JPH11514875A

JPH11514875A - 増幅された化学ルミネセンスによる物質、好ましくは生物学的物質の定性および／または定量分析のためのシステム、ならびに分析方法およびその適用のためのキット

Info

Publication number: JPH11514875A
Application number: JP9516349A
Authority: JP
Inventors: エル・アラウィ，セイ; ブラム，ロイ; アンリ，ロベール
Original assignee: Fujirebio Europe NV SA
Current assignee: Fujirebio Europe NV SA
Priority date: 1995-10-20
Filing date: 1996-10-18
Publication date: 1999-12-21
Also published as: FR2740219A1; AU722918B2; AU7306696A; WO1997015684A1; EP0880600A1; FR2740219B1; US6124109A; CA2235068A1

Abstract

(57)【要約】化学的および／または生物学的種、例えば、酵素／基質、酵素／阻害剤または抗原／抗体の同定および分析が開示される。解決されるべき問題は、増幅された化学ルミネセンスを用いた生物学的物質の定性および／または定量的分析のためのシステムを提供することであり、ここに、実際、光の放出の顕著な増強が、化学ルミネセンス試薬の励起の結果として達成できる。該問題を解決するために供されるシステムは、分析されるべき物質と対合可能なリガンド（ａ）、ルミノールタイプ試薬（ｂ）、酵素（ｃ）、該酵素（ｃ）のための基質（ｄ）、および少なくとも１種の増強剤を使用する。該システムは、増強剤がハロフェノール（ヨードフェノール）エステル類のファミリーから選択されることにおいて特徴付けられる。該システムを用いた分析法および分析での使用のための該システムを含めた分析キットもまた開示される。

Description

【発明の詳細な説明】増幅された化学ルミネセンスによる物質、好ましくは生物学的物質の定性および／または定量分析のためのシステム、ならびに分析方法およびその適用のためのキット技術分野本発明の分野は興味のある分野、さらに詳しくは、化学種、好ましくは生物種、特に核酸、または天然の蛋白質、例えば：酵素／基質および抗原／抗体の生体高分子のごとき高分子量種の同定および分析のための分析化学の分野である。より正確には、本発明は、 −第一に、増幅された化学ルミネセンスによる、物質、好ましくは生物学的物質の定性および／または定量分析のためのシステム、 −第二に、このシステムを用いた分析方法、および第三には、該システムからなる分析キットに関する。特に、限定的ではないが本発明によって描かれる生物学的種の物質は、核酸ＲＮＡおよびＤＮＡならびにそれらを含むあらゆる遺伝的構造、および免疫学的抗原（Ａｇ）／抗体（Ａｂ）反応に関与しうる化合物であり、さらに認識機構および酵素反応：酵素／基質、酵素／阻害剤、レセプター／リガンドおよびレクチン／糖において互いにカップリングする産物である。先行技術このタイプの分子または構造を検出し、同定しまたは分析するためには、それらのバイオアフィニティーの特性、すなわち、それは、遺伝子ハイブリダイゼーションまたは免疫学的もしくは酵素的認識の機構によりそれらの相補体と特異的にカップリングするそれらの特有の能力を使用することが通常である。化学ルミネセンス、および特にいわゆる増幅された化学ルミネセンスも、この原理によって進行する分析技術の一つであり、研究室において現在使用されている。増幅された化学ルミネセンスの検出は、タンパク質についての「ウエスタン・ブロット(western blot)」タイプのまたは「ＥＬＩＳＡ」タイプの、あるいはＤＮＡまたはＲＮＡについての「サザンおよびノーザンブロット(southern & northen blot)」タイプのよく知られた分析的方法で見いだすことができる。増幅された化学ルミネセンスのこの技術は有利であって、放射活性同位体が、考慮されるカップリングのマーカーおよびインディケーターとして用いられる通常の免疫学的分析と比較して代わりとなるものになる見込みがある。実際、放射性分析は時代遅れになりはじめている、なぜならそれは、とりわけ、 −危険な操作、 −放射能標識物質の有用な保存寿命が低い、 −放射能標識の困難性、 −および放射性廃棄物の処理を含めた多くの欠点を有するからである。あいにくと、増幅化学ルミネセンスによるこれらの分析技術の開発は、現在存在するシステムの限定された感度のために遅れている。この感度は考慮中のカップリングを指示するルミネセンス反応の途中および終わりにおいて放出される光に一部依存する。本明細書のこの段階で、増幅化学ルミネセンスによる検出の原理を記録することにより該概念を述べることは有用に思われる。第一に、ルミネセンスは、励起状態の物質から発せられたエネルギーの一部の回復から生じる光の放出として定義され得る。化学ルミネセンスにおいて、該励起は化学反応により起こる。後者は、１またはそれ以上の物質、好ましくは分析するべき生物学的物質との直接的または間接的なリガンドのカップリングによって続いてトリガーされる。このリガンドは、加えて、化学ルミネセンス試薬、酵素または化学ルミネセンスの触媒的サブユニット、およびこの酵素に特異的な基質または触媒的サブユニット類からなる分析システムの要素の１つであって、化学ルミネセンス試薬の励起の少なくとも１つの開始剤へ、その影響のもとで変換され得、この励起には光が生じることが伴う。増幅化学ルミネセンスで最も使用されるシステムの１つは、その中核において、ルミノールまたはイソルミノールのごとき環状ジアシルヒドリジドタイプの化学反応試薬がみいだされるものである。そのようなシステムにおいて、使用される酵素は、例えば、Ｈ₂Ｏ₂のごとき酸化剤と呼ばれる物質を、ルミノールの酸化の開始剤に変換できるペルオキシダーゼ類である。この酸化はフォトンを生じるのが余りにも少ないので、ルミノールの励起は大きな感度では検出できず、それゆえ、この酸化反応を増幅させることが必要である。公知の最も有効な増幅剤の中では、ハロゲノフェノール類およびそれらの誘導体のファミリーに属するものを挙げることができる。