WO1996032501A1 - Verfahren zur reduzierung der bildung von artefakten während transkription von ribonukleinsäuren in desoxyribonukleinsäuren - Google Patents

Verfahren zur reduzierung der bildung von artefakten während transkription von ribonukleinsäuren in desoxyribonukleinsäuren Download PDF

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dna
acids
transcription
ions
degrading enzyme
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Peter Bauer
Arndt Rolfs
Vera Regitz-Zagrosek
Eckart Fleck
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Boehringer Mannheim Gmbh
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    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]

Definitions

  • the invention relates to a method for transcribing ribonucleic acids (RNA) from a sample to deoxyribonucleic acids (DNA), a method for producing a large number of DNA molecules using RNA molecules and reagents for reducing artifacts and reagent kits for carrying out the method.
  • RNA ribonucleic acids
  • DNA deoxyribonucleic acids
  • RNA and DNA can start from both RNA and DNA. Both options have advantages. In processes which use RNA as the starting material, in many cases the ribonucleic acid is first transcribed into deoxyribonucleic acid, transcribed. This happens, for example, against the background that deoxyribonucleic acids (DNA) are more stable. In many cases, ribonucleic acids (RNA) can also be used to obtain information that is not available in analytical methods based on DNA. This is due to the fact that the genomic DNA still contains intron sequences that are lost in the body's own processing in RNA. Processes in which DNA is detected can therefore, depending on whether the sequence under consideration contains introns or not, come to the same analysis values or not.
  • RNA ribonucleic acids
  • junction primers are oligonucleotides whose sequence is chosen so that its 5 'end is complementary to the sequence of the 5' end of an exon and its 3 'end contains some nucleotides which correspond to the nucleotides of the 3' end of the neighboring exons are complementary, but not to the nucleotides at the 3 'end of the intron in the genome. In such a case, the falsification of the result by contaminating DNA is at least partially avoided.
  • DNase I requires divalent metal ions (J. Biol. Chem. 243: 4409-4416 (1968)) as a factor. It is known that the optimum concentration of Mg2 + ions is approximately an order of magnitude larger than that of Mn ** - + . In addition, it is known that an increase in the Mn ** ; + concentration does not inhibit the DNase reaction as for Mg ⁇ + or Ca ⁇ + .
  • the core of the present invention is the finding that when Mn2 + ions are used, the amount of artifact DNA which is obtained by replicative amplification, e.g. B. by means of the polymerase chain reaction (PCR), is significantly reduced or virtually completely eliminated. In addition, DNase digestion with Mn - * - + 'ions is much more effective than with Mg - * - + .
  • the invention therefore relates to a method for transcribing ribonucleic acids of a sample to deoxyribonucleic acids, comprising the steps:
  • step a) is carried out in the presence of Mn2 + ions.
  • the invention also relates to a method for producing a large number of DNA molecules using RNA molecules, reagent kits for use in these methods and the use of Mn - ⁇ - ions to reduce the formation of artifact DNA in transcription reactions
  • Any ribonucleic acids can be used as the ribonucleic acids according to the present invention, e.g. B. mRNS, tRNS, rRNS.
  • the invention is particularly expedient in the case of intronless mRNA and mRNA which occurs as pseudogenes or from which it is not known whether pseudogenes are present.
  • the ribonucleic acids can be present in a form heavily contaminated with corresponding DNA.
  • samples containing RNA that are already less strongly purified can be used in the method according to the invention.
  • the content of deoxy-ribonucleic acids - be it corresponding to the corresponding ribonucleic acid or else foreign deoxyribonucleic acids - can be higher than in the samples which were used according to methods of the prior art for transcribing the ribonucleic acids.
  • the sample can be taken from any object to be examined. It can e.g. B. is a lysate of tissue or single cells.
  • ribonucleic acid-containing samples in particular lysates
  • the preparation of ribonucleic acid-containing samples is known to the person skilled in the art.
  • the ribonucleic acids can be present in solution in the sample, but they can also be present in a form immobilized on a solid phase. It is ultimately important for the processes of transcription of ribonucleic acids that the sample can be reacted with an enzyme to break down DNA.
  • the sample containing ribonucleic acid is treated with a DNA-degrading enzyme in the presence of Mn2 + ions.
  • DNA-degrading enzymes are known to the person skilled in the art.
  • the preferred enzyme is DNase, particularly preferably DNase I.
  • DNase I is an endonuclease that hydrolyzes double-stranded or single-stranded DNA to form a complex mixture of mono- and oligonucleotides with 5'-phosphoryl ends.
  • the conditions for treating the sample with the Mn ** - + ion-containing solution do not differ significantly from the conditions under which the treatment of ribonucleic acid-containing samples with Mg-- + -ion-containing DNase- Solutions are known.
  • the Mn2 + ions present according to the invention are preferably present in a concentration of more than 10 " ⁇ M.
  • the concentration of Mn2 + is preferably between 10" - 'and 10 "! M, particularly preferably between 10 - ** - and 10" ** - M.
  • a solution is preferably added to the sample to be treated which contains the necessary reagents in a concentration at which the degradation can take place in the resulting reaction mixture. Then incubate for a sufficient time. Incubation periods between 5 and 60 minutes at temperatures between 36 ° and 38 ° C. are preferred.
  • the DNA-degrading enzyme is then preferably used in a known manner, e.g. B. by heat (5 minutes, 90 ° C) or, preferably, extraction, inactivated. This is done so that the deoxyribonucleic acids formed in the subsequent reaction are not broken down again.
  • the transcription of the ribonucleic acids into deoxyribonucleic acids then takes place.
  • the ribonucleic acids can either be left in the reaction mixture formed in the previous step, but they can also be cleaned in between.
  • the transcription of the ribonucleic acids can be carried out in a known manner. Transcription of ribonucleic acids means the process known to those skilled in the art of forming DNA from RNA using RNA as a substrate for the enzyme-catalyzed condensation of monodeoxyribonucleotides. This process is described in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY, 1989.
  • the preferred enzyme for transcription is the reverse transcriptase, in particular reverse transcriptase from MMLV, in particular Superscript (RNase H deleted).
  • the invention also relates to a method for producing a large number of DNA molecules using RNA molecules, comprising the steps:
  • the multiplication of deoxyribonucleic acids means the production of a large number of copies of the DNA or parts thereof.
  • Methods for the multiplication of deoxyribonucleic acids are known to the person skilled in the art.
  • a prominent representative of these reactions is the polymerase chain reaction (PCR) according to EP-B-0 201 184.
