WO1997015684A1 - Systeme d'analyse qualitative et/ou quantitative de substances, de preference biologiques, par chimiluminescence amplifiee, procede et necessaire d'analyse en faisant application - Google Patents

Systeme d'analyse qualitative et/ou quantitative de substances, de preference biologiques, par chimiluminescence amplifiee, procede et necessaire d'analyse en faisant application Download PDF

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WO1997015684A1
WO1997015684A1 PCT/FR1996/001636 FR9601636W WO9715684A1 WO 1997015684 A1 WO1997015684 A1 WO 1997015684A1 FR 9601636 W FR9601636 W FR 9601636W WO 9715684 A1 WO9715684 A1 WO 9715684A1
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substituted
enzyme
amplifier
substances
radicals
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Saïd EL ALAOUI
Loïc BLUM
Robert Henry
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Innogenetics N.V.
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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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    • G01N2474/00—Immunochemical assays or immunoassays characterised by detection mode or means of detection
    • G01N2474/20—Immunohistochemistry assay
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    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/962—Prevention or removal of interfering materials or reactants or other treatment to enhance results, e.g. determining or preventing nonspecific binding

Definitions

  • the field of the present invention is that of analytical chemistry, a field in which we are interested, more particularly, in the identification and determination of chemical species, preferably biological, and in particular of high molecular weight species, such as nucleic acids or even biopolymers of a protein nature, e. g. : enzymes / substrates, antigens / antibodies.
  • chemical species preferably biological, and in particular of high molecular weight species, such as nucleic acids or even biopolymers of a protein nature, e. g. : enzymes / substrates, antigens / antibodies.
  • the present invention relates to: firstly, a system for qualitative and / or quantitative analysis of substances, preferably biological, by amplified chemiluminescence, secondly, an analysis method using this system, and thirdly, an analysis kit comprising said system.
  • the biological substances or species, more particularly but not limited to, targeted by the invention are the RNA and DNA nucleic acids and any genetic structure comprising them, as well as the compounds capable of being involved in immunological reactions antigens (Ag) / antibodies (Ac), as well as the products which are paired together within the framework of an enzyme / substrate, enzyme / inhibitor, receptor / ligand and lectin / sugar enzyme recognition and reaction mechanism.
  • Chemiluminescence and more specifically still called amplified chemistry, is one of the analytical techniques which proceeds from this principle and which is commonly used in the laboratory.
  • Detection by amplified chemiluminescence can find well-known analytical procedures of the “western blot” or “ELISA” type for proteins, or even “southern & northern blot” for RNA and DNA.
  • This amplified chemiluminescence technique constitutes an advantageous and promising alternative compared to conventional immunological analyzes in which radioactive isotopes are used, as a marker and revealer of the pairing considered.
  • Radioanalysis is beginning to be obsolete because it has a large number of drawbacks, including: hazardous handling, short useful shelf life of the radioactive labeled substance, difficulty in radioactive labeling, and treatment of radioactive waste.
  • luminescence can be defined as the emission of light resulting from the restitution of part of the energy emanating from a substance in an excited state.
  • excitation results from a chemical reaction. The latter is triggered following the pairing of a ligand, directly or indirectly, with one or more substances, preferably biological, to be analyzed.
  • This ligand is one of the elements of an analysis system comprising, in addition, a chemiluminescent reagent, a chemiluminescence enzyme or catalytic subunits, a specific substrate for this enzyme or for the catalytic subunit (s) and able to transform under the effect of the latter into at least one excitation initiator for the luminescent reagent, this excitation being accompanied by production of light.
  • One of the most widely used systems in amplified chemiluminescence is that at the heart of which are the chemical reactions of cyclic diacylhydrazide type reagents, such as luminol or isoluminol.
  • the enzymes used are, for example, peroxidases capable of transforming a substrate called an oxidant, such as H 2 O 2 into an oxidation initiator for luminol. Since this oxidation produces too few photons, the excitation of the luminol cannot be detected with significant sensitivity, it is therefore necessary to amplify this oxidation reaction
  • patent EP 0 116 454 discloses a chemiluminescence analysis system, in which the luminescent reaction takes place between a peroxidase, an oxidant and a chemiluminescent reagent formed by luminol: 2,3-dihydro-1, 4- phthalazinedione.
  • the invention protected in this patent relates to the use of an amplifier consisting, in particular, of 4-iodophenol, 4-bromophenol, 4-chlorophenol and other phenol derivatives, such as 4- hydroxycinnamic, 2-naphthol, 6-bromonapht-2-ol, 4-hydroxyphenyl disulfide, among others.
  • new chemiluminescence amplifiers In an attempt to improve this known system, it was subsequently proposed, through the international patent application PCT WO 91/05 872, new chemiluminescence amplifiers.
  • the latter are intended to be used in a system comprising luminol as reagent, peroxidase as enzyme and H 2 O 2 as oxidizing substrate.
  • Said amplification means consist of inactive precursors, chosen from the family of esters of p-halophenols, eg iodophenols.
  • the activation of these enhancer precursors is carried out using an esterase, when all the components of the chemiluminescence system are brought into contact, in order to obtain the production of light, which will serve as a developer of detection.
  • Patent application EP 0 516 948 also discloses chemiluminescence amplifiers for the luminol / H 2 O 2 / peroxidase system, constituted by esters of formula ArOX in which X is a masking group which can be activated under the action of a hydrolitic enzyme and Ar is an aromatic group.
  • these are inactive precursors of amplifiers, capable of being transformed into active products under the effect of an enzyme which may be, for example, an esterase in the case where these preamplifiers are esters.
  • Particularly cited in this application are the disodium phosphoric esters of iodophenol, the acetic esters of diphenol and, finally, the exolydic derivatives of iodophenol and diphenol.
  • the amplification means described in this European patent application does not provide better results than those according to PCT application WO 91/05 872 mentioned above.
  • the amplifier consists of a combination of an organoboron compound and a non-boron organic compound.
  • the non-boron organic amplification compound is a halophenol derivative, of the type of those mentioned above in the other references of the prior art.
  • one of the essential objectives of the present invention is to provide a system for qualitative and / or quantitative analysis of substances, preferably biological, by amplified chemiluminescence, allowing a real and significant improvement in the emission. of light, resulting from the transition to the excited state of a chemiluminescent reagent.
  • Another essential objective of the invention is to provide an amplified chemiluminescence system, of the type of the above, and which is simple to implement and economical.
  • Another essential objective of the invention is to provide a chemiluminescence analysis system of the type of those comprising luminol or the like as a luminescent reagent, a peroxidase as the luminescence enzyme, a peracid or peroxide, such as H 2 O 2 as an oxidizing substrate and, in addition, an amplifier belonging to the family of phenol derivatives, said system having to be perfectly effective at low doses, as to the level of luminescence obtained.
  • Another essential objective of the invention is to provide a method for qualitative and / or quantitative analysis of substances, preferably biological, by chemiluminescence, providing the light emission and sensitivity performances mentioned above.
  • Another essential objective of the invention is to provide a kit for analysis by chemiluminescence applying said system and said method.
  • the present invention relates, first of all, to a system of qualitative and / or quantitative analysis of substances, preferably biological, by amplified chemiluminescence, a system of the type of those involving, essentially: a ) at least one ligand capable of pairing with the substance or substances to be analyzed, b) at least one chemiluminescent reagent belonging to the family of diacylated cyclic hydrazides and fused to an aromatic residue, c) at least one enzyme, d) to at least one oxidizing substrate specific for the enzyme (c) capable of transforming under the effect of the latter into at least one oxidation initiator of the reagent (b) with light production, e) and at least one enhancer the luminescence reaction, characterized:
  • R ° is a linear or branched radical in C, -C ] 0 functionalized or not, R ° being preferably selected from the following radicals: O * _ C "_ R> with RI corresponding: li ia a linear or branched alkyl in C, -C 10 , preferably a methyl, a propyl, a butyl, a pentyl or a hexyl, 2 ⁇ my a C, -C 10 alkylcarboxylic substituent, advantageously alkylmonocarboxylic, the substituents malonyl, succinyl , glutaryl, adipyle, heptanoyloique, maleyl or f ⁇ maryl being particularly preferred monocarboxylic alkyls, 3 ⁇ m alkylamine or aminoalkyl, 4i m aryl, aralkyl or alkylaryl, preferably phenyl, * or a radical of nature (
  • R is a radical chosen from the group comprising halogens, iodine being more particularly selected, linear or branched alkyls containing from 1 to 30 carbon atoms, C j -C 30 aryls or aralkyls or C 1 -C 30 alkylaryls, the halogens, phenyls, phthalates and the following radicals being more particularly retained
  • Y representing -CH 2 -, -O- or -N N- and V representing hydrogen, or Y representing -O-, -S- or -SS- and V representing hydroxyl,
  • A represents hydrogen
  • B represents halogen or alkyl in
  • A represents halogen B represents hydrogen and R represents halogen or phenyl, or A represents hydrogen or halogen and R, B together represent a chain completing a naphthalene ring which, read in the direction of R towards B, is of formula 8
  • the present invention therefore relates to an improved chemiluminescence or chemiluminometric analysis system. It is based on the surprising discovery of specific amplifiers derived from halophenol esters (e.g. iodophenols), which significantly improve the sensitivity of the luminescent reaction considered.
  • halophenol esters e.g. iodophenols
  • the term "improved" means that the total light emission of the luminescent reaction according to the invention and / or the signal / background noise ratio of said reaction are greater than those achieved by the systems known previously. .
  • the chemiluminescent system according to the invention does not comprise hydrolytic enzymes intended to allow the cleavage of bond between oxygen and the radical R ° of the formula ( 1), so as to activate the amplifier.
  • the spirit of the invention is radically opposed to this, since it is sought to obtain a minimum hydrolysis rate which is synonymous with high performance of luminescence amplification.
  • 11 i -OCR non-hydrolysis of the amplifier (e) is preferably greater than or equal to 40% by weight, preferably 60% by weight and, more preferably still, 90% by weight.
