WO1997032010A1

WO1997032010A1 - Procede pour la purification et l'elimination de virus

Info

Publication number: WO1997032010A1
Application number: PCT/JP1997/000457
Authority: WO
Inventors: Takashi Ueno; Kimikazu Hashino; Kiyozo Asada; Ikunoshin Kato
Original assignee: Takara Shuzo Co., Ltd.
Priority date: 1996-02-29
Filing date: 1997-02-19
Publication date: 1997-09-04
Also published as: EP0884383A1; JP4223550B2; US6194192B1; AU1733697A; KR19990087373A; EP0884383A4; KR100461701B1; TW479071B

Description

明細書ウィルスの精製および除去方法発明の属する技術分野

本発明は、研究および医薬の分野で利用可能な簡便なウイルスの処理方法及び一連の発明を提供する。従来の技術

マウス、牛、鳥、猿及びヒト等の動物の多くの疾病は、種々のウィルスにより引き起こされる。ヒトにおける代表的なウイルス性疾患としてはたとえばインフルェンザが挙げられるが、近年ではレトロウィルスである H I V (ヒト免疫不全ウィルス）により引き起こされる後天性免疫不全（A I D S ) が社会問題となつている。

—方、遗伝子工学の発展により、細胞に外来遺伝子を導入するための搔々のゥィルスべクタ一が開発されている。すでにヒトを含めた哺乳動物の細胞に遺伝子を導入するためのウィルスベクターとしてレトロウイルス、アデノウイルス、ァデノ随伴ウイルス等に由来するべクターが実用化されているが、さらにこの技術を利用してヒトの疾病を治療する遺伝子治療法が実用化されつつある。また、バキュロウィルスを利用して昆虫、あるいは昆虫細胞に導入した外来逍伝子を発現させ、所望のタンパクを大量生産する手法が注目されている。発明が解決しょうとする課題

ゥィルスにより引き起こされる疾病の予防及び治療法の一つとしてワクチンがある。ワクチンには野生型ウイルスに不活化処理を施したものや病原性の低下した弱毒性ウィルス、あるいはウィルスの構成成分の一部（例えばウィルスの表面タンパク等）などが使用される力;、一般にはこれらのワクチンの製造には精製されたウィルスが原料として使用される。このため、工業的スケールで利用可能であり、かつ信頼性の高いウィルスの精製法が必要とされている。細胞への遺伝子導入用のべクターとして使用されるウイルスは、使用される目的に応じて十分な純度、及び/あるいは濂度を維持している必要があり、簡便なウィルスの精製、饑縮法は利用価値が高い。

また、輪血用血液や血液由来製剤のような医薬品には血液の供給者が感染していたウイルスが混在している場合があり、患者へのこれらの医薬品の投与がウイルス感染症を引き起こしてしまう可能性がある。このようなウィルスの混在は治療上極めて重要な問題であり、可能ならばウィルスが完全に除去されていることが望ましい。このため、血液や製剤を 6 0〜 8 0てで加熱するなどのウィルス不活化処理が施されることがあるが、熱処理はこれらの医薬品中に含まれる成分のうちの熱安定性の低いものを不活化してしまうおそれがあり、もつと温和で効果的なゥィルスの除去方法の開発が望まれている。

本発明の目的は、上記のような種々の状況で利用できる効果的なウイルスの精製方法、及びウィルスの除去方法、ウィルス精製物、ウィルス除去物、及びウイルス吸着担体を提供することにある。

S 理を解決するための手段

本発明を概锐すれば、本発明の第 1の発明はウィルスの精製方法に関し、ウイルス含有試料中のウィルスをフコース硫酸含有多糖及び/又はその分解物に吸着させる工程を含有することを特徴とする。

また、本発明の第 2の発明はウィルスの除去方法に関し、ウィルス含有試料中のウイルスをフコース硫酸含有多糖及び又はその分解物に吸着させる工程を含有することを特徴とする。

また、本発明の第 3の発明は第 1の発明の方法で得られるゥィルス精製物に関し、第 4の発明は第 2の発明の方法で得られるウイルス除去物に関する。

さらに、本発明の第 5の発明はフコース硫酸含有多糖及び/又はその分解物を含有するウイルス吸着担体に関する。本発明者らはウイルスを含有する試料より簡単な方法でウイルスのみを単離、精製する、あるいはウイルスのみを除去する方法を見出すべく鋭意研究を重ねた結果、フコース硫酸含有多糖及び/又はその分解物が種々のウィルスに対して髙い親和性を有することを見出し、フコース硫酸含有多糖及び/又はその分解物を含有するァフィ -ティ担体を用いることにより、簡単な操作で、しかも高い純度、回収率でウィルスを精製または除去できることを見出し、本発明を完成した。図面の簡単な説明

図 1は本発明の方法によるレトロウイルスの精製を示すものである。

図 2は F F—セル口ファインと硫酸化セル口ファインのレトロウイルス吸着能の比較を示すものである。

図 3はフコース硫酸含有多糖の沈殿形成率を示すものである。

図 4はセフアクリル S— 500を用いたゲルろ過法により測定したフコース硫酸含有多糖一 Fの分子量分布を示すものである。

図 5はフコース硫酸含有多糖一 Fの I Rスぺクトルを示すものである。

図 6はフコース硫酸含有多糖一 Fの 1H— N MRスぺクトルを示すものである。図 7はェンド型フコース硫酸含有多糖分解酵素の PHと相対活性の関係を示すものである。

図 8はェンド型フコース硫酸含有多糖分解酵素の温度と相対活性の関係を示すものである。

図 9はセル口ファイン GCL— 300を用いたゲルろ過法により測定した、フコース硫酸含有多糖一 Fをェンド型フコース硗酸含有多糖分解酵素により分解する前後の分子量分布を示すものである。

図 10はセフアクリル S— 500を用いたゲルろ過法により測定したフコース硫酸含有多糖一 Uの分子量分布を示すものである。

図 1 1はフコース硫酸含有多糖一 Uの I Rスぺクトルを示すものである。

図 12はフコース硫酸含有多糖一 Uの 1H— NMRスぺクトルを示すものである。図 13は糖化合物（a) のビリジルー（2)—アミノ化糖化合物（P A— a) を L一力ラムにより分離したときの溶出パターンを示すものである。

図 14は糖化合物（b) のビリジルー（2)—アミノ化糖化合物（PA— b) を L一力ラムにより分離したときの溶出パターンを示すものである。図 15は糖化合物（c ) のビリジルー（2) —アミノ化糖化合物（PA—c) を L一力ラムにより分離したときの溶出パターンを示すものである。

図 1 6は糖化合物（a) のマス分析（ネガチイブ測定）により得られた結果を示すものである。

図 17は糖化合物（b) のマス分析（ネガティブ測定）により得られた結果を示すものである。

図 18は糖化合物（c) のマス分析（ネガティブ測定）により得られた結果を示すものである。

図 19は糖化合物（a) のマスマス分析（ネガティブ測定）により得られた結果を示すものである。

図 20は糖化合物（b) のマスマス分析（ネガティブ測定）により得られた結果を示すものである。

図 21は糖化合物（c) のマスマス分析（ネガティブ測定）により得られた結果を示すものである。

図 22は糖化合物（a) の 1H— NMRスぺクトルを示すものである。

図 23は糖化合物（b) の 1H— NMRスぺクトルを示すものである。

図 24は糖化合物（c ) の 1H— NMRスペクトルを示すものである。発明の実施の形態

以下、本発明に関して具体的に説明する。

本発明において、フコース硫酸含有多糖とは、分子中にフコース硫酸を含有する多糖であり、特に限定はないが、例えば褐藻植物、ナマコ等に含有されている〔左右田徳郎監修、江上不二夫編集、共立出版株式会社、昭和 30年 1 2月 15 曰発刊、多糖類化学、第 319頁、第 321頁〕。なお褐藻植物由来のフコース含有多糖はフコィダン、フコィジン、フカンと通称されている。本発明において使用するフコース疏酸含有多糖としては、褐藻植物、ナマコ等のフコース硫酸含有多糖含有物を、例えばそのまま乾燥、粉砕して用いても良く、またフコース硫酸含有多糖含有物よりのフコース硫酸含有多糖抽出液、該抽出液よりの精製物を使用しても良い。フコース含有多糖抽出液の調製方法、抽出液からの精製方法は公知の方法で行えばよく、特に限定はない。また、本発明に使用する、フコース硫酸含有多糖分解物とは、フコース硗酸含有多糖を酵素化学的方法、化学的方法、物理学的方法で分解して得られるものであり、公知の酵素化学的方法、化学的方法、物理学的方法を使用することができる。

また、本発明において使用するフコース硫酸含有多糖、フコース硫酸含有多糖分解物とはその薬学的に許容される塩を包含する。フコース硫酸含有多糖は硫酸基を分子中に有しており、該基は種々の塩基と反応し塩を形成する。これらのフコース硫酸含有多糖、それらの分解物は塩になった状態が安定であり、通常ナトリゥム及び/又は力リウム等の塩の形態で単離される。これらの物質の塩はダウエツクス 5 OW等の陽ィオン交換樹脂で処理することによって遊離のフコ一ス硫酸含有多糖、遊離のそれらの分解物に導くことが可能である。また、これらは、更に必要に応じ公知慣用の塩交換を行い、所望の種々の塩に交換することができる。フコース硫酸含有多糖、それらの分解物の塩としては、薬学的に許容される塩が用いられ、例えば力リゥム、ナトリクム等のアル力リ金厲塩、カルシウム、マグネシウム、バリウム等のアルカリ土類金属塩、ピリジニゥム等の有機塩基との塩、及びアンモユウム塩等が挙げられる。フコース硫酸含有多糖を含有する褐藻植物としては、例えば、山田幸雄序、瀬川宗吉著、保育社、昭和 52年発刊の原色日本海藻図鑑、第 22 ~52頁に記載の褐藻植物があり、例えば、ヒバマタ（Fucus evanescens) 、ガゴメ昆布（Kjel lean iel la crassi fol ia)> マ昆 ¾J (La覼 inaria japon ica) ゝワカメ (Undar ia pi nriatifida)等を使用し、フコース硫酸含有多糖を調製することができる。フコース硫酸含有多糖を含有するナマコとしては、例えば、特開平 4一 9 1 0 27号公報記載のナマコがあり、例えばマナマコ（Stichopus japonicus)> ニセクロナマコ（Holothuria leucospi lota)等を使用することができ、該公報記載の方法にて、フコース硫酸含有多糖を襞製することができる。フコース硫酸含有多糖には、ゥロン酸を実質的に含まず構成糖の主成分がフコースのものと、ゥロン酸を数％含み構成糖にフコースやマンノースを含むもの等がある。以下、本明細書においてはゥロン酸を実質的に含まない方をフコース硫酸含有多糖一 Fとし、ゥロン酸を含むフコース硫酸含有多糖をフコース硫酸含有多糖一とし、両者の混合物をフコース硫酸含有多糖混合物と記載する。これらのフコース硫酸含有多糖一 F、フコース硫酸含有多糖一 U、フコース疏酸含有多糖混合物及びこれらの分解物を本発明に使用することができる。フコース硫酸含有多糖を含有する褐藻植物、ナマコ等は乾燥後、粉砕処理を行うことにより、フコース硗酸含有多糖含有粉体を調製することができる。

フコース硫酸含有多糖含有粉体から熱水抽出、希酸抽出を行うことによってフコース硫酸含有多糖抽出液を調製することができる。

フコース硫酸含有多糖含有物からの抽出温度、時間としては 0〜2 0 0て、 1 - 3 6 0分の範囲から目的に応じ選択すれば良いが、通常 1 0 ~ 1 5 0て、 5 ~ 2 4 0分、好適には 5 0— 1 3 0て、 1 0 - 1 8 0分の範囲より選択して行うのが良い。

フコース硫酸含有多糖含有率を高めるための抽出物精製手段としては、塩化力ルシゥム、酢酸バリウム等を用いたフコース硫酸含有多糖の分画方法、塩化セチルビリジニゥム等の酸性多糖凝集剤を用いたフコース硫酸含有多糖の分画方法、塩類の存在下で酸性多糖凝集剤を用いるフコース硫酸含有多糖の分画方法、ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー等があり、必要に応じこれらを組合せて、精製を行うことができる。フコース硫酸含有多糖の分解方法としては、フコース硫酸含有多糖分解酵素を使用する方法、酸分解を行う方法、超音波処理を行う方法等フコース硫酸含有多糖分解方法として公知の方法を使用することができ、分解物の精製は上記方法にて行えばよい。通常、褐藻類には複数種のフコース硫酸含有多糖が存在するが、本発明に使用される褐藻類の種類は特に限定されるものではなく、例えばヒバマタ由来のもの，ガゴメ昆布由来のもの、マ昆布由来のもの、ワカメ由来のもの、その他すベての褐藻類由来のものを使用することができる。フコース硫酸含有多糖の製造にはまず、裼藻類の水系溶媒による抽出液を得る _c また、抽出に供する掲藻類はそのまま抽出に供しても良いが、抽出液を得る前に褐藻を乾燥したり、乾燥粉末にしたり、 6 0 ~ 1 0 0 %のアルコールゃァセトン等で洗浄したり、ホルムアルデヒド、ァセトアルデヒド、グルタルアルデヒド、アンモニア等を含む水溶液に浸しておけばフコース硫酸含有多糖への着色性物質の混入が大幅に減少するため有利である。

また、褐藻類あるいは褐藻類のアルコール洗浄残渣等からフコース硫酸含有多糖を抽出する際に可溶性の齚酸カルシウム、酢酸バリウム、塩化バリウム、又は塩化カルシウムを使用するとアルギン酸の混入を抑えることができるため後の精製が有利である。酢酸カルシウムを使用し抽出する際には、 l m M ~ l M程度の酢酸カルシウム溶液で 5 0〜 1 3 0てで抽出するのが好ましい。

褐藻類が厚手で粉末（粒子）が大きい場合、最初から 0 . 2 M以上の酢酸カルシゥムを用いると抽出効率が悪くなることがあるので、まず水で抽出したものに、酢酸カルシウムを加えて、生じるアルギン酸の沈殿を除去すれば良い。