  • PCR polymerase chain reaction
  • the deoxyribonucleic acid to be increased is an excess of primer Molecules added, some of the primers complementary to a sequence region not forming the 5 'end and another part of the primers complementary to the complementary strand, so that the extension product of each primer can again serve as a template for the extension of the other primer.
  • the primers are extended by polymerase-catalyzed attachment of mononucleotide units to the primers.
  • junction primers can also be used as primers.
  • the part which is complementary to the 3 'end of the second exon is preferably 2-4 nt, particularly preferably 3 nt long, while the part adjoining it in the S' direction of the primer is so long that selective hybridization with the S 'end of the first exon is possible, d. H. preferably 10-30, particularly preferably 15-20 nt.
  • deoxyribonucleic acids e.g. B. the ligase chain reaction (LCR) according to EP-A-0 320 308, in which in each case 2 first nucleic acids which hybridize to adjacent regions of the DNA are covalently linked to one another.
  • LCR ligase chain reaction
  • the linkage product of the first two nucleic acids is used as a template for the linkage of two further nucleic acids which hybridize adjacent to the linkage product.
  • an amplification of a sequence region takes place by guiding the cycle.
  • the method according to WO 90/01069 which includes both extension and linkage reactions, can also be used as a method for increasing the deoxyribonucleic acids.
  • the method offers another way of multiplying the DNA
  • EP-A-0 329 822 in which the propagation cycles are a step towards DNA-dependent
  • RNA polymerase reaction include.
  • the invention further relates to a reagent for reducing the formation of artefact DNA in transcription reactions, which contains a DNA-degrading enzyme and Mn ** - + - ions.
  • This reagent can moreover also other reagents, as are usually necessary for setting conditions in which DNA is degraded in RNA-containing samples. These include in particular buffers for setting the optimal pH value for the degradation reaction.
  • artifact DNA is DNA which contains genomic sequences but was formed by an in vitro reaction which is not based on RNA transcription.
  • the invention also relates to a reagent kit for the transcription of ribonucleic acids in deoxyribonucleic acids, containing in separate containers a DNA-digesting enzyme and Mn * - + ions and a reverse transcriptase.
  • This reagent kit therefore contains the reagents required for steps a) and b) in separate containers.
  • Mg - ⁇ - ions, buffers, the deoxyribonucleoside triphosphates required for incorporation and RNase inhibitors are preferred for the reverse tripping reaction.
  • the invention also relates to a reagent kit for producing a large number of DNA molecules from RNA molecules containing in separate containers: a DNA-degrading enzyme and Mn-- + ions,
  • the reagents for the duplication of the DNA depend on the desired multiplication method.
  • a preferably thermostable, DNA-dependent DNA polymerase and the monodeoxyribonucleoside triphosphates required for the desired extension are required.
  • the reagents for this are described, for example, in EP-B-0 201 184.
  • the transcripts produced in the manner according to the invention can be used for the detection of RNA originally present in a sample.
  • the transcription method according to the invention is first carried out, the method being able to be made specific for specific RNA sequences by using sequence-specific primers.
  • the nucleic acids formed can be detected in a known manner, preferably by hybridization with nucleic acid probes complementary to the nucleic acids and detection of hybridization.
  • the method according to the invention is therefore particularly suitable in the field of nucleic acid diagnostics in molecular biology and clinical laboratory diagnostics.
  • Figure 1 shows the formation of transcripts under various conditions, on the one hand using Mg - * - + , on the other hand using M ⁇ fi + according to the invention.
  • PDH pyruvate dehydrogenase gene
  • RNA 1 ⁇ g RNA was treated with 2 U DNase I (Boehringer Mannheim GmbH, FRG) for 10 minutes at 37 ° C. in the presence of 40 U RNasin / ⁇ g RNS (Promega, FRG). The final concentration of Mg2 + or Mn - * - + was 1 mM. After DNase I digestion, an aliquot was heated to 90 ° C for 5 minutes.
  • RNA treated up to 1 ⁇ g DNase I was incubated with 500 ng random hexanucleotides (random) for 10 minutes at 70 ° C. and then stored at 4 ° C.
  • a mixture of 100 U Superscript MMLV reverse transcriptase (Gibco-BRL, FRG), 3 mM MgCl 2 , 50 mM Tris-HCL (pH 8.3), 75 mM KC1, 10 mM DTT, 0.5 mM dNTPs and 40 U RNasin added. The sample was incubated at 42 ° C for 50 minutes. The reaction was then heated to 95 ° C for 5 minutes.
  • ATR 1 intronless angiotensin II type I receptor gene
  • the reactions were carried out with 8 pmol of each primer, 50 mM KCl, 10 mM TrisxHCl (pH 8.3), 1.5 mM MgCl2, 100 ⁇ M deoxyribonucleoside triphosphates, 0.4 ⁇ M each oligonucleotide, 1.0 U Taq polymerase (Perkin Elmer Cetus) and 50 ng samples - nucleic acid in a volume of 25 ul.
  • a Thermocycler 9600 TM Perkin bucket was used to carry out the reaction. First the sample was denatured at 95 ° C. The following temperature profile was then carried out over 40 cycles: 45 sec. 95 ° C, 60 sec. 60 ° C, 45 sec. 72 ° C and then 5 minutes at 72 ° C.
  • the membranes were prehybridized in 5 xSSC hybridization buffer (1 xSSC: 0.12 M NaCl, 0.015 sodium citrate, 2.0% by weight blocking reagent (Boehringer Mannheim GmbH), 0.02% by weight SDS, 0.1% by weight N-lauryl sarcosine) for 30 minutes. After a blot time of 6 hours, UV crosslinking with 120 mJ (Stratalinker TM, Stratagene) was carried out immediately. The hybridization was carried out for at least 6 hours at 62 ° C. in 5 ml of hybrid detection solution (containing 2 ⁇ l of PCR synthesized, previously denatured with DIG-11-dUTP (Boehringer Mannheim GmbH, Order No.
  • primer pairs in the amplified region (plus primer: 5'-TGCTTGGAGAAGAAGTTGCC-3 ', minus primer: 5'-
  • TCTGGGGGTAACAGTGACCT-3 ' a 94 bp amplicon was amplified directly from the control DNA.
  • This short amplicon was examined according to the ethidium bromide method in a preparative 1% NuSieve GTG agarose gel.
  • the electrophoresis buffer is composed of 0.04 M Tris acetate (pH 8.0).
  • the amplicon was excised from the gel and 5 ul of the melted agarose was reamplified using the above primers and a dNTP labeling mixture in which 35% of the dTTP was replaced by DIG-dUTP. This probe was used in the hybridization step without further purification.