  • the present invention therefore proceeds from the advantageous and judicious selection of certain amplifiers derived from phenols and, more especially still, constituted by phenol esters (eg halophenols) with carboxylic acids, in particular mono, di or poly-carboxylic acids, optionally functionalized. , preferably by amino functionalities or alternatively by aromatic residues carrying one or more carboxylic acid functions.
  • phenol esters eg halophenols
  • carboxylic acids in particular mono, di or poly-carboxylic acids, optionally functionalized.
  • aromatic residues carrying one or more carboxylic acid functions preferably by amino functionalities or alternatively by aromatic residues carrying one or more carboxylic acid functions.
  • the amplifier used can be formed of compounds of formula
  • esters of formula (1) in the case where one is dealing with a mixture of esters of formula (1) as amplifier (e), at least one of these esters, preferably comprising a substituent R 1 selected from the radicals (i), (2i) and (3i), as defined above and at least one other of these esters being particularized by a substituent RI selected from the radicals (4i), as defined above .
  • the ligand included in the system according to the invention advantageously consists of at least one of the elements of the following pairs of apparent substances:
  • enzymes can designate various products, such as proteins, hormones, haptens, steroids, metabolites, among others.
  • the luminescent chemical reagent (b) is a product which can be brought into the excited state during a chemiluminescent reaction, for example initiated by the product (OH ! ) Of an enzymatic reaction and which then returns to a non-state excited after emitting or emitting light.
  • this chemiluminescent reagent (b) is preferably a product belonging to the family of 2,3-dihydro-1,4-phthalazine dione (DPD). Even more preferably, this DPD corresponds to the following general formula (2): in which :
  • R 4 represents an amino residue, substituted or not, and each of the radicals R 5 , R 6 and R 7 represents H, a C 1 -C 4 alkyl substituted or not, a C j -C 6 alkenyl, substituted or not , a hydroxyl, a C 6 -C 6 alkoxyl, a carboxyl, substituted or not, or an amino residue, substituted or not, where R 5 represents an amino residue, substituted or not, and each of the radicals R 4 , R 6 and R 7 represents H, C 1 -C 6 alkyl, substituted or unsubstituted, C 1 -C 6 alkenyl, substituted or not, alkenyl, substituted or not, hydroxyl, alkoxyl, carboxyl, substituted or unsubstituted , or an amino residue, substituted or unsubstituted, where R 4 and R 5 are taken together and represent an amino derivative substituted or not by a benzo radical and each of the radicals R 6
  • substituted amino used in the legend of formula (2) above also designates the amido residues.
  • this amino radical can serve as a coupling bridge for (b ) with the ligand, directly or via a spacer compound of the type of those known and suitable, eg hemisuccinates, hemiglutarates, hemimaleates, carboxymethylated derivatives, glucuronyls, mercaptoacetates.
  • the analysis procedure will consist in reacting the chemiluminescent reagent (b) fixed with the other components of the system, so as to reveal the pairing through the chemiluminescence reaction.
  • the fixation of (b) on the ligand represents only one of the possible methodological variants.
  • enzyme denotes both complete proteins and catalytic subunits.
  • the enzyme (c) preferably corresponds to a redox enzyme, such as that defined by the International Union of Biochemistry. This concerns in particular class 1 enzymes or oxidoreductases, from the classification of the International Union of Biochemistry
  • An advantageous example of an oxidoreductase according to the invention is xanthine oxidase.
  • the enzyme (c) is, more preferably still, selected from peroxidases such as horseradish peroxidase, microperoxidase, peroxidase extracted from microorganism Arthromyces ramosus and lactoperoxidase; horseradish peroxidase and microperoxidase being particularly preferred.
  • peroxidases such as horseradish peroxidase, microperoxidase, peroxidase extracted from microorganism Arthromyces ramosus and lactoperoxidase; horseradish peroxidase and microperoxidase being particularly preferred.
  • the enzyme (c) can optionally be coupled to the ligand, directly or indirectly, and thus constitute a marker. According to variants, this enzyme (c) can be in solution or even immobilized on a matrix.
  • the substrate (d) is an oxidant formed preferably by a peracid or a peroxide and, more preferably still, by hydrogen peroxide and / or a perborate d 'alkaline or alkaline earth.
  • the chemiluminescent reagent is 2,3-dihydro-1,4-phthalazine dione (especially luminol or isoluminol)
  • this oxidant is transformed, under the effect of the enzyme (c) into an initiator (OH *) for the oxidation of reagent (b).
  • this oxidant is attached directly or indirectly to the ligand, thus constituting a marker.
  • it can be part of the means for revealing the pairing by chemiluminescence, which are used to react with the marker (s) carried by the ligand.
  • the pH of the analysis medium is alkaline.
  • Alkalinity is favorable to the luminescence reaction and also plays a role with regard to the solubility of the amplifiers of Formula (1) and of the chemiluminescent reagent of Formula (2).
  • the regulation of the pH is therefore advantageously ensured by a regulator constituted by any suitable buffer such as, for example, the tris buffer, the carbonate buffer or the phosphate buffer
  • a regulator constituted by any suitable buffer such as, for example, the tris buffer, the carbonate buffer or the phosphate buffer
  • the ionic strength is also an important parameter of the analysis medium comprising the system according to the invention. It determines, in fact, the stability of the amplifiers (e) of formula (1) with regard to the hydrolysis of the radical OR 0 and, more particularly, of the ester bond. It has been seen above that the lower the hydrolysis rate of the amplifiers (e) in the form of esters, the higher the luminescence performance.
  • halides mentioned above therefore advantageously perform this function of regulating the ionic strength. To this end, they titrate from 0.1 M to saturation, preferably from 0.1 to 3 M.
  • the present invention also relates to a process for qualitative and / or quantitative analysis of substances, preferably biological, by amplified chemiluminescence, characterized in that it comprises the system as defined above.
  • concentrations of components (b) to (e) of the system are as follows: - reagent (b) (eg DPD ): 5 ⁇ mol-200 mmol / 1, peroxidase (c): 0.1 ng to 5 g / l, oxidizing substrate (d): 10 ⁇ mol-30 mmol / 1, amplifier (e): 1 ⁇ mol-100 mmol / l
  • concentrations are given relative to the totality of the analysis medium which advantageously comprises the buffered aqueous solution, and a fortiori regulated, as defined above.
  • reaction in accordance with the preferred embodiment of the invention can be diagrammed as follows: Lum i nol + HO- + Peroxidase 1 "- light + products amplifier amplifier of formula (1)
  • the present invention also relates to a kit for qualitative and / or quantitative analysis of substances, preferably biological, by amplified chemiluminescence, characterized in that it comprises the system as defined above.
  • the system, method and kit according to the invention have immediate and obvious applications in the field of biochemical and biological analysis. They can, indeed, perfectly fit within the framework of immunological, immunoenzymatic, immunohistological, enzymatic and genetic analysis techniques.
  • the disclosure systems can include the ligand / receptor, sugar / lectin, enzyme / substrate, enzyme / inhibitor recognition systems, for example membrane receptors, hormones, neurotransmitters and, generally, transducers of signals
  • Solid supports are used in so-called heterogeneous, heterogeneous, competitive or even heterogeneous analytical procedures on two sites.
  • Liquid media are more suitable for analytical procedures known as homogeneous phases.
  • the system and method according to the invention can also be used to identify and measure, in the biological medium, substances such as peroxidases or endogenous peroxides (H 2 O) These are substances that correspond to one or more of the analysis system components
  • Figure 1 attached shows curves of the intensity of the light emitted (ILE) in arbitrary units (ua) as a function of the quantity of peroxidase enzyme used in attomoles for iodophenol (curve - D - control) and for the iodophenylbutyrate amplifier B of Example 1 (Curve - "- amplifier B)
  • Figure 2 attached shows the kinetics of light emission in the presence of the amplifier (B) through a graph of the light intensity emitted expressed in arbitrary units (ua), as a function of time in hours, in the conditions of Example 16.
  • Figure 3 attached shows the results of the Western-Blot obtained with iodophenylbutyrate [amplifier (B)] compared to the results obtained with the control iodophenol.
  • FIG. 4 appended represents the kinetics of light emission in the presence of the amplifier B of Example 1 [- • - (B)], by comparison with a positive control amplifier iodophenol [- • - control ⁇ ], and with a negative control without amplifier
  • FIG. 5 appended represents the kinetics of light emission in the presence of the amplifier B of example 1 [- • - (B)], by comparison with a positive control amplifier iodophenol [- • - control ⁇ ], and with a negative control without amplifier
  • FIG. 6 appended represents the kinetics of light emission in the presence of amplifier A of Example 1 with ionic force KCI 1 M Graph [- D -] and without ionic force [graph - O -], through light intensity graphs in arbitrary units (na) ⁇ f (t) (t in min), under the conditions of Example 20
  • HRP Horseradish peroxidase type VI
  • luminol 5-amino-2,3- dihydro-1,4-phthalazinedione
  • Tris hydroxymethyl aminomethane
  • hydrogen peroxide 30% potassium chloride and dimethyl sulfoxide (DMSO).
  • the anti-c-met rabbit polyclonal antibody comes from Santa Cruz Biotechnology, USA;
  • the peroxidase-labeled goat anti-rabbit polyclonal antibody comes from CovalAb, LYON, FRANCE.
  • Nitrocellulose membrane Schoell, ECQUEVILLY, FRANCE).
  • Kodak X-OMAT AR X-Ray film (ROCHESTER, NEW YORK, USA).
  • the chemiluminescence reactions were carried out in 4 ml polystyrene tubes and in 4 ml borosilicate glass tubes (Costar Sc. Co, USA). The light emitted was measured using two luminometers, TLX1 monotube (L9990120-2121) (Dynatech Laborotories, France) and Biolumat LB9500 Berthold, France. Materials for polyacrylamide gel electrophoresis and for transfer come from Biorad Laboratories, France.