しかしながら、すでに上記で示したように、そのような増幅剤の助けを借りて達成された効率は非常に不十分であって、とりわけ該反応後に放出された光の量に関しては不十分である。この問題を扱ったがうまくいかなかったいくつかの先行する技術的提案がある。かくして、特許ＥＰ０１１６４５４には、化学ルミネセンス分析のシステムが開示されており、ここに、該ルミネセンス反応は、ペルオキシダーゼ、酸化剤およびルミノール：２,３−ジヒドロ−１,４−フタラジンジオンの形態の化学ルミネセンス剤の間で化学ルミネセンス反応が起こる。本特許において保護される発明は、特に、４−ヨードフェノール、４−ブロモフェノール、４−クロロフェノールおよび、４−ヒドロキシケイ皮酸、２−ナフトール、６−ブロモナフター２−オールおよび４−ヒドロキシフェニルジスルフィドのごとき他のフェノール誘導体からなる増幅剤の使用を提案する。これらの増幅剤は光放出の改良を可能にし、とりわけ、信号／バックグラウンドノイズ比の改良を可能とする。しかしながら、これらの増幅剤の助けを借りた良好な信号／ノイズ比は、該方法の感度に関しては依然として不満足なものである。これは、十分な感度を得るために使用される増幅剤の量の増加を引き起こす。これは、反応における可能な妨害および分析費用の否定しがたい増加という結果となる。公知のシステムを完全にするために、新しい化学ルミネセンス増幅剤が、国際特許出願ＰＣＴＷＯ９１／０５８７２により提案された。後者は試薬としてのルミノール、酵素としてのペルオキシダーゼ、および酸化基質としてのＨ₂Ｏ₂からなるシステムで使用されることが意図される。増幅の該手段はｐ−ハロゲノフェノール類、例えばヨードフェノール類のエステルのファミリーから選択される不活性な前駆体からなる。増幅剤のこれらの前駆体の活性化は、検出インジケーターとして役立つであろう光の産生を得るために、化学ルミネセンスシステムの全ての成分が一緒になった場合に、エステラーゼの助けを借りて実現する。このＰＣＴ出願において言及される発明者によると、化学ルミネセンス酵素および、増幅剤を活性化する酵素の間でこのようにして実現する該カップリングは、この分析の感度を改良する性質の増幅現象の原因となる。しかしながら、ここにおいてさえも、得られた改良は不十分なままである。特許出願ＥＰ０５１６９４８にもまた、式ＡｒＯＸ（ここにＸは、加水分解酵素の作用により活性化可能なマスキング基であって、Ａｒは芳香族基である）のエステルからなるルミノール／Ｈ₂Ｏ₂／ペルオキシダーゼ系のための化学ルミネセンス増幅剤が開示されている。これらはまた、例えば、これらの増幅剤前駆体がエステルである場合のエステラーゼでありうる酵素の影響下での活性産物に変換可能な不活性な増幅剤前駆体である。ヨードフェノールのリン酸エステル二ナトリウム塩、ジフェノールの酢酸エステルおよび最後にはヨードフェノールおよびジフェノールのエキソリディック(exolydic)な誘導体がこの出願中で特に言及される。このヨーロッパ特許出願に記載される増幅手段は、上記に言及された出願ＰＣＴＷＯ９１／０５８７２によるそれよりも良好な結果を与えない。先行文献であるエイチ・ホリ(H．HORI)らの「アナリティカル・レターズ(Anal ytical Letters)、27(6)、1109-1122、(1994)」は、それらのルミノール／Ｈ₂Ｏ₂ ／ペルオキシダーゼの反応における化学ルミネセンスの新しいフェノール性増幅剤をまた記載する。これらの新規な増幅剤は、一方で４−ヒドロキシベンジリデン−シクロペンテンジオン類であり、他方では４−ヒドロキシベンジリデン− マロノニトリル類である。これらの増幅剤によって得られる光の放出における改良は、前記記載のｐ−ヨードフェノールについて見い出されるそれらよりも依然劣っている。さらに、この論文における関連する研究は、新しい増幅剤の開発において、傾向が変化している。実際、ハロゲノフェノール類由来の不活性エステル類の研究はもはや効果がないものではない。最後に、国際特許出願ＰＣＴＷＯ９４／２３０６０は、ルミノール、ペルオキシダーゼ、酸化基質（＝Ｈ₂Ｏ₂）および発光の信号／ノイズ比を増加させることを意図した増幅剤を含む化学ルミネセンス反応の増幅法を提案する。該増幅剤は、有機ホウ素化合物および非ホウ素化合物の組合せからなる。有機ホウ素化合物は式ＡｒＢ（ＯＲ）₂（ここにＡｒ＝置換または非置換芳香族）に対応する。該増幅の非ホウ素有機化合物は、先行技術の他の文献における上述のそれらのタイプのハロゲノフェノール誘導体である。再度、この出願ＷＯ９４／２３０６０に記載された発明で得られる信号／ノイズ比における改良は非常に興味深いものではない。発明の簡単な記載この知識の状態において、本発明の必須な目的の１つは、励起された状態への化学ルミネセンス剤の経過から生じる光の放出において、実際のかつ重要な改良を可能とする増幅化学ルミネセンスによる物質、好ましくは生物学的物質の定性および／または定量分析のためのシステムを提供することにある。本発明のもう１つの必須な目的は、使用するのに単純で経済的である前記のタイプの増幅化学ルミネセンスのためのシステムを提供することにある。本発明のもう１つの必須な目的は、ルミネセンス試薬としてのルミノールまたはその類似体、ルミネセンス酵素としてのペルオキシダーゼ、酸化基質としてのＨ₂Ｏ₂のごとき過酸または過酸化物に加えて、フェノール誘導体のファミリーに属する増幅剤からなるタイプの化学ルミネセンスによる分析のためのシステムを提供することにあり、該システムは、得られる化学ルミネセンスのレベルに関しては、好ましくは低い量で完全に効果的であるべきである。本発明のもう１つの必須の目的は、上述の光放出および感度効率を得る化学ルミネセンスによる、物質、好ましくは生物学的物質の定性および／または定量分析のための方法を提供することにある。本発明のもう１つの必須の目的は、該システムおよび該方法を用いた化学ルミネセンスによる分析のためのキットを提供することにある。これらの目的を達成するために、出願人らは、いくつかの研究の仕事および実験の後、非常に驚くべきことで予期せぬことであるが、フェノール由来のエステルのサブファミリーからの増幅剤（該エステル類は容易には加水分解されない特性によって区別される）を選択することが適当であることを示すことに成功した。