  • the membranes were placed directly in the chromogenic detection buffer (0.1 mol / 1 Maleic acid, 0.15 mol / 1 sodium chloride, pH 7.5, 0.3 percent by weight Tween-20).
  • Chromogen detection was carried out according to Rolfs et al., PCR: Clinical Diagnostics and Research, Springer Verlag, 1992.
  • the membrane was washed with washing buffer for 1 to 5 minutes at room temperature and then incubated in buffer 2 for 30 minutes. The membrane was then incubated with antibody conjugate solution for 30 minutes. It was then washed twice with 100 ml of washing buffer for 15 minutes. The membranes were then treated in buffer 3 for 2 to 5 minutes. The membranes were then incubated in the dark in a solution of 55 ⁇ l NBT and 35 ⁇ l BCIP in 10 ml buffer 3 for 6 hours. The color reaction was stopped with buffer 4 for 5 minutes. The color formation was then detected.
  • the reagents for chromogen detection were taken from the DIG-DNA labeling and detection kit non-radioactive (Boehringer Mannheim, order no.1093657) and changed as follows:
  • Buffer 2 blocking solution 1:10 diluted in buffer 1 (final concentration 1% blocking reagent) buffer 3: Ol M Tris HC1; 0.1 M NaCl; 50 mM MgCl 2 ; pH 9.5 (20 ° C) buffer 4: 10 mM Tris-HCl; 1mM EDTA; pH 8 (20 ° C) NBT: 75 mg / ml in 70% dimethylformamide (V / V) BCIP: 50 mg ml in dimethylformamide
  • RNA samples were extracted at least twice with gu ⁇ inidinium thiocyanate phenol / chloroform, more or less intensive PDH-specific signals were shown as clear evidence of contaminating DNA when tested directly with the help of PCR if no further DNase I treatment was carried out (FIG 1, column 1). After treatment of part of the RNA with DNase I with either Mg2 + or Mn ⁇ +. Buffer, no further DNA signal (185 bp fragment) was visible in the PCR reaction (FIG. 1, columns 2 and 3).
  • MOLECULE TYPE Other nucleic acid
  • DESCRIPTION: / desc 'oligonucleotides'

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Abstract

Verfahren zur Transkription von Ribonukleinsäuren einer Probe durch Behandlung der ribonukleinsäurehaltigen Probe mit einem DNS abbauenden Enzym in Anwesenheit von Mn2+-Ionen und anschließende Transkription der Ribonukleinsäuren in Desoxyribonukleinsäuren und hierfür geeignete Reagenzien.

Description

Verfahren zur Reduzi erung der Bi ldung von Artefakten während Transkription von Ribonukleinsäuren 1 n Deoxynukl ei nsäuren
Gegenstand der Erfindung sind ein Verfahren zur Transkription von Ribonukleinsäuren (RNS) einer Probe zu Desoxyribonukleinsäuren (DNS), ein Verfahren zur Herstellung einer Vielzahl von DNS-Molekülen unter Verwendung von RNS-Molekülen sowie Reagenzien zur Reduzierung von Artefakten und Reagenzkits zur Durchführung der Verfahren.
Analyseverfahren für Nukleinsäuren können sowohl von RNS als auch von DNS ausgehen. Beide Möglichkeiten haben Vorteile. Bei Verfahren, die RNS als Ausgangsmaterial be¬ nutzen, wird in vielen Fällen zunächst die Ribonukleinsäure in Desoxyribonukleinsäure umgeschrieben, transkribiert. Dies geschieht beispielsweise vor dem Hintergrund, daß Desoxyribonukleinsäuren (DNS) stabiler sind. Aus Ribonukleinsäuren (RNS) sind jedoch in vielen Fällen auch Informationen erhältlich, die bei Analyseverfahren, die von DNS aus¬ gehen, nicht erhältlich sind. Dies liegt daran, daß die genomische DNS noch Intronse- quenzen enthält, die bei der körpereigenen Prozessierung in RNS verloren gehen. Ver¬ fahren, bei denen DNS nachgewiesen wird, können daher, je nachdem, ob die betrachtete Sequenz Introns enthält oder nicht, zu denselben Analysewerten kommen oder nicht. In solchen Fällen, bei denen nur die RNS nachgewiesen werden soll, führt daher eine Verun¬ reinigung durch DNS zu einer positiven Verfälschung des Analyseergebnisses, wenn keine Vorsorge getroffen wird. Eine Möglichkeit der Lösung dieses Problems ist die Verwendung von sogenannten junction-Primern. Junction-Primer sind Oligonukleotide, deren Sequenz so gewählt ist, daß ihr 5'-Ende komplementär zu der Sequenz des 5 '-Endes eines Exons ist und ihr 3 '-Ende einige Nukleotide enthält, die zu den Nukleotiden des 3 '-Endes des benachbarten Exons komplementär sind, nicht jedoch zu den Nukleotiden am 3 '-Ende des im Genom dazwischen liegenden Introns. In einem solchen Fall findet zumindest teilweise eine Ver¬ meidung der Verfälschung des Ergebnisses durch verunreinigende DNS statt.
Eine solche Unterscheidung zwischen DNS und RNS ist jedoch nicht möglich, wenn Transkripte von intronfreien Gen untersucht werden sollen. Darüber hinaus stellen Pseudo- gene dasselbe Problem dar, da sie identisch in der Länge sind und somit nicht von den Transkripten der RNS unterschieden werden können. In diesen Fällen hat es sich somit als zweckmäßig erwiesen, die mRNS-Probe mit RNasefreier DNase vor Durchführung der Transkriptionsreaktion zu behandeln. Ein solches Verfahren ist beispielsweise beschrieben in BioTechniques 9: 262 - 268 (1990) und BioTechniques 13: 726 - 729 (1992).
Die Bewertung im Falle intronhaltiger Genabschnitte eines effektiven DNS-Abbaus er¬ fordert bisher eine Polymerasekettenreaktion eines Teils der DNase behandelten, jedoch noch nicht reverse transkribierten RNS mit einem Primerset, welches eine Größendiskrimirtierung zwischen PCR-Produkten, die einerseits von der cDNS und andererseits von der genomischen DNS herrühren, erlaubt.
DNase I erfordert divalente Metallionen (J. Biol. Chem. 243: 4409 - 4416 (1968)) als Co- faktor. Es ist bekannt, daß das Optimum der Konzentration an Mg2+-Ionen ungefähr eine Größenordnung größer ist als das von Mn**-+. Darüber hinaus ist bekannt, daß eine Erhöhung der Mn**;+-Konzentration nicht wie für Mg^+ oder Ca^+ die DNase-Reaktion in¬ hibiert.
