WO1997036911A1

WO1997036911A1 - Procede de production de tissus durs dissous et tissus durs ainsi dissous

Info

Publication number: WO1997036911A1
Application number: PCT/JP1997/001074
Authority: WO
Inventors: Toshio Taira; Takayuki Watanabe; Makoto Abe; Mariko Tazaki; Anjun Liu; Mitsuko Okamura
Original assignee: Sangi Co., Ltd.
Priority date: 1996-03-29
Filing date: 1997-03-28
Publication date: 1997-10-09
Also published as: AU2044097A

Description

明細書

硬組織溶解物の fSig方法及び ΰ&ΰϋ溶解物産業上の利用分野

本発明は、硬組繳溶解物（特に、人体に摂取可能な機能性食品、飼料、医薬品又は化粧品等の主成分として好適な材料）の！?造方法及び硬 an 溶解物に関するものである。

従来の技術

骨粗鬆症等の骨疾病に対する補耠食として、カルシウムを主成分とする各種の機能性食品が市販されている。

これらの機能性食品は、現在のところ、炭酸カルシウム、乳酸カルシゥム、リン酸カルシウムなどから作成されるもの、或いは、牛骨粉、卵殻、魚骨粉などから作成されるもの（天然の骨由来のカルシウム）が主である。

ところで、生体内に吸収されるカルシウム成分の性状と、生体内における分解吸収との相閻は未だ研究の余地を残しているものの、 Η»:的に言えば、カルシゥム塩の単純摂取に比べて天然の骨由来のカルシウムの摂取は、骨疾病の回復という点で格段に優れているものと考えられる。従来から市販されている天然カルシウム食品、例えば牛骨粉や魚骨粉等は、粉砕によって顆粒状にしたものである。

そして、カルシウム成分を効率よく吸収させるために、動物骨を酸性溶液で Ι¾Κするという技術が提案されている（特開平 4一 1 6 1 6 5号公報） ο

この公知技術は、基本的には、粉砕した骨粉を塩酸、酸、確酸等の無機酸又は、酢酸等の有機酸の水溶液を用いて顺している。この J½K処理で得られた酸可溶性面分や、この面分に更に酵素を作用させ、加水分解して得られた水可溶性画分、これらの面分から透析によつて骨由来のカルシゥム塩を除去した面分に可溶性力ルシゥムを添加したものは、カルシウム吸収補助剤又はカルシウム補給荊として使用可能であることが提案されている。

これを具体的に説明すると、前記した無機酸又は有微を含有する p

H 2〜 3の水溶液に粉砕した骨を懸海させ、 3 0分〜数時間浸拌して脱灰した後、蛋白分解酵素（例えばペプシン〉を添加して酵素分解し、得られた分子量 3 0 0 0 D a〜 6万 D aの酸可溶性面分又は水溶性面分をカルシウム吸収補助剤として用いるか、或いは、これらの面分を|¾¾してべプチドと蛋白質との混合物からなる面分とし、これに可溶性カルシゥムとして乳酸カルシウム、炭酸カルシウムを添加して、カルシウム補給剤とするものである。

他方、動物骨はカルシウムだけでなく、ペプチドやポリペプチドを含むコラーゲン蛋白、アミノ酸やプリテオグリカン、微理活性元素等の生理活性物質を含有している。

カルシゥム以外のこれらの物質も、生体内にぉ、て重要な機能を発揮する生理活性（ホルモンバランスや腸内細菌の活性）の調整を促進するという面から、骨疾病に対する補給剤として望ましいことが知られている。特に、近年発見された BMP (骨形成蛋白質： Bone Morphogenetic Protein) や B S P - I I (骨シァロ蛋白質： Bone Sialo Protein II)等の蛋白質は骨形成に深く閩係することが解明されており、医薬品としての利用が検討されている。

しかしながら、上記した公知技術では、骨成分を塩酸等の強酸を使用して IB^すると、 Ι½Κ生成物中には生理活性の低い成分しか残らないことが多い。また、その他の酸を用いて脱灰処理しても、十分に硬組 »を溶解させることはできない。

発明の目的

本発明の目的は、骨組 «等の硬組 »が本来的に有する有効な成分を変性させることなく、十分かつ短時間に溶解することができる、骨疾病等に優れた効果を示す硬組織溶解物の製造方法、及びこの方法によつて得られる硬組維溶解物をすることにある。

発明の構成

即ち、本発明は、硬組織と酸とを混合する工程と、この «合物を溶解させる工程と、この溶解液中の残渣を溶解処理する工程とを有する、硬組雜溶解物の製造方法に係るものである。

ここで、上記の Γ硬腿」とは、哺乳類、鳥類及び魚類の骨及び骨 «、軟骨、歯、貝化石や龍骨等の化石類、貝殻、甲殻類外毅、卵般又は等の如く、カルシウム、蛋白質、多糖類、他の微量元素を含む生物の組維の総称を主として意味する。

本発明の製造方法において、上記の混合物の溶解方法として、硬組繳と酸との混合物を減圧下（例えば真空下）で溶解させることができる。この溶解温度は 0〜3 0でとするのがよい。

特に、粉砕した硬組維と可食性の酸とを混合し、滅圧下において溶解する。硬組維ば哺乳類、鳥類又は魚類の骨を主とするが、それらの骨 «t や歯、又は貝殻、甲殻類外殻、珊瑚を使用することができる。可食性の酸としては、乳酸を使用することが望ましいが、その他の有機酸（弱酸がよい。）も使用できる。これには、クェン酸、リンコハク酸、酢酸、ァスコルビン酸、酒石酸、リン酸、フマル酸、ダルコン酸、アジピン酸、ギ酸等がある。このようにして、上記混合物が可溶化された硬組織を得るには、 WS. 繳を溶解剤としての可食性の酸の溶液（酸性溶液）と «合（浸浪、溶懸衝）し、減圧下で携拌して溶解することがよい。

即ち、減圧状態、例えば真空状態で上記混合物（合液〉を浸拌したときには、骨粉中の微小空隙内の空気が脱気され、酸性溶液がその微小空隙に侵入する。この場合、減圧状態から大気圧に少なくとも 1回（実膝には複数回）戻すときは、減圧下にそのまま放置する場合よりも、気泡を十分になくすことができる。