  • IR infrared
  • N NMR nuclear magnetic resonance
  • Adipic acid (0.66 g, 4.5 mmol), 4-iodo phenol (1 g, 4.5 mmol) and a drop of 98% sulfuric acid are added to 20 ml of toluene.
  • the solution is heated to reflux, the water formed is removed by a Dean-Stark apparatus (24 hours).
  • the majority of the toluene is evaporated, then the remaining solution is poured into 50 ml of a saturated solution of strongly stirred sodium bicarbonate.
  • the aqueous solution is extracted twice with ether, then acidified with 1 M hydrochloric acid to pH 4.
  • the acid solution is extracted with chloroform (2 x 50 ml), the chloroform phases are combined and dried. After evaporation of the solvent, the residue is recrystallized from a benzene-hexane mixture.
  • an IS test solution comprising:
  • a solution S2 is also prepared comprising in addition potassium chloride at the 3M concentration.
  • Table 2 Amplification of the light intensity by the esters of iodo phenol.
  • the amplifier (B) of the invention is unquestionably more efficient than the iodophenol control.
  • the c-met oncogene encodes a heterodimeric protein of 19C Kd in human thyroid papillary carcinomas (B-CPAP) (C. Paulin et Col, Int. J. Oncology, 7; 657-660 (1995)). These cells were used to detect the c-met protein according to the protocol described by C. Paulo, and Col. The following amounts of total cellular protein were used: 50 ⁇ g; 40 ⁇ g; 30 ⁇ g; 20 ⁇ g; 10 ⁇ g; 5 ⁇ g 2.5 ⁇ g and 1 ⁇ g.
  • the membrane is then treated with various reagents under the following conditions: Saturation of non-specific sites on the membrane with 5% skimmed milk in PBS buffer for 30 min. Incubation of the membrane with the anti-c-met rabbit antibody for 1 hr at 37 ° C. Washing in 0.2% PBS-Tween and incubation with peroxidase-labeled anti-rabbit goat polyclonal antibody for 1 hr at 37 ° C.
  • FIG. 3 represents the revelation in Western blot of the protein c-met (145 kDa) in the cell lysate, with the amplifier B and with a control amplifier iodophenol.
  • the chemiluminescent reagent used is identical to that used in Examples 5 to 9.
  • the numbers annotated on the upper longitudinal edge correspond to the quantities of total protein (QPT) contained in the cell lysate deposited in each lane.
  • the QPTs are given in micrograms ( ⁇ g).
  • Row T corresponds to the iodophenol control and row B to the amplifier (e) according to the invention as synthesized in Example 1 and designated by the letter B.
  • EXAMPLE 18 TO 20 COMPARATIVE STUDY OF AMPLIFIED CHEMILUMINESCENCE USING PEROXIDASE LINKED TO ANTI-MOUSE ANTIBODIES FOR DETECTION OF MOUSE IMMUNOGLOBULINS
  • the tube is emptied of its solution and then washed with 500 ⁇ l of 50 mM TRIS-HCl buffer pH 8.5. 100 ⁇ l of peroxidase-labeled anti-mouse antibodies, of the type sold by COVALAB, are introduced into this washed tube which has fixed the mouse immunoglobulins. These 100 ⁇ l of Ac are diluted 1 / 50,000 in the TRIS-HC1 buffer. This tube is then incubated for 1 hour at 37 ° C. Two washes are carried out as indicated above. Finally, 500 ⁇ l of chemiluminescent reagent containing the amplifiers A or B of Example 1 above is introduced into the tube containing the Ag (mouse Ig) / Ac complexes labeled with peroxidase.
  • composition of this chemiluminescent reagent is identical to that of the reagent used in Examples 5 to 9 above.
  • the tube is shaken and a reading is carried out using the Biolumat LB 9500 luminometer. Berthold France.
  • Example 20 Amplifier A with and without ionic strength (Kcl 1M). 2 - RESULTS:
  • Figures 4 and 5 clearly show that the amplifier B causes an increase in light emission at least 3 times greater than that induced by the iodophenol control.
  • Figure 6 shows that amplifier A is more efficient when it is used in a medium with an ionic strength> 1 M KCI.

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Abstract

Le domaine de la présente invention est celui de l'identification et du dosage d'espèces chimiques et/ou biologiques du type enzyme/substrat, enzyme/inhibiteur ou antigène/anticorps. Le problème à la base de l'invention est la fourniture d'un système d'analyse qualitative et/ou quantitative de substances biologiques par chimiluminescence amplifiée, permettant une réelle significative amélioration de l'émission de lumière, résultant du passage à l'état excité d'un réactif chimiluminescent. Ce problème a trouvé sa solution au travers du système selon l'invention, qui fait intervenir un ligand (a) appariable avec les substances à analyser, un réactif chimiluminescent (b) du type luminol, une enzyme (c), un substrat oxydant (d) de l'enzyme (c), et au moins un amplificateur (e), ce système étant caractérisé en ce que l'amplificateur (e) est sélectionné dans la famille des esters d'halogénophénol (iodophénol). L'invention concerne également un procédé d'analyse mettant en oeuvre ce système ainsi qu'un nécessaire d'analyse comprenant ledit système. Application en analytique.

Description

SYSTEME D'ANALYSE QUALITATIVE ET/OU QUANTITATIVE DE SUBSTANCES, DE PREFERENCE BIOLOGIQUES, PAR CHIMILUMINESCENCE AMPLIFIEE, PROCEDE ET NECESSAIRE D'ANALYSE EN FAISANT APPLICATION
DOMAINE TECHNIQUE
Le domaine de la présente invention est celui de la chimie analytique, domaine dans lequel on s'intéresse, plus particulièrement, à l'identification et au dosage d'espèces chimiques, de préférence biologiques, et notamment d'espèces de haut poids moléculaire, telles que les acides nucléiques ou bien encore les biopolymères de nature proteique, e. g. : enzymes/substrats, antigènes/anticorps.
Plus précisément, la présente invention concerne, : de première part, un système d'analyse qualitatives et/ou quantitative de substances, de préférence biologiques, par chimiluminescence amplifiée, de deuxième part, un procédé d'analyse mettant en oeuvre ce système, et de troisième part un nécessaire d'analyse comprenant ledit système.
Les substances ou espèces biologiques, plus particulièrement mais non limitativement, visées par l'invention sont les acides nucléiques ARN et ADN et toute structure génétique en comprenant, ainsi que les composés susceptibles d'être impliqués dans des réactions immunologiques antigènes (Ag)/anticorps (Ac), de même que les produits s'appariant entre eux dans le cadre d'un mécanisme de reconnaissance et de réaction enzymatique enzyme/substrat, enzyme/inhibiteur, récepteur/ligand et lectine/sucre.
ART ANTERIEUR
Pour détecter, identifier ou doser ce genre de molécules ou structures, il est classique d'exploiter leur propriété de bioaffinité, à savoir leur aptitude singulière à s'apparier spécifiquement avec leurs complémentaires, selon des mécanismes d'hybridation génétique, de reconnaissance immunologique ou enzymatique.
La chimiluminescence, et plus spécifiquement encore celle dite amplifiée, est l'une des techniques analytiques qui procède de ce principe et qui est couramment utilisée en laboratoire.
La détection par chimiluminescence amplifiée peut trouver pour cadre les procédures analytiques bien connues de type "western blot" ou de type "ELISA" pour ce qui concerne les protéines, ou bien encore "southern & northern blot" en ce qui concerne l'ARN et l'ADN. Cette technique de chimiluminescence amplifiée constitue une alternative avantageuse et prometteuse par rapport aux analyses immunologiques classiques dans lesquelles on a recours aux isotopes radioactifs, à titre de marqueur et de révélateur de l'appariement considéré. La radioanalyse commence, en effet, à être désuète car elle présente un grand nombre d'inconvénients dont, notamment : manipulation dangereuse, faible durée de conservation utile de la substance marquée radioactivement, difficulté de marquage radioactif, et traitement des déchets radioactifs.
Malheureusement, le développement de ces techniques d'analyse par chimiluminescence amplifiée est freiné, en raison de la sensibilité limitée des systèmes existant actuellement. Cette sensibilité dépend, pour partie, de la lumière émise au cours et à l'issue, de la réaction de luminescence révélatrice des appariements considérés
A ce stade de l'exposé, il paraît utile de fixer les idées en rappelant les principes de la détection par chimiluminescence amplifiée. Tout d'abord, la luminescence peut être définie comme étant l'émission de lumière résultant de la restitution d'une partie de l'énergie émanant d'une substance dans un état excité. Dans la chimiluminescence, l'excitation résulte d'une réaction chimique. Cette dernière est déclenchée suite à l'appariement d'un ligand, directement ou indirectement, avec une ou plusieurs substances, de préférence biologiques, à analyser. Ce ligand est l'un des éléments d'un système d'analyse comprenant, en outre, un réactif chimiluminescent, une enzyme ou sous-unités catalytiques de chimiluminescence, un substrat spécifique de cette enzyme ou de la ou des sous-unités catalytiques et apte à se transformer sous l'effet de celle-ci en au moins un initiateur d'excitation du réactif luminescent, cette excitation s'accompagnant de production de lumière.
L'un des systèmes les plus utilisés en chimiluminescence amplifiée est celui au coeur duquel se trouvent les réactions chimiques de réactifs de type diacylhydrazide cyclique, tels que le luminol ou l'isoluminol. Dans un tel système, les enzymes mises en oeuvre sont, par exemple, des peroxydases aptes à transformer un substrat dénommé oxydant, tel que l'H2O2 en un initiateur d'oxydation du luminol. Etant donné que cette oxydation produit trop peu de photons, l'excitation du luminol ne peut être détectée avec une sensibilité significative, il est donc nécessaire d'amplifier cette réaction d'oxydation
Parmi les amplificateurs connus les plus efficaces, on peut citer ceux appartenant à la famille des halogénophénols et de leurs dérivés. Mais, comme déjà signalé supra, les performances atteintes à l'aide de tels amplificateurs restent notablement insuffisantes, notamment au regard de la quantité de lumière émise après réaction. Il existe plusieurs propositions techniques antérieures qui traitent, vainement, de ce problème.