Kern der vorliegenden Erfindung ist die Erkenntnis, daß bei Einsatz von Mn2+-Ionen die Menge an Artefakt-DNS, welche durch replikative Amplifizierung, z. B. mittels der Poly¬ merasekettenreaktion (PCR), gebildet wird, deutlich reduziert bzw. praktisch vollständig eliminiert ist. Darüber hinaus ist der DNase- Verdau mit Mn-*-+'Ionen wesentlich effektiver als mit Mg-*-+.
Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Transkription von Ribonukleinsäuren einer Probe zu Desoxyribonukleinsäuren, enthaltend die Schritte:
a) Behandlung der ribonukleinsäurehaltigen Probe mit einem DNS abbauenden Enzym und anschließend
b) Transkription der Ribonukleinsäuren in Desoxyribonukleinsäuren,
wobei Schritt a) in Anwesenheit von Mn2+-Ionen durchgeführt wird.
Ebenfalls Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung einer Vielzahl von DNS-Molekülen unter Verwendung von RNS-Molekülen, Reagenzkits zur Verwendung in diesen Verfahren sowie die Verwendung von Mn-^-Ionen zur Reduktion der Bildung von Artefakt-DNS bei Transkriptionsreaktionen Als Ribonukleinsäuren nach der vorliegenden Erfindung können beliebige Ribonuklein¬ säuren benutzt werden, z. B. mRNS, tRNS, rRNS. Besonders zweckmäßig ist die Erfindung bei intronloser mRNS und mRNS, die als Pseudogen vorkommt oder von der nicht bekannt ist, ob Pseudogene vorliegen.
Die Ribonukleinsäuren können nach der vorliegenden Erfindung in stark mit korrespondie¬ render DNS verunreinigter Form vorliegen. Dies ist einer der Hauptvorteile der Erfindung. Aus diesem Grund können bereits weniger stark aufgereinigte RNS -haltige Proben in das erfindungsgemäße Verfahren eingesetzt werden. Insbesondere kann der Gehalt an Desoxy¬ ribonukleinsäuren - sei es zu der entsprechenden Ribonukleinsäure korrespondierenden oder auch fremden Desoxyribonukleinsäuren - höher sein als bei den Proben, die nach Verfahren des Standes der Technik zur Transkription der Ribonukleinsäuren eingesetzt wurden. Die Probe kann einem beliebigen zu untersuchenden Objekt entnommen sein. Es kann sich z. B. um ein Lysat von Gewebe oder Einzelzellen handeln. Die Herstellung ribo- nukleinsäurehaltiger Proben, insbesondere von Lysaten, ist dem Fachmann bekannt. Die Ribonukleinsäuren können in der Probe gelöst vorliegen, sie können jedoch auch in an eine feste Phase immobilisierter Form vorliegen. Wichtig für die Verfahren der Transkription von Ribonukleinsäuren ist letztendlich, daß die Probe mit einem Enzym zum Abbau von DNS umgesetzt werden kann.
In einem ersten Schritt wird die ribonukleinsäurehaltige Probe mit einem DNS abbauenden Enzym in Anwesenheit von Mn2+-Ionen behandelt. DNS abbauende Enzyme sind dem Fachmann bekannt. Bevorzugtes Enzym ist DNase, besonders bevorzugt DNase I. DNase I ist eine Endonuklease, die doppelsträngige oder einzelsträngige DNS unter Bildung eines komplexen Gemisches von Mono- und Oligonukleotiden mit 5'-Phosphoryl-Enden hydro- lysiert. Die Bedingungen zur Behandlung der Probe mit der Mn**-+-ionenhaltigen Lösung unterscheiden sich mit Ausnahme der Anwesenheit der Mn-^-Ionen nicht wesentlich von den Bedingungen, bei denen die Behandlung von ribonukleinsäurehaltigen Proben mit Mg--+-ionenhaltigen DNase-Lösungen bekannt sind. Die erfindungsgemäß vorhandenen Mn2+-Ionen sind bevorzugt in einer Konzentration von mehr als 10"^ M vorhanden. Bevorzugt liegt die Konzentration an Mn2+ zwischen 10"-' und 10"! M, besonders bevorzugt zwischen 10-**- und 10"**- M. Da es als möglich betrachtet wird, daß die DNA assoziierte Artefakt-Bildung auf die Anwesenheit der Mg*-+-Ionen zurückzuführen ist, sollte der Einsatz von Mg**-+ in der Verdauungslösung vermieden werden. Zur Durchführung des DNS- Abbauschrittes wird der zu behandelnden Probe bevorzugt eine Lösung zugegeben, welche die erforderlichen Reagenzien in einer Konzentration enthält, bei der der Abbau in dem entstehenden Reaktionsgemisch stattfinden kann. Anschließend wird für eine ausreichende Zeit inkubiert. Bevorzugt sind Inkubationsdauern zwischen 5 und 60 Minuten bei Temperaturen zwischen 36. und 38 °C.
Bevorzugt wird anschließend das DNS abbauende Enzym auf bekannte Weise, z. B. durch Hitze (5 Minuten, 90 °C) oder, bevorzugt, Extraktion, inaktiviert. Dies geschieht, damit die in der nachfolgenden Reaktion gebildeten Desoxyribonukleinsäuren nicht wieder abgebaut werden.
Danach findet die Transkription der Ribonukleinsäuren in Desoxyribonukleinsäuren statt. Die Ribonukleinsäuren können hierbei entweder in dem im vorangehenden Schritt ent¬ standenen Reaktionsgemisch belassen werden, sie können jedoch auch zwischengereinigt werden. Die Transkription der Ribonukleinsäuren kann auf bekannte Weise durchgeführt werden. Unter Transkription von Ribonukleinsäuren ist der dem Fachmann bekannte Vor¬ gang der Bildung von DNS aus RNS unter Verwendung der RNS als Substrat für die er-zymkatalysierte Kondensation von Monodesoxyribonukleotiden gemeint. Dieser Vorgang ist in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour, NY, 1989 beschrieben. Bevorzugtes Enzym zur Transkription ist die reverse Transkriptase, insbe¬ sondere reverse Transkriptase aus MMLV, insbesondere Superscript (RNase H deletiert).
Außerdem Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung einer Vielzahl von DNS-Molekülen unter Verwendung von RNS-Molekülen, enthaltend die Schritte:
a) Behandlung einer ribonukleinsaurehaltigen Probe mit einem DNS-abbauenden Enzym in Anwesenheit von Mn2+-Ionen,
b) Transkription der Ribonukleinsäuren in Desoxyribonukleü säuren und
c) Vermehrung der Desoxyribonukleinsäuren.