この結果、硬組維と溶解剤との接触が十分となり、迅速かつ十分な溶解が達成できるため、消泡効果が髙まり、硬組維と溶液との接触が促進されて溶解処理時閼が短縮され、溶解効率が向上する。

このような状態では、骨粉等の硬組被粉は、その外周面及び内部 «wゝ空隙が共に酸性溶液に確実に接触し、溶解作用を受けることになる。滅圧により硬組維内部に侵入して接する酸性溶液の絶対量は、大¾^* 件下に攙拌した場合における酸性溶液の接触量の数十倍〜数百倍に達する C

このため、溶解処理時間が飛嚯的に短縮されると共に、重要な骨成分の十分な溶解が可能となる（減圧度と溶解度との関係は、後述する図 7 に示す通りである）。これは、酸性溶液が微小硬組繳粉体に対し内部から接触し、硬組維のカルシウム、蛋白質、微理活性元素等が十分に抽出されるからである。

また、溶解処理時間が短縮されることにより、酸性溶液による硬成分の変性は小限に低減され、その収量が飛躍的に増大する。

本発明の製造方法におレ、ては、上記の硬 ffilftと酸との混合物の溶解を減圧下で行う以外に、これと同等の効果を生じる方法として、合物を加圧下又は超音波の作用下で溶解させることができる。

本発明者は、上記した下での溶解処理に加えて、更に、その溶解液中には残渣が存在しており、これを溶解処理することによって、一層十分に溶解物が得られることを見出した。

即ち、粉砕した硬組雜と可食性の酸との混合物の溶解液を吸 3 lift通し、生じた残渣を溶解させることによって、その残渣から更に SBfi ftの溶解物が得られ、これを上記混合物の溶解液と合わせると、髙収率に目的物が得られるのである。この生成物は、溶液のままでも使用できるが、凍結乾燥等による固形の状態で使用することができる。

この残渣の溶解処理では、クェン酸、リン =f¾、コハク酸、酢酸、乳酸、ァスコルビン酸、酒石酸、リン酸、フマル酸、グルコン酸、アジピン酸、ギ酸、ワインヴィネガ一、マンゴー圧搏液、ナシ圧搾液、ノイナップル圧搾液、レモン圧搏液、メロン圧搾液、ノ、 *パィャ圧搾液、イチジク圧搾液、キウイ圧搾液、 K I B I NN及びポリアーゼ SMからなる群より選ばれた少なくとも 1種によって、残渣を溶解させることができる。本発明の製造方法によって得られる硬組織溶解物は、機能性食品（特にカルシウム補給剤）に限定されるものではない。機能性食品以外の食品、飲料、調味料、養毛剤、育毛剤、肥料や、医薬品、化粧品、骨剤（素材）、歯磨き素材、徐放性のある体内埋設ペレツト、又は飼料等の分としても適用できる。

但し、機能性食品として人問が経口摂取する場合には、人体に害毒がないことがである。この意味では、原材料となる骨成分に影響を与えず、しかも人体に害毒を与えない可溶化溶液として、乳酸、 t (米齚を含む。 ) . ワインヴイネガー、等の有機酸は本発明の Kig方法の実施にである。また、溶解剤として乳酸を使用した場合には、最 i ^成物として得られる硬繊溶解物は、硬 «&«のカルシウム成分が乳酸カルシウムに変換されるので、人体への吸収性が極めて高く、かつ、骨（ffiifft) の全成分が十分に保たれた生理活性の高い生成物が得られることカ^ 8ESされてい本発明の方法によって得られる硬組雄溶解物は、少なくとも蛋白質を含む有機物とカルシウムとを含有し、前記有機物が未変性の形で存在することがである。特に、天然硬維を溶解して得た蛋白質が骨形成蛋白質又は/及び骨シァロ蛋白質を含んでいることは、極めて有用であ

なお、本発明の方法による硬組織溶解物は、抗酸化剤として、 ΒΗΑ (プチルヒドロキシァ二トール）や ΒΗΤ (プチルヒドロキシトルェン）における安全性の問題を持たず、活性に優れ、同時に保存性が良好であり、活性は水にも脂にも溶ける広い面分に存在し、更に、熱変性に対して高い安定性を示す。この抗酸化剤は、食品、医薬品、化粧品、日用品等への応用が可能となる。

また、本発明の方法による硬組緻溶解物は、脂肪細胞への職分化を抑制できる機能を有し、体内での脂肪細胞の増殖分化が活発な成長期における肥満（小児肥満）の抑制及び肥満の軽減をはかることができる。そして、脂肪細胞へ増殖分化した後にこれを特異的に細胞死又は脂肪蓄積量を抑制させる機能から、成 AT満の抑制及び肥満の軽減が可能である。この場合、脂肪組維（flg肪細胞）自体を壊死（アポトシース）させることができることから、リバウンドも防止できる。更に、この抑制剤は、牛骨等の動物骨組維の如き硬組維を溶解して得られるものであるから、人体に摂取しても安全である。体内への摂取形態は特に限定されず、例えば、錠剤やカプセル剤として経口摂取してもよいし、様々な食品に添加してもよレ、。また、 (例えば皮下注入）によりすることも可能である。

また、本発明は、硬と酸とを混合する工程と、この «合物を加圧下又は超音波の作用下で溶解させる工程とを有する、硬組 «溶解物の製造方法も提供するものである。

この方法では、溶液中の残渣を溶解処理する工程を更に有してよい。そして、上述した方法と同様、硬組維と酸との混合物を 0〜3 O 'Cで溶解させるのがよく、粉砕した硬 mmと可食性の酸とを混合することができる。

