WO1997033987A1 - Verfahren zur herstellung von n-geschützten d-prolinderivaten - Google Patents

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WO1997033987A1
WO1997033987A1 PCT/EP1997/001262 EP9701262W WO9733987A1 WO 1997033987 A1 WO1997033987 A1 WO 1997033987A1 EP 9701262 W EP9701262 W EP 9701262W WO 9733987 A1 WO9733987 A1 WO 9733987A1
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amino acid
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proline
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cyclic
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PCT/EP1997/001262
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Martin Sauter
Daniel Venetz
Fabienne Henzen
Diego Schmidhalter
Gabriela Pfaffen
Oleg Werbitzky
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Lonza Ag
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    • C12P41/006—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by reactions involving C-N bonds, e.g. nitriles, amides, hydantoins, carbamates, lactames, transamination reactions, or keto group formation from racemic mixtures
    • C12P41/007—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by reactions involving C-N bonds, e.g. nitriles, amides, hydantoins, carbamates, lactames, transamination reactions, or keto group formation from racemic mixtures by reactions involving acyl derivatives of racemic amines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
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Definitions

  • the present invention relates to new microorganisms which are capable of an N-protected proline derivative of the general formula
  • N-protected cyclic D-amino acid derivatives such as B.
  • N-protected D-proline derivatives such as N-benzyloxycarbonyl-D-proline (N-Z-D-proline) are important intermediates for the production of pharmaceuticals (J. Org. Chem., 1994, 59, 7496-7498). So far, only a few enzymes are known which, for. B. Accept N-Z-L-proline as a substrate and hydrolyze it to L-proline.
  • N-acyl-L-proline acylase which, for. B. N-acetyl-L-proline is preferred as the substrate and is used to obtain L-proline.
  • This N-acyl-L-proline acylase is made from microorganisms of the species Comamonas testosteroni or Alcaligenes denitrificans isolated. A disadvantage of these microorganisms is that they are incapable of using NZL-proline as the sole nitrogen source and not hydrolyzing NZL-proline as a substrate.
  • WO 95/10604 describes a microbiological process for producing L-
  • Pipecolic acid known from microorganisms of the species Alcaligenes denitrificans. These microorganisms also have the disadvantage that they do not use the corresponding N-acyl substrate (N-acetyl- (DL) -pipecolic acid) as the only nitrogen source.
  • the object of the present invention is to isolate microorganisms which can be used both for a simple and technically viable process for the preparation of N-protected cyclic or aliphatic D-amino acid derivatives and for a simple process for the preparation of cyclic or aliphatic L-amino acid derivatives. The corresponding products should be isolated in good enantiomeric purity.
  • microorganisms according to claim 1 can be isolated from soil samples, sludge or waste water with the aid of customary microbiological techniques. According to the invention, these microorganisms are isolated in such a way that they are in a medium containing an N-protected proline derivative of the general formula
  • the C 1-4 alkoxy may be applied methoxy, fluorenylmethoxy, ethoxy, propoxy, i-propoxy, butoxy, t-butoxy or i-butoxy.
  • aryl a phenyl or benzyl group is substituted or unsubstituted, such as. B. 4-methoxybenzyl or 4-methoxyphenyl used.
  • Aryloxy is hereinafter defined as a phenyloxy or benzyloxy group, substituted or unsubstituted.
  • Examples of an aryloxy group are benzyloxy, 4-methoxybenzyloxy or 4-nitrobenzyloxy.
  • the microorganisms can use, for example, sugar, sugar alcohols, or carboxylic acids as a growth substrate as a suitable carbon source.
  • Hexoses such as glucose, fructose or pentoses can be used as sugar.
  • carboxylic acids di- or
  • Tricarboxylic acids or. the salts of which are used such as citrate or malate.
  • Sugar alcohol can be used, for example, glycerol.
  • microorganisms for example ammonium, nitrate,
  • the selection and cultivation medium which can be used are those customary in the art, for example that described in Table 1. Preferably that described in Table 1 is used.
  • the effective enzymes of the microorganisms are expediently induced during the cultivation and selection.
  • An N-protected proline derivative of the general formula I or the L-isomer thereof can be used as the enzyme inducer.
  • Cultivation and selection are usually carried out at a temperature of 10 to 40 ° C., preferably 20 to 35 ° C. and at a pH between pH 4 and pH 10, preferably between pH 5 and pH 9.
  • Preferred microorganisms are NZL-proline utilizing the genus Arthrobacter (first gram-positive microorganism with proline acylase activity), Agrobacterium / Rhizobium, Bacillus, Pseudomonas or Alcaligenes.
  • microorganisms of the species Arthrobacter sp are NZL-proline utilizing the genus Arthrobacter (first gram-positive microorganism with proline acylase activity), Agrobacterium / Rhizobium, Bacillus, Pseudomonas or Alcaligenes.
  • microorganisms of the species Arthrobacter sp are NZL-proline utilizing the genus Arthrobacter (first gram-positive microorganism with proline acylase activity),
  • HSZ5 with the designation DSM 10328 Agrobacterium / Rhizobium HSZ30, Bacillus simplex K2, Pseudomonas putida K32, Alcaligenes piechaudii K4 or Alcaligenes xylosoxydans ssp denitrificans HSZ 17 with the designation DSM 10329, and their functionally equivalent variants and mutants.
  • the microorganisms DSM 10329 and DSM 10328 were deposited on January 6, 1995 at the German Collection of Microorganisms and Cell Culture GmbH, Mascheroderweg 1b, D-38124 Braunschweig, in accordance with the Budapest Treaty.
  • “Functionally equivalent variants and mutants” are understood to mean microorganisms which have essentially the same properties and functions as the original microorganisms. Such variants and mutants can happen accidentally, e.g. B. are formed by UV radiation.
  • Taxonomic description of Alcaligenes xylosoxydans ssp. denitrificans HSZ17 (DSM 10329)
  • Peptidoglycan type A3 ⁇ , L-Lys-L-Ser-L-Thr-L-Ala 16S rDNA sequence similarity: Sequencing of the area with the greatest variability gave 98.2% as highest values with Arthrobacter pascens,
  • the partial sequencing of the 16SrDNA showed a similarity of 100% to Bacillus simplex.
  • the profile of cellular fatty acids is typical of the Alcahgenes genus.
  • the profile of cellular fatty acids is typical of Pseudomonas putida.
  • Pseudomonas putida can be assigned.
  • the enzymes according to the invention, the N-acyl-L-proline acylases can, for. B. are obtained by expertly disrupting the microorganism cells described, preferably the enzymes are obtained from Arthrobacter sp HSZ5 (DSM 10329). For example, the ultrasound, French press or lysozyme method can be used for this.
  • the enzymes are characterized by the following properties: N-acyl-L-proline acylase characterized by the following properties: a) substrate specificity:
  • a together with -N- and -CH represent an optionally substituted 4-, 5- or 6-membered saturated heterocyclic ring and R - (CH 2 ) 2 -COOH, each optionally substituted alkyl, alkoxy, aryl or aryloxy, is carried out in this way that in the racemic N-protected cyclic amino acid derivative of the general formula
  • N-protected cyclic L-amino acid derivative by means of the microorganisms already described or by means of their cell-free enzymes converted into the cyclic L-amino acid derivative (formula III) and optionally isolated , where the N-protected D-amino acid derivative (formula II) is obtained in addition to the L-amino acid derivative, which is optionally isolated.
  • the inventive method for the preparation of N-protected aliphatic D-amino acid derivatives of the general formula V and / or of an aliphatic L-amino acid derivative of the general formula VI in which R 3 has the meaning given, R 4 is hydrogen, an optionally substituted unbranched alkyl group or an ⁇ -hydroxyalkyl group and R 5 is hydrogen or an optionally substituted unbranched alkyl group is carried out analogously to the corresponding cyclic amino acid derivatives.
  • the starting material for this is a racemic N-protected aliphatic amino acid derivative of the general formula
  • R 3 , R 4 and R 5 have the meaning given.
  • optionally substituted saturated 5-membered heterocyclic rings are proline, pyrazolidine, imidazolidine, oxazolidine, isoxazolidine, thiazolidine, triazolidine.
  • 5-oxoproline pyroglutamate
  • 5-oxoproline pyroglutamate
  • optionally substituted saturated 6-membered heterocyclic rings are piperazine, pipecolin, morpholine, quinolinane, isoquinolinane, quinoxaline.
  • Azetidine can be used as the 4-membered, optionally substituted, saturated heterocyclic ring.
  • Alkyl is referred to as a C 1 -, substituted or unsubstituted 18 alkyl group, defined examples of a C 1 - 18 alkyl group are methyl, chloromethyl, hydroxymethyl, ethyl, propyl, butyl, i-butyl, i-propyl, stearyl.
  • Unbranched alkyl is defined below as methyl, ethyl, propyl or butyl. Hydroxymethyl, hydroxyethyl, hydroxypropyl or hydroxybutyl is defined below as the ⁇ -hydroxyalkyl group.
