JP4126348B2 - リボ核酸のデオキシリボ核酸への転写中のアーティファクト形成の低減方法 - Google Patents
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Description
本発明の主題は、試料のリボ核酸（ＲＮＡ）をデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）に転写する方法；さらに、ＲＮＡ分子により多数のＤＮＡ分子を調製する方法、アーティファクト（ａｒｔｉｆａｃｔ）を減少させるための試薬および該方法を実施するための試薬キットである。
核酸を分析する方法は、ＲＮＡおよびＤＮＡの両方の分析に基づき得る。両異形はそれぞれの利点を有する。ＲＮＡの分析に基づいた方法において、デオキシリボ核酸がより安定であるという理由から、まずリボ核酸をデオキシリボ核酸に転写する。しかしながら、ゲノムＤＮＡは、ＲＮＡが生物によりプロセシングを受けた際に失われるイントロン配列を含むので、リボ核酸は、しばしばＤＮＡが用いられた時には得られない情報を提供する。したがって、ＤＮＡの分析に基づいた方法は、分析対象配列がイントロンを含むかどうかにかかわらず、同じ結果を与える。ＲＮＡのみが検出対象である場合、特定の予防処理をしないかぎり、ＤＮＡによる混入は結果の肯定的な変更を導く。この問題を解決するための１つの可能性は接合プライマーの使用である。接合プライマーは、その５’末端がエキソンの５’末端の配列に相補的で、その３’末端が隣接したエキソンの３’末端のヌクレオチドに相補的だが、ゲノム中の該２つのエキソンの間に位置するイントロンの３’末端のヌクレオチドに相補的でないヌクレオチドを含むように配列が選択されたオリゴヌクレオチドである。この場合、ＤＮＡを混入させることによる結果の変更は、少なくとも部分的に回避できる。
しかしながら、かかる識別は、イントロンを含まない遺伝子の転写産物を分析する際のＤＮＡおよびＲＮＡの間においてはされない。さらに、偽遺伝子は、長さにおいて同一であり、それゆえ、ＲＮＡ転写産物から区別することができないという同じ問題を提示する。かかる場合、転写反応の前に、ＲＮアーゼ−フリーＤＮアーゼでｍＲＮＡ試料を処理することが有利であることが証明されている。この種の方法は、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ９：２６２−２６８（１９９０）およびＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １３：７２６−７２９（１９９２）に記載されている。
イントロンを含む遺伝子部分を扱う際の効果的なＤＮＡ消化の評価は、ＤＮアーゼで処理したが逆転写されなかったＲＮＡの一部が、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡという結果である大きさに従うＰＣＲ産物の区別を許容するプライマーセットを用いたポリメラーゼ連鎖反応に付されることを必要とする。
ＤＮアーゼＩは、補因子として二価の金属イオンを必要とする（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４３：４４０９−４４１６（１９６８））。最適Ｍｇ2+イオン濃度がＭｎ2+濃度を１桁以上越えるものであることが知られている。さらに、Ｍｎ2+濃度の増加がＭｇ2+またはＣａ2+の場合のように、ＤＮアーゼ反応を阻害しないことも知られている。
本発明の主要部は、Ｍｎ2+イオンの使用が、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法による複製的増幅により形成されるアーティファクトＤＮＡの量を有意に減少させ、または完全に排除さえするという発見である。さらに、Ｍｎ2+イオンを用いるＤＮアーゼ消化は、Ｍｇ2+を用いるよりもかなり効果的である。
したがって、本発明の主題は、下記工程：
ａ． リボ核酸を含む試料をＤＮＡ消化酵素で処理する工程、つぎに
ｂ． リボ核酸をデオキシリボ核酸に転写する工程
からなり、工程ａ．がＭｎ2+イオンの存在下で行なわれる、試料のリボ核酸をデオキシリボ核酸に転写する方法である。
本発明の他の主題は、ＲＮＡ分子により多数のＤＮＡ分子を調製する方法、該方法における使用のための試薬キット、および転写反応中のアーティファクトＤＮＡの形成を減少させるためのＭｎ2+イオンの使用である。
本発明における使用のためのリボ核酸は、例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡなどの、いずれの所望のリボ核酸であってもよい。本発明は、イントロンを含まないｍＲＮＡ、および偽遺伝子として存在するまたは偽遺伝子が存在するかどうかわからないｍＲＮＡで、特によく作用する。
本発明によれば、対応するＤＮＡが高度に混入したときでさえ、リボ核酸は存在しうる。これは本発明の主要な利点の１つである。したがって、本発明の方法において、完全には精製されていないＲＮＡを含む試料を用いることは可能である。特にデオキシリボ核酸の含有量は、用いられたリボ核酸または外来性のデオキシリボ核酸に対応するかどうかにかかわらず、リボ核酸を転写するための従来技術にしたがって用いられた試料中の含有量を越えることができる。試料は、例えば、組織または個体細胞由来の溶解物などのいかなる検査対象物からも取得することができる。熟練者は、リボ核酸を含む試料、特に溶解物の調製に精通している。リボ核酸は、試料中に溶解させてもよいし、または固相に固定させてもよい。試料をＤＮＡ消化酵素と反応させることは、リボ核酸の転写にとって、重要である。
最初の工程において、リボ核酸を含む試料を、Ｍｎ2+イオンの存在下でＤＮＡ消化酵素で処理する。ＤＮＡ消化酵素は熟練者に公知である。好ましい酵素は、ＤＮアーゼ、特にＤＮアーゼＩである。ＤＮアーゼＩは、二本鎖または一本鎖ＤＮＡを加水分解し、５’リン酸化末端を有するモノおよびオリゴヌクレオチドの複合混合物を形成させるエンドヌクレアーゼである。Ｍｎ2+イオンの存在を除いては、試料をＭｎ2+イオンを含む溶液で処理する条件は、Ｍｇ2+イオンを含むＤＮアーゼ溶液でのリボ核酸を含む試料の処理に適用されるものと根本的に異なっていない。本発明の存在するＭｎ2+イオンは、好ましくは１０-6Ｍ以上の濃度であること分かっている。Ｍｇ2+の濃度は、好ましくは１０-5〜１０-1Ｍ、最も好ましくは１０-4〜１０-2Ｍである。ＤＮＡに関連するアーティファクト形成はＭｇ2+イオンの存在によるかもしれないので、消化溶液におけるそれらの使用は避けるべきである。
ＤＮＡ消化工程を行なうために、好ましくは、生じた反応混合物中において消化を許容する濃度の必要な試薬を含む溶液を、処理対象の試料に添加する。つぎに、該混合物を十分な時間インキュベートする。好ましいインキュベーション時間は３６℃〜３８℃の温度で５〜６０分の範囲である。
つぎに、ＤＮＡ消化酵素を、公知の方法、例えば、熱処理（９０℃、５分）などにより不活性化することが好ましく、または、より好ましくは抽出により不活性化する。これは、その後の反応において形成されるデオキシリボ核酸の再消化を避けるために行なわれる。
つぎに、リボ核酸をデオキシリボ核酸に転写する。該リボ核酸は、前記工程において作成された反応混合物のままでもよいし、中間工程において精製されてもよい。リボ核酸の転写は、公知の方法で行なうことができる。熟練者にとって、リボ核酸の転写は、モノデオキシリボヌクレオチドの酵素触媒縮合のための基質としてＲＮＡを用いたＲＮＡからのＤＮＡの形成を意味する。この工程は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ，ＮＹ，１９８９に記載されている。転写のための好ましい酵素は、逆転写酵素、特にＭＭＬＶ由来の逆転写酵素、具体的にはスーパースクリプト（ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ）（ＲＮアーゼＨ欠失）である。