この場合、可食性の酸として乳酸を使用できるが、乳汁に乳酸菌を添加し、室温以上ので «拌することによって得られる乳黢を使用してよい。

そして、粉砕した硬織と可食性の酸とを混合し、この混合物の溶解液を吸引據過し、生じた残渣を溶解させる場合、適用する残渣溶解^ は、上述したものと同様であってよい。

その他、少なくとも蛋白質を含む有機物とカルシウムとを含有し、前記有機物が未変性の形で存在する硬纖溶解物を得ること、 fi!iflittを溶解して得た蛋白質が骨形成蛋白質又は z及び骨シァロ蛋白質を含むこと、可溶性力ルシゥムを含む硬組織溶解物を得ること、硬組織溶解物が食品、飼料、医薬品、 <fktt品、飲料、調味料、歯磨き素材、養毛剤、育毛剤又は肥料の主成分として用いられることは、上述した方法と同様であってよい。

本発明の方法で得られる硬組維溶解物は、少なくとも蛋白質を含む有機物とカルシウムとを含有し、前記有機物が未変性の形で存在する硬組橡溶解物であるのがよく、また、硬 rniftを溶解して得た蛋白質が骨形成蛋白質又は z及び骨シァロ蛋白質を含み、可溶性カルシウムを含む維溶解物であるのがよい。

また、この硬溶解物が食品、匍料、医薬品、 ttt品、飲料、調味料、歯磨き素材、養毛剤、育毛剤又は肥料の主成分として使用可能である。

産業上の利用可能性

本発明は上述した如く、硬組繳と酸とを混合する工程と、この混合物を溶解させる工程と、この溶中の残渣を溶解処理する工程とを有する方法によって硬組維溶解物を製造しているので、硬 ffiiftが本来的に有する有効な成分を変性させることなく、十分かつ短時閼に溶解することができる。

この硬組織溶解物は、カルシウムのみならず、骨疾病（例えば骨龍症）の治療に近年注目されている BMPや B S P— II等の骨形成蛋白質を完全な形で包含するので、骨粗鬆症等の骨疾病に対し骨形成に積極的に作用する機能性食品の難を可能にする。更に、？ L酸を溶解剤として使用した場合、硬組織カルシウムは可溶性カルシウムの形態で得られるので、機能性食品として使用した場合の消化吸収性は他のカルシウム塩に比べて格段に優れる。

図面の簡単な説明

図 1は、本発明の実施例の方法で得られた硬組維溶解物の成分を示すクロマトグラフィーのスぺクトル図である。

図 2は、従来技術によって得た動物骨の Ifci^成分を示すクロマトグラフィ一のスぺクトル図である。

図 3は、本実施例による硬組縑溶解物中に BMPの存在を示すウェスタンブロッティング図である。

図 4は、本実施例による硬溶解物のラト背部皮下への埋植の結果を示す図である。

図 5は、本実施例による硬組綠溶解物のアル力リフォスファターゼ活性の測定値を示すグラフである。

図 6は、本実施例による硬組維溶解物中に B S P— 11の存在を示すゥエスタンブロッティング図である。

図 7は、減圧度と溶解時間との関係を示すグラフである。

図 8は、加 JE^と溶解時問との閟係を示すグラフである。

図 9は、ロダン鉄法による過酸化抑制能の結果を示すグラフである。

図 1 0は T B A法による過酸化抑制能の f ffi結果を示すグラフである。図 1 1は本発明に基づく凍結乾燥粉末状 T B E (凍桔乾煉 T B E) の濃度 (%) による活性酸素（0Γ ) の消去能の評価桔果を示すグラフである。

図 1 2は同、凍結乾燥粉末状 T B E (凍結乾燥 T B E) の濃度（％) によるフリーラジカル（· ΟΗ) の消去能の結果を示すグラフである。

図 1 3は従来から使用されているスーパーォキサイドデイスムターゼ (S O D) の濃度（¾ による活性酸素 (0₂- ) の消去能の評価結果を示すグラフである。

図 1 4は同、ジメチルスルホキシド（DMS O) の濃度 (%) によるフリーラジカル（· OH) の消去能の評価結果を示すグラフである。図 1 5は、本発明の他の実施例について高ショ糖飼料投与ラットの体重増加率の測定値を比較して示すグラフである。図 1 6は、同実施例について髙ショ糖飼) isfs与ラタトの臂 wua囲肪量の測定値を比較して示すグラフである。

図 1 7は、同実施例について高ショ糖飼難与ラットの骨破 βίΐ¾»時の最大負荷の測定値を比較して示すグラフである。

図 1 8は、同実施例にいて髙ショ糖飼難与ラットの骨破断! «I時の破断エネルギーの測定値を比較して示すグラフである。

図 1 9は、同実施例にいて髙ショ糖飼料投与ラットの骨破断試»時の体重当たりの最大負荷の測定値を比較して示すグラフである。

図 2 0は、同実施例にいて高ショ糖飼料投与ラットの骨破断試狭時の体重当たりの破断エネルギーの測定値を比較して示すグラフである。図 2 1は、本発明の他の実施例と比較例について摂取カルシウム l m g当たりの糞中カルシゥム排泄量の測定値を示すグラフである。

図 2 2は、同、摂取カルシウム l m g当たりの尿中カルシウム拼 it* の測定値を示すグラフである。

図 2 3は、同、摂取カルシウム l m g当たりの奠尿中カルシウム総排泄量の測定値を示すグラフである。

図 2 4は、本発明の更に他の実施例と比較例について人工胃液及び » 吸収率の測定値を示すグラフである。

実施例

以下、本発明を実施例について更に詳細に説明する。

本実施例によれば、硬組繳溶解物は、例えば次のような手順に従ってした。

まず、発熟を ¾Λ抑えつつ動物骨又は貝殻を適切な粒径の粉体に粉碎し、この粉砕物を水でよく洗浄した。この粉体の粒径は、例えば 5 mm 以下とすることが望ましい。この洗^ ¾、粉体を遽切な濃度、例えば 1 0容量 ¾饞度の乳 ϋ溶液と混合し、この混合物を脱置内で擾拌し、 1 0 -·ΤΟΓΓ以上（¾Rには 5〜9 Torr) の減圧状 «Sにした。この減圧状態から大に少なくとも 1回戻し（実際には何度も戻し）、気泡を十分になくし、溶解を十分に進行させた。