しかしながらフコース硫酸含有多糖をアルギン酸と同時に抽出したい場合や、抽出時ある程度分解したものを得たい場合等では溶媒及び抽出条件は特に限定されるものではなく、水あるいは、食塩、塩化マグネシウム等の様々な濃度の中性塩類水溶液、クェン酸、リン酸、塩酸等様々な澳度の酸性水溶液、水酸化ナトリゥム、水酸化力リゥム等の様々な攮度のアル力リ性水溶液が使用でき、緩衝剤や防腐剤を加えても良い。抽出液の ρ Ηや抽出温度、抽出時間なども特に限定されないが、一般にフコース硫酸含有多糖は酸やアルカリに対して弱いため、酸性溶液やアルカリ性溶液を使用する場合低分子化が進行し易い。加熱温度、時間、 ρ H等を調整することにより、任意の分解物を調製することができ、例えばゲルろ過処理、分子分画胰処理等により、分解物の平均分子量、分子量分布等を調整することができる。すなわち本発明で使用するフコース硗酸含有多糖混合物、フコース硫酸含有多糖一 U、フコース硫酸含有多糖一 F及びこれらの分解物の分子量及び糖組成はフコース硫酸含有多糖の原料の収稷期、賅原料の乾燥方法、該原料の保存方法により異なり、またフコース硫酸含有多糖の抽出時の加熱条件、 P H条件等により異なる。例えば酸によりフコース硫酸含有多糖は加水分解され、アルカリ条件下ではゥ oン酸の /9一脱離により、低分子化が進行する。従って本明細書に記載したフコース硫酸含有多糖一 U、フコース硫酸含有多糖一 Fの分子量、分子量分布はその 1例にすぎず、フコース硫酸含有多糖の処理条件により、その分子量、分子量分布は容易に変化させ得る。例えば、弱アルカリ性で 1 0 0 *C、 1時間加熱し、脱塩に際し、ポアサイズ 3 0 0の分子ふるい膜を使用すれば、分子量分布 1 0 0 0から 1万程度のフコース硫酸含有多糖一 U、フコース硫酸含有多糖一 Fが調製でき、使用する条件によって任意の分子量、分子量分布のフコース硫酸含有多糖一 U及びフコース硫酸含有多糖一 Fを調製できる。上記の褐藻類の抽出液からァルギン酸や中性糖等を除くためには、例えば 0 . 2〜0 . 6 Mの澳度の食塩などの塩類の存在下、これ以上沈殿が生じなくなるまで塩化セチルビリジニゥム等の酸性多糖凝集剤を加え、沈殿を集めれば良い。必要に応じてこの沈殿を 0 . 2〜0 . 6 Mの濃度の食塩などの塩類溶液で洗浄後、沈殿中の塩化セチルビリジニゥムを食塩飽和アルコールで洗い落とし、フコース硫酸含有多糖混合物を得る。こうして得られたフコース硫酸含有多糖混合物から色素を除くために、この沈殿を溶解後陰ィオン交換樹脂や多糖性の樹脂で処理したり限外ろ過等を行っても良い。また脱塩後凍結乾燥すれば乾燥標品を得ることもできる。フコース硫酸含有多糖一 Fのみを効率的に製造したい場台は、塩化セチルビリジ -ゥム等で凝集させる際に、 0 . 2 ~ 0 . 6 Mの塩澳度ではなく、例えば 2 Mの塩璣度にすれば沈殿はフコース硫酸含有多糖一 Fのみを含む。またフコース硫酸含有多糖混合物の水溶液からフコース硫酸含有多糖一 uを分離することができる。

まずフコース硫酸含有多糖混合物の水溶液に 1種又は 2種以上の塩類を添加しその総濃度を 0 . 6〜2 Mとする。添加する塩類は例えば塩化ナトリウム、塩化カルシゥム等で特に限定されるものではない。

通常フコース硗酸含有多糖一 Fとフコース硫酸含有多糖一 Uを分離する場合 1 . 5 M程度の塩濃度で目的は速成できる（後 K図 3の説明参照）。例えば上記塩類の塩澳度を 1 . 5 Mに調整した後塩化セチルビリジニゥム等の酸性多糖凝集剤をこれ以上沈殿が生じなくなるまで添加するとフコース硫酸含有多糖一 Fが沈殿を形成するので、沈殿を除去するとフコース硫酸含有多糖一 Uの溶液が得られる。必要に応じてこの溶液を'港縮後、 4倍量のェタノールなどで溶液中のフコース硫酸含有多糖一 Uを沈殿させ、沈殿中の塩化セチルビリジニゥムを食塩飽和アルコールで洗い落とし、フコース硫酸含有多糖一 Uを得る。こうして得られたフコース硫酸含有多糖一 Uから色素を除くために、この沈殿を溶解後限外ろ過等を行つても良い。また脱塩後凍結乾燥すれば乾燥標品を得ることもできる。また、工程中防腐剤などを添加してもよい。フコース硫酸含有多糖一 Fは下記理化学的性質を有するフコース硫酸含有多糖であって、例えば後記参考例 3〜5に記載のように得ることができる。以下、このフコース硫酸含有多糖一 Fの理化学的性質を示す。

( 1 ) 構成糖：ゥ口ン酸を実質的に含有しない。

( 2 ) フラポパクテリゥム（Fl avobacter iu麗） s p . S A— 0 0 8 2 ( F E R M B P— 5 4 0 2 ) の生産するフコィダン分解酵素により実質上低分子化されない。フコース硫酸含有多糖一 υは下記理化学的性質を有するフコース硫酸含有多糖であって、例えば後記参考例 5、 6に記載のように調製することができる。以下、このフコース硫酸含有多糖一 υの理化学的性質を示す。

( I ) 構成糖：ゥ口ン酸を含有する。 ( 2 ) フラボパクテリゥム（FlavobacteriM) s ρ . SA-0082 (F ER M B P- 5402) の生産するフコィダン分解酵素により低分子化する。次に本発明で使用するフコース硗酸含有多糖一 F及びその製造方法について更に詳細に記載する。本発明で使用するフコース硗酸含有多糖一 Fを製造する際にはフコース硫酸含有多糖一 Uを分解する能力を有する分解酵素をフコース硫酸含有多糖混合物に作用させればよく、酵素反応が終了後低分子化したフコース硫酸含有多糖一 Uを限外ろ過などで除去すればよい。上記分解酵素はフコース硫酸含有多糖一 Uを逸択的に分解できる酵素であればいかなる酵素でもよいが、具体例としては例えば、 WO 96/34004公報に記載のフラボバクテリゥム（Flav obacteriun) s P . S A - 0082株（ F E R M BP - 5402) が生産する上記のエンド型フコィダン分解酵素が挙げられる。本酵素を作用させる場合は酵素反応が有利に進むように基質溏度ゃ温度、 P H 等を設定すればよいが、基質濃度は通常 0. 1から 1 0%程度、温度は 20から 40て付近、 PHは 6から 9付近が望ましい。また、フコース硫酸含有多糖混合物を培地に添加し、フコース硫酸含有多糖一 Uを分解する能力を有する分解酵素生産能を有する微生物をその培地で培養し、培養後の培地から精製してもよい。使用する微生物はフコース硗酸含有多糖一 U を分解する能力を有する分解酵素を生産する微生物であればいかなる微生物でもよいが、具体的には上妃記載のフラボパクテリゥム s p. SA— 0082株 (F ERM BP— 5402) 又は W096Z34004公報に己載のフコイダノバクタ一マリナス（Fucoidanobacter aarinus) S I — 0098株（F ER M B P— 5403 ) が挙げられる。なお上記のフラボパクテリゥム s p. S A— 0082株は F vobacter iu m s p. S A— 0082と表示され、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所 [日本国茨城県つくば市東 1丁目 1番 3号（郵便番号 305) ] に平成 7 年 3月 29曰より FERM P— 14872として寄託され、前記通商産業省ェ業技術院生命工学工業技術研究所に F ERM BP— 5402 (国際寄託への移管請求日：平成 8年 2月 15日）として寄託されている。

また、上記のフコイダノバクタ一マリナス S I— 0098株は Fucoidan obacter narinus S I - 0098と表示され、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所 [日本国茨城県つくば市東 1丁目 1番 3号（郵便番号 305) ] に平成 7年 3月 29日より FE RM P— 1 4873として寄託され、前記通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に F ERM BP— 5403 (国際寄託への移管請求日：平成 8年 2月 1 5曰）として寄託されている。前述のように 0. 6~3Mの 1種類又は 2種類以上の塩類の存在下でフコース硫酸含有多糖一 Fとフコース硫酸含有多糖— Uが酸性多糖凝集剤に対して全く異なる挙動を示す。

従ってフコース硫酸含有多糖混合物の水溶液からフコース硫酸含有多糖一 Fを分離することができる。

まずフコース硫酸含有多糖混合物の水溶液に 1種又は 2種以上の塩類を添加しその総濃度を 0. 6~3Mとする。添加する塩類は例えば塩化ナトリウム、塩化カルシウム等で特に限定されるものではない。こうして塩濃度を調整した後塩化セチルビリジユウム等の酸性多糖凝集剤をこれ以上沈殿が生じなくなるまで添加し、沈殿を集めると本発明で使用するフコース硫酸含有多糖一 Fが得られる。しかし上記塩馕度を 2 M超にすると本発明のフコース硫酸含有多糖一 Fが塩化セチルビリジェゥムにより沈殿を形成しにくくなるので注意を要する。本発明で使用するフコース硫酸含有多糖一 Fとフコース硫酸含有多糖一 Uを分離する目的では通常 1. 5M程度の塩濃度で目的は逮成できる。

フコース硫酸含有多糖一 F、及びフコース硫酸含有多糖— Uの各塩化ナトリゥム澳度における、過剌璗の塩化セチルビリジ -ゥム存在下における沈殿形成性を図 3に示す。

図 3の縦軸は沈殿形成率（％) を示し、横軸は塩化ナトリウム澹度（M) を示す。図中、点線及び白三角はフコース疏酸含有多糖一 Fの各塩化ナトリウム港度での沈殿形成率を示し、図 3中、実線及び白丸はフコース硫酸含有多糖一 Uの各塩化ナトリゥム濃度（M ) での沈殿形成率を示す。沈殿形成率の測定は、溶液温度 3 7てにて、以下のように行った。

フコース硫酸含有多糖一 U及びフコース硗酸含有多糖一 Fをそれぞれ 2 %の濃度で水及び 4 Mの塩化ナトリゥムに溶解し、これらを様々な割合で混合することにより様々な澳度の塩化ナトリゥムに溶解したフコース硫酸含有多糖一 U及びフコース硫酸含有多糖一 F溶液を各 1 2 5 I ずつ調製した。次に、塩化セチルビリジニゥムを 2 . 5 %の濂度で水及び 4 Mの塩化ナトリウムに溶解し、それらを混合することにより様々な濂度の塩化ナトリクムに溶解した 1 . 2 5 %の塩化セチルビリジニゥム溶液を調製した。

水に溶解している 2 %のフコース硫酸含有多糖一 U及びフコース硫酸含有多糖一 Fを 1 . 2 5 %の塩化セチルピリジニクムで完全に沈殿させるには容量で 3 . 2倍必要であった。そこで、各濾度の塩化ナトリウムに溶解した 2 %のフコース硫酸含有多糖一 U及びフコース硫酸含有多糖一 Fの各 1 2 5 1 に対して各々の澳度の塩化ナトリクムに溶解した塩化セチルビリジニゥム溶液を 4 0 0 ^ 1添加後、十分かくはんし、 3 0分放置後、遠心分離し上清中の糖含量をフノール一硫酸法〔アナリティカルケミストリー（Analyt ica l Chenistry) 、第 2 8巻、第 3 5 0頁（ 1 9 5 6 ) 〕により測定し、各塩化ナトリゥム濃度下での各フコース硫酸含有多糖の沈殿形成率を算出した。次に必要に応じてこの沈殿を洗浄後、沈殿中の塩化セチルビリジ-ゥムを食塩飽和アルコールで洗い落とし、フコース硫酸含有多糖一 Fを得る。こうして得られたフコース硫酸含有多糖一 Fから色素を除くために、この沈殿を溶解後限外ろ過等を行っても良い。また脱塩後凍結乾燥すれば乾燥標品を得ることもできる。また、工程中防腐剤などを添加してもよい。フコース硫酸含有多糖を陰ィオン交換樹脂で精製する際に 2価の隔ィオンが共存すると単位樹脂量当りに吸着するフコース硫酸含有多糖量が増加し、フコース硫酸含有多糖の分離が良くなる。すなわち、本発明で使用するフコース硫酸含有多糖一 Fを製造する際には、まずフコース硫酸含有多糖混合物に 2価の陽イオン源となる薬品を好ましくは 1 mM以上添加する。次に、陰イオン交換樹脂を 2偭の陽イオンを好ましくは 1 mM以上含む液で平衡化し、上記フコース硫酸含有多糖混合物を吸着させる。この陰イオン交換樹脂を平衡化した液で十分洗浄後、例えば塩化ナトリウムのグラジヱントによりフコース硫酸含有多糖一 Fを溶出させる。本方法を用いる壜合、添加する 2価陽イオンの濃度は 1 mM以上ならばよい。また本方法に用いる二価の陽ィオン源となる薬品はカルシゥム塩やバリゥム塩が特にその効果が優れているが、特に限定されるものではなく、硫酸マグネシウム、塩化マンガン等も使用することができる。本発明で使用するフコース硫酸含有多糖一 Fは例えば参考例 3に記載のように得ることができる。以下、このフコース硫酸含有多糖の理化学的性質を示すが、本発明で使用するフコース硫酸含有多糖一 Fはこの例に限定されるものでは無い。得られたフコース硫酸含有多糖一 Fの分子量をセフアクリル S— 500 (ファルマシア社製）を用いたゲルろ過法により求めたところ、約 19万を中心とした分子量分布を示した（図 4参照）。なお、図 4において、縦軸はフエノールー硫酸法により測定した試料中の糖含量を 480 nmの吸光度で示し、横軸はフラクシ β ンナンバーを示す。

また、ゲルろ過の条件を下己に示す。

カラムサイズ： 3. 08X 162. 5 c m

溶媒： 0. 2 Mの塩化ナトリゥムと 10%のエタノールを含む 1 OmMのリン酸ナトリゥム緩衝液（ PH 6. 0)

流速： 1. 5m l /分

サンプル濃度： 0. 25%

サンブル液量： 20 m I

分子量標準物質： Shodex STANDARD P-82 (昭和電工社製）次に、得られたフコース硗酸含有多糖一 Fの成分を分析した。

まず、ジャーナルォブバイオロジカルケミストリー（Journal of Biolo gical Chenistry)、第 1 75巻、第 595頁（ 1 948) の記載に従いフコース

Sを定量した。

次に、得られたフコース硫酸含有多糖一 Fの乾燥標品を 1規定の塩酸に 0. 5 %の澳度で溶解し、 1 1 O'Cで 2時間処理し、構成単糖に加水分解した。次に、グライコタツグ及びグライコタツグリージヱントキット（ともに宝酒造社製）を用いて加水分解して得られた単糖の還元性末端をピリジルー（2) —ァミノ化 (PA化）し、 HP LCにより構成糖の比率を調べた。なお、 HP LCの条件は下記によった。

装置： L一 6200型（日立製作所製）

カラム：パルパックタイプ A (4. 6mmX 1 50mm) (宝酒造社製）溶離液： 700 mMホウ酸緩衝液（ PH9. 0) ：ァセ卜 - トリル = 9 ： 1 検出：蛍光検出器 F— 1 1 50 (日立製作所製）にて励起波長 3 1 0 nm 蛍光波長 380 n mで検出。

流速： 0. 3m I /分

力ラム温度： 65て次に、アナリティカルバイオケミストリー（Analytical B iochemistry)、第 4巻、第 330頁（ 1 962) の記載に従いゥロン酸量を定量した。

次に、バイオケミカルジャーナル（Biocheaiical Journal )、第 84巻、第 1 06頁（ 1 962 ) の β載に従い硫酸含量を定量した。

以上の結果、得られたフコース硫酸含有多糖一 Fの構成糖はフコース、ガラクトースで、そのモル比は約 1 0 ： 1であった。ゥロン酸及びその他の中性糖は実質的に含有されていなかった。また、フコースと硫酸基のモル比は約 1 ： 2であつた。

1 %のフコース硫酸含有多糖一 F溶液 16m l と、 50mMのリン酸緩衝液 ( p H 8. 0) 1 2 m 1 と 4 Mの塩化ナトリウム 4 m 1 と 32 m UZm Iの W0 96/34004公報に記載のブラボパクテリゥム S P. S A- 0082 (F ERM BP— 5402) 由来のエンド型フコィダン分解酵素溶液 8 m 1を混合し、 25'Cで 48時間反応させた。反応による分解物の生成は認められず、その低分子化も認められなかった。次に、得られたフコース硫酸含有多糖一 Fのカルシウム塩の I Rスぺクトルをフーリ _Λ変換赤外分光光度計 J I R-D I AMOND 20 (曰本電子社製）により測定したところ図 5に示すスぺクトルが得られた。なお、図 5において縦軸は透過率（％) 、橫轴は波数（cm—¹) を示す。次に、得られたフコース硫酸含有多糖一 Fのナトリウム塩の NMRスぺクトルを 50 OMH zの核磁気共鳴装置 J NM- α 500型核磁気共鳴装置（曰本電子社製）により測定したところ、図 6に示すスぺクトルが得られた。図 6中、縦軸はシグナルの強度、横軸は化学シブト値（ p pm) を示す。なお、 1H— NMRでの化学シフト値は HODの化学シフト値を 4. 65 p pmとして表した。

