WO1997036997A1 - Nouveau microorganisme convertissant l'acide biliaire et son procede de preparation - Google Patents

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WO1997036997A1
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Akio Okamura
Hiroyuki Matsui
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Tokyo Tanabe Company Limited
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    • C12P33/00—Preparation of steroids
    • C12P33/06—Hydroxylating
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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    • Y10S435/911—Microorganisms using fungi

Definitions

  • the present invention provides a method for converting 7-position unsubstituted bile acids to 3-, 7 / 3-dihydroxy-5-cholanic acid (hereinafter referred to as ursodeoxycholic acid) which is useful as a bile agent.
  • the present invention relates to a microorganism producing a bile acid having a 3-hydroxy group, and a method for producing ursodeoxycholic acid or a bile acid having a 73-hydroxy group which is an intermediate for producing the same using the microorganism.
  • ursocholic acid Using one or more microorganisms belonging to the genus (Pholiota) or the genus Fusarium, 3 ⁇ , 12 ⁇ -dihydroxy-5) 3-cholanic acid (hereinafter referred to as deoxycholic acid) ) To produce 3a, 7/3, 12 ⁇ -trihydroxy-5 / 3-cholanic acid (hereinafter referred to as ursocholic acid)
  • the substrate concentration had to be as low as about 0.02 to 0.1 v / w%. For this reason, there were technically significant problems, such as the need to increase the size of production facilities when performing industrial production.
  • An object of the present invention is to provide a method for producing bile acids having a 7; 3-hydroxyl group which is industrially useful, overcoming the drawbacks of the prior art that the substrate concentration is low.
  • the inventors conducted intensive research to achieve this object, and discovered a novel microorganism capable of converting bile acid to introduce a 73-hydroxyl group, and this microorganism has a higher substrate concentration, that is, a higher concentration than before.
  • the present inventors have found that a hydroxyl group is introduced at the 7/3 position of bile acid even at a high substrate concentration of 0.5 v / w% or more, and completed the present invention.
  • the present invention relates to Penicillium sp. TTUR 422 (hereinafter referred to as TTUR 422) and TTUR 422, which belong to the genus Benicillium and have the ability to introduce a 7 ⁇ -monohydroxyl group into a 7-position-unsubstituted bile acid. 7) A method for producing a bile acid having a 3-hydroxyl group, which comprises converting the compound into a bile acid having a 3-hydroxyl group by contacting with an acid.
  • deoxycholic acid can be used as an intermediate for the production of ursodeoxycholic acid, ursocholic acid and 12-ketoursodeoxycholic acid (12 -Keto-ursodeoxycholic acid), lithic acid is converted to ursodeoxycholic acid.
  • Chemical formula 1
  • the ursocholic acid obtained according to the present invention has a hydroxyl group at the 12-position by a chemical method using an oxidizing agent or a method using a microorganism (JP-A-5-111391). Oxidized and converted to 12-ketoursodeoxycholic acid.
  • ursodeoxycholic acid can be obtained in good yield by subjecting 12-ketoursodeoxycholic acid to Wof-Kishner reduction.
  • TTUR 422 Cultivate TTUR 422 in a nutrient medium, separate TTUR 422 from the medium by centrifugation, filter paper filtration, etc., and contact with a 7-position unsubstituted bile acid in an appropriate reaction solution to obtain 7 ⁇ —A method for converting bile acids having hydroxyl groups to obtain them.
  • TTUR 422 Immobilize TTUR 422 separated by the method of (2) using a carrier such as polyacrylamide or calcium alginate, and then contact with the reaction solution containing the unsubstituted bile acid at the 7-position. Then, it is converted to a bile acid having a 7 / 3-hydroxyl group, and a method of obtaining this.
  • a carrier such as polyacrylamide or calcium alginate
  • TTUR 422 is cultured in a nutrient medium until sporulation is formed.After collecting the spores, the spores are introduced into a reaction solution in which the 7-position unsubstituted bile acid is dissolved or suspended, and 7i3-hydroxyl group is removed. A method for converting bile acids into a bile acid. (5) After immobilizing the spores collected by the method of (4) in the same manner as in the cells of (3), the spores are brought into contact with a reaction solution in which bile acid at the 7-position is not present, and bile acid having a 7j3 monohydroxy group How to convert to and get this.
  • bile acid at the 7-position can be appropriately added in the culture step.
  • the reaction solution contains an organic substance as a source of energy such as glucose, other carbohydrates, casein hydrolyzate or yeast. It is desirable to add the extract at a low concentration.
  • the 7-position unsubstituted bile acids include, for example, lithocholic acid, deoxycholic acid, or 3-hydroxy-12-keto5) 3-cholanic acid (hereinafter, 12-keto-lithocholic acid). ) Etc.
  • the microorganism of the present invention has the ability to convert these substrate bile acids into bile acids having a 7 ⁇ -hydroxyl group, but does not exhibit the property of assimilating or decomposing the substrate bile acids.