この溶解処理（減 ΒΕΐ¾κ) では、脱気の程度が進むほど、 mmo 解処理速度が早くなった。滅圧に伴う成分変化は wrgできなかった。そして、この溶解処理時間を短くするためには、より真空に近い状 88 にして容器内を攬拌すればよい。攪拌温度は限定されないが、雑菌の繁殖を防止する等の目的から、できるだけ低温（特に 0で以上、 3 0で以下）、好ましくは 4で程度で処理を行うことが望ましい。

次に、上記の減した溶解液を吸引 «過し、得られた残渣（コラ

—ゲンが主体と考えられる。〉を溶解させるため、所定濃度のクェン酸溶液を用いて残渣を溶解した。その他、リン: ^m、コハク酸、醉酸、乳酸、パイナップル圧搾液、レモン圧搾液、メ αン圧抨液、ノパィャ圧搾液、イチジク圧搾液、キウイ圧搾液等でも溶解可能である。また、 Γ Κ I B I NNJ . 「ボリァーゼ S MJ (いずれも商品名）でも溶解可能であ 0

こうしたクェン酸等による残渣の溶解処理は、 6 0〜 8 0ででの «拌下で行うのがよい。

以上のような ¾JE 下で約 5〜6時間捷拌し、更に残渣の溶解処理を攙拌下で所定時間行うことによって、動物骨及び貝穀 ifiittの全成分を完全に溶解することができた。減圧しない場合の処理時間に較べると、図 7に示すように、処理時間は格段に早くなり、しかも硬組織の全成分を未変性のまま得ることが可能となった。このようにして、硬 fiittが本来有するカルシウム、有機物及び «a元素の !Riが著しく加した。例えば濃度 1 0 %の乳酸溶液を使用し、滅圧状態（例えば真空伏筋）に置いた場合は、非減件の場合よりも収量が約 6〜1 0倍となることがわかった。

また、上記のような減圧条件下（必ずしも真空でなくともよい。）及びクェン酸による残渣溶解処理によって、例えば骨が本来有するカルシゥム、有機物及び微量元素をほぼ完全に得ることが可能となった。即ち、健常な天然硬組織の蛋白質（ぺプチドを含む）は、上記の «JE 及び残渣溶解処理による両溶解物の混合液について、図 1に示すように、その分子量が 1 0 0 D a〜2 0 0万 D aの広がりをもつ。これに反し、減圧しない条件下で得られる骨溶解物の分子量は、図 2に示す如くせいせい 3 0 0 0 D a〜6万 D a程度である。これは、、 JKJgの程で、生体利用性の高い成分を失うことを意味する。これに対し、本発明に基づけば、生体利用性の高い成分を失わず、 ^量 1 0 0 D a〜2 0 0万 D aまでの蛋白質（ペプチドを含む。 ) 、多糖類等の有機物を得ることが可能となった。

本発明に基づく本実施例の製造方法で得られた硬溶解物は、蛋白質を未変性の状態で可溶化させたものであり、生理活性を十分にした蛋白質を含有していると考えられる。このことから、硬溶解物中に存在する B S P— I I (骨シァロ蛋白質： Bone Sialo Protein U)及び BMP (骨形成蛋白質： Bone Morphogenetic Protein) について、その存在の有無と、 BMPについてはその生理活性の有無とについてし図 3は、本実施例による硬組織溶解物に BMPが存在しているかについて検討したものである。検討方法としては、ゥ Xスタンプロットにより抗ゥシ BMP— 2モノク α—ナル抗体を用いて »rgした。

この結果、レーン 2には、抗ゥシ BMP— 2モノクローナル抗体に反応ずるバンドが **¾ 2 4 , 0 0 0のところに検出された。一方、本実施例のレーン 4にも同様に、 ^fi*¾ 2 8 , 0 0 0のところに検出された。これは、本実施例による硬腿溶解物中に BMPが存在し、しかも、一般に行われているグァニジン抽出による方法に比べて、より^ な状態で存在していることが示唆された。

次に、この蛋白質が生理活性を保持しているかについて、ラタト背部皮下への埋植実験を行い、骨形成能の有無を調べた。

図 4は、ラット背部皮下への埋植実験を行った後の軟 X線写真を基に作成した図である。サンプル 2及び 3において不透過像を呈していることから、本実施例による硬組維溶解物には骨形成能が存在していることが示された。

図 5は、石灰化を起こしたペレツト中のアルカリフォスファターゼ活性を測定した結果である。サンプル 2及び 3はサンブル 1のコントロールより明らかに高く、本実施例のサンブル 3はサンブル 2より活性が高かった。これによつて、図 4の不透過像は、単にカルシウムの沈着ではなく、骨形成を意味するものであると考えられる。

図 6は、硬組維溶解物に B S P一 I〖が存在しているかについて検討したものである。抗ゥシ B S P - I I乇ノク α—ナル抗体を用いたウェスタンブロット法でした。

この図から分かるように、本実施例による硬組雜溶解物（レーン 2、 3 ) 中に抗ゥシ B S Ρ— IIモノクローナル抗体に反応するバンドが検出された。

以上のように、本発明に基づいて fiitされる硬組維溶解物中には、骨 ai¾症等の骨疾病の治療上、近年注目されている BMP及び B S P - II 等の骨形成に閼する蛋白の存在が確認されたことが分かる。この硬組職溶解物は、単にカルシウム塩の補給だけでなく、他の微量生理活性元素と共に骨形成を促進する蛋白質を供給することにより、骨疾病の回復に寄与する各種 $ϊ品の提供を可能にするものである。

なお、上記において、乳酸を使用して滅圧した場合、骨カルシウムは主として可溶性カルシウムの形 «Iで得られる。機能性食品として使用した場合には、消化吸収性は他のカルシウム塩に比べて格段に優れている。本発明に基づいて硬組織溶解物を ®造する際、必ずしも乳酸溶液を使用することに限定されない。同じ乳酸溶液を使用する場合でも、例えば骨組維粉に牛乳（粉乳）を加え（に応じて砂糖を添加し）、この乳汁に乳酸菌を添加し、室温以上の（例えば 3 7で程度）で «拌すると、牛乳は乳酸溶液に変化して硬組維粉の溶解作用を営む。

