WO1997011092A1

WO1997011092A1 - Derives de phosphates de cyclosporine et composition medicinale

Info

Publication number: WO1997011092A1
Application number: PCT/JP1995/001906
Authority: WO
Inventors: Kiyotaka Konno; Takashi Seto; Hiroto Yoshifusa; Yoji Ezure
Original assignee: Nippon Shinyaku Co., Ltd.
Priority date: 1994-04-07
Filing date: 1995-09-21
Publication date: 1997-03-27
Also published as: EP0852233A1; EP0852233A4

Description

明細害

シクロスボリン類のリン酸エステル誘導体及び医薬組成物

技術分野

本発明は、シクロスボリン類のリン酸エステル誘導体に Mするものである。詳しくは、医薬、特に免疫抑制剤として有用なシクロスポリン類のリン酸エステル誘導体に Mするものである。

背景技術

シクロスボリン類は、トリポクラジウム · インフラ一タム（

Tolypocladium in latum) などの糸伏菌によって逢生される 11個のァミノ酸から構成される環状べプチドである。シクロスボリン類は、リンパ球に対し、特異的かつ可逆的に作用し、強力な免疫抑制作用、抗炎症作用を有するものが多い。これらの薬理活性については、これまでに多数の幸 R告がある（例えば、 R.Y.Calne, Trend in

Pharmaceutical Sciences：【mmunosupressi vein Clinical Organ Grafting. 1巻（ 1979年） 21-22 頁、 R. Y. Calne. Nephron. 26卷

( 1980年〉 57-63頁など）。

シクロスボリン類は、メルク，インデックスにも収載されている化合物であり、これまで多くの化合物が知られている。例えば、

「R. M. Wengerら著、 Progress in the Chemistry of Organic

Natural Products, 50巻、 157 頁、 Springer-Verlag 社発刊、 W. Herzら編集 j には、真菌類が生逢するシクロスボリン類の一 K表が記載されている。これを次に示す。

表中、最上 fflの 1 から 1 1の番号は、上記シクロスポリン Aの構造式に付されている番号に対応するアミノ酸の位 S番号を意味し、縱に並んでいる Aから Zまでの記号はシクロスボリン類の種類を意味する。また、 MeBmt は構造式（ Π〕で示される Ν-メチル _(4R)-4-ブ夕- 2B-ェン -1- ィル -4- メチル -α)トレオニン又は構造式（m〕で示される〔E〕のジヒドロ体を、 DeoxyBmtは N-メチル -(4R)-4-ブ夕 -2E-ェン -1- ィル -4- メチル -(L)- な- アミノ »黢を、 Brot は（4R) -4- ブタ -2B-ェン-卜ィル -4- メチル-（ぃトレオニンを、 *は N-メチル -2- アミノォクタノン酸を、 Sar はザルコシン（sarcosine 、 N-メチル-いグリシン）を、 Abu は a - ァミノ »酸 (L-a- aminobutylic acid ) を、 Ala はァラニンを、 Leu はロイシンを、 MeLeu は N-メチル-し- ロイシン（N-methy卜い leucine) を、 MeVal は N-メチル-し- バリン（N-methy卜 L-leucine) を、 Nva はノルバリンを、 Thr はトレオニンを、 Val はバリンを、接頭きの D はり型を、接頭箱の L はし型を、それぞれ表す。

〔I〕 CI)

8位に D-セリンを S换したシクロスボリン類も知られている（ R. Traber ら、 J. Antibiot.. 42巻、 591-597 頁、 1989年）。 2位が 3-ヒドロキシノルバリン、 4-ヒドロキシノルバリンなどに置換されたシクロスポリンも報告されている（C. Papageogiou et al 、

Bioorganic & Medical Chemistry Letters^ 13巻、 2529-2564 頁、 1993年) o

更に、特開昭 52-59180号公報、特開昭 56-128725 号公報、特開昭 57-140753 号公報、特開昭 60-215700 号公報、特開昭 61-212599 号公報、特開昭 62-77399号公報、特開平 2-137 号公報などにもシクロスボリン類が開示されている。

シクロスボリン類は免疫抑制作用等を有することから、種々のシクロスボリン類を含有する医薬組成物が提案されている（特表平 5- 500964号公報、特表平 5-503306号公報、特開平 5-208996号公報、特開平 5-310591号公報、特表平 5-507903号公 «など）。実際にシクロスポリン Aについては、カブセル、内用液、注射液の剤型で市阪されている。

しかしながら、これまで知られているシクロスボリン類は、難水溶性であり、賢毒性があり、綞ロ投与した場合には吸収率が良くないという题点などが報告されている（シクロスボリン Aの副作用 Iこつヽて、 M. J.Mihatsch et al, Toxicology Letters. 6^. 125- 139 頁. 1989年、 B. Ryffel. Arch Toxicology. 53巻. 107-141 頁， 1983年など) o

ところで、シクロスボリン類がリン酸エステル化された化合物及びそれを含有する医薬組成物は知られていない。そればかりかボリペプチドをリン酸エステル化することによって、水溶性を高め、吸収性を向上させると共に、 g毒性の柽減をもたらした例も見当たらない。発明の開示

本発明の目的は、水溶性及び経口投与した場合の吸収性が高く、かつ胥毒性が低い新規なシクロスボリン類及びそれを含有する医薬組成物を提供することにある。

本発明は、水酸基を有するアミノ酸を構成要素とするシクロスポリン類において、該水酸基の全部又は一部がリン酸エステル（ -P(0) (0H) ,) 化されているシクロスボリン類のリン ¾エステル誘導体若しくはその塩、又はそれらの溶媒和物（水和物を含む）である。本発明は、水酸基を有するァミノ酸を構成要素とするシクロスボリン類の水酸基の全部又は一部がリン酸エステル化されているところに特 aを有する。

水酸基を有するァミノ酸を構成要素とするシクロスボリン類としては、例えば、次の構造式〔 I〕で表される化合物若しくはその、又はそれらの溶媒和物（水和物を含む。以下これらを「本発明化合物 J という）を挙げることができる。厂 MeBmt

_Α · -Α,'

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

( I )

ここで、 A ,は D-若しくはい a —アミノ酸酸、 D-若しくはいァラニン、 D-若しくはいトレォニン、 D-若しくはいバリン、 D-若しくはい 3-ヒドロキシノルバリン又は D-若しくはい 4-ヒドロキシノルバリンを表し、は D-若しくはい N-メチルロイシン、 D-若しくはい口イシン又は D-若しくはいバリンを表し、 A,は D-若しくはいバリン又は D- 若しくはいノルバリンを表し、 A«は D-若しくはし-口イシン又は D-若しくは L-メチルロイシンを表し、 A ,は D-若しくは L-ァラニン又は D- 若しくはい α —ァミノ酪酸を表し、 Α·は D-若しくはいァラニン又は D-若しくはいセリンを表し、 Α₇は D-若しくはいメチルロイシン又は D-若しくはいロイシンを表し、 Α,は D-若しくは L-メチルロイシン又は D-若しくはいロイシンを表し、 Α,は D-若しくはレバリン又は D-若しくはいメチルバリンを表す。 MeBmt 、 Sar は、前記と同じである。