  • the substrate concentration is more than Ov / w% and less than 5v / w% (0-5v / w%). It is preferably 0.5 v / w% or more and 3 v / w% or less (0.5 to 3 v / w%), and more preferably 0.5 v / w% or more lv / w% (0.5 to lv / w%). %).
  • TTUR 422 the growth form of the microorganism of the present invention, TTUR 422, in the medium is described as follows.
  • the growth on the Wapec agar medium was rather slow, and after culturing for 25 or 7 days, white wool colonies with a diameter of 2,0 to 2.5 cm were obtained. The back was white.
  • FIG. 1 shows a micrograph (400-fold magnification) of the growth form of TTUR422 when cultured for 1 week at 27 using tap water 11 (pH 6.5 to 7.0) at 27.
  • the conidiophores formed on the surface of the mycelium, and formed above the mycelium when a conidiophore bundle was formed. In addition, conidiophores usually diverged irregularly under the force of being a double wheel.
  • the number of metreia was two to three, measuring 5 to 7 x 1.5 to 2.5 m. There were three phialides per meter, the size was 8 to 11 X 1.0 to 2.0, and the tip was elongated, the bottom was thin, and the middle was a warped ampule. The spores were spindle-shaped and ranged in size from 3.0 to 4.0 XI. 2.0 to 2.0. No sexual generation was observed after long-term culture. Based on the above morphological characteristics, the isolated strain was identified as a strain belonging to the genus Benicillium. Furthermore, a classification method for the genus Penicillium in pits (John I. Pitt The Genus
  • the isolated strain was cultured in various media such as PDA, ISP No. 3, CYA (Czapexyeas autolysate agar: Pitt, 1973), and MEA (Malt extract agar), the neutrophil stalks within 7 days was formed.
  • Penicillium * clabiforme (Penici llium clavi forme), Penicillium isarifuorume ⁇ en icillium i sar iif orme, and Penicillium tuclaukie (Penici 1) Hum duclauxi i). The following results were obtained by comparison with these.
  • TTUR 4 2 2 The conidiophore bundle of TTUR 4 2 2 formed was a conidia bunion closer to Isarifolme or Duklauky's cinema than Cholemia of Krabiforme.
  • the size of the colonies generally showed a value close to Duclauky.
  • the color of conidia of TTUR 422 was pale pink (No. 50) and pale yellowish ash in various media.
  • the color of conidia of Krabi Folme, Isarif Olme and Duclauky is Oribe Green (No.128), Ashy Yellow Green (No.130), Nibu Yellow Green (No.135), Yellow Brown (No.101), etc. Tended to exhibit a dark color.
  • TTUR 422's PenicillH (broom) has a characteristic form in which flowers are formed as if they are open, and a large number of curved ampoule-shaped phialides are radially formed.
  • Beni Siri of Krabi Folme, Isarif Folme and Duclauky formed toward the tip, and no phialide morphology characteristic of TTUR 422 was observed.
  • the conidia of TTUR 422 were thinner and elliptical than the conidia of Krabi, Rume, Isarif Olme, and Duclauky.
  • TTUR 422 has properties that are partially different from Therefore, it was found that this is a new species belonging to the genus Penicillium and forming a conidiophore bundle.
  • Optimal growth pH is 5-6, optimal growth temperature is 25-27 ° C
  • the conversion capacity test medium was prepared at pH 7.5, containing 24 g of potato dextrose broth, 5 g of yeast extract, and 5 g of sodium deoxycholate as a conversion substrate in deionized water 11. It was used.
  • FIG. 1 is a micrograph showing the morphology of TTUR 422. BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
  • 2.5N liquid medium adjusted to pH 7.5 with 4N—NaOH 10 g of Ducose, 11 g of Essan Meat (soy protein, Ajinomoto Co., Ltd.), 20 g of water extract, 1 g of Extract 1) 0 g and 10 g of deoxycholic acid (containing a substrate concentration of lv / w%) were charged into a 51-volume fermentation tank.
  • the culture solution from which the cells had been removed by centrifugation was adjusted to pH 3 with hydrochloric acid, and then extracted three times with twice the volume of ethyl acetate.
  • the ethyl acetate layer was washed several times with water, dried over anhydrous sodium sulfate, and distilled off under reduced pressure to obtain 24.5 g of crystals.
  • the lg in this was adsorbed on a column filled with 95 g of silica gel (FL 60D, manufactured by Fuji Silicon Chemical Co., Ltd.) (diameter: 2.2011, height: 70011), and the eluent consisting of the following mixed solvent was used sequentially. To elute fractions.
  • the fact that the conversion products are ursocholic acid and 12-ketoursodeoxycholic acid means that both standard materials of ursocholic acid and 12-ketoursodeoxycholic acid and TLC analysis of the conversion products were used. The results were confirmed by the coincidence of the Rf value, retention time of HP LC analysis, NMR spectrum and mass spectrometry.