さらに本発明のもう１つの主題は、下記工程：
ａ． Ｍｎ2+イオンの存在下でリボ核酸を含む試料をＤＮＡ消化酵素で処理する工程、
ｂ． リボ核酸をデオキシリボ核酸に転写する工程、および
ｃ． デオキシリボ核酸を増幅する工程
からなる、ＲＮＡ分子により多数のＤＮＡ分子を調製する方法である。
デオキシリボ核酸の増幅は、ＤＮＡまたはその一部の多数のコピーの調製であると理解される。デオキシリボ核酸を増幅させる方法は、熟練者に公知である。この種のよく知られた方法は、欧州特許ＥＰ−Ｂ−０ ２０１ １８４号明細書に記載のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である。この反応において、過剰量のプライマー分子を増幅対象デオキシリボ核酸に添加する；プライマーの一部は、５’末端を形成しない配列に相補的であるが、プライマーの他の部分は相補鎖に相補的である；したがって、各プライマーの伸長産物は、他のプライマーの伸長に利用できる。プライマーは、ポリメラーゼにより触媒される反応においてモノヌクレオチドユニットをプライマーに添加することにより伸長される。
本発明によれば、プライマーとして接合プライマーを用いることも可能である。好ましい方法において、２番目のエキソンの３’末端に相補的な部分は、２〜４ヌクレオチドの長さを有し、特に好ましくは３ヌクレオチドである；プライマーの５’方向に続く部分は、１番目のエキソンの５’末端との選択的ハイブリダイゼーションを可能にするために十分な長さ、すなわち、１０〜３０ヌクレオチド、最も好ましくは１５〜２０ヌクレオチドの長さを有する。
例えば、欧州特許出願公開第０ ３２０ ３０８号明細書に記載のリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）などの、デオキシリボ核酸を増幅する他の方法も公知である。この反応において、ＤＮＡの隣接した領域上でハイブリダイズする２つの開始核酸が共有結合している。最初の２つの連結した核酸産物は、最初の連結産物に隣接してハイブリダイズする２つのさらなる核酸を連結させるための鋳型として働く。配列はサイクル反応において増幅される。
デオキシリボ核酸の増幅に対して伸長反応および連結反応の両者からなる国際公開第９０／０１０６９号パンフレットの方法を用いることも可能である。
ＤＮＡを増幅する他の可能性は、増幅サイクルがＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメーラーゼ反応の工程を含む欧州特許出願公開第０ ３２９ ８２２号明細書に記載の方法である。
前記増幅方法の全てが、配列特異的増幅を生じさせる。複合体計数測定が行なわれるおよび／または特定の事情が存在しないかぎり、これらの方法は、ＲＮＡ分子を転写することにより得られ実際に増幅するつもりのデオキシリボ核酸のみならず、本質的に同一の配列を含む混入したゲノムＤＮＡを増幅するであろう。しかしながら、このことは、通常核酸を含む試料中に存在し、増幅および／または検出されるべきでない、他の配列の核酸により作成されるバックグランドシグナルより通常大きい、望ましくないバックグランドシグナルへ通常導く。したがって、本発明は、かかる多数のＤＮＡ分子の調製方法が用いられた際に特に好適である。
この記載に結びつけることなく、この実験の結果は以下のことを示す：ＤＮＡおよびＲＮＡを含む試料をＤＮＡ消化酵素で処理したのち、（例えば、適当なプライマーを用いたＰＣＲで）ＤＮＡは全く検出されないので、消化反応をマグネシウムイオンの存在下で行なったにもかかわらずＤＮＡシグナルがまだ存在していたという事実は、ＤＮＡ（これは明らかに部分的にしか消化されていない）のアーティファクト構築物が発生したことを示している。マンガンイオンを本発明にしたがって用いた際、かかる再構築物は明らかに生じない。このことは、続く転写反応におけるアーティファクトＤＮＡの形成を妨げる。
本発明の他の主題は、ＤＮＡ消化酵素およびＭｎ2+イオンを含む、転写反応中のアーティファクトＤＮＡの形成を減少させるための試薬である。さらに、この試薬は、ＲＮＡを含む試料においてＤＮＡが消化される条件を調節するために、通常必要な追加の試薬を含んでいてもよい。これは、特に、消化反応に最適ｐＨ値を達成するための緩衝液を含む。
本発明において理解されるアーティファクトＤＮＡはゲノム配列を含むＤＮＡであるが、ＲＮＡの転写に基づかないｉｎ ｖｉｔｒｏ反応において得られた。
本発明のさらなる主題は、別々の容器に、ＤＮＡ消化酵素、Ｍｎ2+イオンおよび逆転写酵素を有する、リボ核酸をデオキシリボ核酸に転写するための試薬キットである。したがって、このキットは、別々の容器に、工程ａ．およびｂ．に必要な試薬を含む。逆転写酵素に加えて、逆転写反応のためのＭｇ2+イオン、緩衝液、取込みに必要なデオキシリボヌクレオシド三リン酸およびＲＮアーゼ阻害剤を有することが好ましい。
本発明の他の主題は、別々の容器に、下記のもの
− ＤＮＡ消化酵素およびＭｎ2+イオン
− 逆転写酵素、ならびに
− ＤＮＡ増幅用試薬
を有する、ＲＮＡ分子から多数のＤＮＡ分子を調製するための試薬キットである。
ＤＮＡ増幅用試薬は、用いた増幅方法に依存する。ポリメラーゼ連鎖反応は、例えば、所望の伸長に必要な、増幅対象のＤＮＡ領域に特異的なプライマー、好ましくは熱安定な、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼおよびモノデオキシリボヌクレオシド三リン酸の使用を必要とする。必要な試薬は欧州特許ＥＰ−Ｂ−０ ２０１ １８４号明細書に記載されている。
本発明により調製された転写産物は、試料中に初めから存在していたＲＮＡの検出のために用いることができる。このことを実行するために、本発明の転写方法を実施するが、配列特異的プライマーを用いることによって、特定のＲＮＡ配列に特異的であってもよい。必要ならば、転写産物ＤＮＡを、例えばＰＣＲで増幅することができる；つぎに、この方法で得られた核酸を公知の方法で検出することができる；これは、核酸に相補的な核酸プローブとのハイブリダイゼーションの後、ハイブリダイゼーションの検出により行なわれることが好ましい。したがって、本発明の方法は、分子生物学および臨床的実験用診断学における核酸診断の分野に特に好適である。
図１は、様々な条件下；Ｍｇ2+イオンを用いたもの、本発明によるＭｎ2+イオンを用いたものでの転写産物の形成を示す。
以下、実施例により、本発明をさらに詳細に説明する。
実施例１
ＲＮＡの単離
ＲＮＡを凍結保存ヒト心臓組織から抽出した。試料をホモゲナイズし、全細胞ＲＮＡをグアニジニウムチオシアネート／フェノール／クロロホルムで抽出し（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６２：１５６−１５９（１９８７））、１００％イソプロパノールを用いて２０，０００ｇ、４℃で沈澱させた。ペレットを７５％エタノールで洗浄し、乾燥し、ＤＥＰＣ処理水に再懸濁した。ＤＮＡ混入の可能性を示すため、（下記のピルビン酸脱水素酵素遺伝子（ＰＤＨ）プライマーシステムを用いて）全ＲＮＡ試料をＰＣＲにより試験した。
ＤＮアーゼＩ切断
