOH, 21.8。C) FAB-MSCM/Z)：
414CM+H) + (Matrix;m-Nitrobenzyl Alcohol)
(計算値 413:C27H4103)
IR " cm"1：
3382, 2959, 2870, 1449, 1377.1267, 1151.1047.930
UVA„.x nm ） ：
260(8860 sh), 269(12300).280(12750), 291(7210)
'H-NMRCCDCh) 5(ppm) ：
5.72(1H, d. J=4Hz), 5.40(1H. m), 3.91(1H. m), 3.33(1H. d. J=4Hz),
3.05(1H. d. J=4Hz).2.4〜2.5(2H. m).2.24(1H， t, J=llHz),
2.1〜2.15(1H, m), 2.0K1H, d, J=5Hz), 1.88〜1.95(2H, m),
1.78〜1.85(2H.m), 1.66〜1.71(lH.m),1.22〜1.5(llH.m),
1.22(6H, s).1.05(3H. s).0.97(3H, d. J=7Hz).0.6 (3H. S)
13C-NMR(CDCl3)(5(ppin) ：
141.5(s). 133.7(s), 122.0(d), 115.9(d). 71.1(s). 67.2(d), 60.9(d), 60.2(d), 55.7(d), 54.5(d), 44.4(0, 42.7(s), 39.7(d). 38.8(t), 38.4(s), 36.9(t), 36.4(t). 36.1(d), 29.4(q). 29.2(q). 28.0(t), 23.0(t). 20.8(0. 20.6(t), 18.8(q), 15.2(q). 11.9(q)
実施例 7
基質として、 ステロイド bを用い、 実施例 2と同様にして 6時間反応を行い、 25位にヒドロキシ基を有するステロイド類の定量を行った。 結果を表— 7に示 す。
表一 7 反応 6時間後の 25位水酸化体生成量
PMCD濃度 （％) 0 0.25 0.5 1.0 2.0
25位水酸化体 0 /ml) 4. 0_ 7.5 24 8.0 7.5 上記の結果から部分メチル化シクロデキストリンの至適濃度が 0.5 %であるこ とがわかる。 実施例 8
基質としてステロイド bを用い、 実施例 3と同様にして 6時間反応を行い、 2 5位にヒドロキシ基を有するステロイド類の定量を行った。 結果を表— 8に示す c 表一 8 反応 6時間後の 25位水酸化体生成量 基質濃度 （ zg/ml) 65 1 25 250 500 1 000
25位水酸化体 （ g/ml) 10.5 17.4 23.2 8.5 0 3.45
上記の結果からステロイド類の至適濃度が 250 n g/m 1であることがわか る。
実施例 9 ステロイド bの 25位水酸化体の合成
実施例 6と同様にして PMCDを含む培地 Bでアミコラ一夕 オートトロヒカ ATCC 33796株を培養し 200mlの培養液をえた （フラスコ 4本分） 。 これらの培養液に各々 25mgのステロイド bを 1 m 1のエタノールに溶解して 各々添加し、 24時間で培養した。 この培養液に、 さらに 25mgのステロイド bを lm lのエタノールに溶解して追加し、 同様に 24時間で培養した （ステロ ィド bの添加濃度 1 g/L) 。 その結果、 PMCDを含む培地 Bにおいて 778 mgZLのステロイド bの 25位水酸化体を蓄接した。 PMCDを含まない培地 Bでの蓄積量は 4.0m g/Lであった。
PMC Dを含む培地 Bで得た反応液 200mlを 3000 r pm、 1 0分間の 遠心分離を行い上清を得た後、 アンバーライト XAD— 7カラム （内径 30mm、 長さ 1 4 0mm；オルガノ製） に通過させステロイド b及びその 25位水酸化体 を吸着させた。 水洗及び 50%メタノールでカラムを洗浄した後、 1 00%メタ ノ―ルで溶出し、 溶出液を減圧濃縮乾固した。
次に、 50 gのヮコーゲル C一 300 (和光純薬製） をジクロロメタン：エタ ノール = 1 9 ： 1で充塡したカラムに濃縮乾固物を少量のジクロロメタン：エタ ノール = 1 9 : 1に溶解し、 カラム上端に吸着させジクロロメタン：エタノール = 1 9 : 1で溶出した。 溶出画分を H PLCで分析しステロイド bの 25位水酸 化体画分を滅圧濃縮乾固した。 その結果 1 03mgのステロイド bの 25位水酸 化体を得た。 m. . : 1 5 5〜1 57。C (クロ口ホルムからの結晶）
ία) D ： 44.6 (c 0.5. MeOH.22°C)
FAB- S(ra/z)：
490(M)+ (マトリックス； m-ニトロべンジルアルコール Pos.)
489CM-H) (マトリックス； m-ニトロべンジルアルコール Neg.)(490: C30HSo
6 についての計算値）
IR " cm"1 ：
3385. 2938, 2870. 1468. 1379. 1136. 1096, 1055, 910
υνλ„" nm (ε) ：
262(6570 sh). 272(9400), 282(10010), 294(5850)
'H-NMR(CDC13) 5 (ppm) ：
5.7K1H. m, J=5.5, 2.2Hz).5.40(1H. m. J=5.5.2.6Hz). 3.6〜4.0(7H. m),
2.5 ~2.7(2H. ra), 2.32(1H, dd. J=14, 5Hz), 2.10(1H. m), 1.23〜2.0(22H. m).
1.22(6H. s), 1.07(3H. s).0.96(3H. d， J=6.6Hz). 0.63(3H. s)
I3C-N R(CDCl3)<5(ppm) ：
141.0(s), 136.1(s). 124.6(d). 115.4(d). 82.3(d). 71.8(d). 71.1(s), 68.9(t). 67.0(d). 60.8(t). 55.9(d). 54.6(d), 44.4(0. 43. l(s).41.8(s), 39.2(t), 38.7(d). 36.4(t). 36.1(d). 35.2(0. 32.3(t), 29.4(q), 29.2(q), 28. l(t), 23.0(t), 21.1(t), 20.8(t). 18.8(q), 15.9(q)， 11.9(q)