従って、牛乳に乳酸菌を添加して骨 ffi ft粉と混合し、これを «flE^# 下に置けば上述した例と同様に、天然骨成分を短時間で十分に溶解することが可能となる。この場合、初期の SJK^ は髙ぃ方が望ましいが、牛乳が乳酸溶液に変じた時点で減圧すれば、上述した例と同様の結果を得る。

なお、本発明の造方法による硬組綠溶解物は、上述した例の如き処理によって得られるものに限定されない。例えば、使用する可食性の酸は乳酸に限定されない。

上述の例で乳酸を例示したのは、溶解物を骨疾病の回復剤又は機能性食品としてそのまま食することを前提とした場合に、味等の面で最も抵抗感なく食することの可能な溶解物を得るためであり、食材として消化吸収したとき、人体に害毒のない溶解物を得ることができるならば、溶解剤として乳酸を必ずしも使用するはないからである。結果において同様であれば、酢酸、クェン酸、酸性果汁等を溶として使用してもよいし、最成物（硬組維溶解物）を食材として使用しないのであれぱ、塩酸等の非可食性の酸を使用することも可能である。

また、上述の例では、骨 M l粉と乳酸溶液との混合物を„ (例えば真空状態〉に撹拌するが、このように減圧することの麟は、 a 内の空隙への酸性溶液の侵入を容易にすることである。従って、溶解作用をより促進させるには、骨組織粉内の空隙と酸性溶液との接触機会を増加させることが望ましい。

そのためには、減圧状 SSを変化させることによって、微小空腺内に侵入する酸性溶液の侵入及び侵出を交互に行わせてもよい。例えば、 3 0 分間真空状態に攬拌後、 5分閽大気圧に戻し、更に 3 0分問真空というィンタ一バルを繰り返すこと等である。このィンターバルの時問は特に限定しなレ、。骨粉の溶解がより短時間で十分なものとなる滅圧ー非減圧の繰り返しであればよい。

図 8は、上述の例の減圧状態での溶解 ( smo に代えて、加圧状態での溶解処理（加圧脱灰）を行った以外は、上述した例と同様に処理した場合の処理結果を示している。

この加 ra¾灰は次の条件で行つた。

( 1 ) 圧力範囲は数 kgi/ciD² 〜数 1 O kgf/cm² が考えられるが、実際には、 ]ΕΛは 3 kgf/cni² で行った。

( 2 ) 温度は J ^した滅 fflK灰と同様であり、例えば室温付近とした。

( 3 )携拌は上述した減 £ΕΙ¾Κと同様に行つた。

この加 JE ½灰によっても、短時間で硬組維の溶解が可能であることが分かる。これは、加圧によって骨組織内部に対する酸の接触が十分に行われたことを意味している。

なお、この場合も、 ± の例と同様、加後に残渣の溶解 ftkSを仃っ o

図 9は、口ダン鉄法に基づく開始後 1 5日までのリノール酸に対する過酸化抑制能の I K結果を示すものである。これは、波長 50 On mにおいての吸光度変化によるリノール酸の酸行度を示すものである。

ここでは、反応液の最終濃度が 0. 02%になるように調整したのエタノール溶液に、 2. 5 1%のリノール酸'エタノール溶液を 2.0 mL加えた後、 4. OmLの 0. 05 M (モル：以下、同様）リン酸緩街液（PH7. 0)及び 2. OmLの蒸留水を加えて密封し、温度 40 でで喑所に放置したものを使用した。また、比較として現在食品に使用されている合成抗酸化剤の BHT (プチルヒドロキシトルエン：以下、同様）、 BHA (プチルヒドロキシァ二トール：以下、同様）、天然抗酸化剤のな一トコフヱロールを本実施例と同一濃度にして測定した。

½S試唳は、上記のように調製した各反応液 0. lmLを試 I管に入れ、 75%エタノール 9. 7mL及び 30%チォシアン酸アンモニゥム 0. lmLを加え、その後、 3. 6%塩酸に溶解させた 2 X 10_²M塩化第一鉄 0. lmLを加えて反応させ、 S分後に波長 500 n mの吸光度を測定した。

図 9より、食品添加物として現在一般に使用されている天然抗蒙化の α—トコフェロール（比較例〉との過酸化抑制能の比較では、およそ 1 5日を経過するまで、 FD— ΤΒΕ及び理 ΤΒΕは α—トコフエ口ールと同等かそれに便る過酸化抑制能を示した。

また、ここで分かつたことの一^ Dに、従来の抗酸化剤（特に α—トコフエロール）が大気中に放置しておくと著しく通黢化抑制能を喪失するのに比較して、本実施例の抗酸化剤である上述の溶解物： TBE

(特に FD— ΤΒΕ、 ΙίΜ&δΤΒΕ)は通常の大気中に放置しても、またそれが髙温のままの放置であっても酸化抑制の能力上の問題を生じないという特異性があった。

この結果、本実施例（FD— TBE、熟処理 TBE)の抗酸化剤は、食品添加剤として使用する場合や医薬品、化粧品として使用する場合にも、取り扱いが非常に容易になると考えられる。

図 10は、リノール酸の酸化が進んで生成されるマロンアルデヒドの相対量を測定する TBA法（TWobarbitoric acid method)の iiffi結果を示すものである。

ここでは、反応液（上記と同様） 2. OmLを^管に入れ、 20% トリクロ口酢酸 2. 0111；1及び0. 7%チオハ *ルビツール酸 1. OmL を加え、沸騰水浴中に 10分間浸滇し、冷却後、遠 ' 離 (300 r p mx 1 Omi n) し、所定期間をおいて波長 532 nmの吸光度を測定した。

図 10によれば、 7日目 i¾®時点において、 FD-TBE、熱処理 T BEは、な一トコフェロールと同等かそれ以上の過酸化抑制能を示している。また、 16曰目 j¾¾時点をみると、 α—トコフヱロールよりも優れた過酸化抑制能を示しており、 7日目経過時点とほぼ同じような値となっており、優れた過酸化抑制能を有していることが分かった。

次に、下記の表 1〜2に示した組成の凍結乾燥粉末状 T BE (凍結乾燥 TBE)を用いて、ヒドロキシラジカル（ · OH)及びスーパーォキサイド（0₂_ ) に対する消去能を調べた。