１μｇのＲＮＡを、４０Ｕ ＲＮａｓｉｎ／μｇ ＲＮＡ（ドイツ、プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）製）の存在下で、２ＵのＤＮアーゼＩ（ドイツ、ベーリンガー マンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）製）で３７℃で１０分間処理した。Ｍｇ2+およびＭｎ2+の最終濃度は、各１ｍＭであった。ＤＮアーゼＩ消化後、１つのアリコートを、５分間９０℃まで加熱した。
逆転写
ＤＮアーゼＩで処理したＲＮＡ試料の９０％を、逆転写（ＲＴ）反応に用いた。残りをＰＣＲコントロールとして用いた。ＤＮアーゼＩで処理した１μｇまでのＲＮＡを５００ｎｇのランダムヘキサンヌクレオチドと７０℃で１０分間インキュベートし、つぎに、４℃で保存した。反応を開始するために、１００Ｕ Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＭＭＬＶ 逆転写酵素（ドイツ、ギブコービーアールエル（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）製）、３ｍＭ ＭｇＣｌ2、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、７５ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＤＴＴ、０．５ｍＭ ｄＮＴＰｓおよび４０Ｕ ＲＮａｓｉｎの混合物を添加した。試料をこの混合物中で４２℃で５０分間インキュベートした。つぎに、混合物を５分間９５℃まで加熱した。
ポリメラーゼ連鎖反応におけるデオキシリボ核酸の増幅およびドットブロット反応
を有するピルビン酸脱水素酵素遺伝子（ＰＤＨ）用のイントロン−カバーリングプライマーシステムを用いて、ＤＮＡレベルで長さが１８５塩基対（ｂｐ）のアンプリコンおよびｃＤＮＡレベルで長さが１０３塩基対のアンプリコンを生じさせた。以前の実験においては、このＰＤＨ遺伝子領域についての偽遺伝子が存在しないことが示された。より大きなアンプリコン（５３８ｂｐ）を生じさせるために、以下の特異的プライマー
をイントロンを含まないアンギオテンシンII−タイプＩ−受容体遺伝子（ＡＴＲ１）に対して用いた。
反応を、２５μｌの各量の８ｐＭｏｌの各プライマー、５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＴｒｉｓｘＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2、１００μＭ デオキシリボヌクレオシド三リン酸、０．４μＭの各オリゴヌクレオチド、１．０Ｕ Ｔａｑポリメラーゼ（パーキンエルマーシータス（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ）製）および５０ｎｇ試料核酸で行なった。反応を、９６００TMパーキンエルマーサーマルサイクラー中で行なった。まず、試料を９５℃で変性させた。つぎに、以下の温度プロファイルを、９５℃で４５秒、６０℃で６０秒、７２℃で４５秒を４０サイクル、続いて７２℃で５分で行なった。
６μｌの反応混合物を３％アガロースゲル（３％ ３：１ ＮｕＳｉｅｖｅTM、ＦＭＣ）で分析し、電気泳動に付した。つぎに、ゲルを変性緩衝液（１．５Ｍ塩化ナトリウム、０．５Ｍ水酸化ナトリウム、１０分間）で処理し、１０分間で中和（ｐＨ５．０）し、ナイロンメンブレン（正荷電したナイロンメンブレン、ベーリンガー マンハイム ゲーエムベーハー（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ ＧｍｂＨ）製）上にブロットした。中和およびブロッティング緩衝液は、１．０Ｍ ＴｒｉｓＨＣｌ、２．０Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ５．０）からなる。メンブレンを、５×ＳＳＣハイブリダイゼーション緩衝液（１×ＳＳＣ：０．１２Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５クエン酸ナトリウム、２．０ｗ／ｗパーセントのブロッキング試薬（ベーリンガー マンハイム ゲーエムベーハー製）、０．０２ｗ／ｗパーセントＳＤＳ、０．１ｗ／ｗパーセントＮ−ラウリルサルコシン）中で３０分間プレハイブリダイズした。６時間のブロッティング後、メンブレンを、１２０ｍＪでＵＶクロスリンクさせた（ＳｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒTM、ストラタジェン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）製）。ハイブリダイゼーションを、５×ＳＳＣ；０．１％（ｖ／ｖ）Ｎ−ラウリルサルコシン（Ｎａ塩）；０．０２％（ｗ／ｖ）ドデシル硫酸ナトリウム；２％（ｗ／ｖ）ブロッキング試薬（ベーリンガー マンハイム製、カタログ番号１０９６１７６、無脂肪乾燥乳のカゼイン画分）中の５ｍｌのハイブリダイゼーション溶液（ＰＣＲにより合成され（ベルリン、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ発行のＰＣＲ：Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１２１頁および業者のデータ）、ＤＩＧ−１１−ｄＵＴＰ（ベーリンガー マンハイム ゲーエムベーハー製、カタログ番号１０９３６５７）で前もって変性した２μｌの標識プローブを含む）中で、６２℃で、少なくとも６時間行なった。
プローブを以下のようにして得た：
プライマー対を、増幅領域において用いたとき（プラスプライマー：
５’−ＴＧＣＴＴＧＧＡＧＡＡＧＡＡＧＴＴＧＣＣ−３’、マイナスプライマー：５’−ＴＣＴＧＧＧＧＧＴＡＡＣＡＧＴＧＡＣＣＴ−３’）、９４ｂｐのアンプリコンを、コントロールＤＮＡにより直接増幅した。この短いアンプリコンを、臭化エチジウム法を用いて、調製用１％ＮｕＳｉｅｖｅ ＧＴＧアガロースゲル中でアッセイした。電気泳動緩衝液は、０．０４Ｍ Ｔｒｉｓ酢酸（ｐＨ８．０）からなる。アンプリコンをゲルから切り出し、５μｌの融解させたアガロースを、前記のプライマーおよび３５％のＤＩＧ−ｄＵＴＰで置換したｄＴＴＰを有するｄＮＴＰ標識混合物を用いて、再増幅した。このプローブを、さらに精製することなく、ハイブリダイゼーション工程に用いた。
２×ＳＳＣ−０．１％ＳＤＳ中で２度洗浄し（５分、室温）、再度０．２×ＳＳＣ−０．１％ＳＤＳ中で２度洗浄（１５分、６２℃）したのち、メンブレンを、直接色素原検出緩衝液（０．１ｍｏｌ／ｌ マレイン酸、０．１５ｍｏｌ／ｌ 塩化ナトリウム、ｐＨ７．５、０．３ｗ／ｗパーセントＴｗｅｅｎ−２０）に移した。
色素原検出は、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇにより発行された、ロルフス（Ｒｏｌｆｓ）ら、ＰＣＲ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９９２にしたがって行なった。この検出方法においては、メンブレンを、洗浄緩衝液を用いて、室温で１〜５分間、洗浄緩衝液で洗浄し、つぎに、緩衝液２中で３０分間インキュベートした。つぎに、メンブレンを、抗体コンジュゲート溶液中で３０分間インキュベートした。つぎに、混合物を１００ｍｌの洗浄緩衝液で１５分間２度洗浄した。つぎに、メンブレンを、緩衝液３中で２〜５分間処理した。つぎに、メンブレンを、１０ｍｌの緩衝液３中の５５μｌ ＮＢＴおよび３５μｌ ＢＣＩＰの溶液中で６時間暗黒中でインキュベートした。発色反応を、緩衝液４を用いて５分間停止した。つぎに、色形成を検出した。