Claims

請求の範囲
1. ステロイド類の 25位を水酸化することができる能力を有するアミコラ一夕 (Amycolata)属又はスフィンゴモナス（Sphingomonas)属に厲する微生物菌体ま たは培養液にステロイ ド類 （但し、 コレステロールを除く） を添加して、 ステ ロイド類の 25位の炭素に結合している水素原子を水酸基に変えることを特徴 とするステロイド類の 25位水酸化物の生物学的製造方法。
2. ステロイド類が 1ひ， 3 /S—ジヒドロキシ一 5, 7-コレス夕ジェン、 2 β 一 （3—ヒドロキシプロピルォキシ） 一 1 α, 3 S—ジヒドロキン一 5, 7— コレス夕ジェン、 5 α, 8 α- (3, 5—ジォキソ一 4一フエ二ルー 1 , 2,
4—トリアブリジノ） 一 1 , 6—コレスタジェン一 3 ^—オール、 3yS—ヒド 口キシ一 1, 5. 7—コレスタトリエン、 1 α, 2α—エポキシ一 5α, 8 - (3, 5—ジォキフー 4—フエ二ルー 1, 2, 4—トリアゾリジノ） 一 6— コレステン一 3 S—オール、 1な， 2 α—エポキシ一 3 8—ヒドロキシー 5， 7—コレス夕ジェン、 20 (S) — （3—メチルプチルォキシ） ーブレグナ一 5—ェンー 1 a, 3 ージオールからなる群より選ばれる化合物であることを 特徴とする請求項 1記載の製造方法。
3. ステロイド類が 1 α, 3 ^5—ジヒドロキン一 5, アーコレス夕ジェンである 請求項 2記載の製造方法。
4. ステロイド類が 2 ;3— （3—ヒドロキシプロピルォキン） 一 1 a, 3 S-ジ ヒドロキシー 5, アーコレス夕ジェンである請求項 2記載の製造方法。
5. ステロイド類が 5 α, 8 α- (3. 5—ジォキソ一 4—フエ二ルー 1 , 2,
4ートリアゾリジノ） 一し 6-コレス夕ジェン一 3 —オールである請求項 2記載の製造方法。
6. ステロイド類が 3 /3—ヒドロキシ一 1, 5, 7—コレスタト 1 ンである請 求項 2記載の製造方法。
7. ステロイド類が 1 α, 2 α_エポキシ— 5 α, 8 α- (3, 5—ジォキソ— 4一フエ二ルー 1. 2, 4—トリアゾリジノ） 一 6—コレステン一 3 /9—才一 ルである請求項 2記載の製造方法。
8. ステロイド類が 1 α, 2 α—エポキシ一 3 /5—ヒドロキシ - 5 , 7—コレス 夕ジェンである請求項 2記載の製造方法。
9. ステロイド類が 2 0 ( S ) 一 （3—メチルプチルォキシ） ープレグナ— 5— ェンー 1 α, 3 /8—ジオールである請求項 2記載の製造方法。
10. アミコラー夕属に属する微生物がアミコラ一夕 ·サツルネアである請求項 1 記載の製造方法。
11. アミコラ一夕厲に厲する微生物がアミコラ一夕 ·サツルネア A— 1 2 4 6株 である請求項 1記載の製造方法。
12. ァミコラータ厲に属する微生物がアミコラ一夕 ·ォートトロヒカである請求 項 1記載の製造方法。
13. アミコラ一夕属に属する微生物がアミコラータ 'オートトロヒカ A T C C 3 3 7 9 6株である請求項 1記載の製造方法。
14. スフィンゴモナス厲に属する微生物がスフィンゴモナス 'パラバウシモビリ スである請求項 1記載の製造方法。
15. スフィ ンゴモナス厲に厲する微生物がスフィンゴモナス ·バラバウシモピリ ス I F O 1 5 1 0 0株である請求項 1記載の製造方法。
16. シクロデキストリンまたはシクロデキストリン誘導体の共存下で行う請求項
1〜 1 5のいずれか 1項に記載の製造方法。
17. シクロデキストリンが -または 7—シクロデキストリンである請求項 1 6 記載の製造方法。
18. シクロデキストリン誘導体がメチル化シクロデキストリンである請求項 1 6 記載の製造方法。
19. メチル化シクロデキストリンのメチノレ化率が 5 0〜 7 0 %である請求項 1 8 記載の製造方法。
20. メチル化シクロデキストリンのメチル化率が約 6 1 %である請求項 1 8また は 1 9記載の製造方法。
21. シクロデキストリンまたはシクロデキストリン誘導体の添加量が、 反応溶液 l m lあたり 0. 1〜1 O m gである請求項 1 6〜2 0のいずれか 1項に記載の 製造方法。