C'est ainsi que le brevet EP 0 116 454 divulgue un système d'analyse de chimiluminescence, dans lequel la réaction luminescente a lieu entre une peroxydase, un oxydant et un réactif chimiluminescent formé par le luminol : 2,3-dihydro-l,4- phtalazinedione. L'invention protégée dans ce brevet vise la mise en oeuvre d'un amplificateur constitué, notamment, par du 4-iodophénol, du 4-bromophénol, du 4- chlorophénol et d'autres dérivés des phénols, tels que l'acide 4-hydroxycinnamique, le 2- naphtol, le 6-bromonapht-2-ol, le disulfure de 4-hydroxyphényle, entre autres. Ces amplificateurs permettent une amélioration de l'émission de la lumière et, plus particulièrement, du rapport signal bruit de fond. Mais, le meilleur rapport signal/bruit à l'aide de ces amplificateurs reste insuffisant au regard de la sensibilité de la méthode. Cela impose d'augmenter les volumes d'amplificateurs mis en oeuvre pour obtenir une sensibilité suffisante. Il s'ensuit d'éventuelles perturbations de la réaction et une augmentation indéniable du coût de l'analyse.
Pour tenter de perfectionner ce système connu, il a été ultérieurement proposé, au travers de la demande de brevet internationale PCT WO 91/05 872, de nouveaux amplificateurs de chimiluminescence. Ces derniers sont destinés à être mis en oeuvre dans un système comprenant du luminol comme réactif, une peroxydase comme enzyme et l'H2O2 comme substrat oxydant. Lesdits moyens d'amplification sont constitués par des précurseurs inactifs, choisis dans la famille des esters de p- halogénophénols, e. g. iodophénols. L'activation des ces précurseurs d'amplificateurs est réalisée à l'aide d'une estérase, lors de la mise en présence de toutes les composantes du système de chimiluminescence, en vue d'obtenir la production de lumière, qui servira de révélateur de détection. D'après les inventeurs cités dans cette demande PCT, le couplage, ainsi réalisé, d'une enzyme de chimiluminescence et d'une enzyme d'activation de l'amplificateur, est à l'origine d'un phénomène d'amplification, de nature à améliorer la sensibilité d'analyse. Mais, là encore, les améliorations obtenues restent insuffisantes.
La demande de brevet EP 0 516 948 divulgue, également, des amplificateurs de chimiluminescence pour système luminol/H2O2/peroxydase, constitués par des esters de formule ArOX dans laquelle X est un groupement de masquage activable sous l'action d'une enzyme hydrolitique et Ar est un groupement aromatique. Il s'agit là encore de précurseurs inactifs d'amplificateurs, aptes à être transformés en produits actifs sous l'effet d'une enzyme qui peut être, par exemple, une estérase dans le cas où ces pré¬ amplificateurs sont des esters. Sont notamment cités dans cette demande les esters phosphoriques disodiques de l'iodophénol, les esters acétiques de diphénol et, enfin, les dérivés exolydiques d'iodophénol et de diphénol. Les moyens d'amplification décrits dans cette demande de brevet européen n'apportent pas de meilleurs résultats que ceux selon la demande PCT WO 91/05 872 évoquée ci-dessus.
La référence antérieure "Analytical Letters, 27(6), 1 109-1 122, (1994)" de H. HORI et al. décrit, elle aussi, de nouveaux amplificateurs phénoliques de chimiluminescence dans le cadre de leur réaction luminol/H2O2/peroxydase. Ces nouveaux amplificateurs sont des 4-hydroxybenzylidène-cyclopentènediones, d'une part, et des 4-hydroxybenzylidène-malononitriles, d'autre part.
Les améliorations d'émission de lumière obtenues avec ces amplificateurs restent inférieures à celles constatées pour le p-iodophénol décrit auparavant. Par ailleurs, l'étude relatée dans cet article est révélatrice d'un changement de tendance dans le cadre du développement de nouveaux amplificateurs. En effet, les travaux sur les esters inactifs dérivant d'halogénophénols ne sont plus de mise.
Enfin, la demande de brevet internationale PCT WO 94/23 060 vise un procédé d'amplification de réaction de chimiluminescence faisant intervenir du luminol, une peroxydase, un substrat oxydant (= H2O2) et un amplificateur destiné à accroître le ratio signal/bruit d'émissions lumineuses. L'amplificateur est constitué par une combinaison d'un composé organoboré et d'un composé organique non bore. Le composé organoboré répond à la formule ArB(OR)2 dans laquelle Ar = groupement aromatique substitué ou non. Le composé organique non bore d'amplification est un dérivé d'halogénophénol, du type de ceux mentionnés ci-dessus dans les autres références de l'art antérieur. Une nouvelle fois, l'amélioration du ratio signal/bruit, obtenue grâce à l'invention décrite dans cette demande WO 94/23 060, n'est pas significativement intéressante.
EXPOSE SUCCINCT DE L'INVENTION
Dans cet état de connaissances, l'un des objectifs essentiels de la présente invention est de fournir un système d'analyse qualitative et/ou quantitative de substances, de préférence biologiques, par chimiluminescence amplifiée, permettant une réelle et significative amélioration de l'émission de lumière, résultant du passage à l'état excité d'un réactif chimiluminescent.
Un autre objectif essentiel de l'invention est de fournir un système de chimiluminescence amplifié, du type de celui ci-dessus, et qui soit simple à mettre en oeuvre et économique.
Un autre objectif essentiel de l'invention est de fournir un système d'analyse par chimiluminescence du type de ceux comprenant du luminol ou analogues à titre de réactif luminescent, une peroxydase à titre d'enzyme de luminescence, un peracide ou peroxyde, tel que H2O2 à titre de substrat oxydant et, en outre, un amplificateur appartenant à la famille des dérivés de phénol, ledit système se devant d'être parfaitement efficace à faible dose, quant au niveau de luminescence obtenu.
Un autre objectif essentiel de l'invention est de fournir un procédé d'analyse qualitative et/ou quantitative de substances, de préférence biologiques, par chimiluminescence, procurant les performances d'émission de lumière et de sensibilité évoquées ci-dessus.
Un autre objectif essentiel de l'invention est de fournir un nécessaire d'analyse par chimiluminescence faisant application dudit système et dudit procédé.
Lors de la quête de ces objectifs, la demanderesse a eu le mérite de mettre en évidence, après de nombreuses recherches et expériences et de manière tout à fait surprenante et inattendue, qu'il convient de sélectionner l'amplificateur dans la sous- famille des esters dérivés de phénol, lesdits esters se singularisant par leur caractère peu hydrolysable.
D'où il s'ensuit que la présente invention concerne, tout d'abord, un système d'analyse qualitative et/ou quantitative de substances, de préférence biologiques, par chimiluminescence amplifiée, système du type de ceux faisant intervenir, essentiellement : a) au moins un ligand apte à s'apparier avec la ou les substances à analyser, b) au moins un réactif chimiluminescent appartenant à la famille des hydrazides cycliques diacylées et fusionnées à un reste aromatique, c) au moins une enzyme, d) au moins un substrat oxydant spécifique de l'enzyme (c) apte à se transformer sous l'effet de celle-ci en au moins un initiateur d'oxydation du réactif (b) avec production de lumière, e) et au moins un amplificateur de la réaction de luminescence, caractérisé :
• en ce que l'amplificateur (e) répond à la formule générale suivante :
ORυ
(D
B
R dans laquelle :
- R° est un radical linéaire ou ramifié en C,-C]0 fonctionnalisé ou non, R° étant, de préférence, sélectionné parmi les radicaux suivants : O * _ C" _ R > avec RI correspondant : li i a un alkyle linéaire ou ramifie en C,-C10, avantageusement un méthyle, un propyle, un butyle, un pentyle ou un hexyle , 2ι m a un substituant alkylcarboxylique en C,-C10, avantageusement alkylmonocarboxylique, les substituants malonyle, succinyle, glutaryle, adipyle, heptanoyloique, maléyle ou fùmaryle étant des alkyls monocarboxyhques particulièrement préférés , 3ι m alkylamine ou aminoalkyle , 4i m aryle, aralkyle ou alkylaryle, de préférence phényle , * ou un radical de nature (poly)organosιloxanique et/ou
(poly)organosιloxanique , R est un radical choisi dans le groupe comprenant les halogènes, l'iode étant plus particulerement sélectionne, les alkyles linéaires ou ramifiés contenant de 1 à 30 atomes de carbone, les aryles en Cj-C30 ou les aralkyles ou alkylaryles en C,-C30 , les halogènes, les phényles, les phtalates et les radicaux suivants étant plus spécialement retenus
Figure imgf000008_0001
Y représentant -CH2-, -O- ou -N=N- et V représentant l'hydrogène, ou bien Y représentant -O-, -S- ou -S-S- et V représentant hydroxyle ,
W W représentant hydrogène ou carboxyle ,
-CH=CH-Z, Z re -présCentanWt carboxyle3 ou 2,4-dιnιtrophenyle
CH2CH2COOC2H2 , ou un alkyle en C,-C6 ,
A représente l'hydrogène, B représente un halogène ou un alkyle en
C,-C6 et R représente un halogène ,
A représente l'halogène B représente l'hydrogène et R représente un halogène ou un phényle, ou bien A représente l'hydrogène ou un halogène et R, B représentent ensemble une chaîne complétant un noyau naphtalene qui, lue dans la direction de R vers B, est de formule 8
(2) — CH=C-CH=CH — i X
X représentant l'hydrogène ou un halogène, de façon que le composé de formul le :
Figure imgf000009_0001
- R°, R, A, B étant substitués ou non ;
• et en ce qu'il est exempt d'enzyme hydrolytique apte à lyser la liaison entre l'oxygène et R° dans -OR0.