色素原検出用試薬は、ＤＩＧ−ＤＮＡ Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ ａｎｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｎｏｎ−ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ（ベーリンガー マンハイム製、カタログ番号１０９３６５７）から得、以下のように変更した：
洗浄緩衝液：
緩衝液： １＋０．３％（ｗ／ｖ）ＴｗｅｅｎTM２０
緩衝液２： 緩衝液１で１：１０に希釈したブロッキング溶液（最終濃度１％ブロッキング試薬）
緩衝液３： ０．１Ｍ ＴｒｉｓＨＣｌ；０．１Ｍ ＮａＣｌ；５０ｍＭ ＭｇＣｌ2；ｐＨ９．５（２０℃）
緩衝液４： １０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ；１ｍＭ ＥＤＴＡ；ｐＨ８（２０℃）
ＮＢＴ： ７０％（ｖ／ｖ）ジメチルホルムアミド中７５ｍｇ／ｍｌ
ＢＣＩＰ： ジメチルホルムアミド中５０ｍｇ／ｍｌ
結果
さらなるＤＮアーゼＩ処理を行なわなかった時、ＲＮＡプローブを、グアニジニウムチオシアネート／フェノール／クロロホルムで少なくとも２度抽出したにもかかわらず、多少強いＰＤＨ特異的シグナルがＰＣＲ試験において示され、このことは、明らかに混入したＤＮＡの存在を示していた（図１、カラム１）。Ｍｇ2+またはＭｎ2+緩衝液いずれかでＤＮアーゼＩで一部のＲＮＡを処理したのち、他のＤＮＡシグナル（１８５ｂｐ断片）は、ＰＣＲにおいて見られなかった（図１、カラム２および３）。ＤＮアーゼＩ／Ｍｇ2+緩衝液で消化された反応混合物を、逆転写酵素反応において用い、つぎに、ＰＣＲ増幅を行なった時、特異的な１０３ｂｐのｃＤＮＡ断片が現れた；しかしながら、驚くべきことに、同様に１８５ｂｐのアーティファクトＤＮＡのアンプリコンが現れた（図１、カラム４）。対照的に、ＤＮアーゼ消化をＭｎ2+緩衝液で行い、つぎに、逆転写酵素およびＰＣＲを行なったとき、１０３ｂｐのｃＤＮＡアンプリコンのみが見られた（図１、カラム５）。５０ｎｇのＤＮＡを１０分の反応時間で用いたときも、ＤＮアーゼＩに対する補因子としてのＭｎ2+での高い切断効率は存在した：両試料がＰＣＲ反応において増幅されるとき（逆転写酵素反応なし）、ＤＮアーゼ／Ｍｇ2+緩衝液のみがアンプリコンを生じさせるが（図１、カラム９）、一方、ＤＮアーゼＩ／Ｍｎ2+処理ＤＮＡは完全に消化された（図１、カラム１０）。
ＲＮＡを５３８ｂｐのイントロンを含まないＡＴ１Ｒ断片の存在についてアッセイし、この反応混合物を異なる量のＤＮアーゼＩで異なる消化時間アッセイしたとき（１０分、２０分、３０分、３７℃）、短い１０３ｂｐのＰＤＨ断片に対する特異的内部コントロールシグナルが同じ強さで見られたにもかかわらず、用いたＤＮアーゼＩの量が多いほど、インキュベーション時間が長いほど、逆転写およびＰＣＲ後のＡＴ１Ｒ特異的シグナルは弱くなった。
ＤＮアーゼＩ／Ｍｇ2+処理後の逆転写酵素／ＰＣＲ反応において生じたＤＮＡシグナルが、ＭＭＬＶ逆転写酵素またはＴａｑポリメラーゼの酵素特性によるものであるかどうかを立証するために、逆転写酵素工程においてＭＭＬＶ酵素無しにした以外は、全実験を繰り返した。ＤＮアーゼＩ消化が、Ｍｇ2+イオンの存在下で行なわれたとき、これらの条件下では、（偽）逆転写酵素／ＰＣＲにおけるその大きさのＤＮＡのさらなる断片は見られなかった。
これらの実験は、シグナル（逆転写酵素反応によるＲＮＡから生じた）がｃＤＮＡまたはアーティファクトＤＮＡにより発生するかどうかを見るために、Ｍｎ2+を補因子として用い時にのみ、逆転写酵素反応およびＰＣＲ後のシグナル判別が可能であったことを示す。Ｍｇ2+を含む緩衝液で得られた転写産物のｍＲＮＡのコピー数について定量的記述をすることは、困難および／または不可能である。さらに、稀なｍＲＮＡの転写産物は、イントロン含有遺伝子により影響され、それゆえ、不正確な否定的な結果を提供する。一方、イントロンを含まない遺伝子を扱うときは、再会合したＤＮＡ断片は、全く転写されないｍＲＮＡコピーに対する不正確な肯定的なシグナルを生じさせる。
配列表
（1）一般情報：
（i）出願人：
（A）名称：ベーリンガー マンハイム ゲーエムベーハー
（B）ストリート：サンドホファー シュトラーセ 116
（C）市：マンハイム
（E）国：ドイツ連邦共和国
（F）郵便番号： 68298
（G）電話番号： 0621 759 4348
（H）ファクシミリ番号： 0621 759 4457
（ii）発明の名称：リボ核酸のデオキシリボ核酸への転写中のアーティファクト形成の低減方法
（iii）配列の数：６
（iv）コンピュータ可読フォーム：
（A）媒体タイプ：フロッピーディスク
（B）コンピュータ：IBM PC 互換機
（C）オペレーティング システム：PC-DOS/MS-DOS
（D）ソフトウェア：パテントイン リリース#1.0，バージョン#1.30（EPO）
（2）配列番号：１の情報：
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：20塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（A）種類: /desc = 「オリゴデオキシリボヌクレオチド」
（iii）ハイポセティカル：NO
（xi）配列：配列番号：１：
（2）配列番号：２の情報：
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：20塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（A）種類: /desc = 「オリゴデオキシリボヌクレオチド」
（iii）ハイポセティカル：NO
（xi）配列：配列番号：２：
（2）配列番号：３の情報：
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：20塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（A）種類：/desc = 「オリゴデオキシリボヌクレオチド」
（iii）ハイポセティカル：NO
（xi）配列：配列番号：３：
（2）配列番号：４の情報：
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：20塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（A）種類: /desc = 「オリゴデオキシリボヌクレオチド」
（iii）ハイポセティカル：NO
（xi）配列：配列番号：４：
（2）配列番号：５の情報：
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：20塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（A）種類: /desc = 「オリゴデオキシリボヌクレオチド」
（iii）ハイポセティカル：NO
（xi）配列：配列番号：５：
（2）配列番号：６の情報：
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：20塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（A）種類： /desc = 「オリゴデオキシリボヌクレオチド」
（iii）ハイポセティカル：NO
（xi）配列：配列番号：６：