1H-NMR (D₂ 0)

5. 30 (フコースの 1位の H) 、 1. 19 (フコースの 5位の C H3 の H) 次に、得られたフコース硫酸含有多糖一 Fの凍結乾燥物の比旋光度を高速 ·高感度旋光計 S EP A— 300 (堀場製作所製）により測定したところ、 — 135 度であった。以上フコース硫酸含有多糖一 Uと分離され、純化されたフコース硫酸含有多糖一 Fが提供される。本発明で使用するフコース硗酸含有多糖一 Fは構成糖としてゥロン酸を実質的に含有せず、フラポパクテリゥム s p. S A- 0082 (F E RM BP— 5402) の生産するフコィダン分解酵素により低分子化されない。その分子量、分子量分布、糖組成はフコース硫酸含有多糖一 Fをなんら限定するものではなく、任意の分子量、分子量分布のフコース硗酸含有多糖一 F を瀾製することができ、本発明において糖組成、還元末端等の理化学的性質が明確で、硫酸化度が極めて高いフコース硗酸含有多糖一 Fを使用することができる。次にフコース硫酸含有多糖一 Fのみを選択的に分解する酵素を使用することによりフコース硫酸含有多糖一 Fの低分子化分解物が提供される。酵素源の微生物としてはェンド型フコース硫酸含有多糖一 F分解酵素生産能を有する菌株であればいかなる菌株でもよいが、該ェンド型フコース ½酸含有多糖 —F分解酵素生産能を有する菌株の具体例としては、例えば特願平 8— 204 1 87号明細書に記載のアルテロモナス（A eroBonas) s p. SN— 1 009株が挙げられる。該菌株由来のェンド型フコース硫酸含有多糖一 F分解酵素をフコース硫酸含有多糖一 Fに作用させれば、フコース疏酸含有多糖一 Fの酵素学的低分子化物を得ることができる。本菌株はアルテロモナス s p. S N— 1 009と命名され、 A eroaonas s P. SN- 1 009と表示され、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所 [日本国茨城県つくば市東 1丁目 1番 3号（郵便番号 305) ] に平成 8年 2 月 1 3日より F E RM P- 1 5436として寄託され、前記通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に F E RM B P— 5747 (国際寄託への移管請求曰：平成 8年 1 1月 1 5日）として寄託されている。本発明に使用する菌株の培地に加える栄養源は使用する菌株が利用し、ェンド型フコース磙酸含有多糖一 F分解酵素を生産するものであればよく、炭素源としては例えばフコース硫酸含有多糖、海藻粉末、アルギン酸、フコース、ガラクトース、グルコース、マンニトール、グリセロール、サッカロース、マルト一ス等が利用でき、窒素源としては、酵母エキス、ペプトン、カザミノ酸、コーンスティーブリカー、肉エキス、脱脂大豆、硫安、塩化アン乇ニゥム等が適当である。その他にナトリウム塩、リン酸塩、カリウム塩、マグネシウム塩、亜鉛塩等の無機質、及び金厲塩類を加えてもよい。

また本菌株は上記栄養源を含んだ海水あるいは人工海水中で非常に良く生育する ₀ 該ェンド型フコース硫酸含有多糖一 F分解酵素の生産菌を培養するに当り、生産量は培養条件により変動するが、一般に培養温度は、 1 5て〜 30· (：、培地の PHは 6~9がよく、 5 ~72時間の通気かくはん培養でェンド型フコース硫酸含有多糖一 F分解酵素の生産量は最萵に達する。

培養条件は使用する菌株、培地組成等に応じ、エンド型フコース硫酸含有多糖一 F分解酵素の生産量が最大になるように設定するのは当然のことである。ェンド型フコース硫酸含有多糖一 F分解酵素は菌体中にも培養物上清中にも存在する。上記のアルテロモナス S P. S N— 1009を適当な培地で培養し、その菌体を集め、通常用いられる細胞破壊手段、例えば、超音波処理などで菌体を破砕すると無細胞抽出液が得られる。

次いで、この抽出液から通常用いられる精製手段により精製酵素標品を得ることができる。例えば、塩析、イオン交換カラムクロマト、疎水結合カラムクロマト、ゲルろ過等により精製を行い、他のフコィダン分解酵素を含まない純化されたェンド型フコース硫酸含有多糖一 F分解酵素を得ることができる。

また、上述の培蹇液から菌体を除去した培養液上清中にも本酵素が大量に存在するので、菌体内酵素と同様の精製手段により精製することができる。ェンド型フコース硫酸含有多糖一 F分解酵素の化学的及び理化学的性質は次の通りである。

( I )作用：下記理化学的性質を有するフコース硫酸含有多糖、すなわちフコース硫酸含有多糖一 Fに作用して、該フコース硫酸含有多糖一 F を低分子化させる。

(a) 構成糖：ゥロン酸を実質的に含有しない。

( b ) フラボパクテリゥム（Flavobacteriun) s p. SA-0082 (F E RM BP— 5402) の生産するフコィダン分解酵素により実質上低分子化されない。

下記理化学的性質を有するフコース硫酸含有多糖、すなわちフコース硫酸含有多糖一 uに作用しない。

( c ) 構成糖：ゥ口ン酸を含有する。

( d ) ブラボパクテリゥム（Flavobacteriu，） s p. SA-0082 (F E RM BP— 5402) の生産するフコィダン分解酵素により低分子化し、少なくとも下紀式（ I ) 、（11) 、（111) より透択される少なくとも一種以上の化合物が生成する。

-61-

LSPOOIL6d£/ Dd 0Ϊ0 /ム 6 OA\ -02-

L9P00IL6d£/JLDd ( II)至適 pH ：本酵素の至通 PHは 7~8付近である（図 7)。

すなわち図 7は本酵素の P Hと相対活性の関係を表すグラフであり、縦軸は相対活性（％) 、横軸は P Hを示す。実線は、還元性末端を P A化したフコース硫酸含有多糖一 F (PA- F F) を基質に用いた曲線であり、点線はネイティブのフコース硫酸含有多糖一 Fを基質に用いた場合の曲線である。

(III) 至適温度：本酵素の至適温度は 30-35'C付近である（図 8) 。すなわち図 8は、本酵素の温度と相対活性の関係を表すグラフであり、縦軸は相対活性（％) 、横軸は温度（）を示す。実線は、還元性末端を PA化したフコース硫酸含有多糖一 F (PA-F F) を基質に用いた場合の曲線であり、点線はネイティブのフコース硫酸含有多糖— Fを基質に用いた場合の曲線である。

( IV) 分子量：本酵素の分子量を、セフアクリル（Sephacryl) S - 200 (フアルマシア社製）を用いたゲルろ過法により求めたところ、約 1 0万であった。

(V) 酵素活性の測定方法：

ェンド型フコース硫酸含有多糖一 F分解酵素活性の測定は次のようにして行つた。

まず、ェンド型フコース硫酸含有多糖一 F分解酵素の基質となるフコース硫酸含有多糖一 F、及び PA— FFを下己（ 1 ) から（3) の工程により調製した。

( 1 ) ガゴメ昆布フコース硫酸含有多糖混合物の調製

乾燥ガゴメ昆布 2 Κ 8Γを自由粉砕機 M— 2型（奈良機械製作所製）により粉砕し、 4. 5倍量の 80%エタノール中で 80て、 2時間処理後、ろ過した。残渣に対し、上記 80%エタノール抽出、ろ過という工程をさらに 3回繰り返し、ェ夕ノール洗浄残渣 1870 gを得た。残渣に 36リットルの水を加え、 100て、 2時間処理し、ろ過により抽出液を得た。抽出液の塩濃度を 400 mMの塩化ナトリゥム溶液と同じにした後、 5%の塩化セチルビリジニゥムをこれ以上沈殿が生じなくなるまで添加し、遠心分離した。その沈殿を、 80%のエタノールで繰り返し洗浄し、塩化セチルビリジユウムを完全に除去した後、 3リツトルの 2M 塩化ナトリゥムに溶解し、不溶物を遠心分離で除去し、 2 Mの塩化ナトリウムで平衡化した 100m lの DEAE—セル口ファイン A— 800を魅濁し、かくはん後ろ過し、樹脂を除いた。このろ液を、 2 Mの塩化ナトリウムで平衡化した 1 00m lの DEAE—セル口ファイン A— 800 (生化学工業社製）のカラムにかけ、通過画分を限外ろ過器（ろ過膜の排除分子量 10万）により脱塩及び低分子除去を行い、この際生じた沈殿を遠心分離により除去した。この上清を凍結乾燥して精製ガゴメ昆布フコース硫酸含有多糖混合物 82. 2 srを得た。

(2) フコース硫酸含有多糖一 Fの翻製

上記のガゴメ昆布由来フコース硫酸含有多糖混合物 68Γを 600m lの 0. 2 Mの塩化カルシゥムを含む 20 mMの酢酸ナトリウム（P H6. 0) に溶解後、あらかじめ 0. 2 Mの塩化カルシウムを含む 20 mMの酢酸ナトリウム（pH6. 0) で平衡化した 3600m lの DEAE—セファロース FF (フアルマシア社製）のカラムにかけ、 0. 2 Mの塩化カルシゥムを含む 2 OmMの酢酸ナトリゥム（ PH6. 0) で十分カラムを洗浄後、 0 ~2Mの塩化ナトリウムのグラジェントで溶出した。

塩化ナトリゥム濂度が 0. 75 M以上で溶出してくるフコース硫酸含有多糖一 F画分を集め、排除分子量 10万の限外ろ過膜を装着した限外ろ過器で港縮脱塩後凍結乾燥し、フコース硫酸含有多糖一 Fの凍結乾燥標品を、 3. 3 g得た。

(3 ) P A— F Fの調製

上記のフコース硫酸含有多糖一 Fの凍結乾燥標品 12m gを水 480 1に溶解し、 12 w 1ずつ 36本に分注後、凍結乾燥しグライコタツグ及びグライコタッグリージユントキットを用いて還元性末端を P A化し、 P A— F Fを得た。得られた PA— FFを 15m 1の 10%のメタノールを含む 1 OmMの酢酸ァンモニゥム溶液に溶解し、セル口ファイン G C L— 300 (生化学工業社製）のカラム（40 x 900mm) によりゲルろ過し、高分子画分を集めた。得られた高分子画分をボアサイズ 3500の透析胰を用いて十分透析して脱塩し、次にェバポレーターにより 5m 1に澳縮してェンド型フコース硫酸含有多糖一 F分解酵素の基質用 P A— F Fとした。

また、こうして得られた PA— F Fを、市販のビリジルー（2) —アミノ化フコース（宝酒造社製）の蛍光強度（励起波長 320 n m、蛍光波長 400 n m) と比較することにより定量したところ約 40 n m o 1であった。上記（ 1 )及び（2) の工程により得られたフコース硫酸含有多糖一 Fを用いてェンド型フコース硫酸含有多糖分解酵素の活性を測定するときは下記の要領で行つた。

すなわち、 2. 5%のフコース硫酸含有多糖一 F溶液 1 2 I と、 6 / 1の 1 M塩化カルシウム溶液と 12 1の 1 M塩化ナトリウム溶液と、 72// 1の 50 mMの酢酸とィミダゾールとトリス一塩酸を含む緩衝液（ PH7. 5) と、 18 ； u Iのエンド型フコース硫酸含有多糖一 F分解酵素とを混合し、 30て、 3時間反応させた後、反応液を 100'C、 10分問処理し、遠心分雜後、 100 1を HP LCにより分析し、低分子化の程度を測定した。

対照として、エンド型フコース硫酸含有多糖一 F分解酵素の代りに、エンド型フコース硫酸含有多糖一 F分解酵素溶液の調製に使用した緩衝液を用いて同様の条件により反応させたもの及びフコース硫酸含有多糖一 F溶液の代りに水を用いて反応を行ったものを用意し、それぞれ同様に HP LCにより分析した。

1単位の酵素は、上記反応系において 1分間に 1 /m o 1のフコース硫酸含有多糖一 Fのフコシル結台を切断する酵素量とする。切断されたフコシル結合の定量は下記式により求めた。

{ ( 12 X2.5)/(100 XMF) } X {(MF/H)-1} X {0.12/(180 X0.01) }

( 1 2 2. 5 ) / 1 0 0 ：反応系中に添加したフコース硫酸含有多糖一 F

(m 8： )

MF：基質フコース硗酸含有多糖一 Fの平均分子量

M：反応生成物の平均分子量

(MF/M)一 1 ： 1分子のフコース硫酸含有多糖一 Fが酵素により切断された数

1 80 ：反応時間（分）

0. 01 ：酵素液量（m I )

0. 12 ：反応液 «g重（m 1 ) なお、 H P L Cの条件は下妃によった。

装置： L一 6200型（日立製作所製）

カラム： OHp a k KB-804 (8mmX300mm) (昭和電工社製）溶離液： 5 mMのアジ化ナトリウム、 25 mMの塩化カルシウム、及び 50 m

Mの塩化ナトリゥムを含む 25mMのィミダゾール緩衝液（ PH8) 検出：視差屈折率検出器（S h o d e x R I— 71、 ¾和電工社製）流速： 1 m l /分

力ラム温度： 25て反応生成物の平均分子量の測定のために、市販の分子量既知のブルラン（ST ANDARD P— 82、昭和電工社製）を上記の H P L C分析と同条件で分析し、ブルランの分子量と OH P a k KB— 804の保持時間との関係を曲線に表し、上記酵素反応生成物の分子量測定のための標準曲線とした。上記（ 1 )〜（ 3) の工程により得られた PA— FFを用いてエンド型フコース硫酸含有多糖一 F分解酵素の活性を測定するときは下記の要領で行った。

すなわち、 8 pmo l Z/i l 0PA— F F溶液 2 1 と、 5 1の 1 M塩化力ルシゥム溶液と 1 0 1の 1 M塩化ナトリウム溶液と、 23/^ 1の水と、 50 Iの 50mMの酢酸とィミダゾールとトリス一塩酸を含む緩衝液（PH 8. 2 ) と、 10 1のエンド型フコース硫酸含有多糖一 F分解酵素とを混合し、 30て、 3時間反応させた後、反応液を 100'C、 1 0分間処理し、遠心分離後、 80〃 1を HPLCにより分析し、低分子化の程度を測定した。

対照として、エンド型フコース硫酸含有多糖一 F分解酵素の代りに、エンド型フコース硫酸含有多糖一 F分解酵素溶液の調製に使用した緩衝液を用いて同様の条件により反応させたもの及び P A— F F溶液の代りこ水を用いて反応を行ったものを用意し、それぞれ同様に HPLCにより分析した。

1単位の酵素は、上記反応系において 1分間に 1 mo 1のフコース硫酸含有多糖一 Fのフコシル結合を切断する酵素量とする。切断されたフコシル結合の定量は下記式により求めた。

Ιβ ΙΟ^Χ { (MF/M)-1 } X {1/(180X0.01) } = U/B1

1 6 x 1 0-6：反応系中に添加した PA— F F ( mo 1 )