1-Πの番号は、アミノ酸の位匱略称のための番号を表す。

この中、 A ,がいトレォニンであるもの、又は A,が D-セリンであるものが好ましい。また、〔トレオニン，〕シクロスポリン八、 ( 4- ヒドロキシノルバリン * 〕シクロスボリン A、〔D-セリン * 〕シクロスボリン A又は〔トレオニン¹ 、 D-セリン * 〕シクロスポリン A であるものが好ましい。

ここで、本発明に係るシクロスボリン類の命名方法について説明する。

Φ特に D-の記载のないァミノ酸は、全ていァミノ酸を意味するものとする。

②シクロスボリン Aを基準にとり、シクロスボリン Aと異なるアミノ酸を有するシクロスボリンに対し、異なるアミノ酸の種類と S換した位置を次のように示す。例えば、〔トレオニン》〕シクロスボリン A、〔トレオニン 2 、 D-セリン ¹ 〕シクロスボリン Aにおいて、前者はシクロスボリン Aの 2位のアミノ酸がトレォニンに a換したシクロスボリン Aを、後者はシクロスポリン Aの 2位のアミノ酸がトレォニンに且つ 8位のアミノ酸が D-セリンに換したシクロスボリン Aを意味するものとする。また、〔フォスフオノトレオニン：〕シクロスボリン A、〔フォスフオノ - D- セリン，〕シクロスポリン Aにおいては、前者はシクロスポリン Aの 2位のアミノ酸がいトレオニンに S換し且つそのいトレオニンの水酸基がリン酸エステル化された化合物を、後者はシクロスボリン Aの 8位のアミノ酸が D- セリンに ϋ換し且つその D-セリンの水酸基がリン酸エステル化された化合物を意味するものとする（アミノ酸の位 Sについては、構造式〔 I 〕を参照）。また、〔フォスフオノ - D- セリン ' 〕シクロスボリン Α ニナトリウム塩は、〔フォスフオノ - D- セリン · 〕シクロスボリン Aのリン酸基がニナトリゥム坦となった化合物を意味するものとする。

本発明化合物のいくつかを以下に挙げる。本発明化合物はこれらに限定されるものではない

フォスフオノトレオニンシクロスボリン A、

フォスフオノトレオニンシクロスボリン A —ナトリゥム ¾、フォスフオノトレオニンシクロスボリン A ニナトリウム t &、フォスフオノトレオニンシクロスボリン A 二カリゥム堪、フォスフオノ - D- セリンシクロスボリン A、

フォスフオノ - D- セリンシクロスボリン A —ナトリウム塩、フォスフオノ - D- セリンシクロスボリン A ニナトリゥム塩、フォスフオノ - D- セリンシクロスボリン A 二カリウム塩、フォスフオノ - D- セリンシクロスボリン A 二べンジルアミン塩、 (：フォスフオノトレオニン》、フォスフオノ - D- セリン，〕シクロスボリン A、

(フォスフオノトレオニン 2 、フォスフオノ - D- セリン ' 〕シクロスポリン A ニナトリウム埴、

〔フォスフオノトレオニン i 、フォスフオノ - D- セリン ' 〕シクロスボリン A 四ナトリウム埴、

(フォスフオノトレオニン ^a 、フォスフオノ - D- セリン ' 〕シクロスボリン A 四カリウム塩、

〔フォスフオノ - D- トレオニン ¹ シクロスボリン A、

(フォスフオノ - D- トレオニン 1 シクロスポリン A ニナトリゥム埴、

(フォスフオノ - D- トレオニン ¹ シクロスポリン A 二カリウム堪、

(フォスフオノ - D- トレオニン ¹ シクロスボリン B、

(フォスフオノ - D- トレオニン ¹ シクロスボリン B ニナトリゥム埴、

〔フォスフオノ - D- トレオニンシクロスボリン B 二カリウム坩、

〔フォスフオノ - D- トレオニンシクロスボリン：、

(フォスフオノ - D- トレオニンシクロスボリン C ニナトリゥム塩、

〔フォスフオノ - D- トレオニンシクロスポリン C 二カリウム堪、

〔フォスフオノ - D- トレオニンシクロスボリン D、〔フォスフオノ - D- トレオニンシクロスボリン D ニナトリゥム、

〔フォスフオノ - D- トレオニンシクロスボリン D 二カリウム i]Si、

〔フォスフオノ - D- トレオニンシクロスボリン Ε、

〔フォスフオノ - D- トレオニンシクロスボリン Ε ニナトリゥム塩、

〔フォスフオノ - D- トレォニンシクロスボリン Ε 二カリウム塩、

〔フォスフオノ - D- トレオニンシクロスボリン F、

〔フォスフオノ - D- トレオニンシクロスボリン F ニナトリゥム¾、

〔フォスフオノ - D- トレオニンシクロスボリン F 二カリウム塩、

〔フォスフオノ - D- トレオニンシク αスボリン G、

(フォスフオノ - D- トレオニンシクロスボ |J ン G ニナトリゥム堪、

(フォスフオノ - D- トレオニンシクロスボ |J ン G 二カリウム坦、

(フォスフオノ - D- トレオニンシクロスボリン

〔フォスフオノ - D- トレオニンシクロスボリン H ニナトリゥム埴、

〔フォスフオノ - D- トレオニン，〕シクロスボリン H 二カリウム塩、 (フォスフオノ - D- トレォニン ¹ シクロスボン I、〔フォスフオノ - D- トレオニン ¹ シクロスボン I ニナトリゥム ½、