本発明はこれによるものであり、第一に、増幅された化学ルミネセンスによる、物質、好ましくは生物学的物質の定性および／または定量分析のためのシステムであって、必須構成用件として：ａ）分析されるべき物質または物質類とカップリングできる少なくとも１種のリガンド、ｂ）芳香基に縮合した環状ジアシル化ジヒドラジド類のファミリーに属する少なくとも１種の化学ルミネセンス試薬、ｃ）少なくとも１種の酵素、ｄ）酵素（ｃ）に特異的であって、その影響のもとで、光の産生により試薬（ｂ）の酸化の少なくとも１種の開始剤に変換され得る少なくとも１種の酸化基質、ｅ）およびルミネセンス反応の少なくとも１種の増幅剤を含み、該増幅剤（ｅ）は、以下の一般式：［式中、 −Ｒ⁰は官能基を有するか有しない直鎖または分岐鎖のＣ₁−Ｃ₁₀基であり、Ｒ⁰は、好ましくは以下の基から選択され：＊ここにＲ¹は：１ｉ＝直鎖または分岐鎖のＣ₁−Ｃ₁₀アルキル基、有利にはメチル、プロピル、ブチル、ペンチルまたはヘキシルに対応し；２ｉ＝Ｃ₁−Ｃ₁₀アルキルカルボキシ置換基、有利にはアルキルモノカルボキシに対応し、置換基マロニル、スクシニル、グルタリル、アジピル、ヘプタノイル、マレイルまたはフラニルが特に好ましいアルキルモノカルボキシであり；３ｉ＝アルキルアミンまたはアミノアルキルに対応し；４ｉ＝アリール、アラルキルまたはアルキルアリール、好ましくはフェニルに対応し；＊または（ポリ）オルガノシロキサンおよび／または（ポリ）オルガノシロキサンの性質の基： −Ｒはハロゲン類（ヨウ素が特に選択される）、１ないし３０炭素原子を含む直鎖または分岐鎖アルキル類、Ｃ₁−Ｃ₃₀アリールまたはＣ₁−Ｃ₃₀アラルキルもしくはアルキルアリール類よりなる群から選択され；ハロゲン類、フェニル類、フタレート類および以下の基がより具体的には適し、ここにＹは−ＣＨ₂−、−Ｏ−または−Ｎ＝Ｎ−であってＶは水素、またはＹは −Ｏ−、−Ｓ−または−Ｓ−Ｓ−であってＶはヒドロキシルを表し；ここにＷは水素またはカルボキシルを表し； −ＣＨ＝ＣＨ−Ｚ、Ｚはカルボキシルまたは２,４−ジニトロフェニルを表し；ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＯＯＣ₂Ｈ₂；またはＣ₁−Ｃ₆アルキル； −Ａは水素を表し、ＢはハロゲンまたはＣ₁−Ｃ₆アルキルを表し、Ｒはハロゲンを表し； −Ａはハロゲン；Ｂは水素を表し、Ｒはハロゲンまたはフェニルを表し、 −あるいはＡは水素またはハロゲンであって、ＲおよびＢは一緒になって鎖を表し、これは、式：を有し、ＲからＢの方向で読まれるナフタレン核を完成し、Ｘは式（Ｉ）の化合物が式：で示されるベーターナフトールであるように、水素またはハロゲンを表し、 −Ｒ⁰、Ｒ、ＡおよびＢは置換または非置換である］に対応し、 −ＯＲ⁰中の酸素およびＲ⁰の間の結合の分解を可能とする加水分解酵素を含まないという特徴を有するそれらのシステムに関する。かくして、その最も一般的な態様において、本発明は化学ルミネセンスまたは化学ルミネセンス法による分析の完全なシステムを提供する。それは、ハロゲノフェノール類（例えばヨードフェノール類）のエステルから由来し、かつ考慮中のルミネセンス反応の感度を有意に改良する特定の増幅剤の驚くべき発見に基づく。本明細書において、「改良された」なる用語は、本発明によるルミネセンス反応の全発光および／または該反応の信号／バックグラウンドノイズ比が、以前に知られたシステムによって達成されたそれよりも優れていることを示す。さらに、先行技術のいくつかの原理により唱えられているものと対照的に、本発明による化学ルミネセンスは、増幅剤を活性とするための式（Ｉ）中の酸素原子および基Ｒ⁰間の結合の開裂を可能とするよう意図された加水分解酵素を含まない。さらに、本発明の主要部は、その概念に根本的に反対する、なぜなら加水分解の最小レベルを得ることが意図され、これはルミネセンスの増幅の高効率と同意であるからである。発明の詳細な記載本発明の好ましい特徴によると、増幅剤（ｅ）の式（Ｉ）において：この場合、増幅剤(ｅ)の非加水分解エステル：の含量は４０％重量より大きいかまたは等しく、好ましくは６０％重量であり、より好ましくは９０％重量である。かくして、本発明はフェノール由来のある増幅剤の有利なかつ賢明な選択から進行し、さらに詳しくは、カルボン酸、特にモノ−、ジ−またはポリカルボン酸とフェノール（例えばハロゲノフェノール）とのエステルよりなり、所望により、好ましくはアミン官能基によって、または１またはそれ以上のカルボン酸基を有する芳香族基によっても官能基化されていてもよい。使用される増幅剤（ｅ）は、同じ性質の式（Ｉ）の化合物の形態であり得るか、または、有利には、式（Ｉ）の少なくとも１種の化合物、好ましくは本発明の興味ある変形によると、増幅剤（ｅ）としての式（Ｉ）のエステルの混合物に関する場合、これらのエステルの少なくとも１種が、好ましくは、上記定義の基（ｉ）、（２ｉ）および（３ｉ）から選択される置換基Ｒ¹を含み、これらのエステルのうち少なくとも１種の他のものは、上記定義の基（４ｉ）から選択される置換基Ｒ¹によって区別される。本発明によるシステムに含まれるリガンドに関して、これは有利には、カップリングできる物質の以下の対：＝抗原／抗体、＝酵素／基質、酵素／阻害剤、＝レセプター／リガンド、＝レクチン／糖、＝核酸／相補的核酸の要素のうち少なくとも１種からなる。これらの用語、酵素、基質、抗原および抗体により、とりわけ蛋白質、ホルモン、ハプテン、ステロイドおよび代謝産物のごとき種々の産物を指定することが可能である。ルミネセンス化学試薬（ｂ）は、例えば、酵素反応の産物（ＯＨ'）によって開始する化学ルミネセンス反応の間に励起状態に至り、次いで、光が放出された後、または光を放出することにより非励起状態に戻る産物である。本発明において、化学ルミネセンス試薬（ｂ）は、好ましくは、２，３−ジヒドロ−１,４− フタラジンジオン（ＤＰＤ）のファミリーに属する産物である。さらに詳しくは、このＤＰＤは以下の一般式（２）：［式中： −Ｒ⁴は置換または非置換のアミン基を表し、基類Ｒ⁵、Ｒ⁶およびＲ⁷の各々はＨ、置換または非置換Ｃ₁−Ｃ₆アルキル、置換または非置換Ｃ₁−Ｃ₆アルケニル、ヒドロキシル、Ｃ₁−Ｃ₆アルコキシ、置換または非置換カルボキシルまたは置換または非置換アミン基を表し、 −あるいはＲ⁵は置換または非置換アミン基を表し、基類Ｒ⁴、Ｒ⁶およびＲ⁷の各々はＨ、置換または非置換Ｃ₁−Ｃ₆アルキル、置換または非置換Ｃ₁−Ｃ₆アルケニル、ヒドロキシル、アルコキシ、置換または非置換カルボキシルまたは置換あるいは非置換アミン基を表し、 −あるいはＲ⁴およびＲ⁵は一緒になってベンゾ基によって置換されたまたは置換されていないアミノ誘導体を表し、基類Ｒ⁶およびＲ⁷の各々はＨ、置換または非置換Ｃ₁−Ｃ₆アルキル、置換または非置換Ｃ₁−Ｃ₆アルケニル、ヒドロキシル、アルコキシ、置換または非置換カルボキシルあるいは置換または非置換アミン基を表す］に対応し、ルミノールおよびイソルミノールが特に好ましい。