  • Example 1 conversion was performed using the same strain and the same medium except for using 12-ketotolic acid instead of the substrate deoxycholic acid (substrate concentration; lv / w%). 24.6 g were obtained.
  • the composition ratio of 12-ketoursodeoxycholic acid in the conversion product was 43.9%.
  • Example 1 The same strain and the same medium as in Example 1 except that lithocholic acid was used in place of the substrate deoxycholic acid and the amount added per 1 g was 5 g (substrate concentration: 0.5 v / w%). Conversion was performed using to obtain 24.7 g of a conversion product.
  • the composition of ursodeoxycholic acid in the conversion product was 5.1% when analyzed by HPLC under the following conditions.
  • the fact that the conversion product is ursodeoxycholic acid means that the Rs value of TLC analysis of the standard substance of ursodeoxycholic acid and the conversion product, the retention time of HP LC analysis, NMR spectrum and mass spectrometry Confirmed by matching values.
  • Ursodeoxycholic acid standard substance Z
  • Example 3 0.38 / 0.38 developing solvent 2;
  • Ursodeoxycholic acid standard substance Z Example 32 0.24 / 0.42
  • the microorganism according to the present invention introduces a hydroxyl group at the 7) -third position of bile acid at a higher substrate concentration than conventional microorganisms. 3 ⁇ , 7; 3-dihydroxy-5 / 3-cholanic acid or a production intermediate thereof useful as an agent can be efficiently produced.

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Description

明細書 新規な胆汁酸変換微生物及び胆汁酸の製造法 技術分野
本発明は、 7位無置換胆汁酸から、 利胆剤として有用な 3 ひ， 7 /3—ジヒドロ キシ— 5 —コラン酸 （以下、 ウルソデォキシコール酸 （Ursodeoxychol ic acid) という。 ） 等の 7 ;3—水酸基を有する胆汁酸を生産する微生物及び当該微 生物を利用してウルソデォキシコール酸またはその製造中間体である 7 3—水酸 基を有する胆汁酸を製造する方法に関する。 背景技術
微生物変換を利用して 7位無置換胆汁酸に 7 β 水酸基を導入する方法に関し ては、
1 ) プルロウタス （Pleurotus) 属、 コリオラス （Coriolus) 属、 ダエダレオプ シス （Daedaleopsis) 属、 パナェォラス （Panaeolus) 属、 マラスミウス (Marasmius) 厲、 クリニベリス （Cr i pe l l i s) 属、 フォリオ夕
(Pholiota) 属またはフサリウム （Fusarium) 属に属する微生物のうちの 1 種またはそれ以上を用い、 3 α, 1 2 α—ジヒドロキシ— 5 )3—コラン酸 (以下、 デォキシコール酸 （Deoxychol ic acid) という。 ） から 3 a， 7 /3， 1 2 α—トリヒドロキシ— 5 /3—コラン酸 （以下、 ウルソコール酸 (Ursocholic acid) という。 ） を製造する方法
(特公平 1一 3 4 0 3 8号公報）
2 ) フサリウム属に属する微生物を用い、 3 ひ —ヒドロキシー 5 ;3—コラン酸 (以下、 リ トコール酸 （Lithocholic acid) という。 ） からウルソデォキシ コール酸を製造する方法 （特公平 3— 2 9 3 9 7号公報）