〔フォスフオノ - D- トレオニン ¹ シクロスボン I 二カリウム塩、

〔フォスフオノ - D- トレオニン ¹ シクロスボン

〔フォスフオノ - D- トレオニン ¹ シクロスボリン Κ ニナトリゥム塩、

〔フォスフオノ - D- トレオニン¹ シクロスボリン Κ 二カリウム埴、

〔フォスフオノ - D- トレォニン¹ シクロスボ J ンし、

〔フォスフオノ - D- トレオニン¹ シクロスボリン L ニナトリゥム¾、

〔フォスフオノ - D- トレオニンシク αスボリン L 二カリウム埴、

(フォスフオノ - D- トレオニンシクロスボリン

(フォスフオノ - D- トレオニンシクロスボリン M ニナトリゥム埴、

〔フォスフオノ - D- トレォニンシクロスボリン M 二カリウム塩、

(フォスフオノ - D- トレォニンシクロスボリン 0、

(フォスフオノ - D- トレオニンシクロスボリン 0 ニナトリゥム塩、

〔フォスフオノ - D- トレオニン ' 〕シクロスボリン 0 二カリウム坩、

〔フォスフオノ - D- トレオニンシクロスボリン P、

〔フォスフオノ - D- トレオニンシクロスボリン P ニナトリゥム也、

〔フォスフオノ - D- トレオニンシクロスボリン P 二カリウム埴、

(フォスフオノ - D- トレオニンシクロスボリン Q、

〔フォスフオノ - D- トレオニンシクロスボリン Q ニナトリゥム堪、

〔フォスフオノ - D- トレオニンシクロスボリン Q 二カリウム埴、

(フォスフオノ - D- トレォニンシクロスボリン

〔フォスフオノ - D- トレオニンシクロスポリン R ニナトリゥム坦、

(フォスフオノ - D- トレオニンシクロスボリン R 二カリウム坦、

(フォスフォノ -D- トレオニンシクロスボリン S、

(フォスフォノトレオニンシクロスボリン S ニナトリゥム埴、

〔フォスフオノ - D- トレオニンシクロスポリン S 二カリウム堪、

(フォスフォノ -D- トレォニンシクロスボ Iン1\

(フォスフォノ -D- トレォニンシクロスボリン T ニナトリゥム、〔フォスフオノ - D- トレオニン * 〕シクロスボリン丁二カリウム坦、

〔フォスフオノ - D- トレオニン ¹ シクロスボン U、

〔フォスフオノ - D- トレオニン ¹ シクロスボリン U ニナトリゥム塩、

〔フォスフオノ - D- トレオニン ¹ シクロスボン U 二カリウム也、

〔フォスフオノ - D- トレオニン ¹ シクロスボン V、

〔フォスフオノ - D- トレオニン' シクロスボン V ニナトリゥム埴、

〔フォスフオノ - D- トレオニン ¹ シクロスボリン V 二カリウム塩、

〔フォスフオノ - D- トレオニンシクロスボ

(フォスフオノ - D- トレオニンシクロスボリン W ニナトリゥム埴、

(フォスフオノ - D- トレオニンシクロスボリン W 二カリウム埴、

(フォスフオノ - D- トレオニンシクロスポリン X、

〔フォスフオノ - D- トレォニンシクロスボリン X ニナトリゥム坦、

〔フォスフオノ - D- トレォニンシクロスボリン X 二カリウム塩、

〔フォスフオノ - D- トレオニンシクロスボリン Y、

〔フォスフオノ - D- トレオニンシクロスボ J ン Υ ニナトリゥム坦、

〔フォスフオノ D- トレォニン i 〕シクロスボリン Y 二カリウム埴、

(フォスフオノ - D- トレオニン · 〕シクロスボリン、

〔フォスフオノ - D- トレォニン，〕シクロスボリン Z ニナトリゥム埴、

〔フォスフオノ - D- トレオニン ¹ 〕シクロスボリン Z 二カリウム塩、

〔フォスフオノ - D- トレオニン，、フォスフオノトレオニン》〕シクロスボリン A、

〔フォスフオノ - D- トレォニン，、フォスフオノトレオニン，〕シクロスボリン A ニナトリゥム塩、

〔フォスフオノ - D- トレオニン，、フォスフオノトレオニン，〕シクロスポリン A 二カリウム坩、

〔フォスフオノヒドロキシノルバリン，〕シクロスボリン A、

〔フォスフオノヒドロキシノルバリン》〕シクロスボリン A ニナトリゥム塩、

〔フォスフオノヒドロキシノルバリン，〕シクロスポリン A 二力リゥ厶坦、

〔フォスフオノヒドロキシノルバリン、フォスフオノ - D- セリン ¹ 〕シクロスボリン A、

〔フォスフオノヒドロキシノルバリン 1 、フォスフオノ - D- セリン ¹ 〕シクロスボリン A ニナトリウム塩、

〔フォスフオノヒドロキシノルバリン ² 、フォスフオノ - D- セリン ¹ 〕シクロスボリン A 二カリウム塩。

この中、〔フォスフオノ - D- セリン ' 〕シクロスボリン A ニナトリゥム塩が好ましい。

発明を実施するための最良の形

次に本発明化合物の製造方法について説明する。

本発明化合物の合成原料となる各種のシクロスボリン類は、これまでに知られている公知の方法を用いて合成することができる。その方法が記載されている文献としては、例えば、特開昭 52-591 80号公報、特開昭 56- 128725 号公報、特開昭 57- 140753 号公報、特開昭 60-215700 号公報、特開昭 61 -212599 号公報、特開昭 62-77399号公報、特開平 2- 1 37 号公報及びその他前記した文献などを举げることができる。

リン酸エステル化の反応も公知の方法で行なうことができる。例えば、リン酸化剤としては、酸クロリド型リン醵化剤（ォキシ埴化リン、フエニルリン酸ジクロリド、ジフ tニルリン酸クロリド、ジベンジルリン酸クロリド、二トロフエニルリン酸ジクロリド、ジモルフォリノリン酸クロリド、ビス（ 9 . β , 9一トリクロロェチル）リン黢、 Ρ -ジフニル - ρ' -モルホリノビ口リン酸クロリドなど ) を用いる方法、酸無水物型リン酸化剤（0-ベンジル亜リン酸 0- ジフニルリン酸無水物、テトラ（パラニトロフニル）ピロリン酸、テトラクロ口ピロリン酸、ジフニルリン酸無水物、など）を用いる方法、イミドイルリン酸を中間体とする方法（ )9ーシァノエチルリン酸とジシクロへキシルカルポジイミド、モノべンジルリン酸とジシクロへキシルカルポジイミドなど）、三塩化リン、トリス ( 8-キノリル）リン酸、 2- ( N. N-ジメチルァミノ） -4- ニトロフエニルリン酸などのその他のリン酸化剂を用いる方法などである。溶媒としては、ピリジン、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、クロ口ホルム、メチレンクロリド、メタノール、エタノールなどである。ピリジン以外の溶媒を用いた時は、ピリジン、 2. 6-ジメチルビリジンなどの適当な塩基を加えても良い。反応温度は、通常、 0-100 でであるが、必要に応じて更に冷却または加温して行なうこともできる。反応時間は、通常、数時間- 数日である。以上の方法でリン酸エステル化した後、本発明の化合物を得るためには、使用したリン酸化剤に応じて、保 »基を脱 «すれば良い。これも公知の方法、例えば、酸またはアルカリによる加水分解、接触 ¾元などで行なうことができる。

反応液からの回収、精製、単 «には、シクロスポリンにおいて、これまでに用いられて来た公知の方法が応用できる（特開昭 55- 55150 号公報、特開昭 57-140753 号公報、特開昭 62-77399号公報など）。更に、本発明の化合物においては、リン酸基に着目した情製方法も非常に有利に適用できる。例えば、低 pHにおける酢酸ェチル、 tt¾プチル、クロ口ホルム、堪化メチレン、 n-ブ夕ノールなどでの溶媒抽出およびその溶媒層から高 pHでの水層への転溶：活性炭、ァンバーライト XAD (ローム ' アンド ·ハース社製）、ダイアイオン HP- 20 (三菱化成社製）などによる吸着とメタノール水、ァセトン水などによる溶出：ダウエックス 1 X 2 (ダウケミカル社製）、 QAB-セフアデックス A-25 (フアルマシア社製）、 DEAE -セルローズヮットマン DE-32 (ヮットマン社製）、 DEAE- セフアツデックス A- 25 (フアルマシア社 K ) などのイオン交換樹脂による吸着及び溶出：セフアデックス G- 10 (フアルマシア社製）、バイオ · ゲル Ρ-20 (バィオラッド社製）などによるゲルろ a ：セルロース、アビセル SP ( アメリカン · ピスコース社製）などのカラムクロマトグラフィー；ァセトンなどの溶剤添加による強制沈》法；凍結乾燥法などをそれぞれ単独で或いは適宜組み合わせて、更に場合によっては、反復して使用される。