本発明において、上記の式（２）の説明において使用される「置換アミノ」もまたアミド基を指定する。好ましい試薬（ｂ）、すなわち、Ｒ⁴、Ｒ⁵、Ｒ⁶＝ＨであってＲ⁷＝ＮＨ₂であるルミノールが存在する場合、このアミノ基は、直接的にまたは、公知であって適当なタイプのスペーサー化合物、例えば、ヘミスクシネート類、ヘミグルタレート類、ヘミマレエート類、カルボキシメチルおよびグルクロニル誘導体およびメルカプトアセテート類を介して、（ｂ）とリガンドとのカップリングプリッジとして役立つ。分析されるべき種と、（ｂ）にカップルしたリガンドとの直接または間接的カップリング後、分析方法は、したがって、固定された化学ルミネセンス試薬（ｂ）とシステムの他の成分とを、該カップリングが化学ルミネセンス反応を通じて示されるように反応させることよりなる。（ｂ）のリガンドへの固定は、描くことのできる方法の変形のただ１つを表すにすぎない。本発明において、酵素なる用語は、完全な蛋白質および触媒的サブユニットを共に示す。酵素（ｃ）は好ましくは、国際生化学連合(International Union of Biochemi stry)によって定義されるごとく酸化還元酵素に対応する。これは、とりわけ、国際生化学連合分類のクラス１の酵素、またはオキシドレダクターゼの酵素に関する。本発明によるオキシドレダクターゼの有利な例はキサンチンオキシダーゼである。該酵素（ｃ）はより好ましくはセイヨウワサビペルオキシダーゼ、マイクロペルオキシダーゼ、微生物アルスロミセス・ラモスス(Arthromyces ramosus)から抽出されたペルオキシダーゼ、およびラクトペルオキシダーゼから選択されるが、セイヨウワサビペルオキシダーゼおよびマイクロペルオキシダーゼが特に好ましい。化学ルミネセンス試薬（ｂ）のように、酵素（ｃ）は所望により、直接または間接的にリガンドにカップリングすることができ、かくしてマーカーを構成する。変形に依存して、この酵素（ｃ）は、溶液中にあるか、あるいはマトリックスに固定化されてもよい。本発明を実施する好ましい態様において、基質（ｄ）は、好ましくは過酸または過酸化物の形態の酸化剤であり、より好ましくは過酸化水素および／または過ホウ酸アルカリ金属または過ホウ酸アルカリ土類金属である。実際、化学ルミネセンス試薬が２,３−ジヒドロ−１,４−フタラジンジオン（特にルミノールまたはイソルミノール）である場合、この酸化剤は、酵素（ｃ）の影響下にて、試薬（ｂ）の酸化の開始剤（ＯＨ・）に変換される。上記のごとく、この酸化剤が直接または間接的にリガンドに結合し、かくしてマーカーを構築することが考えられる。１つの代法によると、それは、リガンドによって担持されるマーカー（類）との反応で使用される化学ルミネセンスによるカップリングの示標の手段の一部であり得る。本発明によるシステムの成分の配置に正確に関し、上記したことは、これらの成分（ｂ）ないし（ｅ）のうち少なくとも１つ、最大で３つが、リガンド（ａ）に結合し（あるいは担持され）、他の成分または成分（類）が分析媒体に含まれるのが有利であることを示す。リガンドのマーカーまたはマーカー類が何であろうと、本発明によると、化学ルミネセンス分析の進行中、考慮中のシステムを、少なくとも１種ｐＨ調整剤および／またはアルカリ金属および／またはアルカリ土類金属の塩から選択される少なくとも１つのイオン強度調整剤、好ましくはハロゲン化物（有利には塩化物）であって、ＫＣｌ、ＫＢｒ、ＮａＣｌ、ＣａＣｌ₂およびＣｓＣｌが特に好ましい塩からなる溶液と合することが好ましい。実際、分析媒体のｐＨがアルカリ性であることが有用であると判明した。アルカリ度はルミネセンス反応に有利であり、式（Ｉ）の増幅剤および式（２）の化学ルミネセンス試薬の溶解度に関係する役割も果たす。ｐＨ調整は、従って、例えば、トリス緩衝液、炭酸緩衝液またはリン酸緩衝液のごときいずれかの適当な緩衝液からなる調整剤によって有利に確保される。イオン強度はまた、本発明によるシステムからなる分析媒体の重要なパラメーターである。実際、それは、基ＯＲ⁰、さらに詳しくはエステル結合の加水分解に関する式（Ｉ）の増幅剤類（ｅ）の安定性を決定する。上記において、エステルの形態での増幅剤（ｅ）の加水分解のレベルが低いほど、化学ルミネセンスの効率が大きいことが観察された。上述のハロゲン化物は、従って、有利には該イオン強度の調整のこの機能を確実とする。この目的のために、それらの量は０.１Ｍないし飽和、好ましくは０. １ないし３Ｍである。もちろん、化学ルミネセンス反応が良好に進行するのに重要である、ｐＨおよびイオン強度以外の第二の要素がある。とりわけ、システムの温度、成分（ｂ）ないし（ｅ）の濃度、混合速度および光の測定技術を挙げることができる。本発明はまた、上記定義のシステムからなることを特徴とする、増幅された化学ルミネセンスによる、物質、好ましくは生物学的物質の定性および／または定量的分析法に関するので、これらは、本発明の意味で完全に適合する方法および分析の特徴である。一般的に、この方法で使用される条件、および上記記載のシステムは、以前使用されたそれら、特に特許ＥＰ０１１６４５４および出願ＰＣＴＷＯ９４／２３０６０に記載される方法において使用されたものに対応する。参考のために、これらの文献の対応する部分を、従って、本明細書に統合する。要約すると、該分析の温度は有利には１０℃ないし５０℃であり、システムの成分類（ｂ）ないし（ｅ）の濃度は以下の通りである： −試薬（ｂ）（例えばＤＰＤ）：５μｍｏｌ−２００μｍｏｌ／ｌ、 −ペルオキシダーゼ（ｃ）：０.１ｎｇないし５ｇ／ｌ、 −酸化基質（ｄ）：１０μｍｏｌ−３０ｍｍｏｌ／ｌ、 −増幅剤（ｅ）：１μｍｏｌ−１００ｍｍｏｌ／ｌこれらの濃度は、全分析媒体に対して与えられ、これは有利には上記定義のごとく確実に制御された、水緩衝溶液からなる。本発明による増幅剤（ｅ）の例外的効率は、注目する酵素濃度の減少を可能とする。