Sous son aspect le plus général, la présente invention vise donc un système d'analyse chimiluminescence ou chimiluminométrique perfectionné. Elle est basée sur la découverte étonnante, d'amplificateurs particuliers dérivés des esters d'halogénophénols (e.g. iodophénols), qui améliorent de façon significative, la sensibilité de la réaction luminescente considérée.
Au sens du présent exposé, le terme "amélioré" signifie que l'émission lumineuse totale de la réaction luminescente conforme à l'invention et/ou le rapport signal/bruit de fond de ladite réaction sont supérieurs à ceux atteints par les systèmes connus antérieurement.
De plus, contrairement à ce que préconise certains enseignements de l'an antérieur, le système chimiluminescent selon l'invention ne comprend pas d'enzymes hydrolytiques destinées à permettre le clivage de liaison entre l'oxygène et le radical R° de la formule (1), de manière à rendre actif l'amplificateur. Du reste, l'esprit de l'invention est radicalement opposé à cela, puisque l'on cherche à obtenir un taux d'hydrolyse minima qui est synonyme de haute performance d'amplification de la luminescence.
EXPOSE DETAILLE DE L'INVENTION
Suivant une caractéristique préférée de l'invention
O
. 1
R° = -C-R" dans la formule (1) de l'amplificateur (e). Dans ce cas. le taux d'ester O
11 i -O-C-R non hydrolyse de l'amplificateur (e) est préférablement supérieur ou égal à 40 % en poids, de préférence à 60 % en poids et, plus préférentiellement encore, à 90 % en poids.
La présente invention procède donc de la sélection avantageuse et judicieuse de certains amplificateurs dérivés des phénols et, plus spécialement encore, constitués par des esters de phénol (halogénophénols e. g.) avec des acides carboxyliques, en particulier mono, di ou poly-carboxyliques, éventuellement fonctionnalisés, de préférence par des fonctionnalités aminés ou bien encore par des restes aromatiques porteurs d'une ou plusieurs fonctions acides carboxyliques.
L'amplificateur (e) mis en oeuvre peut être formé de composés de formule
(1) de même nature ou, avantageusement, peut comprendre un mélange d'au moins un composé de formule (1), de préférence les esters, dans lesquels :
O
" i R° = "C-R1
Suivant une variante intéressante de l'invention, dans le cas où l'on a affaire à un mélange d'esters de formule (1) à titre d'amplificateur (e), au moins l'un de ces esters, comportant de préférence un substituant R1 sélectionné parmi les radicaux (i), (2i) et (3i), tels que définis supra et au moins un autre de ces esters étant particularisé par un substituant RI sélectionné parmi les radicaux (4i), tels que définis supra.
S'agissant du ligand compris dans le système conforme à l'invention, il est avantageusement constitué par au moins l'un des éléments des couples de substances appariables suivants :
• antigène/anticorps.
• enzyme/substrat, enzyme/inhibiteur,
• récepteur/ligand
• lectine/sucre
• acide nucléique/acide nucléique complémentaire,
Ces termes d'enzymes, substrats, antigènes et anticorps peuvent désigner divers produits, tels que des protéines, des hormones, des haptènes, des stéroïdes, des métabolites, entre autres.
Le réactif chimique luminescent (b) est un produit qui peut être amené à l'état excité au cours d'une réaction chimiluminescente, par exemple initiée par le produit (OH ! ) d'une réaction enzymatique et qui retourne ensuite à un état non excité après avoir émis ou en émettant de la lumière. Dans le cadre de l'invention, ce réactif chimiluminescent (b) est, de préférence, un produit appartenant à la famille des 2,3-dihydro-l,4-phtalazine dione (DPD). Plus préférentiellement encore, cette DPD répond à la formule générale (2) suivante :
Figure imgf000011_0001
dans laquelle :
R4 représente un reste aminé, substitué ou non, et chacun des radicaux R5, R6 et R7 représente H, un alkyle en C^-C^ substitué ou non, un alcényle en Cj-C6, substitué ou non, un hydroxyle, un alcoxyle en C,-C6, un carboxyle, substitué ou non, ou un reste aminé, substitué ou non, où R5 représente un reste aminé, substitué ou non, et chacun des radicaux R4, R6 et R7 représente H, un alkyle en C,-C6, substitué ou non un alcényle en C,-C6, substitué ou non, un alcényle, substitué ou non, un hydroxyle, un alcoxyle, un carboxyle, substitué ou non, ou un reste aminé, substitué ou non, où R4 et R5 sont pris ensemble et représentent un dérivé amino-substitué ou non par un radical benzo et chacun des radicaux R6 et R7 représente H, alkyle en CrC6, substitué ou non, un alcényle en C,-C6, substitué ou non, un alcényle, substitué ou non, un hydroxyle, un alcoxyle, un carboxyle, substitué ou non, ou un reste aminé, substitué ou non, le luminol et l'isoluminol étant particulièrement préférés.
Au sens de la présente invention, le terme "aminosubstitué" employé dans la légende de la formule (2) ci-dessus désigne, également, les restes amido.
Dans le cas où l'on est en présence du réactif (b) préféré, à savoir le luminol R4, R5, R6 = H et R7 = NH2, ce radical amino peut servir de pont de couplage de (b) avec le ligand, de manière directe ou par l'intermédiaire d'un composé d'espacement du type de ceux connus et appropriés, e. g. hémisuccinates, hémiglutarates, hémimaléates, dérivés carboxyméthylés, glucuronyles, mercaptoacétates. Ainsi, après appartement direct ou indirect du ligand couplé à (b), avec l'espèce à analyser, la procédure d'analyse consistera à faire réagir le réactif chimiluminescent (b) fixé avec les autres composantes du système, de façon à révéler l'appariement au travers de la réaction de chimiluminescence. La fixation de (b) sur le ligand ne représente que l'une des variantes méthodologiques envisageables.
Au sens de l'invention, le terme enzyme désigne aussi bien des protéines complètes que des sous-unités catalytiques.
L'enzyme (c) correspond, de préférence à une enzyme d'oxydoréduction, comme celle définie par l'International Union of Biochemistry. Cela concerne notamment les enzymes de la classe 1 ou oxydoréductases, de la classification de l'International Union of Biochemistry Un exemple avantageux d'oxydoréductase conforme à l'invention est la xanthine oxydase.
L'enzyme (c) est, plus préférentiellement encore, sélectionnée parmi les peroxydases telles que la peroxydase de raifort, la microperoxydase, la peroxydase extraite de microorganisme Arthromyces ramosus et la lactoperoxydase ; la peroxydase de raifort et la microperoxydase étant particulièrement préférées.
Tout comme le réactif chimiluminescent (b), l'enzyme (c) peut, éventuellement, être couplée au ligand, directement ou indirectement, et constituer ainsi un marqueur. Selon des variantes, cette enzyme (c) peut se trouver en solution ou bien encore immobilisée sur une matrice.
Dans le mode préféré de mise en oeuvre de l'invention, le substrat (d) est un oxydant formé, de préférence, par un peracide ou un peroxyde et, plus préférentiellement encore, par le peroxyde d'hydrogène et/ou un perborate d'alcalin ou d'alcalinoterreux.
En réalité, dans le cas où le réactif chimiluminescent est le 2,3-dihydro-l,4- phtalazine dione (spécialement le luminol ou l'isoluminol), cet oxydant est transformé, sous l'effet de l'enzyme (c) en un initiateur (OH*) d'oxydation du réactif (b). Tout comme précédemment, il est envisageable que cet oxydant soit fixé directement ou indirectement au ligand, constituant ainsi un marqueur. Selon une alternative, il peut faire partie des moyens de révélation de l'appariement par chimiluminescence, qui sont mis en oeuvre pour réagir avec le ou les marqueur(s) portés par le ligand.
S'agissant précisément de la localisation des composantes du système selon l'invention, il ressort de ce qui précède qu'il est avantageux qu'au moins l'une, et au plus trois, de ses composantes (b) à (e) est liée (ou portée par) le ligand (a), l'autre ou les autres composantes étant comprises dans le milieu d'analyse.
Quels que soient le ou les marqueurs du ligand, il est préférable, conformément à l'invention, que, lors du déroulement de l'analyse chimiluminescente, le système considéré soit associé à une solution comportant au moins un régulateur de pH et/ou au moins un régulateur de la force ionique choisi parmi les sels, de préférence les halogenures (avantageusement chlorures) de métaux alcalins et/ou alcalino terreux, KCI, KBr, NaCl, CaCl2, CsCl étant particulièrement préférés
Il s'est avéré, en effet, utile que le pH du milieu d'analyse soit alcalin L'alcalinité est favorable à la réaction de luminescence et joue également un rôle en ce qui concerne la solubilité des amplificateurs de Formule (1) et du réactif chimiluminescent de Formule (2).
La régulation du pH est donc, avantageusement, assurée par un régulateur constitué par tout tampon approprié comme, par exemple, le tampon tris, le tampon carbonate ou le tampon phosphate La force ionique est également un paramètre important du milieu d'analyse comprenant le système selon l'invention. Elle détermine, en effet, la stabilité des amplificateurs (e) de formule (1) au regard de l'hydrolyse du radical OR0 et, plus particulièrement, de la liaison ester. Il a été vu, ci-avant, qu'au plus le taux d'hydrolyse des amplificateurs (e) sous forme d'esters est faible, au plus les performances de luminescence sont importantes.
Les halogenures mentionnées ci-dessus assurent donc, avantageusement, cette fonction de régulation de la force ionique. A cette fin, ils titrent, de 0,1 M à saturation, de préférence de 0, 1 à 3 M.
Il existe, bien sûr, d'autres facteurs secondaires que le pH et la force ionique, qui sont importants pour le bon déroulement de la réaction chimiluminescente. On citera, entre autres, la température, la concentration des composants du système (b) à (e), la vitesse de mélange et la technique de mesure de la lumière.
Ce sont là des caractéristiques de procédé et d'analyse qui s'insèrent parfaitement dans le cadre du présent exposé, puisque, on le rappellera, la présente invention a également pour objet un procédé d'analyse qualitative et/ou quantitative de substances, de préférence biologiques, par chimiluminescence amplifiée, caractérisé en ce qu'il comprend le système tel que défini supra.