本発明化合物はリン酸基の塩の形 »をとることができ、かかる埴は、公知の方法により得ることができ、例えば、遊離の本発明化合物に水酸化ナトリウム等の水酸化物を加え、擾拌処理することにより得ることができる。当眩埴の例としては、例えば、ナトリウム埴、カリウム ¾、リチウム坩のようなアルカリ金属坦：カルシウム堪、マグネシウム坦のようなアルカリ土親金堪；アルミニウム埴のようなその他の金厲塩；アンモニゥム坦、モノェチルァミン、ジメチルァミン、トリメチルァミン、モノエタノールァミン、ジェ夕ノールァミンのような第一极、第二极又は第三极ァミンによる堪；ベンザチン、ブロカイン、ベンジルァミン、ジベンジルァミン、 N-ベンジル- β - フ Xネチルァミン、レエフ： tナミン、 Ν. Ν' - ジベンジルエチレンジァミン、デヒドロアビエチルァミン、 Ν-ェチルビベリジン、ジシクロへキシルアミンなどの有機塩基による塩等が含まれ、中でも生理学的に許容しうる ¾が好ましく、特に、ナトリウム ¾、力リゥム塩などが好適である。

本発明化合物は、一般に遊離型の化合物よりも塩の形の方が、水溶性が高い。従って、医薬用途に使用する場合、その用途にじて ¾の形の化合物を選択することが好ましい。

また、本発明化合物は、水和物を含む溶媒和物の形 S8をとることもできる。当該水和物等は、主に本発明化合物の合成，精製過程において生じ、そのまま単雜することができる。当該溶媒和物は、遊 tt型本発明化合物の溶媒和物であっても、塩型の本発明化合物の溶媒和物であってもよい。

本発明化合物は、結晶多形をとる場合がある。この場合も本発明化合物に含まれる。

本発明化合物は、基本的に既存のシクロスボリン類のリン酸エステル体であるから、既存のシクロスボリンが持つ効能を有する。特に、本発明化合物は免疫不全に起因する各種疾患及びそれらの疾患の治麽薬として有用である。

具体的には、本発明化合物は胥移植における拒否反応の抑制、骨 a移植における拒否反応及び移植片対宿主病の抑制、ペーチ：ト病 (眼症状のある場合）、肝移 ttにおける拒否反応の抑制、專常性乾せん、讓泡性乾せん、乾せん性杠皮症、閟節症性乾せんなどの治療 ¾として、また内因性プドウ «炎、角 «移植、春季角結腠炎、木質角結胰炎、乾燥眼症候群、前部プドウ膜炎、オンコセルカ症などの眼疾患などの治療薬、心班、肺 «、 n 、皮膚および角膜における移植された臓器の排除防止、リューマチ性 M節炎、真性糖尿病 I、全身性紅班性郎¾そう、かん皮症、ゥェグナ一氏肉芽臛症、好酸球性筋胰炎、原発性シローシス、グレーブス病、およびクローン病のような各種自己免疫疾患及び重症筋無力症、多発性硬化症などの治麽薬として有用である。エイズ又はエイズ M連疾患の処8、アトピ一性皮 If炎、ァレルギ一性接触皮膚炎などの疾患に対しても有用である。更に、ネフローゼ症候群（頻回再発型、ステロイド抵抗性）、再生不良性貧血、赤芽球ろうなど基本的に免疫不全に起因する各種疾患の治療薬としても有用である。

本発明化合物を医薬として投与する場合、本発明化合物はそのまま又は医薬的に許容される無毒性かつ不活性の担体中に、例えば

0. 01 ¾〜99. 59ί、好ましくは 0. 5¾〜90 ¾含有する医薬組成物として、人を含む動物に投与することができる。

以下、本発明化合物に係る医薬組成物（以下「本発明組成物 j という）について説明する。

担体としては、固形、半固形、又は液状の希釈剤、充填剤、及びその他の処方用の助剤一種以上が用いられる。本発明組成物は、投与単位形 «で投与することが望ましい。本発明組成物は、経口投与、組織内投与、局所投与（経皮投与、点眼、綞鼻等）又は柽直 AS的に投与することができる。これらの投与方法に適した剤型で投与されるのはもちろんである。例えば、経口投与及び組織内投与、特に経口投与が好ましい。経口投与が好ましいのは、本発明化合物の特徴の一つである。

免疫抑制剤としての本発明化合物の用量は、年齢、体重、等の患者の状 »、投与経路、病気の性 Kと程度等を考慮した上で調整することか望ましいが、通常は、成人に対して本発明の有効成分量として、 1 日あたり、 5 rog〜 I 日/ヒトの ¾囲が、好ましくは、 10 mg〜100mg ノ日ノヒトの範囲が ¾当である。場合によっては、これ以下でも足りるし、また逆にこれ以上の用量を必要とすることもある。また 1 日 2〜 3回に分割して投与することもできる。経口投与は固形又は液状の用量単位、例えば、末剤、カブセル剂、锭剤、糖衣剤、顆拉剤、散剤、懸菊剤、液剤、シロップ剤、ドロッブ剤、舌下锭その他の剤型によって行うことができる。

末剤は本発明化合物を適当な細かさにすることにより製造される。敢剤は本発明化合物を適当な細かさと成し、ついで同様に細かくした医薬用担体、例えば »粉、マンニトールのような可食性炭水化物その他と混合することにより製造される。必要に応じ風味剤、保存剤、分散剤、着色剤、香料その他のものを混じてもよい。

カブセル剤は、まず上述のようにして粉末状となつた末剤ゃ敢剤あるいはお剤の項で述べるように顆粒化したものを、例えばゼラチンカプセルのようなカプセル外皮の中へ充«することにより製造される。滑沢剤や流動化剂、例えばコロイド状のシリカ、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、固形のボリエチレングリコールのようなものを粉末状 |»のものに混合し、然るのちに充«操作を行うこともできる。崩壞剤ゃ可溶化剤、例えばカルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、低置换度ヒドロキシブ口ビルセルロース、クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウム、垅酸カルシウム、拔酸ナトリウム、を添加すれば、カブセル剤が摂取されたときの医薬の有効性を改善することができる。

また、本発明化合物の微粉末を植物油、ボリエチレングリコール、グリセリン、界面活性剤中に « ¾分敗し、これをゼラチンシートで包んで軟カブセル剤とすることができる。锭剤は陚形剤を加えて粉末混合物を作り、顆粒化もしくはスラグ化し、ついで崩壊剤又は滑沢剤を加えたのち打锭することにより製造される。粉末混合物は、適当に粉末化された物質を上述の希釈剤やベースと混合し、必要に応じ結合剤（例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシブ口ビルメチルセルロース、ゼラチン、ボリビュルピロリドン、ボリビュルアルコールなど）、溶解運延化剤（例えば、パラフィンなど〉、再吸収剤（例えば、四极塩）や吸着剤（例えばベントナイト、カオリン、リン酸ジカルシウムなど）をも併用してもよい。扮末混合物は、まず結合剤、例えばシロップ、 «粉糊、アラビアゴム、セルロース ¾液又は高分子物質溶液で湿らせ、 «拌混合し、これを乾燥、粉砕して顆拉とすることができる。このように扮末を顆拉化するかわりに、まず打錠機にかけたのち、得られる不完全な形 1»のスラグを破砕して頼泣にすることも可能である。