実際、０.１ｎｇおよび１ｎｇ／ｍｌの間の濃度で扱うことが可能である。これは消耗品における無意味な節約ではない。本発明の好ましい具体例による反応は、以下の通り概説される。：ルミノール＋Ｈ₂Ｏ₂＋ペルオキシダーゼ→光＋酸化産物式（Ｉ）の増幅剤（ｅ）産業の利用性もう１つのその有利な態様のもとで、本発明は、また、上記定義のシステムからなることを特徴とする、増幅された化学ルミネセンスによる、物質、好ましくは生物学的物質の定性および／または定量分析のためのキットを提供する。本発明によるシステム、方法およびキットは、生化学および生物学的分析の分野で即座のかつ明らかな適用を有する。実際、それらは、免疫学的、免疫酵素的、免疫組織学的、酵素的および遺伝的分析の技術の範囲に取り込むことができる。示指システムは、例えば：膜レセプター類、ホルモン類、神経伝達物質および、一般的にはシグナルトランスデューサー類(signal transducer)のごとき、リガンド／レセプター、糖／レクチン、酵素／基質および酵素／阻害剤タイプの認識システムを含むことができる。これらは、例えば、サンドイッチタイプの、「ウエスタン、ノーザンおよびサザンブロット（western，northern & southern」タイプの、または免疫組織学タイプ（抗体／マークした抗原または核酸プローブ）の競合または非競合タイプの「ＥＬＩＳＡ」技術であり得る。分析されるべき物質は、好ましくは、以下のリストから選択される固体支持体上または固体支持体中に含まれる； −全体または分割可能なミクロ滴定プレート、 −合成ポリマーまたはガラスの試験管、 −生物学的ポリマー、 −免疫組織学的切片、 −膜、 −ビーズ等。または分析媒体の一部を形成する、該溶液のエマルジョンまたは分散液タイプの液体媒体の中に含まれる。固体支持体は、いわゆる不均一の、不均一競合的または不均一２部位分析法において使用する。該液体媒体は、いわゆる均一相分析法により適している。本発明による該システムおよび該方法は、また、生物学的媒体中において、ペルオキシダーセまたは細胞外過酸化物（Ｈ₂Ｏ₂）のごとき物質を同定し、分析するのにも使用できる。これらは、該分析システムの構成物の１またはそれ以上に対応する物質である。以下の実施例は、本発明のより良い理解を可能とし、全てのその使用の利点および変形を明らかとする。実施例１．図面の説明添付の図１は、ヨードフェノールに対して（曲線−□−対照）、および実施例１の酪酸ヨードフェニル増幅剤Ｂに対して（曲線−■−増幅剤Ｂ）attomolで使用されるペルオキシダーゼ酵素の量の関数としての、任意の単位（a.u.）における放出された光の強度の曲線を示す。添付の図２は、実施例１６の条件下での時間単位の時間の関数としての、任意の単位(a.u.)で表された放出された光度のグラフによる増幅剤(Ｂ)の存在下での光の放出の速度論を示す。添付の図３は、対照ヨードフェノールで得られた結果と比較した酪酸ヨードフェニル［増幅剤（Ｂ）］で得られたウエスタンブロットの結果を示す。添付の図４は、実施例１８の条件下での任意の単位（a.u.）＝ｆ（ｔ）（分単位でのｔ）における光度のグラフによる陽性対照：ヨードフェノール増幅剤［−● の増幅剤Ｂ［−■−Ｂ−］の存在下での光放出の速度論を表す。添付の図５は、実施例１９の条件下での任意の単位（a.u.）＝f(t)（分単位でのｔ）における光度のグラフによる、陽性対照：ヨードフェノール増幅剤［−●− 増幅剤Ｂ［−■−Ｂ］の存在下での光放出の速度論を表す。添付の図６は、実施例２０の条件下での任意の単位（a.u.）＝f(t)(分単位でのｔ)における光度のグラフによる、イオン強度：ＫＣｌ１Ｍグラフ［−□− ］およびイオン強度無し［グラフ−○−］での実施例１の増幅剤Ａの存在下での光放出の速度論を表す。 II−物質および方法試薬全ての以下の製品はフランス国のSigma Chimieから入手したものである：ワサビペルオキシダーゼ(HRP)タイプVI、ルミノール(５−アミノ−２,３−ジヒドロ −１,４−フタラジンジオン）、トリス（ヒドロキシメルチル）アミノメタン、過酸化水素３０％、塩化カリウムおよびジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）。化学合成のために使用される製品は全てフランス国のAldrichから入手したものである。ウサギ抗−ｃ−ｍｅｔポリクローナル抗体は、アメリカ合衆国サンタ・クルツ・バイオテクノロジー(Santa Cruz Biotechnology)から入手したものである；ペルオキシダーゼでマークしたヤギ抗−ウサギポリクローナル抗体はフランス国、 LYONのCovalAbから入手したものである。フランス国、Ecquevillyのニトロセルロース膜（シュライヒャー・アンド・シュエル(Schleicher and Schuell)、ＫｏｄａｋｆｉｌｍＸ−ＯＭＡＴＡＲＸ−Ｒａｙ（アメリカ合州国ニューヨーク州、ロチェスター（ROCHESTER）分析のための装置化学ルミネセンス反応は、４ｍｌポリスチレン製チューブおよび４ｍｌガラス（ホウケイ酸ガラス）製チューブ（アメリカ合衆国コスター・サイエンス・コーポレイション(Costar Sc．Co.)中で行った。放出された光を２つのルミノメーター；ＴＬＸＩモノチューブ(L9990120-2121)(フランス国、ダイナテック・ラボラトリーズ(Dynatech Laboratories)およびフランス国、BertholdのBiolumat LB9500を用いて測定した。ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびトランスファーのための物質は、フランス国のバイオラッド・ラボラトリーズ(Biorad Labora tories)から入手する。赤外（ＩＲ）スペクトルはPerkin Elmer spectrometer model 1310上にプロットし、ｃｍ^-1単位で表す。核磁気共鳴スペクトル（¹Ｈ−ＮＭＲ）はBruker AC200 spectrometer上でプロットし、化学シフトは、内部対照としてのテトラメチルシランに対してppmで示す。液体クロマトグラフィーによる分離は、Merck Kieselge160(70-230メッシュASTM) のシリカカラム上で行う。 III−本発明による増幅剤（ｅ）の合成および加水分解（４−ヨードフェノールのエステル）実施例１：酢酸４−ヨードフェニル（増幅剤Ａ）および酪酸４−ヨードフェニル（増幅剤Ｂ）の合成対応する酸の塩化物６.