De façon générale, les conditions de mise en oeuvre de ce procédé, et donc du système sus-évoqué, correspondent à celles mises en oeuvre antérieurement, notamment dans les procédés décrits dans le brevet EP 0 1 16 454 et dans la demande PCT WO 94/23 060. On intégre donc, par référence, les parties correspondantes de ces documents dans le présent exposé. Pour mémoire, on peut rappeler que la température d'analyse est, avantageusement, comprise entre 10 et 50 °C et que les concentrations en composantes (b) à (e) du système sont les suivantes : - réactif (b) (e. g. DPD) : 5 μmole-200 mmole/1, peroxydase (c) : 0, 1 ng à 5 g/l, substrat oxydant (d) : 10 μmole-30 mmole/1, amplificateur (e) : 1 μmole-100 mmole/l
Ces concentrations sont données par rapport à la totalité du milieu d'analyse qui comprend, avantageusement, la solution aqueuse tamponnée, et a fortiori régulée, telle que définie ci-dessus.
Il est important de noter que l'efficacité exceptionnelle des amplificateurs (e) conformes à l'invention, permet d'envisager des réductions de concentration d'enzyme. Il est en effet possible de se contenter de concentrations comprises entre 0, 1 ng et 1 μg/1. Cela représente des économies en consommables non négligeables.
La réaction conforme au mode préféré de mise en oeuvre de l'invention peut être schématisée comme suit : Luminol + H-O- + Peroxydase 1»- lumière + produits
Figure imgf000014_0001
dation amplificateur (e) de formule (1)
APPLICATION INDUSTRIELLE
Sous un autre de ses aspects avantageux, la présente invention vise, également, un nécessaire d'analyse qualitative et/ou quantitative de substances, de préférence biologiques, par chimiluminescence amplifiée, caractérisé en ce qu'il comprend le système tel que défini supra.
Le système, le procédé et le nécessaire selon l'invention ont des applications immédiates et évidentes dans le domaine de l'analyse biochimique et biologique. Ils peuvent, en effet, parfaitement s'inscrire dans le cadre de techniques d'analyses immunologiques, immunoenzymatiques, immunohistologiques, enzymatiques et génétiques.
Il est important de noter que les systèmes de révélation peuvent inclure les systèmes de reconnaissance de type ligand/récepteur, sucre/lectine, enzyme/substrat, enzyme/inhibiteur, par exemple récepteurs membranaires, hormones, neurotransmetteurs et, de façon générale, les transducteurs de signaux
Il peut s'agir, par exemple, de techniques "ELISA", de type compétitif ou non, de type sandwich, de type "Western, Northern & Southern blot", ou bien encore de type immunohistologique (anticorps/antigène marqué ou sonde nucléique)
C'est ainsi que les substances à analyser peuvent être comprises •
• sur ou dans des supports solides choisis, de préférence, dans la liste ci- après :
- plaque de microtitration entières ou sécables,
- tube à essai en polymère synthétique ou en verre,
- polymères biologiques,
- lames d'immunohistologie,
- membranes,
- billes, etc.
• ou dans des supports liquides de type solution, émulsion ou dispersion, formant une partie du milieu d'analyse
Les supports solides sont mis en oeuvre dans des procédure., analytiques dites hétérogènes, hétérogènes compétitives ou bien encore hétérogènes sur deux sites Les milieux liquides sont plus adaptés à des procédures analytiques dites phases homogènes.
Le système et le procédé selon l'invention peuvent également être utilisés pour identifier et doser, dans le milieu biologique des substances telles que les peroxydases ou les peroxydes endogènes (H2O:) Ce sont là des substances qui correspondent à un ou plusieurs des constituants du système d'analyse
Les exemples qui suivent permettront de mieux comprendre l'invention et de faire ressortir tous ses avantages et variantes de mise en oeuvre
EXEMPLES
/ - DESCRIPTION DES FIGURES
La figure 1 annexée, montre des courbes de l'intensité de la lumière émise (ILE) en unités arbitraires (u a) en fonction de la quantité d'enzyme peroxydase mise en oeuvre en attomoles pour l'iodophénol (courbe — D — témoin) et pour l'iodophénylbutyrate amplificateur B de l'exemple 1 (Courbe — " — amplificateur B)
La figure 2 annexée représente la cinétique d'émission de lumière en présence de l'amplificateur (B) au travers d'un graphe de l'intensité lumineuse émise exprimée en unités arbitraires (u.a ), en fonction du temps en heures, dans les conditions de l'exemple 16.
La figure 3 annexée présente les résultats du Western-Blot obtenus avec l'iodophénylbutyrate [amplificateur (B)] comparé aux résultats obtenus avec le témoin iodophenol.
La figure 4 annexée représente la cinétique d'émission de lumière en présence de l'amplificateur B de l'exemple 1 [ — • — (B)], par comparaison avec un témoin positif amplificateur iodophenol [ — • — témoin Θ], et avec un témoin négatif sans amplificateur
[ — O — témoin Q], au travers de graphes intensité lumineuse en unités arbitraires (n a)
= f(t) (t en min), dans les conditions de l'exemple 18
La figure 5 annexée représente la cinétique d'émission de lumière en présence de l'amplificateur B de l'exemple 1 [ — • — (B)], par comparaison avec un témoin positif amplificateur iodophenol [ — • — témoin Θ], et avec un témoin négatif sans amplificateur
[ — O — témoin Q], au travers de graphes intensité lumineuse en unités arbitraires (n a)
= f^t) (t en min), dans les conditions de l'exemple 19
La figure 6 annexée représente la cinétique d'émission de lumière en présence de l'amplificateur A de l'exemple 1 avec force ionique KCI 1 M Graphe [ — D — ] et sans force ionique [graphe — O — ], au travers des graphes intensité lumineuse en unités arbitraires (n a) ≈ f(t) (t en min), dans les conditions de l'exemple 20
// - MA TERIELS ET METHODES
Réactifs
Tous les produits suivants proviennent de chez Sigma Chimie, France Peroxydase de Raifort (HRP Horseradish peroxydase) type VI, luminol (5-amino-2,3- dihydro-l,4-phthalazinedione), Tris(hydroxymethyl)aminométhane, peroxyde d'hydro¬ gène 30 %, Chlorure de potassium et dimethylsulfoxyde (DMSO).
Tous les produits utilisés pour les synthèses chimiques proviennent d'Aldrich, France.
L'anticorps polyclonal de lapin anti c-met provient de Santa Cruz Biotechnology, USA ; L'anticorps polyclonal de chèvre anti lapin marqué à la peroxydase provient de CovalAb, LYON, FRANCE. Membrane de nitrocellulose (Schleicher et Schuell, ECQUEVILLY, FRANCE). Film Kodak X-OMAT AR X-Ray (ROCHESTER, NEW YORK, USA). Equipement d'analyse
Les réactions de chimiluminescence ont été réalisées dans des tubes en polystyrène de 4 ml et dans des tubes en verre (borosilicate glass) de 4 ml (Costar Sc. Co, USA). La lumière émise a été mesurée en utilisant deux luminomètres , TLX1 monotube (L9990120-2121) (Dynatech Laborotories, France) et Biolumat LB9500 Berthold, France. Matériels pour l'électrophorèse en gel de polyacrylamide et pour le transfert proviennent de Biorad Laboratories, France.
Les spectres infra-rouge (IR) ont été tracés sur un spectomètre Perkin Elmer model 1310 et exprimés en cm-1.
Les spectres de résonance magnétique nucléaire (RMN Η) ont été tracés sur un spectromètre Bruker AC200, les déplacements chimiques sont indiqués en ppm par rapport au tétraméthylsilane comme référence interne.
Les séparations par chromatographie liquide sont réalisées sur colone de silice Merk Kieselgel 60 (70-230 mesh ASTM).
/// - SYNTHESE ET HYDROLYSE D'AMPLIFICATEURS (e) SELON L'INVENTION (Esters du 4-iodophénol)
EXEMPLE 1 : SYNTHESE DU 4-IODOPHENYLACETATE (AMPLIFICATEUR A) ET DU 4- IODOPHENYLBUTYRATE (AMPLIFICATEUR B)
A une solution de 1 g de 4-iodophénol (4,5 mmole) dans 10 ml de pyridine maintenue à 0 °C, on additionne, goutte à goutte, 6,5 mmoles (1,5 eq) du chlorure d'acide correspondant. Après 3 heures à température ambiante, la solution est versée dans 100 ml d'une solution 0,5 M d'acide chlorhydrique. Après extraction à l'éther éthylique (2 x 50 ml), la phase organique est lavée à l'eau, puis par une solution de bicarbonate de sodium, et enfin à l'eau. Après séchage sur sulfate de magnésium, le solvant est évaporé et le résidu purifié par chromatographie sur Silice, éluant éther éthylique-pentane 5-95. Rendement : 75 à 90 %. -4-IODOPHENYLACETATE : PF = 27° C IR (film) : 1755 cm-'
RMN (CDC13) : 2,28, s, 3 H ; 6,86, m, 2H ; 7,68, m, 2H.
-4-IODOPHENYLBUTYRATE : PF = 34° C.
IR (film) : 1755 cm-'.
RMN (CDC13) : 1,03, t, 3 H, 1,76, sex, 2 H ; 2,52, t, 2H ; 6,85, m, 2 H ; 7,67, m, 2H.