  • Alkoxy is referred to as a C 1 -, substituted or unsubstituted alkoxy group 18, defined examples of a C 1 - 18 alkoxy group are methoxy, fluorenylmethoxy, ethoxy, propoxy, butoxy, t-butoxy, i-butoxy, Stearoxy.
  • racemic N-protected cyclic or aliphatic amino acids or their derivatives is known in principle.
  • the corresponding L-amino acid is racemized in a known manner according to EP-A 0 057 092, which in turn is then known in a known manner with the corresponding N-protecting group according to Grassmann & Wünsch (Chem. Ber. 91 (1958), 462 - 465) is implemented.
  • Racemization and the introduction of the protective group in an aqueous medium without isolation of the racemic amino acid is carried out.
  • biotransformation is possible with all microorganisms that use an N-protected proline derivative in the form of the racemate or its optically active isomers as the only nitrogen source, as the only carbon source or as the only carbon and nitrogen source.
  • N-acyl-L-proline acylases isolated from the microorganisms.
  • the microorganisms of the genus Arthrobacter, Alcaligenes, Agrobacterium / Rhizobium, Bacillus, described above are particularly suitable for the process.
  • Pseudomonas in particular of the species Agrobacterium / Rhizobium HSZ30, Bacillus simplex K2, Arthrobacter sp. HSZ5, Alcaligenes xylosoxydans ssp. denitrificans HSZ17 (DSM 10329), Pseudomonas putida K32 or Alcaligenes piechaudii K4, or their functionally equivalent variants and mutants.
  • the biotransformation can be carried out with resting cells (non-growing cells which no longer require a carbon and energy source) or with growing cells.
  • the biotransformation is preferably carried out with resting cells.
  • media customary in the art can be used, such as, for example, low-molecular phosphate buffers, Tris buffers, or the medium described in Table 1.
  • the biotransformation is preferably carried out in the medium according to Table 1.
  • the biotransformation is expediently carried out with a single or continuous addition of an N-protected amino acid derivative in such a way that the concentration does not exceed 50% by weight, preferably 20% by weight.
  • the pH of the medium can be in a range from 3 to 12, preferably from 5 to 9.
  • the biotransformation is expediently carried out at a temperature of from 10 to 70 ° C., preferably from 20 to 50 ° C.
  • an N-protected cyclic or aliphatic amino acid derivative is completely converted into a cyclic or aliphatic L-amino acid derivative.
  • An N-protected D-amino acid derivative falls in good yield and
  • N-protected D-amino acid derivative and / or L-amino acid derivative obtained in this way can be prepared by conventional workup methods such as. B. isolated by extraction.
  • N-Z-L-proline 5 g / l was added as the C source.
  • N-Z-L-proline 5 g / l was added to this basic medium as the only N source.
  • Different batches were then inoculated with soil samples from different locations and incubated (30 ° C, 120 rpm) until clearly visible growth could be seen. An aliquot of this culture was then inoculated into an equal volume of fresh medium and incubated again until it became cloudy. This process was repeated three times.
  • the enriched microorganisms were then separated and cleaned on a solid medium (same composition as liquid medium, only addition of 20 g / l agar agar). In this way, about 30 different bacterial isolates were obtained which were able to use NZL-proline as the only N -Source to recycle.
  • the isolates obtained with the method described in Example 1 were propagated in the medium described there. All cultures with sufficient cell density (OD 650 2.0) were harvested by centrifugation. The sedimented cells were resuspended in 0.85% NaCl and washed.
  • NZL-proline After resuspending in NaCl solution, the ability to hydrolize NZL-proline was tested with resting cells. A suitable amount of cells with NZL-proline (5 g / l) in buffer solution (50 mM Tris / Cl, pH 7.0) was used for this ) incubated (30 ° C) At different times, aliquots were removed and checked for the release of proline from NZ-proline by thin layer chromatography. Several isolates showed this hydrolytic activity, especially the two from the DSM as Arihrohacter sp. and Alcahgenes xylosoxydans ssp. denilnficans certain strains HSZ5 and HSZ17.
  • Arthrobacter sp HSZ5 was grown with various C- (NZL-proline as N-source) or N-source (fructose as C-source). C-sources were added to 5 g / l, N-sources to 2 g / l. For induction If necessary, 1 g / l NZL-proline was added to the desired enzymatic activity. Only fructose, glucose, sucrose and mannitol from the tested C sources could be used. In all other cases, N-Z-L-proline was used as the C source. The enzymatic activity was only slightly dependent on the C source used. In contrast, all tested N sources could be used, but the enzymatic activity was, e.g. T. significant, reduced (Table 2):
  • Table 2 Growth and enzymatic activity of Arthrobacter sp. HSZ5 when cultivated with different C- (A) resp. N- (B) sources
  • Arthrobacter sp HSZ5 was grown in minimal medium (Example 1) with fructose (5 g / l) as the C source and L-glutamate (2 g / l) as the N source.
  • NZL-proline was almost completely hydrolyzed, while NZD-proline remained unchanged in the solution.
  • NZD proline was thus present in high optical purity (ee> 99%): Arthrobacter sp. HSZ5 was in a Chemap fermenter (working volume 2 1) in
  • Minimal medium (see example 1) with glucose (30 g / l) and L-proline (7 g / l) as a C or N source at 30 ° C. to a cell density of OD 650 > 35 to induce the enzymatic activity , a small amount of NZ-DL-proline (5 g / l) was then added and incubated for some time. Finally, a further 145 g of NZ-DL-proline were continuously added over a period of 20 hours and then incubated for a further five hours. The cells were then separated by centrifugation.
  • the fermentation broth was adjusted to a pH ⁇ 3 with the aid of hydrochloric acid and NZ-proline, which is almost water-insoluble under these conditions, was obtained by extraction with the aid of butyl acetate. Separation of the two phases gave an aqueous solution of L-proline and NZ-proline in organic solvent. The organic phase was concentrated in vacuo and the NZ-proline obtained was dissolved in ethyl acetate and crystallized out by adding hexane.
  • Minimal medium (cf. Example 1) with glucose (20 g / l) and L-proline (7 g / l) as a C or N source at 30 ° C. to a cell density of OD650> 30.
  • 1 12 g of a 50% (w / w) N-Z-DL-proline solution were then added and incubated for a further hour.
  • the volume of the culture was then reduced to 4 l by draining off the amount not required.
  • a further 709 g of the 50% (w / w) N-Z-DL-proline solution were then continuously added to this 4 l culture with induced cells over a period of 5.5 h and then incubated for a further 17.5 h.
  • the pH was maintained at 7.5-8.5 during the biotransformation.
  • Example 1 with glucose (13 g / l) and L-proline (7 g / l) as C or N source at 30 ° C. to the desired cell density (OD650 approx. 25).
  • OD650 approx. 25
  • Figure 2 Activity of the N-acyl-L-proline acylase from Arthrobacter sp. HSZ5 depending on the pH value.
  • Figure 3 Activity of N-acyl-L-proline acylase from Arthrobacter sp. HSZ5 depending on the temperature.
  • NZL-proline L-proline, NZD-proline, benzyl alcohol
  • Figure 4 Activity of the N-acyl-L-proline acylase from Arthrobacter sp. HSZ5 depending on the concentration of the products.
  • Agrobacterium / Rhizobium HSZ30, Bacillus simplex K2, Alcaligenes piechaudii K4 and Pseudomonas putida K32 were grown in the medium described in Table 1 with fnictose (5 g / l) as the C source (30 ° C, 120 rpm) as the only N source (5 g / l) various N-protected amino acids were added. When a cell density of OD 650 > 0.5 was reached, the approach was assessed as positive.
  • HSZ5 Alcaligenes xylosoxidans ssp. denitrificans HSZ 17, Agrobacterium / Rhizobium HSZ30, Bacillus simplex K2, Alcaligenes piechaudii K4 and Pseudomonas putida K32 were in the medium described in Table 1 with fructose (5 g / l) and NZL-proline (5 g / l) as a C or N source (30 ° C, 120 rpm). After reaching the desired cell density, the cells were harvested by centrifugation and washed in saline (0.9%). After all strains had been tested for the desired enzymatic activity, the cells were then resuspended in 100 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0) after the addition of various N-protected amino acids

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Abstract

Beschrieben werden Mikroorganismen, die befähigt sind, ein N-geschütztes Prolinderivat der allgemeinen Formel (I), in Form des Racemats oder eines seiner optisch aktiven Isomere, worin R1 -(CH2)2-COOH gegebenenfalls substituiertes C1-4-Alkoxy, Aryl oder Aryloxy und R2 Wasserstoff oder Hydroxy bedeutet, als einzige Stickstoffquelle, als einzige Kohlenstoffquelle oder als einzige Kohlenstoff- und Stickstoffquelle zu verwerten. Diese Mikroorganismen können für ein Verfahren zur Herstellung von N-geschützten cyclischen oder aliphatischen D-Aminosäurederivaten der allgemeinen Formeln (II) und (V), worin A zusammen mit -N- und -CH- und R?3, R4 und R5¿ die genannte Bedeutung haben, eingesetzt werden.