MF ：基質 PA— F Fの平均分子量

M ：反応生成物の平均分子量

(MF/M) - 1 ： 1分子のフコース硫酸含有多糖一 Fが酵素により切断された数

1 80 ：反応時間（分）

0. 0 1 :酵素液量（m l ) なお、 HP LCの条件は下記によった。

装置： L一 6200型（日立製作所製）

カラム： OH p a k S B— 803 (8 M X 300 a丽）（昭和電工社製）溶難液： 5 mMのアジ化ナトリウム及び 1 0%のジメチルスルホキシドを含む

200 mMの塩化ナトリゥム溶液

検出：蛍光検出器 F-1150 (日立製作所製）にて励起波長 320 n m、蛍光波長 400 n mで検出。

流速： 1 m 1 Z分

力ラム温度： 50て反応生成物の平均分子量の測定のために、市販の分子量既知のブルラン（S T ANDARD P— 82、昭和電工社製）をグライコタツグ及びグライコ夕ツグリージントキットを用いて還元性末端を、 P A化し、様々な分子量の P A 化プルランを得た。得られた様々な分子量の P A化プルランを上記の H P LC分折と同条件で分析し、ブルランの分子量と 0 H P a k S B— 803の保持時間との関係を曲線に表し、上記酵素反応生成物の分子量測定のための標準曲線とした。夕ンパク質の定畺は、酵素液の 280 nmの吸光度を測定することにより行つた。その際 1 mg/m 1のタンパク質溶液の吸光度を 1. 0として計算した。次にエンド型フコース硫酸含有多糖一 F分解酵素の作用機作を決定し、分解物を翻製した。

( 1 ) ェンド型フコース硫酸含有多糖一 F分解酵素によるフコース硫酸含有多糖一 Fの分解及び分解物の調製

精製したガゴメ昆布由来のフコース硫酸含有多糖一 Fにェンド型フコース硫酸含有多糖一 F分解酵素を作用させ、分解物の翻製を行った。

まず、フコース硫酸含有多糖一 F分解酵素の生産を行った。すなわち、アルチ口モナス s p. S N- 1009 (F ERM B P— 5747) を、ダルコ一ス 0. 25%、ペプトン 1. 0%、酵母エキス 0. 05 %を含む人工海水（ジャマリンラボラトリー社製） PH 8. 2からなる培地 600 m Iを分注して殺菌した（ 1 20て、 20分） 2リットルの三角フラスコに接種し、 25 で 26時間培 *して種培養液とした。ペプトン 1. 0%、酵母エキス 0. 02%、前 S己のガゴメ昆布由来のフコース硫酸含有多糖 0. 2%、及び消泡剤（信越化学工業社製 KM70) 0. 0 1 %を含む人工海水 PH8. 0からなる培地 20リ 'ソトルを 3 0リットル容のジヤーファーメンターに入れて 1 20てで 20分殺菌した。冷却後、上記の種培養液 600m l を接種し、 24'Cで 24時間、毎分 1 0リットルの通気量と毎分 250回転のかくはん速度の条件で培養した。培養終了後、培赘液を遠心分離して菌体及び培養上清を得た。得られた培養上清を、分画分子量 1 万の限外ろ過器により澳縮後 85%飽和硫安塩折し、生じた沈殿を遠心分離により集め、 1 0分の 1澳度の人工海水を含む 2 OmMのトリスー塩酸緩衝液（ P H 8. 2) に対して十分透析し、 600 m 1の粗酵素を得た。

こうして得られた粗酵素のうち 4 Om 1 と、人工海水 44m 1 と、前記のフコ —ス硫酸含有多糖一 Fの 5 1 Omgと水 36m lを混合し、 P Hを 8に調整し、 25てで 48時間反応後、セル口ファイン G CL— 300によりゲルろ過を行い、 4画分に分け、分子量の大きな方から順に、 F— F d— 1 (分子量 25000超）、 F - F d - 2 (分子量 25000〜 1 2000超）、 F— F d— 3 (分子量 1 2 000~6500超）、及び F— F d— 4 (分子量 6500以下）とした。これらの 4画分を脱塩後凍結乾燥し、乾燥品をそれぞれ 1 70ms:、 270mg、 3 00 m8T、及び 340mgr得た。

フコース硫酸含有多糖一 Fの酵素分解物、すなわち低分子化物のセルロファィン GC L— 300によるゲルろ過の結果を図 9に示す。図 9において縦軸は 48 0 n mの吸光度（フノール硫酸法による発色量）、横軸はフラクシンナンパ一を示し、 1 フラクシン 1 0m lである。カラムボリュームは 1075m lであり、溶出液は 1 0%のエタノールを含む 0. 2Mの酢酸アンモニゥム溶液である。

図 9中、白丸印はフコ一ス硫酸含有多糖一 Fの酵素分解物を、黒三角印は酵素分解前のフコース硫酸含有多糖一 Fをそれぞれゲルろ過した結果を表す。

上記セルロファイン GCL— 300の結果から、フコース硫酸含有多糖一 F分解酵素の反応生成物の分子量分布は約 1 000~ 3万程度である。

(2) 酵素反応生成物の還元末端糖及び中性糖組成の分析

上記の F— F d— 1、 F— F d— 2、 F— F d— 3、及び F— F d— 4の一部をグライコタツグ及びグライコタツグリージヱントキットを用いて還元性末端を P A化し、得られた各 PA化糖（PA— F— F d— 1 ) 、（PA— F— F d 一 2) 、 (PA- F-F d -3) 、及び（PA— F— F d— 4) を 4規定の塩酸、 100'C> 3時間処理により加水分解し、 HPLCにより還元末端糖を調べた。なお、 H PLCの条件は下記によった。

装置： L一 6200型（日立製作所製）

カラム：パルパックタイプ A (4.6 聽画 X 150 in) (宝酒造社製）

溶離液： 700 mMほう酸緩衝液（ ρΗ 9) ：ァセトニトリル =9 : 1 検出：蛍光検出器 F— 1 1 50 (日立製作所製）にて励起波長 31 0 nm、蛍光波長 380 nmで検出。

流速： 0. 3m 1 Z分

力ラム温度： 65て

この結果、（ΡΑ— F— F d— 1 ) 、（PA— F— F d— 2) 、（PA— F— F d— 3) 、及び（PA— F— F d— 4) の還元末端糖は総てフコースであった。また、 F— F d— 1、 F— F d— 2、 F— F d— 3、及び F— F d— 4の中性糖組成を下記の方法により測定した。なお、基質に用いたフコース硫酸含有多糖一 Fを硫酸加水分解後グライコタツグ及びグライコタツグリージ -ントキットを用いて構成糖の還元性末端を P A化し、上記の酵素反応生成物の還元性末端を分析したときと同じ HP LC条件で分析したところ、フコースとガラクトースのみしか検出されず、それらの立体配位はそれぞれ L及び Dであったので生成物に関しても Lーフコースと D—ガラクトースのみを測定した。

すなわち、構成糖の一つである D—ガラクトースの含量を調べるために F—キト乳糖 Zガラクトース（ベーリンガーマンハイム山之内社製）を用い、説明書に従って D—ガラクトースのみを測定できる反応系を構築し、別に 4規定の塩酸で 1 00て、 2時間加水分解した F— F d— 1、 F— F d— 2、 F— F d— 3、及び F— F d— 4を中和後この反応系で測定した。更にもう一方の構成糖である L一フコースを定重するために、クリ -カルケミストリ一（Clincal Cheaistry), 第 36巻、第 474~476頁（ 1 990) 記載の方法に従って、別に 4規定の塩酸で 1 00'C、 2時間加水分解した F— F d— 1、 F— F d— 2、 F— F d— 3、及び F— F d— 4を中和後この反応系で測定した。

以上の結果 L一フコースと D—ガラクト一スの比率は F— F d— 1、 F - F d 一 2、 F— F d— 3、及び F— F d— 4それぞれおよそ 1 00 ： 44、 100 ： 27、 100 ： 5、及び 1 00 ： 1であった。

以上の結果をまとめると、エンド型フコース硫酸含有多糖一 F分解酵素は、フコース硫酸含有多糖一 Fに作用してフコシル結合を加水分解し、分子量約 1 00 0~ 3万程度の低分子化物を生成し、その低分子化物は分子量が大きいほどガラクトース含量が高い。なお、低分子化物の還元性末端はすべて Lーフコースであつた。次に、本酵素の基質特異性を瀾ぺるためにフコース硫酸含有多糖一 Uにフコース硫酸含有多糖一 F分解醉素を作用させた。

すなわち、 2. 5%のフコース硗酸含有多糖一 U溶液 1 2 1 と、 6 1の 1 M塩化カルシウム溶液と 12 1の 1 M塩化ナトリゥム溶液と、 72 1の 50 mMのイミダゾ一ル緩衝液（PH7. 5) と、 18 1のエンド型フコース硫酸含有多糖分解酵素（ 1. 6 mU/m 1 ) とを混合し、 30 ' (：、 3時間反応させた後、反応液を 100*C、 10分間処理し、遠心分離後、 1 00 1を1^?し（により分析し、低分子化の程度を測定した。

対照として、エンド型フコース硗酸含有多糖一 F分解酵素の代わりに、エンド型フコース硫酸含有多糖一 F分解酵素溶液の調製に使用した緩衝液を用いて同様の条件により反応させたものを用意し、同様に HP LCにより分析した。

なお、 HP LCの条件は次の通りである。

装置： L一 6200型（日立製作所製）

カラム： OHp a k K B - 804 (8 MX 300 ιι) (昭和電工社製）溶離液： 5mMのアジ化ナトリウム、 25 mMの埕化カルシウム、及び 50 m

Mの塩化ナトリウムを含む 25 mMのィミダゾール緩衝液（ p H 8 ) 検出：視差屈折率検出器（S h o d e x R I - 71 昭和電工社製）流速： 1 m l /分

力ラム温度： 25て

その結果、フコース硗酸含有多糖一 F分解酵素は、フコース硫酸含有多糖一 U を全く低分子化しなかった。以上、フコース硫酸含有多糖一 F分解酵素をフコース硫酸含有多糖一 F含有物に作用させることによって、フコース硫酸含有多糖一 Fの低分子化物を調製することができる。フコース硗酸含有多糖一 F含有物としては、例えばフコース硫酸含有多糖一 F精製品でもよく、また前述フコース硫酸含有多糖混合物でもよく、更に褐藻類海藻の水性溶媒抽出物でもよい。フコース硫酸含有多糖一 F含有物の溶解は通常の方法で行えばよく、溶解液中のフコース硗酸含有多糖濃度はその最高溶解濃度でもよいが、通常はその操作性、酵素カ偭を考慮して遝定すればよい。フコース硫酸含有多糖一 F溶解液としては水、緩衝液等より目的に応じて透択すればよい。溶解液の P Hは通常中性で、酵素反応は通常 3 O 'C付近で行う。酵素量、反応時間などを調整することによって、低分子化物の分子量を調整することができる。次に低分子化物を分子量分画することによって、更に均一な分子量分布のフコース硫酸含有多糖一 F低分子化物を調製することができる。分子量分画は通常よく使用されている方法を適用することができ、例えばゲルろ過法や分子量分画胰を使用すればよい。低分子化物は、必要に応じて更にイオン交換榭脂処理、活性炭処理などの精製操作を行ってもよく、必要に応じて脱塩処理、無菌処理を行い、凍結乾燥することによって、本発明に使用するフコース硗酸含有多糖一 Fの分解物の乾燥品を調製することもできる。フコース硫酸含有多糖一 Uは例えば参考例 5、 6に記載のように調製することができる。以下、このフコース硫酸含有多糖一 Uの理化学的性質を示すが、本発明で使用するフコース硫酸含有多糖一 Uはこの例に限定されるものではない。なぉフコース硫酸含有多糖一 Uの理化学的性質は前記フコース硗酸含有多糖一 Fの理化学的性質の測定方法に頭じ行った。得られた本発明に使用するフコース硗酸含有多糖一 Uの分子量をセフアクリル S— 5 0 0を用いたゲルろ過法により求めたところ、約 1 9万を中心とした分子量分布を示した（図 1 0参照）。なお、図 1 0において、縦軸はフノールー硫酸法により測定した試料中の糖含量を 4 8 0 n mの吸光度で示し、橫釉はフラクシ a ンナンバーを示す。

次に、得られたフコース硫酸含有多糖一 Uの成分を分析した。

得られたフコース硫酸含有多糖一 Uの構成糖はフコース、マンノース、ガラクトース、グルコース、ラムノース、キシロース、ゥロン酸であった。その他の中性糖は実質的に含有されていなかった。また、主要成分のフコース：マンノース：ガラクト一ス：ゥ口ン酸：硫酸基はモル比で約 1 0 ： 7 ·· 4 ： 5 ： 2 0であつた, 次に、フコース硫酸含有多糖一 Uの I Rスぺクトルを測定したところ図 1 1に示すスペクトルが得られた。なお、図 1 1において縦軸は透過率（％) 、横軸は波数（ c m-i) を示す。次に、フコース硫酸含有多糖一 Uのカルシウム塩の NMRスぺクトルを測定したところ図 12に示すスぺクトルが得られた。

図 12中、縦軸はシグナルの強度、横軸は化学シフト値（P P m) を示す。なお、 1H— NMRでの化学シフト値は HODの化学シフト値を 4. 65 p pmとして表した。

1H-NMR (D2 0)

δ 5. 27 (マンノースの 1位の Η) 、 5. 07 (フコースの 1位の Η) 、 4. 49 (フコースの 3位の Η) 、 4, 37 (グルクロン酸の 1位の Η) 、 4. 04 (フコースの 4位の Η) 、 3. 82 (フコースの 2位の Η) 、 3. 54 (ダルクロン酸の 3位の Η) 、 3. 28 (グルクロン酸の 2位の Η)、 1. 09 (フコースの 5位の C Η3 の Η) このフコース疏酸含有多糖一 Uの凍結乾嫒物の比旋光度を高速 ·高感度旋光計 SE PA— 300 (堀場製作所製）により測定したところ、一 53. 6度であつた。フコース硫酸含有多糖一 Uの構造は特願平 8 - 45583号明細書に記載の様に決定されている。フコース硫酸含有多糖一 Uを分解する能力を有する分解酵素によるフコース硫酸含有多糖一 Uの分解及び分解物の精製

精製したフコース硫酸含有多糖一 Uに WO 96/34004公報記載のェンド型フコィダン分解酵素を作用させ分解物の精製を行った。すなわち、 1 %のフコース硫酸含有多糖一U溶液 1 6m 1 と、 50mMのリン酸緩衝液（PH8. 0) 1 2m 1 と 4Mの塩化ナトリウム 4m 1 と 32 mU/m Iのエンド型フコィダン分解酵素溶液 8 m 1 を混合し、 25'Cで 48時間反応させた。反応の進行と共に 230 nmの吸光度が増加することを確認し、本酵素によりフコース硫酸含有多糖一 Uが分解されていることが判明した。この反応液をマイクロァシライザ一 G3 (旭化成社製）により脱塩後、 DEAE—セファロ一ス F Fにより 3つの画分（a) 、（ b) 、及び（c ) に分離精製した。

なお、上記のェンド型フコィダン分解酵素の生産に用いる菌株としては、該ェンド型フコィダン分解酵素生産能を有する菌株であればいかなる菌株でもよいが、具体例としては例えば、 WO 96/34004公報記載のフラボパクテリゥム (Flavobacteriui) s p . S A - 0082株（ F E R M BP - 5402) が挙げられる。