3 ) モルティエレラ （Mortierella) 属に属する微生物を用い、 抱合型リ トコ一 ル酸から抱合型ウルソデォキシコール酸を製造する方法 (特公平 5— 2 94 3 8号公報）
が知られている。
しかしながら、 これらの微生物を用いて 7 0—水酸基を導入する場合は、 基質 濃度はいずれも 0. 0 2〜0. 1 v/w%程度と低くしなければならなかった。 そ のため、 工業的生産を行う場合には生産設備等を巨大なものとしなければならな い等、 技術的に大きな問題点を抱えていた。
一方、 1 3—水酸基及び 1 5 /3—水酸基を導入する胆汁酸変換能を有するベニ シリウム属 （Penici 11 ium) の微生物は知られている （Journal of Lipid Research, vol.22, p.1225(1980) 力 7 3—水酸基を導入する胆汁酸変換能を 有するぺニシリウム属の微生物は知られていない。 発明の開示
この発明の目的は、 基質濃度が低いという従来技術の欠点を克服し、 工業的に 有用な 7 ;3—水酸基を有する胆汁酸の製造方法を提供することにある。 発明者ら はこの目的を達成すべく鋭意研究を行い、 7 3—水酸基を導入する胆汁酸変換能 を有する新規な微生物を発見し、 この微生物がこれまでよりも高い基質濃度、 す なわち、 基質濃度 0. 5v/w%以上の高濃度でも胆汁酸の 7 /3位に水酸基を導入 することを知り本発明を完成した。
本発明は、 ベニシリゥム属に属し 7位無置換胆汁酸に 7 β一水酸基を導入する 能力を有する Penicillium sp. TTUR 422 (以下、 TTUR 42 2という。 ） 及び TTUR 4 2 2を 7位無置換胆汁酸と接触させることにより、 7 )3—水酸 基を有する胆汁酸に変換させることを特徴とする、 7 3—水酸基を有する胆汁酸 の製造方法である。 すなわち、 化学式 1に示すように TTUR 4 2 2をデォキ シコール酸またはリ 卜コール酸と接触させることで、 デォキシコール酸はウルソ デォキシコール酸の製造中間体であるウルソコール酸及び 1 2—ケトウルソデォ キシコール酸 （12- Keto- ursodeoxychol ic acid) , リ トコ一ル酸はウルソデォキ シコール酸に変換される。 化学式 1
Figure imgf000005_0001
Deoxycholic acid
Figure imgf000005_0002
Ursocholic acid 12-Keto- ursodeoxycholic acid
Figure imgf000005_0003
し ithocholic asid Ursodeoxycholic acid
本発明により得られたウルソコール酸は、 酸化剤を用いた化学的な方法または 微生物を用いた方法 （特開平 5— 1 1 1 3 9 1号公報） により、 その 1 2位の水 酸基が酸化され 1 2—ケトウルソデォキシコール酸に変換される。
次いで、 1 2—ケトウルソデォキシコール酸を Wo f -K i shner還元に付すこと により、 ウルソデォキシコール酸が収率良く得られる。
化学式 2
acid
Figure imgf000005_0004
- eto-ursodeoxycholic acid Ursodeoxycholic acid
差替え用紙（規則 26) 具体例を以下に示すが、 本発明製造方法はこれらに限定されるものではない。
( 1 ) 7位無置換胆汁酸の存在する培地において TTUR 422を培養し、 7 β—水酸基を有する胆汁酸に変換させ、 これを取得する方法。
(2) TTUR 422を栄養培地において培養し、 培地から遠心分離、 濾紙濾 過等により TTUR 42 2を分離後、 適当な反応液中で、 7位無置換胆 汁酸と接触させて、 7 β—水酸基を有する胆汁酸に変換させ、 これを取得 する方法。
(3) (2) の方法により分離した TTUR 42 2をポリアクリルアミ ドまた はカルシュゥムアルギネー卜等の担体を用いて固定化後、 7位無置換胆汁 酸が存在する反応液と接触させて、 7 /3—水酸基を有する胆汁酸に変換さ せ、 これを取得する方法。
(4) TTUR 422を栄養培地において、 胞子形成に至るまで培養し、 この 胞子を採取後、 7位無置換胆汁酸が溶解または懸濁している反応液中に投 入し、 7 i3—水酸基を有する胆汁酸に変換させ、 これを取得する方法。 (5) (4) の方法で採取した胞子を （3) の菌体と同様に固定化後、 7位無置 換胆汁酸が存在する反応液と接触させて 7 j3一水酸基を有する胆汁酸に変 換させ、 これを取得する方法。
なお、 （ 1 ) の方法では培養工程において、 7位無置換胆汁酸を適宜、 添加す ることができる。
さらに、 上記 （2) 、 （3) 、 （4) 及び （5) の方法では、 反応液中にエネ ルギ一源としての有機物質、 例えば、 ブドウ糖、 その他の炭水化物、 カゼイン加 水分解物または酵母エキスを低濃度に添加することが望ましい。
7位無置換胆汁酸は、 例えば、 リ 卜コール酸、 デォキシコール酸または 3ひ — ヒ ドロキシ— 1 2—ケトー 5 )3—コラン酸 （以下、 1 2—ケトリ トコール酸 (12-Keto-lithocholic acid) という。 ） 等である。 本発明の微生物はこれらの 基質胆汁酸を 7 β -水酸基を有する胆汁酸へ変換する能力を有するが、 基質胆汁 酸を資化または分解する性質を示さない。