Description

Verfahren zur Herstellung von N-geschützten D-Prolinderivaten
Die vorliegende Erfindung betrifft neue Mikroorganismen, die befähigt sind, ein N-geschutztes Prolinderivat der allyemeinen Formel
Figure imgf000003_0001
in Form des Racemats oder eines seiner optisch aktiven Isomere, worin R1 -(CH2)2-COOH, jeweils gegebenenfalls substituiertes C1-4-Alkoxy, Aryl oder Aryloxy und R2 Wasserstoff oder =O bedeutet, als einzige Stickstoffquelle, als einzige Kohlenstoffquelle oder als einzige
Kohlenstoff- und Stickstoffquelle zu verwerten . Diese Mikroorganismen bzw . deren zellfreien Enzyme werden für ein neues Verfahren zur Herstellung von N-geschutzten cyclischen oder aliphatischen D-Aminosäurederivaten und / oder von cyclischen oder aliphatischen L- Aminosaurederivaten eingesetzt.
N-geschutzte cyclische D-Aminosaurederivate wie z . B. N-geschutzte D-Prolinderivate wie N- Benzyloxycarbonyl-D-Prolin (N-Z-D-Prolin) sind wichtige Zwischenprodukte zur Herstellung von Pharmazeutika (J. Org. Chem. , 1994, 59, 7496 - 7498). Bisher sind nur wenige Enzyme bekannt, die z . B. N-Z-L-Prolin als Substrat akzeptieren und dieses zum L-Prolin hydrolysieren. Diese Enzyme wurden aus Mikroorganismen der Gattung Rhodotorula (JP-A 01 074 987), Pseudomonas (JP-A 55 071 491 ; Kikuchi et al ., Biochim. Biophys. Acta, 744 (1983), 180-188) oder aus Alcaligenes (JP-A 55 007 015) isoliert. All diese Enzyme reagieren bevorzugt mit strukturell verwandten Substraten des N-Z-L-Prolins wie z . B. mit N-Chloracetyl-L-Prolin, weisen aber mit N-Z-L-Prolin eine geringe Aktivität auf Daher sind diese Enzyme füi ein wirtschaftliches Verfahren z . B. zur Herstellung von N-Z-D- Prolin nicht geeignet. Ein weiterer Nachteil liegt darin, dass die Umsetzung des Substrats nicht mit ganzen Zellen, sondern mit Rohextrakten oder isolierten Enzymen durchgeführt wird, was den technischen Aufwand deutlich erhöht.
Aus der EP-A 0 416 282 ist eine N-Acyl-L-Prolin-Acylase bekannt, welche z . B. als Substrat N-Acetyl-L-Prolin bevorzugt und zur Gewinnung von L-Prolin eingesetzt wird. Diese N-Acyl- L-Prolin-Acylase wird aus Mikroorganismen der Spezies Comamonas testosteroni oder Alcaligenes denitrificans isoliert. Ein Nachteil dieser Mikroorganismen liegt darin, dass sie nicht befähigt sind, N-Z-L-Prolin als einzige Stickstoffquelle zu verwerten und N-Z-L-Prolin nicht als Substrat zu hydrolysieren. Aus der WO 95 / 10 604 ist ein mikrobiologisches Verfahren zur Herstellung von L-
Pipecolinsäure, mittels Mikroorganismen der Spezies Alcaligenes denitrificans, bekannt. Auch diese Mikroorganismen haben den Nachteil, dass sie das entsprechende N-Acyl-Substrat (N- Acetyl-(DL)-pipecolinsäure) nicht als einzige Stickstoffquelle verwerten. Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist, Mikroorganismen zu isolieren, die sowohl für ein einfaches und technisch gangbares Verfahren zur Herstellung von N-geschützten cyclischen oder aliphatischen D-Aminosäurederivaten als auch für ein einfaches Verfahren zur Herstellung von cyclischen oder aliphatischen L-Aminosäurederivaten eingesetzt werden können. Dabei sollen die entsprechenden Produkte in guter Enantiomeren-Reinheit isoliert werden.
Diese Aufgabe wird mit den Mikroorganismen gemäss Anspruch 1, mit den Enzymen aus diesen Mikroorganismen gemäss Anspruch 5 und mit den Verfahren gemäss den Ansprüchen 6, 7 ,9 und 10 gelöst. Die erfindungsgemässen Mikroorganismen können aus Bodenproben, Schlamm oder Abwasser unter Zuhilfenahme üblicher mikrobiologischer Techniken isoliert werden. Erfindungsgemäss erfolgt die Isolation dieser Mikroorganismen derart, dass man diese in einem Medium enthaltend ein N-geschutztes Prolinderivat der allgemeinen Formel
Figure imgf000004_0001
in Form des Racemats oder eines seiner optisch aktiven Isomere
• als einzige Kohlenstoff- und Stickstoffquelle oder
• als einzige Stickstoffquelle mit einer geeigneten Kohlenstoffquelle oder
• als einzige Kohlenstoffquelle mit einer geeigneten StickstofTquelle
auf übliche Weise züchtet. Aus der durch Züchtung erhaltenen Kultur werden dann zweckmassig jene selektioniert, die ein N-geschütztes L-Prolinderivat der allgemeinen Formel I als einzige Stickstoffquelle, einzige Kohlenstoffquelle oder einzige Kohlenstoff- und Stickstoffquelle verwerten. Der Rest R1 im N-geschützten Prolinderivat der allgemeinen Formel I bedeutet -(CH2)2- COOH, C 1-4- Alkoxy, Aryl oder Aryloxy Der Rest R2 bedeutet Wasserstoff oder =O. Als C1-4-Alkoxy können Methoxy, Fluorenylmethoxy, Ethoxy, Propoxy, i-Propoxy, Butoxy, t- Butoxy oder i-Butoxy angewendet werden.
Als Aryl wird eine Phenyl- oder Benzylgruppe substituiert oder unsubstituiert, wie z. B. 4- Methoxybenzyl oder 4-Methoxyphenyl, eingesetzt.
Aryloxy wird im folgenden als eine Phenyloxy- oder Benzyloxygruppe, substituiert oder un- substituiert, definiert. Beispiele für eine Aryloxygruppe sind Benzyloxy, 4-Methoxybenzyloxy oder 4-Nitrobenzyloxy.
Die besonders bevorzugten N-geschützten Prolinderivate der Formel I sind N-Succinyl-L- Prolin (R1 = -(CH2)2-COOH), N-phenylacetyl-L-Prolin (R1 = Phenylmethyl), N-Z-L-Prolin (R1 = Benzyloxy), N-Benzoyl-L-Prolin (R1 = Phenyl), N-Isobutoxycarbonyl-L-Prolin (R 1 = Isobutoxy) und N-Z-L-Pyroglutamat (R1 = Benzyloxy, R2=O).
Als geeignete Kohlenstoffquelle können die Mikroorganismen bspw. Zucker, Zuckeralkohole, oder Carbonsäuren als Wachstumssubstrat nutzen . Als Zucker können Hexosen wie bspw. Glucose, Fructose oder Pentosen verwendet werden. Als Carbonsäuren können Di- oder
Tricarbonsäuren bzvv. deren Salze verwendet werden wie bspw. Citrat oder Malat. Als
Zuckeralkohol kann bspw. Glycerin Verwendung finden.
Als geeignete Stickstoffquelle können die Mikroorganismen beispielsweise Ammonium, Nitrat,
Harnstoff oder Glycin nützen.
Als Selektions- und Anzuchtmedium können die in der Fachwelt üblichen verwendet werden, wie bspw. das in Tabelle 1 beschriebene. Vorzugsweise wird das in Tabelle 1 beschriebene verwendet. Während der Anzucht und Selektion werden zweckmässig die wirksamen Enzyme der Mikroorganismen induziert. Als Enzyminduktor kann ein N-geschütztes Prolinderivat der allgemeinen Formel I bzw. das L-Isomere davon verwendet werden.
Üblicherweise erfolgt die Anzucht und Selektion bei einer Temperatur von 10 bis 40 °C, vor- zugsweise von 20 bis 35 °C und bei einem pH-Wert zwischen pH 4 und pH 10 vorzugsweise zwischen pH 5 und pH 9. Bevorzugte Mikroorganismen sind N-Z-L-Prolin verwertende der Gattung Arthrobacter (erster grampositiver Mikroorganismus mit Prolin-Acylase-Aktivität), Agrobacterium / Rhizobium, Bacillus, Pseudomonas oder Alcaligenes. Insbesondere werden Mikroorganismen der Spezies Arthrobacter sp. HSZ5 mit der Bezeichnung DSM 10328 Agrobacterium / Rhizobium HSZ30, Bacillus simplex K2, Pseudomonas putida K32, Alcaligenes piechaudii K4 oder Alcaligenes xylosoxydans ssp denitrificans HSZ 17 mit der Bezeichnung DSM 10329, sowie deren funktionell aequivalente Varianten und Mutanten, isoliert. Die Mikroorganismen DSM 10329 und DSM 10328 wurden am 6.1 1 .1995 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkultur GmbH, Mascheroderweg 1b, D-38124 Braunschweig, gemäss Budapester Vertrag hinterlegt.