群素反応生成物の構造解析

上記のェンド型フコィダン分解酵素は、フコース硫酸含有多糖一 U中に存在する D—マンノースと D—グルクロン酸の間の α 1→ 4結合を脱離的に分解する酵素であり、得られたフコース硫酸含有多糖一 Uに作用させると下記式（ I ) 、 (II) 、及び（111) の構造を有するオリゴ糖が生成した。

-εε-

LSP0Q/L6d£/∑Dd

LSP00/L6df/LDd 010 /" OAV 以下、詳細に説明する。

上 3己の DEAE—セファロース F Fで分離精製した 3つの画分（ a ) 、（ b ) 、及び（ c ) をそれぞれ一部だけグライコタツグ及びグライコタツグリージントキットを用いて遣元性末端を、ビリジルー（2) —ァミノ化（P A化）し、各 PA化糖（PA— a) 、（PA— b)、及び（PA— c ) を得た。（PA— a)、 (PA— b) 、及び（PA— c ) を HPLCにより分析した。

なお、 HP LCの条件は下記によった。

(ァ）分子量分画カラムを用いた HPLC分析

装置： L一 6200型（日立製作所製）

カラム： SHODEX SB— 803 (4. 6X 250 mm) (昭和電工社製）溶離液： 0. 2 M塩化ナトリウム：ジメチルスルホキシド = 9 ： 1

検出：蛍光検出器 F— 1 1 50 (日立製作所製）にて励起波長 320 nm、蛍光波長 400 nmで検出

流速： 1 m l /分

力ラム温度： 50て

(ィ）逆相カラムを用いた HPLC分析

装置： L一 6200型（日立製作所製）

カラム： L—カラム（4. 6 X250 mm) 〔（財）化学薬品検査協会〕溶離液： 5 OmM舴酸ートリェチルァミン（pH5. 5)

検出：蛍光検出器 F— 1 1 50 (日立製作所製）にて励起波長 320 n m> 蛍光波長 400 n mで検出

流速： 1 m l /分

カラム温度： 4 O'C 図 13、 14、及び 1 5には各々ピリジルー（2) —アミノ化糖化合物（PA 一 a) 、（PA— b) 、及び（PA— c) の HPLCの各溶出パターンを示し、図において縦軸は相対蛍光強度、横軸は保持時間（分）を示す。下 saに式（ I ) 、式（π)、及び式（1【ί) で表される化合物、すなわち（ a )

( b ) 、及び（ C ) の物性を示す。図 1 6に（ a ) の、図 1 7に（ b ) の、図 1 8に（ c ) のマスのスペクトルを示し、図 1 9に（ a) の、図 20に（ b ) の、図 2 1 に（ c ) のマスマスのスぺクトルを示し、各図において縦軸は相対強度（％) 横軸は mZ z値を示す。更に図 22は（ a ) の、図 2 3は（ b ) の、図 2 4は（ c ) の 1H— NHRスぺクトルを示し、各図において縦釉はシグナルの強度、横軸は化学シフト値（ P p m ) を示す。

なお、 1H— N HRでの化学シフト値は H ODの化学シフト値を 4. 65 p p として表した。

( a ) の物性

分子量 564

MS m/ z 5 63 CM-H+ 〕 -

MS /MS m/ z 97 〔H S 04 〕 — 157 〔不飽和 D—グルクロン酸一 H2 O— H 1 7 5 〔不飽和 D—グルクロン酸一 H⁺ 〕 — 22 5 〔L— フコース硫酸一 H 2 0— H⁺ 〕 — 2 43 〔 L一フコース硫酸一 H 3 1 9 〔不飽和 D—グルクロン酸と D—マンノースが結合したもの一 H2 0— H - 40 5 〔M—不飽和 D—グルクロン酸ー H⁺ 〕 - 483 CM- S 03 — H ⁺ 〕 ⁺

1H -NMR (D2 0)

6 5. 78 ( 1 Η, d , J = 3. 7 H z , 4"一 H) 、 5. 26 ( 1 H, d， J = 1 . 2 H z , 1一 H) 、 5. 1 2 ( 1 H , d， J = 4. 0 H z , 1 ' 一 H) 、 5. 03 ( 1 H, d , J = 6. 1 H z , 1 " - Η) 、 4 · 47 ( 1 H, d - d， J = 3. 4， 1 0. 4 H z , 3 ' 一 H) 、 4. 2 1 ( 1 H , b r - s , 2 - H) 、 4. 1 2 ( 1 H, m, 5 ' 一 H) 、 . 1 0 ( 1 H , d— d， J = 3. 7 , 5. 8 H z , 3 " - H ) ゝ 4. 03 ( 1 H, d , J = 3. 4 H z , 4 ' 一 H) 、 3. 86 ( 1 H, m， 3 - H) 、 3. 83 ( 1 H， d - d , J = 4. 0, 1 0. 4 H z， 2' 一 H) 、 3. 72 ( 1 H, m, 4 - H) 、 3. 72 ( 1 H, m, 5 - H) 、 3. 70 (2 H, m, 5 - C の）、 3. 65 ( 1 H, d— d , J = 5. 8, 6. 1 H z , 2" - H) 、 1. 08 (3 H， d , J = 6. 7 H z , 5 ' 一 C H3 の ) 糖組成 Lーフコース：不飽和 D—グルクロン酸： D—マンノース = 1 ： 1 ： 1

(各 1分子）

硫酸塩 1分子（Lーフコースの 3位）

なお、 ]H— NMRにおけるビークの帰屈の番号は下己式（IV) の通りである。

( b ) の物性

分子量 724

MS m/ z 723 〔M - H+〕 - 、 36 1 〔M - 2 H⁺ 〕 2 - MS/MS m/ z 97 〔HS04 〕 -、 175 〔不飽和 D—グルクロン酸一 H⁺ 〕一、 243 〔Lーフコース硫酸一 H十〕一、 321 M-S0₃ -2H + 〕 2-、 405 〔M—不飽和 D—グルクロン酸一 S 0₃— H+ 〕― 、 417 (M- L 一フコース一 2 S03一 2H⁺ 〕 +

1H - NMR (D2 0)

δ 5. 66 ( 1 Η, d, J = 3. 4 H z , 4"一 H) 、 5. 27 ( 1 H, d, J = 7. 3 H z , 1 "一 H) 、 5. 22 ( 1 H, d , J = 1. 8 H z , ' 一 H) 、 5. 21 ( 1 H, d， J = 3. 7 H z , 1 ' 一 H) 、 4. 50 ( 1 H, d , J = 3. 1 H z , 4' 一 H) 、 4. 32 ( 1 H, q, J = 6. 7 H z , 5 ' 一 H) 、 4. 27 ( 1 H, d - d, J = 3. 7， 10. 4 H z , 2 ' -H) > 4. 21

( 1 H, d - d, J = 3. 4, 6. 7 H z , 3" - H) 、 4. 18 ( 1 H, d - d , J = 1. 8, 1 1. 0Hz , 5— CHの H) 、 4. 1 5 ( 1 H, b r - s, 2 - H) 、 4. 1 0 ( 1 H, d— d, J = 5. 8 , 1 1. 0Hz、 5 - CHの H) 、 3. 99 ( 1 H, d - d, J = 3. 1 , 1 0. 4 H z , 3' 一 H) 、 3. 90

( 1 H, m, 5 - H) 、 3. 82 ( 1 H, m, 3 - H) 、 3. 82 ( 1 H， m, 4一 H) , 3. 54 ( 1 H, b r - t , J = 7. 3 H z , 2" - H) 、 1. 1 1

( 3 H, d, J = 6. 7 H z , 5 ' 一 CH3 の H3 ) 糖組成 Lーフコース：不飽和 D—グルクロン酸： D—マンノース = 1 ： 1 ： 1

(各 1分子）

硫酸塩 3分子（Lーフコースの 2位と 4位及び D—マンノースの 6位）

なお、 1H— NMRにおけるビークの帰属の番号は下記式（V) の通りである

( c ) の物性

分子量 1 1 28

MS m/ 2 1 1 27 CM- H⁺ 〕 -

MS/MS / z 97 〔H S 04 〕 — 1 75 〔不飽和 D—グルクロン酸一 H 225 〔Lーフコース硫酸一 H2 0— H 243 〔L一フコース硫酸一 H 37 1 〔M—不飽和 D—グルクロン酸一 L一フコース一 S 0 3一 2 H 2 - 405 〔硫酸化 Lーフコースと D—マンノースが結合したもの一 H⁺ - 72 1 〔M一 D一マンノース— L一フコ一スー S 03 一 H2 0— H

+

1H - NMR (D2 0)

δ 5. 69 ( 1 Η, d , J = 3. 7 H z , (4) " 一 H) 、 5. 34 ( 1 H, s， ( 1 ) 一 H) 、 5. 1 6 ( 1 H, s， 1一 H) 、 5. 1 0 ( 1 H, d , J = 4. 0H z , ( 1 ) ' — H) 、 5. 50 ( 1 H, d , J = 3. 7 H z , 1 ' 一 H ) 、 . 93 ( 1 H, d， J = 6. 4 H z , ( 1 ) " —H) 、 4. 50 ( 1 H, d - d , J = 3. 4, 1 0. 7 H z , 3 ' 一 H) 、 4. 47 ( 1 H, d - d , J =3. 4, 1 0. 4 H z , (3 ) ' 一 H) 、 4. 39 ( 1 H, d , J = 7. 9 H z , 1 " —H) 、 4. 33 ( 1 H, b r - s , (2) - H) 、 4. 1 ( 1 H, m, 2 - H) 、 4. 1 2 ( 1 H, m, (3) " —H) 、 4. 12 ( 1 H, m, 5 ' — H) 、 4. 1 2 ( 1 H, m, (5) ' 一 H) 、 4. 04 ( 1 H, m, 4' - H) 、 4. 03 ( 1 H, m, (4) ' 一 H) , 3. 85 ( 1 H, m, 2 ' 一 H) 、 3. 85 ( 1 H, m, (2) ' 一 H) 、 3. 82 ( 1 H， m， 3—H) 、 3. 8 2 ( 1 H, m, (3) - H) 、 3. 73 ( 1 H, m, 4一 H) 、 3. 73 ( 1 H, m, 5 - H) 、 3. 73 ( 1 H, m, (4) 一 H) 、 3. 70 (2H， m， 5 - CH2 の H2 ) 、 3. 70 ( 2 H, m, (5 ) — CH2 の H2 ) 、 3. 67 ( 1

H, m, 5" - H) 、 3. 62 ( 1 H, m, 4"一 H) 、 3. 62 ( 1 H, m, (2) " — H) 、 3. 62 ( 1 H, m, (5) - H；) 、 3. 5 1 ( 1 H, t , J

=8. 9 H z , 3" - H) 、 3. 28 ( 1 H, t , J =7. 9H z, 2" - H) 、

I , 09 ( 3 H, d , J = 6. 7H z , (5) ' 一じの）、 1. 07 ( 1 H, d , J = 6. 7 H z , 5 ' 一 CH3 の H3 ) 糖組成 Lーフコース：不飽和 D—グルクロン酸： D—グルクロン酸： D—マンノース = 2 ： 1 ： 1 ： 2 (L—フコースと D—マンノース各 2分子と不飽和 D—グルクロン酸と D—ダルクロン酸各 1分子）

硫酸塩 2分子（各し—フコースの 3位）

なお、 1H— NMRにおけるビークの帰属の番号は下記式（VI) の通りである。

得られたフコース硫酸含有多糖一 Uに上妃ェント'型フコィダン分解酵素を作用させると反応の進行と共に脱離反応が起こって 230 nmの吸光度が増加するが、脱離反応の生成物となる不飽和へキス口ン酸基が主要反応生成物のすべてにることから得られたフコース硫酸含有多糖一 Uの分子内にへキスロン酸とマンノースが交互に結合した糖鎖の存在が示唆された。得られたフコース硫酸含有多糖一 U の構成糖の多くはフコースであるためフコース硫酸含有多糖一 Uは一般の多糖より酸に分解され易い。一方、へキスロン酸やマンノースの結合は比較的酸に強いことが知られている。ガゴメ昆布のフコース硫酸含有多糖混合物の分子内に存在するへキス口ン酸とマンノースが交互に結台している糖鎖中のへキスロン酸の種類を明らかにするためにカーボハイドレートリサーチ（Carbohydrate Researc h) 、第 125巻、第 283〜 290頁（ 1 984) の方法を参考にして、まずフコース硫酸含有多糖混合物を 0. 3Mのシユウ酸に溶解し 100· (：、 3時間処理したものを分子簠分画し、分子量が 3000以上の画分を集め、更に陰イオン交換樹脂により吸着分を集めた。この物質を凍結乾燥後 4 Nの塩酸で酸加水分解し、 PH 8に調整後、 PA化し、 H P L Cによりゥロン酸の分析を行った。なお HP L Cの条件は下記によった。

装置： L一 6200型（曰立製作所製）

カラム：パルパ 'ソクタイプ N ( 4. 6mmX250mm) (宝酒造社製）溶離液： 200 mM齚酸ートリエチルァミン緩衝液（ P H 7. 3) ：ァセトニトリル = 25 ： 75

検出：蛍光検出器 F— 1 1 50 (日立製作所製）にて励起波長 320 n m、蛍光波長 400 nmで検出

流速： 0. 8m 1 Z分

力ラム温度： 40て

なお、 P A化へキスロン酸の標準物質はグルクロン酸はシグマ社製、ガラクッ口ン酸は和光純薬社製、ィズロン酸はシダマ社製の 4—メチルゥンベリフリル α— Lーィズロニドを加水分解したもの、マンヌロン酸及びダルロン酸はァクタ，ケミカ《スカンヂナヴイカ（Acta Chenica Scand inavica)、第 1 5巻、第 1 3 97〜 1 398頁（ 1 961 ) 紀載の方法に従い、和光純薬社製のアルギン酸を加水分解後陰ィォン交換樹脂で分離したものを PA化することにより得た。

この結果、上記フコース硗酸含有多糖混合物の糖鎖中に含まれるへキスロン酸はグルクロン酸のみであることが判明した。更に上記糖鎖の加水分解物中のグルクロン酸を陰ィオン交換樹脂により D—マンノースと分離し凍結乾燥後その比旋光度を測定したところ右旋性でありグルク口ン酸は D—グルク口ン酸であることが判明した。

また、ガゴメ昆布由来のフコース硫酸含有多糖混合物をあらかじめ上記のェンド型フコィダン分解酵素で処理したものについても上記と同様にシュゥ酸で酸加水分解したが、 D—グルクロン酸と D—マンノースが交互に結合したボリマーは検出されなかった。このことから、上記のェンド型フコィダン分解酵素が脱離反応により切断するフコース硫酸含有多糖の骨格構造は D—グルクロン酸と D—マンノースが交互に結合した構造を持つことが判明した。更に、 D—グルクロン酸と D—マンノースのそれぞれの結合位置とグリコシド結合のァノメリック配置を調べるため、シュゥ酸分解により得られたボリマーを NMR分析した。

ボリマーの NMRの測定結果を以下に示す。但し、 1H— NMRでの化学シフト値はトリエチルァミンのメチル基の化学シフト値を 1. 13 p pmに、 I3c— NMRではトリェチルアミンのメチル基の化学シフト値を 9. 32 p pmとして表した。

1H -NMR (D₂ 0)