また、 基質濃度については Ov/w%を超え 5v/w%以下 （0〜 5v/w%) であり、 好ましくは 0. 5v/w%以上 3v/w%以下 （0. 5〜3v/w%) であり、 より好ま しくは 0. 5v/w%以上 lv/w% (0. 5〜 lv/w%) である。
次に、 本発明の微生物である TTUR 422の培地における生育形態を説明 すれば以下の通りである。
( 1 ) 各種培地における生育形態
TTUR 422をオートミール寒天培地 （ISP培地 No.3) で 2 5 、 7日間 培養すると、 直径は 2. 5〜3. 5 c mの白色羊毛状集落となり、 同心円状に高 さ l〜5mmの分生子柄束 （シンネマ （Synnema：柄部を覆うように胞子を形成） またはコレミア （Coremia：胞子のない柄部と胞子を形成するコンパク 卜な楕円 形の頭頂部を特徴とする） 様構造物） が形成された。 分生子は黄味灰 （日本色彩 社の Today's col or/300の No.68) であった。 また、 所々に、 黄味赤 （日本色彩社 の Today's color/300の No.15) 分泌物が観察された。 裏面は培地の色のみが確認 された。
ッァペック寒天培地上での生育はやや遅く 25 、 7日間培養すると、 直径は 2, 0〜2. 5 c mの白色羊毛状集落となった。 裏面は白色であった。
(2) 形態的特徴
三浦培地 （ブドウ糖 l g、 リン酸二水素カリウム l g、 硫酸マグネシウム (7水塩） 0. 2 g、 塩化カリウム 0. 2 g、 硝酸ナトリウム 2. 0 g、 酵母エキス 0. 2 g、 寒天 1 3 g、 水道水 1 1 pH 6. 5〜 7. 0) を 用いて 27でで 1週間培養したときの TTUR 422の生育形態の顕微鏡写真 (倍率 400倍） を第 1図に示した。 分生子柄は菌糸表面に形成され、 分生子柄 束が形成されるときは菌糸上部に形成された。 また分生子柄は通常、 複輪生であ る力 時に不規則に分岐した。 メ トレ （metuia) は 2〜 3本で、 5〜 7 X 1. 5 〜2. 5 mの大きさであった。 フィアライ ド （phial ide) はメ トレ当たり 3個 あり、 大きさは 8〜 1 1 X 1. 0〜 2. 0 で先端は細長く、 下端も細く中間 は反ったアンプル形をしていた。 胞子は紡錘形で、 その大きさは 3. 0〜4. 0 X I . 0〜2. 0 であった。 長期培養をしても有性世代は観察されなかった。 以上の形態的特徴から分離菌株はべニシリゥム属に属する菌株と同定された。 さらに、 ピッ トのぺニシリウム属の分類法 （John I. Pi t t The Genus
Pen i c i 11 i um and i t s Te 1 emorph i c States Eupen i c i 11 i m and Ta 1 ar omyces： Academic Press, London, New York, Toronto, Sydney, San Franc i sco (1979) ) を参照し、 TTUR 42 2の同定を試みた。 分離菌株を P DA、 I S P No.3、 C Y A (Czapek yeas t autolysate agar :Pi t t, 1973) 及び ME A (Mal t extract agar) 等の各種培地で培養したところ、 7日間以内に分性子柄束が形成 された。 このような形態を示すぺニシリウム属の種として、 ぺニシリウム * クラ ビフオルメ （Penici ll ium clavi forme) 、 ぺニシリウム · ィサリフオルメ ^en i c i l l ium i sar i i f orme) 及ひぺニシリ ウム · テュク ラウキー (Penici 1 Hum duclauxi i) の 3種がある。 これらとの比較を行ったところ、 以 下の結果が得られた。
1 ) 形成される TTUR 4 2 2の分生子柄束はクラビフオルメのコレミアより、 ィサリフオルメまたはデュクラウキーのシンネマに近い分生子柄束であった
2 ) 各菌種のコロニーの大きさを比較すると以下の通りである。
I ： CYA培地
2 5°Cで培養したとき、 TTUR 4 2 2のコロニーの大きさは、 ィサリ フオルメ及びクラビフオルメより小さく、 デュクラウキーより大きかった 5 :ではクラビフオルメは数 mmの大きさに生育したが、 TTUR 4 2 2、 ィサリフオルメ及びデュクラウキーはいずれも、 殆ど生育しなかった 3 0 tではいずれも生育しなかった
Π ： G 2 5 N培地 （25% glycerol nitrate agar:Pi tt, 1973)
2 5でで培養したとき、 クラビフオルメは直径 1 Ommを越える大きさに なったが TTUR 4 2 2、 ィサリフオルメ及びデュクラウキ一はいずれ も数 mmにとどまった
ΙΠ ： ME A培地
ィサリフオルメが他のものより大きくなつた。
コロニーの大きさは総じてデュクラウキーに近い値を示した。
3) 形成するコロニーは培地の種類により多様な形態を示すが、 分生子の色は表 1のような違いが認められた。 表 1 各種培地における分生子の色