Unter "funktionell aequivalente Varianten und Mutanten" werden Mikroorganismen verstanden, die im wesentlichen dieselben Eigenschaften und Funktionen wie die Ursprungsmikroorganismen besitzen. Derartige Varianten und Mutanten können zufallig, z . B. durch UV-Bestrahlung, gebildet werden.
Taxonomische Beschreibung von Alcaligenes xylosoxydans ssp. denitrificans HSZ17 (DSM 10329)
Eigenschaften des Stammes
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Taxonomische Beschreibung von Arthrobacter sp HSZ5 (DSM 10328)
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meso -Diaminopimelinsäure in der Zellwand : nein
Peptidoglycan-Typ: A3α, L-Lys-L-Ser-L-Thr-L-Ala 16S rDNA Sequenz-Ähnlichkeit: Sequenzierung des Bereichs mit der grössten Variabilität gab als höchste Werte 98,2% mit Arthrobacter pascens,
A. ram osus und A. oxydans
Taxonomische Beschreibung von Agrobacterium/Rhizobium HSZ30
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Die partielle Sequenzierung der 16SrDNA ergab vergleichbar hohe Ähnlichkeiten von ca. 96% zu Vertretern der Gattungen Agrobacterium und Rhizobium. Eine eindeutige Zuordnung zu einer innerhalb dieser Gattungen beschriebenen Art ist nicht möglich.
Taxonomische Beschreibung von Bacillus simplex K2
Figure imgf000009_0001
Figure imgf000010_0001
Die Analyse der zellulären Fettsäuren ergab eine Bestätigung der Zuordnung zur Gattung Bacillus.
Die partielle Sequenzierung der 16SrDNA ergab eine Ähnlichkeit von 100% zu Bacillus simplex.
Taxonomische Beschreibung von Alcaligenes piechaudii K4
Figure imgf000010_0002
Figure imgf000011_0001
Das Profil der zellulären Fettsäuren ist typisch für die Gattung Alcahgenes.
Die partielle Sequenzierung der 16SrDNA ergab eine Zuordnung von 99,3% zu der Spezies
Alcaligenes piechaudii.
Taxonomische Beschreibung von Pseudomonas putida K32
Figure imgf000011_0002
Figure imgf000012_0001
Das Profil der zellulären Fettsäuren ist typisch für Pseudomonas putida.
Die partielle Sequenzierung der 16SrDNA ergab Ähnlichkeiten von ca . 98% zu Pseudomonas mendocina und Pseudomonas alcaligenes. Die Ähnlichkeit zu Pseudomonas putida betrug 97,4%. Aufgrund der phänotypischen Daten kann dieser Stamm aber eindeutig der Spezies
Pseudomonas putida zugeordnet werden.
Die erfindungsgemässen Enzyme, die N-Acyl-L-Prolin-Acylasen, können z. B . durch fach- männisch übliches Aufschliessen der beschriebenen Mikroorganismenzellen gewonnen werden, vorzugsweise werden die Enzyme aus Arthrobacter sp HSZ5 (DSM 10329) gewonnen. Hierzu kann bspw die Ultraschall-, French-Press- oder Lysozym-Methode verwendet werden. Die Enzyme sind durch folgende Eigenschaften gekennzeichnet: N-Acyl-L-Prolin-Acylase gekennzeichnet durch folgende Eigenschaften : a) Substratspezifitat :
hydrolysiert wird N-Benzyloxycarbonyl-L-Prolin,
N-Benzoyl-L-Prolän,
N-Isobutoxycarbonyl-L-Prolin
N-Benzyloxycarbonyl-L-Pyroglutamat,
N-Benzyloxycarbonyl-DL-Pipecolinsäure,
N-Benzyloxycarbonyl-L- Alanin, b) pH-Optimum :
das pH-Optimum ist bei pH 6,5 ± 0,2 c) Temperatur-Stabilität:
bis 43 °C und pH 6,5 ist nach όstundiger Inkubation kein Aktivitätsverlust nachweisbar. d) Temperaturaktivität:
bei 50 °C und pH 6,5 ist gute Aktivität nachweisbar e) Einflüsse von Inhibitoren:
inhibierend wirken Benzylalkohol und N-Benzyloxycarbonyl-D-Prolin Das erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung von N-geschützten cyclischen D-Amino- säurederivaten der allgemeinen Formel ll und / oder von einem cyclischen L-Ammosäure- derivat der allgemeinen Formel III
Figure imgf000014_0001
worin A zusammen mit -N- und -CH einen gegebenenfalls substituierten 4-, 5- oder 6- gliedrigen gesättigten heterocyclischen Ring und R -(CH2)2-COOH, jeweils gegebenenfalls substituiertes Alkyl, Alkoxy, Aryl oder Aryloxy bedeutet, erfolgt derart, dass man im racemischen N-geschützten cyclischen Aminosäurederivat der allgemeinen Formel
Figure imgf000014_0002
worin A zusammen mit -N- und -CH und R3 die genannte Bedeutung haben, das N-geschützte cyclische L-Aminosäurederivat mittels den bereits beschriebenen Mikroorganismen oder mittels deren zellfreien Enzyme ins cyclische L-Aminosäurederivat (Formel III) überführt und dieses gegebenenfalls isoliert, wobei bei der Biotransformation neben dem L-Aminosäurederivat das N-geschützte D-Aminosäurederivat (Formel II) anfallt, das gegebenenfalls isoliert wird.
Das erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung von N-geschützten aliphatischen D- Aminosäurederivaten der allgemeinen Formel V und / oder von einem aliphatischen L- Aminosäurederivat der allgemeinen Formel VI
Figure imgf000015_0001
worin R3 die genannte Bedeutung hat, R4 Wasserstoff, eine gegebenenfalls substituierte unverzweigte Alkylgruppe oder eine ω-Hydroxyalkylgruppe und R5 Wasserstoff oder eine gegebenenfalls substituierte unverzweigte Alkylgruppe bedeutet, erfolgt analog zu den entsprechenden cyclischen Aminosäurederivaten. Als Edukt wird dafür ein racemischesN- geschütztcs aliphatisches Aminosäurederivat der allgemeinen Formel
Figure imgf000015_0002
worin R3, R4 und R5 die genannte Bedeutung haben, eingesetzt.
Beispiele für gegebenenfalls substituierte gesättigte 5-gIiedrige heterocyclische Ringe sind Prolin, Pyrazolidin, Imidazolidin, Oxazolidin, Isoxazolidin, Thiazolidin, Triazolidin. Als substituierter gesättigter 5-gliedriger heterocyclischer Ring kann beispielsweise 5-Oxoprolin (Pyroglutamat) verwendet werden.
Beispiele für gegebenenfalls substituierte gesättigte 6-gliedrige heterocyclische Ringe sind Piperazin, Pipecolin, Morpholin, Chinolinan, Isochinolinan, Chinoxalin. Als 4-gliedriger gegebenenfalls substituierter gesättigter heterocyclischer Ring kann Azetidin verwendet werden. Alkyl wird im folgenden als eine C1-18-Alkylgruppe, substituiert oder unsubstituiert, definiert Beispiele für eine C1-18-Alkylgruppe sind Methyl, Chlormethyl, Hydroxymethyl, Ethyl, Propyl, Butyl, i-Butyl, i-Propyl, Stearyl. Unverzweigtes Alkyl wird im folgenden als Methyl, Ethyl, Propyl oder Butyl definiert Als ω-Hydroxyalkylgruppe wird im folgenden Hydroxymethyl, Hydroxyethyl, Hydroxypropyl oder Hydroxybutyl definiert.
Alkoxy wird im folgenden als eine C1-18-Alkoxygruppe, substituiert oder unsubstituiert, definiert Beispiele für eine C1-18-Alkoxygruppe sind Methoxy, Fluorenylmethoxy, Ethoxy, Propoxy, Butoxy, t-Butoxy, i-Butoxy, Stearoxy.
Als gegebenenfalls substituierte Aryl- oder Aryloxygruppe können die gleichen wie die zuvor beschriebenen eingesetzt werden .
Besonders bevorzugte N-geschützte cyclische oder aliphatische Aminosäurederivate (Edukte, der Formel IV oder VII) sind : N-Z-Prolin (R3 = Benzyloxy), N-t-Butoxycarbonyl-Prolin (R3 = t-Butoxy), N-Acetyl-Prolin (R3 = Methyl), N-Succinyl-Prolin (R1 = -(CH2)2-COOH), N- Phenylacetyl-Prolin (R3 = Benzyl), N-Benzoyl-Prolin (R 3 =Phenyl), N-Chloracetyl-Prolin (R3 = Chlormethyl), N-i-Butoxycarbonyl-Prolin (R 3 = i-Butoxy), N-Z-Pipecolinsäure (R3 = Benzyloxy; 6-gliedriger gesättigter heterocyclischer Ring = Pipecolin), N-Z-Alanin (R3 = Benzyloxy, R4 = Methyl, R5 = Wasserstoff), N-Z-Serin (R3 = Benzyloxy, R4 = Hydroxyethyl, R5 = Wasserstoff, N-Z-Pyroglutamat (R3 = Benzyloxy; 5-gliedriger gesättigter substituierter heterocyclischer Ring = 5-Oxoprolin) und N-Z-Sarcosin (R3 = Benzyloxy, R 5 = Methyl).