δ 5. 25 ( 1 Η, b r - s, 1 - H) 、 4. 32 ( 1 H, d, J = 7. 6H z, 1 ' 一 H) 、 4. 00 ( 1 H, b r - s , 2 - H) 、 3. 71 ( 1 H, _m> 5' 一 H) 、 3. 69 ( 1 H, m, 5 - CHの H) 、 3. 68 ( 1 H, m, 3 - H) 、 3. 63 ( 1 H， m， 5 - CHの H) 、 3. 63 ( 1 H, m, 4 ' 一 H) 、 3. 57 ( 1 H, m, 4 - H) 、 3. 54 ( 1 H, m， 3 ' 一 H) 、 3. 53 ( 1 H， m, 5 - H) 、 3. 25 ( 1 H, t , J = 8. 5H z、 2' - H) -NMR (D2 O)

5 1 75. 3 (5' 一 COOHの C) 、 1 02. 5 ( 1 ' 一 C) 、 99. 6 ( 1一 C) 、 78. 5 (2 - C) 、 77. 9 (4' 一 C) 、 77. 0 (3' - C) 、 76. 7 (5' 一 C) 、 73. 9 (5 - C) 、 73. 7 (2' 一 C) 、 70. 6 (3— C) 、 67. 4 (4— C) 、 61. 0 (5 - CH2 OHの C) なお、ビークの^屈の番号は下紀式（VII) の通りである：

D—グルクロン酸の 1位の立体配置はそのビシナル桔合定数が 7. 6 H zであることから 9一 D—グルクロン酸であると決定した。

また、マンノースの 1位の立体配置はその化学シフト値から 5. 25 p pmであることから α— D—マンノースであると決定した。

構成糖の結合様式は ^¾Η検出異褪核検出法である HMB C法を用いて行った。

1H— NMRの帰屈には DQF— COS Y法及び H 0 H A H A法を、じ一 NM Rの帰厩には HS QC法を用いた。

HMBCスぺクトルにより 1—Hと 4' 一 Cの間及び 4 ' 一 Hと 1一 Cの間、 1 ' 一 Hと 2— Cの間及び 2— Hと 1 ' 一 Cの間にそれぞれクロスピークが認められた。このことから D—グルクロン酸は /9結合で D—マンノースの 2位に、 D 一マンノースは α結合で D—グルクロン酸の 4位にそれぞれ結合していることが明らかとなった。

上記の結果を考え併せると、（a) は、還元末端残基である D—マンノースに不飽和 D—グルクロン酸と、硫酸基が結合した Lーフコースが結合した構造を持つこと、（ b ) は硫酸基が結合した還元末端残基である D—マンノースに不飽和 D—グルクロン酸と、 2個の疏酸基が結合した Lーフコースが結合した構造を持つこと、（ c ) は還元末端残基である D—マンノースに D—グルクロン酸と、硫酸基が桔合した L一フコースが結合し、その D—グルクロン酸に D—マンノースが桔合し、更にその D—マンノースに不飽和 D—グルクロン酸と、硫酸基が結合した Lーフコースが結合した構造を待つことが判明した。以上、得られたフコース硗酸含有多糖一 Uは、 D—グルクロン酸と D—マンノースが交互に結合した構造を持ち、少なくとも 1つ以上の D—マンノースに L一フコースが桔合している構造を有する。

また、下記一般式（Y 1 1 I ) で表される部分構造を有する（但し、式中の少なくとも 1つのアルコール性水酸基は硫酸エステル化しており、また _nは 1以上の整数を表す）。

以上フコース硫酸含有多糖一 Fと分離され、純化されたフコース硗酸含有多糖一 Uが提供される。本発明で使用するフコース硫酸含有多糖一 Uは構成糖としてゥロン酸を含有し、フラボパクテリゥム s p . S A - 0 0 8 2 ( F E R M B P— 5 4 0 2 ) の生産するフコィダン分解酵素により低分子化し、少なくとも上記式（ 1 ) 、（1 1 ) 、（I I I ) で表される化合物より選択される 1種以上の化合物が生成する。その分子量、分子量分布、糖組成は本発明で使用するフコース硫酸含有多糖一 Uをなんら限定するものではなく、任意の分子量、分子量分布のフコース硫酸含有多糖一 Uを調製することができ、糖組成等の理化学的性質が明確なフコース硫酸含有多糖一 υを提供することができる。

このフコース硫酸含有多糖一 Uを化学的、物理的、酵素学的に処理することによりその分解物を調製することができ、例えば上記式（ I ) 、（ Η ) 、（I I I ) 等の構造を有するォリゴ糖も本発明に使用することができる。本発明に使用するフコース硫酸含有多糖及び/又はその分解物はウイルスに高い親和性を有し、これらのフコース硫酸含有多糖及び/又はその分解物をウィルス吸着担体として利用することにより、ウイルスの精製やウィルスの除去が簡便に逮成される。

フコース硫酸含有多糖及び又はその分解物を含有するウィルス吸着担体としてはフコース硫酸含有多糖及び/又はその分解物の有効量を含有すれば良く、使用する目的により、任意のウイルス吸着担体を作製すれば良い。

本発明のウイルス吸着担体をゥィルスを含有する試料に接触させ、フコース硫酸含有多糖及び Ζ又はその分解物に目的のウイルスを吸着させた後、フコース硫酸含有多糖及び/又はその分解物を選択的に分別することにより、ウイルスの除去又は精製を簡便に行うことができる。ウイルス吸着後のフコース硫酸含有多糖及び Ζ又はその分解物の分別方法としては、例えば前述のフコース硫酸含有多糖及び Ζ又はその分解物の分別方法が使用できる。こうして試料からフコース硫酸含有多糖及び/又はその分解物を分別することにより、試料からのウイルスの除去が逮成される。ウィルスの精製が目的の場合には、分別されたフコース硫酸含有多糖及びノ又はその分解物から吸着されたゥィルスを適当な方法で溶離、回収すればよい。

また、本発明のウィルス吸着担体は、適当な修飾を施されたフコース硫酸含有多糖及び又はその分解物に適当な修飾を施されたものを含有したものでも良い。たとえば、ピオチンを結合させたフコース硫酸含有多糖及び/又はその分解物を含有するウイルス吸着担体を使用する場合には、試料との分別操作にァビジンを固定化した担体を用いることにより、ウィルスを吸着したフコース硫酸含有多糖及び Z又はその分解物をァビジン固定化担体上に回収することができる。なお、フコース硫酸含有多糖及び Z又はその分解物の修飾方法としては、公知の化学的、あるいは酵素的修飾方法を使用することができる。一方、フコース硫酸含有多糖及びノ又はその分解物を担体に固定化したウィルス吸着担体を作製することができる。特に不溶性の担体を用いて作製されたウイルス吸着担体は特别な分別操作を行うことなく液体試料や空気中などのウィルスの精製、除去に用いることができる。フコース硫酸含有多糖及び/又はその分解物の固定化に用いられる担体には特に制限はなく、たとえばゲル、あるいは粒子状の担体を使用することができる。なお、粒子状の担体としては粒子の表面積の大きな多孔性のものが好適である。また薄膜状支持体や中空糸状支持体を固定化用担体として用いても良い。固定化に用いる担体の材質はァガロース、セルロース、デキストラン等の多糖類、ボリアクリルアミド、アクリル酸ポリマー、スチレンジビニルベンゼンポリマ一、ポリメタクリレート等の合成高分子、シリカゲル、ガラス等の無機高分子等から使用の目的、方法に応じて適当なものを遒択すればよい。フコース硫酸含有多糖及び Z又はその分解物の固定化は、利用する担体に応じ、常法（例えば、 Γ新生化学実験講座，タンパク質 I j 第 2 2 7 ~ 2 3 7頁、 1 9 9 0年、東京化学同人発行等）に従って実施されるが、例えば、多糖類ゲルを固定化用担体として用いる場合には、多糖類ゲルの有する導入基にフコース硫酸含有多糖及び Z又はその分解物中の官能基を共有結合させることにより行われる。多糖類ゲルへのフコース硗酸含有多糖及びノ又はその分解物の固定化に当っては、フコース硫酸含有多糖及び/又はその分解物中の官能基との結合に適した導入基を有する多糖類ゲルを選択することが必要である。例えば、フコース硫酸含有多糖及び/又はその分解物中に存在するカルボキシル基を利用する埸合には導入基として ω—アミノアルキル基、あるいはチオール基を有する多糖類ゲルを、また、水酸基を利用する埸合には導入基としてエポキシ基を有する多糖類ゲルを使用することにより固定化を実施できる。多糖類ゲルが適当な導入基を有していない場合には、まず公知方法により適当な導入基を付加したうえで固定化に使用すればよい。

こうしてフコース硫酸含有多糖及び Ζ又はその分解物が共有結合によって担体に固定化されたウィルス吸着担体は物理、化学的に安定であり、ウィルス吸着操作、および/あるい溶出操作時においてフコース硫酸含有多糖及び/又はその分解物の試料中への脱離は見られない。このため該担体は、例えば医薬品の製造等へも支障なく使用することができる。以上のようにして作製されたフコース硗酸含有多糖及び Ζ又はその分解物を含有するウイルス吸着担体を用いてウイルスの精製、あるいはその除去を行うことができる。本発明の方法に適用されるウィルス含有試料としては、例えばウィルス感染培養細胞の上清や細胞の破砕物、血液や血清のような生体物質、医薬品、飲料水等の液体試料が挙げられる。また、気体、例えば空気中に浮遊するウィルスを本発明の方法によって除去することも可能である。

本発明のウィルス吸着担体は各種のウィルスに対して結合能を有しており、たとえばレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウィルス（A A V ) 、インフルェンザウィルス、ヘルぺスウィルス、ノ、'キュロウィルス等のウィルスを本発明の方法により精製、あるいは除去することが可能である。以上、本発明のフコース硫酸含有多糖及び Z又はその分解物を含有するゥィルス吸着担体はウイルス除去用の担体、ウイルス精製用の担体として有用である。本発明の方法はウィルスの精製方法として有用であり、研究を目的として、あるいはワクチンの製造のために高純度のウイルスが必要とされる場合に効果を発揮する。ウイルス濃度の希薄な試料ではウイルスの澳縮手段としても重要である。また、細胞の培養に用いられる培地のような研究用試薬や医薬品などのようにゥィルスの混在が望ましくないものについては、ウイルスの除去に本発明の方法を利用することができる。更に、試料中のウィルスの検出を行う場合には、本発明の方法を利用したウィルスの港縮操作を組み合わせることにより、検出感度を向上させることもできる。

試料中のウィルスを検出する際、その感度を決定する最大の要因は試料中のゥィルスの濃度である。本発明を利用することにより、従来法に比べて萵感度なゥィルスの検出が可能になる。すなわち、検出対象となる試料中のウィルスを本発明のウィルス吸着担体上に浦集した後、担体をそのまま、あるいは担体上のウイルスを適当な操作で回収した後にウイルス検出操作に供することにより、ウィルスを高感度に検出することができる。ウイルス検出の対象となる試料には特に限定はなく、組織、血液、尿といった生体由来試料のほか、医薬品、食品、飲料水、排水、空気、あるいは自然環境中の様々な試料について本発明の方法を適用できる。また、ウィルスの検出方法にも特に限定はなく、検出しょうとするウィルスを認識する抗体を使用する方法や、ウィルスの持つ核酸を検出する方法などを適宜遴択して使用すればよい。例えば、本発明のウィルス吸着担体を含有する溶液でうがいをした後、うがい液よりウィルス吸着担体を回収し、該担体、あるいは該担体より溶離、回収された港縮ウィルス試料をウイルス検出操作に用いることにより、口腔中に存在するウイルスの有無やその量を調べることができる。

ゥィルスの精製、例えばフコース硫酸含有多糖及び/又はその分解物を多糖類ゲルに固定化して作製されたウィルス吸着担体を用いたカラムクロマトグラフィ —法による液体試料中のウィルスの精製は以下のようにして行われる。まず上記の担体を充てんしたカラムを翻製し、通当な開始緩衝液を用いてカラムを平衡化する。次にウィルスを含有する試料を上記カラムに負荷した後、開始緩衝液等を用いて非吸着物質を洗浄する。必要であれば吸着したウイルスが溶離しない条件で緩衝液の組成を変化させて力ラムを洗浄し、ウイルス以外の吸着物を減らすことができる。その後に適当な溶出操作、例えば高澳度の塩を含む緩衝液の使用により吸着したウィルスを溶出液中に回収する。ゲルあるいは粒子状のウイルス吸着担体は上妃のカラムクロマトグラフィ一法の他、バッチ法による精製にも利用できる。また、薄膜状、あるいは中空糸状支持体を用いて作製されたウィルス吸着担体はそれぞれの担体に適した使用方法で、例えば適当な装置に装着した上で使用することができる。本発明のウイルス精製方法は簡便、かつ生理的条件に近い状態でのウイルスの精製、及び除去を可能にする。

従来のウィルス精製方法としてはポリエチレングリコールや硫酸アンモ-ゥムを用いた沈殿法があるが、この方法ではウィルスの感染能の低下が大きな問題であり、特に胃症候性出血熱 ( H F R S ) ウィルスでは感染能力が全く失われてしまう。また超遠心分離法や限外ろ過膜を用いた膜濃縮によるウィルス精製法も知られているが、これらの方法は操作が煩雑であり、また、ある程度の慼染能の低下は免れない。本発明の方法では試料中のウイルスを不活化させることなく精製、灞縮することが可能となり、ヮクチンの製造やウイルスに関する研究を行う上で有用である。

ウイルスの精製に利用可能なクロマトグラフィー用担体としては、硫酸化セルロースが知られており、日本脳炎ウィルス（特公昭 6 2— 3 3 8 7 9号公報）、インフルエンザウイルス（特公昭 6 2 - 3 0 7 5 2号公報）、狂犬病ゥィルス (特公昭 6 2— 3 0 7 5 3号公報）、レトロウイルス（米国特許 5 4 4 7 8 5 9 号公報）、アデノ随伴ウィルス [ヒューマンジーンセラビー（Hu靈 an Gene T herapy ) 、第 7巻、第 5 0 7 ~ 5 1 3頁（ 1 9 9 6 ) ] 等の精製に利用できることが知られている。しかしながら、下記実施例に示すように本発明のウィルス吸着担体は硫酸化セルロースに比べて高いウィルス吸着容量を有している。また、担体上に存在する硫酸基当たりのレトロウイルス吸着量を比較した場合も本発明のウィルス吸着担体は硫酸化セルロースに比較して優れている。このため、本発明のウィルス吸着担体を使用することにより、より効率的にウィルスの精製、 ¾1 縮、あるいは除去を行うことができる。さらに、アデノウイルスは硫酸化セル口一スには吸着しないが [バイォ Zテクノロジー（Bio/Technology)、第 1 1巻、第 173~178頁（ 1993) ] 、本発明のウイルス吸着担体はアデノウィルスに対しても吸着能を有しており、より広範なウイルス種に対して適用することができる。

また、本発明のウィルス吸着担体を利用することにより、試料中の有効成分を損なうことなく混在するウイルスを除去することも可能であり、医薬品等の製造において特に有用である。実施例

以下に本発明を実施例をもつて更に具体的に示すが、本発明が以下の実施例の範囲のみに限定されるものではない。参考例 1

ガゴメ昆布のフコース硫酸含有多糖混合物の抽出

ガゴメ昆布を十分乾燥後、 2 k 8：を自由粉砕機（奈良機械製作所製）により粉砕し、得られた乾燥粉末を 9リツトルの 80 %エタノールに懸濁し 80て、 2時間処理した。処理後ろ紙によりろ過し残渣を得た。この残渣に対して上記エタノール洗挣、ろ過という操作を 3回操り返しエタノール洗浄残渣を得た。この残渣を 36リットルの 0. 2 M酢酸カルシウム溶液に懸濁後、 95'C、 2時間処理し、ろ過した。残渣を 4リットルの 0. 2M酢酸カルシウム溶液で洗浄し、ガゴメ昆布のフコース ¾酸含有多糖混合物抽出液 36リづトルを得た。参考例 2