ISP No.3 CYA MEA
— , —— ——
TTUR 422 ピンク白 ピンク白、 黄味灰 ピンク白
(No.50) (No.50) 、 (No.68) (No.104)
クラビフオルメ オリ一ブ緑 うす黄茶 灰味黄緑
ATCC48945 (No.128) (No.94) (No.130)
ィサリフオルメ にふ ' 1¾ 黄味白 濃い黄
ATCC48951 (No.135) (No.106) (No.108)
デュクラウキー 黄茶 ォリーブ緑 黄味赤、 ォリーブ緑
ATCC9121 (No.101) (No.128) (No.15)、 (Nol28)
TTUR 422の分生子の色は各種培地でピンク白 （No.50) 及び黄味灰の 淡い色であった。 しかしクラビフオルメ、 ィサリフオルメ及びデュクラウキーの 分生子の色はオリ一ブ緑 （No.128) 、 灰味黄緑 （No.130) 、 にぶ黄緑 （No.135) 、 黄茶 （No.101) 等の濃い色を呈する傾向にあった。
4) 顕微鏡による形態
TTUR 422のべニシリ （PenicilH :箒状体） は、 第 1図に示した通り 花が開いたように形成され、 湾曲したアンプル状のフィアラィ ドが放射状に多数 形成される特徴的な形態を示した。 これに対し、 クラビフオルメ、 ィサリフオル メ及びデュクラウキーのベニシリは先端に向かって形成され、 TTUR 422 に特徴的なフィアライ ドの形態は観察されなかった。 また、 TTUR 422の 分生子はクラビフ才ルメ、 ィサリフオルメ及びデュクラウキーの分生子より細い 楕円形をしていた。
以上のように、 TTUR 422はいずれのものとも一部異なる性質を有して いたことから、 ぺニシリウム属に属し分生子柄束を形成する新たな種であること が判明した。
そこでこの菌株を Penicillium sp. TTUR 422 として、 平成 8年 2月 22日, あて名 ： 日本国茨城県つくば市東 1丁目 1番 3号 （郵便番号 30 5) 、 名称：通 商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託した （受託番号 F ERM B P - 54 10 ) 。
そして、 かかる TTUR 422の生理学的性質は以下の通りである。
( 1 ) 最適生育条件 （pH、 温度）
最適生育 pHは 5〜6、 最適生育温度は 2 5〜 2 7°C
(2) 生育の範囲 （pH、 温度）
PHの範囲は 3〜9、 温度の範囲は 5〜29 :
(3) その他の顕著な特徴
1 ) 培養 7 日間以内に分生子柄束を形成する
2) 液体培養で酵母様増殖をする
続いて、 TTUR 4 2 2の採取経路を説明する。 関東各地の土壌から 5v/w%のコール酸ナトリウムを添加した P D A平板培地に生育する力ビを単離 した。 5 m 1の変換能試験用培地を含む中型試験管 （ 1 8 Φ X 1 80 mm) に 1 株ずつ接種し、 2 8 で 7日間振盪培養した。 培養終了後、 培養液をウルソコー ル酸の標準物質と比較するため、 薄層クロマトグラフィ一による定性分析を行い, デォキシコール酸からウルソコール酸への変換能を有する菌株をスクリーニング した。
なお、 変換能試験用培地は脱イオン水 1 1中、 ポテトデキストロースブロス 24 g、 ィーストエキス 5 g及び変換反応基質としてデォキシコール酸ナ卜リウ ム 5 gを含有し、 pH 7. 5に調製されたものを使用した。
以上の結果、 デォキシコール酸からウルソコール酸への最も良好な変換能を有 する菌株として、 1 993年 8月 9日に埼玉県北本市で採取した土壌から分離さ れた TTUR 422を得た。 図面の簡単な説明
第 1図は TTUR 422の形態を示す顕微鏡写真である。 発明を実施するための形態
次に、 本発明の例を実施例をもって示すが、 これらは本発明を限定するもので はない。 ぐ実施例 1 >
4N— N aOHでpH7. 5とした 2. 5 1の液体培地 （水 1 1 に対し、 ダル コース 1 0 g、 エスサンミー卜特等 （大豆蛋白、 味の素 （株） 製） 20 g、 ィ一 ストエキス 1 0 g及びデォキシコール酸 1 0 g (基質濃度： lv/w%) を含有） を 5 1容量の醚酵槽に投入した。 予めポテトエキス 0. 4 %、 グルコース 2 %、 イーストエキス 0. 5 %からなる培地を用いて、 2 7 :にて 2日間振盪培養して おいた TTUR 422の培養液 25m 1を上記醱酵槽の液体培地に接種し、 培 養温度 27 ：、 pH 7. 5に調整しながら攪拌速度 300 r pm、 通気量 2. 5 1 分で 7日間、 好気的に培養した。
培養終了後、 遠心分離にて菌体を除去した培養液を塩酸で pH 3に調整してか ら、 2倍量の酢酸ェチルで 3回抽出した。 この酢酸ェチル層を数回水洗した後、 無水硫酸ナトリウムで乾燥後、 減圧下にて酢酸ェチルを留去し、 結晶 24. 5 g を得た。 この中の l gをシリカゲル （FL 60D、 富士シリシァ化学 （株） 製） 95 g (直径 2. 2011 高さ 70011) をつめたカラムに吸着させ、 下記の混合溶 媒からなる溶離液を順次使用して溶出分画した。 TL C分析で 1 2—ケ卜ウルソ デォキシコール酸及びウルソコール酸に相当するスポッ トのみ与える画分をそれ ぞれ集め溶媒を留去し、 12—ケトウルソデォキシコール酸 36 7 mg及びウル ソコール酸 88m gの結晶を取得した。