Unter Vermehrung der Desoxyribonukleinsäuren wird die Herstellung einer Vielzahl von Kopien der DNS bzw. von Teilen davon verstanden. Verfahren zur Vermehrung von Desoxyribonukleinsäuren sind dem Fachmann bekannt. Ein prominenter Vertreter dieser Reaktionen ist die Polymerasekettenreaktion (PCR) nach EP-B-0 201 184 Bei dieser Reaktion wird der zu vermehrenden Desoxyribonukleinsäure ein Überschuß an Primer- molekülen zugegeben, wobei ein Teil der Primer komplementär zu einem nicht das 5'-Ende bildenden Sequenzbereich und ein anderer Teil der Primer zum komplementären Strang komplementär ist, so daß das Verlängerungsprodukt jedes Primers wieder als Matrize für die Verlängerung des anderen Primers dienen kann. Die Verlängerung der Primer findet durch polymerasekatalysierte Anhängung von Mononukleotideinheiten an die Primer statt.
Als Primer können erfindungsgemäß auch junction-Primer verwendet werden. Bevorzugt ist der Teil, der zum 3 '-Ende des zweiten Exons komplementär ist, 2 - 4 nt, besonders bevorzugt 3 nt lang, während der daran in S'-Richtung des Primers anschließende Teil so lang ist, daß eine selektive Hybridisierung mit dem S'-Ende des ersten Exons möglich ist, d. h. bevorzugt 10 - 30, besonders bevorzugt 15 - 20 nt.
Es sind weitere Verfahren zur Vermehrung von Desoxyribonukleinsäuren bekannt, z. B. die Ligasekettenreaktion (LCR) nach EP-A-0 320 308, bei der jeweils 2 erste Nukleinsäuren, welche an benachbarte Bereiche der DNS hybridiseren, miteinander kovalent verbunden werden. Das Verknüpfungsprodukt der ersten beiden Nukleinsäuren wird als Matrize für die Verknüpfung zweier weiterer, benachbart an das Verknüpfungsprodukt anhybridisierender Nukleinsäuren benutzt. Auch hier findet durch Cyclusführung eine Amplifikation eines Sequenzbereiches statt.
Ebenfalls verwendet werden kann als Verfahren zur Vermehrung der Desoxyribo¬ nukleinsäuren das Verfahren nach WO 90/01069, welches sowohl Extensions- als auch Verknüpfüngsreaktionen beinhaltet.
Eine weitere Möglichkeit der Vermehrung der DNS bietet das Verfahren nach
EP-A-0 329 822, bei welchem die Vermehrungszyklen einen Schritt zur DNS-abhängigen
RNS-Polymerasereaktion beinhalten.
All diesen bisher beschriebenen Veimehrungsverfahren ist gemeinsam, daß sie eine sequenz¬ spezifische Vermehrung bewirken. Sofern nicht komplizierte Gegenmaßnahmen eingeleitet werden, und wenn nicht besondere Umstände vorliegen, würden diese Verfahren verun¬ reinigende, im wesentlichen gleiche Sequenzen beinhaltende genomische DNS genauso vermehren wie die eigentlich für die Vermehrung zu verwendenden, aus den RNS- Molekülen durch Transkription hergestellten Desoxyribonukleinsäuren. Dies führt jedoch zu einem unerwünschten Hintergrundsignal, welches in der Regel größer ist als das Hinter¬ grundsignal, welches durch die üblicherweise in nukleinsäurehaltigen Proben vorhandenen, nicht zu vermehrenden bzw. nachzuweisenden Nukleinsäuren anderer Sequenzen, hervor- gerufen wird. Bei solchen Verfahren zur Herstellung einer Vielzahl von DNS-Molekülen ist die vorliegende Erfindung daher ganz besonders geeignet.
Ohne an diese Erklärung gebunden zu sein, weisen die bisherigen Ergebnisse der Versuche auf folgendes hin. Da nach Behandlung der DNS und RNS enthaltenden Probe mittels des DNS-abbauenden Enzyms keine DNS mehr nachzuweisen war (beispielsweise durch PCR mit geeigneten Primern), weist die Tatsache, daß für den Fall, daß die Abbaureaktion in Gegenwart von Magnesium-Ionen durchgeführt wurde, dennoch DNS-Signale festgestellt wurden, daraufhin, daß eine Artefakt-Konstruktion der offenbar nur teilweise verdauten DNS der Probe stattgefunden hat. Bei erfindungsgemäßem Einsatz von Mangan-Ionen kann offenbar eine solche Rekonstruktion nicht mehr stattfinden. Die Bildung von Artefakt-DNS in der nachfolgenden Transkriptionsreaktion wird dadurch vermieden.
Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein Reagenz zur Reduzierung der Bildung von Arte¬ fakt-DNS bei Transkriptionsreaktionen, welches ein DNS abbauendes Enzym und Mn**-+- Ionen enthält. Dieses Reagenz kann außerdem noch weitere Reagenzien, wie sie üblicher¬ weise zur Einstellung von Bedingungen erforderlich sind, bei denen DNS in RNS-haltigen Proben abgebaut wird. Hierzu gehören insbesondere Puffer zur Einstellung des für die Ab¬ baureaktion optimalen pH- Wertes.
Als Artefakt-DNS wird im Sinne der Erfindung DNS bezeichnet, die genomische Sequenzen enthält, jedoch durch eine in-vitro-Reaktion gebildet wurde, die nicht auf Transkription von RNS beruht.
Außerdem Gegenstand der Erfindung ist ein Reagenzkit zur Transkription von Ribonuklein¬ säuren in Desoxyribonukleinsäuren, enthaltend in getrennten Behältern ein DNS abbauendes Enzym und Mn*--+-Ionen sowie eine reverse Transkriptase. Dieser Reagenzkit enthält daher die für die Schritte a) und b) erforderlichen Reagenzien in getrennten Behältern. Für die reverse Tr_ _J riptionsreaktion sind neben reverser Transkriptase Mg-^-Ionen, Puffer, die zum Einbau erforderlichen Desoxyribonukleosidtriphosphate sowie RNase-Inhibitoren bevorzugt.
Ebenfalls Gegenstand der Erfindung ist ein Reagenzkit zur Herstellung einer Vielzahl von DNS-Molekülen aus RNS-Molekülen enthaltend in getrennten Behältern: ein DNS-abbauendes Enzym und Mn--+-Ionen,
eine reverse Transkriptase und
Reagenzien zur Vervielfältigung von DNS.