図 11は、した硬組織溶解物から得られる凍結乾燥粉末状 T BE (凍結乾燥 TBE)によるスーパーォキサイド（0₂_ ) の消去能を示すグラフである。但し、 «I軸は、凍結乾燥 T BE無添加の場合の 0 の S を 1としたときの相対量である。下記の表 1に、この時使用した凍結乾燥 T BEを含むサンブルの Jfi^を示す。但し、表中 EDTAとはェチレンジアミンテトラ S¾、 DMPOとは 5， 5-ジメチルー 1一ピロリン一 Ν—才キシドを示す（以下、同様）。

表 1

同様に図 12は、凍結乾燥 TBEによるヒド oキシラジカル（·〇 Η) の消去能を示すグラフである。この時使用したサンブルの ffiJSを下記の表 2に示す。表 2

ここで、表 1及び表 2において、リファレンスとは「コントロール」とほぼ同義語であり、の基準である。また、最終サンブルとは、最終的に試験に供したサンプル（試薬）の組成である。勿論、表 1及び表 2において、凍結乾煉 T B Eの濃度は図 1 1及び図 1 2に対応する值に適宜変動させたものを使用した。

次に、図 1 3に比較例として、スーパーォキサイド（0Γ ) に対する最も一般的な消^と考えられるスーパーォキサイドディスムターゼ (S OD) を用いてスーパーオキサイドの消去能を調べた。この時の溶液のは凍結乾燥 T B Eを使用しないこと以外は表 1に示したものと同様である。

同様に、図 1 4に比較例としてヒドロキシラジカル（ · OH) に対する最も一般的な消^と考えられるジメチルスルホキサイド（dimethyl sulfoxide： DMS O) を用いてヒドロキシラジカルの消去能を調べた。この時の溶液の ifijKは凍桔乾燥 T B Eを使用しいこと以外は表 2に示したものと同様である。

図 1 1より、凍結乾燥 TB Eはその濃度が大きくなるにつれて、スーバーオキサイド（0₂_ ) の消去能も向上していることが分かる。特に凍結乾燥 T B Eの濃度が 0 , 2 5 %以上であることが好ましいものと思われる。

また、図 1 3に示した一股的な 0₂_の消去剤であるスーパーォキサイドデイスムターゼ（S OD) に比べても、同等又はそれ以上の消去能を有していることが分かる。

更に、図 1 2よりヒドロキシラジカル（ · ΟΗ) に対しては、特に凍結乾燥 Τ Β Εの濃度が 0. 0 1 %以上であることがその消去能からみて好ましいものと思われる。

また、図 1 4に示した一般的な · ΟΗ消である DMS O (ジメチルスルホキシド）と比べても、優れた消去能を有していることが分かる。更に、図 1 3及び図 1 4で示したように、一般的な消は、それぞれ対応する活性酸素種に対して優れた消果を示しているが、本 ¾¾6 例の凍結乾燥粉末状ァパタイトカルシウムエキスは、スーパーォキサイド（0Γ ) に対しても、また、ヒドロキシラジカル（， OH)に対しても優れた消果を有していることが分かる。更に、通酸化抑制能にも優れていることが分かった。

次に、本発明による抗酸化剤（特に FD - TBE) を用いて、経口摂取用の顆粒、ドリンク剤を作製した。下記の表 3及び表 4に、その成分構成例を示す。

表 3 (頼粒の構成内容）原料名添加量（重量）還元乳糖（ミルヘン） 43. 0

TBE 35. 0

焼成牛骨粉（N - CaP) 18. 0

甘味料（エリスリトール） 3. 5

香料 0. 5

表 4 (ドリンク剤の構成内容）

ΤΒΕの経口投与による脂質代謝調節機能（体重、肾,囲脂肪 itt、大腿骨強度）について下記の要領で実験を行った。

SD系雄ラット（予備飼育 1週間後、 19週齡のもの）を使用し、高ショ糖飼料（サッカロース： 60%、カゼイン： 10%、他は A I N— 76の文献公知の配合に基づく）を予備飼育時から本実験に至るまで維続して与えた。そして、本飼育時より毎日ゾンデにより（5mlZ匹〕の量を与える。実験群は 4群であり、投与量と共に以下に示す。群透析前の T B E重量投与サンブル蛋白質濃度コントローノレ D. W. (蒸留水） 0 Qg/nl

TBE- 1 0. lg TBB/500g/day 0.56 og/ml

TBE- 2 1.0g TBB/500g/day 5.80 og/ml

TBE- 3 10. Og TBB/500g/day 81.84 mg/ml 投与サンプルは T B Eを 1 mM HC 1で透析し、凍结乾燥後に

D. . で溶かした。

結果は図 15 (体重增加率）、図 16 (脂肪重量）、図 17、図 18 図 19及び図 20 (骨強度）に示す通りであった。

(1)体重について

TBE摂取群はコントロール群よりも増加率が低い傾向が見られた。

(2)腎麵囲脂肪について

T B E摂取群の脂肪重量はコント α—ル群よりも低く、その中でも Τ Β Ε - 2群とは有意な差があると思われる。

(3)骨強度について

最大負荷、骨破断エネルギー（弾性力を含めた骨強度）共に、コントロール群と比較して ΤΒΕ摂取群は濃度依存的に髙くなる。さらに、体重当たりで換算すると、その傾向は強まり、 ΤΒΕ— 3群とは有意な差がある。

これらの結果から、 ΤΒΕ摂取による体重の増加率の抑制は、脂肪重量（特に内猶旨肪、皮下脂肪重量は殆ど差はない。 ) の減少によるものだと考えられる。また、に体重の減量は骨^ Sの低下をもたらし、骨粗鬆症の発生率が高くなる j といわれ、若い女性の無謀なダイエットが問題となっている。しかし、本実験では雄ラッ卜ではあるものの、 T BE摂取により、体重は減少しているにも拘らず、大腿骨重量の増加 · 骨強度の有意な強化という結果が得られた。即ち、 TBEには Γ内騸旨肪を減少させながら骨強度を髙める J 活性があることが示唆された。更に、脂質代謝調節活性と骨強度強化活性のメカニズムは異なり、それぞれの活性の最適条件（T BE摂取量〉が異なる可能性もあり得る結果と