ガゴメ昆布のフコース硫酸含有多糖混合物の精製

参考例 1で得られたろ液に 5%の塩化セチルビリジニゥムをそれ以上沈殿が生じなくなるまで添加し遠心分雜により沈殿を集めた。この沈殿を 3リットルの 0. 4M食塩水に懸濁後遠心分離し、洗浄した。この洗浄操作を 3回緣り返した後沈殿に 1 リットルの 4 M食塩水を添加しよくかくはん後エタノールを 80%となるように添加し、かくはん後遠心分離により沈殿を得た。この沈殿を 80%ェタノール中に翻濁し遠心分離するという操作を、上清中の 260 nmの吸光度が 0になるまで繰り返した。この沈殿を 2Mの食塩水 3リットルに溶解し、不溶物を遠心分離により除去後、 2 Mの食塩水で平衡化した 100m lの DEAE—セル口ファイン A— 800 (生化学工業社製）を添加し、かくはん後、加えた樹脂をろ過により除去した。ろ液を 2 Mの食塩水で平衡化した D E AE—セル口ファイン A— 800カラムにかけ非吸着分を排除分子量 10万以下のホ口ファイバーを備えた限外ろ過装置で限外ろ過し、着色性物質及び食塩を完全に除去後、遠心分離及びろ過により不溶性物質を除去し、凍結乾燥した。凍結乾燥フコース硫酸含有多糖混合物の重量は 90 srであった。参考例 3

フコース硫酸含有多糖一 Fの製造方法

参考例 2で得られたフコース硫酸含有多糖混合物を 1. 28：抨量し、 1. 5M の塩化ナトリウム溶液に終 «度 0. 2%となるように溶解し、 1. 25%の塩化セチルビリジユウムの 1. 5M塩化ナトリウム溶液をこれ以上沈殿が生じなくなるまで添加した。生じた沈殿を遠心分離により集め、この沈殿を 500 m 1の 1. 5M食塩水に ¾濁後遠心分離し、洗浄した。この洗浄操作を 3回繰り返した後沈殿に 1 リットルの 4 M食塩水を添加しよくかくはん後エタノールを 80%となるように添加し、かくはん後遠心分離により沈殿を得た。この沈殿を 80%ェタノール中に懸濁し遠心分離するという操作を、上清中の 260 nmの吸光度が 0になるまで繰り返した。この沈殿を 2 Mの食塩水 50 Om Iに溶解し、不溶物を遠心分離により除去後、 2 Mの食塩水で平衡化した 1 m lの DEAE—セルロファイン A— 800 (生化学工業社製）を添加し、かくはん後、加えた樹脂をろ過により除去した。ろ液を 2Mの食塩水で平衡化した D E AE—セル口ファイン A— 800カラムにかけ非吸着分を排除分子量 10万以下のホロファイバーを備えた限外ろ過装置で限外ろ過し、着色性物質及び食塩を完全に除去後、遠心分離及びろ過により不溶性物質を除去し、凍結乾燥した。涑結乾燥フコース硗酸含有多糖一 Fの重置は 71 Omfirであった。参考例 4

フコース硫酸含有多糖一 Fの培養的精製方法

参考例 2で得られたフコース硫酸含有多糖は 2種のフコース硫酸含有多糖の混合物であるが、これを 60 sr秤量し、 20リットルの人工海水に溶解後ペプトン 200 gと酵母ェキス 4 gを加え、 30リツトル容のジャーフアーメンターに入れ滅菌後、前紀 WO 96Z34004号公報記載のフラボパクテリゥム s p. SA— 0082株（FERM BP— 5402) を植菌して 25て、 24時間培 «した。培養液を遠心分離し菌体を除去後、排除分子量 1 0万以下のホロフアイバーを備えた限外ろ過装置で限外ろ過し、低分子性物質を完全に除去後、遠心分離及びろ過により不溶性物質を除去し、凍桔乾燥した。凍結乾燥フコース硫酸含有多糖一 Fの重量は 36 であった。参考例 5

フコース硫酸含有多糖一 U、フコース硫酸含有多糖一 Fの分別精製

参考例 2記載のフコース硗酸含有多糖混合物の凍結乾燥物を 7 sr秤量し、 0. 2Mの塩化カルシウムに溶解した。次に、これを 0. 2Mの塩化カルシウムで平衡化した 4000m lの DEAE—セファロース F F (ファルマシア社製）の力ラムにかけ、 0. 2Mの塩化カルシウムで十分洗浄し、次に、 0〜4Mの塩化ナトリウムのグラジントで溶出を行つた。溶出画分のうち塩化ナトリウム璣度が 0. 05〜0. 8 Mの画分を集め透析により脱塩後凍結乾燥し、フコース硫酸含有多糖— Fと分離されたフコース硫酸含有多糖一 Uを 2. 1 g得た。

また、上記溶出画分のうち塩化ナトリウム濃度が 0. 9~1. 5Mの画分を集め透析により脱塩後凍結乾燥し、フコース硫酸含有多糖一 Uと分離されたフコース硫酸含有多糖一 Fを 4. 7 sr得た。参考例 6

ガゴメ昆布を十分乾燥後、 2 k gを自由粉砕機（奈良機械製作所製）により粉砕し、得られた乾燥粉末を 9リットルの 80 %エタノールに懸 Sし 80 *C、 2時間処理した。処理後ろ紙によりろ過し残渣を得た。この残渣に対して上記 Xタノール洗挣、ろ過という操作を 3回繰り返しエタノール洗浄残渣を得た。この残渣を 36 リットルの 0. 2 M酢酸カルシウム溶液に懸濁後、 95て、 2時間処理し、ろ過した。残渣を 4リットルの 0. 2 M酢酸カルシウム溶液で洗浄し、ガゴメ昆布のフコース硗酸含有多糖混合物抽出液 36 リットルを得た。

このろ液を排除分子量 1 0万の限外ろ過膜を装着した限外ろ過器により 2リットルに濃縮し、次に、終饞度が 1. 5 Mとなるように食塩を添加し 5%の塩化セチルビリジニゥムをこれ以上沈殿が生じなくなるまで添加した。生じた沈殿を遠心分雜により除去した。得られた上清を限外ろ過により 1 リットルに澳縮し、 4 リットルのエタノールを添加し、生じた沈殿を遠心分離により集めた。この沈殿に 1 0 Om 1 の 4 M食塩水を添 ¾しょくかくはん後エタノールを 80%となるように添加し、かくはん後遠心分雜により沈殿を得た。この沈殿を 80%ェタノ一ル中に ¾灝し遠心分離するという操作を、上清中の 260 nmの吸光度が 0になるまで繰り返した。この沈殿を 2 Mの食塩水 2リットルに溶解し、不溶物を遠心分離により除去後、 2 Mの食塩水で平衡化した 50 m 1 の D EA E—セルロファイン A— 800 (生化学工業社製）を添加し、かくはん後、加えた樹脂をろ過により除去した。ろ液を 2Mの食塩水で平衡化した D E AE—セル口ファイン A— 80 0力ラムにかけ非吸着分を排除分子量 1 0万以下のホロフアイバーを備えた限外ろ過装置で限外ろ過し、着色性物質及び食塩を完全に除去後、遠心分雠及びろ過により不溶性物質を除去し、凍結乾燥した。凍結乾爆したフコース硫酸含有多糖一 Uの重量は 1 58：であった。

またこのフコース硫酸含有多糖一 Uは、前記: cンド型フコィダン分解酵素を作用させると上記式（ I ) 、（11) 、及び（III) で表されるオリゴ糖が生じた。実施例 1

F F—セルロフアインの調製

参考例 3記載のフコース硫酸含有多糖一 F 840 mgrを 50g (湿重量）のァミノセル σファイン（生化学工業社製）とともに 500m srの N a C N B H4を含む 80m 1 の反応溶液（0. 2M リン酸緩衝液、 P H7. 0、 0. 1 M N a C 1 ) に添加し、 60*C；、 60時間の縮合反応を行った。得られた反応生成物を純水で洗浄した後、 420m 8：のグルコースと 2 1 Omgrの N a CNB Haを含む 8 Om 1の反応溶液（0. 2 M リン酸緩衝液、 P H 7. 0、 0. 1 M N a C

1 ) を加えてさらに 6 0'C、 8 0時間縮合反応を行った。得られた反応生成物を 3 M N a C 1、次いで純水で洗浄した。以下この反応生成物を F F—セルロファインと呼ぶ。

上記の F F—セル口ファインは 3 3 mo 1 / m 1 の硗酸基を有していた。実施例 2

( 1 ) ウィルス上清液の調製

マウス白血病ウイルス由来の組換えレトロウイルスを含有する上清液は以下のようにして調製した。レトロウイルスプラスミド、 PM5 n e oベクター〔ェクスペリメンタル ·へマトロジ一（Exp. Heiatol.)_N 第 23巻、第 630〜 638 頁（ 1 995) 〕を含有する GP + E 86産生細胞（ATC C C R L - 964

2 ) は 1 0 %ゥシ胎児血清（F C S、ギブコ社製）並びに 5 0単位/ m 1 のべ二シリン及び 50〃 srZm l のストレブトマイシン（共にギブコ社製）を含有するダルベッコ改変イーグル培地（DM E M、 J RHバイオサイエンス社製）中で培養した。なお、実施例 2~4において使用した DMEMはすべて 50単位 Zm I のペニシリン及び S O gr/m 1のストレブトマイシンを含んだものである。ゥィルス含有上清液は上記産生細胞をセミコンフルェントに生育させたプレートに

1 0% F C Sを含有する DM ΕΜを添加し、一夜培養した後に採集して調製した。採集した培地上清を 0. 45 mのフィルター（ミリポア社製）でろ過してレトロウィルス上清液とし、使用するまでは一 80てで保存した。

上清液のウィルスカ偭は N I H/3 T 3細胞（ATC C CRL- 1 658) を使用して標準的な方法〔ジャーナル · ォブ · ウイロロジ一（J. Virol. )_N 第 6 2巻、第 1 1 20~ 1 1 24頁（ 1 988) 〕に従って測定した。すなわち、 6 ゥエルの組蛾培養ブレートの 1 ゥエルあたりに 2000個の N I H/3 T3細胞を含む DMEMを添加し、一夜培養させた後、系列希釈したウィルス上清液と終濃度 7. 5 g: m I のへキサジメトリン · ブロミド（ボリプレン：アルドリツチ社製）とを各ゥエルに加えた。これを 37てで 2 4時間インキュベートした後、培地を G 418 (終濃度 0. 75m8r/m l、ギブコ社製）を含有するものと交換してさらにインキュベートを桉けた。 10~12曰後に生育した G418耐性 (G 418^r) コロニーをクリスタルバイオレツトで染色しその数を記録した。各ゥエルのコ口エー数と添加されたウイルス上清液の希釈倍率をもとに上清 1 m 1 当りに含まれる感染性粒子数（c f u/m l ) を算出し、カ偭を求めた。

( 2 ) F F -セル口ファインを用いたレトロウイルスの精製

実施例 2で調製した F F—セルロファイン 3m Iを脱気し、デイスボーザブルカラム（セバコールミニ、生化学工業社製）に充てんしてべッド体積 3 m 1の力ラムを作製した。 PBS (リン酸緩衝生理食塩水）でカラムを十分に平衡化した後、実施例 1で調製したレトロウイルス上清液 3 m Iをカラムにアブライした。次にカラムを 30m lの PB Sで洗浄し、溶出緩衝液 A ( 360 mM NaC l を含む PB S) 1 5m 1、溶出緩衝液 B (86 OmM N aC lを含む PBS) 15 m 1、溶出緩衝液 C ( 1860 mM N aC lを含む PBS) 15 m Iを順に添加して吸着物質を溶出させた。カラムからの溶出液はウイルス上清液のアブライ時のものを含めて 3m lずつ分取した。

分取された溶出液について 280 n mにおける吸光度を測定すると共に、そこに含まれるウィルス量の測定を行った。ウイルス量の測定には実施例 1に記載のウイルスカ価の測定法を用いた。分取された溶出液より 200/i lを取り、これに 800 1の DMEM、及び終激度 7. のへキサジメトリン · ブロミドを加えたものを系列希釈したウィルス上清液の代りに用いて、上記同様の操作で出現する G418酎性コロニーの数を翻べた。

得られた結果を図 1に示す。ウィルス上清液に含まれる 280 nmに吸収を持つ物質のほとんどはカラムへの添加直後に溶出されているが、ウィルスのほとんどは溶出緩衝液 Aで溶出を行ったところで溶出されている。このことはウィルスが F F—セル口ファイン力ラムに特異的に吸着し、これによつて試料中の多くの夾雑物との分離が可能であることを示している。

(3) FF—セル口ファイン、硫酸化セル口ファインのレトロウイルス吸着能の比較

F F —セルロフアインと硫酸化セルロースとの性能を比較を以下に示す操作により行った。なお、硫酸化セルロースとしては硫酸化セル口ファイン（生化学ェ業社製）を使用した。この硫酸化セルロフアインは 8 z m o 1 / m 1 の硫酸基を有していた。

F F—セルロフアインと硫酸化セルロファィンのそれぞれを用いて実施例 2— ( 2 ) に記載のレトロウィルスの精製操作を行った。ただし溶出緩衝液 B、および Cによる溶出操作は省略した。結果を図 2に示す。 F F —セル口ファインカラムを用いた場合には非吸着画分（素通り、および P B S洗浄による溶出画分）にはウイルスが検出されないが、硫酸化セルロフアインではこの画分にウィルスの漏出が見られる。また、カラムに吸着した後、溶出緩衝液 Aにより回収されるゥィルス量、および両担体に存在する硫酸基当りのウイルス回収量を表 1 に示す。総回収ウィルス量、硫酸基当りの回収ウィルス量のどちらを比較した場合も、 F F—セルロフアインでの値が硫酸化セルロフアインを上回っている。このことから F F —セルロフアインは疏酸化セルロファィンに比較して高いレトロウィルス吸着容量を有していることがわかる。表 1

実施例 3

( 1 ) 組換えアデノ随伴ウイルスの作製以下に示す操作に従い、レポーター遺伝子として大腸菌の 1 a c Zil伝子を含有する組換えアデノ随伴ウィルスを作製した。アデノ随伴ウィルス（AAV) ゲノム全長を含むプラスミド PAV 1 CAT C C No. 3721 5、ジーン（Ge ne) 第 23巻、第 65~73頁（ 1983) 参照〕にはベクター（p A 1 I P) に由来する 2力所の X b a I部位が存在する。まずこれらを除くために PAV 1 を X b a I (宝酒造社製）で消化し、 DNAブランティングキット（宝酒造社製）を用いて末端を平滑化した後、ライゲージ _B ンキット（宝酒造社製）を用いてセルフーライゲーションさせた。こうして得られた組換えブラスミド（ p A 1 I P 由来の Xb a I— Xb a I小断片が除かれたもの）について、 AAVゲノム上のタンパクをコードする傾域と、末端配列（ I TR) とを容易に分離できるように X b a I リンカーの導入を行った。すなわち、上記のブラスミドを N c o I (宝酒造社製）で部分消化した後、配列表の配列番号 1で示される塩基配列を有する X b a I リンカーと混合してライゲーシ _B ンを行った。得られたブラスミドのうち、 AAVゲノムの 5' 末端より 4481塩基の位置に存在する N c o Iサイトに上記のリンカーが揷入されたものを Sび、さらにこのプラスミドを A v a il (宝酒造社製）で部分消化した後、配列表の配列番号 2、 3で示される塩基配列を有するォリゴヌクレオチドから構成される Xb a I リンカ一と混合してライゲ —シ 3 ンを行った。こうして作製されたプラスミドのうち、 AAVゲノムの 5' 末端より 1 90塩基の位置に存在する A V a Πサイトに上記のリンカーが挿入されたものを JSんだ。こうして得られた、新たに 2力所の X b a Iサイトが導入されたプラスミドを pAV l Xと命名した。