核酸を分析する方法は、ＲＮＡおよびＤＮＡの両方の分析に基づき得る。両異形はそれぞれの利点を有する。ＲＮＡの分析に基づいた方法において、デオキシリボ核酸がより安定であるという理由から、まずリボ核酸をデオキシリボ核酸に転写する。しかしながら、ゲノムＤＮＡは、ＲＮＡが生物によりプロセシングを受けた際に失われるイントロン配列を含むので、リボ核酸は、しばしばＤＮＡが用いられた時には得られない情報を提供する。したがって、ＤＮＡの分析に基づいた方法は、分析対象配列がイントロンを含むかどうかにかかわらず、同じ結果を与える。ＲＮＡのみが検出対象である場合、特定の予防処理をしないかぎり、ＤＮＡによる混入は結果の肯定的な変更を導く。この問題を解決するための１つの可能性は接合プライマーの使用である。接合プライマーは、その５’末端がエキソンの５’末端の配列に相補的で、その３’末端が隣接したエキソンの３’末端のヌクレオチドに相補的だが、ゲノム中の該２つのエキソンの間に位置するイントロンの３’末端のヌクレオチドに相補的でないヌクレオチドを含むように配列が選択されたオリゴヌクレオチドである。この場合、ＤＮＡを混入させることによる結果の変更は、少なくとも部分的に回避できる。
しかしながら、かかる識別は、イントロンを含まない遺伝子の転写産物を分析する際のＤＮＡおよびＲＮＡの間においてはされない。さらに、偽遺伝子は、長さにおいて同一であり、それゆえ、ＲＮＡ転写産物から区別することができないという同じ問題を提示する。かかる場合、転写反応の前に、ＲＮアーゼ−フリーＤＮアーゼでｍＲＮＡ試料を処理することが有利であることが証明されている。この種の方法は、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ９：２６２−２６８（１９９０）およびＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １３：７２６−７２９（１９９２）に記載されている。
イントロンを含む遺伝子部分を扱う際の効果的なＤＮＡ消化の評価は、ＤＮアーゼで処理したが逆転写されなかったＲＮＡの一部が、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡという結果である大きさに従うＰＣＲ産物の区別を許容するプライマーセットを用いたポリメラーゼ連鎖反応に付されることを必要とする。
ＤＮアーゼＩは、補因子として二価の金属イオンを必要とする（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４３：４４０９−４４１６（１９６８））。最適Ｍｇ2+イオン濃度がＭｎ2+濃度を１桁以上越えるものであることが知られている。さらに、Ｍｎ2+濃度の増加がＭｇ2+またはＣａ2+の場合のように、ＤＮアーゼ反応を阻害しないことも知られている。
本発明の主要部は、Ｍｎ2+イオンの使用が、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法による複製的増幅により形成されるアーティファクトＤＮＡの量を有意に減少させ、または完全に排除さえするという発見である。さらに、Ｍｎ2+イオンを用いるＤＮアーゼ消化は、Ｍｇ2+を用いるよりもかなり効果的である。
したがって、本発明の主題は、下記工程：
ａ． リボ核酸を含む試料をＤＮＡ消化酵素で処理する工程、つぎに
ｂ． リボ核酸をデオキシリボ核酸に転写する工程
からなり、工程ａ．がＭｎ2+イオンの存在下で行なわれる、試料のリボ核酸をデオキシリボ核酸に転写する方法である。
本発明の他の主題は、ＲＮＡ分子により多数のＤＮＡ分子を調製する方法、該方法における使用のための試薬キット、および転写反応中のアーティファクトＤＮＡの形成を減少させるためのＭｎ2+イオンの使用である。
本発明における使用のためのリボ核酸は、例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡなどの、いずれの所望のリボ核酸であってもよい。本発明は、イントロンを含まないｍＲＮＡ、および偽遺伝子として存在するまたは偽遺伝子が存在するかどうかわからないｍＲＮＡで、特によく作用する。
本発明によれば、対応するＤＮＡが高度に混入したときでさえ、リボ核酸は存在しうる。これは本発明の主要な利点の１つである。したがって、本発明の方法において、完全には精製されていないＲＮＡを含む試料を用いることは可能である。特にデオキシリボ核酸の含有量は、用いられたリボ核酸または外来性のデオキシリボ核酸に対応するかどうかにかかわらず、リボ核酸を転写するための従来技術にしたがって用いられた試料中の含有量を越えることができる。試料は、例えば、組織または個体細胞由来の溶解物などのいかなる検査対象物からも取得することができる。熟練者は、リボ核酸を含む試料、特に溶解物の調製に精通している。リボ核酸は、試料中に溶解させてもよいし、または固相に固定させてもよい。試料をＤＮＡ消化酵素と反応させることは、リボ核酸の転写にとって、重要である。
最初の工程において、リボ核酸を含む試料を、Ｍｎ2+イオンの存在下でＤＮＡ消化酵素で処理する。ＤＮＡ消化酵素は熟練者に公知である。好ましい酵素は、ＤＮアーゼ、特にＤＮアーゼＩである。ＤＮアーゼＩは、二本鎖または一本鎖ＤＮＡを加水分解し、５’リン酸化末端を有するモノおよびオリゴヌクレオチドの複合混合物を形成させるエンドヌクレアーゼである。Ｍｎ2+イオンの存在を除いては、試料をＭｎ2+イオンを含む溶液で処理する条件は、Ｍｇ2+イオンを含むＤＮアーゼ溶液でのリボ核酸を含む試料の処理に適用されるものと根本的に異なっていない。本発明の存在するＭｎ2+イオンは、好ましくは１０-6Ｍ以上の濃度であること分かっている。Ｍｇ2+の濃度は、好ましくは１０-5〜１０-1Ｍ、最も好ましくは１０-4〜１０-2Ｍである。ＤＮＡに関連するアーティファクト形成はＭｇ2+イオンの存在によるかもしれないので、消化溶液におけるそれらの使用は避けるべきである。
ＤＮＡ消化工程を行なうために、好ましくは、生じた反応混合物中において消化を許容する濃度の必要な試薬を含む溶液を、処理対象の試料に添加する。つぎに、該混合物を十分な時間インキュベートする。好ましいインキュベーション時間は３６℃〜３８℃の温度で５〜６０分の範囲である。
つぎに、ＤＮＡ消化酵素を、公知の方法、例えば、熱処理（９０℃、５分）などにより不活性化することが好ましく、または、より好ましくは抽出により不活性化する。これは、その後の反応において形成されるデオキシリボ核酸の再消化を避けるために行なわれる。
つぎに、リボ核酸をデオキシリボ核酸に転写する。該リボ核酸は、前記工程において作成された反応混合物のままでもよいし、中間工程において精製されてもよい。リボ核酸の転写は、公知の方法で行なうことができる。熟練者にとって、リボ核酸の転写は、モノデオキシリボヌクレオチドの酵素触媒縮合のための基質としてＲＮＡを用いたＲＮＡからのＤＮＡの形成を意味する。この工程は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ，ＮＹ，１９８９に記載されている。転写のための好ましい酵素は、逆転写酵素、特にＭＭＬＶ由来の逆転写酵素、具体的にはスーパースクリプト（ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ）（ＲＮアーゼＨ欠失）である。
さらに本発明のもう１つの主題は、下記工程：
ａ． Ｍｎ2+イオンの存在下でリボ核酸を含む試料をＤＮＡ消化酵素で処理する工程、
ｂ． リボ核酸をデオキシリボ核酸に転写する工程、および
ｃ． デオキシリボ核酸を増幅する工程
からなる、ＲＮＡ分子により多数のＤＮＡ分子を調製する方法である。