Die Herstellung von racemischen N-geschutzten cyclischen oder aliphatischen Aminosäuren bzw. dessen Derivate ist im Prinzip bekannt. Dabei wird die entsprechende L-Aminosäure auf bekannte Weise gemäss der EP-A 0 057 092 racemisiert, welche dann wiederum auf bekannte Weise mit der entsprechenden N-Schutzgruppe gemäss Grassmann & Wünsch (Chem. Ber. 91 (1958), 462 - 465) umgesetzt wird.
Nicht bekannt ist ein Verfahren zur Herstellung von N-geschützten cyclischen oder aliphatischen Aminosäuren ausgehend von der entsprechenden L-Aminosäure, bei dem die
Racemisierung und die Einführung der Schutzgruppe in wässrigem Milieu, ohne Isolation der racemischen Aminosäure, durchgeführt wird. Prinzipiell ist die Biotransformation mit allen Mikroorganismen möglich, die ein N-geschütztes Prolinderivat in Form des Racemats oder seiner optisch aktiven Isomere als einzige Stickstoffquelle, als einzige Kohlenstoffquelle oder als einzige Kohlenstoff- und Stickstoffquelle verwerten. Ebenfalls geeignet sind die aus den Mikroorganismen isolierten N-Acyl-L-Prolin- Acylasen Für das Verfahren besonders geeignet sind die zuvor beschriebenen Mikroorganismen der Gattung Arthrobacter, Alcaligenes, Agrobacterium / Rhizobium, Bacillus,
Pseudomonas, insbesondere der Spezies Agrobacterium / Rhizobium HSZ30, Bacillus simplex K2, Arthrobacter sp. HSZ5, Alcaligenes xylosoxydans ssp. denitrificans HSZ17 (DSM 10329), Pseudomonas putida K32 oder Alcaligenes piechaudii K4, bzw. deren funktionell aequivalente Varianten und Mutanten.
Die Biotransformation kann nach üblichem Anzüchten der Mikroorganismen mit ruhenden Zellen (nicht wachsende Zellen, die keine Kohlenstoff- und Energiequelle mehr benötigen) oder mit wachsenden Zellen durchgeführt werden. Vorzugsweise wird die Biotransformation mit ruhenden Zellen durchgeführt.
Für die Biotransformation können fachmännisch übliche Medien eingesetzt werden, wie bspw. niedermolare Phosphatpuffer, Tris-Puffer, oder das in Tabelle 1 beschriebene Medium.
Vorzugsweise wird die Biotransformation in dem Medium gemäss Tabelle 1 durchgeführt.
Zweckmässig wird die Biotransformation unter einmaliger oder kontinuierlicher Zugabe von einem N-geschützten Aminosäurederivat so durchgeführt, dass die Konzentration 50 Gew. %, vorzugsweise 20 Gew. %, nicht übersteigt. Der pH-Wert des Mediums kann in einem Bereich von 3 bis 12, vorzugsweise von 5 bis 9, liegen. Zweckmässig wird die Biotransformation bei einer Temperatur von 10 bis 70 °C, vorzugsweise von 20 bis 50 °C, durchgeführt.
Gemäss des erfindungsgemässen Verfahrens wird ein N-geschütztes cyclisches oder aliphatisches Aminosäurederivat vollständig in ein cyclisches oder aliphatisches L-Aminosäurederivat überführt. Dabei fallt ein N-geschütztes D-Aminosäurederivat in guter Ausbeute und
Enantiomeren-Reinheit (ee grösser als 98%) an, welches dann isoliert wird.
Das auf diese Weise gewonnene N-geschützte D-Aminosäurederivat und / oder L-Aminosaurederivat kann durch übliche Aufarbeitungsmethoden wie z. B. durch Extraktion isoliert werden.
Beispiel 1:
Selektion von N-Z-L-Prolin-verwertenden Mikroorgansimen
Zunächst wurde ein Minimalmedium (Tabelle 1) hergestellt, das die Wachstumsansprüche vieler Mikroorganismen erfüllt :
Tabelle 1 : Minimalmedium
Figure imgf000018_0001
Als C-Quelle wurde Fructose (5 g/l) beigefügt. Um Mikroorganismen anzureichern, die in der Lage sind, N-Z-L-Prolin selektiv zu hydrolysieren, wurde diesem Grundmedium N-Z-L-Prolin (5 g/l) als einzige N-Quelle zugesetzt. Verschiedene Ansätze wurden dann mit Erdproben unterschiedlicher Standorte inokuliert und solange inkubiert (30 °C, 120 rpm), bis deutlich sichtbares Wachstum zu erkennen war. Ein Aliquot dieser Kultur wurde dann in ein gleich großes Volumen frischen Mediums überimpft und erneut bis zu deutlicher Trübung inkubiert. Dieser Vorgang wurde dreimal wiederholt. Die angereicherten Mikroorganismen wurden anschließend auf einem Festmedium (gleiche Zusammensetzung wie Flüssigmedium, nur Zusatz von 20 g/l Agar-Agar) vereinzelt und gereinigt, Auf diese Weise wurden etwa 30 verschiedene bakterielle Isolate erhalten, die befähigt waren, N-Z-L-Prolin als einzige N-Quelle zu verwerten.
Beispiel 2:
Anzucht der selektierten Mikroorganismen
Die mit der in Beispiel 1 beschriebenen Methode erhaltenen Isolate wurden in dem dort beschriebenen Medium vermehrt. Alle Kulturen, die eine ausreichende Zelldichte (OD650 2,0) aufwiesen, wurden durch Zentrifugation geerntet. Die sedimentierten Zellen wurden in 0,85% NaCl resuspendiert und gewaschen.
Nach erneutem Resuspendieren in NaCl-Lösung wurde mit ruhenden Zellen die Fähigkeit zur Hydrolyse von N-Z-L-Prolin getestet Dazu wurde eine geeignete Menge an Zellen mit N-Z-L- Prolin (5 g/l) in Pufferlösung (50 mM Tris/Cl, pH 7,0) inkubiert (30 °C) Zu verschiedenen Zeitpunkten wurden Aliquots entnommen und über Dünnschichtchromatographie auf die Freisetzung von Prolin aus N-Z-Prolin hin überprüft. Mehrere Isolate wiesen diese hydrolyti- sehe Aktivität auf, vor allem die beiden von der DSM als Arihrohacter sp. und Alcahgenes xylosoxydans ssp. denilnficans bestimmten Stämme HSZ5 und HSZ17.
Beispiel 3:
Wachstum und enzymatische Aktivität von Arthrobacer sp. HSZ5 (DSM 10328)
Arthrobacter sp HSZ5 wurde mit verschiedenen C- (N-Z-L-Prolin als N-Quelle) bzw N- Quellen (Fructose als C-Quelle) angezogen C-Quellen wurden auf 5 g/l, N-Quellen auf 2 g/l beigefugt Zur Induktion der gewünschten enzymatischen Aktivität wurde außerdem, soweit notwendig, 1 g/l N-Z-L-Prolin zugesetzt. Von den getesteten C-Quellen konnten nur Fructose, Glucose, Saccharose und Mannit verwertet werden. In allen anderen Fallen wurde N-Z-L- Prolin als C-Quelle verwendet. Die enzymatische Aktivität war nur in geringem Umfang von der eingesetzten C-Quelle abhängig. Im Gegensatz dazu konnten alle getesteten N-Quellen verwertet werden, die enzymatische Aktivität war allerdings, z. T. deutlich, verringert (Tabelle 2) :
Tabelle 2: Wachstum und enzymatische Aktivität von Arthrobacter sp . HSZ5 bei Anzucht mit verschiedenen C- (A) bzw . N- (B) Quellen
Figure imgf000020_0001
Figure imgf000021_0001
Beispiel 4:
Induktoren der N-Acyl-L-Prolin Acylase
Arthrobacter sp HSZ5 wurde in Minimalmedium (Beispiel 1 ) mit Fructose (5 g/l) als C-Quelle und L-Glutamat (2 g/l) als N-Quelle angezogen. Zusätzlich wurden N-Z-L-Prolin, N-Z-DL- Prolin, N-Z-D-Prolin, N-Z-Sarcosin, N-Z-Diethylamin, N-Z-Glycin, L-Phenylalaninamid, Benzamid, N-Acetyl-L-Prolin, N-Acetyl-Glycin, Acetamid (jeweils 1 g/l) oder Gelatine (5 g/l) beigefugt Nach Ernte der Zellen wurden mit ruhenden Zellen jeweils die enzymatische
Aktivität gegen N-Z-L-Prolin bzw N-Z-D-Prolin getestet (wie in Beispiel 2 beschrieben). Der analytische Nachweis von Prolin per HPLC zeigte, daß einzig N-Z-L-Prolin und N-Z-DL- Prolin die gewünschte enzymatische Aktivität induzierten, wobei in beiden Fällen nur N-Z-L- Prolin als Substrat akzeptiert wurde, d . h. die Selektivität des Enzyms war in beiden Fällen hoch .