プラスミド pAV l xを Xb a lで消化してァガロースゲル電気泳動を行い、 AAVゲノム由来のタンパクをコードする傾域を含む約 4. 3 k bの DNA断片と、 AAV末端配列を含む約 4. 4 k bの DNA断片とをそれぞれゲルより回収した。

ブラスミドベクター p CMV /9 (クロンテツク社製）を E c o R I、 H i n d m (ともに宝酒造社製）で消化した後、ァガロースゲル電気泳動を行って CMV (サイトメガロウィルス） iBmediate early prouoter、大 te 1 a c Z遣伝子、および S V 40ポリ Aシグナルを含む約 4. 5 k bの DN A断片を回収した。該断片、および上記のプラスミド P AV 1 X由来の約 4. 4 k b DN A断片の末端をそれぞれ DN Aブランティングキトを用いて平滑化した後、これらを混合してライゲ一シ _aンを行い、組換えブラスミドを作製した。該ブラスミドを AAV ベクターブラスミドと命名した。

一方、ブラスミドベクタ一 pUC 18 (宝酒造社製）を X b a Iで消化し、これと上記のプラスミド PAV 1 X由来の約 4. 3 k b DNA断片とを混合してラィゲーシ _a ンを行い、組換えブラスミドを作製した。該ブラスミドを AAVヘルパーブラスミドと命名した。

(2) アデ/随伴ウィルス上清液の調製

ヒトアデノウイルス 5型（ATCC VR— 5) を感染させた 293細胞（A TCC C R L- 1573) に AAVベクターブラスミド、および AAVへルバ一プラスミドをリン酸カルシウム法によって導入した。この細胞を 10% FCS を含有する DM EM中で 2~ 3日間培養した後、遠心分雜を行って上清を回収した。この上清を 0. 45^mのフィルター（ミリポア社製）でろ過した後、 56 •C、 30分間の加熱処理によって混在するアデノウイルスを不活化し、これをァデノ随伴ウィルス上清液として以下の実験に用いた。

アデノ随伴ウイルス上清液のウィルス力価は以下の操作に從つて測定した。コラーゲンコートされた 24ゥエルのプレート（岩城硝子社製）を用い、この 1ゥエルにつき 15000個の 293細胞と、 10% F C Sを含む D M E Mとを添加して培養した。翌日、培地を除き、新たに 10% FC Sを含む DMEM 0. 5 m 1と系列希釈したウィルス上清液 0. 1 m lとを添加し、 37 'Cで一晩培養した。プレートより培地を除き、 PBSで洗浄した後、 0. 5%グルタルアルデヒト'溶液を加えて室温で 30分間放置し、細胞を固定した。プレートを PB Sで洗浄し、 X— Ga l溶液（0. 04% X - G a 5mM K3F e (CN) s、 5 mM K4F e (CN) e、 1 mM MgC 12) を添加して 37てで一晩放置した。

1 a c Z遺伝子上にコードされる /9一ガラクトシダーゼの活性によって青く染まつている細胞の数を顕微鏡下で計数し、これとゥエルに添加されたウィルス上清液の希釈倍率をもとに上清 1 m Iあたりに含まれる感染性粒子数（ P f u/m 1 ) を算出してこれを上清液の力価とした。

(3) FF—セル口ファイン、および硗酸化セル口ファインを用いたアデノ随伴ゥィルスの精製

F F—セル口ファイン、および硫酸化セル口ファインカラムを脱気し、それぞれデイスポーザブルカラム（セパコールミ -) に充てんしてべッド体積 0. 5 m 1のカラムを作製した。 PB S (リン酸緩衝生理食塩水）でカラムを十分に平衡化した後、上記のアデノ随伴ウィルス上清液 30m 1づっをアブライした。次にカラムを 9m lの PBSで洗挣し、溶出緩衝液 A ( 360 mM N a C lを含む PB S) 9m 1 > 溶出緩衝液 B (86 OmM N a C lを含む PB S) 9m l、溶出緩衝液 C ( 1860 mM N a C Iを含む PB S) 9m lを順に添加して吸着物質を溶出させた。この際、溶出緩衝液 A~Cでの溶出液をそれぞれ 3m 1ずつ分取した。

得られた溶出液に含まれるウィルス量を実施例 3— (2) に記したアデノ随伴ウィルスの力価測定法に従って定量した。なお、このとき各溶出液の希釈は行わなかつた。 FF—セル口ファイン、硫酸化セルロファインのどちらの溶出液でも、溶出緩衝液 Aで溶出を行った最初の画分にのみウイルスが存在しており、該画分の感染細胞の数はそれぞれ F F—セル口ファインが 1 26、碇酸化セルロフアインが 33であった。このことから FF—セル口ファインは硫酸化セル口ファインと比較してアデノ随伴ウイルスに対して高い吸着容盪を有していることが明らかとなった。実施例 4

( 1 ) アデ/ウィルス上清液の S製

ヒトアデノウイルス 5型を含有する上清液は以下のようにして 33製した。 5% F C Sを含有する DM E M中で 50一 70%コンフルェントとなるまで培餐した 293細胞（ATCC CRL— 1573) にヒトアデノウイルス 5型（ATC C VR- 5) を感染させ、 1 % F C Sを含む DMEMを添加して 2~3日間培養してウィルス粒子を生産させた。培養終了後、回収した 293細胞を凍結融解を 3回繰り返すことによって破砕し、さらに遠心分離を行って上清を回収した。こうして得られた上清をアデノウィルス上清液とし、使用するまでは一 80てで保存した。

アデノウィルス上清液のウイルスカ価は、 293細胞を使用したブラークアツセィによって測定した。すなわち、 24ゥエルの組織培養プレートを用い、この 1 ゥエルにつき 2 00000個の 293細胞と、 5 % F C Sを含む DMEMとを添加して 2日間培養した。ゥエルを 1 %の F C Sを含む D MEMで洗浄した後、 1 % F C Sを含む DM EMで系列希釈したウィルス上清液 1 00 / 1を添加し、 37 てで 1 .5時間培養し感染を成立させ、さらに 1 % 03を含む13\15\1を 1 m 1 /ゥエル添加して培養を続けた。 3 ~5日問培養を铰けた後に顕微鏡観察によりゥエルあたりのプラークの数を数え、ゥエルに添加されたゥィルス上清液の希釈倍率をもとに上清 1 m 1 あたりに含まれる感染性粒子数（ p f u Zm 1 ) を算出し、これを上清液の力価として用いた。本発明において使用されたアデノウィルス上清液は 2. 4 X 1 09p f u / l の力価を有していた。

( 2 ) F F—セル口ファインへのアデノウイルスの吸着

F F—セル口ファインカラムは実施例 2— (2 ) と同様の方法で作製した。上記のアデノウィルス上清液を 1 X 1 05p f u /m 1 になるように P B Sで希釈し、そのうちの l m 1 をカラムにアブライした。次にカラムを 3 0 m 1 の P B Sで洗浄し、続いてカラムに吸着した物質を溶出緩衝液 1 ( 8 60 mM N a C l を含む P B S ) 1 5 m I 、および溶出緩衝液 2 ( 1 500 mM N a C l を含む P B S ) 1 5 m 1 を用いて順次溶出させた。

力ラムからの溶出液を 3 m 1づっ分取し、そのそれぞれについて実施例 4一

( 1 ) に記載の方法でウィルス粒子数を計数した。その結果、非吸着画分（素通り、および P B S洗浄による溶出画分）には 1 X 1 04p f uのウィルス粒子が含まれており、アプライされたアデノウイルスの 9 0%がカラムに吸着したことが示された。また、溶出緩衝液 1 による溶出画分には 2 X 1 04 p f _u、溶出緩衝液 2による溶出画分には 3 X 1 03p f uのウィルス粒子がそれぞれ含まれていた。一方、 F F—セル口ファインにかえて硫酸化セル口ファインを用いてカラムを作製し、上記のとおりのウィルス吸着〜溶出の操作を行った。この場合には、ァプライしたウイルスのほとんどすべてが非吸着画分に回収されており、アデノウィルスの硫酸化セル口フアインへの吸着は見られなかった。実施例 5

( 1 ) FF—セル口ファインへのバキュロウィルスの吸着

オートグラファ · カリフオルユカ（Autographa carifornica) マルチヌクレオキヤブシド核多角体病ウイルス（Ac MNPV) について本発明のゥィルス吸着担体への吸着を調べた。ウィルスの基本的な取り扱い操作は W H フリーマンアンドカンパニー社、 1 992年発行、ォレイリー（O'Reilly) ら著、バキュロウイノレスェクスフレヅシ aンベクター (Baculovirus Expression Vecto r) に記載の方法に準じて行った。

実施例 2— （2) に記載の方法に準じてべッド体積 2 m 1の F F—セルロファィンカラムを作製し、 30m l の PB Sで力ラムを平衡化した。野生型 AcMN P V高カ価ストツク（インビトロジヱン社製）を 1 X 1 0?pfu/m 1になるように S F 900 Π培地で希釈し、そのうちの 1 m 1をカラムにアブライした。次にカラムを 1 6m l の PB Sで洗浄し、この際のカラムからの溶出液を 4 m 1ずつ分取した（このそれぞれを画分 A~Dとした）。さらに 20m lの PB Sでカラムを洗浄し、この溶出液を画分 Eとした。次にカラムに吸着した物質を 200 m M N a C l を含む PB S、 300 mM Na C lを含む P BS、 400 mM N a C 1 を含む P B S、 700 mM N a C 1を含む P B S、 1 M N aC l を含む P B S それぞれ 4 m 1ずつを用いて順次溶出した。なお、溶出操作に使用した P B Sには終壤度 0. 2%のゥシ血清アルブミン（B SA) を添加した。各 N a C 1 旗度の PB Sで回収された溶出液を分取し、それぞれを画分 F~ Jとした。画分 A〜 Jより 2m lずつを取り、それぞれを S F 900 Π培地に対して透析した後、 0. のフィルターでろ過した。 35 mm径のゥエルに 3 m 1の T C 1 00 培地（ギブコ社製）および 1. 5X 1 0⁵個/ c m2の細胞密度の S f 9 M細胞 [ゥイスコンシン大学、ディ一ンモシャー (Deane Mosher) 博士より恵与] を添加したものを準備し、このそれぞれに上記のろ液 1 m 1ずつを加えて培餐した。また、ポジティブコントロールとして 2 . 5 X 1 06 p f uのウィルスを含む l m

1 の S F 9 0 0 Π培地を加えたゥエル、およびネガティブコントロールとして 1 m 1 の S F 9 0 0 Π培地を加えたゥエルを用意して同様に培養した。 4、 7、 1

1 曰後にゥエルを観察し、プラークの出現、およびプラーク内での多角体の形成からウィルス感染の有無を期べた。結果を表 2に示す。表中、（+ ) はウィルスの感染が見られたことを、また（一）は感染が認められなかったことを示す。表 2

表 2に示されるように、培養 7日後には画分 I、 Jのゥエルのみにウィルス感染が認められたが 1 1 曰後では画分 A、 G〜 Jのゥエルに感染が見られた。この結果より、バキュロウィルスは F F —セル口ファインに吸着されること、およびカラムに吸着されたバキュロウィルスの大部分が 7 0 O m M以上の潘度の N a C 1 を含む P B Sによって溶出されることが示された。発明の効果

以上詳細に説明したように、本発明によれば、効果的なウィルスの精製又は除去を行うことができ、その各方面における利用は極めて有用である。

本発明の方法では試料中のゥィルスを不活化させることなく精製、 ¾8縮することが可能となり、ワクチン等のウィルス由来の生理活性物質、逆転写酵素等の製造やウイルスに閱する研究を行う上で有用である。

また、試料中の有効成分を損なうことなく混在するウイルスを除去することも可能であり、ウィルスフリーの血液製剤等の医薬品などの製造において特に有用である。

またウィルスの簡便な港縮が可能となり、ウィルスの検出等、診断の分野においても極めて有用である。

更に、本発明のウィルス吸着担体を使用することにより、空気中のウィルス除去が高度に可能になり、インフルエンザウイルスの予防、清浄空気の作成において特に有用である。

配列番号： 1

配列の長さ： 1 0

配列の型：核酸

鎖の数： 2

トポロジー：直鎖状

配列の種類：その他の核酸（台成 D N A )

配列：

CATGTCTAGA 10 配列番号： 2

配列の長さ： 7

配列の型：核酸

鎖の数： 1

トポロジー：直鎖状

配列の種類：その他の核酸（合成 DNA) 配列：

GTCTAGA 7

配列番号： 3

配列の長さ： Ί

配列の型：核酸

鎖の数： 1

トポロジー：直鎖状

配列の種類：その他の核酸（合成 DNA) 配列：

GACTCTA 7

Claims

請求の範囲

1. ウィルス含有試料中のウイルスをフコース硗酸含有多糖及び Z又はその分解物に吸着させる工程を含有することを特徴とするウィルスの精製方法。

2. ウイルス含有試料中のウイルスをフコース硫酸含有多糖及び/又はその分解物に吸着させる工程を含有することを特徴とするウィルスの除去方法。

3. フコース硫酸含有多糖及び/又はその分解物が担体に固定化されている請求項 1又は 2に記載の方法。

4. フコース硫酸含有多糖及び Z又はその分解物が下記理化学的性質を有するフコース硫酸含有多糖及び/又はその分解物である請求項 1 ~3いずれか 1項に妃載の方法。

( 1 ) 構成糖：ゥ口ン酸を実質的に含有しない。

(2) フラボバクテリゥム（F vobacteriu醒） s P . SA—ひ 082 (F E R M BP— 5402) の生産するフコィダン分解酵素により実質上低分子化されない。

5. ウィルスがレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウィルス、ノヽ'キュロウィルス、インフルエンザウイルス、ヘルぺスウィルスより選択される請求項 1〜3いずれか 1項に記載の方法。

6. ウイルス含有試料が液体又は気体である請求項 1〜 3いずれか 1項に記載の方法。

7. 担体がゲルまたは粒子状担体である請求項 3記載の方法。

8. 担体が薄膜状支持体である請求項 3記載の方法。

9. 担体が中空糸状支持体である請求項 3記載の方法。

10. 請求項 1記載の方法で得られるウィルス精製物。

11. 請求項 2記載の方法で得られるウィルス除去物。

12. フコース硫酸含有多糖及び/又はその分解物を含有するゥィルス吸着担体。

13. フコース硫酸含有多糖及び Z又はその分解物が担体に固定化されているゥィルス吸着担体。

14. フコース硫酸含有多糖及び又はその分解物が下記理化学的性質を有するフコース疏酸含有多糖及び/又はその分解物である請求項 1 2又は 1 3記載のゥィルス吸着担体。

( 1 ) 構成糖：ゥ口ン酸を実質的に含有しない。

(2 ) フラボバクテリゥム（FlavobacteriM) s P . SA-0082 (F ER M BP— 5402) の生産するフコィダン分解酵素により実質上低分子化されない。

15. 担体がゲルまたは粒子状担体である請求項 1 3記載のウィルス吸着担体。

16. 担体が薄膜状支持体である請求項 1 3記載のウィルス吸着担体。

17. 担体が中空糸状支持体である請求項 1 3記載のウィルス吸着担体。