このようにして作られる顆拉は、滑沢剤としてステアリン酸、ステアリン酸埴、タルク、ミネラルオイルその他を添加することにより、互いに付着することを防ぐことができる。このように滑沢化された混合物をついで打 a [する。こうして製造した素绽にフイルムコ一ティングゃ糖衣を施すことができる。

また本発明化合物は、上述のように顆拉化ゃスラグ化の工程を経ることなく、流動性の不活性担体と混合したのちに直接打锭してもよい。シ Xラックの密閉被 κからなる透明又は半透明の保護被覆、糖や高分子材料の被覆、及び、ワックスよりなる e上被覆の如きも用いうる。他の経口投与剤型、例えば溶液、シロップ、トローチ、エリキシルなどもまたその一定量が本発明化合物の一定 iを含有するように用量単位形想にすることができる。シロップは、本発明化合物を適当な香味水溶液に溶解して製造され、またェリキシルは非毒性のァルコール性担体を用いることにより製造される。懸溷剤は、本発明化合物を非毒性担体中に分敗させることにより処方される。可溶化剤や乳化剤（例えば、エトキシ化されたイソステアリルアルコール類、ポリオキシエチレンソルビトールエステル類）、保存剤、風味

K与剤（例えば、ぺパミント油、サヅカリン）その他もまた必要に応じ添加することができる。

必要とあらば、経口投与のための用 ft単位処方はマイクロカブセル化してもよい。該処方はまた被覆をしたり、高分子 · ワックス等中にうめこんだりすることにより作用時間の延長ゃ持挠放出をもたらすこともできる。

組織内投与は、皮下 ·筋肉又は静脈内注射用としたところの液伏用量単位形 «8、例えば溶液ゃ懸 «剤の形餓を用いることによって行うことができる。これらのものは、本発明化合物の一定量を、注射の目的に適合する非毒性の液状担体、例えば水性や油性の媒体に翻濁し又は溶解し、ついで該懸 ¾液又は溶液を滅菌することにより製造される。注射液を等張にするために非毒性の塩や塩溶液を添加してもよい。更に安定剤、保存剤、乳化剤等を併用することもできる < 直腸投与は、化合物を低融点の水に可溶又は不溶め固体、例えばボリエチレングリコール、カカオ胞、半合成の油脂（例えば、ウイテブゾール、登録商摞）、高极エステル類（例えばバルミチン酸ミリスチルエステル）及びそれらの混合物に溶解又は ® ®させて製造した坐剤等を用いることによって行うことができる。

その他、局所投与は、軟膏剤、パップ剤、ブラスタ一剤、パッチ剤、リニメント剤、点眼剤、柽森剤などの剤型で行うことができる。軟膏剤は、脂肪、脂肪油、ラノリン、ヮセリン、バラフイン、ろう、榭脂、ブラスチック、グリコール類、高极アルコール、グリセリン、水、乳化剤、化剂若しくはそのほかの適当な添加剤を原料とするか、又はこれらを基剤とし、本発明化合物を加え、混和して製することができる。パッブ剤は、本発明化合物の粉末をグリセリン、水又はそのほかの適当な液状の物質と混和し、精油成分を加えて製することができる。ブラスタ一剂は、脂肪、脂肪油、脂肪酸塩、ろう、榭脂、ブラスチック、精製ラノリン、ゴム若しくはこれらの混合物を原料とするか、又はこれらを基剤とし、本発明化合物を均等に混和して製することができる。点眼剤は、本発明化合物の一定量を «菌精製水、生理食 ¾水、注射用蒸留水等に溶解又はし、一定容 *とすることにより製することができる。

実施例

実施例、試験例により、本発明を以下に更に詳しく説明する。実施例に係る化合物は、本発明化合物の一例である。

実施例 1 〔フォスフオノトレオニン》〕シクロスボリ Aの合成

ノ<リウム 2-シァノエチルフォスフエ一トジハイドレート 484mg を 5ml の強酸性イオン交换榭脂（AG50W-X2、 B I 0-RAD 社製）の人つた 6ml の水に « 33し、不溶の坦が消えるまで擾はんした。これを 2ml の同榭脂を充¾したカラムに流し、さらに 20ralの水で溶出した後、滅圧下 ¾8槠乾固し、シァノエチルフォスフュートを ¾製した。以下の実施例で使用したシァノエチルフォスフ X— トは同様の方法で製した。これにシクロスボリン C 187mg. ジシクロへキシルカルボジイミド 640mg 、ピリジン l Onlを加え、室温下 63. 5時間浸はんした。反応終了後、水 3ral を加え、 30分間麼はん後、不溶物をろ紙 Λ ¾で除去し、ろ液を減圧下 »椅した。これをメタノール 5ml に S ®し、セフアデックス LH20 (フアルマシア社製）を充填したカラムクロマト（27X850mm)、メタノールで精製し、反応物の粗画分 235mg を得、そのうち 91ragに 25¾ アンモニア水 8ml を加え、室温下で 24時間擾はんした。これを 5N坦酸で pH 1〜2 に調整し、逆相 C M の榭脂 ( MEGA BOND ELUT C , ,カートリッジ、 Anal y t i chem 社製）に吸着させ、水洗後 60から 70% メタノールにて溶出し、滅圧下溶媒を留去することにより、 29mgの白色粉末を得た。さらにこれを下記の条件で高速液体クロマトグラフィによる分取精製を行って目的物を分画し, 減圧下溶媒を留去した。

分取条件カラム：イナ一トシル PREP-0DS 、 20X250miD (ジーエルサイェンス製）

力ラム温度： 60で

溶雜液： 70¾ ァセトニトリルリン酸水溶液

流 is ： 7ml/min

反応物のリテンションタイム： 17.2roin

この分画を少量の水で懸面し、逆相の榭脂（Sep-Pak C. 力ートリッジ、 WATERS社製〉に吸着させ、水洗後メタノールで溶出することにより、白色扮末状の〔フォスフオノトレオニン ' 〕シクロスボリン Aを 16mg得た。

/ (フォスフオノ卜レオニン，〕シクロスポリン Aの物性値

1.物質の色及び伏懇白色粉末

2.融点 171-175 で

3.旋光度〔な〕 ^>0=-138 · (c-0.69, ノ-ル中）

4.元素分析 C<₂H._{1 2}N O..P · 5/2H,0として

計算傢（ ) ： C 55.42 ： H 8.78 ； 11.47

実測値（¾) ： C 55.14 ： H 8.45 ： N 11.37

5.分子量 1297 (FABMS)

6.質 i分析險イオン FABMS 法：（M-H) - 、 ra/z 1296

イオン PABMS 法：（M+H) ♦ 、 m/z 1298 実施例 2 (フォフオノトレオニン¹ 〕シクロスボリン A ニナトリゥ堪の合成

シクロスポリン C250mgにシァノエチルフォスフェート 154mg 、ジシク口へキシルカルボジィミド 422rag 、ピリジン 8ml を加え、室温下 16時間 «はんした。反応終了後、水 2ml を加え、 60分間擾はん後，不溶物を Λ¾除去し、弒圧下濃槠した。これに 25 アンモニア水 40 mlを加え、室温下で 19時間 «はんした。これを鉞圧下、約 15mlまで ¾槠し、 2N塩酸で pH 1〜2 に I»整し、 15π»1の齚酸ェチルで 3回抽出した。得られた^酸ェチル閽は水洗浄後、硫酸ナトリウムで乾煉し弒圧下 »槠した。次にこれをメタノール 10mlに溶かし、 0.5N水酸化ナトリウムを 0.9ml ¾下し、窒温下 16時間 «はん後、滅圧下溶媒を留去した。これに水 3ral を加え、逆相 d, の榭脂（MEGA BOND