(溶離液）
1 ) クロロホルム ： ァセトン ： 酢酸- 8 : 2 : 0. 3 500 m l
2 ) クロロホルム ： ァセトン ：酢酸 = 7 : 2 : 0. 5 600 m l 3) クロ口ホルム ： アセトン ： 酢酸 = 7 9 600 m l
4) クロ口ホルム ： アセトン ：酢酸 = 3 1 600 m l
5) クロ口ホルム ： アセトン ：酢酸 = 1 1 60 0 m l
なお、 変換生成物がウルソコール酸及び 1 2—ケトウルソデォキシコール酸で あることは、 ウルソコール酸及び 1 2—ケトウルソデォキシコール酸の両標準物 質と変換生成物の TL C分析の R f 値、 HP LC分析の保持時間、 NMRスぺク トル及び質量分析値が一致したことにより確認された。
TL C分析条件及びその R f 値
担体； K i e s e 1 g e 1 60 (0. 25 mm厚、 メルク社製） 展開溶媒 1 ； クロ口ホルム ： アセトン ：酢酸 = 7 ： 2 ： 1 (体積比） 展開溶媒 2 ； ベンゼン ： イソプロパノール ：酢酸 = 40 ： 1 0 ： 1 (体積比） 発色； リンモリブデン酸一硫酸試薬 （リンモリブデン酸 1 gをメタノール
20m l に溶解し、 濃硫酸 1 m 1 を添加したもの） を噴霧し、 胆汁酸ス ポッ 卜が濃青色となるまで加熱発色させる。
R ί値
展開溶媒 1 ： ウルソコール酸 ：標準物質/実施例 1 = 0. 1 4/0. 14 展開溶媒 1 ： 1 2—ケトウルソデォキシコール酸 ：標準物質ノ実施例 1
= 0. 25/0. 25 展開溶媒 2 ： ウルソコ一ル酸 ：標準物質/実施例 1 = 0. 24/0. 24 展開溶媒 2 ： 1 2—ケトウルソデォキシコール酸 ：標準物質/実施例 1
= 0. 38/0. 38
HP L C分析条件及びその保持時間
カラム ； イナ一トシル OD Sカラム （カラムサイズ 4. 6 φ X 2 50 mm) 検出 ；示差屈折法
移動相 ； 0. 0 3M N a2HP〇4爱衝液 （H3P〇4で pH 3に調整） ： ァセ卜二トリル： メタノール = 3 7 : 30 : 40 移動相流速； 1 m 1ノ分
保持時間 ； ウルソコール酸：標準物質ノ実施例 1 = 8. 0分 Z8. 0分 1 2—ケトウルソデォキシコール酸：標準物質 Z実施例 1
= 6. 1分 6 1分
'H— NMRスペク トル （DMS0- d6, ppm)
1 2—ケ卜ウルソデォキシコール酸
0. 7 7 (3H, d, 6.1Hz) , 0. 9 9 (6H, s) 3. 3 2 (2H, s) , 4 1 3 (1H, d, J=6.7Hz) , 4. 44 (1H, d, J=4.9Hz) 1 1. 9 3 (1H, s) ウルソコール酸
0. 60 (3H, d, 6.1Hz) ， 0. 8 5 (3H, s) 0. 9 2 (3H, s) , 3. 3 3 (2H, br) ， 3. 7 6 (1H, s) , 3. 82 (1H, d, J=6.7Hz) , 4. 1 8 (1H, d, J = 3.7Hz) , 4. 4 6 (1H, d, J = 4.3Hz) , 1 1. 94 (1H, s) 質量分析値 （L CZMS、 AP C Iモード、 MH+)
AP C I (m/z ) ： ウルソコール酸：標準物質ノ実施例 1 = 40 9 /4 0 9
1 2—ケトウルソデォキシコール酸：標準物質 実施例 1
= 40 7 X4 0 7 分子量； ウルソコール酸：標準物質 Z実施例 1 = 4 0 8 /40 8
1 2—ケトウルソデォキシコール酸：標準物質 Z実施例 1
= 4 0 6/4 0 6 <実施例 2〉
実施例 1において、 基質デォキシコール酸の代わりに、 1 2—ケトリ トコ一ル 酸を用いた （基質濃度； l v/w%) 他は、 同じ菌株及び同じ培地を用いて、 変換 を行い、 変換生成物を 24. 6 g得た。 実施例 1に記載された条件で HP L C分 析を行ったところ変換生成物中の 1 2—ケトウルソデォキシコール酸の組成比は 4 3. 9 %であった。
変換生成物中の 1 gを実施例 1と同様にシリカゲルカラムクロマトグラフィー を行った。 その結果、 HP L C分析で 9 7. 6 %の純度を示す 1 2—ケトウルソ デォキシコ一ル酸 3 9 5 mgを取得した。 なお、 変換生成物が 1 2—ケトウルソデォキシコール酸であることは 1 2—ケ トウルソデォキシコール酸の標準物質と変換生成物の T L C分析の R f 値、 H P L C分析の保持時間、 NMRスぺクトル及び質量分析値が実施例 1中の値と 一致したことにより確認された。 ぐ実施例 3 >
実施例 1において、 基質デォキシコール酸の代わりに、 リ トコール酸を用い、 その 1 1当たりの添加量を 5 g (基質濃度； 0. 5v/w%) とした他は、 同じ菌 株及び同じ培地を用いて変換を行い、 変換生成物を 24. 7 g得た。 下記に示す 条件で H P L C分析を行ったところ変換生成物中のウルソデォキシコール酸の組 成比は 5. 1 %であった。