デオキシリボ核酸の増幅は、ＤＮＡまたはその一部の多数のコピーの調製であると理解される。デオキシリボ核酸を増幅させる方法は、熟練者に公知である。この種のよく知られた方法は、欧州特許ＥＰ−Ｂ−０ ２０１ １８４号明細書に記載のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である。この反応において、過剰量のプライマー分子を増幅対象デオキシリボ核酸に添加する；プライマーの一部は、５’末端を形成しない配列に相補的であるが、プライマーの他の部分は相補鎖に相補的である；したがって、各プライマーの伸長産物は、他のプライマーの伸長に利用できる。プライマーは、ポリメラーゼにより触媒される反応においてモノヌクレオチドユニットをプライマーに添加することにより伸長される。
本発明によれば、プライマーとして接合プライマーを用いることも可能である。好ましい方法において、２番目のエキソンの３’末端に相補的な部分は、２〜４ヌクレオチドの長さを有し、特に好ましくは３ヌクレオチドである；プライマーの５’方向に続く部分は、１番目のエキソンの５’末端との選択的ハイブリダイゼーションを可能にするために十分な長さ、すなわち、１０〜３０ヌクレオチド、最も好ましくは１５〜２０ヌクレオチドの長さを有する。
例えば、欧州特許出願公開第０ ３２０ ３０８号明細書に記載のリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）などの、デオキシリボ核酸を増幅する他の方法も公知である。この反応において、ＤＮＡの隣接した領域上でハイブリダイズする２つの開始核酸が共有結合している。最初の２つの連結した核酸産物は、最初の連結産物に隣接してハイブリダイズする２つのさらなる核酸を連結させるための鋳型として働く。配列はサイクル反応において増幅される。
デオキシリボ核酸の増幅に対して伸長反応および連結反応の両者からなる国際公開第９０／０１０６９号パンフレットの方法を用いることも可能である。
ＤＮＡを増幅する他の可能性は、増幅サイクルがＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメーラーゼ反応の工程を含む欧州特許出願公開第０ ３２９ ８２２号明細書に記載の方法である。
前記増幅方法の全てが、配列特異的増幅を生じさせる。複合体計数測定が行なわれるおよび／または特定の事情が存在しないかぎり、これらの方法は、ＲＮＡ分子を転写することにより得られ実際に増幅するつもりのデオキシリボ核酸のみならず、本質的に同一の配列を含む混入したゲノムＤＮＡを増幅するであろう。しかしながら、このことは、通常核酸を含む試料中に存在し、増幅および／または検出されるべきでない、他の配列の核酸により作成されるバックグランドシグナルより通常大きい、望ましくないバックグランドシグナルへ通常導く。したがって、本発明は、かかる多数のＤＮＡ分子の調製方法が用いられた際に特に好適である。
この記載に結びつけることなく、この実験の結果は以下のことを示す：ＤＮＡおよびＲＮＡを含む試料をＤＮＡ消化酵素で処理したのち、（例えば、適当なプライマーを用いたＰＣＲで）ＤＮＡは全く検出されないので、消化反応をマグネシウムイオンの存在下で行なったにもかかわらずＤＮＡシグナルがまだ存在していたという事実は、ＤＮＡ（これは明らかに部分的にしか消化されていない）のアーティファクト構築物が発生したことを示している。マンガンイオンを本発明にしたがって用いた際、かかる再構築物は明らかに生じない。このことは、続く転写反応におけるアーティファクトＤＮＡの形成を妨げる。
本発明の他の主題は、ＤＮＡ消化酵素およびＭｎ2+イオンを含む、転写反応中のアーティファクトＤＮＡの形成を減少させるための試薬である。さらに、この試薬は、ＲＮＡを含む試料においてＤＮＡが消化される条件を調節するために、通常必要な追加の試薬を含んでいてもよい。これは、特に、消化反応に最適ｐＨ値を達成するための緩衝液を含む。
本発明において理解されるアーティファクトＤＮＡはゲノム配列を含むＤＮＡであるが、ＲＮＡの転写に基づかないｉｎ ｖｉｔｒｏ反応において得られた。
本発明のさらなる主題は、別々の容器に、ＤＮＡ消化酵素、Ｍｎ2+イオンおよび逆転写酵素を有する、リボ核酸をデオキシリボ核酸に転写するための試薬キットである。したがって、このキットは、別々の容器に、工程ａ．およびｂ．に必要な試薬を含む。逆転写酵素に加えて、逆転写反応のためのＭｇ2+イオン、緩衝液、取込みに必要なデオキシリボヌクレオシド三リン酸およびＲＮアーゼ阻害剤を有することが好ましい。
本発明の他の主題は、別々の容器に、下記のもの
− ＤＮＡ消化酵素およびＭｎ2+イオン
− 逆転写酵素、ならびに
− ＤＮＡ増幅用試薬
を有する、ＲＮＡ分子から多数のＤＮＡ分子を調製するための試薬キットである。
ＤＮＡ増幅用試薬は、用いた増幅方法に依存する。ポリメラーゼ連鎖反応は、例えば、所望の伸長に必要な、増幅対象のＤＮＡ領域に特異的なプライマー、好ましくは熱安定な、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼおよびモノデオキシリボヌクレオシド三リン酸の使用を必要とする。必要な試薬は欧州特許ＥＰ−Ｂ−０ ２０１ １８４号明細書に記載されている。
本発明により調製された転写産物は、試料中に初めから存在していたＲＮＡの検出のために用いることができる。このことを実行するために、本発明の転写方法を実施するが、配列特異的プライマーを用いることによって、特定のＲＮＡ配列に特異的であってもよい。必要ならば、転写産物ＤＮＡを、例えばＰＣＲで増幅することができる；つぎに、この方法で得られた核酸を公知の方法で検出することができる；これは、核酸に相補的な核酸プローブとのハイブリダイゼーションの後、ハイブリダイゼーションの検出により行なわれることが好ましい。したがって、本発明の方法は、分子生物学および臨床的実験用診断学における核酸診断の分野に特に好適である。
図１は、様々な条件下；Ｍｇ2+イオンを用いたもの、本発明によるＭｎ2+イオンを用いたものでの転写産物の形成を示す。
以下、実施例により、本発明をさらに詳細に説明する。
実施例１
ＲＮＡの単離
ＲＮＡを凍結保存ヒト心臓組織から抽出した。試料をホモゲナイズし、全細胞ＲＮＡをグアニジニウムチオシアネート／フェノール／クロロホルムで抽出し（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６２：１５６−１５９（１９８７））、１００％イソプロパノールを用いて２０，０００ｇ、４℃で沈澱させた。ペレットを７５％エタノールで洗浄し、乾燥し、ＤＥＰＣ処理水に再懸濁した。ＤＮＡ混入の可能性を示すため、（下記のピルビン酸脱水素酵素遺伝子（ＰＤＨ）プライマーシステムを用いて）全ＲＮＡ試料をＰＣＲにより試験した。
ＤＮアーゼＩ切断
１μｇのＲＮＡを、４０Ｕ ＲＮａｓｉｎ／μｇ ＲＮＡ（ドイツ、プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）製）の存在下で、２ＵのＤＮアーゼＩ（ドイツ、ベーリンガー マンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）製）で３７℃で１０分間処理した。Ｍｇ2+およびＭｎ2+の最終濃度は、各１ｍＭであった。ＤＮアーゼＩ消化後、１つのアリコートを、５分間９０℃まで加熱した。
逆転写