Beispiel 5:
Herstellung von N-Z-D-Prol in
a) Arthrobacter sp. HSZ5 wurde in Minimalmedium (Beispiel 1 ) mit Fructose (5 g/l) als C- Quelle und N-Z-L-Prolin (5 g/l) als N-Quelle angezogen. Die Zellen wurden, wie zuvor beschrieben, geerntet und gewaschen. Die ruhenden Zellen (OD650 = 30) wurden unter pH-Stase (pH 7,0) und unter Rührung mit N-Z-DL-Prolin (50 g/l) bei 30 °C inkubiert. Zu verschiedenen Zeitpunkten wurden Aliquots entnommen und per HPLC wurde die Konzentration an N-Z-L-Prolin und N-Z-D-Prolin verfolgt (s. Abbildung 1 ) . Nach 60 Minuten war N-Z-L-Prolin nahezu vollständig hydrolysiert, wahrend N-Z-D-Prolin unverändert in der Lösung vorlag. In Lösung lag damit N-Z-D-Prolin in hoher optischer Reinheit vor (ee > 99%) : Arthrobacter sp. HSZ5 wurde in einem Chemap-Fermenter (Arbeitsvolumen 2 1) in
Minimalmedium (s Beispiel 1 ) mit Glucose (30 g/l) und L-Prolin (7 g/l) als C- bzw N- Quelle bei 30 °C auf eine Zelldichte von OD650 > 35 angezogen Um die enzymatische Aktivität zu induzieren, wurde dann eine geringe Menge N-Z-DL-Prolin (5 g/l) zugesetzt und einige Zeit weiter inkubiert Schließlich wurden weitere 145 g N-Z-DL-Prolin über einen Zeitraum von 20 h kontinuierlich zugegeben und dann weitere fünf Stunden inkubiert. Anschließend wurden die Zellen durch Zeπtrifugation abgetrennt Die Fer- mentationsbruhe wurde mit Hilfe von Salzsaure auf einen pH < 3 eingestellt und N-Z- Prolin, das unter diesen Bedingungen nahezu wasserunlöslich ist, wurde durch Extraktion mit Hilfe von Butylacetat gewonnen. Durch Trennung der beiden Phasen erhielt man eine wäßrige Lösung von L-Prolin sowie N-Z-Prolin in organischem Lösungsmittel. Die organische Phase wurde unter Vakuum eingeengt und das erhaltene N-Z-Prolin wurde in Ethylacetat gelost und durch Zugabe von Hexan auskristallisiert. Dabei wurden 41. 4 g N-Z-D-Prolin in kristalliner Form isoliert (53.4% der Theorie), dessen Identität und Reinheit über 1H-NMR und Schmelzpunktbestimmung (75.3 °C) bestätigt wurde und das eine ausgezeichnete optische Reinheit (ee > 99. 5% nach HPLC, []D = 60.0 für c =
1 in Essigsäure) aufwies.
Figure imgf000022_0001
c) In einem Fermenter (Nennvolümen 20 1) wurde Arthrobacter sp HSZ5 in 6 1
Minimalmedium (vgl. Beispiel 1 ) mit Glucose (20 g/l) und L-Prolin (7 g/l) als C- bzw. N- Quelle bei 30 °C auf eine Zelldichte von OD650 > 30 angezogen. Zur Induktion der enzymatischen Aktivität wurden dann 1 12 g einer 50 % (w/w) N-Z-DL-Prolin-Lösung zugesetzt und 1 h weiter inkubiert. Anschliessend wurde das Volumen der Kultur durch Ablassen der nicht benotigten Menge auf 4 1 reduziert. Zu diesen 4 1 Kultur mit induzierten Zellen wurden dann weitere 709 g der 50 % (w/w) N-Z-DL-Prolin-Lösung über einen Zeitraum von 5,5 h kontinuierlich zugegeben und dann weitere 17,5 h inkubiert. Während der Biotransformation wurde der pH bei 7,5 - 8,5 gehalten. Nach
Beendigung der Umsetzung fielen 4077 g Zellsuspension an, von der die Zellen durch Ultrafiltration abgetrennt wurden. Ein Aliquot (1000 g) der anfallenden
Fermentationsbrühe wurde wie unter 6a) beschrieben aufgearbeitet. Dabei wurden 31,24 g N-Z-D-Prolin in kristalliner Form isoliert (85,0 % der Theorie), das in Bezug auf Reinheit (titrimetrischer Gehalt = 99,6 %) und optische Reinheit (ee > 99,5 % nach
HPLC, [α]D24 = 60,2 für c = 2 in Essigsäure) ausgezeichnete Werte aufwies. d) In einem 450 1-Fermenter wurde Arthrobacter sp. HSZ5 in 250 kg Minimalmedium (vgl.
Beispiel 1 ) mit Glucose (13 g/l) und L-Prolin (7 g/l) als C- bzw. N-Quelle bei 30 °C auf die gewünschte Zelldichte (OD650 ca .25) angezogen. Durch Zugabe von 4 kg einer 50
% (w/w) N-Z-DL-Prolin-Lösung wurde dann die enzymatische Aktivität induziert. Nach einer Inkubationszeit von 1 h, in der der pH langsam erhöht wurde (pH = 7,5 - 8,5), wurden unter pH-Stase weitere 67 kg der 50 % (w/w) N-Z-DL-Prolin-Lösung mit einer Rate von 20 kg/h zugegeben und dann weitere 20 h inkubiert, wobei infolge der schnellen Umsetzung (maximale Rate ca. 12 g N-Z-L-Prolin hydrolysiert/l x h) die
Reaktion bereits 8h nach Induktion nahezu abgeschlossen war (ee > 98 %). Aus den schliesslich anfallenden 320 kg Kultur wurden die Zellen durch Ultrazentrifugation abgetrennt und ein Aliquot (1444 g) der zellfreien Fermentationsbrühe wurde wie unter 6a) beschrieben aufgearbeitet Dabei wurden 50,0 g N-Z-D-Prolin (83,2 % der Theorie) in kristalliner Form mit sehr guter Reinheit (titrimetrischer Gehalt > 99 %) bzw. optischer
Reinheit (ee > 99 % nach HPLC) isoliert. Abbildung 1 : Enzymatische Hydrolyse von N-Z-L-Prolin durch ruhende Zellen von
Arthrobacter sp HSZ5.
Figure imgf000024_0001
[ ]
Beispiel 6:
Raccmisierung von L-Prolin
500 mMol L-Prolin wurden in 125 ml 4 N NaOH (500 mMol) gelöst. Diese Lösung wurde dann in einem Druckgefäß aul 160 °C erhitzt und 6 h bei dieser Temperatur gehalten, wobei cin Druck von maximal 4,5 bar auftrat. Nach dem Abkühlen der Lösung konnte anhand des Drchwcrlcs ([ ]54520 = -1 ,5) gezeigt werden, daß Prolin nahezu vollständig racemisch vorlag. Ähnliche Ergebnisse konnten erzielt werden, wenn die Raccmisierung mit nur 0, 15 Mol-Äquivalcntcn NaOH durchgeführt wurde. Allerdings mußte die
Reaktionsdauer auf 16 h erhöhl werden. Beispiel 7:
Herstellung von N-Z-(DL)-Prolin
100,0 g DL-Prolin wurden in 217 ml 4 N NaOH gelöst. Zu dieser Lösung wurde unter Thcrmostatisicrung (5 - 10 °C) und pH-Slasc (pH = 11 ,5 - 12,0) Chlorameisensäure- bcnzylcster (Z-Cl) zugetropft. Insgesamt wurden dabei 158,1 g Z-Cl und weitere 251 ,2 g 4 N NaOH zugesetzt. Außerdem wurden 150 ml destilliertes Wasser beigefügt, um die Rührbarkcit der Rcaklionsmischung aufrecht zu erhalten. Mit konzentrierter Salzsäure (76 ml) wurde dann auf pH = 2,4 angesäuert und mit insgesamt 584 ml Butylacetat extrahiert. In der organischen Phase enthaltenes N-Z-DL-Prolin wurde analog zum Vorgehen in Beispiel 6 kristallisiert. Auf diese Weise wurden 187,4 g N-Z-DL-Prolin (86,5% d. Th.) erhalten.