ELUT d,カートリッジ、 Analytichem 社製）に吸着させ、水洗後 40 から 60¾ メタノールにて溶出し、減圧下溶媒を留去することにより, 目的とするニナトリゥム堪を 204mg 得た。

（フォスフオノトレオニン，〕シクロスボリン A ニナトリウム坦の物性值

1.物質の色及び伏 SS 無色結晶性粉末

2.融点 209-210 で

3.旋光度〔a ) ^,β»-158 · (c=0.48 、ル中）

4.元素分析 ,Η,,οΝ,,Ο,,ΡΝΒ, · 3Η,0として

計算値（¾) ： C 53.32 ； Η 8.37 ： Ν 11.03

実測値 C ： C 53.03 ： H 8.44 ； 11.02

5.分子 ft 1341 (FABMS)

6. K量分析イオン FABMS 法：（M+H) ♦ 、 m/z 1342 またシクロスボリン C200mgを用いて同様にリン酸化し、 0.2N水酸化ナトリウムにてシァノエチル基を脱 «後、マイクロァシライザ一 GK ァシブレックスカートリッジ AC-210-10 (いずれも旭化成社製 ) にて脱坦後、弒圧下 S縮し、セフアデックス LH20 (フ τルマシア社製）を充填したカラムクロマト、メタノールで精製すると白色粉末の反応物が 16mg得られた。本化合物は FAB MSによる分子量測定により（フォスフオノトレオニン，〕シクロスポリン Aのーナトリウム埴であることが同定された（質量分析： »イオン FABMS 法：

(M+H) ♦ 、 m/z 1320) 。

実施例 3 〔フォフオノ - D- セリ _ン ¹ 〕シクロスポリン Aの合成〔D-セリン ¹ 〕シクロスボリン A 0.7g 、シァノエチルフォスフエート 0.5g、ジシクロへキシルカルボジイミド 1.5g、ビリジン 20ml を添加し、 20時閒«はんした。水 5ml を加え、 1時間浸はん後、ろ紙»過して不溶物を除去した。ろ液を減圧下濃槠乾固し、アンモニァ水 100ml を添加し、室温下、一夜擾はんした。これを酸で pH 1 〜2 に W整し、 K酸ェチル 0ml で 3回油出し、銥水硫酸ナトリウムで脱水し、滅圧下溶媒を留去した。これをセフアデックス LH-20 (フアルマシア社製）を充填したカラムクロマト（27X 270mm), メ夕ノールにて精製し、（フォスフオノ - D- セリン * 〕シクロスポリン Aを 0.34g 得た。

/ 〔フォスフオノ - D- セリン * 〕シクロスボリン Aの物性镓

1.物質の色及び状白色扮末

2.融点 170-174 で

3.旋光度（a〕 ²⁰=-167 * (c-0.51 、 /-ル中）

4.元素分析 C.,H, ,₂N,,0,«P * 3/2H,0として

計算値（ ) ： C 56.18 ； H 8.74 ； 11.62 実測値（¾) ： C 56.12 ； H 8.55 ： N 11.45

5.分子量 1297 (FAB S)

6.質量分折陰ィォン PABMS 法：（M-H) - 、 m/z 1296

暘イオン PABMS 法：（M+H) ♦ 、 m/z 1298 実施例 4 〔フォスフオノ- D- セリン * 〕シクロスボリン A ニナトリゥム塩の合成

実施例 3と同様にして、〔D-セリン * 〕シクロスボリン Aのリン酸化を行った。〔D-セリン，〕シクロスポリン A 120mgにシァノェチルフォスフエ一ト 74mg、ジシクロへキシルカルボジィミド 204mg 、ピリジン 4ml を加え、 64時間 «はんした。次に水 0.5ml を加え、 30 分間機はんした後、ろ紙 «!¾により不溶物を除去した。これを滅圧下讓槠½固し、 25 アンモニア水 20mlを加え 21時間 «はん後、ろ紙 »¾により再び不溶物を除去した。 ¾圧下これを »槠乾固した後、 0.5Nの水酸化ナトリゥム水溶液を 0.7ml 加え、 20時間浸はんした。滅圧下溶媒を留去し、逆相 C,, の榭脂 (MEGA BOND ELUT カートリッジ、 Ana tichera 社製）に吸着させ、水洗後 40¾ メタノールにて溶出し、減圧下溶媒を留去することにより、目的とするニナトリゥム塩を 70mg得た。

/ (フォスフオノ- D- セリン · 〕シクロスボリン A ニナトリウム堪の物性値

1.物質の色及び伏》無色繪 β性 ¾粉末

2.融点 199-203 'C

3.旋光度〔な〕 ^|0 =-159 · (c=0.27 、メタノ-ル中）

4.元素分析 Ο.^Η. ,ΟΝ, ,Ο,.Ρ Β^ · 5Η,0として計算値（¾) C 51.98 ： H 8.44 ： N 10.75

実測値（¾) C 51.72 ： H 8.15 ； N 10.74

5.分子量 1341 (FABMS)

6.質量分析 »イオン PABMS 法：（M+H) * 、 m/z 1342

実施例 5 〔フォスフオノ - D- セリン ' 〕シクロスボリン A 二べンジルァミン填の合成

実施例 4 で得られた〔フォスフオノ - D- セリン · 〕シクロスポリン Aのニナトリゥ厶塩 20mgを水 Iml に溶かし、 2Nの塩酸で pH 1〜2 に ¾整し、酢酸ェチル lral で 3回抽出し、硫酸ナトリウムで乾燥後、弒圧下濃槠乾固し、 17ragの白色物を得た。これにメタノール 0.5 ralを加え、ベンジルァミン 4 1 を加え、一夜 «はんした。滅圧下溶媒を留去し、水 1ml を加え、逆相 C,, の榭脂（SEP-PAK C. カートリッジ、 WATERS社製）に吸着させ、水洗後 40¾ メタノルにて溶出し、減圧下溶媒を留去することにより、目的とする二べンジルアミン塩を 13mg得た。

/ (フォスフオノ - D- セリン，〕シク αスポリン A 二ベンジルァミン埴の物性値

1.物 κの色及び状》白色粉末

2.融点 164-166 で

3.旋光度（α〕 *°»-199 · (C-0.28 、メタ/ -ル中）

4.元素分折 ,Η,,ΟΝΜΟΜΡ · 7Η,0として

計算値（ ) ： C 55.69 ； Η 8.86 ： Ν 11.11

実蒯値 C ： C 55.98 ； H 8.55 ： N 11.17

実施例 6 〔フォスフオノトレオニン * 、フォスフオノ - D- セリン " 〕シクロスボリン A 四ナトリウム塩の合成

実施例 3 と同様にして、〔D-セリン · 〕シクロスボリン Cのリン酸化を行った。 CD-セリン，〕シクロスボリン C 30m にシァノエチルフォスフヱート 39mg、ジシクロへキシルカルボジィミド 102mg 、ビリジン 2ml を加え、 65時間擾はんした。次に水 0.5ml を加え、 30 分間 «はんした後、ろ紙 ¾¾により不溶物を除去した。これを弒圧下濃槠乾固し、アンモニア水 6ml を加え 21時間 «はん後、ろ紙滤過により再び不溶物を除去した。絨圧下これを S槠乾固した後、 0.5N の水酸化ナトリウム水溶液を 0.2ml 加え、 20時間 «はんした。減圧下溶媒を留去し、逆相 Ci, の榭脂 (SEP-PAK カートリッジ、 WATERS社製）に吸着させ、水洗後メタノールにて溶出し、滅圧下溶媒を留去することにより、目的とする四ナトリウム塩を白色扮末として 8mg 得た。本化合物は PAB MSによる分子量測定により（フォスフオノトレオニン * 、フォスフオノ - D- セリン · 〕シクロスボリン Aの四ナトリゥ厶堪であることが同定された（質量分析； »ィオン PABMS法：（M+H) ⁺ 、 m/z 1482) 。