５ｍｍｏｌ（１.５当量）を０℃に維持した１０ｍｌピリジン中の１ｇ４−ヨードフェノール（４.５ｍｍｏｌ）の溶液に滴下する。室温にて３時間後、該溶液を１００ｍｌの０.５Ｍ塩酸に注ぎこむ。エチルエーテル（２×５０ｍｌ）での抽出後、有機相を水、次いで炭酸水素ナトリウム溶液、および最後に水で洗浄する。硫酸マグネシウム上で乾燥した後、溶媒を留去し、残渣を、エチルエーテル／ペンタン５−９５を溶離液とするシリカ上のクロマトグラフィーによって精製する。収率：７５ないし９０％。 −酢酸４−ヨードフェニル：融点＝２７℃. ＩＲ（フィルム）：１７５５ｃｍ^-1. ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）：２.２８，ｓ，３Ｈ；６,８６，ｍ，２Ｈ；７８.６８，ｍ，２Ｈ． −酪酸４−ヨードフェニル：融点＝３４℃. ＩＲ（フィルム）：１７５５ｃｍ^-1. ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）：１.０３，ｔ，３Ｈ；１.７６，sex，２Ｈ；２.５２，ｔ，２Ｈ；６.８５，ｍ，２Ｈ；７.６７，ｍ，２Ｈ．実施例２：コハク酸モノ（４−ヨードフェニル）エステル（増幅剤Ｃ）の合成０.１０ｇナトリウム（４.５ｍｍｏｌ）を、撹拌しながら窒素雰囲気下にて２５ｍｌ無水エーテル中の１ｇ４−ヨードフェノール（４.５ｍｍｏｌ）の溶液に添加する。ナトリウムが消失した時に、ベンゼンに溶解した無水コハク酸０ .５ｇ（４.５ｍｍｏｌ）を添加する。混合物を室温にて２４時間撹拌する。ゼラチン状のナトリウム塩を濾去し、無水エーテルで洗浄し、次いで水に溶解する。０.５Ｍ塩酸で酸性化した後、該酸エステルをエーテルで抽出し、溶液を乾燥させる。０.５Ｍ塩酸で酸性化した後、該酸エステルをエーテルで抽出し、溶液を乾燥させる。溶媒の蒸留後、残渣をヘキサン／ベンゼンの混合液中で再結晶させる。得られた重量：０.４ｇ．融点＝１４５℃. ＩＲ（ＣＣｌ₄）：１７４５，１７０５^-1. ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）２.６ないし２.９，ｍ，４Ｈ；７.０，ｍ，２Ｈ；７.６８，ｍ，２Ｈ．実施例３：アジピン酸モノ（４−ヨードフェニル）エステル（増幅剤Ｄ）の合成アジピン酸（０.６６ｇ，４.５ｍｍｏｌ）、４−ヨードフェノール（１ｇ，４ .５ｍｍｏｌ）および１滴の９８％硫酸を２０ｍｌトルエンに添加する。該溶液を還流下にて加熱し、形成された水をディーンスターク（Dean-Stark）装置で除去する(２４時間)。トルエンの大部分を蒸留で除き、残った溶液を次いで５０ｍ１の激しく撹拌する飽和炭酸水素ナトリウム溶液に注ぎ込む。該水溶液をエーテルで２回抽出し、次いで１Ｍ塩酸でｐＨ４にまで酸性化する。該酸溶液をクロロホルム（２×５０ｍｌ）で抽出し、クロロホルム相を合し、乾燥する。溶媒の蒸留後、残渣をベンゼン／ヘキサンの混合液から再結晶する。得られた重量：０．３７ｇ．融点＝８９℃. ＩＲ（ＣＣｌ₄）：１７４５−１７０５ｃｍ^-1. ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）：１.６ないし１.８，ｍ，４Ｈ；２.４３，t，２Ｈ；２.５８，ｔ，２Ｈ；７.０６，ｍ，２Ｈ；７.６７，ｍ，２Ｈ．実施例４：ｐＨ＝８.６の緩衝溶液中での４−ヨードフェニルエステル（Ａ）および（Ｂ）の加水分解４.１操作法・トリス緩衝液０.１Ｍ−ｐＨ：８.６；・ルミノール：１.２ｍＭからなる試験溶液Ｓ１をまず調製する３Ｍ濃度の塩化カリウムからなる溶液Ｓ２も調製する。操作法：これらの溶液Ｓ₁およびＳ₂を、いくつかの濃度(conc.)にて実施例１からの増幅剤（ｅ）ＡおよびＢと混合し、分析前に４℃にて数日間保存する。ヨードフェノールおよびエステルの割合を、次いで気相クロマトグラフィー（ＧＰＣ）で決定する。このフェノール／エステル分析は以下に示すように行う。１０ｍｌの溶液、１ｍｇ／ｍｌ濃度のメタノール中チモール溶液１ｍｌおよび５０ｍｌエチルエーテルを撹拌する；５０ｇ硫酸ナトリウムを添加する。エーテル相を吸い出し、固体を５０ｍｌエーテルですすぐ；エーテル相を合し、次いで濃縮して約２ｍｌとする。０.５μｌをＧＰＣに注入する。４．２結果分析結果を以下の表１に示す。塩基性媒体中で、Ｓ₂のハロゲン化物またはハロゲン化物類およびアルカリ性硝酸塩はエステルの加水分解の速度を遅くすることが分かる。 III−化学ルミネセンス実施例５ないし９：ヨードフェノールのエステルにより増幅された化学ルミネセンス反応。０.１１２ｍｍｏｌのルミノールおよび０.０６８ｍｍｏｌの対照ヨードフェノール（実施例５）および種々の増幅剤（ｅ）（実施例１ないし３のＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）＝実施例６ないし９を１００ｍｌトリス緩衝液０.１ＭｐＨ８.６に添加する。溶液をその使用の数時間前に調製し、４℃にて保存する。２０ｍＭの１０μＬＨ₂Ｏ₂を０.９ｍｌのこの溶液０.９ｍｌに添加する。光の放出の最初の測定を行い、バックグラウンドノイズに対応させる。１０^-9ｇ／ｍｌの５０μｌペルオキシダーゼをこの同じチューブに添加し、光の放出を次いで測定した。これらの試験の結果を以下の表２に示す。実施例１０ないし１４：化学ルミネセンス反応の増幅に対するイオン強度の影響実施例５ないし９の手法を２Ｍ塩化カリウムの存在下にて繰り返す。これらの試験の結果を以下の表３に示す。実施例１５：種々の濃度におけるペルオキシダーゼを用いた増幅化学ルミネセンス反応の比較実験ヨードフェノールおよび酪酸ヨードフェノールＢのみを用いる以外は実施例５ないし８の手法を繰り返す。ペルオキシダーゼの濃度は、５０ないし５００ａｔｔｏｍｏｌ（１０^-12ｍｏｌ）を用いて減少させた。これらの試験の結果を添付の図１に示した。本発明の増幅剤（Ｂ）が対照ヨードフェニルよりも効率的であることは否定しがたいことが判明する。実施例１６：増幅された化学ルミネセンス反応の速度論的実験酪酸ヨードフェニル（実施例１の増幅剤Ｂ）のみを用いる以外は実施例５ないし９の方法を繰り返す。光の放出は２０秒毎に３時間測定した。これらの試験の結果を添付の図２に示す。