Beispiel 8:
Herstellung von N-Z-(DL)-Prolin (Eintopfreaktion)
80,0 g L-Prolin wurden in 174 ml 4 N NaOH gelöst und diese Lösung wurde in einem Druekgcfäß auf 160 °C erhitzt. Diese Temperatur wurde für 6 h beibehalten, wobei ein Druck von maximal 4,4 bar auftrat. Nachdem die Lösung abgekühlt war, wurde anhand des Drehwerts ([I545 = -0,6) die nahezu vollständige Racemisierung festgestellt. Zu dieser Lösung von DL-Prolin wurde nun unter Thermostatisierung (4 °C) und pH-Stase (pH = 11,5 - 12.0) Chlorameiscnsäurcbcnzyleslcr (Z-Cl) zugetropft. Insgesamt wurden dabei 124,5 g Z-Cl und weitere 203,7 g 4 N NaOH zugesetzt, sowie 50 ml destilliertes Wasser, um die Rührbarkcit der Reaktionsmischung zu gewährleisten. Nun wurde durch Zugabc von 4,7 g konzentrierter Salzsäure neutralisiert. Nach Zugabc von 200 ml Butylacetat wurde der pH der wäßrigen Phase schließlich durch Zugabc von 67,4 g konzentrierter Salzsäure auf 2,0 eingestellt. Die wäßrige Phase wurde abgetrennt und mit insgesamt noch einmal 200 ml Butylacetat extrahiert. Die organischen Phasen wurden vereinigt und N-Z-DL-Prolin wurde analog zum Vorgehen in Beispiel 6 kristallisiert. Auf diese Weise wurden 151 ,3 g N-Z-DL- Prolin (87,3% d. Th.) erhallen.
Beispiel 9:
Charakterisierung der N-Acyl-L-Prolin-Acylase von Arthrobacter sp. HSZ5 a) pH-Optimum der N-Acyl-L-Prolin-Acylase
Arthrobacter sp HSZ5 wurde in dem in Tabelle 1 beschriebenen Medium mit Fructose (5 g/l) und N-Z-L-Prolin (5 g/l) als C- bzw. N-Quelle angezogen (30 °C, 120 rpm). Nach Erreichen der gewünschten Zelldichtc wurden die Zellen durch Zentrifugation geernlel, in Kochsalz- Lösung (0,9%) gewaschen und in dieser schliesslich auch resuspendiert. Die enzymatische Aktivität in Abhängigkeit des pH- Wertes wurde unter Beibehaltung aller anderen Parameter (30 °C, 50 g/l N-Z-L-Prolin, OD650 = 15 - 20) bestimmt. Als
100% - Wert wurde das Ergebnis des Ansatzes bei pH = 7,0 eingesetzt.
Abbildung 2: Aktivität der N-Acyl-L-Prolin-Acylase von Arthrobacter sp. HSZ5 in Abhängigkeit vom pH-Wert.
Figure imgf000026_0001
Dabei ergab sich eine typische Optimumskurve mit einem Optimum im Bereich von pH = 6,4 - 6,6. Bei pH = 5,0 und pH = 8,5 konnte keine enzymatische Aktivität mehr festgestellt werden. Aktivität der N-Acyl-L-Prolin-Acylase von Arthrobacter sp. HSZ5 in Abhängigkeit von der Temperatur
Zellen mit N-Acyl-L-Prolin-Acylase-Aktivitat wurden wie unter 9a) beschrieben hergestellt. Dieses Mal wurde die enzymatische Aktivität unter Variation der Temperatur bestimmt. Alle anderen Parameter wurden konstant gehalten (pH 6,5, 50 g/l N-Z-L-Prolin, OD650 ~ 20 - 25). Als 100% - Wert wurde das Ergebnis des Ansatzes bei 30 °C eingesetzt.
Abbildung 3: Aktivität der N-Acyl-L-Prolin-Acylase von Arthrobacter sp. HSZ5 in Abhängigkeit von der Temperatur.
Figure imgf000027_0001
Die enzymatische Aktivität steigt in Form einer leicht sigmoidalen Kurve an Selbst bei 50 °C ist noch gute Aktivität feststellbar, was auf eine gute Stabilität des Enzyms hindeutet. c) Stabilität der N-Acyl-L-Prolin-Acylase von Arthrobacter sp. HSZ5 in Abhängigkeit von der Temperatur
Zellen mit N-Z-L-Prolin-Acylase-Aktivität wurden wie unter 9a) beschrieben hergestellt. Um die Stabilität des Enzyms zu bestimmen, wurden dann Aliquots der Zellsuspension (gerührt, pH = 6,5, OD650 ~ 40 - 50) bei verschiedenen Temperaturen inkubiert und zu unterschiedlichen Zeitpunkten Proben gezogen, die unter Standardbedingungen (30 °C, pH = 6,5, 50 g/l N-Z-L-Prolin, OD650 ~ 15 - 20) auf die verbliebene Aktivität der N-Acyl- L-Prolin-Acylase hin analysiert wurden . Folgende Ergebnisse wurden dabei beobachtet :
• bis 43 °C war für wenigstens sechs Stunden volle Aktivität nachweisbar
• bei Temperaturen zwischen 43 °C und 53 °C kam es zunächst sogar zu einem Anstieg der Aktivität, danach aber zu einem geringen Aktivitatsverlust, so dass nach fünf bis sechs Stunden noch ca. 80% der Anfangs-Aktivitat vorhanden war
• höhere Temperaturen führten zur Inaktivierung des Enzyms (50% Restaktivitat nach zwei Stunden bei 60 °C bzw. vollständige Inaktivierung nach einer Stunde bei 65 °C) d) Einfluss von Produkt-Hemmung auf die Aktivität der N-Acyl-L-Prolin-Acylase von
Arthrobacter sp. HSZ5 Zellen mit N-Acyl-L-Prolin-Acylase-Aktivitat wurden wie unter 9a) beschrieben hergestellt . Aliquots der Zellsuspension wurden dann mit verschieenen Konzentrationen der bei der Hydrolyse von N-Z-L-Prolin anfallenden Produkte (L-Prolin, N-Z-D-Prolin, Benzylalkohol) für 30 Minuten inkubiert (30 °C, pH 6,4), bevor die enzymatische Aktivität der jeweiligen Ansätze unter Standardbedingungen (30 °C, pH = 6,5, 50 g/l N-Z-L-Prolin, OD650 - 15 - 20) bestimmt wurde Als 100% - Wert wurde dabei das Ergebnis des Ansatzes, der ohne Zusatz eines der Produkte inkubiert worden war, eingesetzt.
Abbildung 4: Aktivität der N-Acyl-L-Prolin-Acylase von Arthrobacter sp. HSZ5 in Abhängigkeit von der Konzentration der Produkte.
Figure imgf000029_0001
Dabei zeigt sich, dass L-Prolin auch in hoher Konzentration keinerlei Hemmung der enzymatischen Aktivität verursacht N-Z-D-Prolin und Benzylalkohol fuhren hingegen zu einer drastischen Verringerung der Enyzm-Aktivitat mit zunehmender Konzentration. Während N-Z-D-Prolin als kompetitiver Inhibitor zu wirken scheint (linear zunehmende Hemmung mit steigender Konzentration), hemmt Benzylalkohol eher in nicht-kompetitiver Art und Weise (wirksam oberhalb einer Grenzkonzentration). Beispiel 10:
Substrat-Spektrum verschiedener Stämme mit N-Acyl-L-Prolin-Acylase a) Wachstum mit verschiedenen N-geschützten Aminosäuren als einziger N-Quelle Arthrobacter sp HSZ5, Alcaligenes xylosoxidans ssp . denitrificans HSZ 17,
Agrobacterium/Rhizobium HSZ30, Bacillus simplex K2, Alcaligenes piechaudii K4 und Pseudomonas putida K32 wurden in dem in Tabelle 1 beschriebenen Medium mit Fnictose (5 g/l) als C-Quelle angezogen (30 °C, 120 rpm) Als einzige N-Quelle (5 g/l) wurden jeweils verschiedene N-geschützte Aminosäuren zugesetzt. Bei Erreichen einer Zelldichte von OD650 > 0,5 wurde der Ansatz als positiv bewertet.
Tabelle 3: Wachstum verschiedener Stämme mit verschiedenen N-geschützten
Aminosäuren als einziger N-Quelle.
Figure imgf000030_0001
b) Enzymatische Hydrolyse verschiedener N-geschützter Aminosäuren Arthrobacter sp.
HSZ5, Alcaligenes xylosoxidans ssp. denitrificans HSZ 17, Agrobacterium/Rhizobium HSZ30, Bacillus simplex K2, Alcaligenes piechaudii K4 und Pseudomonas putida K32 wurden in dem in Tabelle 1 beschriebenen Medium mit Fructose (5 g/l) und N-Z-L-Prolin (5 g/l) als C- bzw. N-Quelle angezogen (30 °C, 120 rpm). Nach Erreichen der gewünschten Zelldichte wurden die Zellen durch Zentrifugation geerntet und in Kochsalz- Lösung (0,9%) gewaschen . Nachdem alle Stamme auf die gewünschte enzymatische Aktivität hin getestet worden waren, wurden die Zellen dann in 100 mM Kaliumphosphat- Puffer (pH 7,0) resuspendiert Nach Zugabe verschiedener N-geschutzter Aminosäuren
(Endkonzentration 100 mM) wurden die Ansätze unter Schuttein bei 30 °C inkubiert, wobei in geeigneten Abstanden Proben entnommen wurden Diese Proben wurden anschliessend auf die Hydrolyse der eingesetzten Substrate hin analysiert. Tabelle 4: Enzymatische Hydrolyse verschiedener N-geschutzter Aminosäuren durch ganze Zellen verschiedener, N-Acyl-L-Prolin-Acylase enthaltender Stamme.