¾ た o 次に、ラット（Fisher 344、 4週齡、ォス、 6匹〉 1群を低カルシゥム飼料 ( (株）船穢農場調 «品）で 3週藺飼育した。この後、上記実施例で得られた硬 jfiitt溶解物質、還元乳糖、酸味料、エリスリトール、粉末香料等を原材料として作製した骨疾患予防食品を上記低力ルシゥム飼料に添加し、上記ラット 1群に 2週間自由摂取させた。なお、骨疾患予防食品は、 1日の摂取量がカルシウム換算で 1 O m gに相当するように低力ルシゥム飼料に添加させた。

飼育は代謝ケージで行い、毎日、摂食晨を測定し、糞、尿を個別回収した。この後、糞、尿を強熱乾燥後、マツフル焼成し、原光分析に供し、ラツトを屠殺する前日に、糞、尿中それぞれのカルシウム排泄量及び総排泄量の測定を行つた。

比較例 1として、骨疾患予防食品の代わりに牛骨粉を用いて実施例と同様な測定を行った。なお、牛骨粉は、カルシウム含有率が骨疾患予防食品と比較して高いために、骨疾患予防食品と比べて添加量を少なくした。

また、比較例 2として、骨疾患予防食品の代わりに力ルシゥム (貝殻）を用いて実施例と同様な測定を行った。なお、炭酸カルシウムは、カルシウム含有率が骨疾患予防食品と比較して高いために、骨疾患予防食品と比べて添加量が少なく、牛骨粉と比較して同率であるために、牛骨粉と比べて添加量は同量である。

図 2 1は、実施例、比較例 1、比較例 2について摂取カルシウム 1 m g当たりの糞中カルシウム排泄量を測定した結果、図 2 2は、実施例、比較例 1、比較例 2について摂取カルシウム l m g当たりの尿中カルシゥム排泄量を測定した結果、図 2 3は、実施例、比較例 1、比較例 2について摂取カルシウム l m g当たりの糞尿中カルシウム総排泄量、即ち、カルシゥムの排泄率を測定した結果である。

実驗終了後までの実施例、比較例 1、比較例 2における体重増加、摂 ¾S、奠量、尿量には有意な差は生じなかった。奠中カルシウム排泄量、尿中カルシウム排泄; 1、貧尿中カルシウム排泄量とも、骨疾患予防食品は、添加量が牛骨粉、炭酸カルシウムに比べて多い傾向にあつたにもかかわらず、カルシウム排泄量が一番少なかった。このことは、本発明による骨疾患予防食品中のカルシウムが最も生体内部に止まりやすい、即ち、本発明による骨疾患予防食品中のカルシウムの吸収性（利用性）が優れていることを示している。

次に、ラツト（ウィスター系ラット、ォス、 7週餘）をネンブタール麻酔下（0. lm l/1 00 g) で開腹後、空勝及び回腸部の 2ケ所に約 1 0 cmの結さつループを作製した。

上記実施例で得られたのと同様の骨疾患予防食品（カルシウム換算 1 0 Omg) を人工胃液（塩化ナトリウム 2. 0 g、希塩酸 24mlを蒸留水（超純水） 1 000m 1にメスアップしたもの） 50mlで溶解し、注入試料とした。

上記の各ループ内にシリンジを用いて 4 OmMリン酸緩衝液（pH7. 4) 0. 2m lを、統いて注入試料を注入した。注入後、 1時岡放 ISし、ループ内容物を 0. 1N塩酸溶液（超純水使用）によって洗浄し、回収した。回収した内容物中のカルシウム残量を湿式分解し、原光分析によって測定した。

この湿式分解（確酸、過塩素酸による分解）は、具体的には、回収した内容物 5mlをるつぼに入れ、濃 HN0₈ を 5 ml添加し、蓋を載せ穏やかに熱した。反応が収まったら加熱を強め、乾固させた。次に、希 HNOs を 1 0mし 70¾>HC 10₄ を 1 0ml添加し、穏やかに加熱し、液がになるまで分解を行った。にならないときは 7 0 %

H C 1 0₄ を数 m 1加え、加熱した。

更に、蒸発乾固して H C 1 0₄ を除いた。残留物に希 H C 1を約 1 0 m l添加し、等置の水（超)^) で薄め、 7j浴中で加熱して完全に溶解した可溶化物とした。そして、この可溶化物を 1 0 0 m lのメスフラスコに移し、水（超を加えて 1 0 0. 0 m lにし、液とし、原子吸光光度法によりカルシウムの残量をした。

比較例 3として、骨疾患予防食品の代わりにカルシウム吸収性に優れている L一乳酸カルシウムを用レ、て実施例と同様な測定を行つた。

図 2 4は、実施例、比較例 3について人工胃液溶解率及び腸吸収率を測定した結果である。

本発明による骨疾患予防食品も、 L一乳酸カルシウムも人工胃液溶解率に優れ、ほぼ 1 0 0 %であった。しかし、腸吸収率に関しては、本発明による骨疾患予防食品は、 L一乳酸カルシウムと比較して格段優れている。この結果から、本発明による骨疾患予防食品は、乳酸カルシウムが含まれていることにより吸収性が髙、というだけではなく、何らかの吸収促進因子が存在していることにより吸収性が格段優れているといえ 0