EXEMPLE 2 : SYNTHÈSE DE L'ACIDE SUCCINIQUE MONO (4-IODOPHENYL) ESTER (AMPLIFICATEUR C)
En atmosphère d'azote, sous agitation on additionne 0,10 g de sodium (4,5 mmoles) à une solution de 1 g de 4-iodophénol (4,5 mmoles) dans 25 ml d'éther anhydre. Lorsque le sodium a disparu, on ajoute 0,5 g (4,5 mmoles) d'anhydride succinique en solution dans le benzène. Le mélange est agité 24 heures à température ambiante. Le sel de sodium gélatineux est filtré, lavé à l'éther anhydre, puis mis en solution dans l'eau. Après acidification avec de l'acide chlorhydrique 0,5 M, l'acide-ester est extrait à l'éther, la solution est séchée. Après acidification avec de l'acide chlorydrique 0,5 M, l'acide ester est extrait à l'éther, la solution est séchée. Après évaporation du solvant, le résidu est recristallisé dans un mélange Hexane-Benzène. Masse obtenue : 0,4 g. PF = 145 °C.
IR (CC14) : 1745, 1 705 cm-' RMN (CDC13) : 2,6 à 2,9, m, 4 H ; 7,0, m, 2 H ; 7,68, m, 2 H.
EXEMPLE 3 : SYNTHESE DE L'ACIDE ADIPIQUE MONO (4-lODOPHENYL) ESTER (AMPLIFICATEUR D)
Acide adipique (0,66 g, 4,5 mmoles), 4-iodo phénol (1 g, 4,5 mmoles) et une goutte d'acide sulfurique 98 % sont ajoutés à 20 ml de toluène. La solution est chauffée à reflux, l'eau formée est éliminée par un appareil de Dean-Stark (24 heures). La majorité du toluène est évaporée, puis la solution restante est versée dans 50 ml d'une solution saturée de bicarbonate de sodium fortement agitée. La solution aqueuse est extraite deux fois à l'éther, puis acidifiée avec de l'acide chlorhydrique 1 M jusqu'à pH 4. La solution acide est extraite au chloroforme (2 x 50 ml), les phases chloroformiques sont réunies et séchées. Après évaporation du solvant, le résidu est recristallisé dans un mélange benzène-hexane. Masse obtenue : 0,37 g. PF = 89 °C.
IR (CC14) : 1 745-1 705 cm-'. RMN (CDCI3) : 1,6 à 1.8, m, 4H ; 2,43, t, 2H ; 2,58, t, 2H ; 7,06, m, 2 H ; 7,67, m, 2H. EXEMPLE 4 : HYDROLYSE DES 4-IODOPHENYLESTERS (A) ET (B) DANS UNE SOLUTION TAMPON DE PH = 8,6
4.1 MODE OPÉRATOIRE :
On prépare tout d'abord une solution SI de test comprenant :
• tampon TRIS : 0, 1 M - pH : 8,6 ;
• luminol : 1,2 mM,
On prépare également une solution S2 comprenant en plus du chlorure de potassium à la concentration 3M. MODE OPÉRATOIRE :
Ces solutions S, et S2 sont mélangées avec des amplificateurs (e) A et B de l'exemple 1, à plusieurs concentrations (Conc) et stockées à 4° C plusieurs jours avant analyse.
On détermine ensuite par chromatographie Phase gazeuse (CPV) les proportions d'iodophénol et d'ester. Ce dosage phénol/ester est effectué comme indiqué ci-après :
10 ml de solution, 1 ml de solution de thymol dans le méthanol de concentration 1 mg/ml, 50 ml d'éther éthylique sont agités ; 50 g de sulfate de sodium sont ajoutés. La phase éthérée est soutirée, le solide est rincé avec 50 ml d'éther ; les phases éthérées sont réunies, puis concentrées à environ 2 ml. 0,5 μl sont injectés en CPV.
4.2 RESULTATS :
Les résultats d'analyse sont donnés dans ie Tableau 1 ci-après
TABLEAU 1
Figure imgf000018_0001
Il apparaît, qu'en milieu basique, l'(ou les) halogenures de S2 ainsi que les nitrates alcalins ralentissent la vitesse d'hydrolyse des esters.
///- CHIMILUMINESCENCE
EXEMPLES 5 A 9 : REACTION DE CHIMILUMINESCENCE AMPLIFIEE PAR LES ESTERS D'IODOPHENOL
Dans 100 ml de tampon Tris 0,1 M pH 8,6 sont ajoutés 0,112 mmoles de luminol et 0,068 mmoles de témoin iodophenol (exemple 5) et de différents amplificateurs (e) (A, B, C, D des exemples 1 à 3) = exemples 6 à 9. La solution est préparée plusieurs heures avant son utilisation et stockée à 4° C. A 0,9 ml de cette solution, sont ajoutés 10 μl de H2O2 à 20 mM. Une première mesure de l'émission de la lumière est effectuée et correspond au bruit de fond. Dans ce même tube 50 μl de peroxydase à IO-9 g/ml sont ajoutées puis l'émission de la lumière a été mesurée. Les résultats de ces essais sont présentés dans le tableau 2 ci-après.
Tableau 2 : Amplification de l'intensité lumineuse par les esters de l'iodo phénol.
Figure imgf000019_0001
Légende : u.a. = unités arbitraires EXEMPLES 10 A 14 : EFFET DE LA FORCE IONIQUE SUR L'AMPLIFICATION DE LA REACTION DE CHIMILUMINESCENCE
Les procédures des exemples 5 à 9 sont répétées en présence de chlorure de potassium 2M. Les résultats de ces essais sont présentés dans le tableau 3 ci-après. Tableau 3 : Effet de l'augmentation de la force ionique sur l'amplification de la réaction chimiluminescente
Figure imgf000020_0001
EXEMPLE 15 : ETUDE COMPARATIVE DE LA REACTION DE CHIMILUMINESCENCE AMPLIFIEE UTILISANT LA PEROXYDASE A DIFFERENTES CONCENTRATIONS
Les procédures des exemples 5 à 8 sont répétées mais seulement avec l'iodophénol et l'iodophénylbutyrate B. La concentration de la peroxydase a été diminuée et utilisée de 50 à 500 attomoles (10-'8 moles). Les résultats de ces essais sont présentés dans la figure 1 annexée.
On constate que l'amplificateur (B) de l'invention, est incontestablement plus performant que le témoin iodophenol.
EXEMPLE 16 : ÉTUDE CINÉTIQUE DE LA REACTION DE CHIMILUMINESCENCE AMPLIFIEE.
Les procédures des exemples 5 à 9 sont répétées en utilisant uniquement l'iodophénylbutyrate (amplificateur B de l'exemple 1). L'émission de la lumière a été mesurée toutes les 20 secondes pendant 3 heures. Les résultats de ces essais sont présentés dans la figure 2 annexée.
EXEMPLE 17 : ÉTUDE COMPARATIVE DE LA CHIMILUMINESCENCE AMPLIFIEE SUR LA DETECTION DE PROTEINE CELLULAIRE EN WESTERN-BLOT
L'oncogène c-met code pour une protéine hétérodimère de 19C Kd dans les carcinomes papillaires thyroïdiens humain (B-CPAP) (C. Paulin et Col, Int. J. Oncology, 7 ; 657-660 (1995)). Ces cellules ont été utilisées pour détecter la protéine c-met selon le protocole décrit par C. Paulo, et Col. Les quantités de protéines cellulaires totales suivantes ont été utilisées : 50 μg ; 40 μg ; 30 μg ; 20 μg ; 10 μg ; 5 μg 2,5 μg et 1 μg.
La technique d'electrophorèse en gel de polyacrylamide décrite par Laemmli, Nature 227, 680 (1970) a été utilisée pour séparer et transférer sur membrane de nitrocellulose les protéines cellulaires. La membrane est ensuite traitée avec différents réactifs dans les conditions suivantes : Saturation des sites non spécifiques sur la membrane avec du lait écrémé à 5 % dans du tampon PBS pendant 30 min. Incubation de la membrane avec l'anticorps de lapin anti c-met pendant 1 hr à 37°C. Lavage en PBS- Tween 0,2 % et incubation avec l'anticorps polyclonal de chèvre anti lapin marqué à la peroxydase pendant 1 hr à 37 °C. Après quatre lavages de 5 min en PBS-Tween 0,2 %, la membrane est immergée dans le réactif chimiluminescent décrit dans les exemples 5 à 9 pendant 3 min. Ensuite la membrane est égouttée puis couverte d'un film plastique et exposée à un film X-ray pour une durée allant de 30 secondes à une heure, puis développer. Plus précisément, la Figure 3 annexée représente la révélation en Western blot, de la protéine c-met (145 kDa) dans le lysat cellulaire, avec l'amplificateur B et avec un amplificateur témoin iodophenol. Le réactif chimiluminescent mis en oeuvre est identique à celui utilisé dans les exemples 5 à 9.
Sur cette Figure 3, les nombres annotés sur le bord supérieur longitudinal correspondent aux quantités de protéines totales (QPT) contenues dans le lysat cellulaire déposé dans chaque piste. Les QPT sont données en microgrammes (μg).
La rangée T correspond au témoin iodophenol et la rangée B à l'amplificateur (e) selon l'invention tel que synthétisé à l'exemple 1 et désigné par la lettre B.
On constate un début de révélation pour une QPT de 1 μg et une bande de révélation nette pour QPT = 2,5 μg, en ce qui concerne l'essai réalisé avec l'amplificateur (B).
Alors que pour le témoin T la première des révélations n'apparaît qu'à un QPT de 5.
Cela traduit bien l'extrême sensibilité du système selon l'invention. EXEMPLE 18 A 20 : ÉTUDE COMPARATIVE DE LA CHIMILUMINESCENCE AMPLIFIÉE UTILISANT LA PEROXYDASE LIEE A UN ANTICORPS ANTI-SOURIS POUR LA DETECTION D'IMMUNOGLOBULINES DE SOURIS
1 - PROTOCOLE EXPERIMENTAL :
Dans un tube de mesure en polystyrène, on introduit 100 μl d'une solution d'immunoglobulines de souris à 1 mg/ml (tampon carbonate 50 mM pH 8,5). On incube ensuite cette solution pendant 2 H à 37° C.