ＤＮアーゼＩで処理したＲＮＡ試料の９０％を、逆転写（ＲＴ）反応に用いた。残りをＰＣＲコントロールとして用いた。ＤＮアーゼＩで処理した１μｇまでのＲＮＡを５００ｎｇのランダムヘキサンヌクレオチドと７０℃で１０分間インキュベートし、つぎに、４℃で保存した。反応を開始するために、１００Ｕ Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＭＭＬＶ 逆転写酵素（ドイツ、ギブコービーアールエル（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）製）、３ｍＭ ＭｇＣｌ2、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、７５ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＤＴＴ、０．５ｍＭ ｄＮＴＰｓおよび４０Ｕ ＲＮａｓｉｎの混合物を添加した。試料をこの混合物中で４２℃で５０分間インキュベートした。つぎに、混合物を５分間９５℃まで加熱した。
ポリメラーゼ連鎖反応におけるデオキシリボ核酸の増幅およびドットブロット反応
反応を、２５μｌの各量の８ｐＭｏｌの各プライマー、５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＴｒｉｓｘＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2、１００μＭ デオキシリボヌクレオシド三リン酸、０．４μＭの各オリゴヌクレオチド、１．０Ｕ Ｔａｑポリメラーゼ（パーキンエルマーシータス（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ）製）および５０ｎｇ試料核酸で行なった。反応を、９６００TMパーキンエルマーサーマルサイクラー中で行なった。まず、試料を９５℃で変性させた。つぎに、以下の温度プロファイルを、９５℃で４５秒、６０℃で６０秒、７２℃で４５秒を４０サイクル、続いて７２℃で５分で行なった。
６μｌの反応混合物を３％アガロースゲル（３％ ３：１ ＮｕＳｉｅｖｅTM、ＦＭＣ）で分析し、電気泳動に付した。つぎに、ゲルを変性緩衝液（１．５Ｍ塩化ナトリウム、０．５Ｍ水酸化ナトリウム、１０分間）で処理し、１０分間で中和（ｐＨ５．０）し、ナイロンメンブレン（正荷電したナイロンメンブレン、ベーリンガー マンハイム ゲーエムベーハー（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ ＧｍｂＨ）製）上にブロットした。中和およびブロッティング緩衝液は、１．０Ｍ ＴｒｉｓＨＣｌ、２．０Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ５．０）からなる。メンブレンを、５×ＳＳＣハイブリダイゼーション緩衝液（１×ＳＳＣ：０．１２Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５クエン酸ナトリウム、２．０ｗ／ｗパーセントのブロッキング試薬（ベーリンガー マンハイム ゲーエムベーハー製）、０．０２ｗ／ｗパーセントＳＤＳ、０．１ｗ／ｗパーセントＮ−ラウリルサルコシン）中で３０分間プレハイブリダイズした。６時間のブロッティング後、メンブレンを、１２０ｍＪでＵＶクロスリンクさせた（ＳｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒTM、ストラタジェン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）製）。ハイブリダイゼーションを、５×ＳＳＣ；０．１％（ｖ／ｖ）Ｎ−ラウリルサルコシン（Ｎａ塩）；０．０２％（ｗ／ｖ）ドデシル硫酸ナトリウム；２％（ｗ／ｖ）ブロッキング試薬（ベーリンガー マンハイム製、カタログ番号１０９６１７６、無脂肪乾燥乳のカゼイン画分）中の５ｍｌのハイブリダイゼーション溶液（ＰＣＲにより合成され（ベルリン、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ発行のＰＣＲ：Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１２１頁および業者のデータ）、ＤＩＧ−１１−ｄＵＴＰ（ベーリンガー マンハイム ゲーエムベーハー製、カタログ番号１０９３６５７）で前もって変性した２μｌの標識プローブを含む）中で、６２℃で、少なくとも６時間行なった。
プローブを以下のようにして得た：
プライマー対を、増幅領域において用いたとき（プラスプライマー：
５’−ＴＧＣＴＴＧＧＡＧＡＡＧＡＡＧＴＴＧＣＣ−３’、マイナスプライマー：５’−ＴＣＴＧＧＧＧＧＴＡＡＣＡＧＴＧＡＣＣＴ−３’）、９４ｂｐのアンプリコンを、コントロールＤＮＡにより直接増幅した。この短いアンプリコンを、臭化エチジウム法を用いて、調製用１％ＮｕＳｉｅｖｅ ＧＴＧアガロースゲル中でアッセイした。電気泳動緩衝液は、０．０４Ｍ Ｔｒｉｓ酢酸（ｐＨ８．０）からなる。アンプリコンをゲルから切り出し、５μｌの融解させたアガロースを、前記のプライマーおよび３５％のＤＩＧ−ｄＵＴＰで置換したｄＴＴＰを有するｄＮＴＰ標識混合物を用いて、再増幅した。このプローブを、さらに精製することなく、ハイブリダイゼーション工程に用いた。
２×ＳＳＣ−０．１％ＳＤＳ中で２度洗浄し（５分、室温）、再度０．２×ＳＳＣ−０．１％ＳＤＳ中で２度洗浄（１５分、６２℃）したのち、メンブレンを、直接色素原検出緩衝液（０．１ｍｏｌ／ｌ マレイン酸、０．１５ｍｏｌ／ｌ 塩化ナトリウム、ｐＨ７．５、０．３ｗ／ｗパーセントＴｗｅｅｎ−２０）に移した。
色素原検出は、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇにより発行された、ロルフス（Ｒｏｌｆｓ）ら、ＰＣＲ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９９２にしたがって行なった。この検出方法においては、メンブレンを、洗浄緩衝液を用いて、室温で１〜５分間、洗浄緩衝液で洗浄し、つぎに、緩衝液２中で３０分間インキュベートした。つぎに、メンブレンを、抗体コンジュゲート溶液中で３０分間インキュベートした。つぎに、混合物を１００ｍｌの洗浄緩衝液で１５分間２度洗浄した。つぎに、メンブレンを、緩衝液３中で２〜５分間処理した。つぎに、メンブレンを、１０ｍｌの緩衝液３中の５５μｌ ＮＢＴおよび３５μｌ ＢＣＩＰの溶液中で６時間暗黒中でインキュベートした。発色反応を、緩衝液４を用いて５分間停止した。つぎに、色形成を検出した。
色素原検出用試薬は、ＤＩＧ−ＤＮＡ Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ ａｎｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｎｏｎ−ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ（ベーリンガー マンハイム製、カタログ番号１０９３６５７）から得、以下のように変更した：
洗浄緩衝液：
緩衝液： １＋０．３％（ｗ／ｖ）ＴｗｅｅｎTM２０
緩衝液２： 緩衝液１で１：１０に希釈したブロッキング溶液（最終濃度１％ブロッキング試薬）
緩衝液３： ０．１Ｍ ＴｒｉｓＨＣｌ；０．１Ｍ ＮａＣｌ；５０ｍＭ ＭｇＣｌ2；ｐＨ９．５（２０℃）
緩衝液４： １０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ；１ｍＭ ＥＤＴＡ；ｐＨ８（２０℃）
ＮＢＴ： ７０％（ｖ／ｖ）ジメチルホルムアミド中７５ｍｇ／ｍｌ
ＢＣＩＰ： ジメチルホルムアミド中５０ｍｇ／ｍｌ
結果