Die Reagenzien zur Vervielfältigung der DNS richten sich nach dem gewünschten Ver¬ mehrungsverfahren. Für die Durchführung der Polymerasekettenreaktion werden beispielsweise die auf den zu vermehrenden Bereich der DNS ausgerichteten Primer, eine bevorzugt thermostabile, DNS-abhängige DNS-Polymerase sowie die für die gewünschte Verlängerung erforderlichen Monodesoxyribonukleosidtriphosphate benötigt. Die Reagen¬ zien hierfür sind beispielsweise in EP-B-0 201 184 beschrieben.
Die auf erfindungsgemäße Weise hergestellten Transkripte können zum Nachweis ur¬ sprünglich in einer Probe vorhandener RNS verwendet werden. Hierzu wird zunächst das erfindungsgemäße Verfahren zur Transkription durchgeführt, wobei das Verfahren durch Einsatz sequenzspezifischer Primer für bestimmte RNS-Sequenzen spezifisch gemacht wer¬ den kann. Nach einer gewünschtenfalls angeschlossenen Amplifikation der Transkript DNS, z. B. mit der PCR, können die gebildeten Nukleinsäuren, beovorzugt durch Hybridisierung mit zu den Nukleinsäuren komplementären Nukleinsäuresonden und Nachweis der Hybridi¬ sierung, auf bekannte Weise nachgewiesen werden. Das erfindungsgemäße Verfahren ist daher besonders geeignet auf dem Gebiet der Nukleinsäurediagnostik in der Molekular¬ biologie und der klinischen Labordiagnostik.
Figur 1 zeigt die Bildung von Transkripten unter verschiedensten Bedingungen, einerseits unter Einsatz von Mg-*-+, andererseits unter erfindungsgemäßem Einsatz von Mιfi+.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern.
Beispiel 1
RNS-Isolierung
RNS wurde aus tiefgefrorenen menschlichem Herzgewebe extrahiert. Die Proben wurden homogenisiert, die gesamte zelluläre RNS unter Verwendung der Säure Guanedinium- tMocy- at/Phenol/Chloroformextraktionsmethode (Anal. Biochem. 162: 156-159 (1987)) extrahiert und bei 20.000 g, 4 °C mit 100 % Isopropanol präzipitiert. Die Pellets wurden mit 75 % Ethanol gewaschen, getrocknet und in DEPC-behandeltem Wasser resuspendiert. Alle RNS-Proben wurden mittels PCR getestet, um mögliche DNS-Kontaminationen aufzuzeigen (unter Verwendung des unten genannten Pyruvatdehydrogenasegen (PDH)- Primersystems).
DNase I-Spaltune
1 μg RNS wurde mit 2 U DNase I (Boehringer Mannheim GmbH, BRD) für 10 Minuten bei 37 °C in Anwesenheit von 40 U RNasin/μg RNS (Promega, BRD) behandelt. Die End¬ konzentration von Mg2+ bzw. Mn-*-+ betrug 1 mM. Nach DNase I- Verdau wurde ein Aliquot auf 90 °C für 5 Minuten erhitzt.
Reverse-Transkription
90 % der mit DNase I behandelten RNS-Probe wurde für die Reverse-Transkription (RT)- Reaktion verwendet. Der Rest wurde als PCR-Kontrolle eingesetzt. Bis zu 1 μg DNase I behandelte RNS wurde mit 500 ng Zufallshexanukleotiden (Random) für 10 Minuten bei 70 °C inkubiert und anschließend bei 4 °C aufbewahrt. Zum Start der Reaktion wurde ein Gemisch von 100 U Superscript MMLV reverse Transkriptase (Gibco-BRL, BRD), 3 mM MgCl2, 50 mM Tris-HCL (pH 8.3), 75 mM KC1, 10 mM DTT, 0.5 mM dNTPs und 40 U RNasin zugegeben. Darin wurde die Probe 50 Minuten bei 42 °C inkubiert. Die Reaktion wurde anschließend 5 Minuten auf 95 °C erhitzt.
Vermehrung der Desoxyribonukleinsäuren durch Polvmerasekettenreaktion und Blot- Ver¬ fahren
Ein Intron überspannendes Primersystem für das Pyruvatdehydrogenasegen (PDH) mit dem Plus-Primer: 5'-GGTATGGATGAGGACCTGGA-3'
und dem Minus-Primer
5'-CTTCCACAGCCCTCGACTAA-3*
wurde benutzt, um ein Amplikon der Länge 185 Basenpaare (bp) auf dem DNS-Niveau und 103 Basenpaare auf dem cDNS-Niveau zu erzeugen. In früheren Experimenten war de¬ monstriert worden, daß für diese PDH-Genregion keine Pseudogene existieren. Zur Kreirung größerer Amplikons (538 bp) wurden für das intronlose Angiotensin II-Typ I- Rezeptorgen (ATR 1) spezifische Primer verwendet:
Plus-Primer: 5'-CCTTCGACGCACAATGCTTG-3',
Minus-Primer: 5'-ATGATTGTCCCAAAGCTGGA-3\
Die Reaktionen wurden durchgeführt mit 8 pMol jedes Primers, 50 mMKCl, 10 mM TrisxHCl (pH 8,3), 1.5 mM MgCl2, 100 μM Desoxyribonukleosidtriphosphaten, 0.4 μM jedes Oligonukleotids, 1.0 U Taq-Polymerase (Perkin Eimer Cetus) und 50 ng Proben- nukleinsäure in einem Volumen von 25 μl. Zur Durchführung der Reaktion wurde ein Thermocycler 9600™ Perkin Eimer benutzt. Zunächst wurde die Probe bei 95 °C denatu¬ riert. Anschließend wurde folgendes Temperaturprofil während 40 Zyklen durchgeführt: 45 sec. 95 °C, 60 sec. 60 °C, 45 sec. 72 °C und anschließend 5 Minuten bei 72 °C.