轼驗例 1 IL-2産生阻寄活性

シクロスボリン類の免疫抑制活性は、 T-钿胞の IL-2産生遗伝子発現抑制に基づいていることが知られている。従って、シクロスボリン類の生物活性は、 T-細胞の IL-2産生阻害の検肘をすれば良い。そこで、 T-細胞の一種であるジャーカツト細胞（Jurkat cell 、ヒト T-細胞の腫瘙細胞）を用いて、本発明化合物の生物活性を検討した。

RPMI-1640 培地（フローラボラトリーズ社製、 10¾ heat- inactivated FBS 、 300 mg/1 L-glutaraine^ 50 U/ml streptomycin^ 50 U/ral penicilin、 25 m hepes、 50 M 2- mercaptoethanol)にて対数增¾期としたジャーカツト（Jurkat) 钿胞の钿胞 »度を 8x10^s /ml とし 0.1ml を 96ウェルマルチブレートに分注した。次に、 IL-2産生の刺 »割としてコンカナバリン A を 10 β 1 加え更に各種膿度の試料を 20 1 添加した。培地の添加により最終容量を 0.2ml/ゥエルとし 37"Cp炭酸ガスィンキュベータ一にて 24時間培養した。培養終了後直ちに各ゥ Xルについて遠心処理（ 1000 rpm x 5 min) を行い上淸を得た。

【レ 2の測定は IL-2依存性細胞として知られている CTLL-2钿胞を用いるバイオアツセィ法により行なった。

対数增¾期とした 0. lml の CTLL-2細胞（ 40.000/ral)に前記した上淸を適宜希釈した後、 O.lral 分注し 37でにて酸ガスインキュベーターで 48時間培養した。培養終了後舳胞«¾を MTT アツセィにて測定した。 CTLL-2細胞増 ¾率と 1レ2»度の M係は、予めリコンビナントについて求めておき、これをスタンダードカーブとして測定した CTLL-2<ffl胞增殖率より 1レ2濃度を决定した。

1L-2産生阻害率は、下纪式 (1)により求め、各 »度における阻害率より各試料の【 _β値を算出した。その結果を表 2に示す。

,, n 試料添加細胞での Iし- 2産生量、

IL-2産生阻害率（¾)=(1- ) X 100

試料無添加細胞での Iし- 2産生量

•••(1) 表 2

試料名 I

シク 0スボリン A 3

シク πスボリン C 12

D-セリン，シクロスボリン A 6

スフ ίバレ才ニンンク πスリン A 49

フォスフ才 /-D- セリン^, ]シク 0ス ϋリン A 19 表 2より明らかなように本発明化合物は、非リン酸エステル体に比して活性は低下するが、それ自体で強い I L-2産生阻害活性を有していた。

試験例 2 水に対する溶解性シクロスボリン A、シクロスボリン（：、（ D-セリン，〕シクロスボリン A、〔フォスフオノ - D- セリン · 〕シクロスボリン A ニナトリウム塩、〔フォスフオノトレオニン，〕シクロスボリン A 二ナトリゥム塩をそれぞれ乳鉢で粉砕して試験管に一定量ずつ加えた, 次いで、各々の試験管に蒸留水を試料 β度が 250mg/inlとなる様に加え 30'Cにて 30分間振通慢拌した。それぞれの試験管から 250 tx 1 ずつエツペンチューブに採り、遠心処理（l O. OOOrpra l Omi n) した。その上淸を採って、蒸留水にて希釈後 HPLCにて定量した。

(フォスフオノ - D- セリン，〕シクロスボリン A ニナトリウム及び（フォスフオノトレオニン》〕シクロスボリン A ニナトリゥム塩については、 500mg/nilとなるように蒸留水を加え上記と同様の処理にて再度溶解度を求めた。

HPLC条件；カラムイナ一トシル C8 ( 4. 6x250mm) ,

移動相ァセトニトリルーメタノ一ルー蒸留水一

リン酸 ( 50： 35： 15 ： 0. 005)、カラム温度 75で、 UV 210nmで検出

表 3

試料名溶解度 ( rag/ml ) シク Dスボリン A 0. 0267

シタ πス^ン C 0. 0297

D-セリン Ίシク πスボリン A 0. 0351

フ"フセリン^,】シク πスボリン A ニナトリウム ¾ 500く

フ ίスフトレ才ニンつシク 0スボリン A ニナトリウム坦 250く表 3に既知のシクロスポリン八、 Cと対比して示した。表 3より明らかなように本発明化合物は既存のシクロスボリン八、 C等と比ベ約 7000倍以上も水溶性が高かつた。試験例 3 骨毒性の検时リチウムクリアランス法により、 ¾F «性を抨価した。ここで検时したリチウムクリアランス法が脊障害の指 «としての価值を有することは既に報告されている（武井孝、日本 ©尿器学会珐、 83巻、 40 -47 頁、 1992年) o

7通齢の雄 S Dラットを用い、 1群 10匹で対照群、シクロスボリン A 10mg/kg投与群、シクロスボリン C投与群、〔フォスフオノトレオニン ² 〕シクロスポリン A投与群、〔フォスフオノ - D- セリン ¹ 〕シクロスボリン A投与群の 5群を設け、各試料を 5mg/mlの »度に »整した後、腹腔内に 2ml /kgの容量で 7 日間連統注射した。対照群には試料の調整に用いた溶媒を同様に投与した。投与 *終日に^酸リチウム水溶液（23, 6mg/ 10ml /kg) を強制経口投与した後 P-2 飼料 (船檎農場製）に炭酸リチウムを加えたリチウム含有食（し i CO , 738. 9mg/kg/f ood)を与えた。翌日ラット頓静脈より採血した後代謝ケージに入れリチウム含有食下で 24時間採尿し、その尿 iをメスシリンダ一で測定した。代謝ケージからラットを出したのち直ちに採血し、採尿前後 2点のリチウム值の平均値をラットの血中リチウム値とした。ラットの体重は代謝ケージから出した直後に測定した。血中リチウムは採血後、 3000rpm で 10分間遠心分 «し得られた血漿を用いて、尿中リチウムは採尿後 OOrpm で 10分間遠心分離し得られた上淸を用いて、ともに炎光光度計（ 775型、日立製作所製）により測定した。上記の測定慷から次式 (2)により、ラット体重 100g当りの 24時間リチウムクリアランス（C_{L I}) を算出した。