さらなるＤＮアーゼＩ処理を行なわなかった時、ＲＮＡプローブを、グアニジニウムチオシアネート／フェノール／クロロホルムで少なくとも２度抽出したにもかかわらず、多少強いＰＤＨ特異的シグナルがＰＣＲ試験において示され、このことは、明らかに混入したＤＮＡの存在を示していた（図１、カラム１）。Ｍｇ2+またはＭｎ2+緩衝液いずれかでＤＮアーゼＩで一部のＲＮＡを処理したのち、他のＤＮＡシグナル（１８５ｂｐ断片）は、ＰＣＲにおいて見られなかった（図１、カラム２および３）。ＤＮアーゼＩ／Ｍｇ2+緩衝液で消化された反応混合物を、逆転写酵素反応において用い、つぎに、ＰＣＲ増幅を行なった時、特異的な１０３ｂｐのｃＤＮＡ断片が現れた；しかしながら、驚くべきことに、同様に１８５ｂｐのアーティファクトＤＮＡのアンプリコンが現れた（図１、カラム４）。対照的に、ＤＮアーゼ消化をＭｎ2+緩衝液で行い、つぎに、逆転写酵素およびＰＣＲを行なったとき、１０３ｂｐのｃＤＮＡアンプリコンのみが見られた（図１、カラム５）。５０ｎｇのＤＮＡを１０分の反応時間で用いたときも、ＤＮアーゼＩに対する補因子としてのＭｎ2+での高い切断効率は存在した：両試料がＰＣＲ反応において増幅されるとき（逆転写酵素反応なし）、ＤＮアーゼ／Ｍｇ2+緩衝液のみがアンプリコンを生じさせるが（図１、カラム９）、一方、ＤＮアーゼＩ／Ｍｎ2+処理ＤＮＡは完全に消化された（図１、カラム１０）。
ＲＮＡを５３８ｂｐのイントロンを含まないＡＴ１Ｒ断片の存在についてアッセイし、この反応混合物を異なる量のＤＮアーゼＩで異なる消化時間アッセイしたとき（１０分、２０分、３０分、３７℃）、短い１０３ｂｐのＰＤＨ断片に対する特異的内部コントロールシグナルが同じ強さで見られたにもかかわらず、用いたＤＮアーゼＩの量が多いほど、インキュベーション時間が長いほど、逆転写およびＰＣＲ後のＡＴ１Ｒ特異的シグナルは弱くなった。
ＤＮアーゼＩ／Ｍｇ2+処理後の逆転写酵素／ＰＣＲ反応において生じたＤＮＡシグナルが、ＭＭＬＶ逆転写酵素またはＴａｑポリメラーゼの酵素特性によるものであるかどうかを立証するために、逆転写酵素工程においてＭＭＬＶ酵素無しにした以外は、全実験を繰り返した。ＤＮアーゼＩ消化が、Ｍｇ2+イオンの存在下で行なわれたとき、これらの条件下では、（偽）逆転写酵素／ＰＣＲにおけるその大きさのＤＮＡのさらなる断片は見られなかった。
これらの実験は、シグナル（逆転写酵素反応によるＲＮＡから生じた）がｃＤＮＡまたはアーティファクトＤＮＡにより発生するかどうかを見るために、Ｍｎ2+を補因子として用い時にのみ、逆転写酵素反応およびＰＣＲ後のシグナル判別が可能であったことを示す。Ｍｇ2+を含む緩衝液で得られた転写産物のｍＲＮＡのコピー数について定量的記述をすることは、困難および／または不可能である。さらに、稀なｍＲＮＡの転写産物は、イントロン含有遺伝子により影響され、それゆえ、不正確な否定的な結果を提供する。一方、イントロンを含まない遺伝子を扱うときは、再会合したＤＮＡ断片は、全く転写されないｍＲＮＡコピーに対する不正確な肯定的なシグナルを生じさせる。
配列表
（1）一般情報：
（i）出願人：
（A）名称：ベーリンガー マンハイム ゲーエムベーハー
（B）ストリート：サンドホファー シュトラーセ 116
（C）市：マンハイム
（E）国：ドイツ連邦共和国
（F）郵便番号： 68298
（G）電話番号： 0621 759 4348
（H）ファクシミリ番号： 0621 759 4457
（ii）発明の名称：リボ核酸のデオキシリボ核酸への転写中のアーティファクト形成の低減方法
（iii）配列の数：６
（iv）コンピュータ可読フォーム：
（A）媒体タイプ：フロッピーディスク
（B）コンピュータ：IBM PC 互換機
（C）オペレーティング システム：PC-DOS/MS-DOS
（D）ソフトウェア：パテントイン リリース#1.0，バージョン#1.30（EPO）
（2）配列番号：１の情報：
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：20塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（A）種類: /desc = 「オリゴデオキシリボヌクレオチド」
（iii）ハイポセティカル：NO
（xi）配列：配列番号：１：
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：20塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（A）種類: /desc = 「オリゴデオキシリボヌクレオチド」
（iii）ハイポセティカル：NO
（xi）配列：配列番号：２：
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：20塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（A）種類：/desc = 「オリゴデオキシリボヌクレオチド」
（iii）ハイポセティカル：NO
（xi）配列：配列番号：３：
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：20塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（A）種類: /desc = 「オリゴデオキシリボヌクレオチド」
（iii）ハイポセティカル：NO
（xi）配列：配列番号：４：
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：20塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（A）種類: /desc = 「オリゴデオキシリボヌクレオチド」
（iii）ハイポセティカル：NO
（xi）配列：配列番号：５：
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：20塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（A）種類： /desc = 「オリゴデオキシリボヌクレオチド」
（iii）ハイポセティカル：NO
（xi）配列：配列番号：６：
Claims (8)
- 下記工程
ａ． リボ核酸を含む試料をＤＮアーゼＩの溶液で処理する工程、次に
ｂ． リボ核酸をデオキシリボ核酸に転写する工程、
を含み、工程ａ．がＭｎ2+イオンの存在下で行なわれることを特徴とする、試料のリボ核酸をデオキシリボ核酸に転写する方法。 - 下記工程
ａ． リボ核酸を含む試料をＤＮアーゼＩの溶液で処理する工程、次に
ｂ． リボ核酸をデオキシリボ核酸に転写する工程、
ｃ． ＤＮＡ分子を増幅する工程、
を含み、工程ａ．がＭｎ2+イオンの存在下で行なわれることを特徴とする、ＲＮＡ分子により多数のＤＮＡ分子を調製する方法。 - ＤＮＡ分子がポリメラーゼ連鎖反応において増幅されることを特徴とする、請求項２記載の方法。
- 工程ａ．中の最終Ｍｎ2+濃度が０．０１〜５ｍＭであることを特徴とする、請求項１〜３いずれか記載の方法。
- 転写が逆転写酵素活性を有する酵素により行なわれることを特徴とする、請求項１〜４いずれか記載の方法。
- ＤＮアーゼＩの溶液が工程ｂ．を行なう前に不活性化されることを特徴とする、請求項１〜５いずれか記載の方法。
- 別々の容器に、下記のもの：
− ＤＮアーゼＩの溶液およびＭｎ2+イオン
− 逆転写酵素
を含有してなる、請求項１記載の方法に従ってリボ核酸をデオキシリボ核酸に転写するための試薬キット。 - 別々の容器に、下記のもの：
− ＤＮアーゼＩの溶液およびＭｎ2+イオン
− 逆転写酵素
− ＤＮＡ増幅試薬
を含有してなる、請求項２記載の方法に従ってＲＮＡ分子から多数のＤＮＡ分子を調製するための試薬キット。
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