6 μl der Reaktionsmischung wurden einem 3 % Agarosegel (3 % 3:1 NuSieve™, FMC) mit anschließender Elektrophorese unterworfen. Das Gel wurde anschließend mit Denaturie- rungspuffer (1.5 M Natriumchlorid, 0.5 M Natriumhydroxid, für 10 Minuten) behandelt, 10 Minuten neutralisiert (pH 5,0) und auf eine Nylonmembran geblottet (positiv geladene Nylonmembran, Boehringer Mannheim GmbH). Der Neutralisierungs- und der Blotting- puffer bestanden aus 1.0 M TrisHCl, 2.0 M NaCl (pH 5.0). Die Membranen wurden 30 Minuten prähybridisiert in 5 xSSC-Hybridisierungspuffer (1 xSSC:0.12 M NaCl, 0,015 Natriumeitrat, 2.0 Gewichtsprozent Blockierungsreagenz (Boehringer Mannheim GmbH), 0.02 Gewichtsprozent SDS, 0.1 Gewichtsprozent N-Laurylsarkosin). Nach 6 Stunden Blotzeit wurde unmittelbar eine UV- Vernetzung mit 120 mJ (Stratalinker™, Stratagene) durchgeführt. Die Hybridisierung wurde für mindestens 6 Stunden bei 62 °C in 5 ml Hybri- disierungslösung (enthaltend 2 μl mittels PCR synthetisierter, vorher denaturierter mit DIG- 11-dUTP (Boehringer Mannheim GmbH, Bestell-Nr. 1093657) markierter (PCR: Clinical Diagnostics and Research, Springer Verlag, Berlin, S 121 und Herstellerangaben) Sonden in 5 x SSC; 0,1 % (v/v)N-Laurylsarkosin(Na-Salz); 0,02 %. (w/v) Natriumdodecylsulfat; 2 %. (w/v) Blocker-Reagenz (Boehringer Marinheim, Best.-Nr. 1096176, Casein-fraktion von entfetteter Trockenmilch) ausgeführt.
Zur Herstellung der Sonden wurde folgendermaßen vorgegangen:
Bei Verwendung von Primerpaaren in der amplifizierten Region (Plus-Primer: 5'-TGCTTGGAGAAGAAGTTGCC-3', Minus-Primer: 5'-
TCTGGGGGTAACAGTGACCT-3') wurde ein 94 bp Amplikon direkt von der Kontroll- DNS amplifiziert. Dieses kurze Amplikon wurde nach der Ethidiumbromid-Methode in einem präparativen 1 %-NuSieve GTG Agarosegel untersucht. Der Elektrophoresepuffer setzt sich zusammen aus 0.04 M Tris-Acetat (pH 8.0). Das Amplikon wurde aus dem Gel ausgeschnitten und 5 μl der geschmolzenen Agarose wurden reamplifiziert, wobei die oben genannten Primer und ein dNTP Markierungsgemisch verwendet wurden, in dem 35 % der dTTP durch DIG-dUTP ersetzt waren. Diese Sonde wurde in den Hybridisierungsschritt ohne weitere Reinigung eingesetzt.
Nach 2maligem Waschen (5 Minuten, Raumtemperatur) in 2 xSSC-0.1 % SDS und weiter¬ en 2maligem Waschen (15 Minuten, 62 °C) in 0.2 xSSC-0.1 % SDS wurden die Membranen direkt in den chromogenen Detektionspuffer (0.1 mol/1 Maleinsäure, 0.15 mol/1 Natriumchlorid, pH 7.5, 0.3 Gewichtsprozent Tween-20) überführt.
Die Chromogen-Detektion wurde nach Rolfs et al., PCR: Clinical Diagnostics and Research, Springer Verlag, 1992, durchgeführt. Hierzu wurde die Membran mit Wasch¬ puffer 1 bis 5 Minuten bei Raumtemperatur gewaschen und anschließend in Puffer 2 30 Minuten lang inkubiert. Danach wurde die Membran mit Antikörperkonjugatlösung 30 Minuten inkubiert. Anschließend wurde 2mal für 15 Minuten mit 100 ml Waschpuffer gewaschen. Danach wurden die Membranen 2 bis 5 Minuten in Puffer 3 behandelt. Danach wurden die Membranen im Dunkeln in einer Lösung von 55 μl NBT und 35 μl BCIP in 10 ml Puffer 3 für 6 Stunden inkubiert. Die Farbreaktion wurde für 5 Minuten mit Puffer 4 gestoppt. Anschließend wurde die Farbbildung detektiert. Die Reagenzien für die Chromogen-Detektion wurden dem DIG-DNS-Labelling and Detection Kit non-radioactive (Boehringer Mannheim, Bestell-Nr. 1093657) entnommen und wie folgt geändert:
Waschpuffer:
Puffer: 1 + 0,3 % (WAO Tween™ 20
Puffer 2: Blockierungslösung 1 : 10 verdünnt in Puffer 1 (Endkonzentration 1 % Blockie¬ rungsreagenz) Puffer 3 : O.l M Tris HC1; 0.1 M NaCl; 50 mM MgCl2; pH 9.5 (20 °C) Puffer 4: 10 mM Tris-HCl; 1 mM EDTA; pH 8 (20 °C) NBT: 75 mg/ml in 70 % Dimethylformamid (V/V) BCIP: 50 mg ml in Dimethylformamid
Ergebnis
Obwohl die RNS-Proben mindestens 2mal mit Guεinidiniumthiocyanat Phenol/Chloroform extrahiert wurden, zeigten sich als klarer Beweis für verunreinigende DNS mehr oder weniger intensive PDH-spezifische Signale beim direkten Testen mit Hilfe der PCR, wenn keine weitere DNase I-Behandlung durchgeführt wurde (Figur 1, Spalte 1). Nach Behand¬ lung eines Teils der RNS mit DNase I entweder mit Mg2+ oder Mn^+.Puffer wurde kein weiteres DNS-Signal (185 bp Fragment) in der PCR-Reaktion sichtbar (Figur 1, Spalten 2 und 3). Wenn DNase I/Mg2+-Puffer verdaute Reaktionsmischung für die reverse Transkrip- tasereaktion verwendet wurde, gefolgt von der PCR-Amplifikation, wurde das spezifische 103 bp cDNS-Fragment sichtbar, überraschenderweise jedoch auch das auf der Artefakt- DNS beruhende 185 bp Amplikon (Figur 1, Spalte 4). Im Gegensatz hierzu, wenn DNase- Verdau mit Mn2+-Puffer, gefolgt von reverser Transkriptase und PCR durchgeführt wurde, war nur das 103 bp cDNS-Amplikon sichtbar (Figur 1, Spalte 5). Die hohe Effizienz der Spaltung mit Hilfe von Mn2+ als Kofaktor für DNase I ist auch erkennbar, wenn 50 ng DNS eingesetzt werden bei 10 Minuten Reaktionszeit: Wenn beide Proben mittels PCR amplifiziert werden (ohne reverse Transkriptasereaktion), erzeugt nur der DNase/Mg^+- Puffer ein Amplikon (Figur 1, Spalte 9), während die DNase I/Mn^ " behandelte DNS voll¬ ständig verdaut wurde (Figur 1, Spalte 10).