24時閲 C_L,/100g=尿 ix 100/ラット体重 · 尿 Li值血中し itt

… ) 表 4

試料名

対照群 100

シク Dス ί·;リン A 53

シク D :リン C 39

7*ス 7ί/トレ才ニン *]シク 0スボリン A ニナトリウム埴 125

フォス /-D- セリン^,】シク πスポリ'/ A ニナトリウム 98

• 対照群に対する試料投与群の血中リチウム量の割合

桔果を表 4に既知のシクロスボリン八、 Cと対比して示した。表中で数値がコントロールの 100より小さいことは臂毒性の所見を意味している。表 4 より明らかなように既知のシクロスポリン A、 C が臂毒性を示しているのに対し、本発明化合物の肾毒性は極めて低力、づた ₀

試驗例 4 接口投与時の吸収とリン¾基の遊雌

体重 250gの SD系ラットに 30mg/kg となるように 0.5¾メチルセル口ース水溶液に S¾させた〔D-セリン，〕シクロスボリン A及び〔フォスフオノ - D- セリン，〕シクロスボリン Aを経口投与し柽時毎に頭部静脈より採血した。採血後遠心処理（ 10.000 rpm X 5 min) により上清を分取し、前処理カラム（Sep-pack C. Vac、 waters) に通液して蒸留水、 40¾ メタノールにて洗浄した。 50 メタノールから 100¾メタノールの 10¾ ステップによりカラムからの溶出画分を採り、その 50 1 を HPLCにインジェクトしてそれぞれの濃度を求めた。それらの濃度より血中濃度を計算した。桔果を表 5に示す。表 5

投後（hr) 0.5 1 2 4 8 24 24hrまでの時間の血中 Λ

度の総筘

① 895 4321 1915 1021 533 69 8754

② 1413 3115 2516 2391 910 103 10448

③ 391 813 971 536 311 31 3053

④ 1804 3928 3437 2927 1221 134 13501 表中の血中 S度は、 ng/ml である

[D-セリン，】シク πスボリン A

[フ tスフセリン ·】'ンクロス ίリン Aを投与した場合に、リン酸を遊雌した [D-セリン ·】'ンク πスポリン Aの血中 »度

③： [フォスフセリンリシク mi:リン Aを投与した場合の

[7*スフ */+ セリン，】シクリン Aの血中 as度

④： ②と③の合計

表 5 より明らかなように本発明化合物は既知のシクロスボリン類 (非リン酸エステル体）に比べて吸収速度が早く、また約 1.5倍程度総吸収量が増加した。また、表 5から明らかなように本発明化合物は、インビボにおいて遊 «し、より生物活性の強い非リン酸エステル体へと変換した。製剤例製剤例 1 固形剤 1錠 180mg 中、以下の処方に従って常法により锭剤を調製した。処方実施例 4の化合物 l OOmg

乳糖 61mg ΐβ粉 14mg

ボリビュルアルコール 2mg

タルク 2rag

ステアリン酸マグネシウム lmg

製剤例 2 注射剤

1 管 1 ml中、以下の処方に従って常法により注射剤を調製した。処方実施例 4の化合物 l Oing

塩化ナトリウム 90mg

¾酸水素ナトリウム 10ID8

注射用蒸留水速量

製剤例 3 カブセル剤

1 カブセル 285mg 中、以下の処方に従って常法により硬カブセル剂を調 Sした。

処方実施例 4の化合物 l OOrag

乳糖 107πβ

微結晶セルロース l Ong

ステアリン酸マグネシウム 3ng 発明の効果

本発明化合物は、それ自体で強い生物活性を有しており且つ生体內でより活性の強い非リン酸エステル体へと一部変換される。また. 水に対する溶解度が高く、更に生体内における吸収速度が早く吸収量が多い。従って、特殊な製剤形 SSをとらなくても投与することができ、生体内において薬効を発揮することができる。

更に、本発明化合物は毒性か極めて低い。生体内で非リン酸ェステル体に多少加水分解されるにもかかわらず、 B毒性が Sめて低い理由については今のところ不明である。

Claims

請求の範囲

1 . 水酸基を有するァミノ酸を構成要素とするシクロスポリン類において、該水酸基の全部又は一部がリン酸エステル（ -P(0)(0H)₂) 化されている、シクロスボリン類のリン酸エステル R 導体若しくはその塩、又はそれらの溶媒和物。

2. 水酸基を有するァミノ酸を構成要素とするシクロスポリン類が、次の構造式〔 I 〕で表される、請求項 1 記載のシクロスボリン類のリン酸エステル誘導体若しくはその埴、又はそれらの溶媒和物。 eBmt -A1-Sar-Aj-A1-A4-A1-A.-A7-A.-Ar

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

C I )

ここで、 A,は D-若しくはい a—ァミノ K»、 D-若しくはし-ァラニン、 D-若しくはいトレオニン、 D-若しくはいバリン、 D-若しくはい 3-ヒドロキシノルバリン又は D -若しくはい 4-ヒド αキシノルバリンを表し、 A_aは D-若しくはい Ν-メチルロイシン、 D-若しくはい口イシン又は D-若しくはいバリンを表し、 A,は D-若しくはいバリン又は D- 若しくはいノルバリンを表し、 A«は D-若しくはいロイシン又は D-若しくはいメチルロイシンを表し、 Αιは D-若しくはいァラニン又は D- 若しくは L-α—アミノ酸酸を表し、 A,は D-若しくは L-ァラニン又は D-若しくはいセリンを表し、 A₇は D-若しくはし-メチルロイシン又は D-若しくはいロイシンを表し、 A,は D-若しくはいメチルロイシン又は D-若しくはいロイシンを表し、 A,は D-若しくはいバリン又は D-若しくはいメチルバリンを表す。 MeBmt は、次の構造式〔I I〕で示される N-メチル -(4R)-4-ブタ -2E-ェン -1 - ィル -4- メチル - (ぃトレオニン又は次の構造式〔m〕で示される〔I〕のジヒドロ体を表す。

Sar は、ザルコシン（N-メチルグリシン）を表す _β

〔I〕 C I )

3 . A,がいトレオニンである講求項 2纪載のシクロスボリン類のリン»エステル誘導体若しくはその塩、又はそれらの溶媒和物。

4 . Α·が D-セリンである »求項 2記敏のシクロスボリン類のリン酸エステル誘導体若しくはその ¾、又はそれらの溶媒和物。

5 . 〔フォスフオノトレオニン * 〕シク crスボリン Α、（フォスフオノ - 4- ヒドロキシノルバリン，〕シクロスボリン A、（フォスフオノ - D- セリン * 〕シクロスポリン A及び〔フォスフオノトレオニン，、フォスフオノ - D- セリン，〕シクロスポリン Aからなる群より選択されるシクロスポリン類のリン酸エステル锈導体若しくはその坦、又はそれらの溶媒和物。

6 . 猜求項 1 乃至 5記載のシクロスボリン類のリン酸エステル誘導体若しくはその塩、又はそれらの溶媒和物を含有することを特 ¾とする医薬組成物。

7 . 請求項 1 乃至 5記載のシクロスボリン類のリン酸エステル誘導体若しくはその塩、又はそれらの溶媒和物を含有することを特 »とする免疫抑制剤。