Figure imgf000031_0001
Figure imgf000032_0001
Figure imgf000033_0001

Claims

Patentansprüche:
1. Mikroorganismen, dadurch gekennzeichnet, dass sie bclähigt sind, ein N-geschϋtztes Prolinderivat der allgemeinen Formel
Figure imgf000034_0001
in Form des Racemats oder eines seiner optisch aktiven Isomere, worin R1 -(CH2)2- COOH, jcwcils gegebenenfalls substituiertes C1-4-Alkoxy, Aryl oder Aryloxy und R2 Wasserstoff oder =O bedeutet als einzige Stickstoffquclle, als einzige
Kohlenstoffquelle oder als einzige Kohlenstoff- und Stickstoffquclle zu verwerten.
2. Mikroorganismen nach Anspruch 1 , die befähigt sind, ein N -geschütztes L- Prolinderival der allgemeinen Formel I als einzige Stickstoff quelle, einzige
Kohlenstoffquelle oder als einzige Kohlenstoff- und Stickstoffquelle zu verwerten.
3. Mikroorganismen nach Anspruch 1 oder 2 der Gattung Arthrobacter, Agrobacterium / Rhizobium. Bacillus, Pseudomonas oder Alcaligenes.
4. Mikroorganismen nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3 der Spezies
Arthrobacter sp HSZ5 (DSM 10328), Alcaligenes xylosoxydans ssp. dentirificans
HSZ17 (DSM 10329), Agrobacterium / Rhizobium HSZ30, Bacillus simplex K2, Pseudomonas putida K32 oder Alcaligenes piechaudii K4 sowie deren funktionell aequivalente Varianten und Mutanten.
N-Acyl-L-Prolin-Acyiasc, gekennzeichnet durch folgende Eigcnschalten
a) Subslr.ilspe/ililät :
hvdrolysierl wird N-Benyloxycarbonyl-L-Prυlin,
N-Bcn/oyl-L-Prolin,
N-Isobutoxycarbonyl-L-Prolin,
N-Bcn/yloxycarbonyl-L-Pyroglutamal,
N-Ben/yloxycarbonyl-DL-Pipecolinsäure,
N-Bcnzyloxycarbonyl-L-Alanin, b) pH-Optimum
das pH-Optimum ist bei pH 6,5 ±0,2 c) Temperatur-Stabilität:
bei 43 °C und pH 6,5 ist nach 6slündιger Inkubation kein Aktivitätsverlust nachweisbar d) Tcmpcraturaktivität:
bei 50 °C und pH 6,5 ist gute Aktivität nachweisbar e) Einllussc von Inhibitoren :
inhibierend wirken Benzylalkohol und N-Benzyloxycarbonyl-D-Prolin . Verfahren zur Herstellung von einem N-geschützten cyclischen D-Aminosäurcdcrivat der allgemeinen Formel II und / oder von einem cyclischen L-Aminosäurederivat der allgemeinen Formel III
Figure imgf000036_0001
worin A zusammen mit -N- und -CH einen gegebenenfalls substituierten 4-, 5- oder 6- gliedrigen gesättigten hcterocyclischcn Ring und R 3 -(CH2)2-COOH, jeweils gegebenenfalls substituiertes Alkyl, Alkoxy, Aryl oder Aryloxy bedeutet, dadurch gekennzeichnet, dass man im racemischen N-gcschützlen cyclischen
Aminosäurederivat der allgemeinen Formel
Figure imgf000036_0002
worin A zusammen mil -N- und -CH und R3 die genannte Bedeutung haben, das N- geschülzle cyclische L-Aminosäurcdcrivat mittels den Mikroorganismen gemäss den Ansprüchen 1 bis 4 oder mittels den zollfreien Enzymen gemäss Anspruch 5 ins cyclische L-Aminosäuredcrival (Formel III) überführt und dieses gegebenenfalls isoliert, wobei bei der Biotransformation neben dem cyclischen L-Aminosäurederival das N-geschützte cyclische D-Aminosäuredcrivat (Formel II) anfällt, das
gcgcbnenlalls isoliert wird.
Verfahren zur Herstellung von einem N-geschützten aliphatischen D- Aminosäurcderivat der allgemeinen Formel V und / oder von einem aliphatischen L- Aminosäurcderival der allgemeinen Formel VI
Figure imgf000037_0001
worin R3 die genannte Bedeutung hat, R4 Wasserstoff, eine gegebenenfalls
substituierte unverzweigle Alkylgruppe oder eine ω-Hydroxyalkylgruppc und R4 Wasserstoff oder eine gegebenenfalls substituierte unverzweigle Alkylgruppe bedeutet, dadurch gekennzeichnet, dass man im racemischen N-gcschützten aliphatischen Aminosaurederivat der allgemeinen Formel
Figure imgf000037_0002
worin R3, R4 und R5 die genannte Bedeutung haben, das N-gcschützte aliphatische L- Aminosäυrederivat mittels den Mikroorganismen gemäss den Ansprüchen 1 bis 4 oder mittels den zcll freien Enzymen gemäss Anspruch 5 ins aliphatische L- Aminosäurcdcrivat (Formel VI) überführt und dieses gegebenenfalls isoliert, wobei bei der Bioiransformation neben dem aliphatischen L-Aminosäurederivat das N- gcschützle aliphatische D-Aminosäurcdcrivat (Formel V) anfällt, das gegebenenfalls isoliert wird. 8. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, dass man die
Biolransformalion mittels Mikroorganismen der Galtung Arthrobacter ,
Agrobacterium / Rhizobium, Bacillus, Pseudomonas oder Alcaligenes durchführt.
9. Verfahren zur Herstellung von einem N-geschülztcn cyclischen D-Aminosäurederivat der allgemeinen Formel
Figure imgf000038_0001
worin A zusammen mit -N- und -CH einen gegebenenfalls substituierten 4-, 5- oder 6-gliedrigen gesättigten hctcrocyclischcn Ring und R 3 -(CH2)2-COOH, jeweils gegebenfalls substituiertes Alkyl, Alkoxy, Aryl oder Aryloxy bedeutet, dadurch gekennzeichnet, dass man ein cyclisches L-Aminosäurederival der allgemeinen Formel
Figure imgf000038_0002
worin A zusammen mit -N- und -CH die genannte Bedeutung hat zum entsprechenden cyclischen Aminosäurederivat racemisiert, dieses in ein N-gcschützlcs cyclisches Aminosaurederivat der allgemeinen Formel
Figure imgf000038_0003
worin A zusammen mit -N- und -CH und R3 die genannte Bedeutung haben, überführt und in letzterem das N-gcschützlc L-Aminosäurederivat mittels den Mikroorganismen gemäss den Ansprüchen 1 bis 4 oder mittels den zollfreien
Enzymen gemäss Anspruch 5 ins cyclische L-Aminosäuredcrivat überführt, dieses gegebenenfalls isoliert, wobei bei der Biotransformation neben dem cyclischen L- Aminosäurederival das N-geschülztc cyclische D-Aminosäuredcrivat (Formel II) anfällt, das isoliert wird.
10. Verfahren zur Herstellung von einem N-geschütztcn aliphatischen D- Aminosäurederivat der allgemeinen Formel
Figure imgf000039_0001
worin R3 , R4 und R5 die genannte Bedeutung haben, dadurch gekennzeichnet, dass man ein aliphatisches L-Aminosäurcderivat der allgemeinen Formel
Figure imgf000039_0002
worin R5 die genannte Bedeutung hat zum entsprechenden aliphatischen
Aminosäurederivat racemisiert, dieses in ein N-geschütztes aliphatisches
Aminosaurederivat der allgemeinen Formel
Figure imgf000039_0003
worin R3 , R4 und R5 die genannte Bedeutung haben, überführt und in letzterem das N-geschützte aliphatische L-Aminosäurcdcrivat mittels den Mikroorganismen gemäss den Ansprüchen 1 bis 4 oder mittels den zollfreien Enzymen gemäss Anspruch 5 ins aliphati.sche L-Aminosäuredcrivat überführt, dieses gegebenenfalls isoliert, wobei bci der Biotransformalion neben dem aliphatischen L-Aminosäurederival das N- geschützte D-Aminosäurederival (Formel V) anfällt, das isoliert wird. Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gckcnnzeichncl, dass man die
Umsetzung in wassrigem Milieu ohne Isolation des racemischen Aminosäurederivats durchführt.
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