Wenn RNS unter dem Gesichtspunkt des Auftretens des 538 bp intronfreien ATIR-Frag- mentes untersucht wurden und diese Reaktionsmischung mit verschiedenen DNase I- Mengen sowie für verschiedene Verdauzeiten (10 Minuten, 20 Minuten, 30 Minuten, 37 °C) untersucht wurden, war zu erkennen, daß je mehr DNase I benutzt wurde und je länger die Inkubationszeit war, desto schwächer das ATlR-spezifische Signal nach reverser Transkrip¬ tasereaktion und PCR wurde, obwohl die spezifischen internen Kontrollsignale für die kurzen 103 bp PDH-Fragmente in unveränderter Signalstärke erkennbar waren.
Um zu zeigen, ob das DNS-Signal, welches in der reverse Transkriptase/PCR-Reaktion nach DNase I/Mg**-+-Behandlung auf die enzymatischen Eigenschaften der MMLV reverse Transkriptase oder die Taq-Polymerase zurückzuführen war, wurden alle Experimente wiederholt, jedoch der reverse Transkriptaseschritt ohne MMLV-Enzym durchgeführt. Unter diesen Bedingungen wurde kein zusätzliches Fragment in Größe der DNS in der (pseudo)-reverse Transkriptase/PCR sichtbar, wenn der DNase I- Verdau in Gegenwart von Mg2+-Ionen durchgeführt wurde.
Diese Versuche zeigen, daß nur bei Einsatz von Mn*--+ als Kofaktor eine Differenzierung des Signals nach reverser Transkriptasereaktion und PCR durchgeführt werden kann, ob das Signal auf (durch reverse Transkriptasereaktion aus RNS gebildeter) cDNS oder Artefakt- DNS zurückzuführen ist. Eine quantitative Aussage über die Anzahl von mRNS-Kopien eines gegebenen Transkripts ist mit Mg*-*+-haltigen Puffern nicht oder nur schwierig möglich. Außerdem können Transkripte seltener mRNS durch Intron enthaltende Gene kompetitiert werden und somit falsch negative Ergebnisse liefern. Andererseits liefern bei intronlosen Genen reassoziierte DNS-Fragmente falsch positive Signale für mRNS-Kopien, die gar nicht transkribiert wurden.
SEQUENZPROTOKOLL
(1) ALLGEMEINE ANGABEN:
(i) ANMELDER:
(A) NAME: Boehringer Mannheim GmbH
(B) STRASSE: Sandhofer Strasse 116
(C) ORT: Mannheim
(E) LAND: Germany
(F) POSTLEITZAHL: 68298
(G) TELEFON: 0621/7594348 (H) TELEFAX: 0621/7594457
(ii) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG: Verfahren zur Reduzierung der Bildung von Artefakten
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 6
(iv) COMPUTER-LESBARE FASSUNG:
(A) DATENTRÄGER: Floppy disk
(B) COMPUTER: IBM PC compatible
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: Patentin Release #1.0, Version #1.30 (EPA) (2)ANGABENZUSEQIDNO: 1:
(i)SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 20 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Sonstige Nucleinsäure (A) BESCHREIBUNG: /desc = "oligonucleotide"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1:
GGTATGGATG AGGACCTGGA 20
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 2:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 20 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Sonstige Nucleinsäure (A) BESCHREIBUNG: /desc = 'Oligonucleotide"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2:
CTTCCACAGC CCTCGACTAA 20
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 3:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 20 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Sonstige Nucleinsäure (A) BESCHREIBUNG: /desc = "Oligonucleotide"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 3:
CCTTCGACGC ACAATGCTTG 20
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 4:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN: (A) LÄNGE: 20 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Sonstige Nucleinsäure (A) BESCHREIBUNG: /desc = "Oligonucleotide"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 4:
ATGATTGTCC CAAAGCTGGA 20
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 5:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 20 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Sonstige Nucleinsäure (A) BESCHREIBUNG: /desc = "Oligonucleotide"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 5: TGCTTGGAGA AGAAGTTGCC 20
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 6:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 20 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Sonstige Nucleinsäure (A) BESCHREIBUNG: /desc = "Oligonucleotide"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 6:
TCTGGGGGTA ACAGTGACCT 20

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Transkription von Ribonukleinsäuren einer Probe zu Desoxyribo¬ nukleinsäuren, enthaltend die Schritte:
a) Behandlung der ribonukleinsäurehaltigen Probe mit einem DNS abbauenden Enzym und anschließend
b) Transkription der Ribonukleinsäuren in Desoxyribonukleinsäuren,
dadurch gekennzeichnet, daß Schritt a) in Anwesenheit von Mn-^-Ionen durchgeführt wird.
2. Verfahren zur Herstellung einer Vielzahl von DNS-Molekülen unter Verwendung von RNS-Molekülen, enthaltend die Schritte
a) Behandlung der ribonukleinsäurehaltigen Probe mit einem DNS abbauenden Enzym und anschließend
b) Transkription der Ribonukleinsäuren in Desoxyribonukleinsäuren,
c) Vermehrung der DNS-Moleküle,
dadurch gekennzeichnet, daß Schritt a) in Anwesenheit von Mn2+-Ionen durchgeführt wird.
3. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Vermehrung der DNS-Moleküle mit Hilfe der Polymerasekettenreaktion geschieht.
4. Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Endkonzentration von Mn--+ während Schritt a) zwischen 0.01 und 5 mM liegt.
5. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß das DNS-abbauende Enzym DNase ist.
6. Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Transkription mit Hilfe eines Enzyms mit reverser Transkriptaseaktivität durch¬ geführt wird.
7. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das DNS-ab- bauende Enzym vor Schritt b) inaktiviert wird.
8. Reagenz zur Reduzierung der Bildung von Artefakt-DNS bei Transkriptionsreak¬ tionen, dadurch gekennzeichnet, daß es ein DNS-abbauendes Enzym und Mn2+-Ionen enthält.
9. Reagenzkit zur Transkription von Ribonukleinsäuren in Desoxyribonukleinsäuren, enthaltend in getrennten Behältern:
ein DNS-abbauendes Enzym und Mn2+-Ionen,
eine reverse Transkriptase.
10. Reagenzkit zur Herstellung einer Vielzahl von DNS-Molekülen aus RNS-Molekülen, enthaltend in getrennten Behältern:
ein DNS-abbauendes Enzym und Mn--+-Ionen,
eine reverse Transkriptase,
Reagenzien zur Vervielfältigung von DNS.
11. Verwendung von Mn-^-Ionen zur Reduktion der Bildung von Artefakt-DNS bei Transkriptionsreaktionen.
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DERAGON J-M ET AL: "Use of gamma radiation to eliminate DNA contamination for PCR", NUCLEIC ACIDS RESEARCH, vol. 25, no. 20, October 1990 (1990-10-01), pages 6149, XP000159871 *

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