22. シクロデキストリンまたはシクロデキストリン誘導体の添加量が、 反応溶液 l m lあたり 0. 5〜5 m gである請求項 2 1記載の製造方法。
23. 界面活性化剤を共存させることを特徴とする請求項 1〜2 2記載の製造方法。
24. 界面活性化剤が非イオン性界面活性化剤である請求項 2 3記載の製造方法。
25. 非ィォン性界面活性化剤がボリォキシェチレン ·ソルビ夕ン脂肪酸エステル、 ソルビタン脂肪酸エステル、 ポリオキシエチレンエーテル、 Tri ton X-100、 ノ 二ルフヱノールおよび酸化エチレン一酸化プロピレンのプロック共重合物から なる群より選ばれる 1種以上である請求項 2 4記載の製造方法。
26. 非イオン性界面活性化剤の添加量が 0. 1〜0. 5 %である請求項 2 4または
2 5記載の製造方法。
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH04356190A (ja) * 1990-05-08 1992-12-09 Taisho Pharmaceut Co Ltd ビタミンｄ類の製造方法
WO1997008336A1 (fr) * 1995-08-28 1997-03-06 Mercian Corporation Procede de production de cholesterols hydroxyles par conversion biologique et dihydroxycholesterols obtenus selon ce procede

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4892821A (en) * 1987-07-08 1990-01-09 Taisho Pharmaceutical Co., Ltd. Method for preparing vitamin D compounds
JP2663294B2 (ja) * 1989-03-04 1997-10-15 メルシャン株式会社 ビタミンｄ類の製造方法
AU4357493A (en) * 1992-06-25 1994-01-24 Taisho Pharmaceutical Co., Ltd. Vitamin d hydroxylase gene
JP3589685B2 (ja) * 1993-11-02 2004-11-17 中外製薬株式会社 ステロイド類の２５位水酸化物の生物学的製造法
JPH07241197A (ja) * 1994-01-11 1995-09-19 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd ２５−ヒドロキシビタミンｄ類の製造法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH04356190A (ja) * 1990-05-08 1992-12-09 Taisho Pharmaceut Co Ltd ビタミンｄ類の製造方法
WO1997008336A1 (fr) * 1995-08-28 1997-03-06 Mercian Corporation Procede de production de cholesterols hydroxyles par conversion biologique et dihydroxycholesterols obtenus selon ce procede

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
SHEFER S, ET AL.: "A 25-HYDROXYLATION PATHWAY OF CHOLIC ACID BIOSYNTHESIS IN MAN AND RAT", JOURNAL OF CLINICAL INVESTIGATION, AMERICAN SOCIETY FOR CLINICAL INVESTIGATION, US, vol. 57, 1 April 1976 (1976-04-01), US, pages 897 - 903, XP002908925, ISSN: 0021-9738, DOI: 10.1172/JCI108366 *

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