実施例１７：ウエスタンブロット法による細胞蛋白質の検出に対する増幅された化学ルミネセンスの比較実験がん遺伝子c-metはヒト甲状腺乳頭状癌腫（B-CPAP）中の１９０ｋＤのヘテロ二量体蛋白質をコードする（C．Paulinら、イント・ジェイ・オンコロジー(Int. J．Oncology)7:657-660(1995))。これらの細胞を用いて、C．Pauloらによって記載された方法によりc-met蛋白質を検出する。以下の細胞蛋白質の全量を用いた:５０μｇ；４０μｇ；３０μｇ；２０μｇ；１０μｇ；５μｇ；２.５μｇおよび１μｇ。 Laemmli，ネイチャー(Nature)227、680(1970)によって記載されたポリアクリルアミドゲル電気泳動技術を用い、細胞蛋白質を分離し、それらをニトロセルロース膜に移した。該膜を次いで以下の条件下にて種々の試薬で処理する：膜の非特異的部位の、ＰＢＳ緩衝液中の５％スキムミルクでの３０分の飽和。ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ０.２％での洗浄およびペルオキシダーゼでマークしたヤギ・抗ウサギポリクローナル抗体との３７℃１時間のインキュベーション。ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ０.３％中で５分間洗浄を４回行った後、膜を、実施例５ないし９に記載される化学ルミネセンス試薬中に３分間浸漬する。該膜を次いで水を切り、引き続いてプラスチックフィルムで覆い、３０秒間ないし１時間の範囲の時間、Ｘ −線フィルムに暴露し、次いで現像する。より正確には、添付の図３は増幅剤Ｂでの、および対照増幅剤ヨードフェノールでの、細胞溶解物中のｃ−ｍｅｔ蛋白質（１４５ｋＤａ）のウエスタンブロッティングによる表示を示す。使用された化学ルミネセンス試薬は、実施例５ないし９で使用されたそれと同一である。この図３において、頂部長手方向端部の数は、各トラック中で沈積した細胞溶解物に含まれる蛋白質の全量（ＴＡＰ）に対応する。ＴＡＰはマイクログラム（ μｇ）単位で与えられる。ラインＴは対照ヨードフェノールに対応し、ラインＢは実施例１において合成された本発明による増幅剤（ｅ）に対応し、文字Ｂで示される。該増幅剤（Ｂ）で行われる試験に関しては、１μｇのＴＡＰのための表示およびＴＡＰ＝２.５μｇの明確な表示の開始が見いだされる。対照Ｔに対して、しかしながら、最初の検出は５のＴＡＰにおいてのみのように思われる。これは本発明によるシステムの非常な感度を示す。実施例１８ないし２０：ネズミ免疫グロブリンの検出のための抗マウス抗体に結合したペルオキシダーゼを用いた増幅化学ルミネセンスの比較実験。１ｍｇ／ｍｌのネズミ・免疫グロブリンの１００μｌの溶液（炭酸緩衝液５０ｍＭｐＨ８.５）をポリスチレン測定チューブに入れる。この溶液を次いで３７℃にて２時間インキュベートする。インキュベーション後、該チューブから液を除き、次いで５００μｌＴＲＩＳ−ＨＣｌ緩衝液５０ｍＭｐＨ８.５で洗浄する。ＣＯＶＡＬＡＢにより市販されている型のペルオキシダーゼでマークした１００μＬ抗−マウス抗体を、その上にネズミ・イムノグロブリンが固定されている洗浄したチューブに導入する。これらの１００μｌＡｂをＴＲＩＳ−ＨＣｌ緩衝液中で１／５０，０００に希釈する。このチューブを次いで３７℃にて１時間インキュベートする。２回の洗浄を前記で示したごとく行う。最後に、実施例１の増幅剤Ａまたは増幅剤Ｂを含む５００μｌの化学ルミネセンス試薬を次いで、ペルオキシダーゼでマークしたＡｇ（ネズミＩｇ）／Ａｂの複合体を含むチューブに導入する。この化学ルミネセンス試薬の組成は、前記の実施例５ないし９で用いられる試薬のそれと同一である。該チューブを振蓋させ、結果をフランス国のBertholdからのBiolumat LB 9500 luminometerの助けを借りて読む。３つの異なる試験を実施例１８ないし２０について行う：実施例１８：イオン強度無しの増幅剤Ｂ実施例１９：イオン強度有り（ＫＣｌ３Ｍ）での増幅剤Ｂ実施例２０：イオン強度有りまたは無し（ＫＣｌ１Ｍ）の増幅剤Ａ．２−結果：添付の図４、５および６は得られた結果を示す。図４および５は、増幅剤Ｂが対照ヨードフェノールによって誘導されたよりも少なくとも３倍大きい光の放出における増加を引き起こすことを明らかに示す。これらの結果により実施例５ないし９で得られたそれらが確認される。図６は、増幅剤Ａは、もしそれが＞１Ｍのイン強度が、ドープされた媒体中で使用されるとより効果的であることを示す。結論として、本発明による分析システムは、先行技術の製品よりも、実験された物質の良好な検出を可能とするように思われる(増幅剤＝ヨードフェノール)。これらの実施例１８ないし２０は、本発明による検出システムが、ＥＬＩＳＡタイプの技術により検出し得る物質の定量分析のためのシステムであるという事実を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者アンリ，ロベールフランス、エフ−69006リヨン、リュ・ドゥ・クレキ29番

Claims

【特許請求の範囲】１．増幅された化学ルミネセンスによる、物質、好ましくは生物学的物質の定性および／または定量分析のためのシステムであって、本質的に：ａ）分析されるべき物質または物質類とカップリングできる少なくとも１種のリガンド、ｂ）芳香族基に縮合した環状ジアシル化ジヒドラジド類のファミリーに属する少なくとも１種の化学ルミネセンス試薬、ｃ）少なくとも１種の酵素、ｄ）酵素（ｃ）に特異的であって、その影響のもとで、光の産生により試薬（ｂ）の酸化の少なくとも１種の開始剤に変換され得る少なくとも１種の酸化基質、ｅ）および少なくとも１種のルミネセンス反応増幅剤を含み、該増幅剤（ｅ）は、以下の一般式：［式中、 −Ｒ⁰は官能基を有するか有しない直鎖または分岐鎖のＣ₁−Ｃ₁₀基であり、Ｒ⁰は、好ましくは以下の基から選択され：１ｉ・直鎖または分岐鎖のＣ₁−Ｃ₁₀アルキル基、有利にはメチル、プロピル、ブチル、ペンチルまたはヘキシルに対応し；２ｉ・Ｃ₁−Ｃ₁₀アルキルカルボキシ置換基、有利にはアルキルモノカルボキシルに対応し、置換基マロニル、スクシニル、グルタリル、アジピル、ヘプタノイル、マレイルまたはフマリルが特に好ましくいアルキルモノカルボキシル類であり；３ｉ・アルキルアミンまたはアミノアルキルに対応するか；または４ｉ・アリール、アラルキルまたはアルキルアリール、好ましくはフェニルに対応し、＊または（ポリ）オルガノシロキサンおよび／または（ポリ）オルガノシロキサンの性質の基： −Ｒはハロゲン類（ヨウ素が特に選択される）、１ないし３０個の炭素原子を含む直鎖または分岐鎖のアルキル、Ｃ₁−Ｃ₃₀アリールまたはＣ₁−Ｃ₃₀アラルキルまたはアルキルアリール類よりなる群から選択される基であり；ハロゲン類、フェニル類、フタレート類および以下の基が特に適合し、ここにＹは−ＣＨ₂−、−Ｏ−または−Ｎ＝Ｎ−を表して、Ｖは水素を表し、あるいはＹは−Ｏ−、−Ｓ−または−Ｓ−Ｓ−を表しＶはヒドロキシルを表し；ここにＷは水素またはカルボキシルを表し； −ＣＨ＝ＣＨ−Ｚ、Ｚはカルボキシルまたは２,４−ジニトロフェニルを表し；ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＯＯＣ₂Ｈ₂；またはＣ₁−Ｃ₆アルキル； −Ａは水素を表し、ＢはハロゲンまたはＣ₁−Ｃ₆アルキルを表して、Ｒはハロゲンを表し； −Ａはハロゲンを表し；Ｂは水素を表して、Ｒはハロゲンまたはフェニルを表し、 −あるいは式中、Ａは水素またはハロゲンを表して、ＲおよびＢは一緒になって鎖を表し、これは、ＲからＢの方向で読んで、式：を有するナフタレン核を完成し、ここにＸは、式（Ｉ）の化合物が式：のベーターナフトールとなるように、水素またはハロゲンを表し、 −Ｒ⁰、Ｒ、ＡおよびＢは置換または非置換である］に対応するという特徴を有し、および・−ＯＲ⁰中の酸素およびＲ⁰の間の結合の分解を可能とする加水分解酵素を含まないという特徴を有するタイプの該システム。２．増幅剤（ｅ）の式（Ｉ）において増幅剤（ｅ）の非加水分解エステル：の含量が好ましくは４０％重量より大きいかまたは等しく、好ましくは６０％重量であり、より好ましくは９０％重量であることを特徴とする請求項１記載のシステム。３．増幅剤（ｅ）が、式Ｉ：［式中、］で示される少なくとも２種のエステルの混合物を含むことを特徴とする請求項２記載のシステム。４．・これらのエステルの少なくとも１種が好ましくは請求項１に定義される基類（ｉ）、（２ｉ）、および（３ｉ）から選択される置換基Ｒ¹を含み、および・これらのエステルの少なくとも１種が請求項１に定義される基類（４ｉ）から選択される置換基Ｒ¹によって区別されることを特徴とする請求項５記載のシステム。５．リガンド（ａ）が、カップリングできる物質の以下の：・抗原／抗体、・酵素／基質、酵素／阻害剤、・レセプター／リガンド、・レクチン／糖、・核酸／相補的核酸の要素のうち少なくとも１つを含む請求項１ないし４のいずれか１項記載のシステム。６．化学ルミネセンス試薬（ｂ）が、以下の一般式（２）：［式中： −Ｒ⁴は置換または非置換のアミン基を表し、基類Ｒ⁵、Ｒ⁶およびＲ⁷の各々がＨ、置換または非置換Ｃ₁−Ｃ₆アルキル、置換または非置換Ｃ₁−Ｃ₆アルケニル、ヒドロキシル、Ｃ₁−Ｃ₆アルコキシ、置換または非置換カルボキシルあるいは置換または非置換アミン基を表し、 −あるいはＲ⁵は置換または非置換アミン基を表し、基類Ｒ⁴、Ｒ⁶およびＲ⁷の各々はＨ、置換または非置換Ｃ₁−Ｃ₆アルキル、置換または非置換Ｃ₁−Ｃ₆アルケニル、ヒドロキシ、アルコキシ、置換または非置換カルボキシルまたは置換もしくは非置換アミン基を表し、 −あるいはＲ⁴およびＲ⁵は一緒になってベンゾ基によって置換されないかまたは置換されたアミノ誘導体を表し、基類Ｒ⁶およびＲ⁷の各々はＨ、置換または非置換Ｃ₁−Ｃ₆アルキル、置換または非置換Ｃ₁−Ｃ₆アルケニル、ヒドロキシル、アルコキシ、置換または非置換カルボキシルあるいは置換または非置換アミン基をで表す］で示される化学ルミネセンス性の２,３−ジヒドロ−１,４−フタラジンジオンであり、ルミノールおよびイソルミノールは特に好ましいことを特徴とする、請求項１ないし５のいずれか１項記載のシステム。７．化学ルミネセンス酵素（ｃ）が、オキシドレダクターゼ類から選択され、キサンチンオキシダーゼが有利に採用され、好ましくは以下のペルオキシダーゼ類：セイヨウワサビペルオキシダーゼ、マイクロペルオキシダーゼ、微生物アルスロミセス・ラモスス(Arthromyces ramosus)から抽出されたペルオキシダーゼおよびラクトペルオキシダーゼから選択され、セイヨウワサビペルオキシダーゼおよびマイクロペルオキシダーゼが特に好ましいことを特徴とする請求項１ないし６いずれか１項記載のシステム。８．物質（ｄ）が、好ましくは過酸または過酸化物の形態の酸化剤であり、より好ましくは過酸化水素および／または過ホウ酸アルカリ金属または過ホウ酸アルカリ土類金属の形態の酸化剤であることを特徴とする請求項１ないし７いずれか１項記載のシステム。９．その構成成分（ｂ）ないし（ｅ）のうち少なくとも１つ、そして最大で３つが、リガンド（ａ）に結合され（あるいは担持され）、他の構成成分または構成成分（類）が分析媒体の中に含まれることを特徴とする請求項１ないし８いずれか１項記載のシステム。１０．少なくとも１種のｐＨ調整剤および／または塩、好ましくはアルカリ金属および／またはアルカリ土類金属のハロゲン化物（有利には塩化物）（ＫＣｌ、ＫＢｒ、ＮａＣｌおよびＣａＣｌ₂が特に好ましい）から選択されるイオン強度の少なくとも１種の調整剤を含む溶液と組み合わせたことを特徴とする請求項１ないし９いずれか１一項記載のシステム。１１．イオン強度の調整剤を、０.１Ｍないし飽和、好ましくは０.１ないし３Ｍの量で存在させたことを特徴とする請求項１０記載のシステム。１２．請求項１ないし１１のいずれか１項記載のシステムを用いることを特徴とする増幅された化学ルミネセンスによる、物質、好ましくは生物学的物質の定性および／または定量分析法。１３．請求項１ないし１１のいずれか１項記載のシステムを含むことを特徴とする、増幅された化学ルミネセンスによる、物質、好ましくは生物学的物質の定性および／または定量分析のためのキット。１４．分析されるべき物質が、好ましくは、以下のリスト： −全体または分割可能なミクロ滴定プレート、 −合成ポリマーまたはガラスの試験管、 −生物学的ポリマー、 −免疫組織学的切片、 −膜、 −ビーズから選択される固体支持体上またはその中に含まれ、または、分析媒体の一部を形成する、溶液、エマルジョンまたは分散液タイプの液体媒体中に含まれることを特徴とする、請求項１ないし１１いずれか１項記載のシステム、請求項１２記載の方法および請求項１３記載のキット。