Claims

請求の範囲

1 . 硬組 I»と酸とを ®合する工程と、この混合物を溶解させる工程と、この溶解液中の残を溶解処理する工程とを有する、蛾溶解物の方法。

2. 硬 m«と酸との混合物を滅圧下で溶解させる、睛求の範囲の第 1項に記載した製造方法。

3. 減圧状筋から大気圧に少なくとも 1回戻す、請求の範囲の第 2項に記載した製造方法。

4. 硬組と酸との混合物を加圧下で溶解させる、請求の範囲の第 1項に記載した製造方法。

5. 硬組雜と酸との混合物を超音波の作用下で溶解させる、請求の範囲の第 1項に記載した l¾i方法。

6. 硬組維と酸との混合物を 0〜 3 0でで溶解させる、請求の範囲の第 1項〜第 5項のいずれか 1項に記載した製造方法。

7. 粉砕した硬 ifiifftと可食性の酸とを混合する、請求の範囲の第 1項に記載した製造方法。

8. 可食性の酸として乳酸を使用する、請求の範囲の第 7 項に記載した製造方法。

9. 乳汁に乳酸菌を添加し、室温以上の温度で橋拌することによつて得られる乳酸を使用する、請求の範囲の第 8項に記載した製造方法。

1 0. 粉砕した硬組織と可食性の酸とを混合し、この混合物の溶解液を吸引據過し、生じた残渣を溶解させる、請求の範囲の第 7 項に記載した製造方法。

1 1 . クェン酸、リン =ί¾、コハク酸、酢酸、乳黢、ァスコルビン酸、酒石酸、リン酸、フマル酸、グルコン酸、アジビン酸、ギ酸、ワインヴイネガー、マンゴー圧摊液、ナシ圧掸液、バイナツブル圧摊液、レモン搏液、メロン庄摊液、パパイヤ圧搾液、イチジク圧搏液、キウイ圧摔液、 K I B I NN及びボリァーゼ SMからなる群より選ばれた少なくとも 1種によって、残渣を溶解させる、請求の範囲の第 1 0項に記載した Kit方法。

1 2. 残渣を 6 0〜8 0でで溶解させる、請求の範囲の第 1 0項又は第 1 1項に記載した製造方法。

1 3. 硬組織と酸との混合物の溶解液と、この溶解液の残渣の溶解液とを混合する、請求の範囲の第 1項に記載した Kit方法。

1 . 少なくとも蛋白質を含む有機物とカルシウムとを含有し、前記有機物が未変性の形で存在する硬組維溶解物を得る、求の範囲の第 1項〜第 5項及び第 7項〜第 1 3項のいずれか 1項に記載した製造方法。

1 5. 硬組維を溶解して得た蛋白質が骨形成蛋白質又は/ 及び骨シァロ蛋白質を含む、請求の範囲の第 1 4項に記載した製造方法。

1 6. 可溶性カルシウムを含む硬組繳溶解物を得る、請求の範囲の第 1 4項に記載した 18造方法。

1 , · 硬組維溶解物が哀ロロ、飼料、医薬品、化粧品、飲料調味料、歯磨き素材、養毛剤、育毛剤又は肥料の主成分として用いられる、請求の範囲の第 1 4項に記載した製造方法。

1 8. 硬組維と酸とを混合する工程と、この混合物を加圧下又は超音波の作用下で溶解させる工程とを有する、硬組織溶解物の製造方法。

1 9. 溶解液中の残渣を溶解処理する工程を更に有する、請求の範囲の第 1 8項に iai¾した i¾i方法。

2 0. 硬と酸との混合物を 0〜3 0でで溶解させる、睛求の範囲の第 1 8項又は第 1 9項に記载した «造方法。

2 1 . 粉砕した硬組織と可食性の酸とを混合する、請求の範囲の第 1 8項に記載した製造方法。

2 2. 可食性の酸として乳酸を使用する、請求の範囲の第 2 1項に記載した製造方法。

2 3. 乳汁に乳酸菌を添加し、室温以上の fiKで擾拌することによって得られる乳酸を使用する、請求の範囲の第 2 2項にした製造方法。

2 4. 粉碎した硬 m«lと可食性の酸とを《合し、この私合物の溶解液を吸引據過し、生じた残渣を溶解させる、請求の範囲の第 1 9項に記載した製造方法。

2 5. クェン酸、リンづ ¾L コハク酸、酢酸、乳酸、ァスコルビン酸、酒石酸、リン酸、フマル酸、グルコン酸、アジピン酸、ギ酸、ワインヴイネガー、マンゴー圧搾液、ナシ圧捧液、ノィナツブル圧搾液、レモン圧捧液、メロン圧搾液、ノパィャ圧搏液、イチジク圧摊液、キウイ圧搾液、 K I B I NN及びポリア一ゼ SMからなる群より選ばれた少なくとも 1種によって、残渣を溶解させる、請求の範囲の第 2 4項に記載した製造方法。

2 6. 残渣を 6 0〜 8 0でで溶解させる、睛求の範囲の第 2 4項又は第 2 5項に記載した製造方法。

2 7. 硬組織と酸との混合物の溶解液と、この溶»«の残渣の溶解液とを混合する、請求の範囲の第 1 9項に記載した製造方法。

2 8. 少なくとも蛋白質を含む有とカルシウムとを含有し、前記有機物が性の形で存在する硬組 «fe溶解物を得る、請求の範囲の第 1 8項〜第 1 9項及び第 2 1項〜第 2 7項のいずれか 1項に記載した製造方法。

2 9. 硬組維を溶解して得た蛋白質が骨形成蛋白質又は/ 及び骨シァロ蛋白質を含む、請求の範囲の第 2 8項に記載した製造方法。

3 0. 可溶性力ルシゥムを含む硬組緣溶解物を得る、請求の範囲の第 2 8項に記載した製造方法。

3 1 . 硬組維溶解物が食品、飼料、医薬品、化粧品、欢料、調味料、歯磨き素材、養毛剤、育毛剤又は肥料の主成分として用いられる、請求の範囲の第 2 8項に記載した製造方法。

3 2. 請求の範囲の第 1項〜第 8 1項のいずれか 1項に記載した ΙΪ造方法によって得られ、少なくとも蛋白質を含む有機物とカルシゥムとを含有し、前記有機物が未変性の形で存在する硬 mift溶解物。

3 3. 蛋白質が骨形成蛋白質又は Z及び骨シァロ蛋白質を含む、請求の範囲の第 3 2項に記載した硬組繳溶解物。

3 4■ 可溶性力ルシゥムを含む硬 ifiifft溶解物である、請求の範囲の第 3 2項に記載した硬組維溶解物。

3 5. 硬組 !^解物が食口口、飼料、医薬品、化粧品、飲料、調味料、歯磨き素材、養毛剤、育毛剤又は肥料の主成分として用いられる、請求の範囲の第 3 2項に記載した硬組織溶解物。