変換生成物中の 1 gを実施例 1と同様にシリカゲルカラムクロマ卜グラフィー を行った。 その結果、 HP L C分析で 9 7. 6 %の純度を示すウルソデォキシコ —ル酸 46 mgを取得した。
なお、 変換生成物がウルソデォキシコール酸であることはウルソデォキシコ一 ル酸の標準物質と変換生成物の TL C分析の R f 値、 HP L C分析の保持時間、 NMRスぺクトル及び質量分析値が一致したことにより確認された。
TL C分析条件及びその R f 値
分析条件 ； 実施例 1に同じ
R it
展開溶媒 1 ；
ウルソデォキシコール酸：標準物質 Z実施例 3 = 0. 38/0. 38 展開溶媒 2 ；
ウルソデォキシコール酸：標準物質 Z実施例 3二 0. 42/0. 42
H P L C分析条件及びその保持時間
分析条件 ； 実施例 1に同じ
保持時間 ； ウルソデォキシコール酸 ：標準物質/実施例 3 = 1 8. 5分 Z 1 8. 5分
'H— NMRスペク トル （DMSO- d6， ppm)
0. 6 2 (3H， s) ， 0. 8 7 (3H， s) ， 0. 8 9 (3H, s) ， 3. 3 3 (2H, s) ， 3. 8 7 (1H, d, J = 6.7Hz) , 4. 4 3 (1H, d, J = 4.3Hz) , 1 1. 9 3 (1H, s) 質量分析値 （LCZMS、 APC Iモード、 MH+)
AP C I (m/ z ) ；
ウルソデォキシコール酸：標準物質 実施例 4 = 3 9 3 /3 9 3
分子量； ウルソデォキシコール酸：標準物質 実施例 3 = 3 9 2ノ 3 9 2 産業上の利用可能性
以上のように、 本発明にかかる微生物は、 従来の微生物に比較して高い基質濃 度で胆汁酸の 7 )3位に水酸基を導入するものであり、 当該微生物を利用すること で、 利胆剤として有用な 3 α， 7 ;3—ジヒドロキシー 5 /3—コラン酸またはその 製造中間体を効率よく製造することができる。

Claims

請求の範囲
1. ベニシリゥム属に属し 7位無置換胆汁酸に 7 β—水酸基を導入する能力を 有する Penicillium sp. TTUR 422。
2. 7位無置換胆汁酸が、 デォキシコール酸、 1 2—ケトリ トコール酸または リ トコール酸である請求項 1記載の Penicillium sp. TTUR 422。
3. ぺニシリゥム属に属し 7位無置換胆汁酸に 7 j3—水酸基を導入する能力を 有する微生物を、 7位無置換胆汁酸と接触させることにより、 7 /3—水酸 基を有する胆汁酸に変換させることを特徴とする、 7 β一水酸基を有する 胆汁酸の製造方法。
4. 7位無置換胆汁酸が、 デォキシコール酸、 1 2 _ケトリ トコール酸または リ トコール酸である請求項 3記載の製造方法。
5. 微生物と接触させる際、 7位無置換胆汁酸濃度が 0〜5v/w%である請求 項 3または 4記載の製造方法。
6. 微生物と接触させる際、 7位無置換胆汁酸濃度が 0. 5〜3v/w%である 請求項 3、 4または 5記載の製造方法。
7. 微生物と接触させる際、 7位無置換胆汁酸濃度が 0. 5〜 lv/w%である 請求項 3、 4、 5または 6記載の製造方法。
8. ベニシリゥム厲に属し 7位無置換胆汁酸に 7 β—水酸基を導入する能力を 有する微生物が Penicillium sp. TTUR 422 である請求項 3、 4、 5、 6ま たは 7の製造方法。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS58155098A (ja) * 1982-03-09 1983-09-14 Yakult Honsha Co Ltd 微生物によるウルソデオキシコ−ル酸の製造法
JPS59159795A (ja) * 1983-03-04 1984-09-10 Yakult Honsha Co Ltd 微生物変換による抱合型ウルソデオキシコ−ル酸の製造方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
J. LIPID RES., Vol. 22, (1981), CALSTROEM K. et al., "Microbial Synthesis of 1beta- and 15beta-hydroxylated Bile Acids", pages 1225-1234. *
J. STEROID BIOCHEM., Vol. 14, (1981), JOANNOU G.E., "Identification of 15beta-Hydroxylated C21 Steroids in the Neo-Natal Period: the Role of 3alpha, 15beta, 17alpha-Trihydroxy-5beta-perinatal Diagnosis of Congenital Adrenal Hyperplasia (CAH) Due to a 21-Hydroxylase Deficiency", pages 901-912. *

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