Après incubation, le tube est vidé de sa solution puis lavé avec 500 μl de tampon TRIS-HC1 50 mM pH 8,5. On introduit dans ce tube lavé ayant fixé les immunoglobulines de souris, 100 μl d'anticorps anti-souris marqués à la peroxydase, du type de ceux commercialisés par COVALAB. Ces 100 μl d'Ac sont dilués au 1 /50000e dans le tampon TRIS-HC1. On incube ensuite ce tube pendant 1 h à 37° C. On effectue deux lavages comme indiqué supra. On introduit enfin dans le tube contenant les complexes Ag (Ig souris)/ Ac marqué à la peroxydase, 500 μl de réactif chimiluminescent contenant les amplificateurs A ou B de l'exemple 1 supra.
La composition de ce réactif chimiluminescent est identique à celle du réactif utilisé dans les exemples 5 à 9 supra.
On agite le tube et on effectue une lecture à l'aide du luminomètre Biolumat LB 9500. Berthold France.
On réalise trois essais différents pour les exemples 18 à 20 :
Exemple 18 : Amplificateur B sans Force ionique
Exemple 19 : Amplificateur B avec Force ionique (Kcl 3 M)
Exemple 20 : Amplificateur A avec et sans force ionique (Kcl 1M). 2 - RESULTATS :
Les Figures 4, 5 et 6 annexées rendent compte des résultats obtenus.
Les Figures 4 et 5 montrent clairement que l'amplificateur B entraine une augmentation de l'émission de la lumière au moins 3 fois supérieure à celle induite par le témoin iodophenol.
Ces résultats confirment ceux obtenus dans les exemples 5 à 9.
La Figure 6 montre que l'amplificateur A est plus performant lorsqu'il est mis en oeuvre dans un milieu doté d'une force ionique > 1 M KCI.
En conclusion, il apparaît que le système d'analyse selon l'invention permet une meilleure détection de substances étudiées que les produits de l'art antérieur (amplificateur = iodophenol).
Ces exemples 18 à 20 font également ressortir le fait que le système de détection selon l'invention est un système d'analyse quantitative de substances détectables par une technique du type ELISA.

Claims

REVENDICATIONS :
1 - Système d'analyse qualitative et/ou quantitative de substances, de préférence biologiques, par chimiluminescence amplifiée, système du type de ceux faisant intervenir, essentiellement : a) au moins un ligand apte à s'apparier avec la ou les substances à analyser, b) au moins un réactif chimiluminescent appartenant à la famille des hydrazides cycliques diacylées et fusionnées à un reste aromatique, c) au moins une enzyme, d) au moins un substrat oxydant spécifique de l'enzyme (c) apte à se transformer sous l'effet de celle-ci en au moins un initiateur d'oxydation du réactif (b) avec production de lumière, e) et au moins un amplificateur de la réaction de luminescence, caractérisé :
• en ce que l' ule générale suivante :
Figure imgf000023_0001
dans laquelle :
- R° est un radical linéaire ou ramifié en C,-C10 fonctionnalisé ou non,
R° étant, de préférence, sélectionné parmi les radicaux suivants : O
* C R avec RI correspondant : li a à un alkyle linéaire ou ramifié en Cι-C10, avantageusement un méthyle, un propyle, un butyle, un pentyle ou un hexyle ; 2i m à un substituant alkylcarboxylique en C,-Cι0, avantageusement alkylmonocarboxylique, les substituants malonyle, succinyle, glutaryle, adipyle, heptanoyloïque, maléyle ou fumaryle étant des alkyls monocarboxyliques particulièrement préférés ; 3i m alkylamine ou aminoalkyle ; 4i m aryle, aralkyle ou alkylaryle, de préférence phényle ; * ou un radical de nature (poly)organosiloxanique et/ou (poly)organosiloxanique ; - R est un radical choisi dans le groupe comprenant : les halogènes, l'iode étant plus particulerement sélectionné, les alkyles linéaires ou ramifiés contenant de 1 à 30 atomes de carbone, les aryles en C,-C3() ou les aralkyles ou alkylaryles en Cj-C30 ; les halogènes, les phényles, les phtalates et les radicaux suivants étant plus spécialement retenus :
Figure imgf000024_0001
Y représentant -CH2-, -O- ou -N=N- et V représentant l'hydrogène, ou bien Y représentant -O-, -S- ou -S-S- et V représentant hydroxyle ;
Figure imgf000024_0002
W représentant hydrogène ou carboxyle ;
Figure imgf000024_0003
-CH=CH-Z, Z représentant carboxyle ou 2,4-dinitrophényle CH2CH2COOC2H2 ; ou un alkyle en C,-C6 ;
A représente l'hydrogène, B représente un halogène ou un alkyle en Cj-C6 et R représente un halogène ;
A représente l'halogène : B représente l'hydrogène et R représente un halogène ou un phényle, ou bien A représente l'hydrogène ou un halogène et R, B représentent ensemble une chaîne complétant un noyau naphtalène qui, lue dans la direction de R vers B, est de formule :
5 6 7 8
(2) — CH=C- -CH=CH
I
X
X représentant l'hydrogène ou un halogène, de façon que le composé de formule (1) soit un bêta-naphtol de formule :
Figure imgf000024_0004
R°, R, A, B étant substitués ou non ; • et en ce qu'il est exempt d'enzyme hydrolytique apte à lyser la liaison entre l'oxygène et R° dans -OR0.
2 - Système selon la revendication 1, caractérisé en ce que :
O
" I
R° = -C-R1 dans la formule (I) de l'amplificateur (e) et en ce que le taux d'ester :
O
11 i -O-C-R non hydrolyse de l'amplificateur (e) est supérieur ou égal à 40 % en poids, de préférence à 60 % en poids et, plus préférentiellement encore, à 90 % en poids.
3 - Système selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'amplificateur (e) comprend un mélange d'au moins deux esters de formule (1) avec :
O
R° = -C-R1
4 - Système selon la revendication 3, caractérisé en ce que:
• au moins l'un de ces esters, comportant de préférence un substituant R1 sélectionné parmi les radicaux (i), (2i) et (3i), tels que définis dans la revendication 1,
• et au moins un autre de ces esters étant particularisé par un substituant R1 sélectionné parmi les radicaux (4i), tels que définis dans la revendication 1.
5 - Système selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le ligand (a) est constitué par au moins l'un des éléments des couples de substances appariables suivants :
• antigène/anticorps.
• enzyme/substrat, enzyme/inhibiteur,
• récepteurΛigand
• lectine/sucre
• acide nucléique/acide nucléique complémentaire,
6 - Système selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le réactif chimiluminescent (b) est le 2,3-dihydro-l,4-phtalazinedione chimiluminescente de formule générale (4) :
Figure imgf000025_0001
dans laquelle : R4 représente un reste aminé, substitué ou non, et chacun des radicaux RJ, R6 et R7 représente H, un alkyle en CrC6, substitué ou non, un alcényle en CrC6, substitué ou non, un hydroxyle, un alcoxyle en C,-C6, un carboxyle, substitué ou non, ou un reste aminé, substitué ou non, où R5 représente un reste aminé, substitué ou non, et chacun des radicaux R4, R6 et R7 représente H, un alkyle en C,-C6, substitué ou non un alcényle en C,-C6, substitué ou non, un alcényle, substitué ou non, un hydroxyle, un alcoxyle, un carboxyle, substitué ou non, ou un reste aminé, substitué ou non, où R4 et RJ sont pris ensemble et représentent un dérivé amino-substitué ou non par un radical benzo et chacun des radicaux R6 et R7 représente H, alkyle en C,-C6, substitué ou non, un alcényle en Cι-C6, substitué ou non, un alcényle, substitué ou non, un hydroxyle, un alcoxyle, un carboxyle, substitué ou non, ou un reste aminé, substitué ou non, le luminol et l'isoluminol étant particulièrement préférés.
7 - Système selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que l'enzyme de chimiluminescence (c) est sélectionnée parmi les oxydo-réductases, la xanthine oxydase étant avantageusement retenue, et de préférence parmi les peroxydases suivantes : la peroxydase de raifort, la microperoxydase, la peroxydase extraite de microorganisme Arthromyces ramosus et la lactoperoxydase ; la peroxydase de raifort et la microperoxydase étant particulièrement préférées.
8 - Système selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que le substrat (d) est un oxydant formé, de préférence, par un peracide ou un peroxyde et, plus préférentiellement encore, par le peroxyde d'hydrogène et/ou un perborate d'alcalin ou d'alcalinoterreux.
9 - Système selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce qu'au moins l'une, et au plus trois, de ses composantes (b) à (e) est liée au (portée par le) ligand (a), l'autre ou les autres composantes étant comprise dans le milieu d'analyse.
10 - Système selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce qu'il est associé à une solution comportant au moins un régulateur de pH et/ou au moins un régulateur de la force ionique choisi parmi les sels, de préférence les halogenures (avantageusement chlorures) de métaux alcalins et/ou alcalino terreux, KCI, KBr, NaCl, CaCI2, étant particulièrement préférés.
11 - Système selon la revendication 10, caractérisé en ce que le régulateur de la force ionique titre 0,1 à saturation, de préférence de 0,1 à 3 M.
12 - Procédé d'analyse qualitative et/ou quantitative de substances, de préférence biologiques, par chimiluminescence amplifiée, caractérisé en ce qu'il consiste, essentiellement, à mettre en oeuvre le système selon l'une quelconque des revendications 1 à 1 1. 13 - Nécessaire d'analyse qualitative et/ou quantitative de substances, de préférence biologiques, par chimiluminescence amplifiée, caractérisé en ce qu'il comprend le système selon l'une quelconque des revendications 1 à 11.
14 - Système selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, procédé selo la revendication 12, nécessaire selon la revendication 13, caractérisé en ce que les substances à analyser sont comprises :
• sur ou dans des supports solides choisis, de préférence, dans la liste ci- après :
- plaques de microtitration entières ou sécables,
- tubes à essai en polymère synthétique ou en verre,
- polymères biologiques,
- lames d'immunohistologie,
- membranes,
- billes.
• ou dans des milieux liquides de type solution, émulsion ou dispersion, formant une partie du milieu d'analyse.
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